CN109996880A - 基于模块化aav递送系统的crispr-cas基因组工程 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有独特的模块化CRISPR‑Cas9架构的新型递送系统，其使得基因编辑具有更好的递送性能、特异性和选择性。其较之前描述的split‑Cas9系统而言代表着显著的改进。该模块化架构是“可调节的”。本发明其他方面涉及可以在空间和时间上同时受控的系统，从而带来可诱导编辑的可能性。本发明还有其他方面涉及一种能够与归巢剂偶联的经修饰的病毒衣壳。

Description

基于模块化AAV递送系统的CRISPR-CAS基因组工程

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C119(e)要求2016年8月18日提交的美国系列号62/376,855，2016年11月1日提交的美国系列号62/415,858，以及2017年4月4日提交的美国系列号62/481,589的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

背景技术

提供以下对本发明背景的讨论仅是为了帮助读者理解本发明，而非承认描述或构成本发明的现有技术。

近期出现的衍生自成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)系统的RNA引导的效应因子，改变了设计不同的生物体基因组的能力。

目前，腺相关病毒(AAV)由于其总体安全性、温和的免疫应答、长时转基因表达、高感染效率而被广泛用于基因治疗，并且已在临床试验中使用。然而，其主要缺点是AAV的包装容量有限——约为4.5kb，这使得其难以递送约4.2kb大小的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、一个单独的向导RNA载体和基因编辑所需的其他组分。

因此，本领域需要克服该技术缺陷。本发明公开内容满足了这种需要，并且也提供了相关的优点。

发明概述

基因编辑目前面临的一些关键挑战是：递送、特异性和产品选择性。本发明公开的各方面涉及克服这些挑战的方法(图1)。

因此，在一个方面，本公开涉及模块化递送系统，其能够可编程地掺入CRISPR效应因子和易于假型化，其目的在于整合病毒和非病毒递送方法的优点。

随着对疾病的遗传和致病基础不断的了解，基于CRISPR的基因组和表观基因组工程的安全有效的基因转移平台的开发，可以改变靶向各种人类疾病的能力，并且能够设计对疾病的抗性。在这方面，已经开发出一系列新的病毒的和非病毒的方法，用于体外和体内递送CRISPR试剂。

本公开涉及具有独特的模块化CRISPR-Cas9架构的新型递送系统，其使得基因编辑具有更好的递送性能、特异性和选择性。其较之前描述的split-Cas9系统而言代表着显著的改进。该模块化架构是“可调节的”。本发明其他方面涉及可以在空间和时间上同时受控的系统，从而带来可诱导编辑的可能性。本发明还有其他方面涉及一种经修饰的病毒衣壳，其能够偶联至归巢剂，即能够将衣壳靶向和/或定位于细胞、器官或组织的试剂。

本公开内容方面涉及用于基于CRISPR的基因组或表观基因组编辑的重组表达系统。在一些实施方案中，重组表达系统包含、或者可选地基本上由以下组成、或者进一步地由以下组成：(a)第一表达载体，其包含(i)编码C-内含肽的多核苷酸，(ii)编码C-Cas9的多核苷酸，和(iii)所述第一载体的启动子序列；和(b)第二表达载体，其包含(i)编码N-Cas9的多核苷酸，(ii)编码N-内含肽的多核苷酸，和(iii)所述第二载体的启动子序列，其中，任选地，所述第一表达载体和所述第二表达载体均为腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体，以及其中所述第一表达载体和所述第二表达载体的共表达导致整个Cas9蛋白的表达。

在一些实施方案中，第一表达载体的启动子序列包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由CMV启动子组成。

在一些实施方案中，第二载体的启动子序列包含、或者可选地基本上由、或进一步地由可操作地连接至gRNA序列、任选地连接至sgRNA的第一启动子，和第二启动子组成。在一些实施方案中，第一启动子序列是U6启动子。在一些实施方案中，第二启动子序列是CMV启动子。

在一些实施方案中，第一表达载体和第二表达载体均进一步包含、或者可选择地基本上由、或者进一步地由poly-A尾组成。

在一些实施方案中，第一表达载体进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由四环素响应元件组成，和/或，第二表达载体进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由四环素调控的激活因子组成；或，其中第一表达载体进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由四环素调控的激活因子组成，和/或，第二表达载体进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由四环素响应元件组成。在一些实施方案中，四环素响应元件包含一个或多个tetO重复片段，任选地为七个tetO重复片段。在一些实施方案中，四环素调控的激活因子包含rtTa，以及任选地，2A。

在一些实施方案中，C-Cas9是dC-Cas9，N-Cas9是dN-Cas9。在进一步的实施方案中，第一表达载体和/或第二表达载体进一步地包含、或者可选地基本上由、或进一步地由KRAB、DNMT3A或DNMT3L中的一种或多种组成。在进一步的实施方案中，重组表达系统进一步地包含、或者可选地基本上由、或进一步地由靶向抑制、沉默或下调的基因的gRNA组成。在其他实施方案中，第一表达载体和/或第二表达载体进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由VP64、RtA或P65中的一种或多种组成。在进一步的实施方案中，重组表达系统进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由靶向表达、激活或上调的基因的gRNA组成。在更进一步的实施方案中，重组表达系统进一步地包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由编码靶向表达、活化或上调的基因的第三表达载体和，任选地，启动子组成。

在一些实施方案中，第一表达载体和/或第二表达载体还包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由miRNA回路组成。

其他方面涉及包含所公开的重组表达系统的组合物，其中第一表达载体包被在第一病毒衣壳中，第二表达载体包被在第二病毒衣壳中，并且任选地，其中第一病毒衣壳和/或第二种病毒衣壳是AAV或慢病毒衣壳。在一些实施方案中，AAV是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV-DJ中的一种。

在一些实施方案中，第一病毒衣壳和/或第二病毒衣壳被修饰为包含以下组中的一种或多种：非天然氨基酸、SpyTag或KTag。在一些实施方案中，非天然氨基酸是N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸。

在一些实施方案中，第一病毒衣壳和/或第二病毒衣壳通过肽、适体、寡核苷酸、亲和体(affibody)、DARPin(预设计锚蛋白重复蛋白)、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白(anticalin)或粘附蛋白(adnectin)中的一种或多种进行假型化。

在一些实施方案中，第一病毒衣壳和/或第二病毒衣壳是AAV2衣壳。在进一步的实施方案中，在VP1的氨基酸残基R447、S578、N587或S662处掺入非天然氨基酸、SpyTag或KTag。

在一些实施方案中，第一病毒衣壳和/或第二病毒衣壳是AAV-DJ衣壳。在进一步的实施方案中，在VP1的氨基酸残基N589处掺入非天然氨基酸、SpyTag或KTag。

在一些实施方案中，第一病毒衣壳和第二病毒衣壳是相互连接的。

本发明公开的一些方面涉及控制有需要的受试者的疼痛的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3A、TrpV1、SHANK3、NR2B、IL-10、PENK、POMC或MVIIA-PC中的一种或多种的。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗或预防疟疾的方法，包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CD81、MUC13或SR-B1中的一种或多种。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗或预防丙型肝炎的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CD81、MUC13、SR-B1、GYPA、GYPC、PKLR或ACKR1中的一种或多种。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗或预防造血干细胞疗法的免疫排斥的方法，包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CCR5。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗或预防HIV的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CCR5。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗或预防肌营养不良的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向肌营养不良蛋白。

本发明公开的一些方面涉及治疗或改善治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向PDCD-1、NODAL或JAK-2中的一种或多种。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗细胞色素p450病症的方法，包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CYP2D6。

本发明公开的一些方面涉及在有需要的受试者中治疗或预防阿尔茨海默病的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向LilrB2。

在任何一个或多个公开的方法方面的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，任选地为鼠、犬、猫、马、牛、猿猴或人类患者。

本发明的其他方面涉及修饰的AAV2衣壳，其在VP1的氨基酸残基R447、S578、N587或S662处包含非天然氨基酸、SpyTag或KTag。在一些实施方案中，非天然氨基酸是N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸。在一些实施方案中，修饰的AAV2衣壳是通过肽、适体、寡核苷酸、亲和体、DARPin、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白或粘附蛋白中的一种或多种进行假型化的。在一些实施方案中，修饰的AAV2衣壳包被有脂质体。

本发明的其他方面涉及修饰的AAV-DJ衣壳，其在VP1的氨基酸残基N589处包含非天然氨基酸、SpyTag或KTag。在一些实施方案中，非天然氨基酸是N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸。在一些实施方案中，修饰的AAV-DJ衣壳是通过肽、适体、寡核苷酸、亲和体、DARPin、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白或粘附蛋白中的一种或多种进行假型化的。在一些实施方案中，修饰的AAV-DJ衣壳包被有脂质体。

附图说明

图1是描述了与CRISPR递送相关的挑战和本申请所解决的方面的图表。

图2描述了示例性的双AAV系统的示意图，每个系统分别递送split-内含肽、split-Cas9，其在共表达时重构。

图3描述了示例性的诱导型分裂-Cas9系统的示意图。

图4显示(A)描述了用于基因阻遏的示例性split-Cas9系统，其具有KRAB阻遏物结构域，(B)是用于基因激活的示例性split-Cas系统，其具有VP64和Rta结构域。

图5描述了具有miRNA回路的双AAV的示例性示意图。

图6描述了病毒-适体-细胞相互作用的示意图。

图7描述了(A)示例性的TK-GFP载体示意图和(B)在各种感染复数(MOI)下的HEK293T细胞进行AAV-DJ TK-GFP转导后，所得的合并的荧光和相位显微图像。

图8描述了(A)3只小鼠，其施用了靶向ApoB的AAV8诱导型双Cas9系统，未施用多西环素(B)3只小鼠，其施用了靶向ApoB的AAV8诱导型双Cas9系统，施用了200mg多西环素，一周三次，持续4周，当与多西环素一起施用时显示有1.7％的插入缺失。

图9描述了靶向CXCR4的体外阻遏。用双AAV DJ split-Cas9病毒转导293T细胞，在第3天收集细胞，提取RNA并进行RT-qPCR。

图10描述了体内的CD81阻遏，3只小鼠施用了pAAV8_gCD81_KRAB_dCas9载体，用于体内阻遏。在施用AAV的4周后收获肝脏，提取RNA，并进行RT-qPCR实验。结果显示，与野生型相比，施用了阻遏载体的小鼠显示了35％的CD81基因阻遏。

图11描述了用抗CD81染色的肝脏。从上到下：无一级抗体的对照，施用AAV8gCD81阻遏split-Cas9载体的小鼠，野生型对照。

图12描述了使用dC-Cas9_V的体外激活，其中(a)显示了使用AAVDJ_VR_dCas9载体通过RT-qPCR测定的体外RHOX激活的证据。对照由靶向AAVS1基因座的gRNA组成；(b)显示了使用AAVDJ_VR_dCas9载体通过RT-qPCR测定的体外ASCL1激活的证据。

图13描述了(A)显示在改变UAA浓度的同时针对阴性对照(在不存在UAA的情况下)归一化的GFP+细胞数目的直方图和(B)显示在改变合成酶浓度的同时针对阴性对照进行归一化的GFP+细胞的数目的直方图。

图14描述了显示由等体积的不同突变体转导的细胞％的直方图。

图15描述了显示由等体积的不同变体转导的细胞％的直方图

图16描述了通过模块化split-Cas9双AAV系统的通用基因组工程：(a)左边是用于基因组编辑的内含肽介导的split-Cas9pAAV的示例性示意图，右边是用于时间诱导型基因组工程的内含肽介导的split-Cas9pAAV的示例性示意图。(b)从左到右依次为，在体外HEK293T细胞中、在离体的CD34+造血干细胞中、以及在体内ApoB基因座中的AAVS1基因座的插入缺失频率。(c)与诱导型Cas9(iCas9)AAV相比，用Cas9AAV编辑体外AAVS1基因座的相对活性，培养基中含有多西环素(dox：200μg/ml)。(d)Cas9AAV与诱导型Cas9AAV之间体内ApoB编辑的相对活性。用iCas9AAV转导的小鼠，其中施用含有或不含多西环素的盐水(dox：200mg；总共12次注射；误差棒是SEM)。(e)通过dCas9-KR64阻遏物融合蛋白进行基因组阻遏的示例性示意图，以及通过dCas9-VP64-RTA融合蛋白进行基因组激活的示意图。(f)HEK293T细胞中体外抑制CXCR4的证据，靶向两个不同的间隔区。(g)成年小鼠肝脏中体内抑制CD81的证据。(h)使用双-gRNA进行体外激活ASCL1的证据。(i)成年小鼠肝脏中体内激活Afp的证据。(j)显示肝切片的代表性免疫荧光染色和相对表达水平的相应定量分析：DAPI(下图)和抗CD81(上图)。左图是阴性对照(二抗染色切片)，中间的图是阳性对照(非靶向AAV)，右图是用CD81AAV转导的小鼠。(比例尺：250μm；误差棒是SEM)。

图17描述了通过UAA介导的点击化学操作掺入的多种衣壳假型化：(a)将UAA添加到病毒衣壳并随后将效应器以基于点击化学的化学连接方法连接至UAA的示例性示意图。(b)测定表面残基的位置以置换UAA(编号为VP1残基)。(c)在存在和不存在2mM UAA(0.4mM赖氨酸)的情况下AAV2突变体的相对滴度：用等量的病毒转导293T细胞，并将荧光细胞的数目进行定量；在不存在UAA的情况下，未观察到病毒的聚集。(d)通过Alexa594DIBO炔烃进行AAV的荧光基团假型化：293T转导的2小时后，通过病毒的荧光可视化证实其成功连接到了病毒上(比例尺：250μm)。(e)通过炔烃标记的寡核苷酸进行AAV的寡核苷酸假型化：通过分散在DNA阵列斑点上的293T细胞转导了具体病毒，证明在那些斑点上携带了相应的互补寡核苷酸的AAV的选择性捕获(比例尺：250μm)。(f)集成模块化AAV平台的概念，该平台结合了基因组工程效应器和衣壳效应器中的可编程性，以生成完全可编程的模块化AAV。(g)确认mAAV集成系统是功能性的，即UAA修饰的AAV可以掺入基于split-Cas9的基因组工程负载物并实现稳健的基因组编辑：图中显示了插入缺失特征和代表性的NHEJ特征。

图18描述了通过mAAV的体内和体外的基因组调节：(a)体内mAAV介导的基因组工程的工作流程的示例性示意图：设计和构建AAV质粒，然后通过碘克沙醇梯度生产和纯化病毒。然后通过尾静脉或腹膜内途径向小鼠注射～0.5E12-1E12的GC，并在4周时收集整个组织以进行处理。(b)体内阻遏CD81：小鼠通过腹膜内(IP)注射接受1E12的非靶向或CD81靶向AAV的GC。通过定量RT-PCR在该实验中观察到在整个组织水平下～40-60％的CD81抑制。(c)左图：通过靶向两种不同的间隔物gRHOXF2_1和gRHOXF2_2以及两种双-gRHOXF2的组合，在293T细胞中体外激活RHOXF2。在这些不同条件下通过定量RT-PCR观察到～1.25-7倍的激活。右图：肝脏体内激活Afp：小鼠通过IP注射接受1E12非靶向的GC或Afp AAV。通过定量RT-PCR在该实验中观察到在整个组织水平下～1.25-3倍的Afp激活。

图19描述了UAA掺入的优化：合成酶和UAA的浓度：(a)UAA掺入到在Y39处携带TAG终止位点的GFP报告序列中：描述了在不同实验条件下——不存在或存在2mM UAA(N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸；结构已显示)的情况下，阴性对照、wt-GFP转染和GFP-Y39TAG报告基因和tRNA-tRNA合成酶的转染，转染48小时后的293T细胞的荧光图像。在后一种情况下的UAA掺入恢复了GFP的强表达。(b)合成酶量对UAA掺入的作用：进行tRNA-tRNA合成酶质粒相对于报告质粒(在2mM UAA下)的量的优化。与1：1的比例相比，5：1的比例显示出高出近5倍的UAA掺入。(c)优化UAA掺入的UAA浓度：评估在tRNA-tRNA合成酶与报道质粒的比例为5：1时的一系列UAA浓度。没有观察到掺入效率的显著差异，尽管在高浓度的UAA下，培养物中存在更多的细胞死亡。

图20描述了通过点击化学介导的部分与AAV表面容易连接的各种衣壳的假型化。(a)比较在相同培养条件下产生的AAV2-N587UAA和AAV-DJ-N589UAA的病毒滴度。(b)确认UAA的掺入不影响AAV的活性(在293T中进行的实验)。(c)对抗体中和具有抗性的“屏蔽的AAV”的示意图。(d)在暴露于猪血清后AAV-DJ-N589UAA病毒拴在一系列小分子和聚合物部分上的相对活性(通过测定mCherry的表达)。

图21显示了AAV-CRISPR阻遏和激活的结构域优化：(a)AAV-CRISPR阻遏的结构域优化：评估多个C末端结构域融合的活性：KRAB或DNA甲基转移酶(DNMT3A或DNMT3L)，但是在瞬时阻遏试验中没有观察到显著的额外阻遏。(误差棒是SEM；细胞：HEK293Ts，基因座：CXCR4)(b)AAV-CRISPR激活的结构域优化：多个N末端结构域融合的活性：评估VP64和P65，特别是添加VP64结构域产生了高出～4倍的基因表达。(误差棒是SEM；p＝0.0007；HEK293Ts，基因座：ASCL1)。

图22描述了(a)用于基因组调节的内含肽介导的split-dCas9pAAV的示意图。(b)效应盒的模块化使用方法，以通过KRAB-dCas9-Nr1阻遏物融合蛋白进行基因组的阻遏，并通过dCas9-VP64-RTA融合蛋白进行基因组的激活。(c)成年小鼠肝脏中体内Afp激活的证据。对照组小鼠以5E+11vg/小鼠接受相同滴度的非靶向AAV8病毒的施用。(误差棒是SEM；p＝0.0117)。(d)优化用于体外激活的结构域(上面的新图1)后，将VP64激活结构域添加到dNCas9载体上，并在施用了5E+11vg/小鼠的AAV8的小鼠中重复体内Afp激活实验。对照组小鼠以5E+11vg/小鼠接受相同的滴度非靶向AAV8病毒的施用。在具有额外VP64结构域的Afp处观察到>6倍的激活。(误差棒是SEM；p＝0.0271)。

图23显示了split-Cas9双AAV系统拯救了mdx小鼠中的肌营养不良蛋白的表达。(a)mdx小鼠模型在外显子23处具有提前终止密码子。使用单一gRNA Cas9系统或双重gRNACas9系统两种不同的方法。设计单一gRNA以靶向外显子23中的终止密码子。设计双重gRNA靶向外显子23的上游和下游，导致突变的外显子23的切除，因此恢复了肌营养不良蛋白基因的阅读框，并且恢复蛋白质的表达。(b)用1E+12vg/小鼠的AAV8split-Cas9双重gRNA系统转导的mdx小鼠中的肌营养不良蛋白的免疫荧光显示外显子23的缺失。(肌营养不良蛋白，上面3个小组；细胞核，4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，下面3个小组；比例尺：250μm)。(c)Dmd编辑的目标序列表。gRNA-L和gRNA-R工程化切除外显子23，以及gRNA-T靶向外显子23中的提前终止密码子。PAM序列加下划线；编码序列为大写字母，内含子序列为小写字母。(d)肌营养不良蛋白的Western印迹显示肌营养不良蛋白表达的恢复。与来自WT小鼠的蛋白质的对比表明，双gRNA和单gRNA方法中，恢复的肌营养不良蛋白约为正常量的7-10％。

图24涉及疼痛控制：小鼠按1E+12vg/小鼠鞘内注射AAV5Nav 1.7KRAB阻遏构建体(dCas9)。如图所示，在SCN9A基因(Nav 1.7)中观察到大约70％的阻遏，并且显示出特异性，而Nav 1.8中没有显示出阻遏的迹象。这证明了靶向背根神经节(DRG)的构建体在体内的功能性。

图25显示了将表达mCherry的各种血清型(AAV5、AAV1、AAV8、AAV9、AAVDJ)按1E+12vg/小鼠鞘内注射至小鼠中得到小鼠mCherry的表达。一组小鼠按1E+12vg/小鼠接受鞘内注射AAV5mCherry，每周一次(上述AAV5_multiple)，持续4周。如图所示，与其他血清型相比，AAV9和AAVDJ显示出更高的转导效率。

图26是使用SpyTag和KTag或假型化的杂交寡核苷酸连接两个AAV衣壳的示意图。

图27是显示了使用具有叠氮化物-炔烃反应的非天然氨基酸或SpyTag和KTag进行假型化的一般范例的示意图。

图28显示了(a)AAV2-N587UAA和AAV-DJ-N589UAA的病毒滴度的比较(误差棒为+/-SEM)和(b)验证了UAA的掺入不会对AAV活性产生负面影响(在HEK293T中以不同的vg/细胞进行的实验)(误差棒为+/-SEM)。

图29显示了(a)SDS-PAGE考马斯染色分辨AAVDJ和AAVDJ-N589UAA的衣壳蛋白，(b)用炔烃-寡核苷酸(10kDa)处理后的SDS-PAGE考马斯染色分辨AAVDJ和AAVDJ-N589UAA的衣壳蛋白，和(c)用炔烃-寡核苷酸处理后的未变性的AAV-DJ和AAV-DJN589UAA的Western印迹，并用互补的寡核苷酸-生物素缀合物进行探针检测，然后用链霉亲和素-HRP探测。

图30显示了通过点击化学介导的效应器连接至AAV表面的多种衣壳假型化：(a)表示对抗体中和具有抗性的“隐形AAV”。(b)通过基于AAV-mCherry的HEK 293T细胞转导测定的暴露于猪血清后栓系在一系列小分子和聚合物部分上的AAVDJ和AAVDJ-N589UAA病毒的相对活性。(c)通过基于AAV-mCherry的HEK 293T细胞转导测定的暴露于猪血清后栓系在一系列小分子和聚合物部分上的AAVDJ和AAVDJ-N589UAA病毒的相对活性。(d)HEK 293T细胞(1E+5vg/细胞)中的AAVDJ-N589UAA、AAVDJ-N589UAA+寡核苷酸、以及AAVDJ-N589UAA+寡核苷酸+脂质体的AAVS1编辑率(％NHEJ事件)。

图31显示了UAA掺入AAV的优化：(a)合成酶的量对UAA掺入的作用：进行tRNA和tRNA合成酶的质粒相对于报告质粒(2mM UAA)的用量的优化。与1:1的比例相比，5:1的比例显示出高出近5倍的UAA掺入。(b)UAA浓度的优化对UAA掺入的影响：评估在tRNA和tRNA合成酶与报道质粒的比例为5：1时存在的一系列UAA浓度。没有观察到掺入效率的显著差异，尽管在高浓度的UAA下，培养物中存在更多的细胞死亡。(c)在eTF1-E55D存在下，观察到UAA-AAV的滴度增加了1.5-4倍。

图32显示了跨细胞系的“隐形AAV”的转导效率：具体地是，AAV-DJ-N589UAA和AAV-DJ-N589UAA+寡核苷酸+脂质体在多种细胞系中的转导效率。

图33显示了gRNA构建体如何通过募集MCP-VP64的gRNA-M2M和募集Com-KRAB的gRNA-Com介导内源性人基因的同时激活和阻遏的示意图。

图34显示了同时激活和阻遏的载体设计(双载体系统)。

图35显示了用于基因阻遏和基因过表达的三载体系统。将我们的split-Cas9系统(载体a和b)通过鞘内注射至小鼠中用于基因阻遏(可以变换gRNA以靶向不同基因)，以及注射含有CMV启动子和过表达目的基因的第三载体(载体c)。

图36显示了包括基础编辑模型的split-Cas系统的示意图。

图37a是双AAV(pX600)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：CMV启动子、dCInteinCCas9、KRAB和PolyA。图37b提供了图37a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图37c是由图37a编码的构建体的示意图。

图38a是双AAV(pX600)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：CMV启动子、dCInteinCCas9、DNMT3L和PolyA。图38b提供了图38a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图38c是由图38a编码的构建体的示意图。

图39a是双AAV(pX600)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：CMV启动子、dCInteinCCas9、DNMT3A和PolyA。图39b提供了图39a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图39c是由图39a编码的构建体的示意图。

图40a是双AAV(定制)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：U6启动子，随后是引导RNA的克隆位点、CMV启动子、CP64和dNCas9NIntein。图40b提供了图40a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图40c是由图40a编码的构建体的示意图。

图41a是双AAV(定制)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：U6启动子，随后是引导RNA的克隆位点、CMV启动子、CP65和dNCas9NIntein。图41b提供了图41a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图41c是由图41a编码的构建体的示意图。

图42a是双AAV系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：miRNA识别位点、Zac、iU6启动子、gSa、CMV启动子和tTRKRAB。图42b提供了图42a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图42c是由图42a编码的构建体的示意图。

图43a是双AAV系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：tetO(定制)，U6启动子，随后是引导RNA的克隆位点、CMV启动子、NCas9NIntein和M2rtTA。图43b提供了图43a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图43c是由图43a编码的构建体的示意图。

图44a是双AAV系统中两个载体之一的示例性序列，其包含以下元件：tetO、CBL和iCInteinCCas9。图44b提供了图44a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图44c是由图44a编码的构建体的示意图。

图45a是双AAV(pX600)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：CMV启动子、CIntein-CCas9、BE3C和PolyA。图45b提供了图45a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图45c是由图45a编码的构建体的示意图。

图46a和图46b提供了双AAV(定制)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：U6启动子，随后是引导RNA的克隆位点、CMV启动子、BE3N和dNCas9NIntein。图46c提供了图46a和图46b中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图46d是由图46a和图46b编码的构造的示意图。

图47a和图47b提供了包含以下元件的AAV(pX601)载体的示例性序列：CMV启动子、Cas9Sa、U6启动子和gSa。图47c提供了图47a和图47b中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图47d是由图47a和图47b编码的构造的示意图。

图48a是双AAV(pX600)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：CMV启动子、dCInteinCCas9、VR和PolyA。图48b提供了图48a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图48c是由图48a编码的构建体的示意图。

图49a是双AAV(pX600)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：CMV启动子、dCInteinCCas9、EcoRV和PolyA。图49b提供了图49a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图50c是由图49a编码的构建体的示意图。

图50a是双AAV(定制)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：U6启动子，随后是引导RNA的克隆位点、CMV启动子、KRAB和dNCas9NIntein。图50b提供了图50a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图50c是由图50a编码的构建体的示意图。

图51a是双AAV(定制)系统中两种载体之一的示例性序列，其包含以下元件：U6启动子，随后是引导RNA的克隆位点、CMV启动子、EcoRV和dNCas9。图51b提供了图51a中序列的每一个下划线部分和/或突出显示部分的注释信息。图51c是由图51a编码的构建体的示意图。

表格简要说明

表1列出了实施例1中使用的向导RNA的间隔区序列。

表2a列出了实施例1中使用的qPCR引物的寡核苷酸序列。

表2b列出了实施例1中使用的NGS引物的寡核苷酸序列。

表2c列出了实施例1中使用的用于AAV拴系的寡核苷酸的寡核苷酸序列。

发明详述

下文将更全面地描述根据本发明公开的实施例。然而，本发明公开的各方面可以以不同的形式实施，并且不应该被解释为限于此部分阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了使本发明彻底和完整，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。在本发明的描述中使用的术语仅是为了用于描述特定实施例、而非起限制性的目的。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。还应当理解的是，诸如在常用词典中定义的那些术语，应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且除非在本发明中有明确定义，否则不应该被理解为理想化或过度形式化的含义。在下文中没有明确定义的术语，应根据其共通用含义被理解。

本发明说明书中使用的术语仅为用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用其全文并入本发明。

除非另有说明，本发明技术的实践将采用在本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。

除非上下文另有说明，否则明确旨在本发明所述的各种特征可以任何组合使用。此外，本发明的公开还设想在一些实施例中，可排除或省略本发明中阐述的任何特征或特征组合。为了解释说明，如果说明书中陈述了复合物包含组分A、B和C，则具体地意图为A、B或C或其组合可以单独地或以任何组合的方式省略并且放弃。

除非明确指出，否则所有指定的实施方案、特征和术语均旨在包括所述实施方案、特征或术语及其生物学等价物。

所有数值标记(例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)均为近似值，其适当地以(+)或(-)1.0或0.1的增量变化，或者可选地，以+/-15％的变化、或者可选地10％的变化、或者可选地5％的变化、或者可选地2％的变化。应当理解的是，尽管并非总是明确地说明，所有数值标记前面都有术语“约”。还应当理解的是，尽管并非总是明确地说明，本发明所述的试剂仅仅是示例性的，并且其等价物在本领域中是已知的。

如在本发明的说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

当提及可测量值诸如量或浓度等时，本发明所用的术语“约”意指包括具体量的20％、10％、5％、1％、0.5％，或甚至是0.1％的变化。

此外如本发明所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何的和所有的可能组合，以及当在可选的方案(“或”)中解释为不包括组合。

如本发明所用的术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞，任选地，可以是从受试者或可商购的来源获得。

如本发明所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。如本发明所用，连接词“基本上由......组成”(及其语法变体)应解释为包含所述材料或步骤以及实质上不影响所述实施方案的基本的特征和新颖的特征的那些材料或步骤。因此，本发明所用的“基本上由......组成”的“术语”不应被解释为等同于“包含”。“由......组成”意指除用于施用本发明公开的组分外，不含多于微量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些连接术语中的每一个所定义的方面都在本发明公开的范围内。

当应用于核酸序列时，术语“编码”是指如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时，多核苷酸能够转录和/或翻译成mRNA以产生多肽和/或其片段，则该多核苷酸能够“编码”多肽。反义链是此类核酸的互补链，可以从中推导出编码序列。

当提及具体的分子、生物或细胞材料时，术语“等价物”或“生物等价物”可互换使用，并且意指那些具有最低同源性时仍保持所需结构或功能的物质。

如本发明所用，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中，表达可包括mRNA的剪接。通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量可以确定基因的表达水平。此外，可以确定多个基因的表达水平以建立具体样品的表达谱。

如本发明所用，术语“功能性的”可用于修饰任何分子、生物材料或细胞材料，以使其实现特定的具体效果。

如本发明所用，术语“核酸序列”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，其是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链的DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

如本发明所用的术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物材料或细胞材料。

如本发明所用，术语“器官”是个体生物的具体部分的结构，其中个体生物的某些具体功能是局部进行的并且在形态上是分开的。器官的非限制性实例包括皮肤、血管、角膜、胸腺、肾脏、心脏、肝脏、脐带、肠、神经、肺、胎盘、胰腺、甲状腺和脑。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义上是指具有两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物亚基的化合物。亚基之间可以通过肽键连接。在另一个方面，亚基可以通过其他键，例如酯键、醚键等连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对包含蛋白质或肽的序列中的最大氨基酸数量没有限制。如本发明所用，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L型光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。肽可以通过它们的结构来定义。例如，“双环肽”是指包含两个环化部分的肽家族，任选地，对其工程化以起到抗体模拟物的作用。

术语“组织”在本发明中用于指活体或死亡生物体的组织，或源自或设计成模拟活体或死亡生物体的任何组织。组织可以是健康的、患病的和/或具有基因突变的。生物组织可包括任何单个组织(例如，可以互连的细胞集合)或构成生物体的器官或部分或区域的一群组织。组织可以包括均质的细胞材料，或者可以是复合结构，例如在包括胸部的身体的区域中发现的复合结构，例如可以包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性的组织包括但不限于衍生自肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾、脑、胆管、十二指肠、腹主动脉、髂静脉、心脏和肠，以及包括其任何组合的那些组织。

“有效量”或“有效的量”是指足以实现预期目的的量。在一个方面，有效量是用于实现所述治疗目的的量，例如治疗的有效量。如本发明详细描述的，有效量或剂量取决于目的和组合物，并且可以根据本发明公开内容确定。

如本发明所用，术语“CRISPR”是指依赖于成簇的规律间隔的短回文重复序列通路的序列特异性遗传操作技术，其区别于在转录水平上调节基因表达的RNA干扰技术。如本发明所用的术语“gRNA”或“向导RNA”是指使用CRISPR技术进行靶向特定基因校正的向导RNA序列。设计用于靶特异性的gRNA和供体治疗性的多核苷酸的技术是本领域熟知的。参见，例如Doenchet al.(2014)Nature Biotechnol.32(12):1262-7and Graham al.(2015)GenomeBiol.16:260，在此通过引用并入本发明。当在本发明中使用时，gRNA可以指双重或单一gRNA。本发明提供了两者的非限制性示例性实施方案。

术语“Cas9”是指由该名称(UniProtKB G3ECR1(CAS9_STRTR))引用的CRISPR相关的内切核酸酶，以及缺乏内切核酸酶活性的失活Cas9或dCas9(例如，在RuvC和HNH结构域中都具有突变)。术语“Cas9”可进一步指所引用的Cas9的等价物，其具有与其至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，包括但不限于其他大型的Cas9蛋白。

术语“内含肽”是指一类蛋白质，其能够通过蛋白质剪接进行自身切除并与蛋白质的剩余部分连接。“剪接的内含肽(split-intein)”是指来自两个基因的内含肽。本发明公开的蓝细菌(N.punctiforme)中的剪接的内含肽是一个非限制性实例，其是作为split-Cas9系统的一部分。前缀N和C可以在剪接的内含肽的上下文中使用，以确定编码内含肽的一半的基因包含哪个蛋白质末端。

如本发明所用，术语“重组表达系统”是指用于表达通过重组形成的某些遗传物质的遗传构建体。

如本发明所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与该名称相关并属于依赖病毒属(细小病毒科)的一类病毒的成员。已知该病毒的多种血清型适合于基因传递；所有已知的血清型都可以感染来自各种组织类型的细胞。现有技术中公开了至少11种顺序编号的血清型。可用于本发明公开的方法中的非限制性的示例性血清型包括11种血清型中的任何一种，例如AAV2和AAV8，或变体血清型，例如AAV-DJ。

如本发明所用的术语“慢病毒”是指与该名称相关，并属于慢病毒属(Retroviridae)，逆转录病毒科的病毒类成员。虽然已知一些慢病毒会引起疾病，但已知其他慢病毒适合于基因传递。参见，例如Tomáset al.(2013)Biochemistry，Genetics andMolecular Biology：“Gene Therapy-Tools and Potential Applications”，ISBN 978-953-51-1014-9，DOI：10.5772/52534。

如本发明所用，术语“载体”意指重组载体，其保留感染和转导非分裂的细胞和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞基因组中的能力。载体可以衍生自或基于野生型的病毒。本发明公开的方面涉及腺相关病毒载体或慢病毒载体。

如本发明所用的术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)表达的任何序列。例如，启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的或组织特异性的。“启动子”是一段控制序列，其是一段多核苷酸序列的区域，在该区域中控制转录的起始和速率。它可能含有调节蛋白和分子结合至例如RNA聚合酶和其他转录因子的遗传元件。非限制性的示例性启动子包括CMV启动子和U6启动子。以下提供非限制性的示例性启动子序列：

CMV启动子

ATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTT

或其生物等价物。

U6启动子

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC

或其生物等价物。

本发明公开了许多用于这些载体的效应元件；例如，四环素响应元件(例如，tetO)、tet调控的激活因子、T2A、VP64、RtA、KRAB和miRNA传感器回路。这些效应元件的性质和功能在本领域中通常是公知的，并且许多这些效应元件是可商购的。本发明公开了其非限制性示例性的序列，并且在下文中提供其进一步的描述。

如本发明所用的术语“适体(aptamer)”是指能够以高亲和力和特异性结合一种或多种选定靶标的单链DNA或RNA分子。非限制性示例性的靶标包括但不限于蛋白质或肽。

如本发明所用的术语“亲和体(affibody)”是指一类抗体模拟物，其由小蛋白质组成，该小蛋白质经工程改造以高亲和力结合大量靶蛋白或肽。一般的亲和体结构是基于一个三螺旋束，接着可以修饰这个三螺旋束以结合特定的靶标。

如本发明所用的术语“DARPin”是指设计的锚蛋白重复蛋白，一种对靶蛋白具有高特异性和亲和力的工程化抗体模拟物。一般来说，DARPin包含至少三个重复的蛋白质基序(锚蛋白)，任选地为四个或五个，并且具有约14至18kDa的分子量。

如本发明所用的术语“Kunitz结构域”是指在蛋白质中发现的二硫化物右α+β折叠结构域，其具有蛋白酶抑制剂功能。通常，Kunitz结构域的长度约为50至60个氨基酸，分子量约为6kDa。

如本发明所用的术语“fynomers”是指衍生自人Fyn SH3结构域的小结合蛋白(在GeneCards Ref.FYN中描述)，其可以被工程化为抗体模拟物。

如本发明所用的术语“抗运载蛋白(anticalin)”是指目前由PierisPharmaceuticals商业化的一类抗体模拟物，包括能够结合结构上与抗体无关的抗原的人工蛋白质。抗运载蛋白衍生自人脂质运载蛋白并被修饰以结合特定靶标。

如本发明所用的术语“粘附蛋白(adnectin)”是指一种单体，其是起抗体模拟物作用的合成的结合蛋白，其使用纤连蛋白III型结构域(FN3)构建而成。

除非另有说明，否则在没有明确叙述的情况下可以推断，当本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等价物或生物学等价物也在本公开的范围内。如本发明所用，当提及参考蛋白质、抗体、多肽或核酸时，术语“其生物等价物”旨在与“其等价物”同义，意指具有最小同源性时仍保持所需结构或功能的那些蛋白质、抗体、多肽或核酸。除非本发明具体列举，否则视为本发明提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质还包括其等价物。例如，一个等价物意指与参考的蛋白质、多肽或核酸有至少约70％的同源性或同一性，或至少80％的同源性或同一性，或者可选地至少约85％、或者可选地至少约90％、或者可选地至少约95％、或者可选地98％的同源性或同一性，并且与参考的蛋白质、多肽或核酸显示出基本相同的生物活性。可选地，当提及多核苷酸时，其等价物是在严格条件下与参考的多核苷酸或其互补序列进行杂交的多核苷酸。

申请人在本发明中提供了多肽和/或多核苷酸序列，以用于下文描述的基因和蛋白质的转移和表达的技术。应当理解的是，尽管并非总是明确地指出，但是本发明提供的序列可用于提供表达产物以及产生具有相同生物学特性的蛋白质的基本相同的序列。这些“生物学等价的”或“生物学活性的”多肽由本发明所述的等价多核苷酸编码。在当使用在默认条件下运行的序列同一性方法进行比较时，它们可具有与参考多肽至少60％、或者可选地至少65％、或者可选地至少70％、或者可选地至少75％、或者可选地至少80％、或者可选地至少85％、或者可选地至少90％、或者可选地至少95％或者可选地至少98％同一的一级氨基酸序列。本发明提供了具体的多肽序列作为特定的实施方案的实例。使用具有相似电荷的替代氨基酸进行序列的修饰。另外，等价的多核苷酸是在严格条件下与参考的多核苷酸或其互补序列进行杂交的多核苷酸，或参考某个多肽时，参考多肽由在严格条件下与编码多核苷酸或其互补链进行杂交的多核苷酸编码。可选地，等价的多肽或蛋白质是从等价的多核苷酸表达的多肽或蛋白质。

“杂交”是指一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键作用而稳定。通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式可以形成氢键。复合物可包含形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一自杂交链，以及这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛的过程中的步骤，例如聚合酶链式反应的起始，或核酶对多核苷酸的酶促切割。

严格的杂交条件的实例包括：孵育温度为约25℃至约37℃；杂交缓冲液浓度约为6×SSC至约10×SSC；甲酰胺浓度为约0％至约25％；洗涤溶液为约4×SSC到约8×SSC。中度杂交条件的实例包括：孵育温度为约40℃至约50℃；缓冲液浓度约为9×SSC至约2×SSC；甲酰胺浓度约为30％至50％；洗涤溶液为约5×SSC至约2×SSC。高严格条件的实例包括：孵育温度为约55℃至约68℃；缓冲液浓度约为1×SSC至约0.1×SSC；甲酰胺浓度为约55％至约75％；洗涤溶液为约1×SSC、0.1×SSC或去离子水。通常情况下，杂交孵育的时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多次的洗涤步骤，并且洗涤孵育的时间为约1、2或15分钟。SSC是指0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当理解的是，可以使用其他缓冲系统的SSC的等价物。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中为了比较而对齐的位点来确定同源性。当被比较的序列中的位点被相同的碱基或氨基酸占据时，则该分子在该位点是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置的数量的函数。“不相关的”或“非同源的”序列是指与本发明的某个序列具有小于40％的同一性，或者小于25％的同一性。

实施本公开的方式

本公开涉及具有独特的模块化CRISPR-Cas9架构的新型递送系统，其使得基因编辑具有更好的递送性能、特异性和选择性。其较之前描述的split-Cas9系统而言代表着显著的改进。该模块化架构是“可调节的”。本发明其他方面涉及可以在空间和时间上同时受控的系统，导致可诱导编辑的可能性。本发明还有其他方面涉及一种能够与归巢剂偶联的经修饰的病毒衣壳。

Split-Cas系统

在一个方面，本公开涉及“split-Cas9”，其中Cas9被剪切成两半——C-Cas9和N-Cas9，并与两个内含肽部分或一个“分裂的内含肽(split intein)”融合。参见，例如Volzet al.(2015)Nat Biotechnol.33(2):139-42；Wright et al.(2015)PNAS 112(10)2984-89。“分裂的内含肽”来自两个基因。“分裂的内含肽”的非限制性实例为最初衍生自蓝细菌的C-内含肽和N-内含肽的序列。非限制性的示例性split-Cas9具有包含574-1398位残基的C-Cas9和包含1-573位残基的N-Cas9。dCas9的示例性split-Cas9涉及包含这些dCas9的相同残基的两个结构域，表示为dC-Cas9和dN-Cas9。

以下提供了这些split-Cas9模块的非限制性的示例性序列。氨基酸编号是基于野生型Cas9提供的。

C内含肽(粗体)+CCas9(正常)(H840，粗体下划线，未修饰序列)

或其生物等价物。

C内含肽(粗体)+dCCas9(正常)(H840A，粗体斜体，修饰序列)

NCas9(正常)(D10，粗体下划线，未修饰序列)+N-内含肽(粗体)

或其生物等价物。

dNCas9(正常)(D10A，粗体斜体，修饰序列)+N-内含肽(粗体)

或其生物等价物。

本发明公开的方面涉及一种用于基于CRISPR的基因组编辑或表观基因组编辑的重组表达系统，其包含、或者可选地基本上由以下组成，或者进一步地由以下组成：(a)第一表达载体，其包含(i)编码C-内含肽的多核苷酸，(ii)编码C-Cas9的多核苷酸，和(iii)启动子序列；以及(b)第二表达载体，其包含(i)编码N-Cas9的多核苷酸，(ii)编码N-内含肽的多核苷酸，和(iii)启动子序列，其中第一表达载体和第二表达载体的共表达导致功能性的Cas9蛋白的表达。

在一些实施方案中，重组表达系统的第一表达载体和第二表达载体都是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。

向本发明公开的载体添加效应元件能够调节Cas9的表达，从而调整重组表达系统以用于基于CRISPR的基因组或表观基因组编辑中的特定用途。以下提供了非限制性的示例性效应元件及其在所公开的“split-Cas9”和/或重组表达系统的背景下的用途。应当理解的是，下文描述的每个效应元件均是在重组表达系统中的特定功能的背景下描述的。因此，当需要一种以上的这些功能时，这些效应元件可以在重组表达系统中组合使用。相反地，在仅需要这些功能之一的情况下，在重组表达系统中仅可使用相应的效应元件。

时间调节的效应元件

在一个方面，重组表达系统的第一载体和/或第二载体包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由能够诱导表达的效应元件组成，其中引入特定的外部试剂从而诱导载体进行表达。通常来说，这种诱导之所以能够实现，是由于特异性试剂和效应元件之间的相互作用能够使得转录或翻译的完成。

这种诱导型开关的一个非限制性实例是四环素依赖性系统，在本发明中称为“Tet-ON”系统。Tet-ON系统包含四环素反应元件(“TRE”)，其作为TRE下游基因的转录抑制因子，以及相应的四环素调控的激活因子(“tet-调控的激活因子”，其与TRE结合，并且允许在TRE下游基因的表达。tet-调控的激活因子需要四环素或其衍生物(例如但不限于多西环素)的存在下才能与TRE结合。因此，通过使用Tet-ON系统，TRE下游基因的表达可以通过四环素或其衍生物(例如但不限于多西环素)的添加来“开启”，前提是tet可调节元件也已经被转录。

在一些实施方案中，TRE包含TetO，或任选地其一个或多个重复单元，或其七个重复单元。TetO的典型核酸序列是：ACTCCCTATCAGTGATAGAGAA。TRE可以进一步地包含启动子序列。包含七个TetO重复单元和最小CMV启动子的此类TRE的非限制性实例如以下核酸序列所示：

tetO7-minCMV启动子

TTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAA

或其生物等价物。

另一个示例性的序列包含七个重复的TetO单元：

tetO7

TTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAA

或其生物等价物。

在一些实施方案中，tet调控的激活因子包含rtTA，也称为“反向四环素控制的反式激活蛋白”。参见例如Gossenet al.(1995)Science 268(5218):1766-1769。当在不仅编码基因的载体(即多顺反子载体)中提供有tet-调控的激活因子时，tet-调控的激活因子可以进一步地包含“自切割”肽，其允许其与其他载体产物解离。这种自切割肽的非限制性实例是2A，其是最初在小核糖核酸病毒中发现的短蛋白质序列。肽2A的功能是通过使核糖体跳过2A元件的C末端的肽键的合成，导致2A序列的末端与其下游的肽之间的分离。这种“切割”发生在C末端的甘氨酸和脯氨酸残基之间。下面提供了包含2A和rtTA的tet-调控的激活因子的非限制性的示例性氨基酸序列：

2A(粗体)+M2rtTA(正常)(tet激活因子)

或其生物等价物。

在一些实施方案中，Tet-ON系统可以整合到分裂的Cas-9系统中，例如本发明公开的重组表达系统。

在一些实施方案中，第一载体包含四环素响应元件(“TRE”)，第二载体包含四环素调控的激活因子“tet-regulatable activator”。在一些实施方案中，第二载体包含TRE，第一载体包含tet调控的激活因子。

图中描绘了一个非限制性实例：对于C-Cas9载体而言，包含Tet操纵子(TetO)的TRE和最小CMV启动子，对于N-Cas9载体而言，包含可选择性地添加的rtTA的tet调控的激活因子。将多西环素引入系统使得rtTa与TetO结合并启动C-Cas9的转录，从而促使基因编辑。(图3)。申请人已在体内测试了该非限制性的示例性系统，并证明了在DOX+小鼠中观察到了编辑，但在DOX-小鼠中未观察到编辑(图7)。

组织特异性的效应元件

在一个方面，重组表达系统的第一载体和/或第二载体包含、或者可选地基本上由、或者进一步地由提供组织特异性表达的效应元件或“回路”组成，即，载体的表达由存在于一种或多种特定组织中的一种或多种试剂诱导，该试剂例如蛋白质、寡核苷酸或其他生物组分。

诸如此类回路的非限制性实例是可调的microRNA(“miRNA”)回路或开关。miRNA开关是基因表达的阻遏因子或激活因子，其可被设计为由microRNA进行正向调节或负向调节。

MircoRNA是小的非编码RNA分子，其通过与靶mRNA配对并使mRNA链中的一个或多个切割成两个片段、通过缩短poly(A)尾部使mRNA不稳定、和/或降低mRNA翻译的效率，从而沉默mRNA。多种数据库中编目了在特定组织中表达的特定miRNA，例如在miRmine(guanlab.ccmb.med.umich.edu/mirmine/)和MESAdb(konulab.fen.bilkent.edu.tr/mirna/mirna.php)中。以下提供了可能与本发明相关的miRNA和相应的miRNA靶标的非限制性实例：

HeLa:

miR-21-5p:uagcuuaucagacugauguuga

插入靶标:TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGATCTA

HUVEC:

miR-126-3p:ucguaccgugaguaauaaugcg

插入靶标:CGCATTATTACTCACGGTACGAAGATCAC

心脏:

miR-1a-3p:uggaauguaaagaaguauguau

插入靶标:ATACATACTTCTTTACATTCCAAGATCAC

肝脏:

miR-122a-5p:uggagugugacaaugguguuug

插入靶标:CAAACACCATTGTCACACTCCAAGATCAC

或其各自的生物等价物。通过选择组织特异性的miRNA并产生由该miRNA靶向的miRNA回路，可以校准载体表达以使其具有高度组织特异性。

例如，示例性的载体可以包含由表达的阻遏因子组成的miRNA回路，该阻遏因子由miRNA中的5'UTR的靶位点负调控。因此，如果载体被递送至表达miRNA的靶组织类型，则该阻遏因子被抑制，并相应的载体被激活。相反，如果载体被递送至不包含miRNA位点的不正确的组织类型，则该载体被抑制。

在一些实施方案中，第一载体和/或第二载体整合了靶向特定组织的miRNA开关。图5中提供了这种整合的非限制性的示例性示意图。在一些实施方案中，miRNA开关包含由miRNA靶标负调控的表达阻遏因子。

基因编辑的效应元件

由于本发明公开的重组表达系统可以使用有活性的或失活的Cas9，从而可以整合多种任选地效应元件以促进根据本发明所述的思路的基因编辑。

敲除和敲入：本发明公开的重组表达系统是基于CRISPR的基因组或表观基因组编辑而设计的。一般来说，基于CRISPR的基因组或表观基因组编辑依赖于Cas9的功能以促进gRNA和靶序列之间的配对。通常将gRNA设计为靶向特定的靶基因，并且可以进一步地包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)。在将Cas9-gRNA复合物与靶基因配对后，活性Cas9酶可以触发靶特异性切割以破坏基因，并且任选地敲除或敲入基因。这是CRISPR-Cas9基因编辑所采用的传统方法，并且证明对于治疗应用非常有用，特别是对于遗传疾病的治疗。

可选地，如果使用失活的Cas9(“dCas9”)，可以构建Cas9-gRNA复合物以用于不同的编辑效果，包括但不限于编辑；下调，抑制或沉默；上调，过度表达或激活；或改变靶基因的甲基化。

基础编辑：在一些实施方案中，基础编辑的方法可以整合到重组表达系统，例如，采用dCas9的split-Cas9双AAV系统。

例如，第一载体和/或第二载体中可以掺入指导胞苷转化为尿苷的胞苷脱氨酶(从而可用于定点突变)。这种方法不需要双链断裂，并且在不引入随机插入缺失(indel，这是传统CRISPR-Cas9基因编辑所带来的风险)的情况下通过点突变进行有效的基因校正。因此，该系统通过最小化脱靶随机插入缺失，来提高产品选择性。该方法的一个非限制性实例为采用第三代基础编辑器APOBEC-XTEN-dCas9(A840H)-UGI(公开在Komor等人(2016)Nature 533：420-424和补充材料中)，其中在编辑的U的对面的非编辑链包含一个G，从而形成一个缺口。包含来自Komor等人的APOBEC1的Cas9的构建体，可以适用于该重组表达系统，例如，本发明公开的split-Cas9系统提供如下：

BE3(rAPOBEC1(粗体，下划线)-XTEN-Cas9n-UGI-NLS)

其他实例包括但不限于人AID(UniProt Ref No.Q7Z599)、人APOBEC3G(UniProtRef No.Q9HC16)、大鼠APOBEC1(UniProt Ref.No.P38483)和七鳃鳗CDA1(GenBank RefNo.EF094822)。在基础编辑的实施方案中，基础编辑器使用Cas9切口酶。这导致Cas9的两个切割结构域中只有一个发生突变，并且同时保留了产生单链断裂的能力。例如，图37中提供的示例性的碱基编辑构建体将在Cas9切割的结构域中含有D10A突变。在一些实施方案中，该方法可用于体内环境。

在一些实施方案中，重组表达系统中的第一载体和/或第二载体编码胞苷脱氨酶，其指导胞苷向尿苷的转化，因此可用于定点突变。

阻遏和激活：本发明的一些方面涉及使用dCas9进行基因组调节的重组表达系统的用途。通过传统的CRISPR-Cas9模型进行基因编辑的一个问题是在永久性编辑基因后可能产生的未知效应。这是一个值得关注的问题，因为有许多基因具有未知的功能和与酶相关的杂乱活性。出于这个原因，基因组调控是一个有吸引力的选择，因为其能够控制基因的表达，避免了编辑基因可能带来的后果。在一些实施方案中，该系统被构建用于受控的基因表达。

在一些实施方案中，转录激活因子或转录阻遏因子被任选地整合到重组表达系统，例如，采用dCas9的split-Cas9双AAV系统。在此类实施方案中，设计gRNA以靶向靶基因的启动子。

非限制性的示例性转录阻遏因子是Krüppel相关盒(“KRAB”)，其是高等脊椎动物中高度保守的转录抑制模块，以下提供了其示例性的序列：

KRAB

DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNL

VSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP

或其生物等价物。

非限制性的示例性转录激活因子是VP74、RTa和p65，以下提供了其示例性序列：

VP64

GSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDD

FDLDMLIN

RTa

RDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPA

SLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQA

VKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLN

P65

SQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALL

或其各自的生物等价物。

在一些实施方案中，重组表达系统中的第一和/或第二载体包含KRAB。在进一步的实施方案中，该重组表达系统用于沉默、抑制或下调靶基因。在更进一步的实施方案中，该重组表达系统包含靶向靶基因启动子的gRNA。

申请人已经在体外和体内检测了该系统，并且在体外显示出高达90％的抑制，在体内显示出高达35％的抑制(分别为图8和9)。

在一些实施方案中，重组表达系统中的第一载体和/或第二载体包含VP64、RTa和/或p65。在进一步的实施方案中，该重组表达系统可用于激活、过表达或上调靶基因。在更进一步的实施方案中，该重组表达系统包含靶向靶基因启动子的gRNA。在涉及靶基因的激活、过表达或上调的实施方案中，重组表达系统可以进一步地包含编码用于激活、过表达或上调的靶基因的第三载体。

申请人已经检测了体外的相对表达增加了高达40倍(图11)。

甲基化：在一些实施方案中，甲基化调节剂任选地掺入重组表达系统中；因此，能够进行靶基因的表观遗传修饰。在此类实施方案中，可以设计gRNA以靶向靶基因的启动子。

这种甲基化调节剂的非限制性实例包括但不限于DNMT3A和DNMT3L；其示例性序列如下：

DNMT3A

TYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV

DNMT3L

GSSELSSSVSPGTGRDLIAYEVKANQRNIEDICICCGSLQVHTQHPLFEGGICAPCKDKFLDALFLYDDDGYQSYCSICCSGETLLICGNPDCTRCYCFECVDSLVGPGTSGKVHAMSNWVCYLCLPSSRSGLLQRRRKWRSQLKAFYDRESENPLEMFETVPVWRRQPVRVLSLFEDIKKELTSLGFLESGSDPGQLKHVVDVTDTVRKDVEEWGPFDLVYGATPPLGHTCDRPPSWYLFQFHRLLQYARPKPGSPRPFFWMFVDNLVLNKEDLDVASRFLEMEPVTIPDVHGGSLQNAVRVWSNIPAIRSRHWALVSEEELSLLAQNKQSSKLAAKWPTKLVKNCFLPLREYFKYFSTELTSSL

或其各自的生物等价物。

在一些实施方案中，重组表达系统中的第一载体和/或第二载体包含DNMT3A和DNMT3L中的一种或多种。在进一步的实施方案中，该重组表达系统任选地可以用于改变其甲基化来沉默、抑制或下调靶基因。在更进一步的实施方案中，重组表达系统包含靶向靶基因启动子的gRNA。

特定用途的gRNA

在一些实施方案中，重组表达系统包含gRNA，并且基于其中使用的gRNA定制为特定用途。因此，在一些实施方案中，重组表达系统的第一载体或第二载体编码gRNA。在其他实施方案中，重组表达系统包含编码gRNA的第三载体。在一些实施方案中，gRNA是双gRNA(dgRNA)或单gRNA(sgRNA)。

本发明公开了针对其定制的gRNA的非限制性的示例性方法方面。在给出示例性gRNA的情况下，大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子区域。

应当理解的是，当所公开的gRNA可以设计用于特定的哺乳动物物种例如小鼠或人时，可以使用本领域已知的技术和工具发现同源基因和其中的gRNA，例如使用蛋白质和基因的数据库，包括但不限于GenBank、BLAST、UniProt、SwissProt、KEGG和GeneCards。此外，经验证的特定目标和物种的gRNA序列可以在许多gRNA数据库中找到，例如Cas数据库(rgenome.net/cas-database/)或通过AddGene(addgene.org/crispr/reference/grna-sequence/)或GeneScript(genscript.com/gRNA-database.html)。还应当理解的是，对于这些非限制性的示例性方法和/或与gRNA和/或靶基因相关的任何其他疾病或病症，可以通过重组表达系统靶向这些gRNA和/或靶基因。

应当理解的是，当本发明使用术语“阻遏”时，其旨在与使用转录抑制因子的重组表达系统一起使用，该转录抑制因子例如但不限于KRAB、dCas9以及一种或多种公开的gRNA；该术语意指例如通过下调、抑制和/或沉默来达到降低或消除靶基因的表达的效果。类似地，当本发明使用术语“激活”或“过表达”时，其意指将转录激活因子应用在重组表达系统中，该转录激活因子例如但不限于VP64、RTa和p65、dCas9以及一种或多种公开的gRNA；该术语意指例如通过上调、活化和/或过表达来达到增加靶基因的表达的效果。更普遍地是，“调控”可指与使用dCas9的重组表达系统一起使用的gRNA，而“编辑”可指与使用激活的(或“有活性的”)Cas9的重组表达系统一起使用的gRNA。

疼痛控制：在一些实施方案中，在重组表达系统中使用gRNA以靶向控制疼痛。长期使用阿片类药物可能会造成药瘾和药物滥用，而据估计全世界有3240万人滥用阿片类药物。此外，在西欧和中欧有16％，同时在亚洲有45％，在北美有22％的首次戒毒患者正寻求阿片类药物滥用的治疗。此外，最近的一份报告将吗啡的使用与慢性压迫性损伤的持续时间加倍联系起来，并预测持续的疼痛是大量使用阿片类药物治疗慢性疼痛的结果。因此，找到其它针对疼痛的方法可能对全世界人口都有益。众所周知，有些人类和小鼠中的SCN9A基因(编码电压门控钠通道Nav 1.7)中存在引起功能丧失的突变，并且会引起阿片肽基因的表达量增加，其具有从低到高的疼痛不敏感性。人类和小鼠具有导致该表型的SCN9A中的点突变，包括18个错义突变从而导致单个氨基酸的取代和一个框内缺失。以下提供了靶向SCN9A的示例性gRNA序列：

人类SCN9a设计

1:GGAAAGCCGACAGCCGCCGC

2:GGCGCGGGCCTCTCCTTCCC

3:GAGCACGGGCGAAAGACCGA

4:GTGTGCTCTTAAGGGGTGCG

5:GTGGCGGTTGAGGCGAGCAC

鼠SCN9设计

1:GACCCATGTAACAACTCCAC

2:GTGTATATTGTTGAACCCGT

3:AACAACTCCACTGGAGTAGA

4:CAAACTGTTAAGAAACGGGC

5:GGTTCTGGCAAAATTGCTGT

或其各自的生物等价物。

不受理论束缚，申请人认为使用活性Cas9会对疼痛的控制造成风险，其程度可能导致对疼痛的永久不敏感和/或嗅觉丧失。具体地，申请人意识到SCN9A基因中的突变也可导致嗅觉神经元中功能性NAV1.7钠通道的丧失，从而导致嗅觉丧失。因此，上文提供的示例性gRNA被设计为靶向SCN9A的启动子区域，并且可以用于本发明公开的使用了dCas9的重组表达系统的实施方案中。使用这些gRNA的目的是沉默或下调SCN9A。

例如，申请人在一个方面公开了将dCas9的重组表达系统，例如双pAAV9_gSCN9a_dCas9系统，用于(i)预防手术期间的疼痛，其中患者在手术前施用重组表达系统，或(ii)慢性疼痛的应用。不受理论束缚，重组表达系统的量可以每一次能有效地使患者的疼痛降低约一个月。

可以靶向控制疼痛的其他基因包括其他钠通道，例如Nav 1.8(SCN10A基因)、Nav1.9(SCN11A基因)和Nav1.3(SCN3A基因)，以及瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TrpV1)，也称为辣椒素受体和香草素受体1。其他目的基因包括如下的同样将被抑制或激活的基因。

可用于一些指定靶标的非限制性实例的gRNA包括：

敲除的gRNA：

Nav 1.3:TCGTGGATTTCTATCACTTT

Nav 1.8:CTTGGTAACGTCTTCTCTTG

Nav 1.9:CGATGGTTCCACGTGCAATA

TrpV1:TAAGCTGAATAACACCGTTG

阻遏的gRNA：

Nav 1.3:CCGCTTCCTGTTCTGAGATC

Nav 1.8:GTCACGAGTTCCACCCTGCC

Nav 1.9:CAGCCTGGATGGCTTACCTC

TrpV1:GGGACTTACCAGCTAGGTGC

或其各自的生物等价物。更进一步的示例性gRNA在下文中提供：

或其各自的生物等价物。

或其各自的生物等价物。

肝病：在一些实施方案中，gRNA被设计为靶向肝病和与肝功能障碍有关的病症，例如但不限于疟疾和肝炎。疟疾是一种由寄生虫引起的威胁生命的蚊媒疾病，估计有106个国家和地区的33亿人处于该危险之中——几乎占世界人口的一半。因此，找到预防感染的方法会非常有益。疟疾与肝脏中的三种宿主基因CD81、Sr-b1和MUC13相关。CD81也是丙型肝炎病毒的已知受体。不受理论束缚，据信靶向一种或多种这些基因会阻碍一种或多种这些疾病感染宿主的能力。因此，使用本发明的包含适于调节或编辑这些基因靶标的gRNA的重组表达系统可用于上述疾病的治疗和/或预防。在一些实施方案中，这可以包括预防性施用包含这些gRNA的重组表达系统。用于肝脏疾病(例如但不限于疟疾、丙型肝炎或与这些基因相关的任何其他疾病)的gRNA的非限制性实例包括：

CD81:CGAAATTGAAGACGAAGAGC

MUC13:GGAGACTGAGAGAGAGAAGC

Sr-b1:TGATGAGGGAGGGCACCATG

或其各自的生物等价物。

造血干细胞治疗和HIV：在一些实施方案中，gRNA被设计为防止造血干细胞(HSC)的免疫排斥和/或防止HIV进入宿主细胞。HSC基因疗法可以潜在地治愈多种人类造血疾病，例如镰状细胞性贫血。然而，现在的HSC基因治疗的过程非常复杂和昂贵。目前，造血干细胞移植过程包含从一个人(供体)中取HSC，并将它们输注到另一个人(受体)中。该方法的一些缺点包括由于细胞来自异物而引起的免疫应答(或移植物排斥)。为了防止排斥反应，许多患者还需要化疗和/或放射治疗，这本身就会使患者更虚弱。另一个缺点是移植物抗宿主病(GVHD)，其中来自供体的成熟T细胞将受体组织视为外来物并攻击这些组织。在这种情况下，接受者必须服用药物来抑制炎症和T细胞的激活。有趣的是，CCR5共同受体与HSC移植物的排斥和HIV进入宿主细胞的能力有关。实际上，对HIV有抗性的人类，在CCR5基因有一个突变，被称为CCR5-Δ32，会导致蛋白质被截短从而使HIV不能感染细胞。因此，可以使用具有靶向CCR5的gRNA的重组表达系统应用于这两种应用中。以下提供了非限制性的示例性gRNA：

CCR5gRNA:GGTCCTGCCGCTGCTTGTCA

或其各自的生物等价物。

癌症免疫疗法：癌症免疫疗法是使用免疫系统的组分来对抗癌症，通常通过使用抗体或工程化T细胞来增强身体对癌细胞的免疫应答。通常地，基于T细胞的疗法包括从患者中提取免疫细胞，然后在富集、编辑或治疗后重新输注到患者体内。由于PDCD-1在阻止T细胞免疫应答当中起着重要作用，因此将其敲除可以提高T细胞消除癌细胞的能力，使用这些工程化免疫细胞进行的治疗已经在晚期的癌症患者中产生了一些显著的反应。这种方法还可以用于调节其他非癌症相关的免疫应答。本发明公开了用于此目的的靶向PDCD-1的gRNA的示例性重组表达系统。以下提供了非限制性的示例性gRNA：

PDCD-1靶序列：

1.AGCCGGCCAGTTCCAAACCC

2.AGGGCCCGGCGCAATGACAG

或其各自的生物等价物。

信号通路的异常活动可导致癌症。例如，已有证明nodal基因(TGF-β家族的一部分，例如Uniprot Ref No.Q96S42)的下调可以引起与转移性黑素瘤相关的分子的下调，并且阻断hedgehog信号途径可以阻止肿瘤的生长。因此，重组表达系统可用于下调这些途径中的靶基因，因此可通过设计针对这些靶标的特异性gRNA来用于治疗癌症。

大部分骨髓增生性癌症在JAK-2(例如Uniprot Ref No.O60674)中显示有V617F突变。然而，该突变也存在于HSC群体的个体中。靶向HSC群体中V617F突变的gRNA也在本发明公开的范围内。

血液疾病：疟疾的临床症状发生在疟原虫的生命周期的血液阶段，其侵入宿主并存在于红细胞内，利用宿主的蛋白质和资源满足其自身需要，并导致宿主细胞的改变。某些细胞表面受体如Duffy、血型糖蛋白(Glycophorin)A/C等已被证明对寄生虫进入红细胞是至关重要的。此外，寄生虫严重依赖于红细胞中的丙酮酸激酶。据信敲除这些基因会赋予对疟原虫入侵的抵抗力。为此，提供以下用于构建体的非限制性的示例性gRNA：

GYPA

1.TCTTCAAATAACCACTCCTG

2.TCAGCAACAATGTCAACACC

GYPC

1.GGCAATCTCCATAATGCCGT

2.TATCCACAGAGCCTAACCCA

PKLR

1.TGTACGAAAAGCCAGTGATG

2.GGGTTCACTCCAGACCTGTG

ACKR1(Duffy)

1.AAGGTCTGAGAATCGCGAAG

2.CATTCTGGCAGAGTTAGCAG

或其各自的生物等价物。

肌营养不良症：在其他基因中，异常肌营养不良蛋白与肌营养不良症有关。表1中公开了可用于肌营养不良症和其他神经变性疾病的示例性gRNA。

特异性靶向子宫内胎儿：特定的gRNA可以设计成一个例如来自胎儿父体的载体突变，这将使重组表达系统能够特异性地靶向胎儿而不是子宫内的母体。因此，如果胎儿出现母体不存在的患病基因型时，可以在子宫内解决而不影响母体的基因组。

基于细胞色素P450的病症：已知细胞色素P450酶CYP2D6(例如UniProt RefNo.P10635)与各种各样的药物代谢有关。这种酶的多态性由部分特定群体(例如高加索人)表达，阻止可待因转化为吗啡——一种缓解疼痛的药物。可待因快速的和完全的代谢需要CYP2D6的至少两个活性的或功能性的拷贝。对于具有2个CYP2D6无活性拷贝的患者，提供位于重组表达系统中的gRNA以激活或过表达患者中的至少1个CYP2D6活性的拷贝，从而允许可待因的代谢。

在某些底物的存在下或暴露于某些生理条件下，细胞色素P450(CYP)可产生活性氧(ROS)或产生破坏正常代谢或破坏体内组织的代谢物。因此，能够诱导CYP基因的激活或抑制不仅可以防止药物-药物相互作用的毒性，而且可以防止导致代谢辅助因子异常水平的情况。

更普遍地，可以使用靶向gRNA解决不一致的药物反应，所述靶向gRNA被设计用于激发对患者有益的下一代药物-药物的相互作用。

重编程巨噬细胞：巨噬细胞含有由趋化因子和细胞因子极化的不同亚群，并最终影响免疫应答是促进炎症还是促进再生。具体的gRNA可以用于重组表达系统中以靶向巨噬细胞，并且驱动针对M2巨噬细胞的表型以用于前再生病症(pro-regenerativeconditions)当中。

驱蚊：虽然原因似乎在很大程度上是未知的，但是蚊子和其他昆虫倾向于叮咬某些人而避开其他人。一项对双胞胎的研究表明，这种吸引力似乎存在遗传因素，但具体基因尚不清楚。影响蚊子吸引力的另一个因素是宿主发出的气味。通过选择可以改变引起这种吸引力的基因或引起人类产生排斥蚊子的物质的gRNA，该重组表达系统可以为访问已知具有携带疾病的昆虫的区域的人们提供一定时期的保护。靶向骨髓中HSC的gRNA可以相应地防御蚊子，其也在本发明公开的范围内。

阿尔茨海默氏症：研究人员已经表明，B-淀粉样蛋白与LilrB2的结合(例如UniProt Ref No.Q8N423)是导致阿尔茨海默病的第一步。因此，本发明考虑将gRNA用于重组表达系统，其相应地能够在LilrB2的D1D2区域中引起点突变，从而影响B-淀粉样蛋白的结合以预防阿尔茨海默病的发作。D1与Uniprot Ref No.P21728相关联。D2与Uniprot RefNo.14416相关。下文提供了其非限制性的示例性序列：

多巴胺受体D1

多巴胺受体D2

甲状腺激素的产生：甲状腺疾病(甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症)影响了大量的人群。选择gRNA用于重组表达系统，从而能够调节甲状腺激素并能够治疗或预防这些疾病。

效应元件的排序

应当理解的是，本发明公开的效应元件可以以多种方式构建，这取决于本发明公开的重组表达系统，例如，split-Cas9系统中两种载体中每一种载体的可用空间。此外，应当理解的是，本发明公开的效应元件可任选地用于Cas9系统，其包含编码完整Cas9蛋白的一种载体和编码用于基于CRISPR的基因组或表观基因组编辑的必需gRNA的另一种载体。图5提供了以这种方式使用的miRNA回路的示例性示意图。图中提供了本发明公开的各种效应元件的非限制性的示例性示意图以及排序。

例如，可以将用于激活的效应元件(例如VP64、RTA、P65)、抑制的效应元件(例如KRAB)和/或改变甲基化的效应元件(例如DNMT3A、DNMT3L)置于重组表达系统(例如split-Cas9系统)的第一表达载体或第二表达载体上。

TRE和tet调控的激活因子必须在重组表达系统中的两种不同载体中进行编码。在一些实施方案中，tet调控的激活因子在N-Cas9编码载体中编码，TRE在C-Cas9编码载体中编码。在一些实施方案中，上述顺序可以颠倒，其中TRE在N-Cas9编码载体中编码，并且tet可调控的元件在C-Cas9编码载体中编码。

启动子的放置也是所公开的构建体中的考虑因素。在一个方面，包含gRNA的构建体应具有在其上游编码的启动子，任选地是U6启动子。类似地，包含Cas9或split-Cas9的两半中的任意一半的构建体应具有在其上游编码的启动子，任选地是CMV启动子。

衣壳改造

本发明公开的方面涉及经工程改造以赋予有利特征的病毒衣壳，例如但不限于添加一种或多种非天然氨基酸和/或SpyTag序列或相应的KTag序列。在一些实施方案中，病毒衣壳是AAV衣壳或慢病毒衣壳。

可以修饰衣壳上的多个位点以掺入一种或多种非天然氨基酸、SpyTag序列或KTag序列。在一些实施方案中，表面暴露位点被鉴定为是掺入一种或多种非天然氨基酸、SpyTag序列或KTag序列的合适位点。AAV2衣壳中此类位点的非限制性实例是AAV2中VP1的第447、578、87和662位残基。在一些实施方案中，用于掺入一种或多种非天然氨基酸、SpyTag序列或KTag序列的位点是不损害AAV功能的位点。关于AAV2，已知其某些表面残基可完美地组装，例如，第509-522和561-565位残基，赋予结合HSPG的功能，例如，第586-591、484、487和K532位残基。第138和139位残基是暴露在表面的并且发现其位于VP2的N-末端，该VP2包含在AAV2衣壳中。在第139、161、459、584和587位残基可以插入多达15个氨基酸。

非天然氨基酸(也称为“UAA”或“非常规氨基酸”)是可以天然存在的或化学合成的氨基酸，但不属于被用于在天然的真核生物和原核生物中进行蛋白质合成的22种常规氨基酸之一。其非限制性实例包括β-氨基酸、同型氨基酸(homo-amino acids)、脯氨酸和丙酮酸衍生物，3-取代丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸、以及N-甲基氨基酸。描述了非限制性的示例性非天然氨基酸并且可以通过SigmaAldrich(sigmaaldrich.com/chemistry/chemistry products.html？TablePage＝16274965)商购获得。进一步的非限制性实例包括N-ε-((2-叠氮基乙氧基)羰基)-L-赖氨酸、吡咯赖氨酸和其他赖氨酸衍生物。

在一些实施方案中，非天然氨基酸包含叠氮化物或炔烃。通过选择非天然氨基酸中包含的官能团可以促进使用点击化学以向病毒衣壳进一步添加其他部分。例如，叠氮化物-炔烃的添加提供了一种将额外的官能团结合到氨基酸上的直接方式。

在一些实施方案中，非天然氨基酸是带电荷的或不带电荷的或极性的或非极性的。在一些实施方案中，非天然氨基酸是高度带负电荷的或高度带正电荷的。非天然氨基酸的电荷和极性的选择取决于使用病毒衣壳进行的后续步骤。例如，如果使用脂质体包被病毒衣壳，则可能需要带有高负电荷的非天然氨基酸。

将非天然氨基酸掺入蛋白质中的方法是本领域已知的，并且包括使用重新指定的终止密码子(例如琥珀型压制)的正交翻译系统。用于进行此类添加的正交tRNA合成酶的非限制性实例包括但不限于MbPylRS、MmPylRS和AcKRS。通过使用其他试剂可以进一步加强非天然氨基酸的掺入。一个非限制性的示例是eTF1，其示例性序列在下面提供：

eTF1(正常)-E55D(粗体斜体，修饰序列)

可以使用类似的方法将SpyTag或KTag掺入到病毒衣壳上。已知SpyTag的序列是AHIVMVDAYKPTK，其与相应的KTag序列ATHIKFSKRD配对，并在SpyLigase存在下相连——SpyLigase是可通过AddGene市售获得并且与GenBank Ref No.KJ401122相关的酶——并且在一些情况下是自发的。

下述来自AAV2和AAV-DJ的AAV序列提供了可以掺入非天然氨基酸、SpyTag或KTag序列的示例性位置。

AAV2VP1(正常)(R447(粗体)；S578(粗体下划线)；N587(粗体斜体)；

AAV-DJ VP1(normal)(N589(bold underline))

除非另有说明，否则提及的AAV2或AAV-DJ VP1序列中的氨基酸位置是基于上述公开的序列中残基的位置。此外，当提及每个AAV的VP1时，其旨在还包括其生物等价物。

在一些实施方案中，掺入衣壳中的一种或多种非天然氨基酸、SpyTag或KTag被用于引入衣壳表面的其他部分或“假型化”。所述部分包括但不限于肽、适体、寡核苷酸、亲和体、DARPin、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白或粘附蛋白。各种各样的部分可用于许多功能，包括病毒的分离、病毒与另一种病毒的连接，和/或允许病毒归巢到特定的靶细胞、器官或组织。

这种假型化可以通过点击化学来实现。当将SpyTag掺入衣壳时，点击化学涉及KTag与待假型化部分的偶联。通过调整反应以促进SpyTag与KTag的连接(例如通过引入SpyLigase)，将该部分添加到衣壳的表面。用于这种假型化的序列的非限制性实例是偶联至物质P和RVG的KTag，这两种试剂用于疼痛控制中神经元的归巢：

KTag-物质P:ATHIKFSKRD GSGSGS RPKPQQFFGLM

物质P-KTag:RPKPQQFFGLM GSGSGS ATHIKFSKRD

RVG-Ktag:YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG GGK GG GSGSGS ATHIKFSKRD

KTag-RVG:ATHIKFSKRD GSGSGS GGK GG YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASNG

或其各自的生物等价物。

应当理解的是，虽然上述示例性的实施方案显示了SpyTag在衣壳上的应用和KTag在某部分上的应用，但反过来也可以实现，即，将KTag掺入衣壳中并将SpyTag与某部分偶联。关于非天然氨基酸，叠氮化物-炔烃反应(任选地由铜催化)可用于添加具有相应官能团的部分(例如，非天然氨基酸包含叠氮化物，某部分包含炔烃，反之亦然)。

在一些实施方案中，工程化的衣壳可用于连接至病毒以进行共同递送。这种连接对于递送本发明公开的重组表达系统特别有用，其中Cas9编码为split-Cas9，即在两个载体中。例如，一个衣壳可以包括SpyTag而另一个衣壳可以包括KTag；因此，可以通过催化SpyTag与KTag之间的连接来连接病毒。类似地，叠氮化物-炔烃反应可用来促进病毒的连接，其中一种病毒包含含有叠氮化物的非天然氨基酸，另一种包含含有炔烃的非天然氨基酸。可以使用一种或多种假型化的部分来开发连接的病毒的其他实施方案，其中两种病毒均表达彼此杂交或可以自发地或通过催化连接的部分。

在进一步的实施方案中，衣壳可以设计用于免疫屏蔽。与病毒衣壳如AAV的广泛接触，会导致受试者携带针对许多天然病毒血清型的中和性抗体。在一些实施方案中，可通过缺失或改组来修饰衣壳以逃避免疫系统；在一些实施方案中，该衣壳可以与外来体结合。在一些实施方案中，掺入或使用特定的试剂来包被衣壳以进行免疫屏蔽。例如，可以添加聚合物如聚(乳酸-共-乙醇酸)、PEG、VSVG进行包被，和/或脂质/胺(例如脂质体)进行包被。

免疫屏蔽的一个非限制性实例是脂质体的包被。例如，炔烃-寡核苷酸可以与包含衣壳的非天然氨基酸连接。然后用脂质体洗涤修饰的病毒，从而又形成包衣。

为了靶向特定组织，可以对衣壳进行进一步的修饰。如上所述，“归巢”部分可用于假型化当中，以确保衣壳定位于特定的靶细胞、器官或组织。

应当理解的是，可对本领域已知的衣壳进行进一步修饰，以使其适用于特定的方法方面，例如但不限于美国专利号7,867,484、7,892,809、9,012,224、8,632,764、9,409,953、9,402,921、9,186,419、8,889,641、7,790,154、7,465,583、7,923,436、7,301,898、7,172,893、7,071,172、8,784,799、7,235,235、6,541,010、6,531,135、6,531,235、5,792,462、6,982,082、6,008,035、5,792,462、9,617,561、9,593,346、9,587,250、9,567,607、9,493,788、9,382,551、9,359,618、9,315,825、9,217,159、9,206,238、9,198,984、9,163,260、9,133,483、8,999,678、8,962,332、8,962,233、8,940,290、8,906,675、8,846,031、8,834,863、8,685,387；美国专利公开号2016/120960、2017/0096646、2017/0081392、2017/0051259、2017/0043035、2017/0028082、2017/0021037、2017/0000904、2016/0271192、2016/0244783、2916/0102295、2016/0097040、2016/0083748、2016/0083749、2016/0051603、2016/0040137、2016/0000887、2015/0352203、2015/0315612、2015/0230430、2015/0159173、2014/0271550，以及与这些专利和专利出版物或其受让人或发明人相关的其他同族成员中所述的那些方面。

组合物和方法

本发明公开的方面涉及工程化以赋予良好性能的重组表达系统(split-Cas9)和病毒衣壳的用途，例如但不限于单独或彼此组合，例如以组合物的形式添加一种或多种的非天然氨基酸和/或SpyTag序列或相应的KTag序列。

例如，本发明公开的重组表达系统中包含的两种载体可以各自包装在工程化的病毒衣壳中，该病毒衣壳被工程化以掺入一种或多种非天然氨基酸、SpyTag序列或KTag序列。可选地，可以将一种或多种的载体包装在未修饰的病毒衣壳中。

该组合物提供了如上所述的优势，特别是连接split-Cas9系统中的两个部分以确保两个载体的递送。此外，在病毒衣壳被假型化的实施方案中，可以通过使用归巢部分实现组织特异性的递送。

在一些实施方案中，可以将重组表达系统、如本发明所公开的工程化的病毒衣壳、和/或通过本发明所述的工程化从而包含在两种病毒衣壳中的包含split-Cas9系统的两种载体递送至受试者。在一些实施方案中，可以基于所治疗的受试者或病症确定其施用途径和剂量。

本发明公开了针对具体用途改造的gRNA，包括但不限于疼痛的控制、肝病、HSC疗法、HIV、癌症免疫疗法、血液疾病、肌营养不良症、特异性靶向子宫内胎儿、基于细胞色素p450的病症、重编程巨噬细胞、驱蚊、阿尔茨海默氏症和甲状腺激素的产生。可以针对这些用途中的每一种来优化重组表达系统中使用的效应元件以及病毒衣壳的假型化。

例如，对于疼痛的控制，上文公开的归巢肽允许病毒衣壳靶向神经元，从而赋予了组织特异性。本发明公开的赋予此类组织特异性的其他方面包括但不限于在重组表达系统中使用对神经元特异的miRNA回路和/或使用本发明特异性的gRNA。

癌症免疫疗法中的另一个实例是信号传导途径的调节。由于仅有少数调节全身基因表达的途径，因此本申请中的组织特异性至关重要。病毒衣壳中miRNA回路、组织特异性的启动子、以及掺入对目标癌症特异的归巢肽的使用，可以确保治疗仅影响期望靶标中的基因。

关于HSC疗法和涉及HSC的血液疾病，申请人认为递送途径可能是重要的，因此建议原位或体内递送病毒，例如但不限于直接将本发明公开的重组表达系统或组合物注射到骨髓——其是造血干细胞(HSC)的储库或供T细胞成熟的胸腺。类似的骨髓递送可用于原位或体内的T细胞编辑和/或HSC编辑从而用于免疫疾病(例如使用靶向gRNA的PDCD-1)和/或癌症治疗。可以基于组织特异性的gRNA或其他效应元件的选择来特异性地编辑HSC和/或T细胞；从而治疗和/或预防免疫疾病。相信这种原位或体内的方法比目前的治疗更有效，目前的治疗严重依赖于离体修饰和移植细胞(例如HSC和T细胞)，并且与HSC移植或T细胞移植的高可能性相关。此外，原位或体内递送具有降低此类细胞疗法成本的巨大潜力。

可选地，在涉及HSC和/或T细胞的这些与癌症相关的实施方案中，可以离体修饰患者的HSC和/或T细胞并递送给患者(例如通过直接注射到骨髓中)。然后，修饰的细胞可以在体内进行扩增。在一些实施方案中，在消除了导致该疾病的先前存在的细胞群之后，向患者施用这些修饰的细胞。

在与甲状腺相关的实施方案中，可以使用具有时间调节的dCas9系统，以及任选地，修饰后可用于归巢到甲状腺的病毒衣壳。

其他方法的方面可包括重组表达系统的递送和/或病毒衣壳可使用水凝胶。水凝胶已被用作一种体内药物递送的生物材料。已广泛研究了在一定条件下优化药物的包被和释放。通过调节水凝胶的释放性质，可以根据离散的pH水平、温度或生理条件控制重组表达系统和/或病毒衣壳的特异性递送。例如，可以通过调节重组表达系统和/或病毒衣壳的在较低pH水平的收缩和释放，从而递送它们到例如发炎区域。此外，并且不受理论束缚的话，优化的水凝胶可以将重组表达系统和/或病毒衣壳保持在适当的位置，并且防止非特异性的靶向——从而给予受试者更多保护以避免不希望有的副作用。该递送系统可以增加重组表达系统和/或病毒衣壳的特异性。

在采用split-Cas9系统的方法中，两半的Cas9的滴度相等对于确保在递送时产生功能性的Cas9是重要的。可以通过配对包含两种载体的病毒衣壳和/或利用qPCR来靶向每种载体中的独特区域，以确定每种载体相对于滴度对照品(例如ATCC-VR-1616)的滴度来确保两半的Cas9的滴度相等。

本发明还考虑到使用所公开的病毒衣壳来测试生物相容性的方法的方面。测试材料的生物相容性的一种常用方法是使用动物模型，并进行组织学和免疫组织化学来表征每个组织中存在的细胞。除了成本高昂之外，这种方法也是时间密集型和工作量密集型的，并且可能难以量化。一种可能的替代方案是将TK-GFP包装的病毒衣壳引入目标区域。吞噬TK-GFP AAV的巨噬细胞将发光并表达报告基因。利用B细胞和T细胞上的细胞表面受体也可以通过TK-GFP AAV转导，从而在体内定量淋巴细胞。促进巨噬细胞的吞噬作用或操纵淋巴细胞特异性的细胞受体可以定量先天性的和/或获得性的免疫应答。最终，生物材料的测试将变得更加高效和更容易。

适合于本发明使用的剂量可以通过任何合适的途径进行递送，例如，静脉内、经皮肤、经鼻内、经口服、经粘膜的或其他的递送方法，和/或通过单剂量或多剂量的途径。应理解的是，实际使用的剂量可根据所用的重组表达系统(例如AAV或慢病毒)、靶细胞、器官或组织、受试者以及所寻求的效果程度而变化。组织、器官和/或患者的体型和重量也可影响使用的剂量。剂量可以进一步包括另外的药剂，包括但不限于载体。合适载体的非限制性实例是本领域已知的：例如，水、盐水、乙醇、甘油、乳糖、蔗糖、葡聚糖、琼脂、果胶、植物衍生的油、磷酸盐缓冲盐水和/或稀释剂。其他材料，例如WO2017/070605的第[00533]段中公开的那些材料，可以适当地与本发明公开的组合物一起使用。WO2017/070605的第[00534]至[00537]段也提供了用于本发明CRISPR-Cas系统的剂量惯例的非限制性实例。通常来说，本领域技术人员能够很好地理解剂量的考虑因素。

具体实施方式

以下实施例是非限制性的，并且说明了可以在各种情况下用于实施本发明产生效果的各种情况下使用的步骤。此外，以下本发明公开的所有参考文献都通过引用其整体并入本发明。

实施例1-示例性的模块化AAV系统的生成

载体设计和构建

简而言之，通过相应基因块(Integrated DNA Technologies)的顺序组装将split-Cas9mAAV载体构建到商购合成的rAAV2载体骨架当中。关于UAA实验，插入'TAG'代替编码表面残基R447、S578、N587和S662的核苷酸，以合成四个基因块，并使用Gibson组装技术将其插入pAAV-RC2载体(Cell Biolabs)中。关于ETF1-E55D，合成编码蛋白质序列的基因块并通过Gibson组装技术将其插入CAG启动子的下游。

哺乳动物细胞的培养

在37℃和5％CO₂气体的培养箱中，将HEK293T细胞在添加有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂(ThermoFisher Scientific)的达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium，10％)中生长，并且移至24孔板中以便AAV的转导。用pAAV诱导型Cas9载体转染的293T细胞中添加200μg/ml的多西环素。将表达有CD34(CD34+细胞)的造血干细胞在含有StemSpan^TM CD34+扩增添加物(10×)(均来自StemCell Technologies)的无血清StemSpan^TM SFEM II中生长。将CD34+细胞移至96孔板中用于AAV的转导。

AAV病毒的生产

AAV8病毒用于所有体内研究，AAVDJ用于HEK293T细胞中的所有体外研究，AAV6用于CD34+细胞中的离体研究，AAV2用于UAA的掺入研究。

大规模生产：病毒通过索尔克生物研究所(La Jolla，CA)的基因转移、靶向和治疗学(gT3)中心制备或内部自行制备。简言之，在15cm板中使用PEI，7.5μg的pXR-衣壳(pXR-8、pXR-2、pXR-6、pXR-DJ)、7.5μg的重组转移载体和22.5μg的pAd5辅助载体转染80-90％汇合度的HEK293T细胞而生产AAV2/8、AAV2/2、AAV2/6、AAV2/DJ病毒颗粒。72小时后收获病毒，并使用碘克沙醇进行梯度纯化。使用100kDA过滤器(Millipore)浓缩病毒至终体积为约1mL，并使用ITR区特异性的引物，同时设有一个标准品(ATCC VR-1616)进行qPCR定量。

AAV-ITR-F:5’-CGGCCTCAGTGAGCGA-3’and

AAV-ITR-R:5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’.

UAA的掺入：从进行转染的2小时前到收获，将293T细胞在含有0.4mM赖氨酸(与通常存在于DMEM中的0.8mM赖氨酸相反)，并添加有10％FBS和2mM的N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸的DMEM中生长。将含有吡咯基-tRNA和tRNA合成酶的质粒pAcBac1.tR4-MbPyl(来自Peter Schultz的馈赠，Addgene#50832)与衣壳载体pAAV-RC2(及其突变体)、重组转移载体、以及与衣壳载体的比例为5:1的pAd5辅助载体一起共转染到293T细胞中。使用与上述相同的方案进行病毒的收获、纯化和定量。为了进一步量化其功能活性，在转导48小时后进行UAA AAV的流式细胞术分析，使用FACScan流式细胞仪和Cell Quest软件(均为BectonDickinson)分析20,000个细胞。

小规模生产：使用含有HEK293T细胞的6孔板制备小规模的AAV制备物，所述HEK293T细胞为使用PEI与0.5μg的pXR-衣壳、0.5μg的重组转移载体和1.5μg的pAd5辅助载体共转染后的细胞。72小时后收获细胞和上清液，粗提物用于转导细胞。

动物实验

AAV注射：所有动物步骤均根据加利福尼亚大学圣地亚哥分校的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。所有小鼠都是从杰克逊实验室获得的。通过尾静脉注射将AAV在成人C57BL/6J小鼠(10周)中，或者通过IP将AAV注射在新生小鼠(4周)中，注射使用0.5E+12～1E+12的剂量。注射4周后，通过CO₂人道地处死小鼠。收获组织并在RNAlater稳定溶液(ThermoFisher Scientific)中冷冻组织。

多西环素的施用：将在10mL 0.9％NaCl和0.4mL 1N HCl中的200mg多西环素通过IP注射到经pAAV诱导型-Cas9载体转导的小鼠，每周三次，持续四周。

组织学分析：通过CO₂人道地处死小鼠。将肝脏在含有OCT化合物(VWR)的模具中冷冻，并冷冻保存在干冰/2-甲基丁烷悬液中。组织学分析由穆尔斯癌症中心组织学和成像中心设备公司(Moores Cancer Center Histology and Imaging Core Facility，La Jolla，CA)进行。用苏木精和曙红(H&E)对肝的切片染色，并且用抗CD81(BD Biosciences，No.562240)进行病理学分析。

基因组DNA的提取和NGS制备

根据制造商的方案，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取细胞和组织中的gDNA。按如下所述制备下一代测序文库。简而言之，使用KAPA Hifi HotStart PCR Mix(Kapa Biosystems)，用引物通过PCR扩增4-10μg输入的gDNA，所述引物扩增目标位点周围150bp(表2b)。将PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen凝胶提取试剂盒)，并进一步进行PCR纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒)以去除副产物。使用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina试剂盒(NEB)完成文库的构建。用索引引物来扩增10-25ng输入的DNA。然后使用qPCR文库定量试剂盒(Kapa Biosystems，KK4824)来纯化和定量样品。然后，合并样品并以4nM的浓度上样到Illumina Miseq(150bp配对末端运行或150单端运行)上。使用CRISPR GenomeAnalyzer44进行数据分析。

基因表达分析和qRT-PCR

使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取细胞中的RNA，并使用RNeasy Plus Universal试剂盒(Qiagen)提取组织中的RNA。使用Protoscript II Reverse Transcriptase试剂盒(NEB)逆转录1μg的RNA。使用KAPA SYBR Fast qpcr试剂盒(Kapa Biosystems)，并用基因特异性引物(表2a)进行实时PCR(qPCR)反应。将数据以GAPDH或B-肌动蛋白为对照进行归一化。

AAV的假型化

Alexa 594DIBO炔烃的拴系：将AAV2野生型和AAV2-S578UAA与TBS中的Alexa594DIBO炔烃(两种均购于ThermoFisher Scientific)在室温下孵育1小时。用PBS洗掉过量的标记物。将病毒颗粒加入到293T细胞中，转导2小时后对细胞进行成像。

寡核苷酸的拴系和DNA阵列：将寡核苷酸A'和B'(5μM)点样在链霉亲和素功能化阵列(ArrayIt：SMSFM48)上，并在室温下孵育30分钟45。同时，通过点击化学(Click-iT-ThermoFisher Scientific，C10276)将寡核苷酸A与AAV2-N587UAA_mCherry连接，然后用PBS洗涤。接着，用PBS洗涤该阵列，并将修饰的AAV2-N587UAA_mCherry添加到每个孔中，在室温下孵育30分钟，然后用PBS洗涤。最后，向每个孔中加入293T细胞。转导48小时后对细胞进行mCherry的表达成像。

讨论

由于AAV具有温和的免疫应答、长时程的转基因表达、感染多种细胞的能力以及良好的安全性而极受基因转移的偏爱，因此使用腺相关病毒(AAV)作为核心递送试剂构建示例性平台。然而，AAV具有有限的包装容量(～4.7kb)，使其难以掺入大的Cas9样效应蛋白及其融合物，和有效基因及引导RNA表达所必需的组分。因此，申请人利用split-Cas9系统来绕开该限制。在申请人的递送形式中，化脓性葡萄球菌Cas9(SpCas9)蛋白通过利用最初衍生自蓝细菌的分裂内含肽而分成两半，其中每个Cas9的一半部分与其相应的分裂内含肽部分融合，并且一旦共表达时Cas9蛋白质即被重构出来。这种递送形式利用两种rAAV并通过适当设计相应的载体，申请人利用所得的剩余包装能力来实现完全的CRISPR-Cas基因组工程功能(图16)。

申请人首先在体外和体内的方案中证实了跨一系列细胞类型和基因组基因座上的靶向基因组编辑(图16a，16b)，并且值得注意地，申请人还证明了在人CD34+造血干细胞中存在稳健的AAV6介导的编辑。由于点击和运行的方法足以进行基因组编辑，并且事实上优于长时程的核酸酶表达，申请人接下来设计了掺入合成回路以实现CRISPR-Cas编辑活性的小分子调节。在此，设计一个rAAV构建体以在C-Intein-C-Cas9融合体上游承载携带四环素响应元件(TRE)的最小CMV启动子，并且在第二个rAAV构建体中使用完整启动子来驱动N-Intein-N-Cas9融合体和tet-调控的激活因子(tetA)的表达。在多西环素的存在下，tetA与TRE位点结合，使得C-Cas9进行诱导型表达，从而对基因组编辑进行时间调节。申请人在体外和体内的情况下证明了该回路的功能(图16c)。总之，上述系统能够实现基于CRISPR-Cas9的强大基因组编辑，并且tet调控因子的偶联使得能够容易地调节来自AAV的其他持久性基因的表达。

申请人接下来利用失活的split-Cas9蛋白通过融合KRAB结构域来设计靶向基因组的抑制，并通过VP64和rTA结构域的融合来设计靶向基因组的激活(图16d)。使用AAVDJ在HEK293T中进行体外实验，并且在C57BL/6J，10周龄的小鼠中进行体内实验，使用AAV8血清型并且通过尾静脉注射以每只小鼠0.5E12-1E12AAV8颗粒的滴度进行AAV递送。在转导4周后对小鼠进行分析。申请人在体外和体内情况下以及在跨多个基因组基因座上，通过RNA和基于免疫荧光的蛋白质表达的测定，证实了靶向基因的抑制和激活(图16e-j，图18)。值得注意的是，申请人能够在CD81基因座处达到约80％的体内抑制(n＝4)，并且在Afp基因座(n＝4)处的体内激活高于2倍。因此，该系统为基因表达的精细控制铺平了道路，并为体内的基因组工程应用提供了不留疤痕的方法。

随着CRISPR效应子掺入AAV中的可编程性的建立，申请人接下来将注意力转向了在衣壳假型化中实现容易的可编程性。AAV衣壳蛋白通常不容易插入大的肽或生物分子(在没有显著的滴度或功能损失的情况下)。因此，申请人开发了一种新颖且通用的方法，通过利用非天然氨基酸(UAA)介导的生物正交点击化学的结合来规避这种限制，从而实现容易的衣壳修饰。申请人首先在AAV2表面上计算绘制了可接触的氨基酸位点，并将他们的评估集中在潜在的候选位点R447、N587、S578和S662(图17b)。目标的UAA通过在AAV VP1蛋白的相应氨基酸上的重新指定的无义密码子(TAG)进行遗传编码，并使用正交UAA特异性的tRNA/氨酰基-tRNA合成酶(tRNA/aaRS)对进行共翻译以掺入衣壳中(图17a，图19)。从而申请人可以成功地将基于赖氨酸的叠氮化物修饰的氨基酸N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸掺入AAV2的衣壳表面，N587和S578的修饰显示出最高的相对生产滴度和病毒活性(图17c)。

申请人接下来通过两个独立的假型化实验验证了通过UAA的掺入实现的现有衣壳的工程化：一，申请人进行了点击化学反应，将荧光分子Alexa 594DIBO炔烃连接到病毒上，并通过细胞的转导成功地显示了修饰的荧光病毒(图17d)；二，申请人通过点击化学将炔烃标记的寡核苷酸拴系到AAV表面上，并且通过转导在这些上面培养的细胞的作为证据，证明了它们在带有相应互补寡核苷酸的DNA阵列点上的选择性捕获(图17e)。最后，申请人验证了这些UAA修饰的AAV可以掺入基于split-Cas9的基因组工程负载物(图17f)，并实现稳健的基因组编辑(图17g)，从而建立集成的mAAV递送平台。

总之，申请人的方法提供了使用基于Cas9和dCas9的效应子来编辑和调节内源基因表达的简便且直接的方法，并且还通过在其表面上掺入UAA来准备AAV的假型化。该系统具有几个优点，包括由于AAV的负载能力有限(～4.7kb)而利用的分裂-Cas9系统，其最适于进行所有所需基因组工程应用，包括基因组编辑和调控。另外，该系统的另一个优点是可以利用所需的目的辅助元件来优化负载物的转录。申请人表明，他们的mAAV-Cas9系统可用于实现高水平的体内转录抑制(～80％)(图16g，16j)和体内转录激活(>2倍增加)(图16i)。此外，申请人表明，他们的系统可用于在HEK293Ts、CD34+HSCs细胞中体外编辑细胞，以及在C57BL/6J小鼠体内编辑细胞(图16b)。鉴于靶向CD34+HSC的高治疗价值，申请人相信他们的所有AAV系统可以为开发这些细胞的多功能的递送试剂提供强大的资源。重要的是，申请人还用其诱导型合成开关证明了对基因组编辑的时间控制，其能够限制Cas9核酸酶的表达，因此具有高的治疗价值(图16c，16d)。申请人表明，该mAAV系统还允许通过点击化学过程简单快速地将适体添加到衣壳表面。这为衣壳表面的大量可编程的假型化以系统地设计AAV靶细胞类型的特异性，以及研究AAV转导入细胞的基础生物学打开了大门。申请人预期这些载体将补充用于工程化新型AAV载体的其他策略，例如基于定向进化、分子改组和进化谱系分析的载体，并且进一步实现基于模块化部分的适体和调节AAV的活性的其他部分的系统评价。申请人还注意到mAAV系统的一些潜在限制：一，利用split-Cas9系统将降低靶向效率，因为必须将C-Cas9和N-Cas9这两种组分共同递送至目标靶细胞以恢复Cas9的活性；二，通过UAA对衣壳的修饰导致病毒滴度降低1.5-5倍。申请人期望随着局部组织特异性递送技术的改进和AAV生产参数的优化，这些方面将逐步得到解决。综合考虑下来，通过其在掺入CRISPR效应器和衣壳假型化的现成可编程性，申请人预期它们的多功能mAAV合成递送平台将在基础科学和治疗应用中具有广泛的用途。

实施例2-在AAV2衣壳上添加非天然氨基酸

以下是实验步骤的概要：

1.非经典氨基酸掺入的测试

2.插入有TAG的AAV衣壳构建体的产生

3.在其衣壳中含有非经典氨基酸的AAV的产生

4.用MUC-1适体和A549细胞测试假设

5.测试含有MUC-1适体的AAV2是否可用于选择性转导混合细胞群中的A549

6.使用产生的AAV2选择性地将Cas9递送至混合细胞群中的A549并检查基因编辑

7.体内实验：使用AAV2产生的递送CRISPR-Cas9的机制并检查靶细胞中的基因编辑

申请人首先测试了将非经典氨基酸掺入到GFP报告质粒中，该质粒在GFP基因中间含有TAG终止密码子。利用琥珀型抑制，在tRNA、tRNA合成酶和非经典氨基酸的存在下，GFP的表达得以恢复(图13A)。申请人还改变了报告分子与合成酶的比例(1:1，1:2.5和1:5)，结果如图13B所示。

申请人使用了琥珀型抑制的方法将非天然氨基酸添加到病毒衣壳中。申请人加入了终止密码子TAG来代替表面残基R447、S578、N587和S662。申请人设想只有在tRNA/合成酶对和非天然氨基酸存在时才能产生该病毒。迄今为止进行的实验似乎正好向我们展示了这一点。在不存在非天然氨基酸的情况下，病毒的滴度极低，而在添加了非天然氨基酸的情况下，滴度高出好几倍(200×)。申请人产生了4种不同的病毒，其在特定的残基处含有非经典的氨基N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸(图14)。

接下来，申请人设计了含有炔基的MUC-1适体，并且因为该非经典的氨基酸含有叠氮基，其期望通过点击化学将其添加至非经典的氨基。AAV2不能非常有效地感染A549肺癌细胞系。A549细胞在其表面上显示出MUC-1的过表达，申请人认为添加到AAV2上的MUC-1适体将有助于改善病毒对A549细胞的特异性。

实施例3-AAV2-SpyTag

已经在含和不含HSPG结合肽的AAV2衣壳的残基N587处引入了具有接头肽的SpyTag和SpyTag，并产生4种形式的AAV2(图15)。

实施例4-AAV-DJ

为了促进该系统的更广泛使用，申请人还设计了AAV-DJ血清型以类似地方法掺入UAA。为此，基于蛋白质的比对，选择AAV-DJ中的N589作为AAV2中N587的等价位点。申请人观察到AAV-DJ-N589UAA病毒的滴度比AAV2-N587UAA病毒高出5-15倍(图20a)，并证实掺入UAA以分别代替AAV2和AAV-DJ上的残基N587和N589，不会对病毒的活性产生负面影响(图20b)。

血清中AAV中和抗体的普遍存在是将其有效应用于体内研究和治疗的应用当中的主要障碍。因此，申请人推测，如果利用该系统的可编程性，可以赋予AAV衣壳新的表面特性，从而能够一定程度的屏蔽AAV不被AAV抗体中和(图20c)。为了设计这样的“隐形”AAV，我们通过将小分子和聚合物部分拴系在AAV衣壳表面上并分析暴露于已知能够中和AAV抗体^48-50的猪血清后所得的AAV转导能力(图20d)，从而筛选大量的小分子和聚合物部分。有趣的是，申请人观察到通过脂质屏蔽导致了AAV几乎完全能够抵抗基于猪血清的中和。申请人通过将寡核苷酸拴系在AAV表面上来实现这一点，AAV表面又被用于结合商购的脂质聚合物制剂脂质体。值得注意的是，即使在wt AAV-DJ和AAV-DJ-N589病毒被完全中和的条件下，申请人也观察到了脂质包被的病毒的活性(图20d)。申请人进一步证实了这些工程病毒保留了全基因组编辑的功能，特别是在脂质体包衣的存在下，与未修饰的病毒相比，其显示出增强的编辑速率。因此，该方法为AAV衣壳表面特性的可编程控制铺平了道路，从而能够系统地评估调节AAV的活性的小分子和聚合物。

实施例5-用于组织特异性的miRNA

申请人通过使用TK-GFP(胸苷激酶GFP融合蛋白)作为报告基因评估了该示例性系统的特异性和递送性能。TK-GFP允许使用PET/SPECT时对整个动物进行实时体内成像，其能够提供关于病毒感染了哪些组织的空间信息，同时能够提供如qPCR所提供的定量信息。

实施例6-疼痛控制

申请人在C57BL/6J小鼠中测试了它们的疼痛控制系统，总共使用了9只小鼠。将pAAV9_gSCN9a_dCas9系统注射到3只小鼠中，将空载体pAAV9_gempty_dCas9注射到3只小鼠中，并将3只SNC9a突变小鼠(Scn9atm1Dgen)作为阳性对照。申请人还利用人神经细胞在体外测试了人gRNA。

实施例7-CD81的抑制

申请人设计了split-Cas9和split-dCas9系统以靶向肝脏中的三种疟疾宿主基因CD81、Sr-b1和MUC13，以便抑制和编辑它们。这些是疟原虫子孢子感染肝细胞所需的宿主因子。申请人在体内测试了CD81的抑制，并且检测到了35％的抑制(图8和9)。图8表示用AAV8_gCD81_KRAB_dCas9处理过的3只小鼠和6只对照小鼠中CD81的相对表达。图9表示三组的组织学样品：第一组无一抗，第二组是阳性对照，其显示CD81的相对高表达，第三组是递送了AAV8_gCD81_KRAB_dCas9的组，其显示CD81的表达降低。

例8-疼痛控制

疼痛有三个主要特征：持续时间(急性至慢性)，部位(例如肌肉、口面部)，以及诱因(例如神经性损伤、炎症)。申请人使用四种主要类型的疼痛模型(烧伤模型、炎症性、术后的和神经性)来进一步理解：1)我们的治疗目标是什么类型的疼痛和2)我们的治疗是否显示出与传统疼痛控制方法(例如阿片类药物)相似的结果或改进。这些疼痛模型总结在下表中。对于急性伤害感受烧伤模型，申请人使用两种常用的模型：热板试验和足底热痛觉实验(Hargreaves test)，其通常用于评估伤害感受的过程以作为筛选药物的镇痛活性或生理操作的试验。对于第一个模型而言，将动物置于55℃直至动物在有害的热刺激之后引发已知的行为，例如跳跃或舔爪。如果动物在45秒之前均没有响应，则将其从热板上移开以避免组织损伤。然后使用von Frey纤维丝，其具有对数增量刚度(0.41,0.70,1.20,2.00g)的尼龙纤维，来测量机械阈值，从而测量退缩反应。然后在不同的实验中测试热伤害感受反应，称为足底热痛觉实验。简而言之，将小鼠置于加热(30℃)玻璃表面上的有机玻璃隔间中，来自位于玻璃下方的聚焦投射灯泡的光射向一只后爪的足底表面。在损伤后每30分钟测量一次热退缩反应，共持续3小时。然后测量施加光和后足撤回响应之间的时间间隔，其被定义为缩足潜伏期(PWL:s)。对于炎性疼痛模型而言，申请人将来自关节炎转基因K/BxN小鼠的血清注射到野生型小鼠中，以产生具有强烈的和高机械异常性的疼痛的小鼠，其发作与持续2-3周的关节/爪炎症相关。还将测量如前所述的通过von Frey纤维丝的机械阈值。在下一个术后模型中，在麻醉的情况下通过小鼠后爪的足底皮肤、筋膜和肌肉切开切口。在手术后6天，使用von Frey纤维丝在伤口周围的不同区域测量撤回响应。

最后，我们将利用两种神经性疼痛模型：脊柱神经结扎和利用顺铂的化疗。在第一个模型中，脊神经结扎(SNL)，也称为Chung模型，L5和L6脊神经从L4脊神经中解剖出来并紧密结扎在背根神经节(DRG)的远端。对于化疗模型，小鼠将在8周内每周接受5mg/kg剂量的顺铂。已知神经病理学模型具有行为的改变，例如机械性异常性疼痛、冷异常性疼痛和热痛觉过敏。出于这个原因，利用足底热痛觉实验来测试由于施加辐射热引起的缩足潜伏期，并且利用von Frey测试来测试机械的刺激。

在确定了(图25)哪种AAV血清型是最适于靶向DRG(背根神经节)之后，申请人进行靶向一些基因的实验。

在第一轮实验中，申请人首先编辑了SCN9A基因。申请人将具有靶向SCN9A基因的split-Cas9的AAV以～1E11-1E12vg/小鼠的剂量通过鞘内注射至C57BL/6J小鼠中。然后申请人将其他小鼠分成5组以测试不同的疼痛模型，并用注射阿片类药物的WT小鼠作为阳性对照和注射PBS的小鼠作为阴性对照。在8周结束时，申请人处死了小鼠，从DRG中提取gDNA并通过下一代测序对目标靶区域(切割位点周围150bp)进行测序。因为可能不希望永久性的疼痛丧失，申请人还通过dCas9和优化的抑制结构域靶向SCN9A(图33)。申请人再次用疼痛模型测试这组小鼠。另外，申请人在8周的时候收获小鼠的DRG神经元并进行RNA测序以确定治疗后基因表达的变化。申请人关注的一些其他基因包括其他钠通道，如Nav 1.8(SCN10A基因)，1.9(SCN11A基因)和1.3(SCN3A基因)，以及瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TrpV1)，也称为辣椒素受体和香草素受体1、SHANK3和NMDA受体拮抗剂。因为基因抑制可能不足以实现无痛的状态，申请人还进行了基因激活(或过表达)。

先前的研究表明，对于无痛表型，SCN9A的同时抑制和脑啡肽前体Penk的上调可能是必需的。出于这个原因，申请人使用了具有RNA发夹结构(MS2，PP7，Com)的gRNA构建体并将它们的同源RNA结合蛋白融合到激活/抑制结构域上。为了激活Penk，申请人在dN-Cas9质粒上构建gRNA-MS2构建体并将MS2RNA同源物MCP融合到VP64激活位点上。类似地，申请人将SCN9A特异性的gRNA-Com添加到dN-Cas9，并将其RNA同源物上COM融合到KRAB上。因此，申请人可以利用具有与gRNA连接的RNA发夹的双-AAV dCas9系统，其能够将选择的激活/抑制招募到特定的位置，获得同时激活和抑制(图33和34)。因此，申请人将AAV注射到小鼠中以同时激活Penk并抑制SCN9A，以确定小鼠的疼痛表型是否有任何差异，并且与做RNA-seq对照以确定激活/抑制的程度。除了用于抑制的SCN9A和用于激活的Penk之外，申请人还关注了同时激活/抑制的其他基因。此外，除了通过CRISPR同时激活和抑制之外，申请人还通过dCas9-KRAB-gRNA split-AAV构建体进行抑制并通过基因的过表达同时进行激活。(图35)。

等价形式

除非另外定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语具有与该技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本发明中说明性描述的当前技术可适当地在缺少本发明未具体公开的任何要素、任何限制的情况下进行实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被全面而不受限制地理解。另外，本发明使用的术语和表达用作说明性术语而非限制，并且这些术语和表达的使用无意排除所示的和所述的特征或其部分的任何等价物，但应该认识到在所要求的本技术的范围内可以进行各种修改。

因此，应当理解的是，本发明提供的材料、方法和实施例是具有代表性的优选方面，是示例性的，并不旨在限制本发明的技术范围。

本发明已广泛且一般性地描述了本发明的技术。落入本发明一般性内容中的每个较窄种类和子类分组也构成本发明技术的一部分。这包括本发明技术的一般性描述，其具有限制性条款或从该种类中排除任何主题的负限制，无论是否在本发明中具体列举了删去的材料。

此外，在根据马库什群组描述本发明技术的特征或方面的情况下，本领域技术人员将会意识到，本发明技术也因此以马库什群组的任何个体成员或成员子群的形式描述。

本发明提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用其整体明确地并入本发明，其程度如同每个单独地通过引用并入本发明。如有冲突，将以本发明的说明书包括定义为准。

其他方面在本发明的权利要求中阐述。

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Claims (46)

1.一种基于CRISPR的基因组或表观基因组编辑的重组系统，其包括：

(a)第一表达载体，其包含(i)编码C-内含肽的多核苷酸，(ii)编码C-Cas9的多核苷酸，和(iii)所述第一载体的启动子序列；和

(b)第二表达载体，其包含(i)编码N-Cas9的多核苷酸，(ii)编码N-内含肽的多核苷酸，和(iii)所述第二载体的启动子序列，

其中任选地，所述第一表达载体和所述第二表达载体都是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体，和

其中所述第一表达载体和所述第二表达载体的共表达导致整个Cas9蛋白的表达。

2.如权利要求1所述的重组系统，其特征在于，所述第一表达载体的启动子序列包含CMV启动子。

3.如权利要求1或2所述的重组系统，其特征在于，所述第二载体的启动子序列包含与gRNA序列、任选地与sgRNA可操作地连接的第一启动子，以及第二启动子。

4.如权利要求3所述的重组系统，其特征在于，所述第一启动子序列是U6启动子。

5.如权利要求3或4所述的重组系统，其特征在于，所述第二启动子序列是CMV启动子。

6.如权利要求1所述的重组系统，其特征在于，所述第一表达载体和所述第二表达载体均还包含poly-A尾。

7.如权利要求1所述的重组表达系统，其特征在于：所述第一表达载体还包含四环素响应元件和/或所述第二表达载体还包含四环素调控的激活因子，或，所述第一表达载体还包含四环素调控的激活因子和/或所述第二表达载体还包含四环素响应元件。

8.如权利要求7所述的重组表达系统，其特征在于，所述四环素响应元件包含一个或多个tetO重复片段。

9.如权利要求7所述的重组表达系统，其特征在于，所述四环素响应元件包含7个重复的tetO片段。

10.如权利要求7所述的重组表达系统，其特征在于，所述四环素调控的激活因子包含rtTa和，任选地，2A。

11.如权利要求1所述的重组表达系统，其特征在于，所述C-Cas9为dC-Cas9，所述N-Cas9为dN-Cas9。

12.如权利要求11所述的重组表达系统，其特征在于，所述第一表达载体和/或所述第二表达载体还包含KRAB、DNMT3A或DNMT3L中的一种或多种。

13.如权利要求11所述的重组表达系统，其特征在于，所述第一表达载体和/或所述第二表达载体还包含VP64、RtA或P65中的一种或多种。

14.如权利要求12所述的重组表达系统，其特征在于，其还包含用于靶向抑制、沉默或下调的基因的gRNA。

15.如权利要求13所述的重组表达系统，其特征在于，其还包含用于靶向表达、激活或上调的基因的gRNA。

16.如权利要求15所述的重组表达系统，其特征在于，其还包含编码靶向表达、活化或上调的基因的第三表达载体以及，任选地，启动子。

17.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其特征在于，所述第一表达载体和/或所述第二表达载体还包含miRNA回路。

18.一种包含如权利要求1所述的重组表达系统的组合物，其特征在于，所述第一表达载体包被在第一病毒衣壳中，所述第二表达载体包被在第二病毒衣壳中，并且任选地，其中所述第一病毒衣壳和/或所述第二种病毒衣壳是AAV或慢病毒衣壳。

19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述AAV是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV-DJ中的一种。

20.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一病毒衣壳和/或所述第二病毒衣壳被修饰为包含以下组中的一种或多种：非天然氨基酸、SpyTag或KTag。

21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述非天然氨基酸是N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸。

22.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述第一病毒衣壳和/或所述第二病毒衣壳通过肽、适体、寡核苷酸、亲和体、DARPin、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白或粘附蛋白中的一种或多种进行假型化。

23.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一病毒衣壳和/或所述第二病毒衣壳是AAV2衣壳。

24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述非天然氨基酸、SpyTag或KTag在VP1的氨基酸残基R447、S578、N587或S662处掺入。

25.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一病毒衣壳和/或所述第二病毒衣壳是AAV-DJ衣壳。

26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述非天然氨基酸、SpyTag或KTag在VP1的氨基酸残基N589处掺入。

27.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一病毒衣壳和所述第二病毒衣壳是相连的。

28.一种控制有需要的受试者的疼痛的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3A、TrpV1、SHANK3、NR2B、IL-10、PENK、POMC或MVIIA-PC中的一种或多种。

29.一种治疗或预防有需要的受试者的疟疾的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CD81、MUC13或SR-B1中的一种或多种。

30.一种治疗或预防有需要的受试者的丙型肝炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CD81、MUC13、SR-B1、GYPA、GYPC、PKLR或ACKR1中的一种或多种。

31.一种在有需要的受试者中治疗或预防造血干细胞疗法中的免疫排斥的方法，其包括向受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CCR5。

32.一种治疗或预防有需要的受试者的HIV的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CCR5。

33.一种治疗或预防有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向肌营养不良蛋白。

34.一种治疗或改善治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向PDCD-1、NODAL或JAK-2中的一种或多种。

35.一种治疗有需要的受试者或细胞色素p450病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向CYP2D6。

36.一种治疗或预防有需要的受试者的阿尔茨海默病的方法，其包括向受试者施用有效量的如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含编码gRNA的载体，所述gRNA靶向LilrB2。

37.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述受试者是哺乳动物。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是鼠、犬、猫、马、牛、猿猴或人类患者。

39.一种修饰的AAV2衣壳，其在VP1的氨基酸残基R447、S578、N587或S662处包含非天然氨基酸、SpyTag或KTag。

40.如权利要求39所述的修饰的AAV2衣壳，其特征在于，所述非天然氨基酸是N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸。

41.如权利要求39所述的修饰的AAV2衣壳，其特征在于，所述修饰的AAV2衣壳是通过肽、适体、寡核苷酸、亲和体、DARPin、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白或粘附蛋白中的一种或多种进行假型化。

42.如权利要求39所述的修饰的AAV2衣壳，其包被有脂质体。

43.一种修饰的AAV-DJ衣壳，其在VP1的氨基酸残基N589处包含非天然氨基酸、SpyTag或KTag。

44.如权利要求43所述的修饰的AAV-DJ衣壳，其特征在于，所述非天然氨基酸是N-ε-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸。

45.如权利要求43所述的修饰的AAV-DJ衣壳，其特征在于，所述修饰的AAV-DJ衣壳是通过肽、适体、寡核苷酸、亲和体、DARPin、Kunitz结构域、fynomer、双环肽、抗运载蛋白或粘附蛋白中的一种或多种进行假型化。

46.如权利要求43所述的修饰的AAV-DJ衣壳，其包被有脂质体。