KR20200135433A - 골 장애 치료를 위한 유전자 치료제 - Google Patents

골 장애 치료를 위한 유전자 치료제 Download PDF

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Abstract

일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 골 질량을 조정 (예를 들어, 증가 및/또는 감소)하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 특정 유형의 골 세포, 예를 들어 골모세포, 파골세포, 골세포 등의 활성, 분화 또는 기능을 촉진 (예를 들어, 증가) 또는 억제 (예를 들어, 감소)하는 트랜스진을 발현하도록 구성된, 단리된 핵산 및 벡터, 예컨대 rAAV 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산 및 벡터는 증가된 골 질량 (예를 들어, 골화석증) 또는 감소된 골 질량 (예를 들어, 골다공증)과 연관된 장애 및 상태를 치료하는데 유용하다.

Description

골 장애 치료를 위한 유전자 치료제
<관련 출원>
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 발명의 명칭이 "골 장애 치료를 위한 유전자 치료제"인 2018년 3월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/647,595 및 발명의 명칭이 "골 장애 치료를 위한 유전자 치료제"인 2019년 2월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/799,843의 이익을 주장한다.
골 대사의 결함은 병리학적 고갈 또는 골 질량과 연관된 장애 및 골 질량의 병리학적 증가와 연관된 장애를 포함하여 다양한 여러 골 장애를 유발한다. 골 질량에 대한 효과는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 예를 들어, 골다공증은 골 질량의 손실을 특징으로 하는 질환이며, 노화와 연관된 연약함 및 괴로움의 주요 원인이다. 50세 이상의 미국인 1천만명이 골다공증을 갖는 것으로 추정되고, 골다공증-관련 골절이 매년 대략 150만명에게서 발생하며, 심각한 건강상의 문제가 있다. 대부분의 기존 골다공증 치료제는 파골세포 (OC)에 의한 골의 재흡수를 억제하고, 이러한 억제는 턱의 비정형 골절 및 골괴사를 포함하는 수많은 부작용을 동반한다. 간헐적 부갑상선 호르몬 (PTH)은 골모세포 (OB) 기능을 촉진하는 동화 작용제이고, 골다공증을 갖는 환자의 치료에 이용가능하다. 그러나, 이러한 작용제는 PTH-유도 골 종양에 대한 두려움 때문에 그의 사용이 제한된다. 또한, 새로 개발된 동화 작용제인 항-스클레로스틴 항체는 향상된 Wnt 신호전달을 통해 OB 분화를 촉진한다. 그러나, 염증성 관절염의 맥락에서, 항-스클레로스틴 항체는 TNF-의존적 염증의 맥락에서 골 파괴를 증가시키고 뇌졸중의 위험을 상승시키는 것으로 관찰되었다. 유사하게, 카텝신 K의 소분자 억제제 (예를 들어, 오다나카티브)는 뇌졸중의 발생률 상승으로 인해 FDA 고려대상에서 제외되었다.
<요약>
본 개시내용의 측면은 골 형성 및/또는 대사를 조정 (예를 들어, 증가 또는 감소)하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 골 대사를 조정하는 하나 이상의 트랜스진을 코딩하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)에 부분적으로 기초한다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV는 조절이상 골 대사 (예를 들어, 감소된 골 밀도, 증가된 골 밀도 등)와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 유용하다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 다음을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다: 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 또는 그의 변이체를 포함하는 제1 영역; 및 적어도 하나의 골 대사 조정제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역.
일부 실시양태에서, 골 대사 조정제는 골 형성 촉진제이다. 일부 실시양태에서, 골 형성 촉진제는 OB 및/또는 골세포 (OCY) 분화 또는 활성을 촉진하는 단백질, OC 분화 또는 활성을 억제하는 단백질, 및 OC 분화 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 골 대사-조정제는 골 형성 억제제이다. 일부 실시양태에서, 골 형성-억제제는 OB 및/또는 OCY 분화 또는 활성을 억제하는 단백질, OC 분화 또는 활성을 촉진하는 단백질, 및 OB 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 부갑상선 호르몬 (PTH), PTH-관련 단백질 (PTHrP), 데글리카제(deglycase) DJ1, 스클레로스틴 (SOST)을 표적화하는 억제성 핵산, 슈누리-3(schnurri-3)(SHN3)을 표적화하는 억제성 핵산, 및 카텝신 K (CTSK)를 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 골 형성 촉진제를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK), 부갑상선 호르몬 (PTH)을 표적화하는 억제성 핵산, PTH-관련 단백질 (PTHrP)을 표적화하는 억제성 핵산, 및 데글리카제 DJ1을 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 골 형성 억제제를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 인공 miRNA (amiRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 억제성 핵산을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 돌연변이체 말단 반복부 (mTR)로서 기능한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-15 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호: 1-15 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그의 상보체를 표적화 (예를 들어, 이와 혼성화 또는 이에 결합)한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산은 제2 AAV ITR 또는 그의 변이체를 포함하는 제3 영역을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 (예를 들어, Sf9) 세포, 또는 포유류 세포이다.
본 개시내용은 골 세포, 예컨대 OB, OCY, OC 등에 대한 증가된 주향성(tropism)을 특징으로 하는 rAAV에 부분적으로 기초한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV는 이종 골-표적화 펩티드를 포함하거나 골-표적화 모이어티에 접합된다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 이종 골-표적화 펩티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드는 OC를 표적화한다 (예를 들어, OB에 비해 OC를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함). 일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드는 OB를 표적화한다 (예를 들어, OC에 비해 OB를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함). 일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드는 서열식별번호: 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61, 62 및 63에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 통해 하나 이상의 알렌드로네이트 (Ale) 모이어티에 접합된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다: 캡시드 단백질; 및 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh39, AAV.43, AAV2/2-66, AAV2/2-84 및 AAV2/2-125로부터 선택된 혈청형, 또는 전술한 서열식별번호: 18-34 중 임의의 것의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 OB 및/또는 OCY를 형질도입한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질 (예를 들어, OB 및/또는 OCY를 형질도입하는 캡시드 단백질)은 AAV4, AAV1, AAV6, AAV6.2 및 AAV9로부터 선택된 혈청형 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 OC를 형질도입한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질 (예를 들어, OC를 형질도입하는 캡시드 단백질)은 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV.rh39 및 AAV.rh43으로부터 선택된 혈청형 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 서열식별번호: 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61, 62 및 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 이종 골-표적화 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드는 OC를 표적화한다 (예를 들어, OB에 비해 OC를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함). 일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드는 OB를 표적화한다 (예를 들어, OC에 비해 OB를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함).
일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 캡시드 단백질의 VP2 오픈 리딩 프레임으로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 N587 및 R588에 상응하는 코돈 사이에 또는 AAV2 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 N-말단에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 Q588 및 A589에 상응하는 코돈 사이에 또는 AAV9 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 N-말단에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 통해 하나 이상의 알렌드로네이트 (Ale) 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, rAAV는 자기-상보적 AAV (scAAV)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 트랜스진을 골 조직에 전달하는 방법을 제공하며, 방법은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 조성물 또는 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 본원에 기재된 바와 같이 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV의 트랜스진은 골 형성 촉진제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 골 형성 촉진제는 OB 및/또는 OCY 분화 또는 활성을 촉진하는 단백질, OC 분화 또는 활성을 억제하는 단백질, 및 OC 분화 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 골 형성 촉진제는 부갑상선 호르몬 (PTH), PTH-관련 단백질 (PTHrP), 데글리카제 DJ1, 스클레로스틴 (SOST)을 표적화하는 억제성 핵산, 슈누리-3 (SHN3)을 표적화하는 억제성 핵산, 및 카텝신 K (CTSK)를 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애는 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로부터 유발된 기계적 장애, 및 이차 장애, 예컨대 유방암 또는 전립선암 전이, 1형 당뇨병, 루푸스, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 갑상선기능항진증, 셀리악병, 천식, 치주염, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 증가된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어 골화석증, 골육종 및 이소성 골화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 증가된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV의 트랜스진은 골 형성 억제제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 골 형성 억제제는 OB 및/또는 OCY 분화 또는 활성을 억제하는 단백질, OC 분화 또는 활성을 촉진하는 단백질, 및 OC 분화 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 골 형성 억제제는 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK), 부갑상선 호르몬 (PTH)을 표적화하는 억제성 핵산, PTH-관련 단백질 (PTHrP)을 표적화하는 억제성 핵산, 및 데글리카제 DJ1을 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애는 골화석증, 피크노디소스토시스(pycnodysostosis), 스클레로스테오시스(sclerosteosis), 말단비대증, 불소증, 골수섬유증, C형 간염-연관 골경화증, 및 골암, 예컨대 골육종 및 골의 전이성 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 투여는 주사에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 주사는 전신 주사 (예를 들어, 꼬리 정맥 주사), 국소 주사 (예를 들어, 근육내 (IM) 주사, 무릎 주사 또는 대퇴 골수내 주사)이다.
일부 실시양태에서, 투여는 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV를 포함하는 조직 또는 이식편을 대상체에게 이식함으로써 수행된다.
일부 실시양태에서, 투여는 OB, OCY, OC 및 연골세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형의 형질도입을 유발한다.
도 1은 시험관내에서 마우스 일차 OB 전구체를 형질도입하는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. 마우스 OB 전구체를 출생후 3-5일차에 신생 마우스의 두개관으로부터 단리하고, 증폭을 위해 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 GFP 단백질을 코딩하는 14개의 상이한 scAAV 혈청형과 함께 2일 동안 인큐베이션하고, 이들의 형질도입 효율을 에피형광 현미경법을 사용하여 GFP 발현에 의해 분석하였다.
도 2는 시험관내에서 마우스 ATDC5 연골세포 세포주를 형질도입하는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. 마우스 연골세포 선조 세포주 ATDC5를 GFP 단백질을 코딩하는 14개의 상이한 scAAV 혈청형과 함께 2일 동안 인큐베이션하고, 이들의 형질도입 효율을 에피형광 현미경법을 사용하여 GFP 발현에 의해 분석하였다.
도 3은 시험관내에서 마우스 일차 OC를 형질도입할 수 있는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. 골수-유래 단핵구 (BM-MO)를 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 장골로부터 단리하고, 마우스 m M-CSF (40 ng/ml)의 첨가에 의해 증폭시켰다. BM-MO를 마우스 M-CSF (40 ng/ml) 및 마우스 Rank 리간드 (10 ng/ml)의 존재하에 GFP 단백질을 코딩하는 15개의 상이한 scAAV 혈청형과 함께 6일 동안 인큐베이션하고, 이들의 형질도입 효율을 에피형광 현미경법을 사용하여 GFP 발현에 의해 분석하였다.
도 4는 시험관내에서 마우스 Raw264.7 OC 세포주를 형질도입할 수 있는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. 마우스 Rank 리간드 (5 ng/ml)로 처리한지 2일 후, Raw264.7 세포를 마우스 Rank 리간드 (5 ng/ml)의 존재하에 GFP 단백질을 코딩하는 17개의 상이한 scAAV 혈청형과 함께 6일 동안 인큐베이션하였다. 이들의 형질도입 효율을 에피형광 현미경법을 사용하여 GFP 발현에 의해 분석하였다.
도 5는 마우스에서 GFP-발현 AAV- 형질도입된 조직의 광학 이미지를 나타낸다. PBS 또는 GFP-코딩 scAAV 혈청형 (scAAV4, 5, 6.2 및 9)의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 양쪽 무릎 관절에 주사하고, 4주 후, 마우스를 안락사시키고, 무릎 관절에서의 GFP 발현을 IVIS- 100 광학 이미징 시스템에 의해 모니터링하였다 (전신, 상단). 오른쪽 뒷다리를 절개하고, 근육 제거 후 GFP 발현을 IVIS-100 광학 이미징 시스템에 의해 모니터링하였다 (뒷다리, 하단).
도 6a-6b는 관절 연골에서 연골세포 및/또는 골 표면 상에 OB 및/또는 OC를 형질도입할 수 있는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. GFP-코딩 scAAV 혈청형 (scAAV4, 5, 6.2 및 9)의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 양쪽 무릎 관절에 주사하고, 4주 후, 조직학을 위해 무릎 관절 (도 6a) 및 대퇴골 (도 6b)을 동결-절편화하였다. AC: 관절 연골, CB: 피질골, BM: 골수, 바: 50 μm.
도 7은 리포솜이 마우스에서 근육에 대한 그의 감염성을 감소시킴으로써 골 세포에 대한 scAAV9-형질도입의 선택성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. GFP-코딩 scAAV9 혈청형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피를 PBS 또는 X-tremeGENE (리포솜, 로슈(Roche))과 1:1 비율로 혼합하였다. 인큐베이션 1시간 후, 혼합물의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. 1주 후, 마우스를 안락사시키고, 무릎 관절에서의 GFP 발현을 IVIS-100 광학 이미징 시스템에 의해 모니터링하였다 (왼쪽). 조직학을 위해 대퇴골을 동결-절편화하였다 (오른쪽). CB: 피질골, M: 근육.
도 8은 GFP-코딩 scAAV9 혈청형이 마우스에서 골 표면 상에 OB 및 OC 및 OCY를 형질도입할 수 있음을 나타낸다. GFP-코딩 scAAV9 혈청형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피를 PBS 또는 X-tremeGENE (리포솜)과 1:1 비율로 혼합하였다. 인큐베이션 1시간 후, 혼합물의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. GFP-코딩 scAAV9 혈청형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하고, 4주 후, 조직학을 위해 대퇴골을 동결-절편화하고, GFP 발현을 공초점 현미경에 의해 관찰하였다. 고배율 사진은 X-tremeGENE과 GFP-코딩 scAAV9 혈청형의 혼합물로 처리된 대퇴골에서 scAAV9-형질도입된 OB, OC 및 OCY를 나타낸다 (하단). 위상차 현미경에 의해 본 피질골에서 GFP 발현이 관찰되었다 (왼쪽). GP: 성장판, TB: 섬유주골, CB: 피질골, BM: 골수; 바: 50 μm.
도 9는 골-탐색 AAV 벡터의 개발을 나타낸다. (A) 골-표적화 펩티드, DSS ((AspSerSer)6 또는 HABP,) 또는 (CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL)는 유전자 조작을 통해 VP2 캡시드 단백질에 삽입되었다. (B) WT AAV 벡터는 아지드-보유 아미노산으로 부위-특이적으로 라벨링된 후, 골-탐색 분자 (ADIBO-Ale)로 부착된다.
도 10은 골-표적화 펩티드 (박스; (AspSerSer)6, DSS)를 갖는 VP2 캡시드 단백질을 도시하는 다이어그램을 나타낸다. DSS는 유전자 조작을 통해 Q588 및 A589 사이에 또는 VP2 캡시드 단백질의 N-말단에 삽입된다.
도 11a-11c는 OB에서 DSS-scAAV9의 시험관내 특징화를 나타낸다. 마우스 OB 전구체를 scAAV9-WT (WT) 또는 2개의 DSS-scAAV9 (DSS-588, DSS-Nter)와 함께 2일 동안 인큐베이션하였다. 이들의 형질도입 효율을 항-GFP를 사용한 웨스턴 블로팅 (도 11a) 및 에피형광 (도 11b, 왼쪽)을 사용하여 GFP 발현에 의해 분석하였다. Hsp90을 로딩 대조군으로 사용하였다. 대안적으로, 형질도입된 OB를 6일 동안 OB 분화 조건 하에 배양하고, OB 분화를 알칼리성 포스파타제 (ALK) 염색에 의해 평가하고 (도 11b, 오른쪽), OB 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 평가하였다 (Hprt로 정규화됨, 도 11c). N.S.: 유의하지 않음.
도 12a-12c는 OC에서 DSS-scAAV9의 시험관내 특징화를 나타낸다. 마우스 Rank 리간드 (5 ng/ml)로 처리한지 2일 후, Raw264.7을 scAAV9-WT (WT) 또는 2개의 DSS-scAAV9 (DSS-588, DSS-Nter)로 처리하였다. 형질도입 2일 후, 이들의 형질도입 효율을 항-GFP를 사용한 웨스턴 블로팅 항체 (도 12a) 및 에피형광 (도 12b, 왼쪽)을 사용하여 GFP 발현에 의해 분석하였다. 형질도입된 OC를 Rank 리간드의 존재하에 배양하고, 3일 후, OC 분화를 TRAP 염색에 의해 평가하고 (도 12b, 오른쪽), OC 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 평가하였다 (Hprt로 정규화됨, 도 12c). N.S: 유의하지 않음.
도 13은 DSS-scAAV9 (Nter)가 마우스에서 골 표면 상에 OB, OC 및 OCY를 형질도입할 수 있음을 나타낸다. GFP-코딩 scAAV9-WT (WT) 또는 2개의 DSS-scAAV9 (DSS-588, DSS-Nter)의 1011 ~ 1012/ml 게놈 카피를 X-tremeGENE (리포솜)과 1:1 비율로 혼합하였다. 인큐베이션 1시간 후, 혼합물의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. 1주 후, 조직학을 위해 대퇴골을 동결-절편화하고, GFP 발현을 공초점 현미경에 의해 관찰하였다. 고배율 사진은 X-tremeGENE과 GFP-코딩 scAAV9 혈청형의 혼합물로 처리된 대퇴골에서 scAAV9-형질도입된 OB, OC 및 OCY를 나타낸다 (하단). GP: 성장판, CB: 피질골, BM: 골수; GFP: 녹색, DAPI: 파란색.
도 14는 성숙 OB에서 SHN3의 일시적인 결실이 성체 마우스에서 골 질량을 증가시킴을 나타낸다. 1개월령 암컷 Shn3-fl/fl (WT) 또는 Shn3-fl/fl;OCN/ERT-cre (CKO) 마우스를 5일 동안 타목시펜 (50 mg/kg)으로 처리하고, 6주 후, 골 질량을 마이크로CT 분석에 의해 측정하였다. 섬유주골의 3D 재구축이 표시되고 (왼쪽), 정량적 파라미터가 오른쪽 패널에 표시된다: 골 부피/총 부피 (BV/TV). **: P,0.005.
도 15는 SHN3 결실이 마우스에서 에스트로겐 결핍-유도 골 손실을 방지함을 나타낸다. 3개월령 암컷 마우스는 난소절제술 (OVX) 수술을 받았거나, Sham 수술 (Sham)을 받았으며, 수술 2개월 후 골 질량을 마이크로CT 분석에 의해 측정하였다. 섬유주골 (왼쪽 상단) 및 미드샤프트 피질골 (왼쪽 하단)의 3D 재구축이 표시된다. 정량적 파라미터가 오른쪽 패널에 표시된다: 골 부피/총 부피 (BV/TV). **: P,0.005, N.S: 유의하지 않음.
도 16a-16d는 OB에서 scAAV9-mSHN3i의 시험관내 특징화를 나타낸다. 마우스 일차 두개관 OB를 scAAV9 코딩 -대조군 벡터 (대조군) 또는 2개의 마우스 -SHN3 shRNAsi (Sh-SHN3-1, -2)로 처리하였다. 형질도입 3일 후, 이들의 형질도입 효율 (도 16a) 및 녹다운 효율 (도 16b)을 각각 에피형광을 사용하여 GFP 발현에 의해 및 RT-PCR을 사용하여 SHN3 mRNA 수준에 의해 분석하였다. (도 16c 및 16d) 형질도입된 OB를 OB 분화 조건하에 배양하고, RT-PCR 및 알리자린 레드 염색을 배양의 6일 및 15일에 수행하였다. *: P,0.05, **: P,0.005.
도 17a-17b는 scAAV9-mSHN3i의 생체내 특징화를 나타낸다. GFP-코딩 scAAV9 (대조군, Sh-SHN3-1)의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피를 X-tremeGENE (리포솜)과 1:1 비율로 혼합하였다. 인큐베이션 1시간 후, 혼합물의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. 1주 후, 조직학을 위해 대퇴골을 동결-절편화하고, GFP 발현을 공초점 현미경에 의해 관찰하였다. 고배율 사진은 대퇴골에서 GFP-발현 OB 및 OCY를 나타내며, 이는 대조군-scAAV9 벡터와 유사하게, Sh-SHN3-1 scAAV9 벡터가 골에서 OB 및 OCY를 형질도입할 수 있음을 나타낸다 (도 17a). BMSC를 해리하기 위해 대퇴골을 기계적 및 효소적 소화 (유형 2 콜라게나제 및 디스파제)로 프로세싱하였다. GFP-발현 세포를 FACS 분류법을 사용하여 BMSC로부터 추가로 단리하고, RT-PCR 분석을 위해 사용하여 SHN3 mRNA 수준을 측정하였다 (도 17b). CB: 피질골, BM: 골수, TB: 섬유주골.
도 18a-18d는 OC에서 scAAV9-mCTSKi의 시험관내 특징화를 나타낸다. 마우스 Rank 리간드 (5 ng/ml)로 처리한지 2일 후, Raw264.7을 scAAV9-대조군 (대조군) 또는 2개의 scAAV9-mCTSKi (Sh-CTSK-1, -2)로 처리하였다. 형질도입 2일 후, 이들의 형질도입 효율 (도 18a) 및 녹다운 효율 (도 18b)을 각각 에피형광을 사용하여 GFP 발현에 의해 및 RT-PCR을 사용하여 CTSK mRNA 수준에 의해 분석하였다. 도 18c-18d는 형질도입된 OB를 Rank 리간드의 존재하에 배양하고, 3일 후, OC 분화를 TRAP 활성 (도 18c, 상단) 및 염색 (도 18c, 하단)에 의해 평가하고, OC 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 평가하였음 (Hprt로 정규화됨, 도 18d)을 나타낸다. *: P,0.05, **: P,0.005.
도 19a-19b는 scAAV9-mCTSKi의 생체내 특징화를 나타낸다. GFP-코딩 scAAV9 (대조군, Sh-CTSK-1)의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피를 X-tremeGENE (리포솜)과 1:1 비율로 혼합하였다. 인큐베이션 1시간 후, 혼합물의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. 1주 후, 조직학을 위해 대퇴골을 동결-절편화하고, GFP 발현을 공초점 현미경에 의해 관찰하였다. 고배율 사진은 대퇴골에서 scAAV9-형질도입된 OB 및 OC를 나타낸다 (도 19a). 동결-절편화된 대퇴골을 항-CTSK 항체로 염색하여, GFP-발현 OC에서 CTSK 발현을 평가하였다. IgG 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 고배율 사진은 scAAV9-mCTSKi로 형질도입된 GFP-발현 OC에서 CTSK의 감소된 발현을 나타낸다 (도 19b). GP: 성장판, CB: 피질골, BM: 골수, TB: 섬유주골; GFP: 녹색, DAPI: 파란색, CTSK: 빨간색.
도 20은 골-표적화 scAAV9-매개 유전자 침묵의 전략을 나타낸다. OB 유전자 (SHN3i, SOSTi) 또는 OC 유전자 (CTSKi)에 특이적인 shRNA를 BT-scAAV9 혈청형 (DSS 또는 HABP-scAAV9, Ale-scAAV9)으로 클로닝하였다. 이들 scAAV9 혈청형을 국소 전달을 위해 마우스의 골수내 대퇴골에 주사하였다. 전신 전달을 위해, OB 또는 골세포에서 SHN3 또는 SOST의 발현을 침묵시키기 위해 또는 골 표면 상에 OC에서 CTSK 발현을 침묵시키기 위해 마우스에 IP 또는 IV 주사하였다.
도 21은 전신 생성을 위한 AAV-매개 유전자 첨가를 나타낸다. 인간 PTH (1-84 aa), 인간 PTHrP (1-140 aa), 또는 마우스 DJ-1 cDNA를 scAAV9 벡터로 클로닝하고, 전신 발현을 위해 마우스에 근육내로 주사하였다.
도 22a-22g는 시험관내에서 및 생체내에서 골 세포를 형질도입하는 scAAV 벡터를 나타낸다. 도 22a 및 22b는 두개관 골모세포 (COB), 골수-유래 파골세포 전구체 (BM-OCP), 또는 연골발생 세포 (ATDC5)를 나타내며, 이를 PBS 또는 동일한 CB-Egfp 트랜스진으로 패키징된 14개의 상이한 AAV 캡시드로 처리하였다. 2일 후, 항-GFP 항체를 사용한 이뮤노블로팅에 의해 EGFP 발현을 평가하였다. 항-Hsp90 항체를 로딩 대조군으로 사용하였다. EGFP 단백질의 이뮤노블롯 정량화를 이미지 J 소프트웨어에 의해 내인성 Hsp90 단백질 수준의 백분율로서 측정하였다. 도 22c는 scAAV의 1 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스의 무릎 관절에 관절내로 (i.a.) 주사하고, 뒷다리에서의 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 이미징에 의해 모니터링하였음을 나타낸다. 도 22d는 대퇴골을 동결-절편화하고 EGFP 발현을 형광 현미경법에 의해 평가하였음을 나타낸다. 도 22e 및 22f는 EGFP-발현 골모세포 (OB), 골세포 (OCY) 및 성숙 파골세포 (OC)의 고배율 이미지를 나타낸다. 도 22g는 성숙 파골세포를 확인하기 위해 동결-절편화된 대퇴골을 또한 항-BgIap 항체로 면역염색하였음을 나타낸다. TB, 섬유주골; BM, 골수; GP, 성장판; CB, 피질골. 스케일 바: 500 μm (도 22d); 100 μm (도 22e); 75 μm (왼쪽) 및 25 μm (중간, 오른쪽) (도 22f); 및 25 μm (도 22g).
도 23a-23k는 골모세포에서 Shn3의 유도성 결실이 성체 마우스에서 골 발생을 증가시킴을 나타낸다. 도 23a-23d에서, scAAV9-Egfp의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스에 정맥내로 (i.v.) 주사하였다. 도 23a는 주사 2주 후 IVIS-100 광학 이미징에 의해 모니터링된 개별 조직에서의 EGFP 발현을 나타낸다. y-축, 복사 효율 (p/초/㎠/sr/μW/㎠). 도 23b 및 23c는 동결-절편화된 심장 및 간 (23B) 및 대퇴골 (23C, 오른쪽에 고배율)에서의 EGFP 발현을 나타낸다. 도 23d는 항-EGFP 항체를 사용한 조직 용해물의 이뮤노블롯이다. 도 23e-23g에서, 2개월령 암컷 Ocn-Ert;RosamT/mG 및 Shn3Ocn-Ert;RosamT/mG 마우스를 연속 5일 동안 100 mg/kg 타목시펜으로 처리하였다. 도 23e에서, EGFP-발현 골모세포를 확인하기 위해 2개월 후에 대퇴골을 횡단면-절편화하였다. 도 23f 및 23g 마이크로CT (도 23f) 및 상대적 정량화 (도 23g)에 의해 평가된 대퇴 섬유주골 질량의 대표적인 3D 구축을 나타낸다. 섬유주골 부피/총 부피 (Tb.BV/TV), 섬유주 두께 (Tb.Th), 입방 밀리미터 당 섬유주 수 (Tb.N) 및 섬유주 공간 (Tb.Sp) (n=6/군). 도 23h-23k에서, scAAV9-Egfp 또는 scAAV9-Cre의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 3개월령 수컷 Shn3fl/fl;RosamTmG 마우스에 i.v. 주사하였다. 도 23h는 경골 RNA에서 Cre 및 Shn3 mRNA 수준 및 처리 2개월 후 Hprt로 정규화된 발현을 나타낸다. 도 23i는 EGFP-발현 세포를 확인하기 위해 동결-절편화된 대퇴골에 대한 형광 현미경법을 나타내고 (도 23i), 대퇴 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였다. 도 23j는 대표적인 3D-재구축을 나타내고 도 23k는 상대적 정량화를 나타낸다. 섬유주골 부피/총 부피 (Tb. BV/TV), 섬유주 두께 (Tb.Th), 입방 밀리미터 당 섬유주 수 (Tb.N), 및 연속 밀도 (Conn.Dn) (n=6/군). 스케일 바: 50 μm (23B); 500 μm (왼쪽), 75 μm (오른쪽) (23C); 25 μm (23E); 1 mm (23F 및 23J); 250 μm (23I). 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다: *, P < 0.05; **, P < 0.01; 및 ***, P < 0.001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 23g, 23h 및 23k).
도 24a-24k는 전신으로 전달된 AAV9에 의한 SHN3의 침묵이 골 형성을 촉진함을 나타낸다. 도 24a는 CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터 (CB), amiR-ctrl 또는 amiR-shn3, Egfp 리포터 유전자 (EGFP), β-글로빈 폴리A 서열 (PA), 및 역전된 말단 반복부 (ITR)를 함유하는 scAAV9 구축물의 다이어그램을 나타낸다. 도 24b-24d에서, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 코딩하는 scAAV9를 2개월령 수컷 마우스의 무릎 관절에 관절내 (i.a.) 주사한지 2주 후, EGFP 발현을 IVIS 100 광학 이미징 (도 24b) 및 동결-절편화된 대퇴골의 형광 현미경법 (도 24c)에 의해 평가하였다. 도 24d에서, EGFP 단백질 (상단) 및 hprt로 정규화된 shn3 mRNA (하단)의 수준을 대퇴골로부터의 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)-분류된 EGFP-발현 세포에서 평가하였다. 도 24e-24f에서, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9를 2개월령 암컷 마우스의 무릎 관절에 i.a. 주사한지 2개월 후, 대퇴 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였다. 대표적인 3D-재구축 (도 24e) 및 상대적 정량화 (도 24f)가 표시된다 (n=6/군). 도 24g-24k에서, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 코딩하는 AAV9의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 3개월령 암컷 마우스에 i.v. 주사하였다. 2개월 후, shn3 mRNA 수준을 경골 RNA에서 측정하고 hprt로 정규화하였다 (도 24g, n=8/군). 대퇴 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 측정하였다. 대표적인 3D-재구축 (도 24h) 및 상대적 정량화 (도 24i)가 표시된다 (n=8/군). 대표적인 칼세인/알리자린 레드 라벨링 (도 24j) 및 BFR/BS, MAR 및 Ob.S/BS의 상대적 조직형태계측학적 정량화가 표시된다 (도 24k). 화살표는 칼세인 및 알리자린 레드 라벨링 사이의 거리를 나타낸다. BFR/BS, 골 형성 속도/골 표면; MAR, 광물 부착률(mineral apposition rate); Ob.S/BS, 골모세포 표면/골 표면. GP, 성장판; BM, 골수; TB, 섬유주골. 스케일 바: 250 μm, (도 24c); 1 mm (도 24e 및 24h); 50 μm (도 24j). 값은 평균 ± SD를 나타낸다: **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 24f, 24g, 24i 및 24k).
도 25a-25j는 전신으로 전달된 AAV9에 의한 Shn3의 침묵이 폐경후 골다공증의 마우스 모델에서 골 손실을 방지함을 나타낸다. 도 25a-25b는 sham 또는 OVX 수술을 3개월령 암컷 Shn3+/+ 및 Shn3-/- 마우스에서 수행하고, 2개월 후, 대퇴 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였음을 나타낸다. 대퇴골 (도 25a) 및 상대적 BV/TV (도 25b)의 대표적인 이미지가 표시된다 (n = 6/군). 도 25c는 연구 및 치료 방법의 다이어그램을 나타낸다. Sham 또는 OVX 수술을 3개월령 암컷 마우스에서 수행하고, 6주 후, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 i.v. 주사하였다. 주사 7주 후, EGFP-발현 세포를 확인하기 위해 대퇴골을 동결-절편화하였다 (도 25d). hprt로 정규화 후 경골에서의 shn3 mRNA 수준이 표시된다 (n = 8~12/군) (도 25e). 대퇴 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였다. 대표적인 3D-재구축 (도 25f) 및 상대적 정량화 (도 25g)가 표시된다 (n = 7~8/군). 칼세인/알리자린 레드 라벨링의 대표적인 이미지 (도 25h) 및 BFR/BS 및 MAR의 상대적 조직형태계측학적 정량화 (도 25i). 화살표는 칼세인 및 알리자린 레드 라벨링 사이의 거리를 나타낸다. 굽힘 강성, 굽힘 모멘트, 겉보기 굽힘 모듈러스 및 겉보기 굽힘 응력을 포함하는 대퇴 생체역학적 특성을 정량화하였다 (n=5~9/군) (도 25j). 스케일 바: 1 mm, (도 25a 및 25f); 250 μm, (도 25d); 및 50 μm, (도 25h). 값은 평균 ± SD를 나타낸다: N.S., 유의하지 않음; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 25b) 및 일원 ANOVA 테스트 (도 25e, 25g, 25i 및 25j).
도 26a-26m: 골-귀소 AAV9.DSS-Nter 캡시드는 폐경후 골다공증의 마우스 모델에서 골 손실을 방지하기 위해 Shn3의 침묵을 매개한다. 도 26a는 합리적으로 설계된 골-특이적 AAV 캡시드에 대한 구축물의 다이어그램이다. 골-표적화 펩티드 모티프 (DSS, 빨간색)를 Q588 및 A589 사이 (DSS-588) 또는 AAV9-VP2의 N-말단 (DSS-Nter)에 AAV9 캡시드에 삽입하였다. cap: 캡시드 단백질. 도 26b 및 26c는 상이한 농도의 scAAV9, scAAV9.DSS-587 또는 scAAV9.DSS-Nter로 감염된지 2일 후, COB를 6일 동안 골발생 조건하에 배양하였음을 나타낸다. EGFP 발현을 항-EGFP 항체를 사용한 이뮤노블로팅 (도 26b) 또는 형광 현미경법 (도 26c)에 의해 평가하였다. ALP 활성을 패스트 블루 염색에 의해 평가하였다 (도 26c). 도 26d - 26h는 scAAV9 또는 scAAV9.DSS-Nter의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스에 i.v. 주사하였음을 나타낸다. 개별 조직에서의 EGFP 발현을 주사 2주 후 IVIS-100 광학 이미징에 의해 모니터링하였다 (도 26d). 이뮤노블로팅은 조직 용해물에서의 EGFP 발현 (도 26e) 및 이미지 J 소프트웨어에 의한 상대적 정량화 (도 26f, n=3/군)를 나타낸다. EGFP-발현 세포를 확인하기 위해 동결-절편화된 대퇴골에서 형광 현미경법을 수행하였고 (도 26g), 대퇴골에서 골 표면 당 EGFP-발현 세포의 수를 이미지 J 소프트웨어에 의해 정량화하였다 (도 26h, n=5/군). (도 26i-26m)은 3개월령 암컷 마우스에서 sham 또는 OVX 수술을 수행하였음을 나타낸다. 6주 후, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9.DSS-Nter의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 i.v. 주사하였다. 주사 7주 후, 경골에서 shn3 mRNA 수준을 평가하였다 (도 26i, n=10/군). 대퇴골 및 요추골에서의 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였다. 정량화 (도 26j 및 26m) 및 대표적인 3D-재구축 (도 26k 및 26l)이 표시된다 (n = 6~8/군). GP, 성장판; BM, 골수; TB, 섬유주골. 스케일 바: 100 μm, (도 26c 및 26g); 1 mm, (도 26k 및 26l). 값은 평균 ± SD를 나타낸다: N.S., 유의하지 않음; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 26f 및 26h) 및 일원 ANOVA 테스트 (도 26i, 26j 및 26m).
도 27a - 27c는 시험관내에서 골모세포, 파골세포 및 연골세포를 형질도입하는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. 두개관 골모세포 (COB, 도 27a), 골수-유래 파골세포 전구체 (BM-OCP, 도 27b), 또는 연골발생 세포주 (ATDC5, 도 27c)를 PBS 또는 14개의 상이한 AAV 혈청형으로 처리하였다. 2일 후, EGFP 발현을 형광 현미경법에 의해 모니터링하였다. 스케일 바: 100 μm.
도 28a - 28b는 골 및 연골을 형질도입하는 scAAV 혈청형의 확인을 나타낸다. PBS 또는 scAAV9-EGFP의 1 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스의 무릎 관절에 관절내로 (i.a.) 주사하였다. EGFP-발현 세포를 확인하기 위해 무릎 관절 (도 28a) 및 대퇴골 (도 28b)을 동결-절편화하였다. DAPI를 사용하여 핵을 염색하였다. AC, 관절 연골; M, 근육; CB, 피질골; BM, 골수. 스케일 바: 100 μm, 패널 (도 28a; 250 μm, 도 28b).
도 29a - 29d는 마우스에서 전신으로-전달된 scAAV9의 조직 분포를 나타낸다. 도 29a 및 29b는 PBS 또는 scAAV9-EGFP의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스에 정맥내로 (i.v.) 주사하고, 주사 2주 후 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 이미징에 의해 모니터링하였음을 나타낸다. 전신에서의 EGFP 발현 (도 29a) 및 도 28a에 나타낸 절개된 조직에서의 EGFP 발현의 정량화가 표시된다 (도 29b). PBS-주사를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 29c 및 29d는 EGFP-발현 세포를 배치하기 위해 PBS- 또는 rAAV9-EGFP-주사된 마우스로부터 절개된 조직을 동결-절편화하였음을 나타낸다. 스케일 바: 100 μm, 도 29c; 500 μm, 도 29d.
도 30은 대퇴골에서 전신으로-전달된 scAAV9의 분포를 나타낸다. scAAV-EGFP의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스에 i.v. 주사하고, 주사 2주 후 동결-절편화된 대퇴골에서 EGFP 발현을 평가하였다. L, 인대; GP, 성장판; AC, 관절 연골; BM, 골수; CB, 피질골; P, 슬개골; M, 근육. 스케일 바: 100 μm.
도 31a-31e는 Shn3fl/fl 골모세포에서의 scAAV9-Cre의 시험관내 특징화를 나타낸다. 도 31a는 CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터 (CB), EGFP 리포터 유전자 (EGFP), 또는 Cre 레콤비나제 (Cre), β-글로빈 폴리A 서열 (PA), 및 역전된 말단 반복부 (ITR)를 함유하는 rAAV9 구축물의 다이어그램을 나타낸다. 도 31b는 COB를 2일 동안 scAAV9-EGFP 또는 scAAV9-Cre로 감염시키고 세포를 용해시키고 표시된 항체로 이뮤노블로팅하였음을 나타낸다. 도 31c-31e는 scAAV9-EGFP 또는 scAAV9-Cre로 처리한지 2일 후, COB를 6일 동안 골발생 조건하에 배양하고, Shn3 (도 31c) 및 골발생 유전자 (도 31d)의 mRNA 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였음을 나타낸다. 배양 21일 후, 광물화를 알리자린 레드 염색에 의해 평가하였다 (도 31e). 값은 평균 ± SD를 나타낸다: ***, P < 0.001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 31c 및 31d).
도 32a-32c는 골모세포에서 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9의 시험관내 특징화를 나타낸다. amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9로 처리한지 2일 후, COB를 골발생 조건하에 배양하였다. EGFP 발현 (도 32a), Shn3 및 골발생 유전자의 mRNA 수준 (도 32b), 및 광물화 (도 32c)를 형광 현미경법, RT-PCR, 및 알리자린 레드 염색에 의해 각각 평가하였다. 스케일 바: 100 mm, (도 32a). 값은 평균 ± SD를 나타낸다: *, P < 0.05; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 32b 및 32c).
도 33a-33f는 amiR-shn3을 운반하는 전신으로 전달된 scAAV9로 처리된 마우스의 특징화를 나타낸다. amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 3개월령 암컷 마우스에 i.v. 주사하였다. 처리 2개월 후, 마우스를 동적 조직형태계측학을 위해 칼세인 및 알리자린 레드로 라벨링하였다. IVIS-100 광학 이미징을 사용하여 EGFP 발현을 모니터링하기 위해 비라벨링된 마우스를 사용하였다. 전신 (도 33a) 및 절개된 조직 (도 33b)에서의 EGFP 발현이 표시된다. EGFP-발현 골모세포 계통 세포를 확인하기 위해 대퇴골을 동결-절편화하였다 (도 33c). amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9로 처리된 5개월령 암컷 마우스 (n = 6~7)로부터의 대퇴골의 TRAP-염색된 종단면 (도 33d) 및 조직형태계측학적 분석 (도 33e). 골 주변길이 당 파골세포의 수 (N.Oc/B.Pm). 혈청 CTX 수준을 ELISA에 의해 평가하였다 (n = 6) (도 33f). 스케일 바: 100 μm, 도 33c; 50 mm, 도 33d. 값은 평균 ± SD를 나타낸다; N.S., 유의하지 않음 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 33e 및 33f).
도 34a-34c는 폐경후 골다공증의 마우스 모델에서 전신으로 전달된 scAAV9-amiR-shn3의 치료 효과를 나타낸다. 3개월령 암컷 마우스에서 Sham 또는 OVX 수술을 수행하고, 6주 후, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 i.v. 주사하였다. 주사 7주 후, 마우스를 동적 조직형태계측학을 위해 칼세인 및 알리자린 레드로 라벨링하였다. amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9로 처리된 5개월령 암컷 OVX 마우스로부터의 대퇴골의 종단면에서 폰 코사(Von Kossa) (도 34a) 또는 TRAP (도 34b)에 의한 염색을 수행하였다. 혈청 CTX 수준을 ELISA에 의해 평가하였다 (n = 7) (도 34c). 스케일 바: 1 mm, (도 34a); 50 mm, (도 34b). 값은 평균 ± SD를 나타낸다; NS, 유의하지 않음, ***, P < 0.001 및 ****, P < 0.0001 (독립표본 양측 스튜던트 t-검정에 의함) (도 34c).
도 35a - 35c는 scAAV9.DSS 벡터의 시험관내 또는 생체내 특징화를 나타낸다. (도 35a) scAAV9-Egfp, scAAV9.DSS-588-Egfp 또는 rAAV9.DSS-Nter-Egfp의 1 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스의 무릎 관절에 i.a. 주사하고, 주사 2주 후 EGFP-발현 세포를 확인하기 위해 대퇴골을 동결-절편화하였다. GP, 성장판; CB, 피질골; BM, 골수. 스케일 바: 500 μm, 도 35a. 도 35b 및 35c는 scAAV9-Egfp, scAAV9.DSS-588-Egfp 또는 scAAV9.DSS-Nter-Egfp로 감염 2일 후, COB를 6일 동안 골발생 조건하에 배양하였음을 나타낸다. 골모세포 분화를 ALP 활성 (도 35b) 및 골발생 유전자 발현 (도 35c)에 의해 평가하였다. 값은 평균 ± SD를 나타낸다: N.S, 유의하지 않음 (일원 ANOVA 테스트에 의함) (도 35b 및 35c).
도 36a-36e는 마우스에서 전신으로 전달된 scAAV9.DSS-Nter의 조직 분포를 나타낸다. PBS 또는 scAAV9, scAAV9.DSS-588, 또는 scAAV9.DSS-Nter의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 수컷 마우스에 i.v. 주사하고, 주사 2주 후 IVIS-100 광학 이미징을 사용하여 EGFP 발현을 모니터링하였다. 전신에서의 EGFP 발현 (도 36a) 및 절개된 조직에서의 EGFP 발현의 정량화 (도 36b)가 표시된다. EGFP-발현 세포를 확인하기 위해 심장 (도 36c), 간 (도 36d) 및 요추골 (도 36e)을 동결-절편화하였다. GP, 성장판; BM, 골수. 스케일 바: 100 μm, (도 36c, 36d 및 36e). 값은 평균 ± SD를 나타낸다: *, P < 0.05; **, P < 0.01 및 ***, P < 0.001 (일원 ANOVA 테스트에 의함) (도 36b).
도 37a-37c는 폐경후 골다공증의 마우스 모델에서 amiR-shn3을 운반하는 전신으로 전달된 scAAV9.DSS-Nter의 치료 효과를 나타낸다. 3개월령 암컷 마우스에서 Sham 또는 OVX 수술을 수행하고, 6주 후, PBS 또는 amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 scAAV9.DSS-Nter의 4 x 1011 게놈 카피의 단일 용량을 i.v. 주사하였다. 주사 7주 후, EGFP 발현을 IVIS-100 광학 이미징에 의해 모니터링하였다 (도 37a). 동결-절편화된 대퇴골에서의 EGFP-발현 세포를 형광 현미경법에 의해 확인하였다 (도 37b). 요추골에서의 섬유주골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였으며, 정량화가 표시된다 (n = 7~8/군) (도 37c). 입방 밀리미터 당 섬유주 수 (Tb.N), 섬유주 두께 (Tb.Th), 및 섬유주 공간 (Tb. Sp). TB, 섬유주골; BM, 골수. 스케일 바: 100 mm, 패널 b. 값은 평균 ± SD를 나타낸다: N.S, 유의하지 않음; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001 (일원 ANOVA 테스트에 의함) (도 37c).
<상세한 설명>
본 개시내용의 측면은 대상체에게 전달될 때, 예를 들어 골 형성의 촉진 또는 억제 및/또는 골 재흡수의 촉진 또는 억제에 의해 골 대사를 조정하는데 효과적인 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산, rAAV 등)에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용에 기재된 방법 및 조성물은 일부 실시양태에서 조절이상 골 대사와 연관된 질환 및 장애, 예컨대 골다공증, 염증-유도 골 손실, 유방암 또는 전립선암 전이에 의해 유도된 골 손실, 골화석증, 골육종 및 이소성 골화증의 치료에 유용하다.
단리된 핵산
트랜스진 (예를 들어, 억제성 RNA, 예컨대 shRNA, miRNA 등)을 대상체에게 전달하기 위한 조성물 및 방법이 본 개시내용에 제공된다. 조성물은 전형적으로 골 대사를 조정할 수 있는 트랜스진 (예를 들어, 단백질, 억제성 핵산 등)을 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 트랜스진은 표적 단백질, 예컨대 골 형성의 촉진 또는 억제와 연관된 표적 단백질의 발현을 감소시킨다.
"골 대사"는 일반적으로 골 형성 및/또는 골 재흡수를 수반하는 생물학적 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 골 대사는 골모세포 (OB) 및 분화된 골세포에 의해 생성되는 새로운 골의 형성 및/또는 파골세포 (OC)에 의해 재흡수되는 성숙 골 조직을 수반한다. OB는 궁극적으로 골세포로 최종적으로 분화하는 골수 유래 중간엽 세포로부터 기인한다. OB (및 골세포) 기능 또는 활성은 골 형성, 골 광물화, 및 OC 활성의 조절을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 감소된 골 질량은 OB 및/또는 골세포 기능 또는 활성의 억제로부터 유발된 것으로 관찰되었다. 증가된 골 질량은 증가된 OB 및/또는 골세포 기능 또는 활성으로부터 유발된 것으로 관찰되었다. OC는 골수-유래 단핵구로부터 기인하고, 일부 실시양태에서 OB로부터의 신호에 의해 제어되는 것으로 관찰되었다. OC 기능은 골 재흡수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감소된 골 질량은 증가된 OC 활성으로부터 유발된 것으로 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 증가된 골 질량은 OC 활성의 억제로부터 유발된 것으로 관찰되었다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV는 적어도 하나의 골 대사 조정제 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 골 대사 조정제)를 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "골 대사 조정제"는 예를 들어 골 형성 또는 골 재흡수에 관여하는 단백질, 세포 등의 발현, 활성 및/또는 기능의 증가 또는 감소에 의해 골 형성 또는 침착을 유도 또는 억제하는 분자 (핵산 또는 핵산에 의해 코딩된 단백질, 예를 들어 트랜스진)를 지칭한다. 일반적으로, 골 대사 조정제는 펩티드, 단백질 또는 간섭 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 인공 miRNA 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 골 대사 조정제는 골 형성 유도제이다. 일부 실시양태에서, 골 대사 조정제는 골 형성 억제제이다.
"골 형성 유도제"는 OB 및/또는 골세포 (OCY) 분화 또는 활성의 촉진에 의해 및/또는 OC 활성의 억제에 의해 골 합성을 촉진하는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 골 형성 유도제는 OB 및/또는 골세포 기능 또는 활성 (예를 들어, 골 형성, 광물화, 파골세포 활성 또는 기능의 조절 등)을 촉진하는 핵산 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드 또는 miRNA 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 핵산 (예를 들어, 트랜스진)에 의해 코딩된 단백질이다. 일부 실시양태에서, OB 및/또는 골세포 활성 또는 기능을 촉진하는 골 형성 유도제의 예는 부갑상선 호르몬 (PTH), PTH-관련 단백질 (PTHrP), 데글리카제 DJ1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 골 형성 유도제는 OC 분화 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산, 예컨대 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK) 등을 표적화하는 억제성 핵산이다.
"골 형성 억제제"는 OB 및/또는 골세포 분화 또는 활성을 억제하고/거나 OC 분화, 활성 또는 기능을 증가시키는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 골 형성 억제제는 OB 및/또는 골세포 분화 또는 활성을 억제하는 핵산 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드 또는 miRNA 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 핵산 (예를 들어, 트랜스진)에 의해 코딩된 단백질이다. 일부 실시양태에서, OB 및/또는 골세포 활성 또는 기능을 억제하는 골 형성 억제제의 예는 MAPK 억제제, 및 프로염증성 시토카인 (예를 들어, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 골 형성 억제제는 OB 및/또는 골세포 분화 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산이다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 인공 마이크로RNA (ami-RNA) 등을 코딩한다. 일반적으로, 억제성 핵산은 골 대사와 연관된 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질) (예를 들어, PTH, PTHrP, DJ1, SOST, SHN3, CTSK 등)을 코딩하는 유전자의 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상)의 연속 염기에 특이적으로 결합한다 (예를 들어, 이와 혼성화함). 본원에 사용된 바와 같은 "연속 염기"는 서로에 (예를 들어, 핵산 분자의 일부로서) 공유결합으로 결합된 (예를 들어, 하나 이상의 포스포디에스테르 결합 등에 의해) 2개 이상의 뉴클레오티드 염기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 억제성 핵산은 골 대사와 연관된 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질) (예를 들어, PTH, PTHrP, DJ1, SOST, SHN3, CTSK, RANK 등)을 코딩하는 유전자의 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상)의 연속 뉴클레오티드 염기와 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 동일하다.
"마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 전사 또는 번역후 유전자 침묵을 매개할 수 있는 작은 비코딩 RNA 분자이다. 전형적으로, miRNA는 일차 miRNA (pri-miRNA)로 지칭되는 헤어핀 또는 스템-루프 (예를 들어, 자기-상보성, 단일-가닥 백본을 가짐) 이중나선 구조로서 전사되며, 이는 pre-miRNA로 효소적으로 프로세싱된다 (예를 들어, Drosha, DGCR8, Pasha 등에 의해). pri-miRNA의 길이는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, pri-miRNA는 길이가 약 100 내지 약 5000개의 염기 쌍 (예를 들어, 약 100, 약 200, 약 500, 약 1000, 약 1200, 약 1500, 약 1800 또는 약 2000개의 염기 쌍)의 범위이다. 일부 실시양태에서, pri-miRNA는 길이가 200개 초과의 염기 쌍 (예를 들어, 길이가 2500, 5000, 7000, 9000개 이상의 염기 쌍)이다.
헤어핀 또는 스템-루프 이중나선 구조를 또한 특징으로 하는 Pre-miRNA는 또한 길이가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, pre-miRNA는 약 40개의 염기 쌍 길이 내지 약 500개의 염기 쌍 길이의 크기 범위이다. 일부 실시양태에서, pre-miRNA는 약 50 내지 100개의 염기 쌍 길이의 크기 범위이다. 일부 실시양태에서, pre-miRNA는 약 50 내지 약 90개의 염기 쌍 길이의 크기 범위이다 (예를 들어, 약 50, 약 52, 약 54, 약 56, 약 58, 약 60, 약 62, 약 64, 약 66, 약 68, 약 70, 약 72, 약 74, 약 76, 약 78, 약 80, 약 82, 약 84, 약 86, 약 88 또는 약 90개의 염기 쌍 길이).
일반적으로, pre-miRNA는 세포질로 유출되고, Dicer에 의해 효소적으로 프로세싱되어, 먼저 불완전한 miRNA/miRNA* 이중나선을 생성한 다음 단일-가닥 성숙 miRNA 분자를 생성하고, 이는 후속적으로 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 로딩된다. 전형적으로, 성숙 miRNA 분자는 약 19 내지 약 30개의 염기 쌍 길이의 크기 범위이다. 일부 실시양태에서, 성숙 miRNA 분자는 길이가 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 30개의 염기 쌍이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 인공 miRNA를 코딩하는 단리된 핵산 및 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "인공 miRNA" 또는 "amiRNA"는 내인성 pri-miRNA 또는 pre-miRNA (예를 들어, 기능적 성숙 miRNA를 생성할 수 있는 전구체 miRNA인 miRNA 백본)를 지칭하며, 여기서 miRNA 및 miRNA* (예를 들어, miRNA 이중나선의 패신저(passenger) 가닥) 서열은 예를 들어 문헌 [Eamens et al. (2014), Methods Mol. Biol. 1062:211-224]에 기재된 바와 같이 표적화된 유전자의 고효율 RNA 침묵을 지정하는 상응하는 amiRNA/amiRNA* 서열로 대체되었다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 인공 miRNA는 골 대사 조정 (예를 들어, 골 형성 억제제) miRNA를 코딩하는 서열이 내인성 miR-155 성숙 miRNA-코딩 서열 대신에 삽입된 miR-155 pri-miRNA 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 miRNA (예를 들어, 인공 miRNA)는 miR-155 백본 서열, miR-30 백본 서열, mir-64 백본 서열, 또는 miR-122 백본 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 슈누리-3 단백질을 코딩하는 SHN3 유전자 (GeneID: 59269)를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 슈누리-3 (SHN3) 단백질은 NK-κβ 단백질 발현 및 이뮤노글로불린 및 T-세포 수용체 항체 재조합을 조절하는 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자는 NCBI 등록 번호 NM_001127714.2 또는 NM_024503.5로 표시된다. 일부 실시양태에서, SHN3 단백질은 NCBI 등록 번호 NP_001121186.1 또는 NP_078779.2로 표시된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 SHN3 발현 (예를 들어, SHN3 유전자로부터 하나 이상의 유전자 생성물의 발현, 예를 들어 서열식별번호: 69의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 서열식별번호: 70에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현)을 감소시키는데 사용되는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나 상보성 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자의 6 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나 상보성 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자의 12-24개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자의 9-27개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 길이가 6-50개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 길이가 8-24개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 길이가 12-36개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 길이가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제성 핵산은 표적 유전자의 발현을 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 내지 99%의 임의의 정수, 포함)만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제성 핵산은 표적 유전자의 발현을 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제성 핵산은 표적 유전자의 발현을 80% 내지 99%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제성 핵산은 SHN3 유전자의 발현을 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 내지 99%의 임의의 정수, 포함)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제성 핵산은 SHN3 유전자의 발현을 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제성 핵산은 SHN3 유전자의 발현을 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
트랜스진을 포함하는 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)은 단리된 핵산의 임의의 적합한 위치에 위치될 수 있다. 영역은 예를 들어, 인트론, 5' 또는 3' 비번역된 영역 등을 포함하는 핵산의 임의의 비번역된 부분에 위치될 수 있다.
일부 경우에, 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 단백질 코딩 서열)의 제1 코돈의 상류에 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 위치시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈 및 제1 코돈의 2000개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈 및 제1 코돈의 1000개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈 및 제1 코돈의 500개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈 및 제1 코돈의 250개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈 및 제1 코돈의 150개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다.
일부 경우에 (예를 들어, 트랜스진에 단백질 코딩 서열이 결여된 경우), 트랜스진의 폴리-A 꼬리의 상류에 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 위치시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 2000개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 1000개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 500개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 250개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 150개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 100개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 50개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 제1 염기 및 제1 염기의 20개 뉴클레오티드 상류 사이에 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 영역은 프로모터 서열의 마지막 뉴클레오티드 염기 및 폴리-A 꼬리 서열의 제1 뉴클레오티드 염기 사이에 위치된다.
일부 경우에, 영역은 트랜스진의 폴리-A 꼬리의 마지막 염기의 하류에 위치될 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 마지막 염기 및 마지막 염기의 2000개 뉴클레오티드 하류에 있는 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 마지막 염기 및 마지막 염기의 1000개 뉴클레오티드 하류에 있는 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 마지막 염기 및 마지막 염기의 500개 뉴클레오티드 하류에 있는 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 마지막 염기 및 마지막 염기의 250개 뉴클레오티드 하류에 있는 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 꼬리의 마지막 염기 및 마지막 염기의 150개 뉴클레오티드 하류에 있는 위치 사이에 있을 수 있다.
트랜스진이 하나 초과의 miRNA를 코딩하는 경우, 각 miRNA는 트랜스진 내의 임의의 적합한 위치에 위치될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 제1 miRNA를 코딩하는 핵산은 트랜스진의 인트론에 위치될 수 있고, 제2 miRNA를 코딩하는 핵산 서열은 또 다른 비번역된 영역 (예를 들어, 단백질 코딩 서열의 마지막 코돈 및 트랜스진의 폴리-A 꼬리의 제1 염기 사이)에 위치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 하나 이상의 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터 등)을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 코딩된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적 프로모터를 포함하는 다수의 발현 제어 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있으며 사용될 수 있다.
"프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 문구 "작동가능하게 위치된", "제어 하에" 또는 "전사 제어 하에"는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위해 핵산에 관하여 올바른 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 다음에 및 3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 개시내용에 유용한 rAAV 구축물은 또한 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열 및 트랜스진 사이에 위치된 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되고 SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩티드를 생성하는데 사용된다. IRES 서열은 하나 초과의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질을 생성하는데 사용될 것이다. 이들 및 다른 공통 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 많은 이러한 서열이 이용가능하다 [예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.,] 및 예를 들어, 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27에서 그에 인용된 참고문헌 및 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조]. 일부 실시양태에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 다단백질에 포함되며; 이는 다단백질의 절단을 매개하는 것으로 밝혀진 작은 펩티드 (길이 대략 18개의 아미노산)이다 (문헌 [Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933]; [Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127]; [Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873]; 및 [Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459]). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 벡터 (AAV 및 레트로바이러스)를 포함하는 인공 시스템에서 이전에 입증되었다 (문헌 [Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933]; [Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127]; [Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873]; 및 [Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459]; [de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208]; [de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.]; 및 [Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817]).
구성적 프로모터의 예는 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로 RSV 인핸서 포함), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로 CMV 인핸서 포함) [예를 들어, 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 [인비트로젠(Invitrogen)]를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 향상된 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 U6 프로모터이다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인성으로 공급된 화합물, 환경 인자, 예컨대 온도, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의해, 또는 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 제한 없이, 인비트로젠, 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)를 포함하는 다양한 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되었고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제성 시스템 (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도성 시스템 (문헌 [Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 문헌 [Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조), RU486-유도성 시스템 (문헌 [Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 [Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]) 및 라파마이신-유도성 시스템 (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제 세포에서만 조절되는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 트랜스진을 위한 천연 프로모터가 사용될 것이다. 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것을 원하는 경우 천연 프로모터가 바람직할 수 있다. 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특이적 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 컨센서스 서열이 또한 천연 발현을 모방하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절성 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절성 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절성 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 조직-특이적 조절성 서열은 다음 조직 특이적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 간-특이적 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터, 소마토스타틴 프로모터, 췌장 폴리펩티드 (PPY) 프로모터, 시냅신-1 (Syn) 프로모터, 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터, 포유류 데스민 (DES) 프로모터, α-미오신 중쇄 (a-MHC) 프로모터, 또는 심장 트로포닌 T (cTnT) 프로모터. 다른 예시적인 프로모터는 베타-액틴 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터, (Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)); 알파-태아단백질 (AFP) 프로모터, (Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 골 오스테오칼신 프로모터 (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); 골 시알로단백질 프로모터 (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), CD2 프로모터 (Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)); 이뮤노글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 α-쇄 프로모터, 뉴런, 예컨대 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 뉴로필라멘트 경쇄 유전자 프로모터 (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터 (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))를 포함하며, 특히 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터는 골 조직-특이적 프로모터이다. 골 조직-특이적 프로모터의 예는 오스테릭스, 오스테오칼신, 유형 1 콜라겐 α1, DMP1, 카텝신 K, Rank 등의 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 측면은 하나 초과의 프로모터 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의 프로모터)를 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 제1 영역 및 억제성 RNA (예를 들어, miRNA)를 코딩하는 제2 영역을 포함하는 트랜스진을 갖는 구축물의 맥락에서, 제1 프로모터 서열 (예를 들어, 단백질 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 서열)을 사용하여 단백질 코딩 영역의 발현을 구동하고, 제2 프로모터 서열 (예를 들어, 억제성 RNA 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터 서열)을 사용하여 억제성 RNA 코딩 영역의 발현을 구동하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 제1 프로모터 서열 및 제2 프로모터 서열은 동일한 프로모터 서열 또는 상이한 프로모터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터 서열 (예를 들어, 단백질 코딩 영역의 발현을 구동하는 프로모터)은 RNA 폴리머라제 III (polIII) 프로모터 서열이다. polIII 프로모터 서열의 비제한적인 예는 U6 및 H1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터 서열 (예를 들어, 억제성 RNA의 발현을 구동하는 프로모터 서열)은 RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 서열이다. polII 프로모터 서열의 비제한적인 예는 T7, T3, SP6, RSV 및 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, polIII 프로모터 서열은 억제성 RNA (예를 들어, miRNA) 코딩 영역의 발현을 구동한다. 일부 실시양태에서, polII 프로모터 서열은 단백질 코딩 영역의 발현을 구동한다.
재조합 AAV (rAAV)
본 개시내용의 단리된 핵산은 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (rAAV 벡터)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 또는 그의 변이체를 포함하는 영역 (예를 들어, 제1 영역)을 포함한다. 단리된 핵산 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터)은 캡시드 단백질로 패키징되고 대상체에게 투여되고/거나 선택된 표적 세포에 전달될 수 있다. "재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절성 서열, 및 5' 및 3' AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)로 구성된다. 트랜스진은 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이, 대상체의 내인성 mRNA를 표적화하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 단백질 및/또는 억제성 핵산 (예를 들어, shRNA, miRNA 등)을 코딩하는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 트랜스진은 또한 본 개시내용의 다른 부분에 개시된 바와 같이 예를 들어, 단백질 및/또는 발현 제어 서열 (예를 들어, 폴리-A 꼬리)을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 코딩하는 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 약간의 변형이 허용된다. 이들 ITR 서열을 변형하는 능력은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. (예를 들어, 교과서, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]; 및 [K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)] 참조). 본 발명에서 사용되는 이러한 분자의 예는 선택된 트랜스진 서열 및 연관된 조절 요소가 5' 및 3' AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유류 AAV 유형을 포함하는 임의의 공지된 AAV로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, AAV2/2-125로부터 선택된 혈청형, 및 그의 변이체를 갖는 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 AAV2 ITR을 코딩하는 영역 (예를 들어, 제1 영역)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 제2 AAV ITR을 포함하는 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, AAV2/2-125로부터 선택된 혈청형, 및 그의 변이체를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 ITR은 기능적 말단 분해 부위 (TRS)가 결여된 돌연변이체 ITR이다. 용어 "말단 분해 부위 결여"는 ITR의 말단 분해 부위 (TRS)의 기능을 중단시키는 돌연변이 (예를 들어, 센스 돌연변이, 예컨대 비동의어 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이)를 포함하는 AAV ITR, 또는 기능적 TRS (예를 들어, ΔTRS ITR)를 코딩하는 핵산 서열이 결여된 말단절단된 AAV ITR을 지칭할 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 기능적 TRS가 결여된 ITR을 포함하는 rAAV 벡터는 예를 들어 문헌 [McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656]에 기재된 바와 같이 자기-상보적 rAAV 벡터를 생성한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자기-상보적 AAV 벡터" (scAAV)는 AAV의 ITR 중 하나로부터의 말단 분해 부위 (TR)의 부재에 의해 생성된 이중-가닥 벡터 게놈을 함유하는 벡터를 지칭한다. TR의 부재는 TR이 존재하지 않는 벡터 말단에서 복제의 개시를 방지한다. 일반적으로, scAAV 벡터는 각 말단에 야생형 (wt) AAV TR 및 중간에 돌연변이된 TR (mTR)을 갖는 단일-가닥 역전된 반복 게놈을 생성한다. 본 발명은 RNA 헤어핀 구조 (예를 들어, shRNA, miRNA 및 AmiRNA)를 코딩하는 DNA 단편이 바이러스 게놈 복제 동안 돌연변이체 역전된 말단 반복부 (mTR)와 유사한 기능을 제공하여 자기-상보적 AAV 벡터 게놈을 생성할 수 있다는 인식에 부분적으로 기초한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 2개의 말단 각각에 역전된 말단 반복부 (ITR)를 갖는 단일-가닥 자기-상보적 핵산 및 헤어핀-형성 RNA (예를 들어, shRNA, miRNA, ami-RNA 등)를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 중앙 부분을 포함하는 rAAV (예를 들어, 자기-상보적 AAV; scAAV) 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-형성 RNA (예를 들어, shRNA, miRNA, ami-RNA 등)를 코딩하는 서열은 돌연변이체 ITR에 의해 일반적으로 점유된 자기-상보적 핵산의 위치에서 치환된다.
"재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절성 서열, 및 5' 및 3' AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)로 구성된다. 이는 캡시드 단백질로 패키징되고 선택된 표적 세포에 전달되는 이 재조합 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 관심있는 폴리펩티드, 단백질, 기능적 RNA 분자 (예를 들어, miRNA, miRNA 억제제) 또는 다른 유전자 생성물을 코딩하는 벡터 서열에 이종인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 표적 조직의 세포에서 트랜스진 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절성 구성성분에 작동가능하게 연결된다.
본 개시내용은 단일 시스-작용 야생형 ITR을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, ITR은 5' ITR이다. 일부 실시양태에서, ITR은 3' ITR이다. 일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR(들)을 코딩하는 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 약간의 변형이 허용된다. ITR 서열을 변형하는 능력은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. (예를 들어, 교과서, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]; 및 [K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)] 참조). 예를 들어, ITR은 그의 말단 분해 부위 (TR)에서 돌연변이될 수 있으며, 이는 TR이 돌연변이된 벡터 말단에서의 복제를 억제하고 자기-상보적 AAV의 형성을 초래한다. 본 개시내용에서 사용되는 이러한 분자의 또 다른 예는 선택된 트랜스진 서열 및 연관된 조절 요소가 5' AAV ITR 서열 및 3' 헤어핀-형성 RNA 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유류 AAV 유형을 포함하는 임의의 공지된 AAV로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, 및/또는 AAVrh10 ITR 서열이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 슈도형(pseudotyped) rAAV이다. 예를 들어, Y의 단백질로 캡시드화된 혈청형 X의 ITR을 함유하는 슈도형 AAV 벡터는 AAVX/Y로 명명될 것이다 (예를 들어, AAV2/1은 AAV2의 ITR 및 AAV1의 캡시드를 갖음). 일부 실시양태에서, 슈도형 rAAV는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질의 조직-특이적 표적화 능력을 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 바이러스 DNA와 조합하여, 이에 의해 표적 조직으로의 트랜스진의 표적화된 전달을 허용하는데 유용할 수 있다.
원하는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 수득하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, US 2003/0138772를 참조하며, 그 내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨). 전형적으로 방법은 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 및 트랜스진으로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질로의 재조합 AAV 벡터의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 수반한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV의 cap 유전자에 의해 코딩되는 구조 단백질이다. AAV는 3개의 캡시드 단백질, 비리온 단백질 1 내지 3 (VP1, VP2 및 VP3으로 명명됨)을 포함하며, 이들 모두는 대안적인 스플라이싱을 통해 단일 cap 유전자로부터 전사된다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 각각 약 87 kDa, 약 72 kDa 및 약 62 kDa이다. 일부 실시양태에서, 번역시, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈 주위에 구형 60-mer 단백질 쉘을 형성한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질의 기능은 바이러스 게놈을 보호하고 게놈을 전달하고 숙주와 상호작용하는 것이다. 일부 측면에서, 캡시드 단백질은 조직 특이적 방식으로 바이러스 게놈을 숙주에 전달한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, AAV2/2-125로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 비인간 영장류로부터 유래된 혈청형, 예를 들어 scAAV.rh8, AAV.rh39, 또는 AAV.rh43 혈청형이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형이다.
본 개시내용은 골 조직에 대한 증가된 주향성을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV에 부분적으로 기초한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 골-표적화 펩티드에 그라프팅된다. 이종 골-표적화 펩티드는 OC (예를 들어, OB에 비해 OC를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함) 또는 OB (예를 들어, OC에 비해 OB를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함)를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골-표적화 펩티드는 (AspSerSer)6 펩티드이며, 이는 또한 DSS6 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 16)로 지칭될 수 있다. 추가 골-표적화 펩티드는 HABP-19 펩티드 (CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL; 서열식별번호: 17)이며, 이는 또한 HABP 펩티드로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골-표적화 펩티드는 8-14개의 아스파르트산 잔기를 포함하는 (Asp)8-14 펩티드이다 (예를 들어, 서열식별번호: 57-63에 기재된 바와 같음). 골-표적화 펩티드의 추가 예는 문헌 [Ouyang et al. (2009) Lett. Organic Chem 6(4):272-277]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 골-표적화 펩티드는 서열식별번호: 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61, 62 및 63에 기재된 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "그라프팅"은 한 분자를 또 다른 분자와 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 적어도 2개의 분자 중 하나가 적어도 2개의 분자 중 또 다른 분자 내에 삽입되도록 적어도 2개의 분자를 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 적어도 2개의 분자 중 하나가 적어도 2개의 분자 중 또 다른 분자에 첨부되도록 적어도 2개의 중합체 분자를 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 하나의 중합체 분자 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드)를 또 다른 중합체 분자 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드)와 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 적어도 2개의 분자 중 하나가 적어도 2개의 핵산 분자 중 또 다른 분자에 첨부되도록 적어도 2개의 핵산 분자를 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 적어도 2개의 핵산 분자 중 하나가 적어도 2개의 핵산 분자 중 또 다른 분자 내에 삽입되도록 적어도 2개의 핵산 분자를 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 표적화 펩티드가 VP2 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산의 특정 유전자좌에 그라프팅될 수 있다는 것이 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 표적화 펩티드 (예를 들어, 골-표적화 펩티드)는 AAV2 또는 AAV9 VP2 캡시드 단백질의 Q588 및 A589 및/또는 N587 및 R588을 코딩하는 코돈 사이의 위치에 상응하는 위치에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 VP3 캡시드 단백질의 N587 및 R588을 코딩하는 코돈 사이의 위치 (또는 AAV2 또는 AAV9에서 이러한 아미노산 위치에 상응하는 위치)에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 VP1 캡시드 단백질의 S452 및 G453을 코딩하는 코돈 사이의 위치에 삽입된다. 다른 잠재적인 위치는 N587 및 R588일 수 있다.
일부 실시양태에서, 그라프팅을 통해 형성된 핵산 (그라프팅된 핵산)은 키메라 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 그라프팅된 핵산은 하나의 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드에 효과적으로 삽입되도록 (예를 들어, N-말단 전에 또는 C-말단 후에 직접 접합되지 않음) 키메라 단백질을 코딩하여, 2개의 폴리펩티드의 인접 융합을 생성한다. 일부 실시양태에서, 그라프팅된 핵산은 하나의 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드에 효과적으로 첨부되도록 (예를 들어, N-말단 전에 또는 C-말단 후에 직접 접합되지 않음) 키메라 단백질을 코딩하여, 2개의 폴리펩티드의 인접 융합을 생성한다. 일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 그의 단편 중 하나가 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 그의 단편 중 또 다른 것 내에 삽입되도록 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 그라프팅은 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 그의 단편 중 하나가 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 그의 단편 중 또 다른 것에 첨부되도록 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 연결 또는 연합시키는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 골-표적화 모이어티에 접합된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질에 관한 것이다. "골-표적화 모이어티"는 일반적으로 골 또는 골 조직으로 rAAV의 트래피킹을 용이하게 하는 소분자, 펩티드, 핵산 등을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 골-표적화 모이어티는 골 세포 (예를 들어, OB, OC, 골세포 등) 상의 수용체에 결합하는 펩티드 또는 소분자이다. 골-표적화 모이어티의 예는 알렌드로네이트 (ALE), 폴리펩티드, 예컨대 시클릭 아르기닌-글리신-아스파르트산-티로신-리신 (cRGCyk), Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (D-Asp8), 및 아프타머, 예컨대 CH6을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 골-표적화 모이어티는 캡시드 단백질에 직접 접합되거나 링커 분자 (예를 들어, 아미노산 링커, PEG 링커 등)를 통해 캡시드 단백질에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 글리신-풍부 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 2개의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGS (서열식별번호: 64)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함한다: [G]n (서열식별번호: 65), [G]nS (서열식별번호: 66), [GS]n (서열식별번호: 67), 및 [GGSG]n (서열식별번호: 68), 여기서 G는 글리신이고, n은 1 초과의 정수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상)이다. 일부 실시양태에서, n은 2 내지 10, 2 내지 20, 5 내지 10, 5 내지 15, 또는 5 내지 25 범위의 정수이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이종 표적화 펩티드는 링커에 접합된다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 ADIBO-태그부착된 골-표적화 모이어티와 반응할 수 있는 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 포함한다 (예를 들어, "클릭 화학"을 통해 캡시드 단백질-골-표적화 모이어티 접합체를 형성함). 비천연 아지드-보유 아미노산을 포함하는 캡시드 단백질은 예를 들어 문헌 [Zhang et al. (2016) Biomaterials 80:134-145]에 기재되어 있으며, 펩티드 접합을 위한 ADIBO-기반 클릭 화학의 사용은 예를 들어 문헌 [Prim et al. (2013) Molecules 18(8):9833-49]에 기재되어 있다.
AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양될 구성성분은 트랜스로 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 임의의 하나 이상의 필수 구성성분 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및/또는 헬퍼 기능)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 하나 이상의 필수 구성성분을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어하에 필수 구성성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필수 구성성분(들)은 구성적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 구성적 프로모터의 예는 트랜스진과 함께 사용하기에 적합한 조절 요소에 대한 논의에서 본원에 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어하에 선택된 구성성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 다른 선택된 구성성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포 (구성적 프로모터의 제어하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래되나 유도성 프로모터의 제어하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 여전히 다른 안정한 숙주 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 생성될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV를 생성하는데 필요한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전 요소 (벡터)를 사용하여 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전 요소는 본원에 기재된 것들을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 실시양태를 구축하는데 사용되는 방법은 핵산 조작의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 유전자 조작, 재조합 조작 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조한다. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 널리 공지되어 있으며, 적합한 방법의 선택은 본 개시내용을 제한하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 번호 5,478,745를 참조한다.
일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염 방법 (미국 특허 번호 6,001,650에 상세하게 기재됨)을 사용하여 생성될 수 있다. 전형적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자, AAV 헬퍼 기능 벡터 및 보조 기능 벡터로 패키징될 재조합 AAV 벡터 (트랜스진 포함)로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 생성된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 생산적인 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 트랜스로 기능하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열 (즉, rep 및 cap)을 코딩한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출가능한 야생형 AAV 비리온 (즉, 기능적 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않고 효율적인 AAV 벡터 생성을 지지한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 6,001,650에 기재된 pHLP19 및 미국 특허 번호 6,156,303에 기재된 pRep6cap6 벡터를 포함하며, 상기 두 특허의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 보조 기능 벡터는 비-AAV 유래된 바이러스에 대한 뉴클레오티드 서열 및/또는 AAV가 복제에 의존적인 세포 기능 (즉, "보조 기능")을 코딩한다. 보조 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 어셈블리에 관여하는 모이어티를 제한 없이 포함하는 AAV 복제에 필요한 기능을 포함한다. 바이러스-기반 보조 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스 유형-1 제외), 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 유입을 지칭하는데 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입될 때 세포는 "형질감염"되었다. 수많은 형질감염 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456], [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York], [Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier], 및 [Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 핵산, 예컨대 뉴클레오티드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포에 도입하는데 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 관심있는 물질을 보유하거나 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 (Sf9), 또는 포유류 (예를 들어, 인간, 설치류, 비인간 영장류 등) 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 구축물, AAV 미니유전자 플라스미드, 보조 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생성과 연관된 다른 이동 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 그러므로, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 부모 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체에서 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있음이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포주"는 시험관내에서 연속적 또는 연장된 성장 및 분열이 가능한 세포 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 선조 세포로부터 유래된 클론 집단이다. 자발적 또는 유도된 변화가 이러한 클론 집단의 저장 또는 이동 동안 핵형에서 발생할 수 있음이 관련 기술분야에 추가로 공지되어 있다. 따라서, 언급된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확히 동일하지 않을 수 있으며, 언급된 세포주는 이러한 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 세포"는 외인성 DNA 세그먼트, 예컨대 생물학적 활성 폴리펩티드의 전사 또는 생물학적 활성 핵산, 예컨대 RNA의 생성을 유발하는 DNA 세그먼트가 도입된 세포를 지칭한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 단리된 핵산 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV를 제공하며, 여기서 트랜스진은 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 인공 마이크로RNA는 세포 (예를 들어, 골모세포, 파골세포, 골세포, 연골세포) 또는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현을 감소시키는 인공 마이크로RNA를 포함한다.
rAAV는 골 세포 (예를 들어, 골모세포, 파골세포, 골세포, 연골세포)에 대한 rAAV의 표적화를 증가시키는 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다. 골 세포에 대한 rAAV의 표적화를 증가시키는 변형의 비제한적인 예는 이종 골-표적화 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61, 62 또는 63 중 어느 하나에 기재된 바와 같음), AAV 캡시드 혈청형 (예를 들어, AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh39, AAVrh43)을 포함한다.
세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 rAAV를 사용하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 내지 99%의 임의의 정수, 포함)만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 rAAV를 사용하여 75% 내지 90%만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 rAAV를 사용하여 80% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV를 생성하기 위해 원하는 AAV 캡시드에 재조합 벡터를 패키징하는 상기 방법은 제한을 의미하지 않으며, 다른 적합한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
투여 방식 및 조성물
본 개시내용의 rAAV는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에 전달될 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 생리적으로 적합한 담체 (예를 들어, 조성물)에 현탁된 rAAV는 대상체, 예를 들어, 숙주 동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니피그, 햄스터, 닭, 칠면조, 또는 비인간 영장류 (예를 들어, 마카크)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 동물은 인간을 포함하지 않는다.
포유류 대상체에게 rAAV의 전달은 예를 들어, 근육내 주사에 의해 또는 포유류 대상체의 혈류로의 투여에 의해 수행될 수 있다. 혈류로의 투여는 정맥, 동맥, 또는 임의의 다른 혈관 도관으로의 주사에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 수술 분야에 널리 공지된 기술인 분리된 사지 관류에 의해 혈류로 투여되며, 상기 방법은 본질적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자가 rAAV 비리온의 투여 전에 전신 순환으로부터 사지를 분리할 수 있게 한다. 미국 특허 번호 6,177,403에 기재된 분리된 사지 관류 기술의 변경이 또한 근육 세포 또는 조직으로의 형질도입을 잠재적으로 향상시키기 위해 분리된 사지의 혈관계에 비리온이 투여되도록 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다. 더욱이, 특정 예에서, 비리온을 대상체의 골 (예를 들어, 골 조직)에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "골 조직"은 척추동물의 골 및/또는 관절 (예를 들어, 연골, 축 및 사지골 등)의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 그러므로, 상기 용어는 골모세포, 골세포, 파골세포, 연골세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 재조합 AAV는 주사에 의해 골에 직접, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 외과적 기술을 사용하여 바늘, 카테터 또는 관련 장치를 사용하여 윤활막내 주사, 무릎 주사, 대퇴 골수내 주사 등을 통해 골에 직접 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 근육내 주사에 의해 투여된다.
본 개시내용의 측면은 트랜스진을 코딩하는 핵산 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 트랜스진은 하나 이상의 골 대사 조정제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 AAV ITR을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 1-15 중 어느 하나에 기재된 서열 (또는 그의 상보적 서열) 또는 그의 부분을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 SHN3을 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 3에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 16-17 또는 57-63에 기재된 바와 같은 이종 골-표적화 펩티드를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 측면은 세포에서 SHN3 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 세포는 단일 세포 또는 세포 집단 (예를 들어, 배양물)일 수 있다. 세포는 생체내 (예를 들어, 대상체) 또는 시험관내 (예를 들어, 배양물)에 있을 수 있다. 대상체는 포유동물, 임의적으로 인간, 마우스, 래트, 비인간 영장류, 돼지, 개, 고양이, 닭 또는 소일 수 있다.
세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 단리된 핵산, rAAV 또는 조성물을 사용하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 내지 99%의 임의의 정수, 포함)만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 단리된 핵산, rAAV 또는 조성물을 사용하여 75% 내지 90%만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 단리된 핵산, rAAV 또는 조성물을 사용하여 80% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 rAAV를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 바이러스와 조합하여 포함할 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 상이한 트랜스진을 갖는 제2 rAAV). 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 상이한 트랜스진을 각각 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 rAAV를 포함한다.
적합한 담체는 rAAV가 지정되는 적응증의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 염수를 포함하며, 이는 다양한 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수)으로 제제화될 수 있다. 다른 예시적인 담체는 멸균 염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참기름 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 개시내용을 제한하지 않는다.
임의로, 본 개시내용의 조성물은 rAAV 및 담체(들) 이외에, 다른 통상적인 제약 성분, 예컨대 보존제, 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
rAAV는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 유해 효과 없이 충분한 수준의 유전자 이동 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 제약상 허용되는 투여 경로는 선택된 장기로의 직접적인 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 경구, 흡입 (비강내 및 기관내 전달 포함), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 투여 경로는 원하는 경우 조합될 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하는데 필요한 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어 게놈 카피/체중 킬로그램 당 (GC/kg)의 용량 단위는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 인자에 기초하여 달라질 것이다: rAAV 비리온 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료될 특정 질환 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 언급된 인자, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 인자에 기초하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위해 rAAV 비리온 용량 범위를 쉽게 결정할 수 있다.
rAAV의 "유효량"은 동물을 감염시키고 원하는 조직 (예를 들어, 골 조직)을 표적화하기에 충분한 양이다. 유효량은 주로 인자, 예컨대 종, 나이, 체중, 대상체의 건강, 및 표적화될 조직에 따라 달라질 것이며, 그러므로 동물 및 조직에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, rAAV의 유효량은 일반적으로 약 109 내지 1016 게놈 카피를 함유하는 용액 약 1 ml 내지 약 100 ml 범위이다. 일부 경우에, 약 1011 내지 1013 rAAV 게놈 카피의 투여량이 적절하다. 특정 실시양태에서, 1012 또는 1013 rAAV 게놈 카피가 골 조직을 표적화하기에 효과적이다.
일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역일 (예를 들어, 24-시간 기간) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 역일 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 1 역주 (예를 들어, 7 역일) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 2주에 1회 (예를 들어, 2 역주 기간에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역월 당 1회 (예를 들어, 30 역일에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 6 역월 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역년 (예를 들어, 365일 또는 윤년에 366일) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, rAAV 조성물은 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우 (예를 들어, ~1013 GC/ml 이상) 조성물에서 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제제화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178]을 참조하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함됨).
제약상-허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 투약법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 투약법의 개발과 마찬가지로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 달라질 수 있고 편리하게는 총 제형의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 또는 그 이상일 수 있다. 물론, 각각의 치료적으로-유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량으로 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 인자, 예컨대 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항이 이러한 제약 제형을 제조하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이며, 이와 같이 다양한 투여량 및 치료 투약법이 바람직할 수 있다.
특정 상황에서, rAAV-기반 치료적 구축물을 본원에 개시된 적합하게 제제화된 제약 조성물로 피하로, 췌장내로, 비강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 경막내로, 대퇴 골수내로 또는 경구로, 복강내로, 또는 흡입에 의해 전달하는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시양태에서, 미국 특허 번호 5,543,158; 5,641,515 및 5,399,363 (각각은 구체적으로 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 투여 방식이 rAAV를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 투여 방식은 문맥 정맥 주사에 의한 것이다.
주사가능한 사용에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일로 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 많은 경우, 형태는 쉽게 주사할 수 있을 정도로 멸균이고 유동적이다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 유발될 수 있다.
예를 들어, 주사가능한 수용액의 투여를 위해, 용액은 필요하다면 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되게 하였다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 ml의 피하주입액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 숙주의 상태에 따라 투여량의 일부 변경이 필연적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떤 경우에도 개별 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 본원에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 rAAV를 혼입한 다음 여과 멸균화하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균화된 활성 성분을 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분 및 기본 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클에 혼입하여 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상-허용되는 염은 산 부가 염 (단백질의 유리 아미노 기로 형성됨)을 포함하며, 무기산, 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성된다. 유리 카르복실 기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제제화시, 용액은 투여 제형과 호환되는 방식으로 및 치료 유효량으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대 주사가능한 용액, 약물-방출 캡슐 등으로 쉽게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 제약 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 문구 "제약상-허용되는"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.
전달 비히클, 예컨대 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 소포 등은 본 개시내용의 조성물을 적합한 숙주 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 전달된 트랜스진은 전달을 위해 제제화되거나 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노스피어 또는 나노입자 등으로 캡슐화될 수 있다.
이러한 제형은 본원에 개시된 핵산 또는 rAAV 구축물의 제약상 허용되는 제형의 도입에 바람직할 수 있다. 리포솜의 형성 및 사용은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 최근에는, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖는 리포솜이 개발되었다 (미국 특허 번호 5,741,516). 또한, 잠재적인 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 기재되었다 (미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).
리포솜은 일반적으로 다른 절차에 의해 형질감염에 내성이 있는 수많은 세포 유형에 성공적으로 사용되었다. 또한, 리포솜은 바이러스-기반 전달 시스템의 전형적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포솜은 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테릭 이펙터를 다양한 배양된 세포주 및 동물에 효과적으로 도입하는데 사용되었다. 또한, 리포솜-매개 약물 전달의 효과를 검사하는 여러 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포솜은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되고, 다층 동심 이중층 소포 (또한 다층 소포 (MLV)라고 함)를 자발적으로 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어에 수용액을 함유하는 200 내지 500 Å 범위의 직경을 갖는 작은 단층 소포 (SUV)의 형성을 초래한다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 오버로딩으로 인한 부작용을 회피하기 위해, 이러한 초미세 입자 (약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자를 사용하는 것이 고려된다.
상기 기재된 전달 방법 이외에, rAAV 조성물을 숙주에 전달하는 대안적인 방법으로서 다음 기술이 또한 고려된다. 초음파영동 (즉, 초음파)이 사용되었고, 순환계로의 및 순환계를 통한 약물 투과의 속도 및 효능을 향상시키기 위한 장치로서 미국 특허 번호 5,656,016에 기재되어 있다. 고려되는 다른 약물 전달 대안은 골내 주사 (미국 특허 번호 5,779,708), 마이크로칩 장치 (미국 특허 번호 5,797,898), 안과용 제형 (Bourlais et al., 1998), 경피 매트릭스 (미국 특허 번호 5,770,219 및 5,783,208) 및 피드백-제어 전달 (미국 특허 번호 5,697,899)이다.
치료 방법
유효량의 트랜스진 (예를 들어, 하나 이상의 골 대사 조정제를 코딩하는 단리된 핵산 또는 rAAV)을 대상체에 전달하는 방법이 본 개시내용에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 골 형성을 촉진하거나 억제할 수 있는 간섭 RNA를 코딩하는 단리된 핵산의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 골 재흡수를 촉진하거나 억제할 수 있는 간섭 RNA를 코딩하는 단리된 핵산의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 핵산, rAAV 및 조성물은 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는데 유용하다.
본원에 사용된 바와 같은 "조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애"는 1) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착 및 골 재흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착 및 골 재흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 3) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착 및 골 재흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 재흡수 (예를 들어, 파괴), 또는 4) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착 및 골 재흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 재흡수 (예를 들어, 파괴)를 초래하는 골 침착 및 골 재흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 상태를 지칭한다.
"감소된 골 밀도와 연관된 질환"은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 재흡수 (예를 들어, 파괴)로부터 유발되는 증가된 골 다공성을 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 증가된 골 다공성과 연관된 질환은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 OB 및/또는 골세포 분화, 기능 또는 활성 및/또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 OC 분화, 기능 또는 활성으로부터 유발될 수 있다. "다공성"은 일반적으로 골 조직에 의해 점유되지 않은 골 분획의 부피를 지칭한다.
"증가된 골 밀도와 연관된 질환"은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 재흡수 (예를 들어, 파괴)로부터 유발된 감소된 골 다공성을 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 감소된 골 다공성과 연관된 질환은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 OB 및/또는 골세포 분화, 기능 또는 활성 및/또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않은 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 OC 분화, 기능 또는 활성으로부터 유발될 수 있다.
본 개시내용의 측면은 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 조절이상 골 대사는 감소된 골 밀도와 연관된 질환 (예를 들어, 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로부터 유발된 기계적 장애)일 수 있다. 조절이상 골 대사는 증가된 골 밀도와 연관된 질환 (예를 들어, 골화석증, 피크노디소스토시스, 스클레로스테오시스, 말단비대증, 불소증, 골수섬유증, C형 간염-연관 골경화증, 이소성 골화증)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. rAAV는 골 세포 (예를 들어, 파골세포 및 골모세포)에 대한 그의 표적화를 촉진하는 변형을 포함할 수 있다. 골 세포에 대한 그의 표적화를 촉진하는 rAAV의 비제한적인 변형은 서열식별번호: 16-17 또는 57-63의 이종 골-표적화 펩티드, 골-특이적 프로모터, 및 다른 조직에 비해 골에 대한 증가된 표적화를 갖는 AAV 혈청형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절이상 골 대사를 치료하는 방법은 서열식별번호: 16-17 또는 57-63에서와 같은 이종 골-표적화 펩티드를 포함하는 rAAV를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드를 포함하는 rAAV는 골 대사의 조절이상과 연관된 표적 유전자를 상향조절하거나 하향조절하는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애 (예를 들어, 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로부터 유발된 기계적 장애)에서 감소된 표적 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애에서 증가된 표적 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애 (예를 들어, 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로부터 유발된 기계적 장애)에서 감소된 표적 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애에서 증가된 표적 유전자의 발현을 하향조절한다.
본 개시내용의 측면은 캡시드 단백질 및 억제성 핵산을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 골 대사의 조절이상을 특징으로 하는 질환 또는 장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. rAAV는 억제성 핵산 (예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA 또는 amiRNA)을 포함할 수 있다. 억제성 핵산은 골 대사의 조절이상을 특징으로 하는 질환 또는 장애와 연관된 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 감소된 골 밀도와 연관된 유전자를 표적화하는 트랜스진을 포함하는 rAAV 또는 단리된 핵산을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 또는 단리된 핵산은 감소된 골 밀도와 연관된 유전자를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 SHN3, PTH, PTHrP, DJ1, SOST, CTSK, 또는 RANK이다.
본 개시내용의 측면은 rAAV 또는 단리된 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, rAAV 또는 단리된 핵산은 서열식별번호: 3에 기재된 바와 같은 서열 또는 그의 상보체를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 18-34 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 16-17 및 57-63 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 서열을 포함하는 이종 골-표적화 펩티드를 포함한다.
세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 내지 99%의 임의의 정수, 포함)만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 75% 내지 90%만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서의 SHN3의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 80% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 물질의 "유효량"은 원하는 효과를 생성하기에 (예를 들어, 골 세포 또는 골 조직을 형질도입하기에) 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 유효량은 대상체의 표적 조직의 표적 세포의 충분한 수를 형질감염시키기에 (또는 rAAV-매개 전달의 맥락에서 감염시키기에) 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 골 조직 (예를 들어, 골 및 골 조직 세포, 예컨대 OB, OC, 골세포, 연골세포 등)이다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 유효량 (예를 들어, rAAV를 통해 전달될 수 있음)은 대상체에서 치료적 이점을 갖기에 충분한 양, 예를 들어 OB 및/또는 골세포의 활성 또는 기능의 증가, OB 및/또는 골세포의 활성의 억제, OC의 기능의 활성의 증가, OC의 활성 또는 기능의 억제 등을 위해 충분한 양일 수 있다. 유효량은 다양한 인자 예컨대, 예를 들어, 종, 나이, 체중, 대상체의 건강, 및 표적화될 조직에 따라 달라질 것이며, 그러므로 본 개시내용의 다른 부분에 개시된 바와 같이 대상체 및 조직에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태는 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명될 것이다. 이들 실시양태는 본 발명의 예시이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 예시적인 실시양태에 제한되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
<실시예>
실시예 1
골 형성의 여러 핵심 조절인자가 골다공증에 대한 치료 표적으로서 확인되었다. 예를 들어, 골 형성의 자연 발생 억제제, 스클레로스틴 (SOST) 또는 어댑터 단백질 슈누리-3 (SHN3, 또한 HIVEP3)의 억제는 증대된 OB 활성으로 인한 골 질량의 점진적 증가를 초래한다. OB에서 주로 기능하는 SHN3 및 SOST와 달리, 카텝신 K (CTSK)는 OC에서 고도로 발현되며, 그의 억제는 OC 활성을 차단함으로써 골 질량을 증가시킨다. 마지막으로, PTH, PTH-관련 단백질 (PTHrP) 또는 DJ-1을 포함하는 골 동화 인자를 사용한 치료는 골 형성을 촉진한다. 이 실시예에, 골-표적화 아데노-연관 바이러스 (AAV)-매개 유전자 침묵 또는 첨가를 사용하여 이들 후보 유전자의 발현을 조작할 수 있는 유전자 치료제가 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 치료제 (예를 들어, 본 개시내용에 기재된 조성물)는 OB 기능 및 골 형성을 촉진함으로써 또는 골 리모델링 및 재생 활성에 대한 제한된 유해 효과를 가지면서 OC 활성 및 골 파괴를 억제함으로써 골 손실을 방지한다.
골-표적화 아데노-연관 바이러스 (BT-AAV)를 사용한 유전자 치료제의 개발
형질도입의 높은 효율, 지속적인 트랜스진 발현, 및 감염후 면역원성 및 병원성의 결여는 AAV를 유전자 요법에 사용하기에 매우 매력적인 바이러스 벡터로 만든다. 현재까지, AAV 벡터는 전 세계적으로 130개 이상의 임상 시험 및 2,000명 이상의 환자에서 평가되었다. 그러나, 비특이적 세포 표적화, 가능한 기존 면역성, 및 다른 속도-제한 사건은 더 자연스러운 AAV 혈청형의 확인 및 벡터 조작에 의한 AAV 혈청형의 특성 및 기능의 개선을 필요로 한다. 여기에서, 시험관내에서 및 생체내에서 OB 및/또는 OC를 형질도입할 수 있는 AAV 혈청형을 확인하였다.
OB, OC 및 연골세포를 형질도입하는 AAV 혈청형의 확인
이를 위해, 향상된 그린 형광 단백질 (GFP) 리포터 유전자를 17개의 AAV 캡시드 (scAAV1, scAAV2, scAAV3, scAAV4, scAAV5, scAAV6, scAAV6.2, scAAV7, scAAV8, scAAV9, scAAVrh8, scAAVrh10, scAAVrh39, scAAVrh43, scAAV2/2-66, scAAV2/2-84, scAAV2/2-125)로 패키징하였다. 에피형광 현미경법을 사용하여 GFP 발현을 모니터링함으로써 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 유래된 마우스 OB- 또는 연골세포-계통 세포 또는 골수 단핵구 (BM-MO)로부터 유래된 마우스 OC를 형질도입하는 이들 정제된 AAV 혈청형 벡터의 능력을 평가하였다. 먼저, OB- 또는 연골세포-계통 세포에 대한 이들의 형질도입 능력을 시험하기 위해, 마우스 MSC 및 연골세포 선조 세포주 (ATDC5)를 각각 시아젠(Cyagen) 및 ATCC로부터 구입하였다. 또한, 3개의 상이한 유사유전자형 배경 (C57BL/6J, BALB/cJ, 129S1/SvlmJ)에서 출생후 3-5일차에 신생 마우스의 두개관으로부터 마우스 OB 전구체 (pre-OB)를 단리하고, 6일 동안 골발생 배지에서 배양하여 성숙 OB (mOB)로 분화시켰다. 17개의 정제된 AAV 혈청형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 이들 세포와 함께 2일 동안 인큐베이션하고, GFP 발현을 에피형광 현미경법 (표 1) 및 EGFP에 대한 이뮤노블로팅 (도 22)에 의해 분석하였다.
<표 1>
Figure pct00001
17개의 AAV 혈청형 중에서, scAAV4는 3개의 상이한 마우스 배경에서 마우스 OB-계통 세포를 형질도입하는데 가장 효과적이었고, scAAV1, scAAV5, scAAV6 및 scAAV6.2 (scAAV6의 조작된 버전)는 3개의 상이한 마우스 배경에서 마우스 OB 및 연골세포-계통 세포 둘 모두를 형질도입하고, scAAV9는 C57B6/J 배경에서 pre-OB만을 형질도입하였다 (도 1 및 도 2의 대표적인 이미지).
다음으로, 마우스 OC 전구체를 형질도입하는 정제된 AAV 혈청형의 능력을 조사하였다. 마우스 일차 OC 전구체 (BM-MO, 골수 유래된 단핵구)를 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 장골로부터 단리하고, 마우스 M-CSF (40 ng/ml, 알&디 시스템스(R&D systems))의 첨가에 의해 증폭시켰다. BM-MO를 마우스 M-CSF (40 ng/ml) 및 마우스 Rank 리간드 (10 ng/ml, 알&디 시스템스)의 존재하에 6일 동안 배양하여, 성숙 OC로 분화시켰다 (도 3). 또한, 마우스 OC 전구체 세포주 (Raw264.7)는 마우스 Rank 리간드 (10 ng/ml)와 함께 배양 4일 후 성숙 OC로 분화되었다 (도 4). 17개의 정제된 AAV 혈청형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 이들 세포와 함께 2일 동안 인큐베이션하고, GFP 발현을 에피형광 현미경법에 의해 분석하였다 (표 2).
<표 2>
Figure pct00002
17개의 AAV 혈청형 중에서, scAAV1, 5, 6, 6.2, 7 및 9는 마우스 일차 OC 및 Raw264.7 OC 세포주 둘 모두를 형질도입하는데 효과적이었지만, scAAV8 및 10, scAAVrh39 및 43은 오직 Raw264.7 OC 세포주만을 형질도입하였다 (도 3 및 4의 대표적인 이미지).
관절 연골 및 골에 대한 AAV 캡시드의 주향성을 검사하기 위해, 8개의 scAAV-Egfp 벡터 (scAAV1, scAAV4, scAAV5, scAAV6, scAAV7, scAAV9, scAAVrh.10 및 scAAVrh.39)를 시험관내 스크린으로부터 선택하였다. 관절 연골 상에 연골세포 및/또는 골 표면 상에 OB 및/또는 OC를 형질도입하는 이들의 능력을 시험하기 위해, 8개의 선택된 GFP-코딩 AAV 혈청형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 양쪽 무릎 관절에 주사하고, 4주 후, 마우스를 안락사시키고, 관절 연골 및/또는 골로의 AAV 형질도입을 UMMS 광학 이미징 시설에서 IVIS-100 광학 이미징 시스템에 의해 모니터링하였다 (도 5). 음성 대조군으로서, 마우스에게 PBS를 주사하였다. 대부분의 캡시드에 대해 관절 연골 (도 28) 또는 성장판 (도 22)에서 EGFP의 발현이 거의 없거나 전혀 없었다. 이러한 불일치는 이들 구조의 무혈관 미세환경에 매립된 연골세포에 대한 scAAV 벡터의 불량한 접근성으로 인한 것일 수 있었다. 대안적으로, 벡터는 단순히 성체 마우스에서 일차 연골세포의 더 낮은 감염성을 나타낼 수 있었다. GFP 단백질은 무릎 관절 및 뒷다리에서 고도로 발현되었으며, 이들의 발현은 국소 주사 구역으로 제한되었다 (도 5, 상단, 도 28). 특히, GFP 발현은 심지어 근육의 제거 후에도 골 및 무릎 관절에서 검출되었다 (도 5, 하단). 관절 연골의 연골세포 및/또는 골 표면의 OB 및/또는 OC에서 GFP 발현을 확인하기 위해, 무릎 관절 및 대퇴골의 동결된 절편에 대해 조직학을 수행하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, scAAV1, scAAV4, scAAV5, scAAV6, scAAV7, scAAV9, scAAVrh.10, 및 scAAVrh.39가 주사된 무릎 관절에서 관절 연골에서 GFP 단백질의 발현이 전혀 없거나 거의 없는 것으로 검출되었다. scAAV9가 주사된 무릎 관절에서, GFP 발현이 연골세포의 작은 집단에서 검출되었다. 연골세포 전구체 세포주 ATDC5를 사용한 시험관내 데이터와는 대조적으로, 이들 결과는 특정 scAAV 혈청형이 생체내에서 관절 연골에서 연골세포를 형질도입하는데 효과적이지 않음을 나타낸다.
대조적으로, GFP 단백질은 scAAV9를 무릎 관절에 주사했을 때 피질골에 있는 OB 및 골세포에서 고도로 발현되었다. 처리된 마우스의 전신 및 개별 장기 이미징은 EGFP 발현이 간 및 뒷다리에서 가장 높았음을 나타내었다 (도 23 및 29). 심장 및 대퇴골에서의 발현은 보통이었지만, 폐, 신장 및 비장에서의 발현은 검출되지 않았다. 심장, 간 및 대퇴골에서의 EGFP의 발현을 형광 현미경법 및 이뮤노블롯 분석에 의해 추가로 확인하였다 (도 23). 관찰된 바와 같이, EGFP 단백질은 주로 피질골 및 섬유주골의 골내 골모세포 및 골세포에서 발현되었지만, 인대, 관절 연골, 성장판, 골막 골모세포, 골수 및 슬개골에서는 발현되지 않았다 (도 23 및 30). 이들 결과는 전신으로 전달된 scAAV9 벡터가 골내 뼈에 존재하는 골모세포 계통 세포를 표적화함을 입증한다.
scAAV9 이외에, scAAV5의 처리에서 골막 세포에서 높은 GFP 발현 및 피질골의 골세포에서 낮은 GFP 발현이 관찰되었다. 골막 세포의 작은 집단은 scAAV4가 주사되었을 때 GFP 단백질을 발현한 반면, scAAV6.2의 처리에서 GFP 발현이 검출되지 않았다 (도 6b). 그러므로, 이들 결과는 scAAV9 혈청형이 마우스의 골 표면에서 OB 및 OC를 형질도입하는데 가장 효과적임을 나타낸다. 골 조직으로의 scAAV9의 형질도입 효능을 증가시키기 위해, scAAV9를 극히 낮은 세포독성을 갖는 지질의 블렌드인 X-tremeGene 9 DNA 형질감염 시약 (로슈) 또는 PBS로 제제화하고, 마우스의 무릎 관절에 주사하였다 (도 7 및 8). X-tremeGene 9 (리포솜)로 제제화된 경우, GFP 단백질은 성장판 아래 및 섬유주골 표면 상의 활성 OB 및 OC (골단) 뿐만 아니라 피질골 내의 골세포인 최종적으로 분화된 OB (골간)에서 고도로 발현되었다. 그러나, GFP 발현은 근육에서 현저하게 감소되었으며, 이는 X-tremeGene 9 제형이 scAAV9의 생체내 주향성을 변경함을 나타낸다.
캡시드 단백질의 유전적 또는 화학적 변형을 통한 골 표적화-scAAV9 (BT-scAA9) 혈청형의 개발
골다공증에서 AAV-매개 유전자 요법을 최대화하기 위해, scAAV9 혈청형이 OB 및 OC가 존재하는 골 표면으로 귀소하고 축적되는 것이 바람직하다. 골-표적화 펩티드 ((AspSerSer)6, DSS)는 골발생 siRNA-캡슐화된 리포솜을 골-형성 표면으로 지정하는데 효과적인 것으로 관찰되었다. 추가의 골-표적화 펩티드, HABP-19 (CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL; 서열식별번호: 17)는 마우스 뿐만 아니라 배양물에서 골 수산화인회석에 선택적으로 결합하는 것으로 보고되었다. HABP-19는 OB로부터 분비되는 가장 풍부한 비콜라겐성 단백질인 오스테오칼신의 생체모방체이다. γ (Gla 잔기)-카르복실화된 글루탐산 (Glu)은 비타민 K-의존적 γ-카르복실화에 의해 Glu로부터 유래된다.
이 실시예는 조작된 scAAV9 혈청형을 골로 지정하기 위해 골-표적화 펩티드를 AAV 캡시드에 삽입하는 것을 설명한다 (도 9A, DSS-scAAV9, HABP-scAAV9). (AspSerSer)6 (서열식별번호: 16)을 코딩하는 DNA 서열을 표준 클로닝 방법을 사용하여 글루타민 587 및 알라닌 588 사이 (DSS-587), 글루타민 588 및 아르기닌 589 사이 (DSS-588) 또는 VP2-ORF의 N-말단 (DSS-Nter)에 캡시드 단백질 VP2 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로 삽입하였다 (도 10 및 26). 또한, 화학적 반응을 통해 검증된 골-탐색 분자에 접합된 AAV 캡시드 (도 9B)를 생성하였다. 세포 표면 상의 아지드 모이어티로의 골-탐색 분자 (ADIBO-Ale)의 부착은 골 단편에 결합하는 비-골 세포 (예를 들어, 주르카트(Jurkat) T 백혈병 세포주)의 능력을 유의하게 향상시킨 것으로 관찰되었다.
DSS 삽입이 scAAV9의 감염성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위해, 원형 AAV9, AAV9.DSS-587 또는 AAV9.DSS-Nter 캡시드에 패키징된 벡터를 COB에 감염시키고, EGFP 발현을 이뮤노블로팅 또는 형광 현미경법에 의해 평가하였다 (도 29). scAAV9와 비교하여, scAAV9.-DSS-Nter은 더 낮은 MOI (109 GC/mL)에서 감염성의 보통의 감소를 나타낸 반면, scAAV9.DSS-587로 처리된 COB에서는 EGFP 발현이 거의 검출되지 않았다 (도 29). 유사하게, i.a. 주사를 통해 마우스를 처리한 경우, scAAV9, 및 scAAV9.DSS-Nter은 대퇴골을 이전과 같이 강하게 형질도입하였다 (도 35). 대조적으로, scAAV9.DSS-587은 트랜스진 발현을 거의 또는 전혀 생성하지 않았다. 또한, 알칼리성 포스파타제 (ALP) 활성 및 골발생 유전자의 발현은 scAAV9 및 scAAV9.DSS 벡터로 처리된 COB에서 필적하였으며, 이는 골모세포 분화에 대한 scAAV에 의한 유해 효과가 없음을 나타낸다 (도 29 및 35).
캡시드 단백질 상의 골-표적화 분자로 장식된 조작된 scAAV9 혈청형 (Ale-scAAV9)을 시험하였다. AAV 캡시드 단백질에 아지드-보유 아미노산을 생성하기 위해, VP3 캡시드 단백질의 아스파라긴 587을 앰버 코돈 (TAG)으로 변경하거나, 이 앰버 코돈을 아스파라긴 587 및 아르기닌 588 사이에 삽입하였다. 이들 돌연변이체 VP3 플라스미드와 함께, pHelper, pAAV-GFP 및 pPyIRS/tRNACUA를 DNA 형질감염 시약을 사용하여 1:1:1:2의 몰비로 AAV-293 패키징 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 6시간 후, 배지를 1 mM N-2-아지도에틸옥시카르보닐-L-리신 (NAEK)을 함유하는 신선한 배지로 대체하고, 72시간 후, 아지드-보유 아미노산을 갖는 scAAV9 혈청형 (아지드-scAAV9)을 형질감염된 세포로부터 수확하였다. pPyIRS/tRNACUA 플라스미드로부터 발현된 직각의 앰버 저해제 아미노아실-tRNA 신세타제/tRNA-CUA 쌍은 NAEK의 존재하에 앰버 코돈의 부위에 아지드-보유 비천연 아미노산을 합성하였다.
아지드 모이어티-함유 VP3 돌연변이체의 발현을 항-VP3 항체를 사용하여 이뮤노블로팅에 의해 확인하였다. 확인되면, OB 또는 OC를 형질도입하는 아지드-scAAV9 혈청형의 능력을 GFP 발현의 모니터링에 의해 평가하였다. 일차 마우스 OB를 GFP-코딩 아지드-scAAV9 혈청형으로 처리하고, GFP 발현을 에피형광 현미경법에 의해 평가하였다. 또한, 이들 scAAV9 혈청형을 M-CSF 및 Rank 리간드의 존재하에 마우스 BM-MO (OC 전구체)의 감염을 위해 사용하였다. 이들의 형질도입 효율을 GFP-코딩 WT-scAAV9 혈청형과 비교하였다.
다음으로, 클릭 화학을 통해 아지드-scAAV9 혈청형의 VP3 캡시드 단백질에서 아지드-보유 아미노산에 골-탐색 분자 (ADIBO-Ale)를 가교함으로써 골-표적화 scAAV9 혈청형 (Ale-scAAV9)을 생성하였다. 아지드-scAAV9 혈청형을 실온에서 상이한 농도의 ADIBO-Ale (퓨쳐켐(FutureChem))와 함께 인큐베이션하고, 2시간 후, 비결합된 ADIBO-Ale를 투석을 사용하여 제거하였다. 일차 OB 또는 OC를 형질도입하는 Ale-scAAV9 혈청형의 능력을 GFP 발현의 모니터링에 의해 검사하였다.
골 세포 및 조직으로의 DSS-scAAV9 형질도입의 검증
펩티드가 AAV 캡시드에 비효율적으로 또는 부적절하게 융합된 경우, AAV의 형질도입 효율이 현저하게 감소될 수 있다는 것이 이전에 보고되었다. OB 및 OC로 형질도입하는 scAAV9의 능력에 대한 DSS 펩티드 삽입의 효과를 시험하기 위해, 마우스 OB 및 OC 전구체를 상이한 용량의 GFP-코딩 scAAV9 (WT-, DSS-588, DSS-Nter)로 처리하였다. 2일 후, 항-GFP 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 및 에피형광 현미경법에 의해 GFP 발현을 분석하였다. 도 11 및 12에 나타낸 바와 같이 (A 및 B-왼쪽), DSS-588로 처리한 경우, OB 및 OC 둘 모두에서 GFP 단백질의 발현이 거의 또는 전혀 검출되지 않았다. 대조적으로, WT-scAAV9와 비교하여, DSS-Nter scAAV9의 처리는 OB 및 OC에서 GFP 발현의 감소를 나타내었고, 그의 발현은 용량-의존적 방식으로 증가되었다. OB (도 11b-오른쪽 및 11c) 및 OC (도 12b-오른쪽 및 12c)의 분화는 이들 scAAV9의 처리에서 정상이었으며, 이는 scAAV9 형질도입이 OB 및 OC 기능에 영향을 미치지 않았음을 입증한다.
다음으로, 생체내에서 골 세포로 형질도입하는 DSS-scAAV9 벡터의 능력을 조사하였다. GFP-코딩 scAAV9 벡터 (WT-, DSS-588, DSS-Nter)를 X-tremeGene 9로 제제화하고, 이들 scAAV9 벡터의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하고, 1주 후, 대퇴골의 동결된 절편에 대해 조직학을 수행하고, OB, OC 및/또는 골세포에서의 GFP 발현을 공초점 현미경법을 사용하여 평가하였다 (도 13). PBS 주사를 비-GFP 발현 대조군으로 사용하였다. 시험관내 실험과 유사하게 (도 11 및 12), DSS-588 scAAV9로 처리된 대퇴골에서 GFP 발현이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. GFP-발현 세포 집단은 WT-scAAV9와 비교하여 감소되었지만, DSS-Nter scAAV는 OB, OC 및 골세포를 포함하는 모든 골 세포를 성공적으로 형질도입하였다.
AAV 캡시드를 생체내에서 골-표적화 활성에 대해 시험하였다. 이전과 마찬가지로, scAAV9 또는 scAAV9-DSS-Nter를 2개월령 마우스에 i.v. 주사하고, 주사 2주 후 EGFP 발현에 의해 조직 분포를 평가하였다. scAAV9 또는 scAAV9-DSS-Nter로 전신으로 처리된 마우스의 전신에서 동등한 수준의 EGFP 단백질이 관찰되었지만 (도 36), scAAV9.DSS-Nter이 주사된 마우스는 심장 및 간에서 scAAV9에 의해 달성된 것의 ~55% 및 ~75%의 EGFP 발현 수준을 각각 수득하였다 (도 26 및 도 36). 중요하게, 대퇴골 및 요추골에서의 발현은 처리군 간에 상대적으로 필적하였다 (도 26 및 36). 특히, scAAV9.DSS-Nter-처리된 대퇴골은 scAAV9-처리된 대퇴골과 비교하여 증가된 EGFP-발현 세포 수를 나타내었다 (도 26). 이들 결과는 골-표적화 펩티드 모티프 (DSS)와 융합된 조작된 VP2 캡시드 단백질이 비-골격 조직으로의 전달을 탈표적화함으로써 scAAV9의 골-귀소 특이성을 개선시키고, 결국, 골에 대한 그의 주향성을 증가시킨다는 것을 입증하였다.
생체내 특이적 골 형질도입을 위한 BT-scAAV9 혈청형의 전신 전달의 검증
생체내에서 골로 귀소하는 BT-scAAV9 혈청형의 능력을 검사하기 위해, GFP-코딩 scAAV9 벡터 (WT-, DSS- 또는 HABP, Ale)의 1 x 1010 게놈 카피의 단일 용량을 마우스에 국소적으로 또는 전신으로 투여하였다. 국소 투여를 위해, 이들 scAAV9 혈청형을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하고, 1주 또는 4주 후, 골의 OB, OC 및/또는 골세포로의 AAV 전달을 IVIS-100 광학 이미징 시스템에 의해 모니터링하였다. 또한, 이들 scAAV9 혈청형에 의해 형질도입된 GFP-발현 OB, OC 및/또는 골세포를 검출하기 위해 대퇴골의 동결된 절편에서 조직학을 수행하였다. PBS 주사를 비-GFP 발현 대조군으로 사용하였다. 전신 투여를 위해, GFP-코딩 WT-, DSS-, HABP- 또는 Ale-scAAV9 혈청형을 정맥내 (IV) 또는 복강내 (IP) 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 1주 또는 4주 후, 골로의 AAV 전달을 IVIS-100 광학 이미징 시스템에 의해 모니터링하고, 조직학을 위해 GFP-양성 골을 추가로 동결-절편화하였다.
마우스 슈누리-3 (SHN3), 스클레로스틴 (SOST), 또는 카텝신 K (CTSK)에 특이적인 shRNA를 코딩하는 scAAV9 벡터의 생성
스클레로스테오시스는 높은 골 질량을 갖는 드문 유전적 장애이고, 스클레로스틴을 코딩하는 유전자인 SOST 유전자에서의 기능 상실 돌연변이와 연관된 것으로 관찰되었다. 스클레로스틴은 골세포, 최종적으로-분화된 골모세포로부터 분비되며, 골 형성을 억제하고 골 재흡수를 향상시킨다. 모노클로날 인간 항-스클레로스틴 항체에 의한 치료는 골 형성을 촉진하고 골 재흡수를 억제함으로써 골다공증을 갖는 인간 환자 및 동물 모델에서 골 손실을 복원한다. 그러나, 현재 FDA 승인은 뇌졸중 위험 증가로 인해 가능성이 낮다. 골모세포 분화를 억제하는 스클레로스틴과 달리, 카텝신 K (CTSK), 리소좀 시스테인 프로테이나제는 골 재흡수에 중요한 성숙 파골세포에서 고도로 발현된다. 높은 골 질량을 갖는 드문 유전적 장애인 피크노디소스토시스는 인간에서 CTSK 유전자에서의 돌연변이의 불활성화로부터 유발된다. CTSK의 소분자 억제제에 의한 치료는 골 재생 활성에 대한 유해 효과를 제한하면서 골 재흡수를 저해함으로써 골다공증을 갖는 인간 환자 및 동물 모델에서 골 손실을 방지한다. 그러나, 최근에는 뇌졸중의 발생률 상승으로 인해 FDA 고려대상에서 제외되었다.
슈누리-3 (SHN3)은 골모세포 분화의 신규 저해제이다. 유도성 loxP:Cre 시스템을 사용한 OB에서의 SHN3의 일시적인 결실은 마우스에서 골 질량의 유의한 증가를 초래하였으며, 이는 SHN3 발현의 하향조절이 골다공증에서 낮은 골 질량을 복원시키는 매력적인 치료적 접근법을 제공함을 나타낸다 (도 14). 마찬가지로, SHN3의 억제는 골 형성을 촉진함으로써 골다공증의 마우스 모델에서 골 손실을 방지한다 (도 15). 그러나, 스클레로스틴 및 CTSK와 달리, SHN3 결핍은 골에 특이적이고 비-골격 조직에서 표현형과 연관이 없다. 그러므로, 실시예 1에 기재된 골-표적화 scAAV9 벡터를 시험관내에서 및 생체내에서 OB 및/또는 OC에서 마우스 SHN3, SOST, 또는 CTSK를 침묵시키기 위해 벡터에 후속적으로 사용하였다.
상기 언급된 유전자 (예를 들어, SHN3, CTSK)를 표적화하는 2개의 shRNA 헤어핀을 기능적 자기-상보적 AAV 벡터 (예를 들어, mTR)에 필요한 대용 돌연변이체 역전된 말단 반복부 (mTR)로 적응시켰으며, 변형된 shRNA-mTR 서열은 서열 섹션에 기재되어 있다. 이들 변형된 shRNA-mTR을 제한 효소 부위, PstI 및 Bgl2에서 pAAVscCB6-EGFP 벡터로 클로닝하고, scAAV9 캡시드로 패키징하였다.
마우스 슈누리-3 (SHN3) 및 마우스 카텝신 K (CTSK) (scAAV9-mSHN3i 및 scAAV9-mCTSKi)에 특이적인 2개의 shRNA 헤어핀을 발현하는 정제된 scAAV9 벡터를 생성하였다. 시험관내 특징화를 위해, scAAV9-mSHN3i 및 scAAV9-mCTSKi의 감염성, 녹다운 효율 및 기능적 활성을 각각 OB 및 OC에서 시험하였다. 먼저, 2개의 scAAV9-mSHN3is (Sh-SHN3-1, -2) 또는 scAAV-벡터 대조군 (대조군)의 1012~1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 마우스 일차 OB 전구체로 처리하였다. 형질도입 2일 후, GFP 발현을 에피형광 현미경법에 의해 모니터링하고, RT-PCR을 사용하여 SHN3 mRNA 수준을 측정함으로써 녹다운 효율을 평가하였다. OB 배양의 6 및 15일차에 각각 OB 분화 유전자 (예를 들어, 골 시알로단백질 (BSP) 및 오스테릭스 (OSX))의 발현 및 알리자린 레드 염색에 의한 광물화 활성을 측정함으로써 OB 분화를 평가하였다 (도 16a-16d). OB로의 scAAV9-mSHN3is의 형질도입은 scAAV9-대조군만큼 효과적이었다. scAAV9-mSHN3i (Sh-SHN3-1)는 SHN3 mRNA 수준을 50%만큼 감소시킬 수 있었다 (도 16a-16b). SHN3 녹다운은 광물화 활성 및 OB 분화 유전자의 발현을 증가시켰다 (도 16c-16d).
다음으로, 생체내 scAAV9-mSHN3i 벡터의 형질도입 및 녹다운 효능을 검사하였다 (도 17). GFP-코딩 scAAV9 벡터 (Sh-SHN3-1)를 X-tremeGene 9로 제제화하고, 이 scAAV9 벡터의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. 1주 후, 대퇴골의 동결된 절편에 대해 조직학을 수행하고, OB 및 골세포에서의 GFP 발현을 공초점 현미경법을 사용하여 평가하였다. PBS 주사를 비-GFP 발현 대조군으로 사용하였다. 대조군 scAAV9와 유사하게, OB 및 골세포에서의 GFP 발현이 scAAV9-mSHN3i 벡터로 처리된 대퇴골에서 관찰되었다 (도 17a). 대안적으로, FACS 분류법을 사용하여 GFP-발현 세포를 대퇴골로부터 단리하고, SHN3 mRNA 수준을 RT-PCR에 의해 평가하였으며, 이는 scAAV9-Sh-SHN3-1 벡터의 형질도입에 의한 SHN3 mRNA 수준의 50% 감소를 입증한다 (도 17b).
또한, scAAV9- mCTSKi의 감염성, 녹다운 효율 및 기능적 활성을 마우스 OC에서 또한 조사하였다. OC 전구체를 수득하기 위해, 마우스 단핵구 세포주인 Raw264.7을 Rank 리간드 (5 ng/ml)로 2일 동안 처리하였다. 후속적으로, 이들 OC 전구체를 2개의 scAAV9-mCTSKis (Sh-CTSK-1, -2) 또는 scAAV-벡터 대조군 (대조군)의 1012~1013/ml 게놈 카피의 단일 용량으로 2일 동안 처리하였다. 에피형광 현미경법을 사용하여 GFP 발현에 의해 형질도입 효율을 평가하고 (도 18a-18d), RT-PCR을 사용하여 CTSK mRNA 수준을 측정함으로써 녹다운 효율을 평가하였다 (도 18b). 또한, TRAP 효소적 활성, TRAP-염색된 OC의 다중-핵형성, 및 OC 분화 유전자 (예를 들어, 수지상 세포-특이적 막횡단 단백질 (DC-STAMP) 및 TRAP)의 발현을 측정함으로써 OC 분화를 평가하였다 (도 18c 및 18d). OC 전구체로의 scAAV9-mCTSKis의 형질도입은 scAAV9-대조군만큼 효과적이었다. scAAV9-mCTSKi (Sh-CTSK-1)는 CTSK mRNA 수준을 70%만큼 감소시킬 수 있었다 (도 18a-18b). CTSK 녹다운은 OC 분화의 경미한 감소를 초래하였다 (도 18c-18d). 생체내에서 OC로 형질도입하는 scAAV9-mCTSKi 벡터의 능력을 검사하기 위해, X-tremeGene 9를 갖는 GFP-코딩 scAAV9 벡터 (Sh-CTSK-1)의 제형의 1012 ~ 1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 무릎 관절에 주사하였다. GFP 및 CTSK 발현에 대한 면역형광 분석은 대조군-scAAV9 및 scAAV9-mCTSKi 벡터 둘 모두가 생체내에서 골 표면에서 OC를 형질도입할 수 있음을 확인하였다 (도 19a). CTSK 발현은 scAAV9-mCTSKi 벡터로 형질도입된 경우에만 GFP-발현 OC에서 현저하게 감소되었다 (도 19b).
마우스 스클레로스틴 (SOST) shRNA (scAAV9-mSOSTi)에 특이적인 2개의 shRNA 헤어핀을 코딩하는 pAAVscCB6 벡터의 녹다운 효율을 스클레로스틴의 높은 발현을 갖는 GFP-DMP1-발현 골세포주에서 검증하였다. 일단 생성되면, 2개의 scAAV9-mCTSKi 또는 scAAV9-벡터 대조군 (대조군)의 1012~1013/ml 게놈 카피의 단일 용량을 스클레로스틴의 높은 발현을 갖는 마우스 골세포주에 주사하였다. 형질도입 2일 후, GFP 발현을 웨스턴 블로팅에 의해 평가하고, RT-PCR을 사용하여 SOST mRNA 수준을 측정함으로써 녹다운 효율을 평가하였다.
BT-AAV-매개 유전자 침묵을 사용한 골다공증에 대한 유전자 치료제의 개발
이 실시예는 마우스 SHN3, SOST, CTSK에 특이적인 shRNA 헤어핀을 코딩하는 scAAV9 혈청형 (SHN3i, SOSTi, CTSKi)의 기능적 효능을 시험하는 것을 설명한다. shRNA 헤어핀을 GFP-코딩 AAV 벡터로 클로닝하고, BT-AAV 캡시드 (DSS-scAAV9, Ale- scAAV9)로 패키징하였다 (도 20). 음성 대조군으로, 대조군 ShRNA (cont-i)를 AAV 벡터로 클로닝하였다. cont-i, SHN3i, 또는 SOSTi를 코딩하는 BT-AAV 혈청형을 일차 마우스 OB로 형질도입하고, 3일 후, SOST 또는 SHN3의 녹다운 효율을 정량 PCR에 의해 평가하였다. cont-i 또는 CTSKi를 코딩하는 BT- AAV 혈청형에 의해 마우스 일차 OC 전구체를 형질도입하고, M-CSF 및 RANK 리간드의 존재하에 배양하였다. 형질도입 3일 후, CTSK의 녹다운 효율을 정량 PCR에 의해 분석하고, 6일 후, OC 분화를 억제하는 CSTK 침묵의 능력을 평가하였다.
골다공증의 마우스 모델에서 골 손실을 방지하는 이들 유전자 치료제의 능력을 검사하기 위해, sham 또는 OVX 수술 4주 후, 4개월령 암컷 마우스 (C57BL/6J, n=12 마우스/군)에 이들 BT-scAAV9 혈청형의 1 x 1012 게놈 카피의 단일 용량을 IV 또는 IP 주사하였다. 대안적으로, 22개월령 암컷 마우스 (C57BL/6J, n=12 마우스/군)에 IV 또는 IP 주사하였다. 음성 대조군으로, 대조군 shRNA를 갖는 GFP-코딩 scAAV9 벡터 (cont-i)를 이들 마우스에 투여하였다. 처리 2개월 후, 마우스를 칼세인 및 알리자린 레드로 라벨링하고, 생체내에서 OB 및 OC의 수, 골 형성 속도, 및 OC 재흡수 활성을 평가하기 위해 동적 조직형태계측학을 수행하였다. GFP-발현 scAAV9-형질도입된 세포를 배치하기 위해, IVIS-100 광학 이미징을 전신에서 수행하였다. 동결된 절편에 대한 조직학을 위해 GFP-발현 조직을 추가로 프로세싱하였다. 또한, GFP 단백질을 발현하는 scAAV9-형질도입된 OB 및/또는 OC를 FACS 분류법을 사용하여 장골로부터 단리하고, SOST, SHN3 또는 CTSK mRNA 수준을 정량 PCR에 의해 평가하였다. 골격 분석을 위해, 장골 및 척추골의 마이크로CT를 수행하여 골 질량 및 구조를 분석하였다.
또한, 조직학적 절편을 OC 분화의 마커로서 타르트레이트-내성 산 포스파타제 (TRAP) 및 OB 분화의 마커로서 유형 I 콜라겐 α1 (Col1) 및 Runx2에 대한 면역조직화학 (IHC)으로 염색하였다. 이 분석은 OB 분화 유전자의 발현을 측정하는 골 RNA의 정량 PCR 분석을 동반하였다. 마지막으로, 골다공증을 갖는 인간 환자에서와 같이, 유형 I 콜라겐 C-말단 텔로펩티드 (CTX), 유형 1 프로콜라겐의 N-말단 프로펩티드 (P1NP), 및 골-특이적 알칼리성 포스파타제 (BSAP)를 포함하는 혈청 골 턴오버 마커의 수준을 ELISA를 사용하여 측정함으로써 전신 OB 및 OC 활성을 분석하였다.
실시예 2: AAV-매개 유전자 첨가를 사용한 골다공증에 대한 신규 유전자 치료제의 개발
피하 주사를 통한 재조합 PTH 펩티드 (1- 34 aa) 또는 재조합 PTHrP 펩티드 (1-36 aa)의 간헐적 치료는 일부 실시양태에서, 골다공증을 갖는 인간 환자 및 동물 모델에서 OB 활성을 증가시키고 골 형성을 촉진한다. 이들 펩티드 (테리파라티드, 아발로파라티드)는 FDA-승인되었고, 현재 골다공증을 갖는 인간 환자를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 분비성 인자 DJ-1은 OB 및 내피 세포 사이의 교차-소통의 매개인자로서 기능한다. 일부 실시양태에서, DJ-1을 사용한 치료는 인간 MSC에서 OB 분화 및 인간 내피 세포에서 혈관신생을 촉진하는 한편 OC 분화를 저해한다.
이 실시예는 근육내 (IM) 주사를 통해 분비성 골발생 인자를 코딩하는 scAAV9 혈청형을 동물에 전달하는 것을 설명하며, 이를 통해 주사된 근육은 바이오-펌프로서 역할을 하며, 혈액 순환에서 이들 인자의 안정한 높은 발현을 제공하여 골다공증 상황에서 골 형성을 촉진한다 (도 21). 이를 위해, 인간 PTH (1-84 aa), 인간 PTHrP (1-140 aa) 또는 마우스 DJ-1 (1-190 aa)을 코딩하는 cDNA는 제한 효소 부위, Age1 및 Hind3 벡터에서 단백질 분비를 위한 기존의 신호 펩티드를 함유하는 pAAVscCB6-EGFP 벡터로 클로닝하고, 근육 향성 AAV 캡시드 (PTH-scAAV9, PTHrP-scAAV9, DJ-1-scAAV9)로 패키징하였다. 이들 cDNA 서열은 서열에 기재되어 있다.
시험관내에서 AAV-형질도입된 세포에서 이들 분비성 골발생 인자의 생성을 검증하기 위해, scAAV9 혈청형을 사용하여 마우스 근모세포 세포주 (C2C12)를 형질도입하고, 배양 3일 후, 상등액을 수확하고, 분비성 인자의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 대안적으로, 세포를 용해시키고, 세포내 단백질을 이뮤노블로팅에 의해 평가하였다. 이들의 분비가 확인되면, 이들 골발생 인자를 골발생 배양 조건 하에 마우스 일차 OB와 함께 인큐베이션하고, 이들의 골발생 잠재력을 평가하였다. 음성 대조군으로, GFP-코딩 scAAV9 혈청형을 사용하였다.
다음으로, 분비성 골발생 인자의 AAV-매개 유전자 첨가가 골다공증 상황에서 골 손실을 방지하는지 여부를 조사하였다. Sham 또는 OVX 수술을 4개월령 암컷 마우스 (C57BL/6J, n=12 마우스/군)에서 수행하고, 수술 4주 후, PTH, PTHrP 또는 DJ-1을 발현하는 GFP-코딩 scAAV9 혈청형 (PTH-scAAV9, PTHrP-scAAV9, DJ-1-scAAV9)의 1 x 1010 게놈 카피의 단일 용량을 IM 주사를 통해 뒷다리의 대퇴사두근으로 투여하였다. 음성 대조군으로, GFP-코딩 scAAV9 벡터 대조군 (cont-scAAV9)을 이들 마우스에 투여하였다. 대안적으로, 이들 AAV 혈청형을 22개월령 암컷 마우스 (C57BL/6J, n=12 마우스/군)에 IM 주사하였다. 처리 2개월 후, 마우스를 칼세인 및 알리자린 레드로 라벨링하고, 생체내에서 OB 및 OC 활성을 평가하기 위해 동적 조직형태계측학을 수행하였다. 골격 분석을 위해, 마이크로CT, TRAP 염색 (OC 분화), 및 Col1 및 Runx2에 대한 IHC (OB 분화)를 장골 및 척추골에서 수행하였다. 마지막으로, CTX (골 재흡수), P1NP 및 BSAP (골 형성), 및 칼슘 및 인 (광물 항상성)의 혈청 수준을 ELISA 또는 비색 분석에 의해 측정하였다. 이 분석은 OB 분화 유전자의 발현을 측정하는 골 RNA의 qPCR 분석을 동반하였다. 마지막으로, 트랜스진 (PTH, PTHrP 또는 DJ-1)의 혈청 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
실시예 3 골모세포에서 Shn3의 유도성 결실은 성체 마우스에서 골 형성을 촉진하다
골 형성에 대한 SHN3의 단기간 억제의 효과를 검사하기 위해, 성숙 골모세포에서 타목시펜-유도 Cre 레콤비나제를 발현하는 오스테오칼신-CreERT 마우스와 Shn3fl/fl 마우스를 교배함으로써 유도성 골모세포-특이적 Shn3-녹아웃 마우스를 생성하였다 (Shn3Ocn-Ert). Cre-발현 세포 (Shn3Ocn-Ert; RosamT/mG)를 시각화하기 위해 이들 마우스를 Cre 리포터 RosamT/mG 마우스와 추가로 교배하였다. 타목시펜을 사용한 Shn3Ocn-Ert; RosamT/mG 마우스의 처리는 섬유주 및 피질골의 표면에서 성숙 골모세포에서 GFP의 발현을 초래하며, 이는 Shn3의 골모세포-특이적 결실을 나타낸다 (도 23). 따라서, 이들 마우스는 타목시펜-처리된 대조군 마우스와 비교하여 섬유주골 질량의 유의한 증가를 나타내었다 (도 23). 이들 결과는 성숙 골모세포에서 Shn3의 유도성 결실이 성체 마우스에서 골 질량을 증가시키기에 충분함을 나타낸다.
Shn3fl/fl 마우스에서 Cre-재조합을 위한 촉진제 역할을 하기 위해 Cre-코딩 scAAV9 벡터 (scAAV9-Cre, 도 30)를 생성하였다. Shn3fl/fl 마우스를 먼저 Shn3fl.fl 마우스로부터 단리된 배양된 COB에서 scAAV9-Cre로 처리하고 (도 30), 예상대로, Shn3fl/fl COB에서 scAAV9-매개 Cre 발현은 Shn3의 결실 및 향상된 골모세포 분화를 초래하였다 (도 31). 다음으로, scAAV9-Cre를 i.v. 투여를 통해 2개월령 Shn3fl/fl;RosamT/mG 마우스에 주사하였다. 주사 2개월 후, 대퇴골에서의 Cre mRNA의 발현 (도 31) 및 골 표면에 존재하는 골모세포 계통 세포에서 EGFP 단백질의 Cre-매개 발현 (도 30)을 RT-PCR 및 형광 현미경법에 의해 각각 검증하였다. scAAV9-EGFP 처리된 대퇴골과 비교하여, scAAV9-Cre-처리된 대퇴골은 shn3 mRNA 수준의 유의한 감소 (도 31) 및 상대적 섬유주골 질량의 증가 (도 31)를 나타내었다. 이들 결과는 Shn3fl/fl 마우스에서 전신으로 전달된 scAAV9-Cre이 골모세포 계통 세포를 표적화하고 Shn3 결실을 매개하여 골 질량을 증가시킨다는 것을 입증한다. 중요하게, 이들 결과는 골 생리학을 극적으로 변경하기 위한 골모세포 계통 세포로의 scAAV9-매개 트랜스진 전달의 효력을 입증한다.
실시예 4: amiR-shn3 트랜스진을 운반하는 scAAV9에 의한 Shn3의 침묵은 생체내에서 골 형성을 촉진한다
miRNA 스캐폴드로 설계된 siRNA 카세트인 인공 마이크로RNA (amiR)는 생체내에서 표적 메시지 분해를 효율적으로 촉진하는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 설계는 발현 카세트가 pol II 프로모터에 의해 구동되는 것을 허용하여, scAAV 벡터로 유전자 녹다운을 제어하는 능력을 확장한다. shn3 (amiR-shn3) 또는 대조군 (amiR-ctrl)을 표적화하도록 인공 마이크로RNA 카세트를 조작하였다. 이러한 설계에서, amiR은 CB 프로모터 및 Egfp 리포터 유전자 사이에 인트론으로 삽입되며 (도 24), 이는 양성으로 형질도입된 세포 또는 조직의 시각적 트래킹을 허용한다. 그 후, 시험 카세트를 AAV9 캡시드로 패키징하였다. scAAV9-amiR-shn3 또는 scAAV9-amiR-ctrl을 사용한 처리는 시험관내에서 COB를 양성으로 형질도입하는 것을 초래하였다 (도 32). amiR-ctrl-처리된 COB와 비교하여, scAAV9-amiR-shn3을 사용한 처리는 shn3 mRNA 수준의 ~50% 감소, 및 ibsp 발현 및 광물화의 상대적 증가를 초래하였다 (도 32).
생체내에서 골 동화 활성을 향상시키는 amiR의 능력을 검사하기 위해, scAAV9-amiR-shn3 벡터를 i.a. 투여를 통해 2개월령 마우스의 무릎 관절에 주사하였다. 처리 2개월 후, 뒷다리 및 대퇴골에서의 EGFP 발현을 각각 IVIS 광학 이미징 (도 24) 및 형광 현미경법 (도 24)에 의해 검사하였다. 중요하게는, 대퇴골로부터 단리된 FACS-분류된 EGFP-발현 세포는 shn3 mRNA 수준의 ~50% 감소를 나타내었다 (도 24). amiR-ctrl-처리된 대퇴골과 비교하여, amiR-shn3-처리된 대퇴골은 상대적 섬유주골 질량의 유의한 증가를 나타내었다 (도 24). 이들 결과는 scAAV9-amiR-shn3의 국소 전달이 골모세포 계통 세포에서 SHN3 발현을 녹다운시키는데 효과적이고 결국 생체내에서 골 질량을 증가시킨다는 것을 입증한다.
그 후, 전신 전달 후 생체내 골 동화 활성을 촉진할 수 있는 scAAV9-amiR-shn3의 능력을 검사하였다. 3개월령 마우스로의 i.v. 투여 2개월 후, 예상대로 뒷다리, 간 및 대퇴골에서 EGFP 발현이 우세하게 검출되었다 (도 33). scAAV9-amiR-shn3에 의해 형질도입된 대퇴골은 shn3 mRNA 수준의 ~50% 감소 (도 24) 및 섬유주골 질량 및 피질골 광물 밀도의 유의한 증가 (도 24)를 나타내었다. 마찬가지로, 더 큰 골 형성 속도 (BFR), 광물 부착률 (MAR), 및 골 표면 당 골모세포 표면 (Ob.S/BS)에 의해 나타낸 바와 같이 (도 24), 생체내 골모세포 활성이 이들 마우스에서 증가되었다. 그러나, 타르트레이트-내성 산 포스파타제 (TRAP)-양성 파골세포의 수 및 골 재흡수 마커 C-말단 텔로펩티드 유형 I 콜라겐 (CTX)의 혈청 수준은 이들 마우스에서 변하지 않았다 (도 33). 이들 결과는 전신으로 전달된 AAV9-amiR-shn3이 골모세포 계통 세포에서 shn3 발현을 감소시키고, 골모세포 활성을 증대시키고, 생체내에서 파골세포 수 및 기능의 어떠한 변경도 없이 골 질량을 증가시켰음을 입증한다. 그러므로, scAAV9-amiR-shn3 벡터는 강력한 골 동화 작용제로서 골다공증의 치료에 유용할 수 있다.
실시예 4: Shn3의 scAAV9-매개 침묵은 폐경후 골다공증에서 골 손실을 방해한다
Wnt 길항제의 억제는 골다공증을 갖는 환자에서 치료적 개입을 위한 새로운 접근법으로서 인식되어 왔다. 이전 연구는 Wnt 신호전달의 교란을 통한 골모세포 분화의 억제제로서 SHN3을 확인하였다. 난소절제된 (OVX) 마우스는 폐경후 골다공증에 대한 확립된 모델이다. Shn3의 억제가 골다공증을 위한 요법으로서 골 형성을 촉진하는 매력적인 표적일 수 있음을 추가로 확립하기 위해, SHN3이 결여된 3개월령 암컷 마우스 (Shn3-/-)에 난소절제술을 수행하고, 수술 2개월 후 골 질량을 마이크로CT에 의해 평가하였다. OVX 수술은 WT 마우스에서 섬유주골 질량의 유의한 감소를 유도하였지만, OVX-유도 골 손실은 Shn3 결실에 의해 완전히 예방되었으며, 이는 섬유주골 질량이 sham-Shn3-/- 마우스 및 OVX-Shn3-/- 마우스 간에 필적하기 때문이다 (도 25). 그러므로, Shn3 표적화는 폐경후 골다공증에서 골 손실을 예방하는 치료 잠재력을 갖는다.
폐경후 골다공증에서 scAAV9-amiR-shn3의 치료 효과를 시험하기 위해, sham 또는 OVX 수술을 3개월령 야생형 암컷 마우스에서 수행하고, 수술 6주 후 벡터를 i.v. 주사하였다 (도 25). 7주 후, 처리된 대퇴골은 효율적인 형질도입을 나타내었으며, shn3의 ~50% 녹다운을 초래하였다 (도 25). 예상대로, amiR-ctrl-발현 OVX 마우스는 sham 마우스에 비해 섬유주골 질량의 유의한 감소를 나타내었다. 그러나, scAAV9-amiR-shn3으로 처리한 경우, 골 손실은 더 큰 섬유주 BV/TV, 두께, 및 연결도 밀도에 의해 나타난 바와 같이 OVX 마우스의 대퇴골에서 완전히 역전되었다 (도 25 및 도 34). 마찬가지로, 대퇴 BFR 및 MAR은 amiR-ctrl-발현 OVX 마우스에 비해 이들 마우스에서 증가되었으며, 이는 생체내에서 향상된 골모세포 활성을 입증한다 (도 25). 특히, TRAP-양성 파골세포의 수 및 골 재흡수 활성이 OVX 마우스 발현하는 amiR-ctrl 및 amiR-shn3 간에 필적하기 때문에, scAAV9-amiR-shn3에 의한 shn3 침묵은 생체내에서 파골세포 기능을 변경하지 않는다 (도 34). 최종적으로, 생체역학적 시험은 대퇴골의 강도 및 강성이 scAAV9-amiR-shn3으로 처리된 마우스의 OVX-유도 골 손실로부터 상당히 보호되었음을 나타내었으며 (도 25), shn3의 scAAV9-매개 침묵이 골다공증 마우스에서 임상적으로 의미있는 종점을 개선시킴을 나타낸다. 종합하면, 이들 결과는 전신으로 전달된 scAAV9-amiR-shn3이 골 형성을 촉진하고 OVX-유도 골다공증의 발병 후 골의 임상적으로 관련된 기계적 특성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 5: AAV9 캡시드로의 골-표적화 펩티드 모티프의 그라프팅은 골-특이적 형질도입을 개선시킨다
OVX 마우스에 치료적 amiR-shn3 트랜스진 (scAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3)을 전달하는 새로운 AAV9.DSS-Nter 골-향성 캡시드의 능력을 검사하였다. Sham 또는 OVX 수술을 3개월령 암컷 마우스에서 수행하고, 수술 6주 후 scAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3을 i.v. 주사하였다. 주사 7주 후, 동물은 동물의 후부 절편 전체에 걸쳐 (도 37) 및 대퇴골의 골모세포 계통 세포에서 (도 37) 강한 EGFP 발현을 나타내었고, 이는 강력한 형질도입을 나타낸다. shn3 mRNA의 수준은 amiR-ctrl-발현 sham 또는 OVX 대퇴골에 비해 amiR-shn3-발현 OVX 대퇴골에서 현저하게 감소되었다 (도 27). amiR-ctrl-발현 OVX 마우스는 sham 마우스에 비해 섬유주골 질량의 유의한 감소를 나타내었지만, 더 큰 섬유주 BV/TV, 두께, 수 및 연결도 밀도에 의해 나타난 바와 같이, scAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3으로 처리된 OVX 마우스의 대퇴골 (도 27) 및 요추골 (도 27, 도 37)에서 골 손실이 완전히 역전되었다. 종합하면, 이들 결과는 골-향성 AAV9.DSS-Nter 캡시드에 의한 amiR-shn3의 전달이 폐경후 골다공증에서 골 손실을 방해할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: 골다공증의 인간 환자 및 동물 모델에서 골 손실의 억제
NF-κβ (RANK, TNFRSF11A) 리간드의 수용체 활성화에 대한 인간화된 생물학적 항체는 RANK 리간드 (RANKL) 및 RANK 사이의 상호작용을 방해하여, 파골세포 분화에 필요한 RANK 신호전달을 억제한다. 그러므로, 그의 치료는 파골세포-매개 골 재흡수를 저해함으로써 골다공증을 갖는 인간 환자 및 동물 모델에서 골 손실을 예방한다.
파골세포 전구체에서 침묵 RANK에 의한 파골세포 분화의 저해, 이에 의한 골다공증의 인간 환자 및 동물 모델에서 골 손실의 억제에 대해, 치료적 amiR-33-mRANKi 트랜스진 (scAAV9.DSS-Nter-amiR-mRANKi 1/2)을 전달하는 새로운 AAV9.DSS-Nter 골-향성 캡시드의 능력을 검사하였다.
방법
scAAV 벡터 설계 및 생성
amiR-33-ctrl 및 amiR-33-shn3에 대한 DNA 서열을 gBlock으로서 합성하고, 제한 효소 부위 (PstI 및 BglII)에서 pAAVsc-CB6-Egfp 플라스미드의 인트론 영역으로 클로닝하였다. Egfp 리포터를 Cre 레콤비나제로 대체함으로써 pAAVsc-CB6-Cre 벡터를 생성하였다. 구축물을 서열분석에 의해 확인하였다. 이전 연구는 트랜스제닉 마우스에서 shRNA 표적화 마우스 Shn3의 독시사이클린-유도성 발현이 shn3 mRNA 수준의 감소 및 골 질량의 상대적 증가를 초래하였음을 나타내었다. amiR-33-shn3 카세트를 생성하기 위해 동일한 표적화 서열을 사용하였다. pAAV-amiR-ctrl 및 pAAV-amiR-shn3 구축물을 AAV9 캡시드로 패키징하였다. 또한, pAAVsc-CB6-Egfp 구축물을 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9-HR, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, 및 AAVrh43 캡시드로 패키징하였다. scAAV 생성을 HEK293 세포의 일시적인 형질감염에 의해 수행하고, CsCl 침강에 의해 정제하고, 이전에 기재된 바와 같이 Egfp 프라임머/프로브 세트를 사용하여 QX200 ddPCR 시스템 (바이오-래드(Bio-Rad))에서 소적 디지털 PCR(droplet digital PCR)(ddPCR)에 의해 적정하였다. ddPCR을 위한 gBlock 및 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 3에 열거되어 있다.
<표 3>
Figure pct00003
골-표적화 scAAV9 벡터의 생성
골-표적화 펩티드 모티프 DSS (AspSerSer)6 (서열식별번호: 16)를 코딩하는 DNA 서열을 코돈-최적화하였다. Q588-DSS-A589 캡시드 (DSS-588)를 생성하기 위해, AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자 (pAAV2/9)를 발현하는 플라스미드를 변형시켜, DSS 서열을 Q588 및 A589 코돈 사이의 AAV9 cap 유전자에 삽입하였다 (pAAV2/9.Q588-DSS-A589). 이 플라스미드를 scAAV 생성에 사용하였다. DSS-Nter 캡시드를 생성하기 위해, 플라스미드 쌍을 사용하였다. 먼저, 오직 VP1 및 VP3만이 발현되도록 (pAAV2/9.noVP2), pAAV2/9에서 VP2의 출발 코돈을 돌연변이하였다 (ACG→ACC). 또 다른 플라스미드에서, DSS 서열은 AAV9 VP2 ORF의 N-말단에 융합되었다. Kozak 서열 및 ATG 출발 코돈을 DSS 서열의 바로 상류에 배치하여, CMV 프로모터 [pcDNA.DSS-VP2(AAV9)]에 의해 구동되는 최적의 발현을 허용하였다. 플라스미드 pAAV2/9.noVP2 및 pcDNA.DSS-VP2(AAV9)를 scAAV 생성에 사용하였다.
세포
연골발생 ATDC5 세포를 시그마(Sigma)로부터 구입하고, 2% FBS, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM/Ham's F12 배지에서 배양하였다. 또한, 콜라게나제 유형 II (50 mg/ml, 워딩턴(Worthington), LS004176) 및 디스파제 II (100 mg/ml, 로슈, 10165859001)를 사용하여 5일령 야생형 신생 마우스 (C57BL/6J)의 두개관으로부터 일차 골선조 (COB)를 단리하고, 10% FBS (깁코(Gibco)), 2 mM L-글루타민 (코닝(Corning)), 1% 페니실린/ 스트렙토마이신 (코닝), 및 1% 비필수 아미노산 (코닝)을 함유하는 α-MEM 배지 (깁코)에서 유지하였다. COB를 아스코르브산 (200 uM, 시그마, A8960) 및 β-글리세로포스페이트 (10 mM, 시그마, G9422)로 분화시켰다. 최종적으로, 2개월령 마우스 (C57BL/6J)의 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 플러싱하고, 10% FBS 및 20 ng/ml의 M-CSF (알&디 시스템스)를 갖는 α-MEM 배지에서 페트리 디쉬에서 배양하여, 골수-유래 파골세포 전구체 (BM-OCP)를 얻었다. 12시간 후, 비부착 세포를 조직 배양 디쉬에 다시 플레이팅하고, 3일 동안 동일한 배지에서 배양하였다. 그 후, BM-OCP를 RAMKL (20 ng/ml; 알&디 시스템스) 및 M-CSF (20 ng/ml; 알&디 시스템스)의 존재하에 6일 동안 파골세포로 분화시켰다.
마우스
Shn3-/- 마우스 및 Shn3fl/fl 마우스를 이전에 기재된 바와 같이 생성하고, 각각 BALB/cJ 및 C57BL/6J 배경에서 유지하였다. 성숙 골모세포에서 타목시펜-유도 Cre 레콤비나제 발현을 갖는 오스테오칼신-ERT/Cre 마우스를 Shn3fl/fl 마우스와 교배하여, Shn3fl/fl ;Ocn-ERT/Cre 마우스를 얻었다. Cre-발현 세포를 라벨링하기 위해, Shn3fl/fl ;Ocn-ERT/Cre 마우스를 RosamT/mG cre 리포터 마우스와 추가로 교배하였다. ERT/Cre의 출생후 활성화를 위해, 옥수수유 (시그마) 중 100 mg/kg 타목시펜 (시그마)을 2개월령 암컷 마우스에게 연속 5일 동안 1일 1회 복강내로 주사하였다.
마우스 유전자형을 꼬리 게놈 DNA에 대해 PCR에 의해 결정하였다. 프라이머 서열은 요청시 입수가능하였다. 대조군 자손을 모든 실험에서 사용하고 분석하였다.
마이크로CT 분석
마이크로CT를 섬유주 및 피질골 미세구조의 정성적 및 정량적 평가에 사용하였으며, 분석 중인 동물의 유전자형에 대해 맹검된 조사자에 의해 수행되었다. 표시된 마우스로부터 절제된 대퇴골을 10% 중성 완충된 포르말린으로 고정하고, 7 μm의 공간 해상도로 마이크로CT 35 (스캔코 메디칼(Scanco Medical))를 사용하여 스캔하였다. 원위 대퇴골의 섬유주골 분석을 위해, 성장판에 근접한 280 μm에서 시작하는 상부 2.1 mm 영역의 윤곽을 그렸다. 대퇴골의 피질골 분석을 위해, 길이 0.6 mm의 미드샤프트 영역을 사용하였다. 12 μm의 등방성 복셀 크기를 사용하여 L4 척추 분절의 마이크로CT 스캔을 수행하였다. 3D 재구축 이미지를 2진화 이미지의 거리 전환에 기초한 방법에 의해 윤곽 2D 이미지로부터 수득하였다. 대안적으로, 마이크로CT 양식의 다중 정적 또는 동적 부피의 융합 3D 보기를 생성하기 위해 인베온(Inveon) 멀티모달리티 3D 시각화 프로그램을 사용하였다 (지멘스 메디컬 솔루션스 유에스에이, 인크(Siemens Medical Solutions USA, Inc)). 제시된 모든 이미지는 각 유전자형을 나타낸다 (n>5).
조직학, 조직형태계측학 및 면역형광
조직학적 분석을 위해, rAAV 벡터로 처리된 마우스로부터 대퇴골 및 척추골을 절개하고, 10% 중성 완충된 포르말린에서 2일 동안 고정시키고, 2-4주 동안 5% 테트라나트륨 EDTA로 탈석회화하였다. 조직을 에탄올 시리즈를 통해 계대로 탈수화하고, 자일렌에서 2회 세정하고, 파라핀에 포매하고, 관상 플레이트를 따라 앞쪽에서 뒤쪽으로 6 μm의 두께로 절편화하였다. 탈석회화된 대퇴 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 또는 타르트레이트-내성 산 포스파타제 (TRAP)로 염색하였다.
동적 조직형태계측학적 분석을 위해, 2% 중탄산나트륨 용액에 용해된 25 mg/kg 칼세인 (시그마, C0875) 및 50 mg/kg 알리자린-3-메틸이미노디아세트산 (시그마, A3882)을 6일-간격으로 마우스에 피하로 주사하였다. 10% 중성 완충된 포르말린에 2일 동안 고정시킨 후, 탈석회화되지 않은 대퇴골 샘플을 메틸메타크릴레이트에 매립하고, 근위 골간단을 세로로 절편화하고 (5 μm), 유골 평가를 위해 맥닐(McNeal)의 트리크롬, 골모세포를 위해 톨루이딘 블루, 및 파골세포를 위해 TRAP으로 염색하였다. 관심있는 영역을 정의하고, 골 형성 속도/골 표면 (BFR/BS), 광물 부착률 (MAR), 골 표면 (BS), 골모세포 표면 (Ob.S/BS), 및 파골세포 표면 (Oc.S/BS)을 반자동 분석 시스템 (오스테오메트릭스(Osteometrics))에 인터페이스된 니콘(Nikon) 옵티팟(Optiphot) 2 현미경을 사용하여 측정하였다. 측정을 2개의 절편/샘플 (~25 μm로 분리됨)에서 수행하고, 정규화 전에 합산하여, ASBMR 표준에 따라 단일 척도/샘플을 얻었다. 이 방법론은 광범위한 품질 관리 및 검증을 거쳤으며, 2명의 상이한 연구자가 맹검 방식으로 결과를 평가하였다.
면역형광을 위해, rAAV-처리된 마우스로부터 절개된 신선한 대퇴골 및 척추골을 수집하고, 즉시 빙냉 4% 파라포름알데히드 용액에서 2일 동안 고정시켰다. 반탈석회화를 일정하게 진탕하면서 0.5 M EDTA pH 7.4에서 4℃에서 5일 동안 수행하고 (연령 ≥ 1주), 1일 동안 20% 수크로스 포스페이트 완충액의 혼합물 및 다음 날 25% 수크로스 포스페이트 완충액으로 침윤을 수행하였다. 모든 샘플을 25% 수크로스 용액 및 OCT 화합물 (사쿠라(Sakura))의 50/50 혼합물에 매립하고, 저온유지장치 (라이카(Leica))를 사용하여 12-um-두께 시상 단면으로 절단하였다. 면역형광 염색 및 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해서, 10분 동안 0.2% 트리톤(Triton) X-100으로 처리한 후, 절편을 실온에서 30분 동안 5% 당나귀 혈청으로 차단하고, 항-BGLAP 항체 (sc-365797, 산타 크루즈(Santa Cruz), 1:150)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 일차 항체를 당나귀 항-래트 IgG 알렉사(Alexa)-594 (1:500, 몰레큘라 프로브스)로 시각화하였다. 핵을 DAPI로 대비염색하였다. 올림푸스(Olympus) IX81 공초점 현미경 또는 라이카 TCS SP5 II 자이스(Zeiss) LSM-880 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 이미징하였다.
생체역학적 분석
대퇴골을 골격 연구 이미징 및 생체역학 시험 코어 센터(Center for Skeletal Research Imaging and Biomechanical Testing Core)에서 전기력 기계적 시험기 (일렉트로포스(Electroforce) 3230, 보스 코포레이션(Bose Corporation), 미국 미네소타주 에덴 프레리)를 사용하여 3-포인트 굽힘에서 기계적으로 시험하였다. 굽힘 고정구는 8 mm의 하단 스팬 길이를 가졌다. 60 Hz에서 수집된 힘 및 변위 데이터로 0.05 mm/초의 속도로 이동하는 변위 제어에서 로딩 포인트로 시험을 수행하였다. 모든 골을 두개 표면이 지지대 위에 놓여 있고 장력이 로딩된 상태에서 시험 동안 동일한 배향으로 배치시켰다. 굽힘 강성 (EI, N-mm2), 겉보기 탄성 모듈러스 (Eapp, MPa), 극한 모멘트 (Mult, N-mm), 겉보기 극한 응력 (σapp, MPa), 골절 일 (Wfrac, mJ), 및 겉보기 인성 (Uapp, mJ/mm3)을 시험으로부터의 힘 및 변위 데이터 및 마이크로CT로 측정된 미드샤프트 기하학에 기초하여 계산하였다. 골절 일은 대퇴골이 골절되는데 필요한 에너지이며, 리만합(Riemann Sum) 방법을 사용하여 힘-변위 곡선하 면적을 찾아 계산하였다. 힘-변위 곡선의 선형 부분을 사용하여 굽힘 강성을 계산하였다. 겉보기 탄성 모듈러스를 계산할 때 최소 관성 모멘트 (Imin)를 사용하였다.
ELISA 분석
제조사의 지침에 따라 키트를 사용하여 CTX1 ELISA (앱클로날(Abclonal) MC0850) 분석을 수행하였다.
골모세포 분화 분석
알칼리성 포스파타제 (ALP) 염색을 위해, 골모세포를 10% 중성 포르말린 완충액으로 고정시키고, 패스트 블루 (시그마, FBS25) 및 나프톨 AS-MX (시그마, 855)를 함유하는 용액으로 염색하였다. 대안적으로, 골모세포를 세포 증식을 위해 10배 희석된 알라마르(Alamar) 블루 용액 (인비트로젠, DAL1100)과 함께 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 세척하고, 6.5 mM Na2CO3, 18.5 mM NaHCO3, 2 mM MgCl2, 및 포스파타제 기질 (시그마, S0942)을 함유하는 용액과 함께 인큐베이션하고, ALP 활성을 루미노미터 (바이오래드(Biorad))에 의해 측정하였다.
성숙 골모세포에서 세포외 매트릭스 광물화를 평가하기 위해, 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 2회 세척하고, 실온에서 15분 동안 70% EtOH에서 고정시켰다. 고정된 세포를 증류수로 2회 세척한 후, 5분 동안 2% 알리자린 레드 용액 (시그마, A5533)으로 염색하였다. 그 후, 세포를 증류수로 3회 세척하고, 칼슘 침착물의 존재에 대해 검사하였다. 광물화를 아세트산 추출 방법에 의해 정량화하였다.
정량 RT-PCR 분석
QIAzol (씨젠(QIAGEN))을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 정제하고, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)로부터의 고용량 cDNA 역방향 전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성하였다. CFX 커넥트 RT-PCR 검출 시스템 (바이오-래드)이 장착된 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스(Master Mix) (바이오-래드)를 사용하여 정량 RT-PCR을 수행하였다. 골 조직에서 Shn3 mRNA 수준을 측정하기 위해, 골수 제거 후, 경골을 액체 질소에서 30초 동안 스냅-동결하고, 결국 1 ml의 QIAzol에서 1분 동안 균질화하였다.
대안적으로, rAAV9-처리된 마우스로부터 절개된 대퇴골 및 경골을 10 mM HEPES (pH 7.2) (셀그로(CellGro))를 함유하는 행크스 평형 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에서 파쇄하고, 15분 동안 37℃에서 온화한 진탕 하에 2.5 mg/mL 콜라게나제 A (로슈) 및 1 unit/mL 디스파제 II (로슈)로 효소적으로 소화시켰다. 생성된 세포 현탁액을 여과하고 (40 μm), 0.5% BSA (분획 V) 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.2)를 사용하여 세척하였다. 세척 후, 세포를 2 mM EDTA 및 1μg/mL 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 갖는 PBS (pH 7.2)에 재현탁시키고 (라이브/데드(live/dead) 배제), DAPI+ 세포 및 이중선을 배제하는 FACS 아리아(Aria) II SORP 세포 분류기 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 EGFP-발현 세포를 분류하였다. QIAzol을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 정제하였다. PCR에 사용되는 프라이머는 표 3에 기재되어 있다.
이뮤노블로팅 분석
세포를 TNT 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마))에 용해시키고, 세포 용해물로부터의 단백질 양을 DC 단백질 검정 (바이오-래드)을 사용하여 측정하였다. 동등한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 적용하고, 이뮤노빌론(Immunobilon)-P 막 (밀리포어(Millipore))으로 이동시키고, 항-GFP 항체 (JL-8, 632381, 타카라(Takara), 1:1000), 항-Cre 레콤비나제 항체 (ab24607, 압캠, 1:1000), 항-Hsp90 항체 (675402, 바이오레전드(Biolegend), 1:1000)로 이뮤노블로팅하고, ECL (써모 피셔 사이언티픽(Thermo fisher scientific))로 전개시켰다. 항-HSP90 항체를 사용한 이뮤노블로팅을 로딩 대조군으로 사용하였다. 대안적으로, 절개된 대퇴골 및 연조직을 RIPA 용해 완충액 (89900, 써모 피셔 사이언티픽)에서 균질화하고, 조직 용해물을 이뮤노블로팅 분석에 적용하였다.
시험관내에서 골모세포, 파골세포 또는 연골세포를 형질도입하는 rAAV 혈청형의 스크리닝
ATDC5 세포 또는 일차 COB를 24-웰 플레이트에서 1 x 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 24시간 후, 3개의 상이한 역가 (109 -1011/mL 게놈 카피)에서 CB-Egfp 리포터 트랜스진을 패키징하는 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV6.2, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAVrh8, rAAVrh10, rAAVrh39, 또는 rAAVrh43 벡터와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, EGFP 발현을 EVOS FL 이미징 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)에 의해 모니터링하였다. 대안적으로, 세포를 TNT 용해 완충액에서 용해시키고, EGFP 발현을 항-EGFP 항체를 사용한 이뮤노블로팅에 의해 평가하고, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 마지막으로, 일차 골수 단핵구를 24-웰 플레이트에 5 x 105 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 10 ng/ml의 RAMKL 및 20 ng/ml의 M-CSF의 존재하에 2일 동안 배양하여 파골세포 전구체로 분화시켰다. rAAV-Egfp 벡터를 사용한 처리 3일 후, EGFP 발현을 EVOS FL 이미징 시스템 및 항-EGFP 항체를 사용한 이뮤노블로팅에 의해 평가하였다.
생체내에서 rAAV 벡터를 스크리닝하기 위해, 10 μl의 rAAV-Egfp 벡터 (1 x 1011 GC; 5 x 1012 GC/kg)를 2개월령 수컷 마우스 (잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory))의 무릎 관절에 관절내로 (i.a.) 주사하였다. 주사 2주 후, IVIS-100 광학 이미징 또는 동결-절편화를 위해 대퇴골 및 무릎 관절을 절개하였다.
골 형성에 대한 Cre-레콤비나제 또는 amiR-shn3의 rAAV9-매개 전달의 효과
국소 전달을 위해, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 10 μl의 rAAV9 (1 x 1011 GC; 5 x 1012 GC/kg)를 2개월령 수컷 마우스의 무릎 관절에 i.a. 주사하였다. 주사 2개월 후, 마이크로CT 분석을 위해 대퇴골을 절개하였다.
전신 전달을 위해, Egfp, Cre, amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 200 μl의 rAAV9 (4 x 1011 GC; 2 x 1013 GC/kg)를 마우스에 정맥내로 (i.v.) 주사하고, 2개월 후, 동적 조직형태계측학적 분석을 위해 6일-간격으로 마우스에 칼세인 및 알리자린-3-메틸이미노디아세트산을 피하로 주사하였다. IVIS-100 광학 이미징 또는 동결-절편화를 사용하여 EGFP 발현을 모니터링하기 위해 비라벨링된 마우스를 사용하였다.
폐경후 골다공증의 마우스 모델에서 전신으로 전달된 rAAV9-amiR-shn3의 치료 효과
3개월령 암컷 마우스 (잭슨 래보러토리)를 마취시키고 양측으로 난소절제 (OVX)함으로써 폐경후 골다공증의 마우스 모델을 생성하였다. 수술 6주 후, sham 또는 OVX 마우스에 amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 운반하는 200 μl의 rAAV9 또는 rAAV9.DSS-Nter (4 x 1011 GC; 2 x 1013 GC/kg)을 i.v. 주사하였다. 마우스를 rAAV9 또는 rAAV9.DSS-Nter로 6개의 군으로 무작위로 분할하였다: sham + rAAV9-amiR-ctrl, OVX + rAAV9-amiR-ctrl, OVX + rAAV9-amiR-shn3, sham + rAAV9.DSS-Nter-amiR-ctrl, OVX + rAAV9.DSS-Nter-amiR-ctrl, OVX + rAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3. 주사 7주 후, 동적 조직형태계측학적 분석을 위해 6일-간격으로 마우스에 칼세인 및 알리자린-3-메틸이미노디아세트산을 피하로 주사하였다. IVIS-100 광학 이미징 또는 동결-절편화를 사용하여 EGFP 발현을 모니터링하기 위해 비라벨링된 마우스를 사용하였다.
통계적 방법
모든 데이터를 평균 ± s.e.m.으로 표시하였다. 측정된 파라미터의 30% 차이가 예상 평균의 10-20%의 시그마의 추정치로 생물학적으로 유의한 것으로 간주된다는 가정하에 샘플 크기를 계산하였다. 알파 및 베타를 각각 .05 및 0.8의 표준 값으로 설정하였다. 동물 또는 샘플을 분석으로부터 배제하지 않았으며, 동물을 해당되는 경우 치료군 대 대조군으로 무작위화하였다. 관련 데이터 분석을 위해, 관련있는 경우, 군의 정규 분포를 점검하기 위해 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 정규성 검정을 먼저 수행하였다. 정규성 검정을 통과하면, 양측, 독립표본 스튜던트 t-검정, 및 정규성 검정이 실패한 경우, 2개의 군 간의 비교를 위해 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 사용하였다. 3 또는 4개의 군의 비교를 위해, 정규성 검정을 통과하면, 일원 ANOVA를 사용한 후, 모든 군 쌍에 대해 튜키(Tukey)의 다중 비교 검정을 사용하였다. 정규성 검정이 실패하면, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정을 수행한 다음, 던(Dunn)의 다중 비교 검정을 수행하였다. 통계적 분석을 위해 그래프패드(GraphPad) PRISM 소프트웨어 (v6.0a, 미국 캘리포니아주 라호이아)를 사용하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001; 및 ****, P<0.0001.
<서열>
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
>SEQ ID NO: 16; (AspSerSer)6 골-표적화 펩티드
Figure pct00008
>EQ ID NO: 17; HABP-19, 골-표적화 펩티드
CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL,
γ (Gla 잔기): γ-카르복실화된 글루탐산 (Glu)은 비타민 K-의존적 γ-카르복실화에 의해 Glu로부터 유래된다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
>SEQ ID NO: 69 인간 슈누리-3 뉴클레오티드 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
>SEQ ID NO: 70 인간 슈누리-3 아미노산 서열
Figure pct00022
Figure pct00023
>SEQ ID NO: 57; 골-재흡수 펩티드 (8-mer)
Figure pct00024
>SEQ ID NO: 58; 골-재흡수 펩티드 (9-mer)
Figure pct00025
>SEQ ID NO: 59; 골-재흡수 펩티드 (10-mer)
Figure pct00026
>SEQ ID NO: 60; 골-재흡수 펩티드 (11-mer)
Figure pct00027
>SEQ ID NO: 61; 골-재흡수 펩티드 (12-mer)
Figure pct00028
>SEQ ID NO: 62; 골-재흡수 펩티드 (13-mer)
Figure pct00029
>SEQ ID NO: 63; 골-재흡수 펩티드 (14-mer)
Figure pct00030
SEQUENCE LISTING <110> University of Massachusetts at Worcester <120> GENE THERAPEUTICS FOR TREATING BONE DISORDERS <130> U0120.70099WO00 <140> Not Yet Assinged <141> Concurrently Herewith <150> US 62/799,843 <151> 2019-02-01 <150> US 62/647,595 <151> 2018-03-23 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60 ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120 gcgggcagct gtgtacaaac tacttgagag caggtgttct ggcaatacct gcctgctctg 180 taatagtttg tacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240 taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327 <210> 2 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60 ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120 gcgggcagct gtgactacag gtactcacaa gctctgttct ggcaatacct ggagcttgtc 180 tgcacctgta gtcacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240 taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327 <210> 3 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60 cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120 gggcagctgt gtttccatgg taagttcaag gctgttctgg caatacctgg ccttgaagat 180 gccatggaaa cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240 agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaat 325 <210> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60 ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120 gcgggcagct gtgtttcatc atagtacaca cctctgttct ggcaatacct ggaggtgtga 180 tccatgatga aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240 taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327 <210> 5 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60 ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120 gcgggcagct gtgttactgt aggatcgaga gggatgttct ggcaatacct gtccctctcc 180 ttactacagt aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240 taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taagg 285 <210> 6 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60 cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120 gggcagctgt gattatcgct attgcagctt tctgttctgg caatacctgg aaagctggta 180 cagcgataat cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240 agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaat 325 <210> 7 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60 cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120 gggcagctgt gtcagattat cgctattgca gctgttctgg caatacctgg ctgcaattcc 180 aataatctga cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240 agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaat 325 <210> 8 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60 ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120 gcgggcagct gtgacaagta ggcagatgag gcactgttct ggcaatacct ggtgcctcaa 180 gtacctactt gtcacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc 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tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaat 325 <210> 11 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 11 gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60 cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120 gggcagctgt gacgtctttg gtctcaaagg ggtgttctgg caatacctgc ccctttgtca 180 tcaaagacgt cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240 agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300 caggggatcc ggtggtggtg caaat 325 <210> 12 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtg ccaccatgat acctgcaaaa gacatggcta 60 aagttatgat tgtcatgttg gcaatttgtt ttcttacaaa atcggatggg aaatctgtta 120 agaagagatc tgtgagtgaa atacagctta tgcataacct gggaaaacat ctgaactcga 180 tggagagagt agaatggctg cgtaagaagc tgcaggatgt gcacaatttt gttgcccttg 240 gagctcctct agctcccaga gatgctggtt cccagaggcc ccgaaaaaag gaagacaatg 300 tcttggttga gagccatgaa aaaagtcttg gagaggcaga caaagctgat gtgaatgtat 360 taactaaagc taaatcccag tgaagcttat cgataccgtc gactagagct c 411 <210> 13 <211> 591 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtg ccaccatgca gcggagactg gttcagcagt 60 ggagcgtcgc ggtgttcctg ctgagctacg cggtgccctc ctgcgggcgc tcggtggagg 120 gtctcagccg ccgcctcaaa agagctgtgt ctgaacatca gctcctccat gacaagggga 180 agtccatcca agatttacgg cgacgattct tccttcacca tctgatcgca gaaatccaca 240 cagctgaaat cagagctacc tcggaggtgt cccctaactc caagccctct cccaacacaa 300 agaaccaccc cgtccgattt gggtctgatg atgagggcag atacctaact caggaaacta 360 acaaggtgga gacgtacaaa gagcagccgc tcaagacacc tgggaagaaa aagaaaggca 420 agcccgggaa acgcaaggag caggaaaaga aaaaacggcg aactcgctct gcctggttag 480 actctggagt gactgggagt gggctagaag gggaccacct gtctgacacc tccacaacgt 540 cgctggagct cgattcacgg taaagcttat cgataccgtc gactagagct c 591 <210> 14 <211> 696 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtc gccaccatgg gatggagctg tattatcctg 60 tttctcgtcg ctactgccac cggagctcat tccgcttcca aaagagctct ggtcatcctg 120 gccaaaggag cagaggagat ggagacagtg attcctgtgg atgtcatgcg gcgagccggg 180 atcaaagtca ctgttgcagg cttggctggg aaggaccccg tgcagtgtag ccgtgatgta 240 atgatttgtc cagataccag tctggaagat gcaaaaacgc agggaccata cgatgtggtg 300 gttcttccag gaggaaatct gggtgcacag aatttatctg agtcgcctat ggtgaaggag 360 atcctcaagg agcaggagag caggaagggc ctcatagctg ccatctgtgc aggtcctacg 420 gctctgttgg ctcacgaagt aggttttgga tgcaaggtca caacacaccc actggctaag 480 gacaaaatga tgaatggcag tcactacagc tactcagaga gccgcgtgga gaaggacggc 540 ctgatcctca ccagccgcgg gccggggacc agctttgagt ttgcactagc cattgtggag 600 gcactcgtgg ggaaagacat ggccaaccaa gtgaaggcac cgcttgttct caaagactag 660 taaaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctg 696 <210> 15 <211> 696 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtc gccaccatgg gatggagctg tattatcctg 60 tttctcgtcg ctactgccac cggagctcat tccgcttcca aaagagctct ggtcatcctg 120 gctaaaggag cagaggaaat ggagacggtc atccctgtag atgtcatgag gcgagctggg 180 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gamma-carboxylated glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> is a gamma-carboxylated glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> is a gamma-carboxylated glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> is a gamma-carboxylated glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> is a gamma-carboxylated glutamic acid <400> 17 Cys Glu Pro Arg Arg Glu Val Ala Glu Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val 1 5 10 15 Ala Glu Leu <210> 18 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 18 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala 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790 795 800 Gln His Thr Ser Ser Phe Glu Lys Ser Asp Ser Leu Glu Gln Pro Ser 805 810 815 Gly Leu Glu Gly Glu Asp Lys Pro Leu Ala Gln Phe Pro Ser Pro Pro 820 825 830 Pro Ala Pro His Gly Arg Ser Ala His Ser Leu Gln Pro Lys Leu Val 835 840 845 Arg Gln Pro Asn Ile Gln Val Pro Glu Ile Leu Val Thr Glu Glu Pro 850 855 860 Asp Arg Pro Asp Thr Glu Pro Glu Pro Pro Pro Lys Glu Pro Glu Lys 865 870 875 880 Thr Glu Glu Phe Gln Trp Pro Gln Arg Ser Gln Thr Leu Ala Gln Leu 885 890 895 Pro Ala Glu Lys Leu Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Arg Leu Ala Glu 900 905 910 Met Ala Gln Ser Ser Gly Glu Ser Ser Phe Glu Ser Ser Val Pro Leu 915 920 925 Ser Arg Ser Pro Ser Gln Glu Ser Asn Val Ser Leu Ser Gly Ser Ser 930 935 940 Arg Ser Ala Ser Phe Glu Arg Asp Asp His Gly Lys Ala Glu Ala Pro 945 950 955 960 Ser Pro Ser Ser Asp Met Arg Pro Lys Pro Leu Gly Thr His Met Leu 965 970 975 Thr Val Pro Ser His His Pro His Ala Arg Glu Met Arg Arg Ser Ala 980 985 990 Ser Glu Gln Ser Pro Asn Val Ser His Ser Ala His Met Thr Glu Thr 995 1000 1005 Arg Ser Lys Ser Phe Asp Tyr Gly Ser Leu Ser Leu Thr Gly Pro 1010 1015 1020 Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala Pro Pro Ala Arg Val Ala Pro Pro 1025 1030 1035 Glu Arg Arg Lys Cys Phe Leu Val Arg Gln Ala Ser Leu Ser Arg 1040 1045 1050 Pro Pro Glu Ser Glu Leu Glu Val Ala Pro Lys Gly Arg Gln Glu 1055 1060 1065 Ser Glu Glu Pro Gln Pro Ser Ser Ser Lys Pro Ser Ala Lys Ser 1070 1075 1080 Ser Leu Ser Gln Ile Ser Ser Ala Ala Thr Ser His Gly Gly Pro 1085 1090 1095 Pro Gly Gly Lys Gly Pro Gly Gln Asp Arg Pro Pro Leu Gly Pro 1100 1105 1110 Thr Val Pro Tyr Thr Glu Ala Leu Gln Val Phe His His Pro Val 1115 1120 1125 Ala Gln Thr Pro Leu His Glu Lys Pro Tyr Leu Pro Pro Pro Val 1130 1135 1140 Ser Leu Phe Ser Phe Gln His Leu Val Gln His Glu Pro Gly Gln 1145 1150 1155 Ser Pro Glu Phe Phe Ser Thr Gln Ala Met Ser Ser Leu Leu Ser 1160 1165 1170 Ser Pro Tyr Ser Met Pro Pro Leu Pro Pro Ser Leu Phe Gln Ala 1175 1180 1185 Pro Pro Leu Pro Leu Gln Pro Thr Val Leu His Pro Gly Gln Leu 1190 1195 1200 His Leu Pro Gln Leu Met Pro His Pro Ala Asn Ile Pro Phe Arg 1205 1210 1215 Gln Pro Pro Ser Phe Leu Pro Met Pro Tyr Pro Thr Ser Ser Ala 1220 1225 1230 Leu Ser Ser Gly Phe Phe Leu Pro Leu Gln Ser Gln Phe Ala Leu 1235 1240 1245 Gln Leu Pro Gly Asp Val Glu Ser His Leu Pro Gln Ile Lys Thr 1250 1255 1260 Ser Leu Ala Pro Leu Ala Thr Gly Ser Ala Gly Leu Ser Pro Ser 1265 1270 1275 Thr Glu Tyr Ser Ser Asp Ile Arg Leu Pro Pro Val Ala Pro Pro 1280 1285 1290 Ala Ser Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ala Pro Pro Leu Ala Leu Pro 1295 1300 1305 Ala Cys Pro Asp Thr Met Val Ser Leu Val Val Pro Val Arg Val 1310 1315 1320 Gln Thr Asn Met Pro Ser Tyr Gly Ser Ala Met Tyr Thr Thr Leu 1325 1330 1335 Ser Gln Ile Leu Val Thr Gln Ser Gln Gly Ser Ser Ala Thr Val 1340 1345 1350 Ala Leu Pro Lys Phe Glu Glu Pro Pro Ser Lys Gly Thr Thr Val 1355 1360 1365 Cys Gly Ala Asp Val His Glu Val Gly Pro Gly Pro Ser Gly Leu 1370 1375 1380 Ser Glu Glu Gln Ser Arg Ala Phe Pro Thr Pro Tyr Leu Arg Val 1385 1390 1395 Pro Val Thr Leu Pro Glu Arg Lys Gly Thr Ser Leu Ser Ser Glu 1400 1405 1410 Ser Ile Leu Ser Leu Glu Gly Ser Ser Ser Thr Ala Gly Gly Ser 1415 1420 1425 Lys Arg Val Leu Ser Pro Ala Gly Ser Leu Glu Leu Thr Met Glu 1430 1435 1440 Thr Gln Gln Gln Lys Arg Val Lys Glu Glu Glu Ala Ser Lys Ala 1445 1450 1455 Asp Glu Lys Leu Glu Leu Val Lys Pro Cys Ser Val Val Leu Thr 1460 1465 1470 Ser Thr Glu Asp Gly Lys Arg Pro Glu Lys Ser His Leu Gly Asn 1475 1480 1485 Gln Gly Gln Gly Arg Arg Glu Leu Glu Met Leu Ser Ser Leu Ser 1490 1495 1500 Ser Asp Pro Ser Asp Thr Lys Glu Ile Pro Pro Leu Pro His Pro 1505 1510 1515 Ala Leu Ser His Gly Thr Ala Pro Gly Ser Glu Ala Leu Lys Glu 1520 1525 1530 Tyr Pro Gln Pro Ser Gly Lys Pro His Arg Arg Gly Leu Thr Pro 1535 1540 1545 Leu Ser Val Lys Lys Glu Asp Ser Lys Glu Gln Pro Asp Leu Pro 1550 1555 1560 Ser Leu Ala Pro Pro Ser Ser Leu Pro Leu Ser Glu Thr Ser Ser 1565 1570 1575 Arg Pro Ala Lys Ser Gln Glu Gly Thr Asp Ser Lys Lys Val Leu 1580 1585 1590 Gln Phe Pro Ser Leu His Thr Thr Thr Asn Val Ser Trp Cys Tyr 1595 1600 1605 Leu Asn Tyr Ile Lys Pro Asn His Ile Gln His Ala Asp Arg Arg 1610 1615 1620 Ser Ser Val Tyr Ala Gly Trp Cys Ile Ser Leu Tyr Asn Pro Asn 1625 1630 1635 Leu Pro Gly Val Ser Thr Lys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser 1640 1645 1650 Lys Gln Lys Val Ser Lys Glu Thr Tyr Thr Met Ala Thr Ala Pro 1655 1660 1665 His Pro Glu Ala Gly Arg Leu Val Pro Ser Ser Ser Arg Lys Pro 1670 1675 1680 Arg Met Thr Glu Val His Leu Pro Ser Leu Val Ser Pro Glu Gly 1685 1690 1695 Gln Lys Asp Leu Ala Arg Val Glu Lys Glu Glu Glu Arg Arg Gly 1700 1705 1710 Glu Pro Glu Glu Asp Ala Pro Ala Ser Gln Arg Gly Glu Pro Ala 1715 1720 1725 Arg Ile Lys Ile Phe Glu Gly Gly Tyr Lys Ser Asn Glu Glu Tyr 1730 1735 1740 Val Tyr Val Arg Gly Arg Gly Arg Gly Lys Tyr Val Cys Glu Glu 1745 1750 1755 Cys Gly Ile Arg Cys Lys Lys Pro Ser Met Leu Lys Lys His Ile 1760 1765 1770 Arg Thr His Thr Asp Val Arg Pro Tyr Val Cys Lys His Cys His 1775 1780 1785 Phe Ala Phe Lys Thr Lys Gly Asn Leu Thr Lys His Met Lys Ser 1790 1795 1800 Lys Ala His Ser Lys Lys Cys Gln Glu Thr Gly Val Leu Glu Glu 1805 1810 1815 Leu Glu Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp Asp Leu Phe Gln Asp Ser 1820 1825 1830 Glu Gly Arg Glu Gly Ser Glu Ala Val Glu Glu His Gln Phe Ser 1835 1840 1845 Asp Leu Glu Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Leu Asp Glu Asp Glu 1850 1855 1860 Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ser Gln Asp Glu Leu Ser Arg Pro Ser 1865 1870 1875 Ser Glu Ala Pro Pro Pro Gly Pro Pro His Ala Leu Arg Ala Asp 1880 1885 1890 Ser Ser Pro Ile Leu Gly Pro Gln Pro Pro Asp Ala Pro Ala Ser 1895 1900 1905 Gly Thr Glu Ala Thr Arg Gly Ser Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg 1910 1915 1920 Leu Thr Ala Ser Ser Cys Ser Met Ser Ser Gln Ser Met Pro Gly 1925 1930 1935 Leu Pro Trp Leu Gly Pro Ala Pro Leu Gly Ser Val Glu Lys Asp 1940 1945 1950 Thr Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Lys Pro Val Ser Pro Arg Arg Pro 1955 1960 1965 Trp Ser Pro Ser Lys Glu Ala Gly Ser Arg Pro Pro Leu Ala Arg 1970 1975 1980 Lys His Ser Leu Thr Lys Asn Asp Ser Ser Pro Gln Arg Cys Ser 1985 1990 1995 Pro Ala Arg Glu Pro Gln Ala Ser Ala Pro Ser Pro Pro Gly Leu 2000 2005 2010 His Val Asp Pro Gly Arg Gly Met Gly Ala Leu Pro Cys Gly Ser 2015 2020 2025 Pro Arg Leu Gln Leu Ser Pro Leu Thr Leu Cys Pro Leu Gly Arg 2030 2035 2040 Glu Leu Ala Pro Arg Ala His Val Leu Ser Lys Leu Glu Gly Thr 2045 2050 2055 Thr Asp Pro Gly Leu Pro Arg Tyr Ser Pro Thr Arg Arg Trp Ser 2060 2065 2070 Pro Gly Gln Ala Glu Ser Pro Pro Arg Ser Ala Pro Pro Gly Lys 2075 2080 2085 Trp Ala Leu Ala Gly Pro Gly Ser Pro Ser Ala Gly Glu His Gly 2090 2095 2100 Pro Gly Leu Gly Leu Asp Pro Arg Val Leu Phe Pro Pro Ala Pro 2105 2110 2115 Leu Pro His Lys Leu Leu Ser Arg Ser Pro Glu Thr Cys Ala Ser 2120 2125 2130 Pro Trp Lys Ala Glu Ser Arg Ser Pro Ser Cys Ser Pro Gly Pro 2135 2140 2145 Ala His Pro Leu Ser Ser Arg Pro Phe Ser Ala Leu His Asp Phe 2150 2155 2160 His Gly His Ile Leu Ala Arg Thr Glu Glu Asn Ile Phe Ser His 2165 2170 2175 Leu Pro Leu His Ser Gln His Leu Thr Arg Ala Pro Cys Pro Leu 2180 2185 2190 Ile Pro Ile Gly Gly Ile Gln Met Val Gln Ala Arg Pro Gly Ala 2195 2200 2205 His Pro Thr Leu Leu Pro Gly Pro Thr Ala Ala Trp Val Ser Gly 2210 2215 2220 Phe Ser Gly Gly Gly Ser Asp Leu Thr Gly Ala Arg Glu Ala Gln 2225 2230 2235 Glu Arg Gly Arg Trp Ser Pro Thr Glu Ser Ser Ser Ala Ser Val 2240 2245 2250 Ser Pro Val Ala Lys Val Ser Lys Phe Thr Leu Ser Ser Glu Leu 2255 2260 2265 Glu Gly Gly Asp Tyr Pro Lys Glu Arg Glu Arg Thr Gly Gly Gly 2270 2275 2280 Pro Gly Arg Pro Pro Asp Trp Thr Pro His Gly Thr Gly Ala Pro 2285 2290 2295 Ala Glu Pro Thr Pro Thr His Ser Pro Cys Thr Pro Pro Asp Thr 2300 2305 2310 Leu Pro Arg Pro Pro Gln Gly Arg Arg Ala Ala Gln Ser Trp Ser 2315 2320 2325 Pro Arg Leu Glu Ser Pro Arg Ala Pro Thr Asn Pro Glu Pro Ser 2330 2335 2340 Ala Thr Pro Pro Leu Asp Arg Ser Ser Ser Val Gly Cys Leu Ala 2345 2350 2355 Glu Ala Ser Ala Arg Phe Pro Ala Arg Thr Arg Asn Leu Ser Gly 2360 2365 2370 Glu Pro Arg Thr Arg Gln Asp Ser Pro Lys Pro Ser Gly Ser Gly 2375 2380 2385 Glu Pro Arg Ala His Pro His Gln Pro Glu Asp Arg Val Pro Pro 2390 2395 2400 Asn Ala 2405

Claims (34)

  1. (i) 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 또는 그의 변이체를 포함하는 제1 영역; 및
    (ii) 적어도 하나의 골 대사 조정제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역
    을 코딩하는 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 골 대사 조정제가 골 형성 촉진제이며, 임의적으로 골 형성 촉진제가 골모세포 및/또는 골세포 기능 또는 활성을 촉진하는 단백질, 파골세포 기능을 억제하는 단백질, 및 파골세포 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 골 대사 조정제가 골 형성 억제제이며, 임의적으로 골 형성 억제제가 골모세포 및/또는 골세포 기능 또는 활성을 억제하는 단백질, 파골세포 기능 또는 활성을 촉진하는 단백질, 및 골모세포 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 핵산.
  4. 제2항에 있어서, 트랜스진이 부갑상선 호르몬 (PTH), PTH-관련 단백질 (PTHrP), 데글리카제 DJ1, 스클레로스틴 (SOST)을 표적화하는 억제성 핵산, 슈누리-3(SHN3)을 표적화하는 억제성 핵산, 카텝신 K (CTSK)를 표적화하는 억제성 핵산, 및 NF-κβ의 수용체 활성화제 (RANK)를 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 골 형성 촉진제를 코딩하는 것인 단리된 핵산.
  5. 제3항에 있어서, 트랜스진이 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK), 부갑상선 호르몬 (PTH)을 표적화하는 억제성 핵산, PTH-관련 단백질 (PTHrP)을 표적화하는 억제성 핵산, 및 데글리카제 DJ1을 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 골 형성 억제제를 코딩하는 것인 단리된 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 인공 miRNA (amiRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 억제성 핵산을 코딩하는 것인 단리된 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 억제성 핵산이 돌연변이체 말단 반복부 (mTR)로서 기능하는 것인 단리된 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-15 또는 55-56 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 AAV ITR 또는 그의 변이체를 포함하는 제3 영역을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하며, 임의적으로 플라스미드인 벡터.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. (i) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 핵산
    을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  14. 제13항에 있어서, 캡시드 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh39, AAV.43, AAV2/2-66, AAV2/2-84 및 AAV2/2-125로부터 선택된 혈청형, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체이며, 임의적으로 캡시드 단백질이 서열식별번호: 18-34 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 것인 rAAV.
  15. 제14항에 있어서, 캡시드 단백질이 골모세포 세포 (OB)를 형질도입하며, 임의적으로 캡시드 단백질이 AAV4, AAV1, AAV6, AAV6.2 및 AAV9로부터 선택된 혈청형, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체인 rAAV.
  16. 제14항에 있어서, 캡시드 단백질이 파골세포 세포 (OC)를 형질도입하며, 임의적으로 캡시드 단백질이 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV.rh39 및 AAV.rh43으로부터 선택된 혈청형, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 변이체인 rAAV.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질이 이종 골-표적화 펩티드를 포함하는 것인 rAAV.
  18. 제17항에 있어서, 이종 골-표적화 펩티드가 서열식별번호: 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61, 62 또는 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAAV.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 이종 골-표적화 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 캡시드 단백질의 VP2 오픈 리딩 프레임으로 삽입되며, 임의적으로 핵산 서열이 AAV9 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 N587 및 R588에 상응하는 코돈 사이에 삽입된 것인 rAAV.
  20. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질이 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 rAAV.
  21. 제20항에 있어서, 캡시드 단백질이 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 통해 하나 이상의 알렌드로네이트 (Ale) 모이어티에 접합된 것인 rAAV.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-상보적 AAV (scAAV)인 rAAV.
  23. 이종 골-표적화 펩티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 캡시드 단백질을 코딩하며, 임의적으로 이종 골-표적화 펩티드는 서열식별번호: 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61, 62 또는 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  24. 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 포함하며, 임의적으로 하나 이상의 아지드-보유 비천연 아미노산을 통해 하나 이상의 알렌드로네이트 (Ale) 모이어티에 접합된 재조합 AAV 캡시드 단백질.
  25. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스진을 골 조직에 전달하는 방법.
  26. 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 트랜스진은 골 형성 촉진제를 코딩하고, 임의적으로 골 형성 촉진제는 골모세포 및/또는 파골세포 기능 또는 활성을 촉진하는 단백질, 파골세포 기능 또는 활성을 억제하는 단백질, 및 파골세포 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 골 형성 촉진제가 부갑상선 호르몬 (PTH), PTH-관련 단백질 (PTHrP), 데글리카제 DJ1, 스클레로스틴 (SOST)을 표적화하는 억제성 핵산, 슈누리-3 (SHN3)을 표적화하는 억제성 핵산, 카텝신 K (CTSK)를 표적화하는 억제성 핵산, 및 NF-κβ의 수용체 활성화제 (RANK)를 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애가 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로부터 유발된 기계적 장애, 및 이차 장애, 예컨대 유방암 또는 전립선암 전이, 1형 당뇨병, 루푸스, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 갑상선기능항진증, 셀리악병, 천식, 다발성 경화증, 및 치주염인 방법.
  29. 증가된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 트랜스진은 골 형성 억제제를 코딩하고, 임의적으로 골 형성 억제제는 골모세포 및/또는 골세포 기능 또는 활성을 억제하는 단백질, 파골세포 기능 또는 활성을 촉진하는 단백질, 및 골모세포 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 및 과대한 (예를 들어, 증가된) 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 골 형성 억제제가 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK), 부갑상선 호르몬 (PTH)을 표적화하는 억제성 핵산, PTH-관련 단백질 (PTHrP)을 표적화하는 억제성 핵산, 데글리카제 DJ1을 표적화하는 억제성 핵산, 및 NF-κβ의 수용체 활성화제 (RANK)를 표적화하는 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 변형된 및 과대한 (예를 들어, 증가된) 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애가 골화석증, 피크노디소스토시스, 스클레로스테오시스, 말단비대증, 불소증, 골수섬유증, C형 간염-연관 골경화증, 이소성 골화증, 및 골암, 예컨대 골육종 및 골의 전이성 암인 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 주사에 의해 수행되며, 임의적으로 주사가 전신 주사 (예를 들어, 정맥내 주사) 및 국소 주사 (예를 들어, 근육내 (IM) 주사, 무릎 주사 및 대퇴 골수내 주사)인 방법.
  33. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 rAAV를 포함하는 조직 또는 이식편을 대상체에게 이식함으로써 수행되는 것인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 골모세포, 골세포, 파골세포 및 연골세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형의 형질도입을 유발하는 것인 방법.
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