CN112368051A - 用于治疗骨病的基因治疗剂 - Google Patents

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Abstract

在一些方面，本公开涉及用于调节(例如，增加和/或减少)受试者中骨量的组合物和方法。在一些方面，本公开提供了分离的核酸，和例如rAAV载体的载体，其被配置以表达促进(例如，增加)或抑制(例如，减少)某些类型的骨细胞的活性、分化或功能的转基因，这些骨细胞例如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等。在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸和载体可用于治疗与骨量增加(例如骨硬化症)或骨量减少(例如骨质疏松症)有关的病症和病况。

Description

用于治疗骨病的基因治疗剂
相关申请
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年3月23日提交的标题为“用于治疗骨病的基因治疗剂”的美国临时申请号62/647,595，以及2019年2月1日提交的标题为“用于治疗骨病的基因治疗剂”的美国临时申请号62/799,843的优先权。
背景技术
骨代谢的缺陷引起各种不同的骨病，包括与病理学损耗或骨量有关的病症以及与骨量的病理学增加有关的病症。对骨量的影响可能是全身性或局部的。例如，骨质疏松症是以骨量减少为特征的疾病，并且是与衰老有关的脆弱和痛苦的主要来源。估计1000万50岁以上的美国人患有骨质疏松症，并且每年约有150万个体发生与骨质疏松症有关的骨折，具有严重的健康后果。用于骨质疏松症的大多数现有治疗剂抑制破骨细胞(OC)的骨吸收，并且这种抑制伴随着许多副作用，包括非典型性骨折和颌骨坏死。间断应用的甲状旁腺激素(PTH)是合成代谢药剂，其促进成骨细胞(OB)功能并可用于治疗骨质疏松症患者。然而，由于对PTH诱导的骨肿瘤的担心，这种药剂的使用受到限制。此外，一种新开发的合成代谢药物抗骨硬化蛋白抗体通过增强的Wnt信号传递促进OB分化。然而，在炎性关节炎的情况下，已观察到抗骨硬化蛋白抗体在TNF依赖性炎症的情况下增加骨组织破坏并提高中风风险。同样地，归因于升高的中风发病率，组织蛋白酶K的小分子抑制剂(例如奥当卡替)从FDA考量中被撤消。
发明内容
本公开的一些方面涉及用于调节(例如，增加或减少)骨形成和/或新陈代谢的组合物和方法。本公开部分基于编码一种或多种调节骨代谢的转基因的重组腺相关病毒(rAAV)。因此，在一些实施方案中，本公开描述的rAAV可用于治疗与骨代谢失调(例如骨密度降低、骨密度增加等)有关的疾病或病症。
因此，在一些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其编码：第一区域，其包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体；和第二区域，其包含编码至少一种骨代谢调节剂的转基因。
在一些实施方案中，骨代谢调节剂是骨形成促进剂。在一些实施方案中，骨形成促进剂选自由以下组成的组：促进OB和/或骨细胞(OCY)分化或活性的蛋白、抑制OC分化或活性的蛋白以及抑制OC分化或活性的抑制性核酸。
在一些实施方案中，骨代谢调节剂是骨形成抑制剂。在一些实施方案中，骨形成抑制剂选自由以下组成的组：抑制OB和/或OCY分化或活性的蛋白、促进OC分化或活性的蛋白以及抑制OB表达或活性的抑制性核酸。
在一些实施方案中，转基因编码选自由以下组成的组的骨形成促进剂：甲状旁腺激素(PTH)、PTH相关蛋白(PTHrP)、去糖化酶(deglycase)DJ1、靶向骨硬化蛋白(SOST)的抑制性核酸、靶向schnurri-3(SHN3)的抑制性核酸和靶向组织蛋白酶K(CTSK)的抑制性核酸。
在一些实施方案中，转基因编码选自由以下组成的组的骨形成抑制剂：骨硬化蛋白(SOST)、schnurri-3(SHN3)、组织蛋白酶K(CTSK)、靶向甲状旁腺激素(PTH)的抑制性核酸、靶向PTH相关蛋白(PTHrP)的抑制性核酸和靶向去糖化酶DJ1的抑制性核酸。
在一些实施方案中，转基因编码选自由dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和人造miRNA(amiRNA)组成的组的至少一种抑制性核酸。
在一些实施方案中，抑制性核酸起到突变末端重复(mTR)的功能。
在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO:1-15中任何一个所示的序列。在一些实施方案中，转基因靶向(例如，与之杂交或与之结合)SEQ ID NO:1-15中任何一个所示的序列或其互补序列。
在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸进一步包含与转基因有效连接的至少一个启动子。
在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸进一步包含含有第二AAV ITR或其变体的第三区域。
在一些方面，本公开提供了包含如本公开所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒。
在一些方面，本公开提供了包含如本公开所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫(例如，Sf9)细胞或哺乳动物细胞。
本公开部分基于以骨细胞如OB、OCY、OC等的向性增加为特征的rAAV。在一些实施方案中，本公开描述的rAAV包含异源骨靶向肽或结合至骨靶向部分。
因此，在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其编码包含异源骨靶向肽的重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白。在一些实施方案中，异源骨靶向肽靶向OC(例如，相对于OB，尤其或优先靶向OC)。在一些实施方案中，异源骨靶向肽靶向OB(例如，相对于OC，尤其或优先靶向OB)。在一些实施方案中，异源骨靶向肽包含SEQ ID NO:16、17、57、58、59、60、61、62和63中所示的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸的rAAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白经由一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸结合至一个或多个阿仑膦酸盐(Ale)部分。
在一些方面，本公开提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：衣壳蛋白；和如本公开所述的分离的核酸。
在一些实施方案中，衣壳蛋白的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh39、AAV.43、AAV2/2-66、AAV2/2-84和AAV2/2-125，或前述SEQ ID NO:18-34中任何一个的变体。
在一些实施方案中，衣壳蛋白转导OB和/或OCY。在一些实施方案中，衣壳蛋白(例如，转导OB和/或OCY的衣壳蛋白)的血清型选自AAV4、AAV1、AAV6、AAV6.2和AAV9，或前述任何一种的变体。
在一些实施方案中，衣壳蛋白转导OC。在一些实施方案中，衣壳蛋白(例如，转导OC的衣壳蛋白)的血清型选自AAV1、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV.rh39和AAV.rh43，或前述任何一种的变体。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含异源骨靶向肽，例如包含SEQ ID NO:16、17、57、58、59、60、61、62和63所示的氨基酸序列的异源骨靶向肽。在一些实施方案中，异源骨靶向肽靶向OC(例如，相对于OB，尤其或优先靶向OC)。在一些实施方案中，异源骨靶向肽靶向OB(例如，相对于OC，尤其或优先靶向OB)。
在一些实施方案中，将编码异源骨靶向肽的核酸序列插入衣壳蛋白的VP2开放阅读框中。在一些实施方案中，将核酸序列插入对应于编码AAV2衣壳蛋白的核酸序列的N587和R588的密码子之间或N末端。在一些实施方案中，将核酸序列插入对应于编码AAV9衣壳蛋白的核酸序列的Q588和A589的密码子之间或N-末端。
在一些实施方案中，衣壳蛋白由具有一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸的氨基酸序列编码。在一些实施方案中，衣壳蛋白经由一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸结合至一个或多个阿仑膦酸盐(Ale)部分。
在一些实施方案中，rAAV是自互补AAV(scAAV)。
在一些方面，本公开提供了用于将转基因递送至骨组织的方法，该方法包括施用如本公开所述的分离的核酸、组合物或rAAV给受试者。
在一些方面，本公开提供了用于治疗与骨密度降低有关的疾病或病症的方法，该方法包括施用给患有或怀疑患有如本文所述的与骨密度降低有关的疾病或病症的受试者，其中rAAV的转基因编码骨形成促进剂。在一些实施方案中，骨形成促进剂选自由以下组成的组：促进OB和/或OCY分化或活性的蛋白、抑制OC分化或活性的蛋白和抑制OC分化或活性的抑制性核酸。
在一些实施方案中，骨形成促进剂选自由以下组成的组：甲状旁腺激素(PTH)、PTH相关蛋白(PTHrP)、去糖化酶DJ1、靶向骨硬化蛋白(SOST)的抑制性核酸、靶向schnurri-3(SHN3)的抑制性核酸和靶向组织蛋白酶K(CTSK)的抑制性核酸。
在一些实施方案中，与骨密度降低有关的疾病或病症选自由以下组成的组：骨质疏松症、临界大小骨缺损(critical sized-bone defect)、由废用或受伤引起的机械性病症以及例如乳腺癌或前列腺癌转移的继发性病症、1型糖尿病、狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、甲状腺功能亢进、乳糜泻、哮喘、牙周炎和多发性硬化。
在一些方面，本公开提供了用于治疗与骨密度增加有关的疾病或病症的方法，例如选自由骨硬化症、骨肉瘤和异位骨化组成的组的疾病，该方法包括施用如本文所述的rAAV给患有或怀疑患有与骨密度增加有关的疾病或病症的受试者，其中rAAV的转基因编码骨形成抑制剂。在一些实施方案中，骨形成抑制剂选自由以下组成的组：抑制OB和/或OCY分化或活性的蛋白、促进OC分化或活性的蛋白和抑制OC分化或活性的抑制性核酸。
在一些实施方案中，骨形成抑制剂选自由以下组成的组：骨硬化蛋白(SOST)、schnurri-3(SHN3)、组织蛋白酶K(CTSK)、靶向甲状旁腺激素(PTH)的抑制性核酸、靶向PTH相关蛋白(PTHrP)的抑制性核酸和靶向去糖化酶DJ1的抑制性核酸。
在一些实施方案中，与骨密度降低有关的疾病或病症选自由以下组成的组：骨质疏松症、致密性成骨不全症(pycnodysostosis)、骨硬化症(sclerosteosis)、肢端肥大症、氟蚀病、骨髓纤维化、丙型肝炎相关性骨硬化和骨癌，例如骨肉瘤和转移性骨癌。
在本公开描述的方法的一些实施方案中，施用通过注射而发生。在一些实施方案中，注射是全身注射(例如，尾静脉注射)、局部注射(例如，肌肉内(IM)注射、膝注射或股骨髓内注射)。
在一些实施方案中，施用通过将包含如本公开描述的rAAV的组织或移植物植入受试者而发生。
在一些实施方案中，施用导致选自由OB、OCY、OC和软骨细胞组成的组的细胞类型的转导。
附图简要说明
图1显示了体外转导小鼠原代OB前体的scAAV血清型的鉴定。在出生后第3-5天从新生鼠颅盖分离出小鼠OB前体，并将其培养于生长培养基中以扩增。将细胞与编码GFP蛋白的14种不同scAAV血清型温育2天，并使用表面荧光显微镜术通过GFP表达分析它们的转导效率。
图2显示了体外转导小鼠ATDC5软骨细胞系的scAAV血清型的鉴定。将小鼠软骨细胞祖细胞系ATDC5与编码GFP蛋白的14种不同scAAV血清型温育2天，并使用表面荧光显微镜术通过GFP表达分析它们的转导效率。
图3显示了可体外转导小鼠原代OC的scAAV血清型的鉴定。从2月龄小鼠(C57BL/6J)的长骨分离衍生自骨髓的单核细胞(BM-MO)，并通过添加小鼠m M-CSF(40ng/ml)将其扩增。在小鼠M-CSF(40ng/ml)和小鼠Rank配体(10ng/ml)的存在下，将BM-MO与编码GFP蛋白的15种不同scAAV血清型温育6天，并使用表面荧光显微镜术通过GFP表达分析它们的转导效率。
图4显示了可体外转导小鼠Raw264.7 OC系的scAAV血清型的鉴定。在用小鼠Rank配体(5ng/ml)处理后2天，在小鼠Rank配体(5ng/ml)存在下，将Raw264.7细胞与编码GFP蛋白的17种不同scAAV血清型温育6天。使用表面荧光显微镜术通过GFP表达分析它们的转导效率。
图5显示了小鼠中表达GFP的AAV转导的组织的光学图像。将单剂量的PBS或1012～1013/ml个基因组拷贝的编码GFP的scAAV血清型(scAAV4、5、6.2和9)注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的两个膝关节中，并在4周后处死小鼠，并通过IVIS-100光学成像系统(全身，顶部)监测膝关节中的GFP表达。解剖右后肢，并在去除肌肉后通过IVIS-100光学成像系统(后肢，底部)监测GFP表达。
图6A-6B显示了可转导关节软骨中的软骨细胞和/或骨表面的OB和/或OC的scAAV血清型的鉴定。将单剂量的1012-1013/ml个基因组拷贝的编码GFP的scAAV血清型(scAAV4、5、6.2和9)注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的两个膝关节中，并在4周后将膝关节(图6A)和股骨(图6B)冰冻切片以用于组织学。AC：关节软骨，CB：皮质骨，BM：骨髓，比例尺：50μm。
图7显示了脂质体可以通过降低小鼠中scAAV9转导对肌肉的感染力来增强scAAV9转导对骨细胞的选择性。将编码GFP的scAAV9血清型的1012～1013/ml基因组拷贝与PBS或X-tremeGENE(脂质体，Roche)以1:1的比例混合。温育1小时后，将单剂量的混合物注射到2月龄的小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。1周后，安乐死小鼠，并通过IVIS-100光学成像系统监测膝关节(左)中的GFP表达。将股骨冰冻切片以用于组织学(右)。CB：皮质骨，M：肌肉。
图8显示了编码GFP的scAAV9血清型可以转导小鼠中骨表面的OB、OC和OCY。将编码GFP的scAAV9血清型的1012～1013/ml个基因组拷贝与PBS或X-tremeGENE(脂质体)以1:1的比例混合。温育1小时后，将单剂量的混合物注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。将单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的编码GFP的scAAV9血清型注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中，并在4周后将股骨冰冻切片以用于组织学，并且通过共聚焦显微镜观察GFP表达。高倍(high-powered)照片显示了用编码GFP的scAAV9血清型与X-tremeGENE的混合物处理的股骨中scAAV9转导的OB、OC和OCY(底部)。通过相差显微镜观察到皮质骨中的GFP表达(左)。GP：生长板(growth plate)，TB：小梁骨，CB：皮质骨，BM：骨髓；比例尺：50μm。
图9显示了骨探查AAV载体的开发。(A)通过遗传操作将骨靶向肽DSS((AspSerSer)6或HABP)或(CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL)插入VP2衣壳蛋白中。(B)将WT AAV载体用携带叠氮化物的氨基酸以位点特异的方式标记，然后附着上骨探查分子(ADIBO-Ale)。
图10的图描绘了具有骨靶向肽的VP2衣壳蛋白(方框；(AspSerSer)6，DSS)。通过遗传操作将DSS插入VP2衣壳蛋白的Q588和A589之间或N端。
图11A-11C显示了OB中DSS-scAAV9的体外特征化。将小鼠OB前体与scAAV9-WT(WT)或两种DSS-scAAV9(DSS-588、DSS-Nter)温育2天。使用抗GFP的western印迹(图11A)和表面荧光(图11B，左)通过GFP表达分析它们的转导效率。使用Hsp90作为上样对照。或者，将转导的OB在OB分化条件下培养6天，并通过碱性磷酸酶(ALK)染色评估OB分化(图11B，右)，并通过RT-PCR评估OB基因表达(标准化为Hprt，图11C)。N.S.：不显著。
图12A-12C显示了OC中DSS-scAAV9的体外特征化。用小鼠Rank配体(5ng/ml)处理后2天，用scAAV9-WT(WT)或两种DSS-scAAV9(DSS-588、DSS-Nter)处理Raw264.7。转导后2天，使用抗GFP抗体的western印迹(图12A)和表面荧光(图12B，左)通过GFP表达来分析它们的转导效率。在Rank配体存在下培养转导的OC，并在3天后通过TRAP染色评估OC分化(图12B，右)，并通过RT-PCR评估OC基因表达(标准化为Hprt，图12C)。N.S：不显著。
图13显示了DSS-scAAV9(Nter)可以转导小鼠中骨表面的OB、OC和OCY。将编码GFP的scAAV9-WT(WT)或两种DSS-scAAV9(DSS-588、DSS-Nter)的1011～1012/ml个基因组拷贝与X-tremeGENE(脂质体)以1:1的比例混合。温育1小时后，将单剂量的混合物注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。1周后，将股骨冰冻切片以用于组织学，并通过共聚焦显微镜观察GFP表达。高倍照片显示了用编码GFP的scAAV9血清型与X-tremeGENE的混合物处理的股骨中scAAV9转导的OB、OC和OCY(底部)。GP：生长板，CB：皮质骨，BM：骨髓；GFP：绿色，DAPI：蓝色。
图14显示了成熟OB中SHN3的瞬时缺失增加了成年小鼠的骨量。将1月龄雌性Shn3-fl/fl(WT)或Shn3-fl/fl；OCN/ERT-cre(CKO)小鼠用他莫昔芬(50mg/kg)处理5天，并在6周后通过microCT分析测量骨量。显示的是小梁骨的3D重建(左)，且定量参数显示在右图中：骨体积/总体积(BV/TV)。**：P，0.005。
图15显示了SHN3缺失防止了小鼠中雌激素缺乏诱导的骨质流失。3月龄雌性小鼠经历了卵巢切除(OVX)手术或经历了假的手术(假手术)，并在手术后2个月通过microCT分析测量骨量。显示的是小梁骨(左上)和干体中间皮质骨(左下)的3D重建。定量参数显示在右图中：骨体积/总体积(BV/TV)。**：P，0.005，N.S：不显著。
图16A-16D显示了OB中scAAV9-mSHN3i的体外特征化。用编码scAAV9的对照载体(对照)或两种小鼠-SHN3 shRNAsi(Sh-SHN3-1、-2)处理小鼠原代颅盖OB。转导后3天，分别通过使用表面荧光的GFP表达和使用RT-PCR的SHN3 mRNA水平分析它们的转导效率(图13A)和敲低效率(图13B)。(图13C和13D)在OB分化条件下培养转导的OB，并在培养的第6天和第15天进行RT-PCR和茜素红染色。*：P，0.05，**：P，0.005。
图17A-17B显示了scAAV9-mSHN3i的体内特征化。将编码GFP的scAAV9(对照，Sh-SHN3-1)的1012～1013/ml基因组拷贝与X-tremeGENE(脂质体)以1:1的比例混合。温育1小时后，将单剂量的混合物注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。1周后，将股骨冰冻切片以用于组织学，并通过共聚焦显微镜观察GFP表达。高倍照片显示了股骨中表达GFP的OB和OCY，表明了：与对照-scAAV9载体相似，Sh-SHN3-1scAAV9载体可以转导骨中的OB和OCY(图17A)。用机械和酶消解(2型胶原酶和中性蛋白酶)处理股骨，以分离BMSC。使用FACS分选从BMSC中进一步分离出表达GFP的细胞，并将其用于RT-PCR分析以测量SHN3 mRNA水平(图17B)。CB：皮质骨，BM：骨髓，TB：小梁骨。
图18A-18D显示了OC中scAAV9-mCTSKi的体外特征化。用小鼠Rank配体(5ng/ml)处理后2天，用scAAV9-对照(对照)或两种scAAV9-mCTSKi(Sh-CTSK-1、-2)处理Raw264.7。转导后2天，通过使用表面荧光的GFP表达和使用RT-PCR的CTSK mRNA水平分别分析它们的转导效率(图18A)和敲低效率(图18B)。图18C-18D显示了在Rank配体存在下培养转导的OB，并在3天后通过TRAP活性(图18C，顶部)和染色(图18C，底部)评估OC分化，并通过RT-PCR评估OC基因表达(标准化为Hprt，图18D)。*：P，0.05，**：P，0.005。
图19A-19B显示了scAAV9-mCTSKi的体内表征。将编码GFP的scAAV9(对照，Sh-CTSK-1)的1012～1013/ml基因组拷贝与X-tremeGENE(脂质体)以1：1的比例混合。温育1小时后，将单剂量的混合物注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。1周后，将股骨冰冻切片以用于组织学，并通过共聚焦显微镜观察GFP表达。高倍图片显示了股骨中scAAV9转导的OB和OC(图19A)。将冰冻切片的股骨用抗CTSK抗体染色以评估表达GFP的OC中的CTSK表达。使用IgG抗体作为阴性对照。高倍照片显示了在用scAAV9-mCTSKi转导的表达GFP的OC中CTSK表达的降低(图19B)。GP：生长板，CB：皮质骨，BM：骨髓，TB：小梁骨；GFP：绿色，DAPI：蓝色，CTSK：红色。
图20显示了骨靶向scAAV9介导的基因沉默的策略。将对OB基因(SHN3i、SOSTi)或对OC基因(CTSKi)特异的ShRNA克隆到BT-scAAV9血清型(DSS或HABP-scAAV9、Ale-scAAV9)中。将这些scAAV9血清型注射到小鼠的髓内股骨中以进行局部递送。对于全身递送，将它们IP或IV注射到小鼠中以沉默OB或骨细胞中的SHN3或SOST表达，或以沉默骨表面OC中的CTSK表达。
图21显示了用于全身生产的AAV介导的基因添加。将人PTH(1-84aa)、人PTHrP(1-140aa)或小鼠DJ-1cDNA克隆到scAAV9载体中，并将它们肌肉内注射到小鼠中以进行全身表达。
图22A-22G显示了体外和体内转导骨细胞的scAAV载体。图22A和22B显示了用PBS或用相同CB-Egfp转基因包装的14种不同的AAV衣壳处理颅骨成骨细胞(COB)、衍生自骨髓的破骨细胞前体(BM-OCP)或软骨细胞(ATDC5)。两天后，通过抗GFP抗体的免疫印迹评估EGFP表达。使用抗Hsp90抗体作为上样对照。通过Image J软件以内源性Hsp90蛋白水平百分比测量EGFP蛋白的免疫印迹定量。图22C显示了将单剂量的1x1011个基因组拷贝的scAAV关节内(i.a.)注射到两月龄雄性小鼠的膝关节中，并且通过IVIS-100光学成像监测后肢中的EGFP表达。图22D显示了将股骨冰冻切片并通过荧光显微镜术评估EGFP表达。图22E和22F显示了表达EGFP的成骨细胞(OB)、骨细胞(OCY)和成熟破骨细胞(OC)的高倍图像。图22G还用抗BgIap抗体对冰冻切片的股骨免疫染色，以鉴定成熟破骨细胞。TB，小梁骨；BM，骨髓；GP，生长板；CB，皮质骨。比例尺：500μm(图22D)；100μm(图22E)；75μm(左)和25μm(中，右)(图22F)；和25μm(图22G)。
图23A-23K显示了成骨细胞中Shn3的诱导性缺失增加成年小鼠的骨增长(boneaccrual)。在图23A-23D中，将单剂量的4×1011个基因组拷贝的scAAV9-Egfp静脉内(i.v.)注射到两月龄雄性小鼠中。图23A显示了在注射后两周通过IVIS-100光学成像监测的个体组织中的EGFP表达。y轴，辐射效率(p/sec/cm2/sr/μW/cm2)。图23B和23C显示了在冰冻切片的心脏和肝脏(23B)和股骨(23C，右为高倍)中的EGFP表达。图23D是用抗EGFP抗体进行的组织裂解物的免疫印迹。在图23E-23G中，用100mg/kg他莫昔芬处理两月龄雌性Ocn-Ert；RosamT/mG和Shn3Ocn-Ert；RosamT/mG小鼠连续5天。在图23E中，两个月后将股骨横切以鉴定表达EGFP的成骨细胞。图23F和23G显示了通过microCT(图23F)和相对定量(图23G)评估的股骨小梁骨量的代表性3D构建。小梁骨体积/总体积(Tb.BV/TV)、小梁厚度(Tb.Th)、每立方毫米的小梁数(Tb.N)和小梁间隔(Tb.Sp)(n＝6/组)。在图23H-23K中，将单剂量的4×1011个基因组拷贝的scAAV9-Egfp或scAAV9-Cre i.v.注射到三月龄雄性Shn3fl/fl；RosamTmG小鼠中。图23H显示了治疗后两个月的胫骨骨RNA中的Cre和Shn3 mRNA水平并标准化为Hprt表达。图23I显示了冰冻切片的股骨上的荧光显微镜术以鉴定表达EGFP的细胞(图23I)，并且通过microCT评估股骨小梁骨量。图23J表示了代表性3D重构，且图23K显示了相对定量。小梁骨体积/总体积(Tb.BV/TV)、小梁厚度(Tb.Th)、每立方毫米的小梁数(Tb.N)和连续密度(Conn.Dn)(n＝6/组)。比例尺：50μm(23B)；500μm(左)，75μm(右)(23C)；25μm(23E)；1mm(23F和23J)；250μm(23I)。数值代表平均值±标准偏差：*，P<0.05；**，P<0.01；和***，P<0.001，通过未配对两尾学生t检验(23G、23H和23K)。
图24A-24K显示了通过全身递送的AAV9进行的SHN3沉默促进骨形成。图24A的图显示了含有CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CB)、amiR-ctrl或amiR-shn3、Egfp报告基因(EGFP)、β-珠蛋白polyA序列(PA)和反向末端重复(ITR)的scAAV9构建体。在图24B-24D中，在将编码amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9关节内(i.a.)注射到两月龄雄性小鼠的膝关节两周后，通过IVIS 100光学成像(图24B)和冰冻切片的股骨的荧光显微镜术(图24C)评估EGFP表达。在图24D中，在来自股骨的以荧光激活细胞分选术(FACS)分选的表达EGFP的细胞中评估标准化为hprt的EGFP蛋白水平(顶部)和shn3 mRNA水平(底部)。在图24E-24F中，在将携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9 i.a.注射到两月龄雌性小鼠的膝关节中两个月后，通过microCT评估股骨小梁骨量。显示了代表性3D重建(图24E)和相对定量(图24F)(n＝6/组)。在图24G-24K中，将单剂量的4×1011个基因组拷贝的编码amiR-ctrl或amiR-shn3的AAV9i.v.注射到三月龄雌性小鼠中。两个月后，测量胫骨RNA中的shn3 mRNA水平并标准化为hprt(图24G，n＝8/组)。通过microCT测量股骨小梁骨量。显示了代表性3D重建(图24H)和相对定量(图24I)(n＝8/组)。显示了代表性的钙黄绿素/茜素红标记(图24J)和BFR/BS、MAR和Ob.S/BS的相对组织形态定量(图24K)。箭头表明钙黄绿素和茜素红标记之间的距离。BFR/BS，骨形成率/骨表面；MAR，矿物质沉积率；Ob.S/BS，成骨细胞表面/骨表面。GP，生长板；BM，骨髓；TB，小梁骨。比例尺：250μm(图24C)；1mm(图24E和24H)；50μm(图24J)。数值代表平均值±SD：**，P<0.01；***，P<0.001；和****，P<0.0001，通过未配对两尾学生t检验(图24F、24G、24I和24K)。
图25A-25J显示了通过全身递送的AAV9的Shn3沉默防止绝经后骨质疏松症的小鼠模型中的骨质流失。图25A-25B显示了在三月龄雌性Shn3+/+和Shn3-/-小鼠上实施假手术或OVX手术，并在两个月后通过microCT评估股骨小梁骨量。显示了股骨(图25A)和相对BV/TV(图25B)的代表性图像(n＝6/组)。图25C的图显示了研究和处理方法。在三月龄雌性小鼠上实施假手术或OVX手术，并在六周后i.v.注射单剂量的4×1011个基因组拷贝的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9。注射后七周，将股骨冰冻切片以鉴定表达EGFP的细胞(图25D)。在标准化为hprt后，显示胫骨中的shn3 mRNA水平(n＝8-12/组)(图25E)。通过microCT评估股骨小梁骨量。显示了代表性3D重建(图25F)和相对定量(图25G)(n＝7-8/组)。钙黄绿素/茜素红标记(图25H)和BFR/BS和MAR的相对组织形态定量(图25I)的代表性图片。箭头表明钙黄绿素和茜素红标记之间的距离。对包括弯曲刚度、弯曲力矩、表观弯曲模量和表观弯曲应力在内的股骨生物力学性质进行定量(n＝5-9/组)(图25J)。比例尺：1mm(25A和25F)；250μm(图25D)；和50μm(图25H)。数值代表平均值±SD：N.S.，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；和****，P<0.0001，通过未配对两尾学生t检验(图25B)和单向ANOVA检验(图25E、25G、25I和25J)。
图26A-26M：骨归巢(bone-homing)AAV9。DSS-Nter衣壳介导Shn3沉默，以防止绝经后骨质疏松症的小鼠模型的骨质流失。图26A的图是合理设计的骨特异的AAV衣壳的构建体。将骨靶向肽基序(DSS，红色)插入AAV9衣壳的Q588和A589之间(DSS-588)或AAV9-VP2的N端(DSS-Nter)。cap：衣壳蛋白。图26B和26C显示了在感染不同浓度的scAAV9、scAAV9.DSS-587或scAAV9.DSS-Nter后两天，在成骨条件下培养COB六天。通过用抗EGFP抗体进行的免疫印迹(图26B)或荧光显微镜术(图26C)评估EGFP表达。通过快蓝染色评估ALP活性(图26C)。图26D-26H显示了将单剂量的4×1011个基因组拷贝的scAAV9或scAAV9.DSS-Nteri.v.注射到两月龄雄性小鼠中。在注射后两周通过IVIS-100光学成像监测个体组织中的EGFP表达(图26D)。免疫印迹显示了组织裂解物中的EGFP表达(图26E)和通过Image J软件进行的相对定量(图26F，n＝3/组)。在冰冻切片的股骨上进行荧光显微镜术以鉴定表达EGFP的细胞(图26G)，并通过Image J软件定量股骨中每个骨表面的表达EGFP的细胞数量(图26H，n＝5/组)。(图26I-26M)显示了在三月龄雌性小鼠上实施假手术或OVX手术。六周后，i.v.注射单剂量的4×1011个基因组拷贝的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9.DSS-Nter。注射后7周，评估胫骨中的shn3 mRNA水平(图26I，n＝10/组)。通过microCT评估股骨和腰椎中的小梁骨量。显示了定量(图26J和26M)和代表性3D重建(图26K和26L)(n＝6-8/组)。GP，生长板；BM，骨髓；TB，小梁骨。比例尺：100μm，(图26C和26G)；1mm(图26K和26L)。数值代表平均值±SD：N.S.，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；和****，p<0.0001，通过未配对双尾学生t检验(图26F和26H)和单向ANOVA检验(图26I、26J和26M)。
图27A-27C显示了体外转导成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的scAAV血清型的鉴定。用PBS或14种不同的AAV血清型处理颅骨成骨细胞(COB，图27A)、衍生自骨髓的破骨细胞前体(BM-OCP，图27B)或软骨细胞系(ATDC5，图27C)。两天后，通过荧光显微镜术监测EGFP表达。比例尺：100μm。
图28A-28B显示了转导骨和软骨的scAAV血清型的鉴定。将单剂量的PBS或1x1011个基因组拷贝的scAAV9-EGFP关节内(i.a.)注射到两月龄雄性小鼠的膝关节中。将膝关节(图28A)和股骨(图28B)冰冻切片以鉴定表达EGFP的细胞。使用DAPI染色细胞核。AC，关节软骨；M，肌肉；CB，皮质骨；BM，骨髓。比例尺：100μm，图(图28A；250μm，图28B)。
图29A-29D显示了小鼠中全身递送的scAAV9的组织分布。图29A和29B显示了将单剂量的PBS或4×1011个基因组拷贝的scAAV9-EGFP静脉内(iv)注射到两月龄雄性小鼠中，并且在注射后两周通过IVIS-100光学成像监测EGFP表达。显示了全身中的EGFP表达(图29A)和在图28A中显示的解剖组织中的EGFP表达的定量(图29B)。使用PBS注射作为阴性对照。图29C和29D显示了将解剖自注射了PBS或rAAV9-EGFP的小鼠的组织冰冻切片以定位表达EGFP的细胞。比例尺：100μm，图29C；500μm，图29D。
图30显示了股骨中全身递送的scAAV9的分布。将单剂量的4×1011个基因组拷贝的scAAV-EGFP i.v.注射到两月龄雄性小鼠中，并在注射后两周在冰冻切片的股骨中评估EGFP表达。L，韧带；GP，生长板；AC，关节软骨；BM，骨髓；CB，皮质骨；P，髌骨；M，肌肉。比例尺：100μm。
图31A-31E显示了Shn3fl/fl成骨细胞中scAAV9-Cre的体外特征化。图31A的图显示了含有CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CB)、EGFP报告基因(EGFP)或Cre重组酶(Cre)、β-珠蛋白polyA序列(PA)和反向末端重复(ITR)的rAAV9构建体。图31B显示了用scAAV9-EGFP或scAAV9-Cre感染COB两天，且裂解细胞并用指定抗体进行免疫印迹。图31C-31E显示了在用scAAV9-EGFP或scAAV9-Cre处理后两天，在成骨条件下培养COB六天，并通过RT-PCR测量Shn3(图31C)和成骨基因(图31D)的mRNA水平。培养21天后，通过茜素红染色评估矿化作用(图31E)。数值代表平均值±SD：***，P<0.001，通过未配对两尾学生t检验(图31C和31D)。
图32A-32C显示了成骨细胞中携带amiR-shn3的scAAV9的体外特征化。用携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9处理后两天，在成骨条件下培养COB。分别通过荧光显微镜术、RT-PCR和茜素红染色评估EGFP表达(图32A)、Shn3和成骨基因的mRNA水平(图32B)和矿化作用(图32C)。比例尺：100mm(图32A)。数值代表平均值±SD：*，P<0.05；***，P<0.001；和****，P<0.0001，通过未配对两尾学生t检验(图32B和32C)。
图33A-33F显示了用全身递送的携带amiR-shn3的scAAV9处理的小鼠的特征化。将单剂量的4×1011个基因组拷贝的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9 i.v.注射到三月龄雌性小鼠中。治疗后两个月，用钙黄绿素和茜素红标记小鼠以用于动态组织形态测定。使用未标记的小鼠以使用IVIS-100光学成像监测EGFP表达。显示了全身(图33A)和解剖组织(图33B)中的EGFP表达。将股骨冰冻切片以鉴定表达EGFP的成骨细胞谱系细胞(图33C)。来自用携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9处理的五月龄雌性小鼠的股骨(n＝6-7)的TRAP染色的纵剖面(图33D)和组织形态测定分析(图33E)。每骨周的破骨细胞数(N.Oc/B.Pm)。通过EFISA评估血清CTX水平(n＝6)(图33F)。比例尺：100μm，图33C；50mm，图33D。数值代表平均值±SD；N.S.，不显著，通过未配对两尾学生t检验(图33E和33F)。
图34A-34C显示了绝经后骨质疏松症的小鼠模型中全身递送的scAAV9-amiR-shn3的治疗效果。在三月龄雌性小鼠上实施假手术或OVX手术，并在六周后i.v.注射单剂量的4×1011个基因组拷贝的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9。注射后七周，用钙黄绿素和茜素红标记小鼠以用于动态组织形态测定。在来自用携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9处理的五月龄雌性OVX小鼠的股骨的纵剖面上实施Von Kossa(图34A)或TRAP(图34B)染色。通过ELISA评估血清CTX水平(n＝7)(图34C)。比例尺：1mm(图34A)；50mm(图34B)。数值代表平均值±SD；NS，不显著，***，P<0.001和****，P<0.0001，通过未配对两尾学生t检验(图34C)。
图35A-35C显示了在体外或体内的scAAV9.DSS载体的特征化。(图35A)将单剂量的1×1011个基因组拷贝的scAAV9-Egfp、scAAV9.DSS-588-Egfp或rAAV9.DSS-Nter-Egfp i.a.注射到两月龄雄性小鼠的膝关节中，并在注射后两周将股骨冰冻切片以鉴定表达EGFP的细胞。GP，生长板；CB，皮质骨；BM，骨髓。比例尺：500μm，图35A。图35B和35C显示了用scAAV9-Egfp、scAAV9.DSS-588-Egfp或scAAV9.DSS-Nter-Egfp感染后两天，在成骨条件下培养COB六天。通过ALP活性(图35B)和成骨基因表达(图35C)评估成骨细胞的分化。数值代表平均值±SD：N.S，不显著，通过单向ANOVA检验(图35B和35C)。
图36A-36E显示了小鼠中全身递送的scAAV9.DSS-Nter的组织分布。将单剂量的PBS或4×1011个基因组拷贝的scAAV9、scAAV9.DSS-588或scAAV9.DSS-Nter i.v.注射到两月龄雄性小鼠中，并在注射后两周使用IVIS-100光学成像监测EGFP表达。显示了在全身中的EGFP表达(图36A)和在解剖组织中的EGFP表达的定量(图36B)。将心脏(图36C)、肝(图36D)和腰椎(图36E)冰冻切片以鉴定表达EGFP的细胞。GP，生长板；BM，骨髓。比例尺：100μm(图36C、36D和36E)。数值代表平均值±SD：*，P<0.05；**，P＜0.01和***，P＜0.001，通过单向ANOVA检验(图36B)。
图37A-37C显示了在绝经后骨质疏松症的小鼠模型中全身递送的携带amiR-shn3的scAAV9.DSS-Nter的治疗效果。在三月龄雌性小鼠上实施假手术或OVX手术，并在六周后i.v.注射单剂量的PBS或4×1011个基因组拷贝的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的scAAV9.DSS-Nter。注射后七周，通过IVIS-100光学成像监测EGFP表达(图37A)。通过荧光显微镜术鉴定冰冻切片的股骨中的表达EGFP的细胞(图37B)。通过microCT评估腰椎中的小梁骨量，并显示定量(n＝7-8/组)(图37C)。每立方毫米的小梁数(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)和小梁间距(Tb.Sp)。TB，小梁骨；BM，骨髓。比例尺：100mm，图b。数值代表平均值±SD：N.S，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P＜0.001，通过单向ANOVA检验(图37C)。
具体实施方式
本公开的一些方面涉及组合物(例如，分离的核酸，rAAV等)，该组合物在被递送至受试者时有效地调节骨代谢，例如通过促进或抑制骨形成和/或促进或抑制骨吸收。因此，本公开描述的方法和组合物在一些实施方案中可用于治疗与骨代谢失调有关的疾病和病症，例如骨质疏松症、炎症引起的骨质流失、乳腺癌或前列腺癌转移引起的骨质流失、骨硬化症、骨肉瘤和异养性骨化。
分离的核酸
本公开中提供了用于将转基因(例如抑制性RNA，如shRNA、miRNA等)递送至受试者的组合物和方法。组合物通常包含编码能够调节骨代谢的转基因(例如蛋白、抑制性核酸等)的分离的核酸。例如，在一些实施方案中，转基因降低靶蛋白的表达，例如与促进或抑制骨形成有关的靶蛋白。
“骨代谢”通常指涉及骨形成和/或骨吸收的生物过程。在一些实施方案中，骨代谢涉及产生自成骨细胞(OB)和分化的骨细胞的新骨的形成，和/或被破骨细胞(OC)吸收的成熟骨组织。OB源自衍生自骨髓的间充质细胞，这些间充质细胞最终末期分化为骨细胞。OB(和骨细胞)的功能或活性包括但不限于骨形成、骨矿化作用和OC活性的调控。已经观察到骨量减少由OB和/或骨细胞功能或活性的抑制导致。已经观察到骨量增加由OB和/或骨细胞功能或活性的增加导致。OC源自衍生自骨髓的单核细胞，并且在一些实施方案中已经观察到OC由来自OB的信号控制。OC的功能包括骨吸收。在一些实施方案中，已经观察到骨量减少由OC活性的增加导致。在一些实施方案中，已经观察到骨量增加由OC活性的抑制导致。
在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸或rAAV包含编码至少一种骨代谢调节剂(例如，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种骨代谢调节剂)的转基因。如本文所用，“骨代谢调节剂”指诱导或抑制骨形成或沉积的分子(由核酸如转基因编码的核酸或蛋白)，例如通过增加或减少涉及骨形成或骨吸收的蛋白、细胞等的表达、活性和/或功能。通常，骨代谢调节剂可以是肽、蛋白或干扰核酸(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、人工miRNA等)。在一些实施方案中，骨代谢调节剂是骨形成诱导剂。在一些实施方案中，骨代谢调节剂是骨形成抑制剂。
“骨形成诱导剂”指通过促进OB和/或骨细胞(OCY)分化或活性和/或通过抑制OC活性来促进骨合成的分子。在一些实施方案中，骨形成诱导剂是核酸(例如，RNAi寡核苷酸或miRNA寡核苷酸或反义寡核苷酸)或由核酸(例如转基因)编码的蛋白，其促进OB和/或骨细胞的功能或活性(例如，骨形成、矿化作用、破骨细胞活性或功能的调控等)。在一些实施方案中，促进OB和/或骨细胞的活性或功能的骨形成诱导剂的示例包括但不限于甲状旁腺激素(PTH)、PTH相关蛋白(PTHrP)、去糖化酶DJ1。在一些实施方案中，骨形成诱导剂是抑制OC分化或活性的抑制性核酸，如靶向骨硬化蛋白(SOST)、schnurri-3(SHN3)、组织蛋白酶K(CTSK)等的抑制性核酸。
“骨形成抑制剂”指抑制OB和/或骨细胞分化或活性和/或增加OC分化、活性或功能的分子。在一些实施方案中，骨形成抑制剂是核酸(例如RNAi寡核苷酸或miRNA寡核苷酸或反义寡核苷酸)或由核酸(例如转基因)编码的蛋白，其抑制OB和/或骨细胞分化或活性。在一些实施方案中，抑制OB和/或骨细胞活性或功能的骨形成抑制剂的示例包括但不限于MAPK抑制剂和促炎细胞因子(例如，肿瘤坏死因子α(TNF-α)等)。在一些实施方案中，骨形成抑制剂是抑制OB和/或骨细胞分化或活性的抑制性核酸。
在一些实施方案中，分离的核酸编码一种或多种(例如1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)抑制性核酸，例如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、人工microRNA(ami-RNA)等。通常，抑制性核酸特异性结合(例如，与之杂交)编码与骨代谢有关的基因产物(例如蛋白)的基因(例如PTH、PTHrP、DJ1、SOST、SHN3、CTSK等)的至少两个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个)连续碱基。如本文所用，“连续碱基”指相互共价结合(例如，通过一个或多个磷酸二酯键等)的两个或更多个核苷酸碱基(例如作为核酸分子的一部分)。在一些实施方案中，该至少一种抑制性核酸与编码与骨代谢有关的基因产物(例如蛋白)的基因(例如PTH、PTHrP、DJ1、SOST、SHN3、CTSK等)的两个或更多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个)连续碱基的同一性为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或约100％。
“microRNA”或“miRNA”是能够介导转录或翻译后基因沉默的小的非编码RNA分子。通常，miRNA被转录为发夹或茎环(例如，具有自互补性，单链主链)双链体结构，被称为初级miRNA(pri-miRNA)，其被酶加工(例如，通过Drosha、DGCR8、Pasha等)成pre-miRNA。pri-miRNA的长度可以变化。在一些实施方案中，pri-miRNA的长度范围从约100个至约5000个碱基对(例如，约100个、约200个、约500个、约1000个、约1200个、约1500个、约1800个或约2000个碱基对)。在一些实施方案中，pri-miRNA的长度大于200个碱基对(例如，长度为2500个、5000个、7000个、9000个或更多个碱基对)。
也以发夹或茎环双链体结构为特征的pre-miRNA的长度也可以变化。在一些实施方案中，pre-miRNA长度的大小范围从约40个碱基对至约500个碱基对。在一些实施方案中，pre-miRNA长度的大小范围从约50个至100个碱基对。在一些实施方案中，pre-miRNA长度的大小范围从约50个至约90个碱基对(例如，长度为约50个、约52个、约54个、约56个、约58个、约60个、约62个、约64个、约66个、约68个、约70个、约72个、约74个、约76个、约78个、约80个、约82个、约84个、约86个、约88个或约90个碱基对)。
通常，pre-miRNA被输出到细胞质中，并经Dicer酶加工以首先产生不完美的miRNA/miRNA*双链体，并随后产生单链成熟miRNA分子，随后将其装载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。通常，成熟miRNA分子长度的大小范围从约19个至约30个碱基对。在一些实施方案中，成熟miRNA分子的长度是约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个或30个碱基对。
在一些方面，本公开提供了编码一种或多种人工miRNA的分离的核酸和载体(例如，rAAV载体)。如本文所用，“人工miRNA”或“amiRNA”指内源pri-miRNA或pre-miRNA(例如，miRNA主链，其是能够产生功能性成熟miRNA的前体miRNA)，其中miRNA和miRNA*(例如，miRNA双链体的过客链)序列已被指导靶基因的高效RNA沉默的相应amiRNA/amiRNA*序列所替代，例如Eamens等人(2014),Methods Mol.Biol.1062:211-224中所描述的。例如，在一些实施方案中，人工miRNA包含miR-155pri-miRNA主链，其中编码骨代谢调节(例如，骨形成抑制剂)miRNA的序列已被插入以替代内源miR-155成熟miRNA编码序列。在一些实施方案中，本公开所述的miRNA(例如人工miRNA)包含miR-155主链序列、miR-30主链序列、mir-64主链序列或miR-122主链序列。
在一些实施方案中，本公开提供了分离的核酸，其包含编码靶向SHN3基因(GeneID：59269)的人工microRNA的转基因，该SHN3基因编码Schnurri-3蛋白。Schnurri-3(SHN3)蛋白是调控NK-κβ蛋白表达以及免疫球蛋白和T细胞受体抗体重组的转录因子。在一些实施方案中，SHN3基因由NCBI登录号NM_001127714.2或NM_024503.5代表。在一些实施方案中，SHN3蛋白由NCBI登录号NP_001121186.1或NP_078779.2代表。
在一些方面，本公开涉及包含编码人工microRNA的转基因的分离的核酸，其用于减少SHN3表达(例如，来自SHN3基因的一种或多种基因产物的表达，例如由SEQ ID NO:69中核苷酸序列编码的mRNA或编码具有SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的蛋白的那个)。
在一些实施方案中，人工microRNA靶向(例如，与之结合或包含与之互补的区域)SHN3基因的至少6个连续核苷酸。在一些实施方案中，人工microRNA靶向(例如，与之结合或包含与之互补的区域)SHN3基因的6个至30个连续核苷酸。在一些实施方案中，人工microRNA靶向SHN3基因的12个至24个连续核苷酸。在一些实施方案中，人工microRNA靶向SHN3基因的9个至27个连续核苷酸。在一些实施方案中，人工microRNA靶向SHN3基因的至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个连续核苷酸。
在一些实施方案中，人工microRNA的长度在6个至50个核苷酸之间。在一些实施方案中，人工microRNA的长度在8个至24个核苷酸之间。在一些实施方案中，人工microRNA的长度在12个至36个核苷酸之间。在一些实施方案中，人工microRNA的长度是6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸。
在一些实施方案中，分离的抑制性核酸使靶基因的表达降低50％至99％(例如，50％至99％之间的任何整数，包含端值)。在一些方面，分离的抑制性核酸使靶基因的表达降低75％至90％。在一些方面，分离的抑制性核酸使靶基因的表达降低80％至99％。在一些实施方案中，分离的抑制性核酸使SHN3基因的表达降低50％至99％(例如，50％至99％之间的任何整数，包含端值)。在一些实施方案中，分离的抑制性核酸使SHN3基因的表达降低75％至90％。在一些方面，分离的抑制性核酸使SHN3基因的表达降低80％至99％。
包含转基因的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)可以被置于分离的核酸的任何合适的位置。该区域可以被置于核酸的任何非翻译部分，包括例如内含子、5’或3’非翻译区域等。
在一些情况下，将该区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)置于编码蛋白的核酸序列(例如蛋白编码序列)的第一密码子的上游可以是合意的。例如，该区域可以被置于蛋白编码序列的第一密码子和第一密码子上游2000个核苷酸之间。该区域可以被置于蛋白编码序列的第一密码子和第一密码子上游1000个核苷酸之间。该区域可以被置于蛋白编码序列的第一密码子和第一密码子上游500个核苷酸之间。该区域可以被置于蛋白编码序列的第一密码子和第一密码子上游250个核苷酸之间。该区域可以被置于蛋白编码序列的第一密码子和第一密码子上游150个核苷酸之间。
在一些情况下(例如当转基因缺乏蛋白编码序列时)，将该区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)置于转基因的poly-A尾的上游可以是合意的。例如，该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游2000个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游1000个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游500个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游250个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游150个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游100个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游50个核苷酸之间。该区域可以被置于poly-A尾的第一碱基和第一碱基上游20个核苷酸之间。在一些实施方案中，该区域被置于启动子序列的最后一个核苷酸碱基和poly-A尾序列的第一个核苷酸碱基之间。
在某些情况下，该区域可以被置于转基因poly-A尾的最后一个碱基的下游。该区域可以在poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基的下游2000个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基的下游1000个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基的下游500个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基的下游250个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基的下游150个核苷酸的位置之间。
应当理解，在转基因编码多于一个miRNA的情况下，每个miRNA均可以被置于转基因内的任何合适的位置。例如，编码第一miRNA的核酸可以被置于转基因的内含子中，并且编码第二miRNA的核酸序列可以被置于另一个非翻译区域中(例如，蛋白编码序列的最后一个密码子和转基因的poly-A尾的第一个碱基之间)。
在一些实施方案中，转基因进一步包含编码一个或多个表达控制序列(例如启动子等)的核酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时增强编码产物分泌的序列。大量表达控制序列，包括天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，在本领域中已知且可以被利用。
“启动子”指由细胞的合成机制或引入的合成机制识别并被启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。短语“有效放置”、“在控制下”或“在转录控制下”意指：启动子相对于核酸而言处于正确的位置和方向，以控制基因的RNA聚合酶起始和表达。
对于编码蛋白的核酸，通常将多聚腺苷酸化序列插入转基因序列之后和3’AAVITR序列之前。可用于本公开的rAAV构建体还可以含有内含子，理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一个可能的内含子序列衍生自SV-40，并被称为SV-40T内含子序列。可以使用的另一个载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单个基因转录物中生产多于一种多肽。IRES序列将用于生产含有多于一条多肽链的蛋白。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可获得的[参见，例如，Sambrook等人，和其中引用的参考文献，例如第3.18 3.26和16.17 16.27页，以及Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989]。在一些实施方案中，手足口病病毒2A序列包含在多蛋白中；这是小肽(长度约18个氨基酸)，其已显示出介导多蛋白的切割(Ryan,M D等人,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M等人,J Virology,1996年11月；p.8124-8127；Furler,S等人,Gene Therapy,2001；8:864-873；和Halpin,C等人,The Plant Journal,1999；4:453-459)。2A序列的切割活性先前已在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中被证实(Ryan,M D等人,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M等人,J Virology,1996年11月；p.8124-8127；Furler,S等人,Gene Therapy,2001；8:864-873；和Halpin,C等人,The Plant Journal,1999；4:453-459；de Felipe,P等人,Gene Therapy,1999；6:198-208；de Felipe,P等人,Human Gene Therapy,2000；11:1921-1931.；和Klump,H等人,Gene Therapy,2001；8:811-817)。
组成型启动子的示例包括但不限于：逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是U6启动子。
诱导型启动子允许基因表达的调控，并且可以被以下调控：外源提供的化合物，环境因素例如温度，或特定生理状态(例如急性期)、特定细胞分化状态的存在或仅在复制细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已经被描述，并且可由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调控的诱导型启动子的示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)，另参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导系统(Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari等人,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。也可用于这种情况的其他类型的诱导型启动子是那些被以下调控的：特定生理状态(例如温度、急性期)、细胞特定分化状态或仅在复制细胞中。
在另一个实施方案中，将使用转基因的天然启动子。当期望转基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可以是优选的。当转基因的表达必须被暂时地或发育地调控，或以组织特异性方式调控，或应答于特定转录刺激而调控时，可以使用天然启动子。在进一步的实施方案中，还可以使用其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列，以模拟天然表达。
在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。这样的组织特异性调控序列(例如启动子、增强子等)是本领域公知的。示例性组织特异性调控序列包括但不限于以下组织特异性启动子：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、α-肌球蛋白重链(a-MHC)启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；α-甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨骨钙素启动子(Stein等人,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen等人,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996))、CD2启动子(Hansal等人,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α-链启动子、神经元的如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人,Neuron,15:373-84(1995))，以及其他对技术人员而言显而易见的启动子。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是骨组织特异性启动子。骨组织特异性启动子的示例包括但不限于成骨相关转录因子(osterix)、骨钙素、1型胶原蛋白α1、DMP1、组织蛋白酶K、Rank等的启动子。
本公开的一些方面涉及包含多于一个启动子(例如2个、3个、4个、5个或更多个启动子)的分离的核酸。例如，在具有包含编码蛋白的第一区域和编码抑制性RNA(例如，miRNA)的第二区域的转基因的构建体的情况下，使用第一启动子序列(例如，有效连接至蛋白编码区域的第一启动子序列)驱动蛋白编码区域的表达，并用第二启动子序列驱动抑制性RNA编码区域的表达(例如，有效连接至抑制性RNA编码区域的第二启动子序列)可以是合意的。通常，第一启动子序列和第二启动子序列可以是相同的启动子序列或不同的启动子序列。在一些实施方案中，第一启动子序列(例如，驱动蛋白编码区域表达的启动子)是RNA聚合酶III(polIII)启动子序列。polIII启动子序列的非限制性示例包括U6和H1启动子序列。在一些实施方案中，第二启动子序列(例如，驱动抑制性RNA表达的启动子序列)是RNA聚合酶II(polII)启动子序列。PolII启动子序列的非限制性示例包括T7、T3、SP6、RSV和巨细胞病毒启动子序列。在一些实施方案中，polIII启动子序列驱动抑制性RNA(例如，miRNA)编码区域的表达。在一些实施方案中，polII启动子序列驱动蛋白编码区域的表达。
重组AAV(rAAV)
本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的区域(例如，第一区域)。可以将分离的核酸(例如，重组AAV载体)包装到衣壳蛋白中并施用给受试者和/或递送至选择的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调控序列，以及5’和3’AAV反向末端重复(ITR)组成。如本公开别处所述的，转基因可以包含编码一种或多种蛋白和/或包含靶向受试者的内源mRNA的核酸的抑制性核酸(例如shRNA、miRNA等)的一个或多个区域。如本公开别处所述的，转基因还可以包含编码例如蛋白和/或表达控制序列(例如，poly-A尾)的区域。
通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中使用编码ITR的实质上整个的序列，尽管对这些序列的一定程度的微小修饰是允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域能力范围内。(参见，例如，如Sambrook等人,"Molecular Cloning.A Laboratory Manual",2ded.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等人,J Virol.,70:520 532(1996)的教材)。本发明中采用的这种分子的一个示例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中选择的转基因序列和相关调控元件的侧翼是5’和3’AAV ITR序列。AAV ITR序列可以获自任何已知的AAV，包括目前已鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，rAAV载体)包含具有选自以下血清型的至少一个ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV2/2-66、AAV2/2-84、AAV2/2-125及其变体。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码AAV2 ITR的区域(例如，第一区域)。
在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含含有第二AAV ITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，第二AAV ITR具有选自以下的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV2/2-66、AAV2/2-84、AAV2/2-125及其变体。在一些实施方案中，第二ITR是缺乏功能性末端解离位点(TRS，terminal resolution site)的突变体ITR。术语“缺乏末端解离位点”可以指包含消除ITR的末端解离位点(TRS)的功能的突变(例如，有义突变，如非同义突变或错义突变)的AAV ITR，或指缺乏编码功能性TRS的核酸序列(例如ΔTRS ITR)的截短的AAV ITR。不希望受到任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性TRS的ITR的rAAV载体产生自互补的rAAV载体，例如如McCarthy(2008)Molecular Therapy 16(10):1648-1656所述的。
如本文所用，术语“自互补的AAV载体”(scAAV)指含有双链载体基因组的载体，该双链载体基因组由AAV的一个ITR中的末端解离位点(TR)的缺乏产生。TR的缺乏阻止在TR不存在之处的载体末端的复制起始。通常，scAAV载体产生单链、反向重复基因组，其在每个末端具有野生型(wt)AAV TR且在中间具有突变的TR(mTR)。本发明部分基于以下认识：编码RNA发夹结构(例如shRNA、miRNA和AmiRNA)的DNA片段在病毒基因组复制过程中可以起到类似于突变的反向末端重复(mTR)的功能，产生自互补的AAV载体基因组。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含在两个末端的每个末端均具有反向末端重复(ITR)的单链自互补核酸和包含有效连接有编码发夹形成RNA(例如，shRNA、miRNA、ami-RNA等)的序列的启动子的中心部分的rAAV(例如，自互补的AAV；scAAV)载体。在一些实施方案中，编码发夹形成RNA(例如，shRNA、miRNA、ami-RNA等)的序列在通常被突变ITR占据的自互补核酸的位置被取代。
“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调控序列，以及5’和3’AAV反向末端重复(ITR)组成。这种重组AAV载体被包装到衣壳蛋白中并被递送至选择的靶细胞。在一些实施方案中，转基因是与载体序列异源的核酸序列，其编码目标多肽、蛋白、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或其他基因产物。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式有效连接至调控组分。
本公开提供了包含单个顺式作用的野生型ITR的载体。在一些实施方案中，ITR是5’ITR。在一些实施方案中，ITR是3’ITR。通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中使用编码ITR的实质上整个的序列，尽管对这些序列的一定程度的微小修饰是可允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域能力范围内。(参见，例如，如Sambrook等人,"MolecularCloning.A Laboratory Manual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等人,J Virol.,70:520 532(1996)的教材)。例如，ITR可以在其末端解离位点(TR)被突变，其抑制在TR已经被突变的载体末端的复制，并导致自互补AAV的形成。本公开中采用的这种分子的一个示例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中选择的转基因序列和相关调控元件的侧翼是5’AAV ITR序列和3’发夹形成RNA序列。AAV ITR序列可以获自任何已知的AAV，包括目前已鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，ITR序列是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10和/或AAVrh10 ITR序列。
在一些实施方案中，本公开的rAAV是假型rAAV。例如，含有被Y的蛋白衣壳化的血清型X的ITR的假型AAV载体将被命名为AAVX/Y(例如，AAV2/1具有AAV2的ITR和AAV1的衣壳)。在一些实施方案中，假型rAAV可用于组合来自一种AAV血清型的衣壳蛋白的组织特异性靶向能力与来自另一种AAV血清型的病毒DNA，从而允许转基因靶向递送至靶组织。
用于获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域中公知的。(参见，例如，US2003/0138772)，其内容通过引用以其整体并入本文)。通常，该方法涉及培养含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成的重组AAV载体；和允许重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的足够辅助功能的宿主细胞。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白，即病毒体蛋白1至3(命名为VP1、VP2和VP3)，所有这些蛋白均经由选择性剪接转录自单个cap基因。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，经由翻译，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球状的60-mer蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组，递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性的方式将病毒基因组递送至宿主。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有的AAV血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV2/2-66、AAV2/2-84、AAV2/2-125。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有的血清型衍生自非人灵长类动物，例如scAAV.rh8、AAV.rh39或AAV.rh43血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有AAV9血清型。
本公开部分基于包含对骨组织具有增加的向性的衣壳蛋白的rAAV。在一些实施方案中，将衣壳蛋白接枝到骨靶向肽。异源骨靶向肽可以靶向OC(例如，相对于OB，尤其或优先靶向OC)或OB(例如，相对于OC，尤其或优先靶向OB)。在一些实施方案中，骨靶向肽是(AspSerSer)6肽，其也可以被称为DSS6肽(例如SEQ ID NO:16)。其他的骨靶向肽是HABP-19肽(CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL；SEQ ID NO:17)，其也可以被称为HABP肽。在一些实施方案中，骨靶向肽是包含8-14个天冬氨酸残基的(Asp)8-14肽(例如，如SEQ ID NO:57-63所示)。骨靶向肽的进一步示例包括但不限于Ouyang等人(2009)Lett.Organic Chem 6(4):272-277描述的那些。在一些实施方案中，骨靶向肽包含SEQ ID NO:16、17、57、58、59、60、61、62和63所示的序列。
如本文所用，“接枝(grafting)”指将一个分子与另一个分子结合或联合。在一些实施方案中，术语接枝指至少两个分子的结合或联合，使得至少两个分子中的一个被插入到至少两个分子中的另一个中。在一些实施方案中，术语接枝指至少两个聚合物分子的结合或联合，使得至少两个分子中的一个附接到至少两个分子中的另一个。在一些实施方案中，术语接枝指一个聚合物分子(例如，核酸、多肽)与另一个聚合物分子(例如，核酸、多肽)的结合或联合。在一些实施方案中，术语接枝指至少两个核酸分子的结合或联合，使得至少两个分子中的一个附接到至少两个核酸分子中的另一个。
在一些实施方案中，术语接枝指至少两个核酸分子的结合或联合，使得至少两个核酸分子中的一个被插入到至少两个核酸分子中的另一个中。例如，已经观察到靶向肽可以被接枝到编码VP2 AAV衣壳蛋白的核酸的某些基因座上。在一些实施方案中，将靶向肽(例如骨靶向肽)插入到对应于编码AAV2或AAV9 VP2衣壳蛋白的Q588和A589和/或N587和R588的密码子之间的位置的位置。在一些实施方案中，将靶向肽插入到编码VP3衣壳蛋白的N587和R588的密码子之间的位置(或对应于AAV2或AAV9中的这些氨基酸位置的位置)。在一些实施方案中，将靶向肽插入到编码VP1衣壳蛋白的S452和G453的密码子之间的位置。其他可能的位置可以是N587和R588。
在一些实施方案中，通过接枝形成的核酸(接枝的核酸)编码嵌合蛋白。在一些实施方案中，接枝的核酸编码嵌合蛋白，使得一个多肽被有效地插入到另一个多肽中(例如，在N末端之前或C末端之后不直接结合)，从而产生两个多肽的连续融合。在一些实施方案中，接枝的核酸编码嵌合蛋白，使得一个多肽被有效地附接到另一多肽上(例如，在N末端之前或C末端之后直接结合)，从而产生两个多肽的连续融合。在一些实施方案中，术语接枝指至少两个多肽或其片段的结合或联合，使得至少两个多肽或其片段中的一个被插入到至少两个多肽或其片段中的另一个中。在一些实施方案中，术语接枝指至少两个多肽或其片段的结合或联合，使得至少两个多肽或其片段中的一个被附接到至少两个多肽或其片段中的另一个。
在一些实施方案中，本公开涉及结合至一个或多个骨靶向部分的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白。“骨靶向部分”通常指促进rAAV转运到骨或骨组织的小分子、肽、核酸等。例如，在一些实施方案中，骨靶向部分是与骨细胞(例如，OB、OC、骨细胞等)上的受体结合的肽或小分子。骨靶向部分的示例包括但不限于阿仑膦酸盐(ALE)、多肽例如环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸(cRGCyk)、Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(D-Asp8)和适体例如CH6。骨靶向部分可以直接结合至衣壳蛋白或经由接头分子(例如氨基酸接头、PEG接头等)结合至衣壳蛋白。
在一些实施方案中，接头是富含甘氨酸的接头。在一些实施方案中，接头包含至少两个甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:64)。在一些实施方案中，接头包含选自由以下组成的组的式：[G]n(SEQ ID NO:65)、[G]nS(SEQ ID NO:66)、[GS]n(SEQ ID NO:67)和[GGSG]n(SEQ ID NO:68)，其中G是甘氨酸，且其中n是大于1的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更大)。在一些实施方案中，n是在2至10、2至20、5至10、5至15或5至25的范围内的整数。因此，在一些实施方案中，异源靶向肽结合至接头。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸，其能够与标记有ADIBO的骨靶向部分反应(例如，经由“点击化学”以形成衣壳蛋白-骨靶向部分结合物)。包含携带叠氮化物的非天然氨基酸的衣壳蛋白由例如Zhang等人(2016)Biomaterials 80:134-145描述，并且用于肽结合的基于ADIBO的点击化学由例如Prim等人(2013)Molecules 18(8):9833-49描述。
可以将待培养于宿主细胞中以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分反式提供给宿主细胞。可选择地，可以由稳定的宿主细胞提供所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)的任何一种或多种，该稳定的宿主细胞已经使用本领域技术人员已知的方法被工程化以含有所需组分的一种或多种。最合适地，这种稳定的宿主细胞将含有在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，所需组分可以在组成型启动子的控制下。在适合与转基因一起使用的调控元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的示例。在另一个替代中，选择的稳定的宿主细胞可以含有在组成型启动子控制下的选择的组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选择的组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但是其含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。
生产本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能可以使用任何合适的遗传元件(载体)递送至包装宿主细胞。选择的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所描述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作领域的技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒体的方法是公知的，并且合适方法的选择不是本公开的限制。参见，例如，K.Fisher等人,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745。
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)生产重组AAV。通常，通过用待包装进AAV颗粒的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞来生产重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)，其以反式发挥作用，用于生产性的AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(即，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本公开的载体的非限制性示例包括描述于美国专利号6,001,650的pHLP19和描述于美国专利号6,156,303的pRep6cap6载体，这两篇文献以其全文通过引用并入本文。附属功能载体编码用于非AAV衍生的病毒功能和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖这些核苷酸序列进行复制(即“附属功能”)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于，涉及AAV基因转录的激活、阶段特异的AAV mRNA剪接、AAVDNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和牛痘病毒。
在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，并且当外源DNA已被引入细胞膜内侧时，细胞已经被“转染”。若干转染技术是本领域公知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456，Sambrook等人(1989)MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York，Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier和Chu等人(1981)Gene 13:197。这些技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。
“宿主细胞”指包含或能够包含目的物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞(Sf9)或哺乳动物(例如人、啮齿动物、非人灵长类动物等)细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV生产相关的其他转移DNA的受体。该术语包括已经被转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”可以指已用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，归因于天然的、偶然的或蓄意的突变，单个亲本细胞的后代与原始亲本在形态或基因组或总DNA互补上不一定完全相同。
如本文所用，术语“细胞系”指能够在体外连续或长期生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域中进一步已知的是，在这些克隆群体的储存或转移期间，核型可能发生自发或诱导的变化。因此，源自所指细胞系的细胞可以不与祖细胞或培养物精确相同，并且所指细胞系包括这类变体。
如本文所用，术语“重组细胞”指其中已引入外源DNA片段的细胞，如导致生物活性多肽的转录或生物活性核酸(例如RNA)的产生的DNA片段。
在一些方面，本公开提供了包含衣壳蛋白和分离的核酸的重组AAV，该分离的核酸包含编码AAV ITR的第一区域和包含转基因的第二区域，其中该转基因编码人工microRNA。人工microRNA可降低细胞(例如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞)或受试者中靶基因的表达。在一些实施方案中，rAAV包含降低细胞或受试者中SHN3表达的人工microRNA。
rAAV可包含至少一个修饰，其增加rAAV对骨细胞(例如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞)的靶向。增加rAAV对骨细胞靶向的修饰的非限制性示例包括异源骨靶向肽(例如，如SEQ ID NO:16、17、57、58、59、60、61、62或63中任何一个所示的)、AAV衣壳血清型(例如AAV1、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh39、AAVrh43)。
使用本公开的rAAV可以使细胞或受试者中SHN3的表达降低50％至99％(例如，50％至99％之间的任何整数，包含端值)。使用本公开的rAAV可以使细胞或受试者中SHN3的表达降低75％至90％。使用本公开的rAAV可以使细胞或受试者中SHN3的表达降低80％至99％。
用于将重组载体包装在所需AAV衣壳中以生产本公开的rAAV的前述方法并不意指是限制性的，并且其他合适的方法对技术人员而言是显而易见的。
施用方式和组合物
根据本领域中已知的任何合适方法可以将本公开的rAAV以组合物的形式递送至受试者。例如，可以将优选地悬浮在生理学相容的载体(例如在组合物中)中的rAAV施用给受试者，例如宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔子、马、奶牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物(例如猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。
rAAV到哺乳动物受试者的递送可以通过例如肌肉内注射或通过施用至哺乳动物受试者的血流中。施用至血流中可以通过注射进静脉、动脉或任何其他血管。在一些实施方案中，通过隔离肢体灌注(isolated limb perfusion)的方式施用rAAV至血流中，这是外科领域中公知的技术，该方法基本上使技术人员能够在rAAV病毒体的施用之前将肢体与全身循环隔离。技术人员还可以采用隔离肢体灌注技术的变体(描述于美国专利号6,177,403中)来施用病毒体至隔离肢体的脉管系统中，以潜在增强向肌细胞或组织的转导。此外，在某些情况下，将病毒体递送至受试者的骨(例如骨组织)中可以是合意的。“骨组织”意指脊椎动物的骨和/或关节(例如，软骨、轴骨(axial bone)和附肢骨(appendicular bone)等)的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、软骨细胞等。经由使用针、导管或相关装置的滑膜内注射、膝注射、股骨髓内注射等，通过使用本领域中已知的外科技术，可以将重组AAV直接递送至骨。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用如本公开所述的rAAV。在一些实施方案中，通过肌肉内注射施用rAAV。
本公开的一些方面涉及包含含有衣壳蛋白和编码转基因的核酸的重组AAV的组合物，其中转基因包含编码一种或多种骨代谢调节剂的核酸序列。在一些实施方案中，核酸进一步包含一个或多个AAV ITR。在一些实施方案中，rAAV包含含有SEQ ID NO:1-15中任何一个所示的序列(或其互补序列)或其部分的rAAV载体。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，组合物包含含有衣壳蛋白和核酸的重组AAV，该核酸包含编码AAV ITR的第一区域和包含转基因的第二区域，其中该转基因编码靶向SHN3的人工microRNA。在一些实施方案中，重组AAV包含SEQ ID NO:3所示的序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白进一步包含SEQ ID NO:16-17或57-63所示的异源骨靶向肽。
本公开的一些方面提供了降低细胞中SHN3表达的方法。细胞可以是单个细胞或细胞群(例如培养物)。细胞可以是体内的(例如在受试者中)或体外的(例如在培养物中)。受试者可以是哺乳动物，任选地是人、小鼠、大鼠、非人灵长类动物、猪、狗、猫、鸡或奶牛。
通过使用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物，可以使细胞或受试者中SHN3的表达降低50％至99％(例如，50％至99％之间的任何整数，包含端值)。通过使用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物，可以使细胞或受试者中SHN3的表达降低75％至99％。通过使用本公开的分离的核酸、rAAV或组合物，可以使细胞或受试者中SHN3的表达降低80％至99％。
本公开的组合物可以仅包含rAAV，或与一种或多种其他病毒(例如，编码一种或多种不同转基因的第二rAAV)组合。在一些实施方案中，组合物包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的rAAV，每一种rAAV均具有一个或多个不同的转基因。
考虑到rAAV被指示的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载体的选择不是本公开的限制。
任选地，除rAAV和载体之外，本发明的组合物还可以含有其他常规的药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸类、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
以足够的量施用rAAV以转染目标组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达而没有过度的不利影响。常规的和药学上可接受的施用途径包括但不限于，直接递送至选择的器官(例如，门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、瘤内和其他胃肠外(parental)施用途径。如需要可以组合施用途径。
获得特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如，基因组拷贝/每千克体重(GC/kg)的剂量单位，将基于多种因素而变化，这些因素包括但不限于：rAAV病毒体的施用途径、获得治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及本领域公知的其他因素，本领域技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒体的剂量范围。
rAAV的“有效量”是足以靶向感染动物、靶向所需组织(例如骨组织)的量。有效量将主要取决于诸如物种、年龄、体重、受试者的健康状况以及要靶向的组织的因素，并且因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量的范围通常在约1ml至约100ml的溶液中含有约109至1016个基因组拷贝。在一些情况下，在约1011至1013个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在某些实施方案中，1012或1013个rAAV基因组拷贝有效地靶向骨组织。
在一些实施方案中，以每个日历日(例如24小时期间)不多于一次施用一个剂量的rAAV给受试者。在一些实施方案中，以每2个、3个、4个、5个、6个、7个日历日不多于一次施用一个剂量的rAAV给受试者。在一些实施方案中，以每个日历周(例如7个日历日)不多于一次施用一个剂量的rAAV给受试者。在一些实施方案中，以不多于每两周一次(例如在两个日历周期间一次)施用一个剂量的rAAV给受试者。在一些实施方案中，以每个日历月不多于一次(例如，在30个日历日中一次)施用一个剂量的rAAV给受试者。在一些实施方案中，以每六个日历月不多于一次施用一个剂量的rAAV给受试者。在一些实施方案中，以每个日历年(例如，365天或闰年的366天)不多于一次施用一个剂量的rAAV给受试者。
在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在高rAAV浓度存在处(例如～1013GC/ml或更高)。用于减少rAAV聚集的方法是本领域公知的，并且包括例如添加表面活性剂、调节pH、调节盐浓度等。(参见，例如，Wright FR等人,Molecular Therapy(2005)12,171-178，其内容通过引用并入本文。)
药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员公知的，用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案的开发也是公知的。
通常，这些制剂可以含有至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地介于总配方重量或体积的约1％或2％至约70％或80％之间或更多。自然地，可以以在化合物的任何给定单位剂量中获得合适剂量的方式制备每种治疗上有用的组合物中的活性化合物的量。制备这些药物制剂的领域的技术人员将考虑如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑的因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可以是合意的。
在某些情况下，以皮下、胰内、鼻内、胃肠道外、静脉内、肌肉内、鞘内、股骨髓内或口服、腹膜内或通过吸入的方式递送本文中公开的合适配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗构建体将是合意的。在一些实施方案中，可以使用如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自通过引用整体并入本文)中描述的施用形式递送rAAV。在一些实施方案中，施用的优选模式是通过门静脉注射。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备。在储存和使用的常规情况下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的且流动性达到容易注射的程度。它在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须防腐以免于微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂可以维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以实现对微生物作用的阻止。在许多情况下，优选包括例如糖或氯化钠的等渗剂。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现注射组合物的延长吸收。
例如，对于施用注射水溶液，如需要可以合适地将溶液进行缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗的NaCl溶液中，然后添加到1000ml皮下输液液体中，或在建议的输注部位注射(参见例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences"15th Edition,1035-1038页和1570-1580页)。取决于宿主的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定对于个体宿主的合适剂量。
通过将所需量的活性rAAV并入具有本文列举的多种其他成分的合适溶剂中然后过滤灭菌(需要时)来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自以上列举的那些所需的其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冰冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
本文公开的rAAV组合物也可以以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，并且其与例如盐酸或磷酸的无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等的有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可以源自例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物的无机碱，以及如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。经由制剂，将以与剂型相容的方式和以治疗有效的量来施用溶液。以各种剂型如可注射溶液、药物释放胶囊等容易地施用制剂。
如本文所用，“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的使用是本领域公知的。补充的活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”指当施用给宿主时不产生过敏或相似的不良反应的分子实体和组合物。
递送载体如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以被配制以包裹在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的形式进行递送。
这些制剂可以优选用于本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂的引入。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改进的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制备物作为潜在药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。
脂质体已成功用于对其他程序的转染通常有抵抗的多种细胞类型。此外，脂质体不存在基于病毒的递送系统典型的DNA长度的限制。脂质体已被有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物(allosteric effector)引入各种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了多种成功的检查脂质体介导的药物递送的有效性的临床试验。
脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也被称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV的直径通常为25nm至4μm。MLV的超声处理导致直径范围在200至
Figure BDA0002767412420000371
内的其核心中含有水溶液的小单层囊泡(SUV)的形成。
或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可再现的方式截留物质。为了避免归因于细胞内聚合体超载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计这些超细颗粒(尺寸约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基-丙烯酸烷酯纳米颗粒。
除上述递送方法外，还考虑将以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。超声促渗(sonophoresis)(即超声)已被使用并描述于美国专利号5,656,016，其作为用于增加药物渗透进和通过循环系统的速率和功效的装置。考虑的其他药物递送替代方式是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、托吡卡胺制剂(ophthalmic formulation)(Bourlais等人,1998)、透皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利号5,697,899)。
治疗方法
本公开提供了用于递送有效量的转基因(例如，编码一种或多种骨代谢调节剂的分离的核酸或rAAV)至受试者的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用有效量的编码能够促进或抑制骨形成的干扰RNA的分离的核酸给受试者的步骤。在一些实施方案中，该方法包括施用有效量的编码能够促进或抑制骨吸收的干扰RNA的分离的核酸给受试者的步骤。因此，在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸、rAAV和组合物用于治疗患有或怀疑患有与骨代谢失调有关的疾病或病症的受试者。
如本文所用，“与骨代谢失调有关的疾病或病症”指以骨沉积和骨吸收之间的失衡为特征的病症，其导致以下之一：1)相对于健康个体(例如，未患有以骨沉积和骨吸收之间的失衡为特征的疾病的受试者)的异常增加的骨沉积(例如，形成)，或2)相对于健康个体(例如，未患有以骨沉积和骨吸收之间的失衡为特征的疾病的受试者)的异常减少的骨沉积(例如，形成)，或3)相对于健康个体(例如，未患有以骨沉积和骨吸收之间的失衡为特征的疾病的受试者)的异常增加的骨吸收(例如，破坏)，或4)相对于健康个体(例如，未患有以骨沉积和骨吸收之间的失衡为特征的疾病的受试者)的异常减少的骨吸收(例如，破坏)。
“与骨密度降低有关的疾病”指由以下原因导致的以增加的骨孔隙度(boneporosity)为特征的病况：1)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度降低为特征的疾病的受试者)的异常减少的骨沉积(例如，形成)，或2)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度降低为特征的疾病的受试者)的异常增加的骨吸收(例如，破坏)。与增加的骨孔隙度有关的疾病可以由以下两种原因之一引起：1)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度降低为特征的疾病的受试者)的异常减少的OB和/或骨细胞的分化、功能或活性，和/或2)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度降低为特征的疾病的受试者)的异常增加的OC分化、功能或活性。“孔隙度”通常指未被骨组织占据的骨部分的体积。
“与骨密度增加有关的疾病”指以由以下原因之一导致的降低的骨孔隙度(boneporosity)为特征的病况：1)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度增加为特征的疾病的受试者)的异常增加的骨沉积(例如，形成)，或2)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度增加为特征的疾病的受试者)的异常减少的骨吸收(例如，破坏)。与降低的骨孔隙度有关的疾病可以由以下两种原因之一引起：1)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度增加为特征的疾病的受试者)的异常增加的OB和/或骨细胞的分化、功能或活性，和或2)相对于健康个体(例如，未患有以骨密度增加为特征的疾病的受试者)的异常减少的OC分化、功能或活性。
本公开的一些方面提供了治疗与骨代谢失调有关的疾病或病症的方法。骨代谢失调可以是与骨密度降低有关的疾病(例如，骨质疏松症、临界大小骨缺损、由废用或受伤引起的机械性病症)。骨代谢失调可以是与骨密度增加有关的疾病(例如，骨硬化症、致密性成骨不全症、硬化性狭窄病、肢端肥大症、氟蚀病、骨髓纤维化、丙型肝炎相关性骨硬化症、异养性骨化)。
在一些实施方案中，治疗与骨代谢失调有关的疾病或病症的方法包括施用包含转基因的重组AAV(rAAV)给有此需要的受试者。rAAV可以包含促进其靶向骨细胞(例如破骨细胞和成骨细胞)的修饰。促进其靶向骨细胞的rAAV的非限制性修饰包括SEQ ID NO:16-17或57-63中的异源骨靶向肽、骨特异性启动子和具有相对于其他组织增加的骨靶向的AAV血清型。在一些实施方案中，治疗骨代谢失调的方法包括施用包含如SEQ ID NO:16-17或57-63中的异源骨靶向肽的rAAV给有此需要的受试者。
在一些实施方案中，包含异源骨靶向肽的rAAV包含上调或下调与骨代谢失调有关的靶基因的转基因。在一些实施方案中，该转基因上调靶基因的表达，该靶基因的表达在与骨密度降低有关的病症(例如，骨质疏松症、临界大小骨缺损、由废用或受伤引起的机械性病症)中降低。在一些实施方案中，转基因下调在与骨密度降低有关的疾病中增加的靶基因的表达。在一些实施方案中，转基因上调靶基因的表达，该靶基因的表达在与骨密度降低有关的病症(例如，骨质疏松症、临界大小骨缺损、由废用或受伤引起的机械性病症)中降低。在一些实施方案中，转基因下调在与骨密度降低有关的疾病中增加的靶基因的表达。
本公开的一些方面提供了用于治疗与以骨代谢失调为特征的疾病或病症有关的疾病或病症的方法，该方法包括施用包含衣壳蛋白和编码抑制性核酸的分离的核酸的rAAV给受试者。rAAV可以包含抑制性核酸(例如，siRNA、shRNA、miRNA或amiRNA)。抑制性核酸可以减少或增加与以骨代谢失调为特征的疾病或病症有关的靶基因的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗与骨密度降低相关的疾病或病症的方法。该方法包括施用包含靶向与骨密度降低有关的基因的转基因的rAAV或分离的核酸给有此需要的受试者。在一些实施方案中，rAAV或分离的核酸包含编码靶向与骨密度降低有关的基因的人工microRNA的转基因。在一些实施方案中，靶基因是SHN3、PTH、PTHrP、DJ1、SOST、CTSK或RANK。
本公开的一些方面提供了治疗与骨密度降低有关的疾病或病症的方法，包括施用rAAV或分离的核酸。在一些实施方案中，rAAV或分离的核酸包含SEQ ID NO:3所示的序列或其互补序列。在一些实施方案中，rAAV包含含有SEQ ID NO:18-34中任何一个所示的序列的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV包含含有SEQ ID NO:16-17和57-63中任何一个所示的序列的异源骨靶向肽。
通过使用本公开的方法，可以将细胞或受试者中SHN3的表达降低50％至99％(例如，50％至99％之间的任何整数，包含端值)。通过使用本公开的方法，可以将细胞或受试者中SHN3的表达降低75％至90％。通过使用本公开的方法，可以将细胞或受试者中SHN3的表达降低80％至99％。
在一些实施方案中，物质的“有效量”是足以产生所需效果(例如，转导骨细胞或骨组织)的量。在一些实施方案中，分离的核酸的有效量是足以转染(或在rAAV介导的递送的情况下感染)足够数量的受试者靶组织的靶细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是骨组织(例如，骨和骨组织细胞，例如OB、OC、骨细胞、软骨细胞等)。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，其可以经由rAAV递送)的有效量可以是足以在受试者中具有治疗益处(例如，增加OB和/或骨细胞的活性或功能、抑制OB和/或骨细胞的活性、增加OC的活性或功能、抑制OC的活性或功能等)的量。有效量将取决于多种因素，例如受试者的物种、年龄、体重、健康状况以及所靶向的组织，并且因此可以如本公开中别处所述在受试者和组织间变化。
通过以下实施例将更详细地描述本发明的示例性实施方案。这些实施方案是本发明的示例，本领域技术人员将认识到本发明不限于示例性实施方案。
实施例
实施例1
已经鉴定了几种骨形成的关键调节子作为骨质疏松症的治疗靶标。例如，归因于增加的OB活性，天然产生的骨形成抑制剂骨硬化蛋白(SOST)或衔接蛋白schnurri-3(SHN3，也称为HIVEP3)的抑制导致骨量的逐渐增加。不同于主要在OB中起作用的SHN3和SOST，组织蛋白酶K(CTSK)在OC中高度表达，并且其抑制通过阻断OC活性增加了骨量。最后，用包括PTH、PTH相关蛋白(PTHrP)或DJ-1的骨合成代谢因子处理促进了骨形成。在这个实施例中，描述了可以通过使用骨靶向腺相关病毒(AAV)介导的基因沉默或添加来操纵这些候选基因表达的基因治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂(例如，本公开描述的组合物)通过促进OB功能和骨形成或通过抑制OC活性和骨破坏阻止骨质流失，而仅具有有限的对骨重塑和再生活性的不良作用。
使用骨靶向腺相关病毒(BT-AAV)开发基因治疗剂
高转导效率、持续的转基因表达以及缺乏感染后的免疫原性和致病性，这些使得AAV成为用于基因治疗中的非常有吸引力的病毒载体。迄今为止，已经在全球超过130个临床试验和2,000例患者中评估了AAV载体。然而，非特异的细胞靶向、可能的预先存在的免疫和其他限速事件使得鉴定更多天然AAV血清型和通过载体工程化改进AAV血清型的性质和功能成为必要。在此，鉴定了可以在体外和体内转导OB和/或OC的AAV血清型。
转导OB、OC和软骨细胞的AAV血清型的鉴定
为此，将增强的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因包装到17种AAV衣壳(scAAV1、scAAV2、scAAV3、scAAV4、scAAV5、scAAV6、scAAV6.2、scAAV7、scAAV8、scAAV9、scAAVrh8、scAAVrh10、scAAVrh39、scAAVrh43、scAAV2/2-66、scAAV2/2-84、scAAV2/2-125)中。通过使用表面荧光显微术监测GFP表达评估了这些纯化的AAV血清型载体转导源自间充质干细胞(MSC)的小鼠OB谱系细胞或软骨细胞谱系细胞或源自骨髓单核细胞(BM-MO)的小鼠OC的能力。首先，为了测试它们对OB谱系细胞或软骨细胞谱系细胞的转导能力，分别从Cyagen和ATCC购买了小鼠MSC和软骨细胞祖细胞系(ATDC5)。此外，小鼠OB前体细胞(pre-OB)分离自三种不同的同基因背景(C57BL/6J、BALB/cJ、129S1/SvlmJ)的出生后第3-5天的小鼠新生鼠的颅盖，并在成骨培养基中培养6天以分化成成熟OB(mOB)。将单剂量的17种纯化的AAV血清型的1012～1013/ml个基因组拷贝与这些细胞一起温育2天，并通过表面荧光显微术(表1)和针对EGFP的免疫印迹(图22)来分析GFP表达。
表1：可在体外转导小鼠MSC谱系细胞的scAAV血清型的鉴定。
Figure BDA0002767412420000421
Figure BDA0002767412420000431
Figure BDA0002767412420000441
在17种AAV血清型中，scAAV4在三种不同的小鼠背景scAAV1、scAAV5、scAAV6上转导小鼠OB谱系细胞是最有效的，且scAAV6.2(scAAV6的工程化版本)在三种不同的小鼠背景上转导小鼠OB谱系细胞和软骨细胞谱系细胞是最有效的，且scAAV9在C57B6/J背景上仅转导pre-OB是最有效的(图1和图2中的代表性图像)。
接下来，研究了纯化的AAV血清型转导小鼠OC前体细胞的能力。小鼠原代OC前体细胞(BM-MO，源自骨髓的单核细胞)分离自两月龄小鼠(C57BL/6J)的长骨，并通过添加小鼠M-CSF(40ng/ml，R&D Systems)进行扩增。在小鼠M-CSF(40ng/ml)和小鼠Rank配体(10ng/ml，R&D Systems)的存在下培养BM-MO 6天，以分化成成熟OC(图3)。此外，在用小鼠Rank配体(10ng/ml)培养4天后，将小鼠OC前体细胞系(Raw264.7)分化成成熟OC(图4)。将单剂量的17种纯化的AAV血清型的1012～1013/ml个基因组拷贝与这些细胞一起温育2天，并通过表面荧光显微镜术分析GFP表达(表2)。
表2：在体外转导小鼠OC的scAAV血清型的鉴定。
Figure BDA0002767412420000442
Figure BDA0002767412420000451
在17种AAV血清型中，scAAV1、5、6、6.2、7和9有效地转导小鼠原代OC和Raw264.7OC系，而scAAV8和10、scAAVrh39和43仅转导Raw264.7OC系。(图3和图4中的代表性图像)。
为了检查AAV衣壳对关节软骨和骨的向性，从体外筛选中选出八种scAAV-Egfp载体(scAAV1、scAAV4、scAAV5、scAAV6、scAAV7、scAAV9、scAAVrh.10和scAAVrh.39)。为了测试它们转导关节软骨上的软骨细胞和/或骨表面的OB和/或OC的能力，将单剂量的八种选择的编码GFP的AAV血清型的1012～1013/ml个基因组拷贝注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的两个膝关节中，并在4周后安乐死小鼠，并通过位于UMMS光学成像设施的IVIS-100光学成像系统监测AAV到关节软骨和/或骨的转导(图5)。作为阴性对照，给小鼠注射PBS。对于大多数衣壳而言，EGFP在关节软骨(图28)或生长板(图22)中从几乎没有表达至无表达。这种不一致可归因于scAAV载体对嵌入这些结构的无血管微环境中的软骨细胞的差的可及性。或者，载体可简单地在成年小鼠中表现较低的原代软骨细胞感染力。GFP蛋白在膝关节和后肢中高表达，且它们的表达限于局部注射区域(图5，顶部，图28)。特别地，即使在去除肌肉后，仍在骨和膝关节中检测到GFP表达(图5，底部)。为了确认GFP在关节软骨的软骨细胞中和/或在骨表面的OB和/或OC中的表达，进行了膝关节和股骨的冰冻切片上的组织学检查。如图6A所示，在注射了scAAV1、scAAV4、scAAV5、scAAV6、scAAV7、scAAV9、scAAVrh.10和scAAVrh.39的膝关节中检测到关节软骨中无或几乎没有GFP蛋白表达。在注射了scAAV9的膝关节中，在少数软骨细胞群中检测到GFP表达。与使用软骨细胞前体细胞系ATDC5的体外数据相反，这些结果表明某些scAAV血清型在体内不能有效地转导关节软骨中的软骨细胞。
相比之下，当将scAAV9注射入膝关节时，GFP蛋白在位于皮质骨中的OB和骨细胞中高表达。经处理的小鼠的全身和单个器官成像显示，EGFP表达在肝脏和后肢中最高(图23和29)。心脏和股骨中的表达是中等的，而未检测到肺、肾和脾中的表达。通过荧光显微镜术和免疫印迹分析进一步证实了心脏、肝和股骨中的EGFP表达(图23)。如观察到的，EGFP蛋白主要在皮质骨和小梁骨的骨内成骨细胞和骨细胞中表达，而不在韧带、关节软骨、生长板、骨膜成骨细胞、骨髓和髌骨(patellta)中表达(图23和30)。这些结果证明，全身递送的scAAV9载体靶向位于骨内的成骨细胞谱系细胞。
除scAAV9外，还在scAAV5处理中观察到皮质骨骨膜细胞中GFP的高表达和骨细胞中GFP的低表达。当注射scAAV4时，小群的骨膜细胞表达GFP蛋白，而在scAAV6.2处理中未检测到GFP表达(图6B)。因此，这些结果表明，scAAV9血清型在转导小鼠骨表面上的OB和OC是最有效的。为了提高scAAV9对骨组织的转导效率，将scAAV9与PBS或X-tremeGene 9DNA转染试剂(Roche，一种具有极低细胞毒性的脂质混合物)一起配制，并注射到小鼠的膝关节中(图7和8)。当与X-tremeGene 9(脂质体)一起配制时，GFP蛋白在生长板下和小梁骨表面(桡骨)上有活性的OB和OC中以及在皮质骨(骨干)中终末分化的OB、骨细胞中高表达。但是，GFP表达在肌肉中显著减少，表明X-tremeGene 9制剂改变了scAAV9的体内向性。
经由衣壳蛋白的遗传或化学修饰的骨靶向-scAAV9(BT-scAA9)血清型的开发
为了最佳化骨质疏松症中AAV介导的基因治疗，scAAV9血清型归巢并累积在OB和OC位于其中的骨表面上是合意的。已经观察到骨靶向肽((AspSerSer)6，DSS)有效地引导成骨的包裹siRNA的脂质体至骨形成表面。已经报道了其他的骨靶向肽HABP-19(CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL；SEQ ID NO:17)选择性结合培养物中和小鼠中的骨羟磷灰石。HABP-19是骨钙素的仿生物，是分泌自OB的最丰富的非胶原蛋白。γ(Gla残基)-羧化谷氨酸(Glu)通过维生素K依赖的γ-羧化衍生自Glu。
该实施例描述了将骨靶向肽插入AAV衣壳中以引导工程化的scAAV9血清型至骨(图9A，DSS-scAAV9、HABP-scAAV9)。通过使用标准克隆方法，将编码(AspSerSer)6(SEQ IDNO:16)的DNA序列插入衣壳蛋白VP2开放阅读框(ORF)的谷氨酰胺587和丙氨酸588(DSS-587)之间、谷氨酰胺588和精氨酸589(DSS-588)之间或VP2-ORF的N端(DSS-Nter)(图10和26)。此外，产生了经由化学反应结合趋骨性(bone-seeking)分子的AAV衣壳(图9B)。已经观察到，亲骨分子(ADIBO-Ale)附着于细胞表面上的叠氮化物部分显著增强了非骨细胞(例如，Jurkat T白血病细胞系)结合骨片段的能力。
为了检查DSS插入是否影响scAAV9的感染力，将包装进原型AAV9、AAV9.DSS-587或AAV9,DSS-Nter衣壳的载体感染到COB中，并通过免疫印迹或荧光显微镜术评估EGFP表达(图29)。与scAAV9相比，scAAV9.-DSS-Nter在较低MOI(109GC/mL)下显示感染力的中度降低，而在经scAAV9.DSS-587处理的COB中几乎未检测到EGFP表达(图29)。相似地，当经由i.a.注射处理小鼠时，scAAV9和scAAV9.DSS-Nter如之前一样强烈地转导股骨(图35)。与之相反，scAAV9.DSS-587几乎不产生或不产生转基因表达。此外，碱性磷酸酶(ALP)活性和成骨基因的表达在经scAAV9和scAAV9.DSS载体处理的COB中是相当的，表明scAAV对成骨细胞分化没有不利影响(图29和35)。
测试了用衣壳蛋白上的骨靶向分子修饰的工程化的scAAV9血清型(Ale-scAAV9)。为了在AAV衣壳蛋白上创造含叠氮化物的氨基酸，将VP3衣壳蛋白中的天冬酰胺587改变为琥珀密码子(TAG)或将此琥珀密码子插入天冬酰胺587和精氨酸588之间。与这些突变VP3质粒一起，使用DNA转染试剂将pHelper、pAAV-GFP和pPyIRS/tRNACUA以1:1:1:2的摩尔比瞬时转染到AAV-293包装细胞中。6小时后，用含有1mM N-2-叠氮基O乙基氧羰基-L-赖氨酸(N-2-azideoethyloxycarbonyl-L-lysine，NAEK)的新鲜培养基替换培养基，并且72小时后从转染的细胞收获具有携带叠氮化物的氨基酸的scAAV9血清型(叠氮化物-scAAV9)。表达自pPyIRS/tRNACUA质粒的正交琥珀抑制剂氨酰基-tRNA合成酶/tRNA-CUA对在NAEK存在下于琥珀密码子位点处合成携带叠氮化物的非天然氨基酸。
通过用抗VP3抗体的免疫印迹确认了含有叠氮化物部分的VP3突变体的表达。一旦确认，通过监测GFP表达来评估叠氮化物-scAAV9血清型转导OB或OC的能力。用编码GFP的叠氮化物-scAAV9血清型处理原代小鼠OB，并通过表面荧光显微镜术评估GFP的表达。此外，这些scAAV9血清型用于在M-CSF和Rank配体存在下感染小鼠BM-MO(OC前体细胞)。将它们的转导效率与编码GFP的WT-scAAV9血清型进行比较。
接下来，经由点击化学，通过交联亲骨分子(ADIBO-Ale)和叠氮化物-scAAV9血清型的VP3衣壳蛋白中携带叠氮化物的氨基酸，生产骨靶向scAAV9血清型(Ale-scAAV9)。将叠氮化物-scAAV9血清型在室温下与不同浓度的ADIBO-Ale(FutureChem)温育，并在2小时后使用透析去除未结合的ADIBO-Ale。通过监测GFP表达来检查Ale-scAAV9血清型转导原代OB或OC的能力。
DSS-scAAV9转导至骨细胞和组织的验证
之前已报道，当将肽无效地或不合适地融合到AAV衣壳中时，AAV的转导效率会显著降低。为了测试DSS肽插入对scAAV9转导至OB和OC的能力的影响，用不同剂量的编码GFP的scAAV9(WT-、DSS-588、DSS-Nter)处理小鼠OB和OC前体细胞。2天后，通过使用抗GFP抗体的western印迹和通过表面荧光显微镜术来分析GFP的表达。如图11和12中所见(A和B-左)，当经DSS-588处理时，在OB和OC中均几乎未检测到或未检测到GFP蛋白表达。相比之下，与WT-scAAV9相比，DSS-Nter scAAV9的处理显示了OB和OC中GFP表达的减少，并且其表达以剂量依赖的方式增加。在这些scAAV9的处理中，OB(图11B-右和11C)和OC(图12B-右和12C)的分化是正常的，表明scAAV9转导不影响OB和OC功能。
接下来，研究了DSS-scAAV9载体在体内转导至骨细胞的能力。用X-tremeGene 9配制编码GFP的scAAV9载体(WT-、DSS-588、DSS-Nter)，并将单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的这些scAAV9载体注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中，1周后，对股骨的冰冻切片进行组织学检查，并使用共聚焦显微术评估OB、OC和/或骨细胞中的GFP表达(图13)。PBS注射充当非GFP表达的对照。与体外实验相似(图11和12)，在用DSS-588scAAV9处理的股骨中几乎未观察到或未观察到GFP表达。尽管与WT-scAAV9相比，表达GFP的细胞群减少，但DSS-Nter scAAV成功转导了所有的骨细胞(bone cells)，包括OB、OC和骨细胞(osteocytes)。
测试了AAV衣壳在体内的骨靶向活性。如之前所述，将scAAV9或scAAV9-DSS-Nteri.v.注射到两月龄小鼠中，并在注射后两周通过EGFP表达评估组织分布。尽管在经scAAV9或scAAV9-DSS-Nter全身处理的小鼠的全身中观察到相等水平的EGFP蛋白(图36)，但经scAAV9.DSS-Nter注射的小鼠产生了分别在心脏和肝中经scAAV9实现的那些的～55％和～75％的EGFP表达水平(图26和图36)。重要地，股骨和腰椎中的表达在处理组之间是相对来说相当的(图26和36)。值得注意的是，与经scAAV9处理的股骨相比，经scAAV9.DSS-Nter处理的股骨显示了增加数量的表达EGFP的细胞(图26)。这些结果表明，与骨靶向肽基序(DSS)融合的工程化的VP2衣壳蛋白通过去靶向至非骨骼组织的递送来提高scAAV9的骨归巢特异性，并转而增加了其对骨的向性。
用于体内特异性骨转导的BT-scAAV9血清型的全身递送的验证
为了检查BT-scAAV9血清型在体内归巢于骨的能力，局部或全身施用单剂量的1×1010个基因组拷贝的编码GFP的scAAV9载体(WT-、DSS-或HABP、Ale)给小鼠。对于局部施用，将这些scAAV9血清型注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中，并在1周或4周后通过IVIS-100光学成像系统监测AAV至骨上的OB、OC和/或骨细胞的递送。此外，在股骨的冰冻切片上进行组织学检查以检测通过这些scAAV9血清型转导的表达GFP的OB、OC和/或骨细胞。PBS注射充当非GFP表达的对照。对于全身施用，经由静脉内(IV)或腹膜内(IP)注射施用编码GFP的WT-、DSS-、HABP-或Ale-scAAV9血清型给小鼠。1周或4周后，通过IVIS-100光学成像系统监控AAV至骨的递送，并且GFP阳性的骨将被进一步冰冻切片以进行组织学检查。
编码特异于小鼠Schnurri-3(SHN3)、骨硬化蛋白(SOST)或组织蛋白酶K(CTSK)的shRNA的scAAV9载体的生成
硬化性狭窄病是一种具有高骨量的罕见遗传性疾病，并且已被观察到与编码骨硬化蛋白的SOST基因中的丧失功能型突变有关。骨硬化蛋白分泌自骨细胞、终末分化的成骨细胞，并且抑制骨形成和增强骨吸收。经单克隆人抗骨硬化蛋白抗体的处理通过促进骨形成和抑制骨吸收来恢复患有骨质疏松症的人患者和动物模型的骨质流失。然而，归因于增加的中风风险，FDA的批准目前是不太可能的。不同于抑制成骨细胞分化的骨硬化蛋白，组织蛋白酶K(CTSK，一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶)在对骨吸收重要的成熟破骨细胞中高表达。致密性成骨不全症(Pycnodysostosis，一种具有高骨量的罕见遗传性疾病)由人体内CTSK基因的失活性突变导致。经CTSK的小分子抑制剂的处理通过抑制骨吸收同时限制对骨再生活性的不利影响来阻止患有骨质疏松症的人患者和动物模型的骨质流失。然而，归因于升高的中风发生率，其最近已从FDA的考虑中撤消。
Schnurri-3(SHN3)作为成骨细胞分化的新型抑制剂。使用可诱导的loxP:Cre系统瞬时缺失OB中的SHN3导致小鼠中骨量的显著增加，表明SHN3表达的下调提供了一种有吸引力的治疗方法以恢复骨质疏松症中的低骨量(图14)。同样地，SHN3的抑制通过促进骨形成阻止了骨质疏松症小鼠模型中的骨质流失(图15)。然而，不同于骨硬化蛋白和CTSK，SHN3缺乏对骨特异，并与非骨组织的表型无关。因此，将实施例1中所述的骨靶向scAAV9载体随后用于载体，以在体外和体内沉默OB和/或OC中的小鼠SHN3、SOST或CTSK。
改造靶向上述基因(例如SHN3、CTSK)的两个shRNA发夹以替代功能性自互补AAV载体(例如mTR)所需的突变的反向末端重复(mTR)，并且修饰的shRNA-mTR序列描述于序列一节中。将这些修饰的shRNA-mTR在限制性酶位点PstI和Bgl2处克隆到pAAVscCB6-EGFP载体中，并包装到scAAV9衣壳中。
生产表达特异于小鼠schnurri-3(SHN3)和小鼠组织蛋白酶K(CTSK)的两个shRNA发夹的纯化的scAAV9载体(scAAV9-mSHN3i和scAAV9-mCTSKi)。对于体外特征化，分别在OB和OC中测试scAAV9-mSHN3i和scAAV9-mCTSKi的感染力、敲低效率和功能活性。首先，用小鼠原代OB前体细胞处理单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的两种scAAV9-mSHN3i(Sh-SHN3-1、-2)或scAAV-载体对照(对照)。转导后2天，通过表面荧光显微镜术监测GFP表达，并通过使用RT-PCR测量SHN3mRNA水平来评估敲低效率。分别在OB培养的第6天和第15天通过测量OB分化基因(例如，骨唾液蛋白(BSP)和成骨相关转录因子(OSX))的表达来评估OB分化和通过茜素红染色来评估矿化作用活性(图16A-16D)。scAAV9-mSHN3i至OB的转导与scAAV9-对照的一样有效。scAAV9-mSHN3i(Sh-SHN3-1)能够使SHN3 mRNA水平降低50％(图16A-16B)。SHN3敲低增加了OB分化基因的矿化作用活性和表达(图16C-16D)。
接下来，检查了体内scAAV9-mSHN3i载体的转导和敲低效率(图17)。用X-tremeGene 9配制编码GFP的scAAV9载体(Sh-SHN3-1)，并将单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的此scAAV9载体注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。1周后，对股骨的冰冻切片进行组织学检查，并使用共聚焦显微镜评估OB和骨细胞中的GFP表达。PBS注射充当非GFP表达对照。与对照scAAV9相似，在用scAAV9-mSHN3i载体处理的股骨中观察到OB和骨细胞中的GFP表达(图17A)。或者，使用FACS分选从股骨分离表达GFP的细胞，并通过RT-PCR评估SHN3 mRNA水平，表明通过转导scAAV9-Sh-SHN3-1载体，SHN3 mRNA水平降低50％(图17B)。
此外，还在小鼠OC中研究了scAAV9-mCTSKi的感染力、敲低效率和功能活性。为获得OC前体细胞，将小鼠单核细胞系Raw264.7用Rank配体(5ng/ml)处理2天。随后，将这些OC前体细胞用单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的两种scAAV9-mCTSKi(Sh-CTSK-1、-2)或scAAV-载体对照(对照)处理2天。使用表面荧光显微镜术通过GFP表达来评估转导效率(图18A-18D)，并通过使用RT-PCR测量CTSK mRNA水平来评估敲低效率(图18B)。此外，通过测量TRAP酶活性、TRAP染色的OC的多核化和OC分化基因(例如，树突细胞特异的跨膜蛋白(DC-STAMP)和TRAP)的表达来评估OC分化(图18C和18D)。scAAV9-mCTSKi至OC前体细胞的转导与scAAV9-对照的一样有效。scAAV9-mCTSKi(Sh-CTSK-1)能够将CTSK mRNA水平降低70％(图18A-18B)。CTSK敲低导致OC分化的轻度降低(图18C-18D)。为了检查scAAV9-mCTSKi载体在体内转导至OC的能力，将单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的编码GFP的scAAV9载体(Sh-CTSK-1)与X-tremeGene 9的制剂注射到2月龄小鼠(C57BL/6J)的膝关节中。对GFP和CTSK表达的免疫荧光分析确认，对照-scAAV9和scAAV9-mCTSKi载体均能体内转导骨表面上的OC(图19A)。仅当用scAAV9-mCTSKi载体转导时，表达GFP的OC中的CTSK表达显著降低(图19B)。
编码特异于小鼠骨硬化蛋白(SOST)shRNA的两种shRNA发夹(scAAV9-mSOSTi)的pAAVscCB6载体的敲低效率在具有骨硬化蛋白高表达的表达GFP-DMP1的骨细胞系中得到验证。一旦生成，将单剂量的1012～1013/ml个基因组拷贝的两种scAAV9-mCTSKi或scAAV9-载体对照(对照)注射到具有骨硬化蛋白高表达的小鼠骨细胞系中。转导后2天，通过Western印迹评估GFP表达，并使用RT-PCR通过测量SOST mRNA水平评估敲低效率。
使用BT-AAV介导的基因沉默开发用于骨质疏松症的基因治疗剂
此实施例描述了编码特异于小鼠SHN3、SOST、CTSK的shRNA发夹(SHN3i、SOSTi、CTSKi)的scAAV9血清型的功能性功效的测试。将shRNA发夹克隆到编码GFP的AAV载体中，并包装到BT-AAV衣壳(DSS-scAAV9、Ale-scAAV9)中(图20)。作为阴性对照，将对照ShRNA(cont-i)克隆到AAV载体中。将编码cont-i、SHN3i或SOSTi的BT-AAV血清型转导至原代小鼠OB中，并在三天后通过定量PCR评估SOST或SHN3的敲低效率。通过编码cont-i或CTSKi的BT-AAV血清型转导小鼠原代OC前体细胞，并在M-CSF和RANK配体存在下培养。转导后三天，通过定量PCR分析CTSK的敲低效率，并在六天后评估CSTK沉默抑制OC分化的能力。
为了检查这些基因治疗剂在骨质疏松症小鼠模型中阻止骨质流失的能力，在假手术或OVX手术后4周，对4月龄雌性小鼠(C57BL/6J，n＝12只小鼠/组)IV或IP注射单剂量的1×1012个基因组拷贝的这些BT-scAAV9血清型。或者，IV或IP注射22月龄雌性小鼠(C57BL/6J，n＝12只小鼠/组)。作为阴性对照，施用具有对照shRNA(cont-i)的编码GFP的scAAV9载体到这些小鼠中。处理后两个月，用钙黄绿素和茜素红标记小鼠，并进行动态组织形态测定以评估体内OB和OC的数量、骨形成速率和OC吸收活性。为了定位表达GFP的scAAV9转导的细胞，在全身进行IVIS-100光学成像。表达GFP的组织在冰冻切片上被进一步处理以用于组织学检查。此外，使用FACS分选从长骨分离表达GFP蛋白的scAAV9转导的OB和/或OC，并通过定量PCR评估SOST、SHN3或CTSK的mRNA水平。对于骨骼分析，进行长骨和椎骨的microCT以分析骨量和结构。
此外，用耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)染色组织切片作为OC分化的标记，并且对I型胶原α1(Coll)和Runx2的免疫组织化学(IHC)作为OB分化的标记。此分析伴有测量OB分化基因表达的骨RNA的定量PCR分析。最后，如在患有骨质疏松症的人患者中一样，使用ELISA通过测量血清骨更新标记(包括I型胶原C端端肽(CTX)、1型前胶原的N端前肽(P1NP)和骨特异的碱性磷酸酶(BSAP))的水平来分析全身OB和OC活性。
实施例2：使用AAV介导的基因添加的用于骨质疏松症的新型基因治疗剂的开发
在一些实施方案中，经由皮下注射的重组PTH肽(1-34aa)或重组PTHrP肽(1-36aa)的间断性治疗在患有骨质疏松症的人患者和动物模型中增加OB活性并促进骨形成。这些肽(特立帕肽(teriparatide)、阿巴帕肽(abaloparatide))被FDA批准，并且目前用于患有骨质疏松症的人患者。在一些实施方案中，分泌性因子DJ-1充当OB与内皮细胞间交叉感知的介导物的作用。在一些实施方案中，DJ-1的治疗促进人MSC中的OB分化和人内皮细胞中的血管生成，同时其抑制OC分化。
该实施例描述了经由肌肉内(IM)注射的编码分泌性成骨因子的scAAV9血清型至动物的递送，经由之，被注射的肌肉充当生物泵，提供了血液循环中这些因子的稳定的高表达，以促进骨质疏松症环境中的骨形成(图21)。为此，将编码人PTH(1-84aa)、人PTHrP(1-140aa)或小鼠DJ-1(1-190aa)的cDNA克隆到pAAVscCB6-EGFP载体中，其在限制性酶位点Agel和Hind3间含有用于蛋白分泌的常规信号肽，并包装到肌肉向性的AAV衣壳(PTH-scAAV9、PTHrP-scAAV9、DJ-1-scAAV9)中。这些cDNA序列在序列一节中描述。
为了在体外验证AAV转导的细胞中这些分泌性成骨因子的产生，使用scAAV9血清型转导小鼠成肌细胞系(C2C12)，并在培养后三天收获上清液和通过ELISA测定分泌因子的水平。或者，裂解细胞并通过免疫印迹评估细胞内蛋白。一旦确认它们的分泌，在成骨培养条件下将这些成骨因子与小鼠原代OB一同温育，且将评估它们的成骨潜力。作为阴性对照，使用编码GFP的scAAV9血清型。
接下来，研究分泌性成骨因子的AAV介导的基因添加在骨质疏松症环境中是否阻止骨质流失。在4月龄雌性小鼠(C57BL/6J，n＝12只小鼠/组)中进行假手术或OVX手术，并在手术后4周经由IM注射施用单剂量的1x1010个基因组拷贝的表达PTH、PTHrP或DJ-1(PTH-scAAV9、PTHrP-scAAV9、DJ-1-scAAV9)的编码GFP的scAAV9血清型到后肢的四头肌中。作为阴性对照，施用编码GFP的scAAV9载体对照(cont-scAAV9)到这些小鼠中。或者，将这些AAV血清型IM注射到22月龄雌性小鼠(C57BL/6J，n＝12只小鼠/组)中。处理后两个月，用钙黄绿素和茜素红标记小鼠，并进行动态组织形态测定以体内评估OB和OC活性。对于骨骼分析，在长骨和椎骨中进行microCT、TRAP染色(OC分化)和针对Coll和Runx2的IHC(OB分化)。最后，通过ELISA或比色分析测量CTX(骨吸收)、P1NP和BSAP(骨形成)以及钙和磷(矿物质稳态)的血清水平。此分析伴有测量OB分化基因表达的骨RNA的qPCR分析。最后，通过ELISA测量转基因(PTH、PTHrP或DJ-1)的血清水平。
实施例3：成骨细胞中Shn3的诱导性缺失促进成年小鼠中的骨形成
为了检查SHN3的短期抑制对骨形成的影响，通过将Shn3fl/fl小鼠与在成熟成骨细胞(Shn3Ocn-Ert)中表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶的骨钙素-CreERT小鼠杂交以产生可诱导的、成骨细胞特异性Shn3-敲除小鼠。将这些小鼠进一步与Cre报告基因RosamT/mG小鼠杂交以可视化表达Cre的细胞(Shn3Ocn-Ert；RosamT/mG)。用他莫昔芬处理Shn3Ocn-Ert；RosamT/mG小鼠导致位于小梁和皮质骨表面的成熟成骨细胞中的GFP表达，表明了Shn3的成骨细胞特异性缺失(图23)。因此，与他莫昔芬处理的对照小鼠相比，这些小鼠显示了小梁骨量的显著增加(图23)。这些结果表明，成熟成骨细胞中Shn3的诱导性缺失足以增加成年小鼠的骨量。
生成编码Cre的scAAV9载体(scAAV9-Cre，图30)以充当用于Shn3fl/fl小鼠中Cre重组的促进剂。首先，在分离自Shn3fl/fl小鼠的培养的COB中用scAAV9-Cre处理Shn3fl/fl小鼠(图30)，并且如预期的，Shn3fl/fl COB中scAAV9介导的Cre表达导致Shn3的缺失和增强的成骨细胞分化(图31)。接下来，经由i.v.施用将scAAV9-Cre注射到两月龄Shn3Ocn-Ert；RosamT/mG小鼠中。注射后两个月，分别通过RT-PCR和荧光显微镜术验证股骨中Cre mRNA的表达(图31)和位于骨表面的成骨细胞谱系细胞中的EGFP蛋白的Cre介导的表达(图30)。与scAAV9-EGFP处理的股骨相比，scAAV 9-Cre处理的股骨显示了shn3 mRNA水平的显著降低(图31)和相对小梁骨量的增加(图31)。这些结果表明，在Shn3fl/fl小鼠中全身递送的scAAV9-Cre靶向成骨细胞谱系细胞并介导Shn3缺失以增加骨量。重要的是，这些结果证明了scAAV9介导的至成骨细胞谱系细胞的转基因递送显著改变骨生理的潜能。
实施例4：通过携带amiR-shn3转基因的scAAV9沉默Shn3促进体内骨形成
已显示人造microRNA(amiR设计进入miRNA支架中的siRNA盒)有效促进体内靶标信息降解。此外，这些设计允许表达盒由pol II启动子驱动，扩展了用scAAV载体控制基因敲低的能力。工程化人工microRNA盒以靶向shn3(amiR-shn3)或对照(amiR-ctrl)。在此设计中，amiR被内含子地(intronically)插入CB启动子和Egfp报告基因之间(图24)，其允许阳性转导(positively transduced)的细胞或组织的视觉追踪。然后，将测试盒包装到AAV9衣壳中。scANV9-amiR-shn3或scAAV9-amiR-ctrl的处理导致体外阳性转导的COB(图32)。与用amiR-ctrl处理的COB相比，scAAV9-amiR-shn3的处理导致shn3 mRNA水平降低～50％，和ibsp表达和矿化作用的相对增加(图32)。
为了检查amiR在体内增强骨合成代谢活性的能力，经由i.a.施用将scAAV9-amiR-shn3载体注射到两月龄小鼠的膝关节中。处理后两个月，分别通过IVIS光学成像(图24)和荧光显微镜术(图24)检查后肢和股骨中的EGFP表达。重要的是，分离自股骨的FACS分选的表达EGFP的细胞显示了shn3 mRNA水平降低～50％(图24)。与经amiR-ctrl处理的股骨相比，经amiR-shn3处理的股骨显示了相对小梁骨量的显著增加(图24)。这些结果表明，scAAV9-amiR-shn3的局部递送在敲低成骨细胞谱系细胞中的SHN3表达中有效，并进而增加体内骨量。
然后检查了scAAV9-amiR-shn3在全身递送后能促进体内骨合成代谢活性的能力。i.v.施用到三月龄小鼠中后两个月，如预期的，主要在后肢、肝和股骨中检测到EGFP表达(图33)。通过scAAV9-amiR-shn3转导的股骨显示了shn3 mRNA水平降低～50％(图24)，和小梁骨量和皮质骨矿物质密度的显著增加(图24)。同样地，体内成骨细胞活性在这些小鼠中增加，如更高的骨形成速率(BFR)、矿物质沉积速率(MAR)和每骨表面的成骨细胞表面(Ob.S/BS)所显示的(图24)。然而，在这些小鼠中，抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)阳性的破骨细胞的数量和骨吸收标记C末端端肽I型胶原(CTX)的血清水平没有改变(图33)。这些结果表明，全身递送的AAV9-amiR-shn3减少成骨细胞谱系细胞中shn3的表达，增强成骨细胞活性，并增加了骨量，而没有破骨细胞数量和功能的任何体内改变。因此，scAAV9-amiR-shn3载体可作为有力的骨合成代谢剂用于治疗骨质疏松症。
实施例4：scAAV9介导的Shn3沉默抵消绝经后骨质疏松症中的骨质流失
Wnt拮抗剂的抑制已被识别为用于骨质疏松症患者中的治疗性干预的一种新方法。先前的研究鉴定了SHN3经由干扰Wnt信号传导而作为成骨细胞分化的抑制剂。卵巢切除(OVX)小鼠是绝经后骨质疏松症的已建立模型。为了进一步证实Shn3的抑制可以是一个有吸引力的促进骨形成而作为骨质疏松症疗法的靶标，将缺少SHN3(Shn3-/-)的三月龄雌性小鼠进行卵巢切除术，并在手术后两个月通过microCT评估骨量。尽管OVX手术诱导WT小鼠中小梁骨量的显著减少，但通过Shn3缺失完全阻止了OVX诱导的骨质流失，因为小梁骨量在假手术-Shn3-/-小鼠和OVX-Shn3-/-小鼠之间相当(图25)。因此，靶向Shn3具有阻止绝经后骨质疏松症中骨质流失的治疗潜力。
为了测试scAAV9-amiR-shn3在绝经后骨质疏松症中的治疗效果，对三月龄野生型雌性小鼠进行假手术或OVX手术，且在手术后六周以i.v.注射载体(图25)。七周后，经处理的股骨显示了有效的转导，导致～50％的shn3敲低(图25)。如预期的，表达amiR-ctrl的OVX小鼠相对于假手术小鼠显示了小梁骨量的显著降低。然而，当用scAAV9-amiR-shn3处理时，骨质流失在OVX小鼠的股骨中完全逆转，如通过更高的小梁BV/TV、厚度和连接密度所显示的(图25和图34)。同样地，相对于表达amiR-ctrl的OVX小鼠，这些小鼠中的股骨BFR和MAR增加，表明增强的体内成骨细胞活性(图25)。值得注意的是，通过scAAV9-amiR-shn3实现的shn3沉默不改变体内破骨细胞功能，因为TRAP阳性破骨细胞的数量和骨吸收活性在表达amiR-ctrl和amiR-shn3的OVX小鼠之间相当(图34)。最后，生物力学测试显示，经scAAV9-amiR-shn3处理的小鼠的股骨的强度和刚度受到相当的保护以免受OVX诱导的骨质流失(图25)，表明scAAV9介导的shn3沉默改善骨质疏松症小鼠的临床上有意义的终点。综上所述，这些结果证明，在OVX诱导的骨质疏松症发作后，全身递送的scAAV9-amiR-shn3促进骨形成并增强骨的临床相关的机械性能。
实施例5：骨靶向肽基序到AAV9衣壳上的接枝改善骨特异性转导
检查了新AAV9.DSS-Nter亲骨(bone-tropic)衣壳递送治疗性amiR-shn3转基因(scAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3)至OVX小鼠的能力。对三月龄雌性小鼠进行假手术或OVX手术，并在手术后六周i.v.注射scAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3。注射后七周，动物在动物的整个后部(图37)和股骨的成骨细胞谱系细胞(图37)中表现了强的EGFP表达，表明强烈的转导。相对于表达amiR-ctrl的假手术或OVX股骨，shn3 mRNA水平在表达amiR-shn3的OVX股骨中显著降低(图27)。尽管表达amiR-ctrl的OVX小鼠相对于假手术小鼠显示了小梁骨量的显著减少，但骨质流失在经scAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3处理的OVX小鼠的股骨(图27)和腰椎骨(图27，图37)中完全逆转，如通过更高的小梁BV/TV、厚度、数量和连接密度所显示的。综上所述，这些结果证明，通过亲骨AAV9.DSS-Nter衣壳的amiR-shn3的递送能抵消绝经后骨质疏松症中的骨质流失。
实施例6：骨质疏松症的人患者和动物模型中骨质流失的抑制
针对NF-κβ(RANK、TNFRSF11A)配体的受体激活的人源化生物抗体干扰RANK配体(RANKL)和RANK之间的相互作用，其抑制破骨细胞分化所需的RANK信号传导。因此，它的治疗通过抑制破骨细胞介导的骨吸收防止患有骨质疏松症的人患者和动物模型中的骨质流失。
为了通过沉默破骨细胞前体细胞中的RANK而抑制破骨细胞分化，从而抑制骨质疏松症的人患者和动物模型中的骨质流失，检查了新AAV9.DSS-Nter亲骨衣壳递送治疗性amiR-33-mRANKi转基因(scAAV9.DSS-Nter-amiR-mRANKi 1/2)的能力。
方法
scAAV载体设计与生产
以gBlock形式合成amiR-33-ctrl和amiR-33-shn3的DNA序列，并将其在限制性酶切位点(Pstl和Bg1II)克隆到pAAVsc-CB6-Egfp质粒的内含子区域中。pAAVsc-CB6-Cre载体通过用Cre重组酶替换Egfp报告基因产生。通过测序验证构建体。先前的研究表明，转基因小鼠中靶向小鼠Shn3的shRNA的多西环素(doxycycline)诱导的表达导致了shn3 mRNA水平的降低和骨量的相对增加。相同的靶向序列用于产生amiR-33-shn3盒。将pAAV-amiR-ctrl和pAAV-amiR-shn3构建体包装到AAV9衣壳中。此外，将pAAVsc-CB6-Egfp构建体包装到AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9-HR、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39和AAVrh43衣壳中。如先前所述，通过HEK293细胞的瞬时转染进行scAAV的生产，通过CsCl沉淀进行纯化，通过使用Egfp引物/探针组在QX200 ddPCR系统(Bio-Rad)上的微滴式数字PCR(ddPCR)进行滴定。表3列出了gBlock和用于ddPCR的寡核苷酸的序列。
表3：引物、探针和gblock的序列
Figure BDA0002767412420000591
Figure BDA0002767412420000601
骨靶向scAAV9载体的产生
对编码骨靶向肽基序DSS(AspSerSer)6(SEQ ID NO:16)的DNA序列进行密码子优化。为了产生Q588-DSS-A589衣壳(DSS-588)，对表达AAV2rep基因和AAV9 cap基因的质粒(pAAV2/9)进行修饰以将DSS序列在Q588和A589密码子之间插入AAV9 cap基因中(pAAV2/9.Q588-DSS-A589)。此质粒可用于scAAV生产。为了产生DSS-Nter衣壳，使用了一对质粒。首先，突变pAAV2/9中VP2的起始密码子(ACG→ACC)，因此仅VP1和VP3被表达(pAAV2/9.noVP2)。在另一个质粒中，将DSS序列融合到AAV9 VP2 ORF的N端。将Kozak序列和ATG起始密码子直接置于DSS序列的上游，以允许由CMV启动子驱动的最佳表达[pcDNA.DSS-VP2(AAV9)]。质粒pAAV2/9.noVP2和pcDNA.DSS-VP2(AAV9)用于scAAV生产。
细胞
从Sigma购入软骨形成的ATDC5细胞，并培养在添加有2％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM/Ham’s F12培养基中。此外，通过使用II型胶原酶(50mg/ml，Worthington，LS004176)和中性蛋白酶II(100mg/ml，Roche，10165859001)，从五日龄野生型新生鼠(C57BL/6J)的颅盖中分离出原代骨原细胞(COB)，并保持在含有10％FBS(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Corning)、1％青霉素/链霉素(Corning)和1％非必需氨基酸(Corning)的α-MEM培养基(Gibco)中。用抗坏血酸(200μM，Sigma，A8960)和β-甘油磷酸酯(10mM，Sigma，G9422)分化COB。最后，从两月龄小鼠(C57BL/6J)的股骨和胫骨中冲洗出骨髓细胞，并培养在含有10％FBS和20ng/ml M-CSF(R&D系统)的α-MEM培养基中的培养皿中，以获得源自骨髓的破骨细胞前体细胞(BM-OCP)。12小时后，将非贴壁细胞重新铺板到组织培养皿中，并在相同的培养基中培养三天。BM-OCP随后在RAMKL(20ng/ml；R&D系统)和M-CSF(20ng/ml；R&D系统)存在下持续六天分化为破骨细胞。
小鼠
如先前所述产生Shn3-/-小鼠和Shn3fl/fl小鼠，并分别保持在BALB/cJ和C57BL/6J背景上。将具有成熟成骨细胞中他莫昔芬诱导的Cre重组酶表达的骨钙素-ERT/Cre小鼠与Shn3fl/fl小鼠杂交，以获得Shn3fl/fl；Ocn-ERT/Cre小鼠。为了标记表达Cre的细胞，将Shn3fl /fl；Ocn-ERT/Cre小鼠进一步与RosamT/mG cre报告基因小鼠杂交。为了ERT/Cre的出生后激活，每天一次连续5天将玉米油(Sigma)中的100mg/kg他莫昔芬(Sigma)腹膜内注射到2月龄雌性小鼠中。
通过尾基因组DNA上的PCR确定小鼠基因型。引物序列应要求提供。在所有实验中均使用和分析同窝对照。
MicroCT分析
MicroCT用于对小梁和皮质骨微结构的定性和定量评估，并由不知道所分析的动物的基因型的研究人员进行。用10％中性缓冲的福尔马林固定切除自指定小鼠的股骨，并使用microCT 35(Scanco Medical)以7μm的空间分辨率对其进行扫描。对于股骨远端的小梁骨分析，对始自生长板近侧280μm的上部2.1mm区域进行轮廓化(contoured)。对于股骨的皮质骨分析，使用了长度为0.6mm的干体中段区域。使用12μm的等向性体素尺寸进行L4脊髓节段的MicroCT扫描。通过基于二值化图像的距离转换的方法从轮廓化的2D图像获得3D重建图像。或者，使用Inveon多模态3D可视化程序(Siemens Medical Solutions USA，Inc)来生成microCT模态的多个静态或动态体积的融合3D视图。展示的所有图像是各自基因型的代表(n>5)。
组织学、组织形态测定和免疫荧光
对于组织学分析，从经rAAV载体处理的小鼠解剖出股骨和椎骨，在10％中性缓冲的福尔马林中固定2天，并用5％四钠EDTA脱钙2至4周。通过乙醇系列使组织脱水，在二甲苯中清洗两次，包埋在石蜡中，并沿冠状板从前向后以6μm的厚度进行切片。用苏木精和曙红(H&E)或抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)对脱钙的股骨切片进行染色。
对于动态组织形态测定分析，以六天间隔将溶解于2％碳酸氢钠溶液中的25mg/kg钙黄绿素(Sigma，C0875)和50mg/kg茜素-3-甲基亚氨基二乙酸(Sigma，A3882)皮下注射到小鼠中。在10％中性缓冲的福尔马林中固定两天后，将未脱钙的股骨样品包埋在甲基丙烯酸甲酯中，并将近端干骺端纵向切片(5μm)，并以McNeal氏三色染色用于类骨质评估，甲苯胺蓝用于成骨细胞，和TRAP用于破骨细胞。明确目标区域，并使用接口到半自动分析系统(Osteometrics)的Nikon Optiphot 2显微镜来测量骨形成率/骨表面(BFR/BS)、矿物质沉积率(MAR)、骨表面(BS)、成骨细胞表面(Ob.S/BS)和破骨细胞表面(Oc.S/BS)。测量在两个切片/样品(相隔～25μm)上进行并在归一化前求和，以获得根据ASBMR标准的单个测量/样品。此方法已经经过广泛的质量控制和验证，并且结果由两位不同的研究人员以盲目方式进行评估。
对于免疫荧光，收集解剖自经rAAV处理的小鼠的新鲜股骨和椎骨，并立即固定于冰冷的4％多聚甲醛溶液中两天。在0.5M EDTA pH 7.4于4℃以持续摇动(年龄≥1周)进行半脱钙五天，并随后用一天的20％蔗糖磷酸盐缓冲液和第二天的25％蔗糖磷酸盐缓冲液的混合物进行浸润。将所有样品包埋在25％蔗糖溶液和OCT化合物(Sakura)的50/50混合物中，并使用低温恒温器(Leica)切成12μm厚的径向切片。如先前所述进行免疫荧光染色和分析。简言之，在用0.2％Triton X-100处理10分钟后，在室温下用5％驴血清将切片封闭30分钟，并在4℃下用抗BGLAP抗体(sc-365797，Santa Cruz，1:150)温育过夜。用驴抗大鼠IgGAlexa-594(1:500，Molecular Probes)使一抗可视化。用DAPI复染细胞核。使用OlympusIX81共聚焦显微镜或Leica TCS SP5 II Zeiss LSM-880共聚焦显微镜成像样品。
生物力学分析
使用位于骨骼研究成像和生物力学测试中心(Center for Skeletal ResearchImaging and Biomechanical Testing Core)的电力机械测试仪(Electroforce 3230，Bose Corporation，Eden Prairie，MN)在三点弯曲中机械性测试股骨。弯曲夹具的底部跨度长度为8mm。通过在位移控制中以0.05mm/sec的速度用力移动的负载点来进行测试，并以60Hz收集位移数据。在测试过程中，所有骨都以相同的方向放置，且颅骨表面置于支撑物上并承受张力。基于来自测试的力和位移数据和用microCT测量的干体中段几何形状来计算弯曲刚度(El，N-mm2)、表观弹性模量(Eapp，MPa)、极限力矩(Mult，N-mm)、表观极限应力(σapp，MPa)、断裂功(Wfrac，mJ)和表观韧度(Uapp，mJ/mm3)。断裂功是导致股骨断裂所需的能量，且它是通过使用黎曼求和法(Riemann Sum method)求出力-位移曲线下的面积来计算的。使用力-位移曲线的线性部分计算弯曲刚度。在计算表观弹性模量时，使用最小惯性力矩(Imin)。
ELISA分析
根据制造商说明通过使用试剂盒进行CTX1 ELISA(Abclonal MC0850)分析。
成骨细胞分化分析
对于碱性磷酸酶(ALP)染色，用10％中性福尔马林缓冲液固定成骨细胞，并用含有Fast Blue(Sigma，FBS25)和萘酚AS-MX(Sigma，855)的溶液染色。或者，将成骨细胞与10倍稀释的Alamar Blue溶液(Invitrogen，DAL1100)一起温育以进行细胞增殖。随后，洗涤细胞并将其与含有6.5mM Na2CO3、18.5mM NaHCO3、2mM MgCl2和磷酸酶底物(Sigma，S0942)的溶液一起温育，并通过光度计(Biorad)测量ALP活性。
为了评估成熟成骨细胞中细胞外基质矿化作用，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并在室温下在70％EtOH中固定15分钟。将固定的细胞用蒸馏水洗涤两次，并随后用2％茜素红溶液(Sigma，A5533)染色5分钟。然后将细胞用蒸馏水洗涤三遍，并检查钙沉积物的存在。通过乙酸提取法定量矿化作用。
定量RT-PCR分析
使用QIAzol(QIAGEN)从细胞纯化总RNA，并使用来自Applied Biosystems的High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA。使用
Figure BDA0002767412420000641
Green PCR MasterMix(Bio-Rad)和CFX连接RT-PCR检测系统(Bio-Rad)进行定量RT-PCR。为了测量骨组织中的Shn3 mRNA水平，在去除骨髓后，将胫骨在液氮中速冻30秒，并随后在1ml QIAzol中均质化1分钟。
或者，将解剖自经rAAV9处理的小鼠的股骨和胫骨在含有10mM HEPES(pH 7.2)(CellGro)的汉克斯平衡盐溶液(Life Technologies)中压碎，然后用2.5mg/mL胶原酶A(Roche)和1单位/mL中性蛋白酶II(Roche)于37℃在温和搅拌下酶消化15分钟。将所得细胞悬浮液过滤(40μm)，使用含有0.5％BSA(组分V)和2mM EDTA的PBS(pH 7.2)洗涤。洗涤后，将细胞重悬于含2mM EDTA和1μg/mL 4-6,联脒-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS(pH 7.2)中(活/死排除)，并使用FACS Aria II SORP细胞分选仪(Becton Dickinson)在排除DAPI+细胞和双联体(doublet)下分选表达EGFP的细胞。使用QIAzol从细胞中纯化总RNA。表3中描述了用于PCR的引物。
免疫印迹分析
在TNT裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mMEDTA、1mM EGTA、50mM NaF、1mM Na3VO4、1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))中裂解细胞，并使用DC蛋白测定法(Bio-Rad)测量蛋白量。将等量的蛋白进行SDS-PAGE，转膜至Immunobilon-P膜(Millipore)，用抗GFP抗体(JL-8，632381，Takara，1:1000)、抗Cre重组酶抗体(ab24607，Abcam，1:1000)、抗Hsp90抗体(675402，Biolegend，1:1000)进行免疫印迹，并用ECL(Thermo fisher scientific)进行显色。用抗Hsp90抗体的免疫印迹作为上样对照。或者，将解剖的股骨和软组织在RIPA裂解缓冲液(89900，Thermo fisher scientific)中均质化，并将组织裂解物进行免疫印迹分析。
体外转导成骨细胞、破骨细胞或软骨细胞的rAAV血清型的筛选
将ATDC5细胞或原代COB以1×104个细胞/孔的密度铺板在24孔板中，并在24小时后将它们与包装有CB-Egfp报告基因转基因的rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV6.2、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAVrh8、rAAVrh10、rAAVrh39或rAAVrh43载体以三种不同的滴度(109-1011/mL个基因组拷贝)一起温育。48小时后，用PBS洗涤细胞，并通过EVOS FL成像系统(Thermo fisher scientific)监测EGFP的表达。或者，在TNT裂解缓冲液中裂解细胞，并通过用抗EGFP抗体的免疫印迹来评估EGFP表达和使用Image J软件来定量。最后，将原代骨髓单核细胞以5×105个细胞/孔的密度铺板在24孔板中，并在10ng/ml RAMKL和20ng/mlM-CSF的存在下培养两天，以分化成破骨细胞前体细胞。用rAAV-Egfp载体处理后三天，通过EVOS FL成像系统和通过用抗EGFP抗体的免疫印迹来评估EGFP的表达。
对于体内筛选rAAV载体，将10μL的rAAV-Egfp载体(1×1011GC；5×1012GC/kg)关节内(i.a.)注射到两月龄雄性小鼠(Jackson Laboratory)的膝关节中。注射后两周，解剖股骨和膝关节用于IVIS-100光学成像或冰冻切片。
rAAV9介导的Cre重组酶或amiR-shn3递送对骨形成的影响
对于局部递送，将10μL的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的rAAV9(1×1011GC；5×1012GC/kg)i.a.注射到两月龄雄性小鼠的膝关节中。注射后两个月，解剖股骨用于microCT分析。
对于全身递送，将200μL的携带Egfp、Cre、amiR-ctrl或amiR-shn3的rAAV9(4×1011GC；2×1013GC/kg)静脉内(i.v.)注射到小鼠中，并在两个月后，以六天的间隔对小鼠皮下注射钙黄绿素和茜素-3-甲基亚氨基二乙酸以用于动态组织形态测定分析。使用未标记的小鼠以使用IVIS-100光学成像或冰冻切片监测EGFP表达。
全身递送的rAAV9-amiR-shn3在绝经后骨质疏松症小鼠模型中的治疗效果
通过麻醉和双侧卵巢切除(OVX)三月龄雌性小鼠(Jackson Laboratory)产生绝经后骨质疏松症的小鼠模型。手术后六周，对假手术或OVX小鼠i.v.注射200μL的携带amiR-ctrl或amiR-shn3的rAAV9或rAAV9.DSS-Nter(4×1011GC；2×1013GC/kg)。将小鼠随机分成具有rAAV9或rAAV9.DSS-Nter的六组：假手术+rAAV9-amiR-ctrl、OVX+rAAV9-amiR-ctrl、OVX+rAAV9-amiR-shn3、假手术+rAAV9.DSS-Nter-amiR-ctrl、OVX+rAAV9.DSS-Nter-amiR-ctrl、OVX+rAAV9.DSS-Nter-amiR-shn3。注射后七周，以六天的间隔对小鼠皮下注射钙黄绿素和茜素-3-甲基亚氨基二乙酸以用于动态组织形态测定分析。使用未标记的小鼠以使用IVIS-100光学成像或冰冻切片监测EGFP表达。
统计方法
所有数据均以平均值±s.e.m表示。在以下假设上计算样本量：所测参数的30％差异被认为与预期平均值的10-20％的σ估计是生物学上显著的。α和β分别设置为.05和0.8的标准值。没有动物或样品被排除在分析之外，并且在适用的情况下将动物随机化到处理组和对照组。对于相关的数据分析，在相关的情况下，首先进行Shapiro-Wilk正态性检验以用于检查组的正态分布。若通过了正态性检验，则两尾、未配对学生t检验，并且若正态性检验失败，则使用Mann-Whitney检验用于两组之间的比较。对于三组或四组的比较，若通过了正态性检验，则使用单向ANOVA，随之对所有成对的组进行Tukey氏多重比较检验。若正态性检验失败，则进行Kruskal-Wallis检验，并随之进行Dunn氏多重比较检验。使用GraphPadPRISM软件(v6.0a，La Jolla，CA)进行统计分析。P<0.05被认为是统计学上显著的。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；和****，P<0.0001。
序列
>SEQ ID NO:1；amiR-33-mSHN3i-1:
tttgtcttttatttcaggtcccAGATCTAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGTACAAACTACTTGAGAGCAGGTGTTCTGGCAATACCTGCCTGCTCTGTAATAGTTTGTACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCCTGCAGgggatccggtggtggtgcaaatca
>SEQ ID NO:2；amiR-33-mSHN3i-2:
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>SEQ ID NO:3；amiR-33-hSHN3i-1:
GtcttttatttcaggtcccagatcttAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGtttccatggtaagttcaaggcTGTTCTGGCAATACCTGGCCTTGAAGATGCCATGGAAACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCccctgcaggggatccggtggtggtgcaaat
>SEQ ID NO:4；amiR-33-mCTSKi-1:
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>SEQ ID NO:5；amiR-33-mCTSKi-2:
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>SEQ ID NO:6；amiR-33-hCTSK-1:
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>SEQ ID NO:7；amiR-33-hCTSK-2:
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>SEQ ID NO:8；amiR-33-mSOSTi-1:
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>SEQ ID NO:9；amiR-33-mSOSTi-2:
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>SEQ ID NO:10；amiR-33-hSosT-1:
GtcttttatttcaggtcccagatcttAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGatggtcttgttgttctccagcTGTTCTGGCAATACCTGGCTGGAGATGAGCAAGACCATCACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCccctgcaggggatccggtggtggtgcaaat
>SEQ ID NO:11；amiR-33-hSosT-2:
GtcttttatttcaggtcccagatcttAGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGACGtCtttGGtCtCAAAGGGGTGTTCTGGCAATACCTGCCCCTTTGTCATCAAAGACGTCACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCCccctgcaggggatccggtggtggtgcaaat
>SEQ ID NO:12；人PTH(1-84aa):
ggaattgtacccgcggccgatccAccggtGCCACCATGATACCTGCAAAAGACATGGCTAAAGTTATGATTGTCATGTTGGCAATTTGTTTTCTTACAAAATCGGATGGGAAATCTGTTAAGAAGAGATCTGTGAGTGAAATACAGCTTATGCATAACCTGGGAAAACATCTGAACTCGATGGAGAGAGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCACAATTTTGTTGCCCTTGGAGCTCCTCTAGCTCCCAGAGATGCTGGTTCCCAGAGGCCCCGAAAAAAGGAAGACAATGTCTTGGTTGAGAGCCATGAAAAAAGTCTTGGAGAGGCAGACAAAGCTGATGTGAATGTATTAACTAAAGCTAAATCCCAGTGAagcttatcgataccgtcgactagagctc
>SEQ ID NO:13；人PTHrP(1-140aa):
ggaattgtacccgcggccgatccAccggtGCCACCATGCAGCGGAGACTGGTTCAGCAGTGGAGCGTCGCGGTGTTCCTGCTGAGCTACGCGGTGCCCTCCTGCGGGCGCTCGGTGGAGGGTCTCAGCCGCCGCCTCAAAAGAGCTGTGTCTGAACATCAGCTCCTCCATGACAAGGGGAAGTCCATCCAAGATTTACGGCGACGATTCTTCCTTCACCATCTGATCGCAGAAATCCACACAGCTGAAATCAGAGCTACCTCGGAGGTGTCCCCTAACTCCAAGCCCTCTCCCAACACAAAGAACCACCCCGTCCGATTTGGGTCTGATGATGAGGGCAGATACCTAACTCAGGAAACTAACAAGGTGGAGACGTACAAAGAGCAGCCGCTCAAGACACCTGGGAAGAAAAAGAAAGGCAAGCCCGGGAAACGCAAGGAGCAGGAAAAGAAAAAACGGCGAACTCGCTCTGCCTGGTTAGACTCTGGAGTGACTGGGAGTGGGCTAGAAGGGGACCACCTGTCTGACACCTCCACAACGTCGCTGGAGCTCGATTCACGGTAAagcttatcgataccgtcgactagagctc
>SEQ ID NO:14；小鼠DJ-1(1-190aa):
ggaattgtacccgcggccgatccaccggtcGCCACCATGGGATGGAGCTGTATTATCCTGTTTCTCGTCGCTACTGCCACCGGAGCTCATTCCGCTTCCAAAAGAGCTCTGGTCATCCTGGCCAAAGGAGCAGAGGAGATGGAGACAGTGATTCCTGTGGATGTCATGCGGCGAGCCGGGATCAAAGTCACTGTTGCAGGCTTGGCTGGGAAGGACCCCGTGCAGTGTAGCCGTGATGTAATGATTTGTCCAGATACCAGTCTGGAAGATGCAAAAACGCAGGGACCATACGATGTGGTGGTTCTTCCAGGAGGAAATCTGGGTGCACAGAATTTATCTGAGTCGCCTATGGTGAAGGAGATCCTCAAGGAGCAGGAGAGCAGGAAGGGCCTCATAGCTGCCATCTGTGCAGGTCCTACGGCTCTGTTGGCTCACGAAGTAGGTTTTGGATGCAAGGTCACAACACACCCACTGGCTAAGGACAAAATGATGAATGGCAGTCACTACAGC TACTCAGAGAGCCGCGTGGAGAAGGACGGCCTGATCCTCACCAGCCGCGGGCCGGGGACCAGCTTTGAGTTTGCACTAGCCATTGTGGAGGCACTCGTGGGGAAAGACATGGCCAACCAAGTGAAGGCACCGCTTGTTCTCAAAGACTAGTAAaagcttatcgataccgtcgactagagctcgctg
>SEQ ID NO:15；人DJ-1(1-190aa):
ggaattgtacccgcggccgatccaccggtc GCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATT ATC CTGTTTCTC GTC GCT ACT GCC ACC GGA GCT CAT TCCGCTTCCAAAAGAGCTCTGGTCATCCTGGCTAAAGGAGCAGAGGAAATGGAGACGGTCATCCCTGTAGATGTCATGAGGCGAGCTGGGATTAAGGTCACCGTTGCAGGCCTGGCTGGAAAAGACCCAGTACAGTGTAGCCGTGATGTGGTCATTTGTCCTGATGCCAGCCTTGAAGATGCAAAAAAAGAGGGACCATATGATGTGGTGGTTCTACCAGGAGGTAATCTGGGCGCACAGAATTTATCTGAGTCTGCTGCTGTGAAGGAGATACTGAAGGAGCAGGAAAACCGGAAGGGCCTGATAGCCGCCATCTGTGCAGGTCCTACTGCTCTGTTGGCTCATGAAATAGGTTTTGGAAGTAAAGTTACAACACACCCTCTTGCTAAAGACAAAATGATGAATGGAGGTCATTACACCTACTCTGAGAATCGTGTGGAAAAAGACGGCCTGATTCTTACAAGCCGGGGGCCTGGGACCAGCTTCGAGTTTGCGCTTGCAATTGTTGAAGCCCTGAATGGCAAGGAGGTGGCGGCTCAAGTGAAGGCTCCACTTGTTCTTAAAGACTAGTAAaagcttatcgataccgtcgactagagctcgctg
>SEQ ID NO:16；(AspSerSer)6骨靶向肽
DSSDSSDSSDSSDSSDSS
>SEQ ID NO:17；HABP-19,骨靶向肽
CγEPRRγEVAγELγEPRRγEVAγEL,
γ(Gla残基):γ-羧化谷氨酸(Glu)通过维生素K依赖的γ-羧化衍生自Glu。
>SEQ ID NO 18:AAV衣壳1；
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>SEQ ID NO 19:AAV衣壳2；
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>SEQ ID NO 20:AAV衣壳3B；
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>SEQ ID NO 21:AAV衣壳4:
MTDGYLPDWLEDNLSEGVREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKKLVFEDETGAGDGPPEGSTSGAMSDDSEMRAAAGGAAVEGGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGHVTTTSTRTWVLPTYNNHLYKRLGESLQSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGMRPKAMRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSSYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMVPQYGYCGLVTGNTSQQQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEITYSFEKVPFHSMYAHSQSLDRLMNPLIDQYLWGLQSTTTGTTLNAGTATTNFTKLRPTNFSNFKKNWLPGPSIKQQGFSKTANQNYKIPATGSDSLIKYETHSTLDGRWSALTPGPPMATAGPADSKFSNSQLIFAGPKQNGNTATVPGTLIFTSEEELAATNATDTDMWGNLPGGDQSNSNLPTVDRLTALGAVPGMVWQNRDIYYQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLIGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPATTFSSTPVNSFITQYSTGQVSVQIDWEIQKERSKRWNPEVQFTSNYGQQNSLLWAPDAAGKYTEPRAIGTRYLTHHL
>SEQ ID NO 22:AAV衣壳5:
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>SEQ ID NO 23:AAV衣壳6:
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>SEQ ID NO 24:AAV衣壳6.2；
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>SEQ ID NO 25:AAV衣壳7:
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>SEQ ID NO 26:AAV衣壳8:
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>SEQ ID NO 27:AAV衣壳9:
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>SEQ ID NO 29:AAV衣壳rh10:
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>SEQ ID NO 30:AAV衣壳rh39:
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>SEQ ID NO 34:AAV衣壳2/2-125:
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>SEQ ID NO:69人Schnurri-3核苷酸序列
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>SEQ ID NO:70人Schnurri-3氨基酸序列
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>SEQ ID NO:56；amiR-33-mRANKi-2:
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>SEQ ID NO:57；骨吸收肽(8-mer)
DDDDDDDD
>SEQ ID NO:58；骨吸收肽(9-mer)
DDDDDDDDD
>SEQ ID NO:59；骨吸收肽(10-mer)
DDDDDDDDDD
>SEQ ID NO:60；骨吸收肽(11-mer)
DDDDDDDDDDD
>SEQ ID NO:61；骨吸收肽(12-mer)
DDDDDDDDDDDD
>SEQ ID NO:62；骨吸收肽(13-mer)
DDDDDDDDDDDDD
>SEQ ID NO:63；骨吸收肽(14-mer)
DDDDDDDDDDDDDD
序列表
<110> 马萨诸塞大学（沃斯特）（University of Massachusetts at Worcester）
<120> 用于治疗骨病的基因治疗剂
<130> U0120.70099WO00
<140> 尚未指定
<141> 同上
<150> US 62/799,843
<151> 2019-02-01
<150> US 62/647,595
<151> 2018-03-23
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 1
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtacaaac tacttgagag caggtgttct ggcaatacct gcctgctctg 180
taatagtttg tacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 2
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 2
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgactacag gtactcacaa gctctgttct ggcaatacct ggagcttgtc 180
tgcacctgta gtcacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 3
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 3
gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60
cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120
gggcagctgt gtttccatgg taagttcaag gctgttctgg caatacctgg ccttgaagat 180
gccatggaaa cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240
agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaat 325
<210> 4
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 4
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtttcatc atagtacaca cctctgttct ggcaatacct ggaggtgtga 180
tccatgatga aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 5
<211> 285
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 5
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgttactgt aggatcgaga gggatgttct ggcaatacct gtccctctcc 180
ttactacagt aacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taagg 285
<210> 6
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 6
gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60
cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120
gggcagctgt gattatcgct attgcagctt tctgttctgg caatacctgg aaagctggta 180
cagcgataat cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240
agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaat 325
<210> 7
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 7
gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60
cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120
gggcagctgt gtcagattat cgctattgca gctgttctgg caatacctgg ctgcaattcc 180
aataatctga cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240
agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaat 325
<210> 8
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 8
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgacaagta ggcagatgag gcactgttct ggcaatacct ggtgcctcaa 180
gtacctactt gtcacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 9
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 9
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtgacctc tgtggcatca ttcctgttct ggcaatacct gggaatgatc 180
gcgcagaggt cacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 10
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 10
gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60
cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120
gggcagctgt gatggtcttg ttgttctcca gctgttctgg caatacctgg ctggagatga 180
gcaagaccat cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240
agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaat 325
<210> 11
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 11
gtcttttatt tcaggtccca gatcttaggg ctctgcgttt gctccaggta gtccgctgct 60
cccttgggcc tgggcccact gacagccctg gtgcctctgg ccggctgcac acctcctggc 120
gggcagctgt gacgtctttg gtctcaaagg ggtgttctgg caatacctgc ccctttgtca 180
tcaaagacgt cacggaggcc tgccctgact gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta 240
agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc gtggggaata aggacagtgt cacccccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaat 325
<210> 12
<211> 411
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtg ccaccatgat acctgcaaaa gacatggcta 60
aagttatgat tgtcatgttg gcaatttgtt ttcttacaaa atcggatggg aaatctgtta 120
agaagagatc tgtgagtgaa atacagctta tgcataacct gggaaaacat ctgaactcga 180
tggagagagt agaatggctg cgtaagaagc tgcaggatgt gcacaatttt gttgcccttg 240
gagctcctct agctcccaga gatgctggtt cccagaggcc ccgaaaaaag gaagacaatg 300
tcttggttga gagccatgaa aaaagtcttg gagaggcaga caaagctgat gtgaatgtat 360
taactaaagc taaatcccag tgaagcttat cgataccgtc gactagagct c 411
<210> 13
<211> 591
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtg ccaccatgca gcggagactg gttcagcagt 60
ggagcgtcgc ggtgttcctg ctgagctacg cggtgccctc ctgcgggcgc tcggtggagg 120
gtctcagccg ccgcctcaaa agagctgtgt ctgaacatca gctcctccat gacaagggga 180
agtccatcca agatttacgg cgacgattct tccttcacca tctgatcgca gaaatccaca 240
cagctgaaat cagagctacc tcggaggtgt cccctaactc caagccctct cccaacacaa 300
agaaccaccc cgtccgattt gggtctgatg atgagggcag atacctaact caggaaacta 360
acaaggtgga gacgtacaaa gagcagccgc tcaagacacc tgggaagaaa aagaaaggca 420
agcccgggaa acgcaaggag caggaaaaga aaaaacggcg aactcgctct gcctggttag 480
actctggagt gactgggagt gggctagaag gggaccacct gtctgacacc tccacaacgt 540
cgctggagct cgattcacgg taaagcttat cgataccgtc gactagagct c 591
<210> 14
<211> 696
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 14
ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtc gccaccatgg gatggagctg tattatcctg 60
tttctcgtcg ctactgccac cggagctcat tccgcttcca aaagagctct ggtcatcctg 120
gccaaaggag cagaggagat ggagacagtg attcctgtgg atgtcatgcg gcgagccggg 180
atcaaagtca ctgttgcagg cttggctggg aaggaccccg tgcagtgtag ccgtgatgta 240
atgatttgtc cagataccag tctggaagat gcaaaaacgc agggaccata cgatgtggtg 300
gttcttccag gaggaaatct gggtgcacag aatttatctg agtcgcctat ggtgaaggag 360
atcctcaagg agcaggagag caggaagggc ctcatagctg ccatctgtgc aggtcctacg 420
gctctgttgg ctcacgaagt aggttttgga tgcaaggtca caacacaccc actggctaag 480
gacaaaatga tgaatggcag tcactacagc tactcagaga gccgcgtgga gaaggacggc 540
ctgatcctca ccagccgcgg gccggggacc agctttgagt ttgcactagc cattgtggag 600
gcactcgtgg ggaaagacat ggccaaccaa gtgaaggcac cgcttgttct caaagactag 660
taaaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctg 696
<210> 15
<211> 696
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtc gccaccatgg gatggagctg tattatcctg 60
tttctcgtcg ctactgccac cggagctcat tccgcttcca aaagagctct ggtcatcctg 120
gctaaaggag cagaggaaat ggagacggtc atccctgtag atgtcatgag gcgagctggg 180
attaaggtca ccgttgcagg cctggctgga aaagacccag tacagtgtag ccgtgatgtg 240
gtcatttgtc ctgatgccag ccttgaagat gcaaaaaaag agggaccata tgatgtggtg 300
gttctaccag gaggtaatct gggcgcacag aatttatctg agtctgctgc tgtgaaggag 360
atactgaagg agcaggaaaa ccggaagggc ctgatagccg ccatctgtgc aggtcctact 420
gctctgttgg ctcatgaaat aggttttgga agtaaagtta caacacaccc tcttgctaaa 480
gacaaaatga tgaatggagg tcattacacc tactctgaga atcgtgtgga aaaagacggc 540
ctgattctta caagccgggg gcctgggacc agcttcgagt ttgcgcttgc aattgttgaa 600
gccctgaatg gcaaggaggt ggcggctcaa gtgaaggctc cacttgttct taaagactag 660
taaaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctg 696
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 16
Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 是γ-羧化谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 是γ-羧化谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 是γ-羧化谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 是γ-羧化谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 是γ-羧化谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 是γ-羧化谷氨酸
<400> 17
Cys Glu Pro Arg Arg Glu Val Ala Glu Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val
1 5 10 15
Ala Glu Leu
<210> 18
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 18
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
<210> 19
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 19
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 20
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 20
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435 440 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
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<210> 21
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 21
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<210> 22
<211> 724
<212> PRT
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<220>
<223> 合成的多肽
<400> 22
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<210> 23
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 23
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<210> 24
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 24
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 25
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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp Asn
260 265 270
Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr
405 410 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe
450 455 460
Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465 470 475 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly Gln
485 490 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His Leu
500 505 510
Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr His
515 520 525
Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile Phe
530 535 540
Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val Met
545 550 555 560
Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565 570 575
Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala Pro
580 585 590
Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595 600 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610 615 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625 630 635 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645 650 655
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660 665 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675 680 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690 695 700
Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly
705 710 715 720
Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725 730 735
Leu
<210> 32
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 32
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Gln Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
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290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
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370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Asn Ala Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
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465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
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705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
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<210> 33
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 33
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
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Lys Pro Ala Glu Arg His Gln Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
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225 230 235 240
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275 280 285
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Asn Ala Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
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<210> 34
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 34
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
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85 90 95
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195 200 205
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275 280 285
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 35
agaggccatt cagacgagtg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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ctgcggaagc tgagagatgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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cacaatatca aggatatcga cgtga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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acatcagttc tgttcttcgg gtaca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 39
tacaaaccat acccagtccc tgttt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 40
agtgctctaa ccacagtcca tgca 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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agtgtggaaa gtgtggcgtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 43
atggcgtcct ctctgcttga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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gaagggtggg tagtcatttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 45
gcagcacagg tcctaaatag 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 46
gggcaataag gtagtgaaca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 48
acgtattctt ccgggcagaa 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 49
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<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 50
ccagtttcac taatgacaca aacg 24
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 51
agcaaagacc ccaacgagaa 20
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 52
ggcggcggtc acgaa 15
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 被6FAM修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 被TAMRA修饰
<400> 53
cgcgatcaca tggtcctgct gg 22
<210> 54
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 54
tttgtctttt atttcaggtc ccagatctag ggctctgcgt ttgctccagg tagtccgctg 60
ctcccttggg cctgggccca ctgacagccc tggtgcctct ggccggctgc acacctcctg 120
gcgggcagct gtgtacaaac tacttgagag caggtgttct ggcaatacct gcctgctctg 180
taatagtttg tacacggagg cctgccctga ctgcccacgg tgccgtggcc aaagaggatc 240
taagggcacc gctgagggcc tacctaacca tcgtggggaa taaggacagt gtcacccctg 300
caggggatcc ggtggtggtg caaatca 327
<210> 55
<211> 269
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 55
agggctctgc gtttgctcca ggtagtccgc tgctcccttg ggcctgggcc cactgacagc 60
cctggtgcct ctggccggct gcacacctcc tggcgggcag ctgtgaatgg tccacatttc 120
agggactgtt ctggcaatac ctggtccctg atttatggac cattcacgga ggcctgccct 180
gactgcccac ggtgccgtgg ccaaagagga tctaagggca ccgctgaggg cctacctaac 240
catcgtgggg aataaggaca gtgtcaccc 269
<210> 56
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 56
agggctctgc gtttgctcca ggtagtccgc tgctcccttg ggcctgggcc cactgacagc 60
cctggtgcct ctggccggct gcacacctcc tggcgggcag ctgtgacaaa ttagctgtca 120
gcgctgttct ggcaatacct ggcgctgact gcaaatttgt cacggaggcc tgccctgact 180
gcccacggtg ccgtggccaa agaggatcta agggcaccgc tgagggccta cctaaccatc 240
gtggggaata aggacagtgt caccc 265
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 57
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 58
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 59
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 60
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 61
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 62
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 62
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 63
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 65
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(25)
<223> 可不存在
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25
<210> 66
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(25)
<223> 可不存在
<400> 66
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 67
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(50)
<223> 可不存在
<400> 67
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
20 25 30
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 68
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(100)
<223> 可不存在
<400> 68
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly
100
<210> 69
<211> 12322
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
ctcacaacca gccgactctc ccattatcca gctgcctagt ttggtgcttc aatgtacatg 60
gctattccgt gtgcatatgt gtgtatacaa acacgcatgc atgcctggat ggacatacgt 120
atgcacaggt tattttttaa ggacaattct ttcaataagg tctttacccc ttacttgaaa 180
caggtgttca tgaaaaaaat gcacaaaatc ctgcctggcc ggaataattc atgaagaagg 240
ggctggatcc gtgggtcaga gaacacagga ccagtttgcc atcccaaggc cgaaggattc 300
gaggcacaaa cccagcagcc tcaacctagt tcatggagga gcctcgcggg gtcctggcca 360
agcaagcccg cccctctggt gggaagagcg gcgcctaggt ggagggtggc tgccgtagga 420
gtggacatga atgctggctt tcagagagaa cagcgtttca gttttggtca tcggaagtgg 480
tgccttcagc acagaagaag agcgtgattt ctcctccaag gccgttgatc tccaacccag 540
aactaaaggg gagaagagcc acccccagca tccagcgtgg catctcttgt gccaggacca 600
gggatgactg ggccatggac acagatgtct ccaaccttca accgtttgca tagcacacgg 660
gggactcgtg ggggccacct gccactgcca gctgaaacaa tacaatggca atactgacat 720
ccttcatgac gttttcccga cagacattca ggcagaaagt gctggtgcgt tttctgtctg 780
caaagtagag ggccatgcct caccaataga atagcgtggg ccctgatgac ctgctccgag 840
tccactcaca gccagtgaca cttgcaaaaa actcccaaag ccgtcttggg tttggctccc 900
acagctcttg accaatgtgg ccaaagctgg acacctcctt gggacactgg gattattcat 960
aaatgcagcc cgccctgact ctccctgaat agcatctgaa gtctttgtga aggtcatgga 1020
tcctgaacaa agtgtcaagg gcaccaagaa ggctgaggga agtccccgga agcggctgac 1080
caaaggagag gccattcaga ccagtgtttc ttccagcgtc ccatacccag gcagcggcac 1140
agctgccacc caagagagcc ccgcccaaga gctcttagcc ccgcagccct tcccgggccc 1200
ctcatcagtt cttagggaag gctctcagga gaaaacgggc cagcagcaga agccccccaa 1260
aaggcccccc atcgaagcat ccgtccacat ctcacagctt ccgcagcacc ctctgacacc 1320
agcattcatg tcgcctggca aacctgagca tctcctggag gggtccacat ggcaactggt 1380
tgaccccatg agacctggac cctctggctc cttcgtggcc cctgggctcc atcctcagag 1440
ccagctcctt ccttcccacg cttccatcat tccccccgag gaccttcctg gagtccccaa 1500
agtcttcgtg cctcgtcctt cccaggtctc cttgaagccc acagaagagg cacacaagaa 1560
ggagaggaag ccccagaagc caggcaagta catctgccag tactgcagcc ggccctgtgc 1620
caagcccagc gtgctccaga agcacattcg ctcacacaca ggtgagaggc cctacccctg 1680
cggcccctgt ggcttctcct tcaagaccaa gagtaatctc tacaagcaca ggaagtccca 1740
tgcccaccgc atcaaagcag gcctggcctc aggcatgggt ggcgagatgt acccacatgg 1800
gctggagatg gagcggatcc ctggggaaga gtttgaggag cccactgagg gagaaagcac 1860
agattctgaa gaggagacta gtgccacctc tggtcaccct gcagagctct ccccaagacc 1920
caagcagccc cttctctcca gcgggctata cagctctggg agccacagtt ccagccacga 1980
acgctgttcc ctgtcccagt ccagcacagc ccagtcactc gaagaccccc ctccatttgt 2040
ggaaccctca tctgagcacc ccctgagcca taaacctgaa gacacccaca cgattaagca 2100
gaagctggcc ctccgcttaa gcgagaggaa gaaggtgatc gatgagcagg cgtttctgag 2160
cccaggcagc aaagggagta ctgagtctgg gtatttctct cgctccgaga gtgcagagca 2220
gcaggtcagc cccccaaaca ccaacgccaa gtcctacgct gagatcatct ttggcaagtg 2280
tgggcgaata ggacagcgga ccgccatgct gacagccacc tccacccagc ccctcctgcc 2340
cctgtccacc gaagacaagc ccagcctggt gcctttgtct gtaccccgga cgcaggtgat 2400
cgagcacatc acgaagctca tcaccatcaa cgaggccgtg gtggacacca gcgagatcga 2460
cagcgtgaag ccaaggcgga gctcactgtc caggcgcagc agcatggagt ccccaaaatc 2520
cagcctctac cgggagcccc tgtcatccca cagtgagaaa accaagcctg aacaatcact 2580
gctgagcctc cagcacccgc ccagtaccgc cccccctgtg cctctcctga gaagccactc 2640
aatgccttct gccgcctgca ctatcagcac cccccaccac cccttccgag gtagctactc 2700
cttcgatgac catatcaccg actccgaagc cctgagccac agcagtcacg tgtttacctc 2760
ccacccccgg atgctgaagc gccagccggc aatcgaatta cctttgggag gggaatacag 2820
ttctgaggag cctggcccaa gcagcaaaga cacagcctcc aagccctcgg acgaagtgga 2880
acccaaggaa agcgagctta ccaaaaagac caagaagggt ttgaaaacaa aaggggtgat 2940
ctacgaatgt aacatatgtg gtgctcggta caagaaaagg gataactacg aagcccacaa 3000
aaaatactac tgctcagagc ttcagatcgc aaagcccatc tctgcaggca cccacacatc 3060
tccagaagct gaaaagagtc agattgagca tgagccgtgg tcccaaatga tgcattacaa 3120
actgggaacc accctggaac tcactccact gaggaagagg aggaaagaga agagccttgg 3180
ggacgaggaa gagccacctg cctttgagtc cacaaaaagt cagtttggca gccccgggcc 3240
atctgatgct gctcggaacc ttcccctgga gtccaccaag tcaccagcag aaccaagtaa 3300
atcagtgccc tccttggagg gacccacggg cttccagcca aggactccca agccagggtc 3360
cggttcagaa tcagggaagg agaggagaac aacgtccaaa gaaatttctg tcatccagca 3420
caccagctcc tttgagaaat ctgattctct cgagcagccg agtggcttgg aaggggaaga 3480
caaacctctg gcccagttcc catcaccccc acctgcccca cacggacgct ctgctcactc 3540
cctgcagcct aagttggtcc gccagcccaa cattcaggtt cctgagatcc tagtaactga 3600
ggagcctgac cggccggaca cagagccaga gccgccccct aaggaacctg agaagactga 3660
ggagttccaa tggccccagc gcagccagac acttgcccag ctcccagctg agaagctgcc 3720
acccaaaaag aagaggttgc gcctggcaga gatggcccaa tcatcagggg agtccagctt 3780
cgagtcctct gtgcctctgt ctcgcagccc gagccaggaa agcaatgtct ctttgagtgg 3840
gtccagccgc tcagcctcgt ttgagaggga tgaccatggg aaagccgagg cccccagtcc 3900
ctcatctgac atgcgcccca aacccctggg cacccacatg ttgactgtcc ccagccacca 3960
cccacatgcc cgagagatgc ggaggtcagc ctcagagcag agccccaacg tttcccattc 4020
tgcccacatg accgagacac gcagcaaatc ctttgactat ggcagcttgt ccttgacagg 4080
cccttctgct ccagccccag tggctccacc agcgcgggtg gccccgccag agagaagaaa 4140
atgcttcttg gtgagacagg cctctctgag caggcctcca gaatctgagt tggaggttgc 4200
ccccaaggga agacaggaga gcgaagaacc acagccctca tccagtaaac cctctgccaa 4260
aagctcattg tcccagattt cctctgcggc cacctcacat ggtggacccc cgggaggcaa 4320
gggcccaggg caggacaggc ccccattggg gcccactgtg ccctacacag aagcactgca 4380
agtgttccac caccccgttg cccagacacc cctgcatgag aagccatacc tgcccccacc 4440
agtctccctt ttctccttcc agcatctcgt gcagcatgag ccaggacagt ctccagaatt 4500
cttctccacc caggccatgt ccagcctcct gtcctcacca tactccatgc ccccacttcc 4560
tccctcctta tttcaagccc caccgcttcc tctccagcct actgttctgc acccaggcca 4620
actccatctc ccccagctca tgcctcaccc agccaacatc cccttcaggc agcccccttc 4680
cttcctcccc atgccatacc cgacctcctc agcactgtct tctgggtttt tcctgcctct 4740
gcaatcccag tttgcacttc agctccctgg tgatgtggaa agccatctgc cccagatcaa 4800
aaccagcctg gccccactgg caacaggaag tgctggcctc tcccccagca cagagtacag 4860
cagtgacatc cggctacccc ctgtggctcc cccagccagc tcctcagcac ctacatcagc 4920
tcctccactg gccctgcctg cctgtccaga caccatggtg tccctggttg tgcctgtccg 4980
tgttcagacc aatatgccgt cctatgggag cgcaatgtac accacccttt cccagatctt 5040
ggtcacccag tcccaaggca gctcagcaac tgtggcactt cccaagtttg aggaaccccc 5100
atcaaagggg acgactgtat gtggtgcaga tgtgcatgag gttgggcccg gcccttctgg 5160
gttaagtgaa gagcaaagca gagctttccc aactccatac ctgagagtgc ctgtgacatt 5220
acctgaaaga aaaggcactt ccctgtcatc agagagtatc ttgagcctgg aggggagttc 5280
atcaacagca gggggaagca aacgtgtcct ttcaccagct ggcagccttg aacttaccat 5340
ggaaacccag cagcaaaaaa gagtgaagga ggaggaggct tccaaggcag atgaaaaact 5400
tgagctggta aaaccatgca gtgtggtcct accagcaccg aggatgggaa gaggccagag 5460
aaatcccact taggcaacca gggccaaggc aggagggagc tagaaatgct gtccagcctg 5520
tcctcagatc catctgacac aaaggaaatt cctcccctcc ctcaccctgc attgtcccat 5580
gggacagccc caggctcaga agctttgaag gaatatcccc agccatctgg caaacctcac 5640
cgaagagggt tgaccccact gagcgtgaag aaagaagatt ccaaggaaca acctgatctc 5700
ccctccttgg cacctccgag ctctctgcct ctgtcagaaa cgtcctccag accagccaag 5760
tcacaagaag gtacggactc aaagaaggta ctgcagttcc ccagcctcca cacaaccact 5820
aatgtcagtt ggtgctattt aaactacatt aagccaaatc acatccagca tgcagatagg 5880
aggtcctctg tttacgctgg ttggtgcata agtttgtaca accccaacct tccgggggtt 5940
tccactaaag ctgctttgtc cctcctgagg tctaagcaga aagtgagcaa agagacatac 6000
accatggcca cagctccgca tcctgaggca ggaaggcttg tgccatccag ctcccgcaag 6060
ccccgcatga cagaggttca cctcccttca ctggtttccc cggaaggcca gaaagatcta 6120
gctagagtgg agaaggaaga agagaggaga ggggagccgg aggaggatgc tcctgcctcc 6180
cagagagggg agccggcgag gatcaaaatc ttcgaaggag ggtacaaatc aaacgaagag 6240
tatgtatatg tgcgaggccg cggccgaggg aaatatgttt gtgaggagtg tggaattcgc 6300
tgcaagaagc ccagcatgct gaagaaacac atccgcaccc acactgacgt ccggccctat 6360
gtgtgcaagc actgtcactt tgcttttaaa accaaaggga atctgactaa gcacatgaag 6420
tcgaaggccc acagcaaaaa gtgccaagag acaggggtgc tggaggagct ggaagccgaa 6480
gaaggaacca gtgacgacct gttccaggac tcggaaggac gagagggttc agaggctgtg 6540
gaggagcacc agttttcgga cctggaggac tcggactcag actcagacct ggacgaagac 6600
gaggatgagg atgaggagga gagccaggat gagctgtcca gaccatcctc agaggcgccc 6660
ccgcctggcc caccacatgc actgcgggca gactcctcac ccatcctggg ccctcagccc 6720
ccagatgccc ccgcctctgg cacggaggct acacgaggca gctcggtctc ggaagctgag 6780
cgcctgacag ccagcagctg ctccatgtcc agccagagca tgccgggcct cccctggctg 6840
ggaccggccc ctctgggctc tgtggagaaa gacacaggct cagccttgag ctacaagcct 6900
gtgtccccaa gaagaccgtg gtccccaagc aaagaagcag gcagccgtcc accactagcc 6960
cgcaaacact cgctaaccaa aaacgactca tctccccagc gatgctcccc ggcccgagaa 7020
ccacaggcct cagccccaag cccacctggc ctgcacgtgg acccaggaag gggcatgggc 7080
gctctccctt gtgggtctcc aagacttcag ctgtctcctc tcaccctctg ccccctggga 7140
agagaactgg cccctcgagc acatgtgctc tccaaactcg agggtaccac cgacccaggc 7200
ctccccagat actcgcccac caggagatgg tctccaggtc aggccgagtc accaccacgg 7260
tcagcgccgc cagggaagtg ggccttggct gggccgggca gcccctcagc gggggagcat 7320
ggcccaggct tggggctgga cccacgggtt ctcttcccgc ccgcgcctct acctcacaag 7380
ctcctcagca gaagcccaga gacctgcgcc tccccgtgga aggccgagtc ccgaagtccc 7440
tcctgctcac ccggccctgc tcatcctctc tcctcccgac ccttctccgc cctccatgac 7500
ttccacggcc acatcctggc ccggacagag gagaacatct tcagccacct gcctctgcac 7560
tcccagcact tgacccgtgc cccatgtccc ttgattccca tcggtgggat ccagatggtg 7620
caggcccggc caggagccca ccccaccctg ctgccagggc ccaccgcagc ctgggtcagt 7680
ggcttctccg ggggtggcag cgacctgaca ggggcccggg aggcccagga gcgaggccgc 7740
tggagtccca ctgagagctc gtcagcctcc gtgtcgcctg tggctaaggt ctccaaattc 7800
acactctcct cagagctgga gggcggggac taccccaagg agagggagag gaccggcgga 7860
ggcccgggca ggcctcctga ctggacaccc catgggaccg gggcacctgc agagcccaca 7920
cccacgcaca gcccctgcac cccacccgac accttgcccc ggccgcccca gggacgccgg 7980
gcagcgcagt cctggagccc ccgcttgggt ccccgcgtgc accgaccaac cccgagcctt 8040
ctgccacccc gccgctggac cgcagcagct ctgtgggctg cctggcagag gcctctgccc 8100
gcttcccagc ccggacgagg aacctctccg gggaacccag gaccaggcag gactccccca 8160
agccctcagg aagtggggag cccagggcac atccacatca gcctgaggac agggttcccc 8220
ccaacgctta gcctctctcc aactgcttca gcatctggct tccagtgtcc agcaacagac 8280
gtttccagcc actttcctcg aatcatccca cttcctcagc cccatctgtc cctccgtcca 8340
ggagctctca cggccccatc tgttgtacct tcccatgtat gcagttacct gtgccttttt 8400
ctacaccttt tgttgcttaa aaagaaacaa aacaaatcac atacatacat ttaaaaaaaa 8460
aacaacaacc cacgaggagt ctgaggctgt gaatagttta tggttttggg gaaaggctga 8520
tggtgaagcc tcctgaccct ccccgctgtg gttggcagcc acccacccca gaggctggca 8580
gagggaaagg ggtacactga gggagaaagg aaaaggaaac ttcaaacaat atagaattaa 8640
atgtaaaagg aagcactcct gtgtacagat gcgatcaagg ttcctgttta ttgccacttc 8700
acccccctgc ccagctcgta gccacccctc tctgccagca gaaaggccag tgtccccagg 8760
cagaggggca caaacacagg caggtgaccc ccacccaggc cccagcaggc aggcccagaa 8820
aaactaatct tttccttttt tttttttttt tttttttttg caagaaaata aaatgatact 8880
tttcctagga tttcaacaca aaataatagg tgcaggtaga aggaggaggg ctggctcccc 8940
aagggctcct ggatactctg gtagtctgag tcatgggccc atcctggcac tccacaggtg 9000
ggcaggccac cccacccacg cacccccact ccagacacct cccttctgca ccccaccctg 9060
gccccctggg ctggggaagg agccctgact gtccgtccct ggctcccaag cccctgaccg 9120
aggcctcact ctcctgttgc ctcctctgtt ctaaaaccac caaaccaccc acaaaggcag 9180
aagtggcagg gcccgagccc tagcggccgt tcctgagact gggttttggg ttttgtttca 9240
tcttggtccc tggggtacaa gggagcctgt tcccctcatg gctgggtttt tccagttctc 9300
cacagcagag gtttgcgggg aactgtttca ggaccacttt gccacaggac cgtttccccc 9360
cgtccctgcc cctgtctcca ctaccccaag gaaataccca caactgtggc tggtggatac 9420
ggcctggacc tgtttgctgt cttacacctc ttttttaaaa agagagagga tggtgtttga 9480
tacttcaccc agccaccaca gattcttttg acctagagga tttttgaatt gtcctaactc 9540
gttggaattc tccaaagcaa tcagtgtgag ccagtgcctc ttccttaccc acatctctac 9600
tttcaagaag ctgccctgca tttcctgggg caaaactcta ctttgtaaga aaaataatag 9660
gaccagaaat ttaaatccca aattgaacta tggaacttga actctagcgt gttcgcccca 9720
actgggagag gtgagctttt tcccagtgtt tcagaactga ttttctttac tttctacaag 9780
ggagggcagc acagggacta cggttgaggc ccgtgaaggc tgggtttgat gccaccctat 9840
acagagcagg gacctctctg gctaatcccc agtcctcagc caggctgtgt gaatcaagtg 9900
cctgccccag ggctcttgag ctattgaagc tgcttgggta caggacacag taggtgggga 9960
gggttaagac ccttctgtga gttccctgtg cggggctgta cttgcctctt ccaattcgtg 10020
gcctttccct gcttggtccc tactagacag acaaaccagc cacagtccag cctgcagcca 10080
gaccaccttg ttcactcatt ctcctttgcc tcagagctaa gacaaaaatg agacagaagg 10140
cagggctccc tgggagtcca ctgtgctcca gggttctggg gaatcagggt tagccagcag 10200
ctcctggctg cttccctcag agactagggc tctcatcctc cccaagagaa gcagcaagcc 10260
cagcctggac cacactgtcc atattgctgg acagtggcct gacagaaagt gactcctcca 10320
agtcccagga ggccagggct tttctcatcc ttgcctttca gccctaaccc atgggactgc 10380
ccacggattg gagacttcaa gggctgaggt ctgggagctg cataaagggc attgcttcag 10440
cccaggttag aaatctgcct gggcaagctc ttcctgcccc agacctacaa agcagcagac 10500
cgggggctct ggtggactag cccctgacat tggtgggggg ccccacacca ctccacccca 10560
ccctgccttc cagctctcct gggcattttt ctccctgtac tcaaacagcc tacccaccca 10620
aggtttcctc cctgggcagc ctagcaatga acagtgcagc cggcagggca gaggcccggc 10680
agtcaccggg cccgtcaggc tcaggcagag aagccacagg ggccaggagt cactggagac 10740
tatttctaaa tgatgggggt aaatgcacaa atagaatctc accaaagggc tgcctccaca 10800
ttgatgccgt gcccagaggg acagaaccaa tgccaccagc ctgggtatat gtcactgggc 10860
acagctctaa ccccctcctc cggactctag tcccgctcct ctgcgcacag agcccccagc 10920
ccacaggtac accttcatga tttggagaaa gacgctcgcc ccatgcacgc cctcctctgg 10980
gccttctgcc ctgctcccag tcacttccaa gcttcctgtt tgcctgtgat gttattgtgc 11040
ctgttgaggg aagcagcaga ggaggcagtg gctgacttgg cacagatgcc tgctacgtgc 11100
tctgttgaaa tgcgcggggt ggccattcct cggtacagac tagtcctggt ccttgggtgt 11160
gggcagtggg ggaggaacca actggtcgag gtttcagagc caaaccttgc ctttggttgg 11220
tgagtccttg ccccccaggc ctgcgctcca cgatgccttt cacccttggc aatctcaggg 11280
ccatcctggg tagtaacccc actcctctct gctcccgccc gcacctgtgg ctctcactct 11340
gggctcaacc cctgcaaccc tccaggagcc cgacagcagc cagctgcctg cactgtcgcc 11400
tccgtaagct ccaacttcca gacccagaag tccctctgct tccctctgtt ggaaaaagcc 11460
taaaagaatt agcttccaga ttcctctagc ccctgctcca ttcccaccca gtccttctga 11520
agaggaatga gcaatacatc tgagctggat ttctctctag tcctttctcc agacaaatcc 11580
ttcttaaagc aaaagtcctg gctgagcacc tgtccttggg gaccgatctg ccgtgtgacc 11640
aggggaagaa agttcccgaa agcctgttcc accaattctg cttctgtgtt gtgaatccag 11700
tctgctttcc attagaaaac cgcttcggca cttatggtca ctttaataaa tctagtatgt 11760
aaaaaaagaa agaaagaaaa gaaacagaaa aaagaaacgt gcaggcaaat gtaaaataca 11820
atgctctctg taagataaat atttgccttt ttttctaaaa ggtgtacgta ttctgtatgt 11880
gaaattgtct gtagaaagtt tctatgttct taaatggcaa tacattccaa aaattgtact 11940
gtagatatgt acagcaaccg cactgggatg gggtagtttt gcctgtaatt ttatttaaac 12000
tccagtttcc acacttgctc ttgcaatgtt ggtatggtat atatcagtgc aaaagaaaaa 12060
acaaaacaga aacaaacaaa aaaaaaaaac aaaaatccac gcaggtctaa agcacagagt 12120
ctgacgtaca aaaggaaaaa tgctcagtat tgatgtgtgt gacctttgtt gtaaattaca 12180
tctgtactgt gaatgagaag tttttacaag tataataatt gcctttatta cagctctggc 12240
tgagtgttca gcctgaggat attttttaaa aaaaaaagaa ttagcatgtt ggaataaatt 12300
tgaaaatccc aacataaaaa aa 12322
<210> 70
<211> 2405
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
Met Asp Pro Glu Gln Ser Val Lys Gly Thr Lys Lys Ala Glu Gly Ser
1 5 10 15
Pro Arg Lys Arg Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Gln Thr Ser Val Ser
20 25 30
Ser Ser Val Pro Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ala Thr Gln Glu Ser
35 40 45
Pro Ala Gln Glu Leu Leu Ala Pro Gln Pro Phe Pro Gly Pro Ser Ser
50 55 60
Val Leu Arg Glu Gly Ser Gln Glu Lys Thr Gly Gln Gln Gln Lys Pro
65 70 75 80
Pro Lys Arg Pro Pro Ile Glu Ala Ser Val His Ile Ser Gln Leu Pro
85 90 95
Gln His Pro Leu Thr Pro Ala Phe Met Ser Pro Gly Lys Pro Glu His
100 105 110
Leu Leu Glu Gly Ser Thr Trp Gln Leu Val Asp Pro Met Arg Pro Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Phe Val Ala Pro Gly Leu His Pro Gln Ser Gln Leu
130 135 140
Leu Pro Ser His Ala Ser Ile Ile Pro Pro Glu Asp Leu Pro Gly Val
145 150 155 160
Pro Lys Val Phe Val Pro Arg Pro Ser Gln Val Ser Leu Lys Pro Thr
165 170 175
Glu Glu Ala His Lys Lys Glu Arg Lys Pro Gln Lys Pro Gly Lys Tyr
180 185 190
Ile Cys Gln Tyr Cys Ser Arg Pro Cys Ala Lys Pro Ser Val Leu Gln
195 200 205
Lys His Ile Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Pro Cys Gly Pro
210 215 220
Cys Gly Phe Ser Phe Lys Thr Lys Ser Asn Leu Tyr Lys His Arg Lys
225 230 235 240
Ser His Ala His Arg Ile Lys Ala Gly Leu Ala Ser Gly Met Gly Gly
245 250 255
Glu Met Tyr Pro His Gly Leu Glu Met Glu Arg Ile Pro Gly Glu Glu
260 265 270
Phe Glu Glu Pro Thr Glu Gly Glu Ser Thr Asp Ser Glu Glu Glu Thr
275 280 285
Ser Ala Thr Ser Gly His Pro Ala Glu Leu Ser Pro Arg Pro Lys Gln
290 295 300
Pro Leu Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Ser Gly Ser His Ser Ser Ser
305 310 315 320
His Glu Arg Cys Ser Leu Ser Gln Ser Ser Thr Ala Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Asp Pro Pro Pro Phe Val Glu Pro Ser Ser Glu His Pro Leu Ser His
340 345 350
Lys Pro Glu Asp Thr His Thr Ile Lys Gln Lys Leu Ala Leu Arg Leu
355 360 365
Ser Glu Arg Lys Lys Val Ile Asp Glu Gln Ala Phe Leu Ser Pro Gly
370 375 380
Ser Lys Gly Ser Thr Glu Ser Gly Tyr Phe Ser Arg Ser Glu Ser Ala
385 390 395 400
Glu Gln Gln Val Ser Pro Pro Asn Thr Asn Ala Lys Ser Tyr Ala Glu
405 410 415
Ile Ile Phe Gly Lys Cys Gly Arg Ile Gly Gln Arg Thr Ala Met Leu
420 425 430
Thr Ala Thr Ser Thr Gln Pro Leu Leu Pro Leu Ser Thr Glu Asp Lys
435 440 445
Pro Ser Leu Val Pro Leu Ser Val Pro Arg Thr Gln Val Ile Glu His
450 455 460
Ile Thr Lys Leu Ile Thr Ile Asn Glu Ala Val Val Asp Thr Ser Glu
465 470 475 480
Ile Asp Ser Val Lys Pro Arg Arg Ser Ser Leu Ser Arg Arg Ser Ser
485 490 495
Met Glu Ser Pro Lys Ser Ser Leu Tyr Arg Glu Pro Leu Ser Ser His
500 505 510
Ser Glu Lys Thr Lys Pro Glu Gln Ser Leu Leu Ser Leu Gln His Pro
515 520 525
Pro Ser Thr Ala Pro Pro Val Pro Leu Leu Arg Ser His Ser Met Pro
530 535 540
Ser Ala Ala Cys Thr Ile Ser Thr Pro His His Pro Phe Arg Gly Ser
545 550 555 560
Tyr Ser Phe Asp Asp His Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ser His Ser
565 570 575
Ser His Val Phe Thr Ser His Pro Arg Met Leu Lys Arg Gln Pro Ala
580 585 590
Ile Glu Leu Pro Leu Gly Gly Glu Tyr Ser Ser Glu Glu Pro Gly Pro
595 600 605
Ser Ser Lys Asp Thr Ala Ser Lys Pro Ser Asp Glu Val Glu Pro Lys
610 615 620
Glu Ser Glu Leu Thr Lys Lys Thr Lys Lys Gly Leu Lys Thr Lys Gly
625 630 635 640
Val Ile Tyr Glu Cys Asn Ile Cys Gly Ala Arg Tyr Lys Lys Arg Asp
645 650 655
Asn Tyr Glu Ala His Lys Lys Tyr Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Ile Ala
660 665 670
Lys Pro Ile Ser Ala Gly Thr His Thr Ser Pro Glu Ala Glu Lys Ser
675 680 685
Gln Ile Glu His Glu Pro Trp Ser Gln Met Met His Tyr Lys Leu Gly
690 695 700
Thr Thr Leu Glu Leu Thr Pro Leu Arg Lys Arg Arg Lys Glu Lys Ser
705 710 715 720
Leu Gly Asp Glu Glu Glu Pro Pro Ala Phe Glu Ser Thr Lys Ser Gln
725 730 735
Phe Gly Ser Pro Gly Pro Ser Asp Ala Ala Arg Asn Leu Pro Leu Glu
740 745 750
Ser Thr Lys Ser Pro Ala Glu Pro Ser Lys Ser Val Pro Ser Leu Glu
755 760 765
Gly Pro Thr Gly Phe Gln Pro Arg Thr Pro Lys Pro Gly Ser Gly Ser
770 775 780
Glu Ser Gly Lys Glu Arg Arg Thr Thr Ser Lys Glu Ile Ser Val Ile
785 790 795 800
Gln His Thr Ser Ser Phe Glu Lys Ser Asp Ser Leu Glu Gln Pro Ser
805 810 815
Gly Leu Glu Gly Glu Asp Lys Pro Leu Ala Gln Phe Pro Ser Pro Pro
820 825 830
Pro Ala Pro His Gly Arg Ser Ala His Ser Leu Gln Pro Lys Leu Val
835 840 845
Arg Gln Pro Asn Ile Gln Val Pro Glu Ile Leu Val Thr Glu Glu Pro
850 855 860
Asp Arg Pro Asp Thr Glu Pro Glu Pro Pro Pro Lys Glu Pro Glu Lys
865 870 875 880
Thr Glu Glu Phe Gln Trp Pro Gln Arg Ser Gln Thr Leu Ala Gln Leu
885 890 895
Pro Ala Glu Lys Leu Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Arg Leu Ala Glu
900 905 910
Met Ala Gln Ser Ser Gly Glu Ser Ser Phe Glu Ser Ser Val Pro Leu
915 920 925
Ser Arg Ser Pro Ser Gln Glu Ser Asn Val Ser Leu Ser Gly Ser Ser
930 935 940
Arg Ser Ala Ser Phe Glu Arg Asp Asp His Gly Lys Ala Glu Ala Pro
945 950 955 960
Ser Pro Ser Ser Asp Met Arg Pro Lys Pro Leu Gly Thr His Met Leu
965 970 975
Thr Val Pro Ser His His Pro His Ala Arg Glu Met Arg Arg Ser Ala
980 985 990
Ser Glu Gln Ser Pro Asn Val Ser His Ser Ala His Met Thr Glu Thr
995 1000 1005
Arg Ser Lys Ser Phe Asp Tyr Gly Ser Leu Ser Leu Thr Gly Pro
1010 1015 1020
Ser Ala Pro Ala Pro Val Ala Pro Pro Ala Arg Val Ala Pro Pro
1025 1030 1035
Glu Arg Arg Lys Cys Phe Leu Val Arg Gln Ala Ser Leu Ser Arg
1040 1045 1050
Pro Pro Glu Ser Glu Leu Glu Val Ala Pro Lys Gly Arg Gln Glu
1055 1060 1065
Ser Glu Glu Pro Gln Pro Ser Ser Ser Lys Pro Ser Ala Lys Ser
1070 1075 1080
Ser Leu Ser Gln Ile Ser Ser Ala Ala Thr Ser His Gly Gly Pro
1085 1090 1095
Pro Gly Gly Lys Gly Pro Gly Gln Asp Arg Pro Pro Leu Gly Pro
1100 1105 1110
Thr Val Pro Tyr Thr Glu Ala Leu Gln Val Phe His His Pro Val
1115 1120 1125
Ala Gln Thr Pro Leu His Glu Lys Pro Tyr Leu Pro Pro Pro Val
1130 1135 1140
Ser Leu Phe Ser Phe Gln His Leu Val Gln His Glu Pro Gly Gln
1145 1150 1155
Ser Pro Glu Phe Phe Ser Thr Gln Ala Met Ser Ser Leu Leu Ser
1160 1165 1170
Ser Pro Tyr Ser Met Pro Pro Leu Pro Pro Ser Leu Phe Gln Ala
1175 1180 1185
Pro Pro Leu Pro Leu Gln Pro Thr Val Leu His Pro Gly Gln Leu
1190 1195 1200
His Leu Pro Gln Leu Met Pro His Pro Ala Asn Ile Pro Phe Arg
1205 1210 1215
Gln Pro Pro Ser Phe Leu Pro Met Pro Tyr Pro Thr Ser Ser Ala
1220 1225 1230
Leu Ser Ser Gly Phe Phe Leu Pro Leu Gln Ser Gln Phe Ala Leu
1235 1240 1245
Gln Leu Pro Gly Asp Val Glu Ser His Leu Pro Gln Ile Lys Thr
1250 1255 1260
Ser Leu Ala Pro Leu Ala Thr Gly Ser Ala Gly Leu Ser Pro Ser
1265 1270 1275
Thr Glu Tyr Ser Ser Asp Ile Arg Leu Pro Pro Val Ala Pro Pro
1280 1285 1290
Ala Ser Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ala Pro Pro Leu Ala Leu Pro
1295 1300 1305
Ala Cys Pro Asp Thr Met Val Ser Leu Val Val Pro Val Arg Val
1310 1315 1320
Gln Thr Asn Met Pro Ser Tyr Gly Ser Ala Met Tyr Thr Thr Leu
1325 1330 1335
Ser Gln Ile Leu Val Thr Gln Ser Gln Gly Ser Ser Ala Thr Val
1340 1345 1350
Ala Leu Pro Lys Phe Glu Glu Pro Pro Ser Lys Gly Thr Thr Val
1355 1360 1365
Cys Gly Ala Asp Val His Glu Val Gly Pro Gly Pro Ser Gly Leu
1370 1375 1380
Ser Glu Glu Gln Ser Arg Ala Phe Pro Thr Pro Tyr Leu Arg Val
1385 1390 1395
Pro Val Thr Leu Pro Glu Arg Lys Gly Thr Ser Leu Ser Ser Glu
1400 1405 1410
Ser Ile Leu Ser Leu Glu Gly Ser Ser Ser Thr Ala Gly Gly Ser
1415 1420 1425
Lys Arg Val Leu Ser Pro Ala Gly Ser Leu Glu Leu Thr Met Glu
1430 1435 1440
Thr Gln Gln Gln Lys Arg Val Lys Glu Glu Glu Ala Ser Lys Ala
1445 1450 1455
Asp Glu Lys Leu Glu Leu Val Lys Pro Cys Ser Val Val Leu Thr
1460 1465 1470
Ser Thr Glu Asp Gly Lys Arg Pro Glu Lys Ser His Leu Gly Asn
1475 1480 1485
Gln Gly Gln Gly Arg Arg Glu Leu Glu Met Leu Ser Ser Leu Ser
1490 1495 1500
Ser Asp Pro Ser Asp Thr Lys Glu Ile Pro Pro Leu Pro His Pro
1505 1510 1515
Ala Leu Ser His Gly Thr Ala Pro Gly Ser Glu Ala Leu Lys Glu
1520 1525 1530
Tyr Pro Gln Pro Ser Gly Lys Pro His Arg Arg Gly Leu Thr Pro
1535 1540 1545
Leu Ser Val Lys Lys Glu Asp Ser Lys Glu Gln Pro Asp Leu Pro
1550 1555 1560
Ser Leu Ala Pro Pro Ser Ser Leu Pro Leu Ser Glu Thr Ser Ser
1565 1570 1575
Arg Pro Ala Lys Ser Gln Glu Gly Thr Asp Ser Lys Lys Val Leu
1580 1585 1590
Gln Phe Pro Ser Leu His Thr Thr Thr Asn Val Ser Trp Cys Tyr
1595 1600 1605
Leu Asn Tyr Ile Lys Pro Asn His Ile Gln His Ala Asp Arg Arg
1610 1615 1620
Ser Ser Val Tyr Ala Gly Trp Cys Ile Ser Leu Tyr Asn Pro Asn
1625 1630 1635
Leu Pro Gly Val Ser Thr Lys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser
1640 1645 1650
Lys Gln Lys Val Ser Lys Glu Thr Tyr Thr Met Ala Thr Ala Pro
1655 1660 1665
His Pro Glu Ala Gly Arg Leu Val Pro Ser Ser Ser Arg Lys Pro
1670 1675 1680
Arg Met Thr Glu Val His Leu Pro Ser Leu Val Ser Pro Glu Gly
1685 1690 1695
Gln Lys Asp Leu Ala Arg Val Glu Lys Glu Glu Glu Arg Arg Gly
1700 1705 1710
Glu Pro Glu Glu Asp Ala Pro Ala Ser Gln Arg Gly Glu Pro Ala
1715 1720 1725
Arg Ile Lys Ile Phe Glu Gly Gly Tyr Lys Ser Asn Glu Glu Tyr
1730 1735 1740
Val Tyr Val Arg Gly Arg Gly Arg Gly Lys Tyr Val Cys Glu Glu
1745 1750 1755
Cys Gly Ile Arg Cys Lys Lys Pro Ser Met Leu Lys Lys His Ile
1760 1765 1770
Arg Thr His Thr Asp Val Arg Pro Tyr Val Cys Lys His Cys His
1775 1780 1785
Phe Ala Phe Lys Thr Lys Gly Asn Leu Thr Lys His Met Lys Ser
1790 1795 1800
Lys Ala His Ser Lys Lys Cys Gln Glu Thr Gly Val Leu Glu Glu
1805 1810 1815
Leu Glu Ala Glu Glu Gly Thr Ser Asp Asp Leu Phe Gln Asp Ser
1820 1825 1830
Glu Gly Arg Glu Gly Ser Glu Ala Val Glu Glu His Gln Phe Ser
1835 1840 1845
Asp Leu Glu Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Leu Asp Glu Asp Glu
1850 1855 1860
Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ser Gln Asp Glu Leu Ser Arg Pro Ser
1865 1870 1875
Ser Glu Ala Pro Pro Pro Gly Pro Pro His Ala Leu Arg Ala Asp
1880 1885 1890
Ser Ser Pro Ile Leu Gly Pro Gln Pro Pro Asp Ala Pro Ala Ser
1895 1900 1905
Gly Thr Glu Ala Thr Arg Gly Ser Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg
1910 1915 1920
Leu Thr Ala Ser Ser Cys Ser Met Ser Ser Gln Ser Met Pro Gly
1925 1930 1935
Leu Pro Trp Leu Gly Pro Ala Pro Leu Gly Ser Val Glu Lys Asp
1940 1945 1950
Thr Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Lys Pro Val Ser Pro Arg Arg Pro
1955 1960 1965
Trp Ser Pro Ser Lys Glu Ala Gly Ser Arg Pro Pro Leu Ala Arg
1970 1975 1980
Lys His Ser Leu Thr Lys Asn Asp Ser Ser Pro Gln Arg Cys Ser
1985 1990 1995
Pro Ala Arg Glu Pro Gln Ala Ser Ala Pro Ser Pro Pro Gly Leu
2000 2005 2010
His Val Asp Pro Gly Arg Gly Met Gly Ala Leu Pro Cys Gly Ser
2015 2020 2025
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Pro Leu Thr Leu Cys Pro Leu Gly Arg
2030 2035 2040
Glu Leu Ala Pro Arg Ala His Val Leu Ser Lys Leu Glu Gly Thr
2045 2050 2055
Thr Asp Pro Gly Leu Pro Arg Tyr Ser Pro Thr Arg Arg Trp Ser
2060 2065 2070
Pro Gly Gln Ala Glu Ser Pro Pro Arg Ser Ala Pro Pro Gly Lys
2075 2080 2085
Trp Ala Leu Ala Gly Pro Gly Ser Pro Ser Ala Gly Glu His Gly
2090 2095 2100
Pro Gly Leu Gly Leu Asp Pro Arg Val Leu Phe Pro Pro Ala Pro
2105 2110 2115
Leu Pro His Lys Leu Leu Ser Arg Ser Pro Glu Thr Cys Ala Ser
2120 2125 2130
Pro Trp Lys Ala Glu Ser Arg Ser Pro Ser Cys Ser Pro Gly Pro
2135 2140 2145
Ala His Pro Leu Ser Ser Arg Pro Phe Ser Ala Leu His Asp Phe
2150 2155 2160
His Gly His Ile Leu Ala Arg Thr Glu Glu Asn Ile Phe Ser His
2165 2170 2175
Leu Pro Leu His Ser Gln His Leu Thr Arg Ala Pro Cys Pro Leu
2180 2185 2190
Ile Pro Ile Gly Gly Ile Gln Met Val Gln Ala Arg Pro Gly Ala
2195 2200 2205
His Pro Thr Leu Leu Pro Gly Pro Thr Ala Ala Trp Val Ser Gly
2210 2215 2220
Phe Ser Gly Gly Gly Ser Asp Leu Thr Gly Ala Arg Glu Ala Gln
2225 2230 2235
Glu Arg Gly Arg Trp Ser Pro Thr Glu Ser Ser Ser Ala Ser Val
2240 2245 2250
Ser Pro Val Ala Lys Val Ser Lys Phe Thr Leu Ser Ser Glu Leu
2255 2260 2265
Glu Gly Gly Asp Tyr Pro Lys Glu Arg Glu Arg Thr Gly Gly Gly
2270 2275 2280
Pro Gly Arg Pro Pro Asp Trp Thr Pro His Gly Thr Gly Ala Pro
2285 2290 2295
Ala Glu Pro Thr Pro Thr His Ser Pro Cys Thr Pro Pro Asp Thr
2300 2305 2310
Leu Pro Arg Pro Pro Gln Gly Arg Arg Ala Ala Gln Ser Trp Ser
2315 2320 2325
Pro Arg Leu Glu Ser Pro Arg Ala Pro Thr Asn Pro Glu Pro Ser
2330 2335 2340
Ala Thr Pro Pro Leu Asp Arg Ser Ser Ser Val Gly Cys Leu Ala
2345 2350 2355
Glu Ala Ser Ala Arg Phe Pro Ala Arg Thr Arg Asn Leu Ser Gly
2360 2365 2370
Glu Pro Arg Thr Arg Gln Asp Ser Pro Lys Pro Ser Gly Ser Gly
2375 2380 2385
Glu Pro Arg Ala His Pro His Gln Pro Glu Asp Arg Val Pro Pro
2390 2395 2400
Asn Ala
2405

Claims (34)

1.一种分离的核酸，其编码：
(i)包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的第一区域；和，
(ii)包含编码至少一个骨代谢调节剂的转基因的第二区域。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中所述骨代谢调节剂是骨形成促进剂，任选地，其中所述骨形成促进剂选自由以下组成的组：促进成骨细胞和/或骨细胞功能或活性的蛋白、抑制破骨细胞功能的蛋白和抑制破骨细胞表达或活性的抑制性核酸。
3.如权利要求1所述的分离的核酸，其中所述骨代谢调节剂是骨形成抑制剂，任选地，其中所述骨形成抑制剂选自由以下组成的组：抑制成骨细胞和/或骨细胞功能或活性的蛋白、促进破骨细胞功能或活性的蛋白和抑制成骨细胞表达或活性的抑制性核酸。
4.如权利要求2所述的分离的核酸，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的骨形成促进剂：甲状旁腺激素(PTH)、PTH相关蛋白(PTHrP)、去糖化酶DJ1、靶向骨硬化蛋白(SOST)的抑制性核酸、靶向schnurri-3(SHN3)的抑制性核酸、靶向组织蛋白酶K(CTSK)的抑制性核酸和靶向NF-κβ的受体激活剂(RANK)的抑制性核酸。
5.如权利要求3所述的分离的核酸，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的骨形成抑制剂：骨硬化蛋白(SOST)、schnurri-3(SHN3)、组织蛋白酶K(CTSK)、靶向甲状旁腺激素(PTH)的抑制性核酸、靶向PTH相关蛋白(PTHrP)的抑制性核酸和靶向去糖化酶DJ1的抑制性核酸。
6.如权利要求1至5任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因编码至少一种选自由dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和人工miRNA(amiRNA)组成的组的抑制性核酸。
7.如权利要求6所述的分离的核酸，其中所述抑制性核酸的功能为突变的末端重复(mTR)。
8.如权利要求1至7任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因包含SEQ ID NO:1-15或55-56中任何一个所示的序列。
9.如权利要求1至8任一项所述的分离的核酸，其进一步包含至少一个有效连接至所述转基因的启动子。
10.如权利要求1至9任一项所述的分离的核酸，其进一步包含含有第二AAV ITR或其变体的第三区域。
11.一种载体，其包含权利要求1至10任一项所述的分离的核酸，任选地，其中所述载体是质粒。
12.一种宿主细胞，其包含权利要求1至10任一项所述的分离的核酸或权利要求11所述的载体。
13.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：
(i)衣壳蛋白；和，
(ii)权利要求1至10任一项所述的分离的核酸。
14.如权利要求13所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白具有选自以下的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh39、AAV.43、AAV2/2-66、AAV2/2-84和AAV2/2-125或前述任一种的变体，任选地，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NOs:18-34中任一个所示的序列。
15.如权利要求14所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白转导成骨细胞(OB)，任选地，其中所述衣壳蛋白具有选自AAV4、AAV1、AAV6、AAV6.2和AAV9或前述任一种的变体的血清型。
16.如权利要求14所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白转导破骨细胞(OC)，任选地，其中所述衣壳蛋白具有选自AAV1、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV.rh39、AAV.rh43或前述任一种的变体的血清型。
17.如权利要求13至16任一项所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白包含异源骨靶向肽。
18.如权利要求17所述的rAAV，其中所述异源骨靶向肽包含SEQ ID NO:16、17、57、58、59、60、61、62或63所示的氨基酸序列。
19.如权利要求17或18所述的rAAV，其中将编码所述异源骨靶向肽的核酸序列插入衣壳蛋白的VP2开放阅读框中，任选地，其中将所述核酸序列插入对应于编码所述AAV9衣壳蛋白的核酸序列的N587和R588的密码子之间。
20.如权利要求13至16任一项所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白由具有一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸的氨基酸序列编码。
21.如权利要求20所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白经由一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸结合至一个或多个阿仑膦酸盐(Ale)部分。
22.如权利要求13至21任一项所述的rAAV，其中所述rAAV是自互补AAV(scAAV)。
23.一种编码包含异源骨靶向肽的重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白的分离的核酸，任选地，其中所述异源骨靶向肽包含SEQ ID NO:16、17、57、58、59、60、61、62或63所示的氨基酸序列。
24.一种包含一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸的重组AAV衣壳蛋白，任选地，其中所述衣壳蛋白经由一个或多个携带叠氮化物的非天然氨基酸结合至一个或多个阿仑膦酸盐(Ale)部分。
25.一种将转基因递送至骨组织的方法，该方法包括施用权利要求1至10任一项所述的分离的核酸或权利要求13至22任一项所述的rAAV给受试者。
26.一种治疗与骨密度降低有关的疾病或病症的方法，该方法包括施用权利要求13至22任一项所述的rAAV给患有或怀疑患有与骨密度降低有关的疾病或病症的受试者，其中转基因编码骨形成促进剂，任选地，其中所述骨形成促进剂选自由以下组成的组：促进成骨细胞和/或破骨细胞功能或活性的蛋白、抑制破骨细胞功能或活性的蛋白和抑制破骨细胞表达或活性的抑制性核酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述骨形成促进剂选自由以下组成的组：甲状旁腺激素(PTH)、PTH相关蛋白(PTHrP)、去糖化酶DJ1、靶向骨硬化蛋白(SOST)的抑制性核酸、靶向schnurri-3(SHN3)的抑制性核酸、靶向组织蛋白酶K(CTSK)的抑制性核酸和靶向NF-κβ的受体激活剂(RANK)的抑制性核酸。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述与骨密度降低有关的疾病或病症是骨质疏松症、临界大小骨缺损、由废用或受伤引起的机械性病症以及例如乳腺癌或前列腺癌转移的继发性病症、1型糖尿病、狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、甲状腺功能亢进、乳糜泻、哮喘、多发性硬化和牙周炎。
29.一种治疗与骨密度畸形和夸张(例如，增加)有关的疾病或病症的方法，该方法包括施用权利要求13至22任一项所述的rAAV给患有或怀疑患有与骨密度增加有关的疾病或病症的受试者，其中转基因编码骨形成抑制剂，任选地，其中所述骨形成抑制剂选自由以下组成的组：抑制成骨细胞和/或骨细胞功能或活性的蛋白、促进破骨细胞功能或活性的蛋白和抑制成骨细胞表达或活性的抑制性核酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述骨形成抑制剂选自由以下组成的组：骨硬化蛋白(SOST)、schnurri-3(SHN3)、组织蛋白酶K(CTSK)、靶向甲状旁腺激素(PTH)的抑制性核酸、靶向PTH相关蛋白(PTHrP)的抑制性核酸、靶向去糖化酶DJ1的抑制性核酸和靶向NF-κβ的受体激活剂(RANK)的抑制性核酸。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述与骨密度畸形和夸张(例如，增加)有关的疾病或病症是骨硬化症、致密性成骨不全症、硬化性狭窄病、肢端肥大症、氟蚀病、骨髓纤维化、丙型肝炎相关性骨硬化症、异养性骨化和骨癌，例如骨肉瘤和转移性骨癌。
32.如权利要求25至31任一项所述的方法，其中所述施用通过注射进行，任选地，其中所述注射是全身注射(例如，静脉内注射)，和局部注射(例如，肌肉内(IM)注射、膝注射和股骨骨髓内注射)。
33.如权利要求26至31任一项所述的方法，其中所述施用通过将包含权利要求13至22任一项所述的rAAV的组织或移植物植入所述受试者进行。
34.如权利要求25至33任一项所述的方法，其中所述施用导致选自由成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和软骨细胞组成的组的细胞类型的转导。
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