JP2023510784A - 脳腫瘍を処置するための血液脳関門を横断する免疫療法剤を送達するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本出願は、血液脳関門を横断する免疫療法剤の浸透を増強する配列、その配列を含む組成物、および脳腫瘍、例えば、膠芽腫（ＧＢＭ）を処置するためのその使用方法に関する。
Description
優先権の主張
本出願は、２０２０年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９５９，６２５号明細書の利益を主張する。前述の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９５９，６２５号明細書の利益を主張する。前述の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
血液脳関門を横断する免疫療法剤の浸透を増強する配列、その配列を含む組成物、および脳腫瘍、例えば、膠芽腫（ＧＢＭ）を処置するためのその使用方法が、本明細書に記載される。
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人において最も一般的で致命的な脳腫瘍であり、全生存期間中央値は１５ヶ月のみである１。約１２，０００の新たなＧＢＭの症例が、米国において毎年診断されており、発症率は人口１００，０００人当たり３．２人である２。ＧＢＭの組織学、分子ランドスケープおよび腫瘍微小環境の理解において著しい進展があったにもかかわらず３～６、２００５年以降、治療上の進歩はほとんどなかった。ＧＢＭに関する本発明者らの豊富な知識を、効果的な治療に転換させる際の１つの重大な障害は、ＧＢＭ腫瘍部位への非効率な薬物送達である。ＧＢＭ腫瘍は構造的に十分に血管形成されているので７、静脈内投与は、理論上、良好な腫瘍適用範囲を達成することができる、便利で、広く適用可能な薬物投与経路である。しかしながら、血液脳関門（ＢＢＢ）および／または血液腫瘍関門を超える薬物の設計は困難なままである。
膠芽腫は、従来の方法を使用して処置することが困難である非常に致命的な脳腫瘍である。全身に投与されるがん遺伝子治療は、膠芽腫に取り組むための新しい治療パラダイムである。膠芽腫遺伝子治療のための血管内遺伝子送達プラットフォームを確立するように、例えば、膠芽腫の処置のためにＰＤ－Ｌ１抗体を全身に送達するように、操作された脳透過性ＡＡＶウイルスベクターが本明細書に記載される。
したがって、対象におけるがんに免疫療法剤を送達するための方法が本明細書に提供される。この方法は、（ｉ）配列ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）免疫療法剤をコードする導入遺伝子とを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、対象に投与するステップを含み、必要に応じて、がん細胞はヒト対象の脳内にある。
一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも６個の連続するアミノ酸を含む。
また、対象におけるがんに免疫療法剤を送達するための方法も本明細書に提供される。この方法は、（ｉ）配列Ｖ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号７９）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号８０）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＫ（配列番号８１）、またはＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＦＫ．（配列番号８２）からの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）免疫療法剤をコードする導入遺伝子とを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、対象に投与するステップを含み、必要に応じて、がん細胞がヒト対象の脳内にある。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）；ＶＳＡＬＫ（配列番号２）；ＴＶＰＡＬＲ（配列番号３）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＰＭＬＫ（配列番号１２）；ＴＶＰＴＬＫ（配列番号１３）；ＦＴＶＳＡＬＫ（配列番号５）；ＬＴＶＳＡＬＫ（配列番号６）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＰＡＬＦＲ（配列番号９）；ＴＶＰＭＬＦＫ（配列番号１０）またはＴＶＰＴＬＦＫ（配列番号１１）を含む。
一部の実施形態では、免疫療法剤をコードする導入遺伝子は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的化する抗体をコードする。
一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。
一部の実施形態では、ＡＡＶ９は、ＡＡＶ９ ＶＰ１を含む。
一部の実施形態では、標的化配列は、配列番号８５を含むＡＡＶ９ ＶＰ１のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入されている。
一部の実施形態では、細胞は、対象の脳内にあり、ＡＡＶは、非経口送達、脳内、または髄腔内送達によって投与される。
一部の実施形態では、非経口送達は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内送達による。
一部の実施形態では、髄腔内送達は、腰椎注射、大槽注射、または実質内注射による。
一部の実施形態では、この方法は、化学療法剤、放射線、および／または外科的切除を対象に投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、化学療法剤は、テモゾラミド（temozolamide）、ロムスチン、またはそれらの組合せを含む。
別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語の全ては、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明に使用するために本明細書に記載され、当該技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用されてもよい。材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書に述べられている全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が優先する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
ＢＢＢを横断する送達に関連する困難さが、がんを含む脳障害を処置するための治療剤の開発を妨げてきた。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、脳、脊髄および眼に治療遺伝子を送達するための重要な研究および臨床手段として浮上した。例えば、米国特許第９１０２９４９号明細書；米国特許第９５８５９７１号明細書；および米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書を参照されたい。ＡＡＶによって媒介される遺伝子治療は、ラクスターナ（Luxturna）およびゾルゲンスマ（Zolgensma）の最近の承認により大幅な進歩をした。２歳未満の脊髄性筋萎縮症患者の血管内処置に対するゾルゲンスマの承認は、それが、中枢神経系（ＣＮＳ）の全身遺伝子治療のためにＢＢＢを超えるＡＡＶベクターを使用する実現可能性を実証しているため、特に有望である。若い患者でのその成功にもかかわらず、ゾルゲンスマに使用されるＡＡＶ血清型であるＡＡＶ９は、特に成人においてＢＢＢを超える低い効率に悩まされており、他のＣＮＳ疾患に対するその適用を制限している８、９。齧歯動物および非ヒト霊長類の両方において現在の工業標準（すなわち、ＡＡＶ９）より少なくとも５～１０倍の増強を達成し、ＧＢＭがん遺伝子治療のために新しいＢＢＢを超えるＡＡＶプラットフォームのために使用され得る、次世代の脳透過性ＡＡＶベクター（すなわち、ＡＡＶ．ＣＰＰ１６）が本明細書に記載される。
公知の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に基づく合理的な設計および標的化スクリーニング（例えば、Gomez et al., Bax-inhibiting peptides derived from Ku70 and cell-penetrating pentapeptides. Biochem. Soc. Trans. 2007;35(Pt 4):797-801を参照されたい）を通じて、ＡＡＶのカプシドへと操作されると、脳への遺伝子送達の効率が最大３桁まで改善した標的化配列が発見されている。これらの方法は、膠芽腫の動物モデルにおいて腫瘍サイズを劇的に減少させるＡＡＶベクターを操作するために使用された。
さらに、脳は、ＧＢＭの免疫療法を困難にする、「免疫特権」を持っている。免疫学的に「冷たい」ＧＢＭ腫瘍を免疫原性の「熱い」ＧＢＭ腫瘍に変えるために免疫応答を「プライミング」することが望ましい。本方法は、まさにこれを達成し得る免疫療法剤、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を送達するために本明細書に記載されるベクターを使用する。理論に束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶベクター自体は、細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増加させることによって免疫系を「プライミング」するが、腫瘍部位、および全体としてＣＮＳにおいて発現された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、その他の方法で「枯渇した」Ｔ細胞を活性化すると考えられる。
標的化配列
本方法は、例えば、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９のカプシド内に挿入されると、または化学的にもしくは融合タンパク質としての発現により、生物学的因子、例えば、抗体もしくは他の大きな生体分子にコンジュゲートすると、ＢＢＢを通過する浸透性を増強する複数の可能性のある標的化ペプチドを同定した。
本方法は、例えば、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９のカプシド内に挿入されると、または化学的にもしくは融合タンパク質としての発現により、生物学的因子、例えば、抗体もしくは他の大きな生体分子にコンジュゲートすると、ＢＢＢを通過する浸透性を増強する複数の可能性のある標的化ペプチドを同定した。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも４個、例えば、配列ＶＰＡＬＲ（配列番号１）およびＶＳＡＬＫ（配列番号２）の５個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７３）。
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７３）。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも４個、例えば、配列ＴＶＰＡＬＲ（配列番号３）、ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）、ＴＶＰＭＬＫ（配列番号１２）、およびＴＶＰＴＬＫ（配列番号１３）の５個または６個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１は、Ｔであり、
（ｉｉ）Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７４）。
（ｉ）Ｘ１は、Ｔであり、
（ｉｉ）Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７４）。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭからの任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、ＥまたはＤである（配列番号７５）。
（ｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭからの任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、ＥまたはＤである（配列番号７５）。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも４個、例えば、配列ＦＴＶＳＡＬＫ（配列番号５）、ＬＴＶＳＡＬＫ（配列番号６）、ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）、ＴＶＰＡＬＦＲ（配列番号９）、ＴＶＰＭＬＦＫ（配列番号１０）、およびＴＶＰＴＬＦＫ（配列番号１１）の５個、６個、または７個の連続するアミノ酸を含む。一部の他の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、またはＹであり、
（ｉｉ）Ｘ２は、Ｔであり、
（ｉｉｉ）Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｖ）Ｘ７は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７６）。
（ｉ）Ｘ１は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、またはＹであり、
（ｉｉ）Ｘ２は、Ｔであり、
（ｉｉｉ）Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｖ）Ｘ７は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７６）。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１は、Ｔであり、
（ｉｉ）Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、
（ｉｖ）Ｘ７は、ＥまたはＤである（配列番号７７）。
（ｉ）Ｘ１は、Ｔであり、
（ｉｉ）Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、
（ｉｖ）Ｘ７は、ＥまたはＤである（配列番号７７）。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、ＥまたはＤであり、
（ｉｖ）Ｘ７は、ＡまたはＩである（配列番号７８）。
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の同一ではないアミノ酸であり、
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、
（ｉｉｉ）Ｘ６は、ＥまたはＤであり、
（ｉｖ）Ｘ７は、ＡまたはＩである（配列番号７８）。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｖ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌの配列（配列番号７９）を含み、大文字がその位置で好ましい。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌの配列（配列番号８０）を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＫの配列（配列番号８１）を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＦＫ．の配列（配列番号８２）を含む。
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）またはＶＳＡＬＫ（配列番号２）からならない。
上述の５個、６個、または７個のアミノ酸配列を含む具体的な例示的なアミノ酸配列は、表１に列挙される。
反転した配列を含む標的化ペプチド、例えば、ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）およびＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）も使用されてもよい。
本明細書に開示される標的化ペプチドは、ペプチド模倣物を製造するための当該技術分野で公知の方法に従って改変され得る。例えば、Qvit et al., Drug Discov Today. 2017 Feb; 22(2): 454-462; Farhadi and Hashemian, Drug Des Devel Ther. 2018; 12: 1239-1254; Avan et al., Chem. Soc. Rev., 2014,43, 3575-3594; Pathak, et al., Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2015. 8; Kazmierski, W.M., ed., Peptidomimetics Protocols, Human Press (Totowa NJ 1998); Goodman et al., eds., Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003);およびMayo et al., J. Biol. Chem., 278:45746 (2003)を参照されたい。一部の場合、本明細書に開示されるペプチドおよび断片のこれらの改変されたペプチド模倣物型は、非ペプチド模倣物のペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで増強した安定性を示す。
ペプチド模倣物を作製するための方法は、ペプチド配列におけるアミノ酸の１つまたは複数、例えば、全てを、Ｄ－アミノ酸エナンチオマーで置換することを含む。そのような配列は、本明細書では「レトロ」配列と称される。別の方法では、元のペプチドのＮ末端からＣ末端のアミノ酸残基の順序が、改変されたペプチド模倣物においてＣ末端からＮ末端のアミノ酸残基の順序になるように、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端の順序が反転されている。そのような配列は、「インベルソ」配列と称され得る。
ペプチド模倣物は、レトロおよびインベルソ型の両方、すなわち、本明細書に開示されるペプチドの「レトロ－インベルソ」型であり得る。新しいペプチド模倣物は、ペプチド模倣物におけるＮ末端からＣ末端のアミノ酸残基の順序が、元のペプチドにおけるＣ末端からＮ末端のアミノ酸残基の順序に対応するように配置されたＤアミノ酸から構成され得る。
ペプチド模倣物を作製するための他の方法は、ペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸残基を、アミノ酸の化学的に異なるが、認識された機能的類似体、すなわち、人工アミノ酸類似体で置き換えることを含む。人工アミノ酸類似体には、β－アミノ酸、β－置換β－アミノ酸（「β３－アミノ酸」）、∀－アミノホスホン酸および∀－アミノホスフィン酸などのアミノ酸の亜リン酸類似体、ならびに非ペプチド結合を有するアミノ酸が含まれる。人工アミノ酸は、ペプトイドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドまたはエステル類似体）、β－ペプチド、環状ペプチド、オリゴ尿素もしくはオリゴカルバメートペプチドなどのペプチド模倣物；または複素環分子を作製するために使用され得る。例示的なレトロ－インベルソ標的化ペプチド模倣物は、ＫＬＡＳＶＴおよびＫＦＬＡＳＶＴを含み、その配列は全てのＤアミノ酸を含む。これらの配列は、例えば、アミノ末端のビオチン化およびカルボキシ末端のアミド化によって改変され得る。
ＡＡＶ
本方法および組成物に使用するためのウイルスベクターには、本明細書に記載される標的化ペプチドおよび必要に応じて、標的組織で発現するための導入遺伝子を含む、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。
本方法および組成物に使用するためのウイルスベクターには、本明細書に記載される標的化ペプチドおよび必要に応じて、標的組織で発現するための導入遺伝子を含む、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。
本方法における核酸の送達に有用な好ましいウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、２５ｎｍのカプシドを有する小さな非エンベロープウイルスである。野生型ウイルスに関連する疾患は知れていないか、または示されていない。ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、長期のエピソーム導入遺伝子発現を提示することが示されており、ＡＡＶは、脳、特に神経細胞において優れた導入遺伝子発現を実証した。わずかに３００塩基対のＡＡＶを含むベクターはパッケージングされ得、組み込むことができる。外因性ＤＮＡについての空間は、約４．７ｋｂに制限されている。Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)に記載されているようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用され得る。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されている（例えば、Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985); Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988); Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984);およびFlotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)を参照されたい）。多くの代替のＡＡＶバリアントが存在し（１００超がクローニングされている）、ＡＡＶバリアントは、所望の特徴に基づいて同定されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３またはＣＳｐ３であり；ＣＮＳでの使用では、一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。一例として、ＡＡＶ９は、ある程度効率的に血液脳関門を超えることが示されている。本方法を使用して、ＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質への、例えば、アミノ酸５８８および５８９の間のＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１への、本明細書に記載される標的化配列の挿入によって、ＢＢＢを横断するか、または特定の組織内への浸透を増加させるように遺伝子操作され得る。
例示的な野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１（Ｑ６ＪＣ４０－１）配列は、以下の通りである：
したがって、本明細書に記載される標的化ペプチド配列の１つまたは複数を含むＡＡＶ、例えば、本明細書に記載される標的化配列を含むカプシドタンパク質、例えば、配列番号１を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶが本明細書に提供され、標的化ペプチド配列は、例えば、アミノ酸５８８および５８９の間の配列に挿入されている。
免疫療法導入遺伝子
一部の実施形態では、ＡＡＶはまた、例えば、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で公知のような、免疫療法剤をコードする導入遺伝子配列（すなわち、異種配列）を含む。導入遺伝子は、好ましくは、標的組織における導入遺伝子の発現を促進／駆動する配列に連結される。
一部の実施形態では、ＡＡＶはまた、例えば、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で公知のような、免疫療法剤をコードする導入遺伝子配列（すなわち、異種配列）を含む。導入遺伝子は、好ましくは、標的組織における導入遺伝子の発現を促進／駆動する配列に連結される。
免疫療法剤として使用するための例示的な導入遺伝子は、免疫チェックポイント阻害抗体またはその抗原結合断片、例えば、チェックポイント阻害剤として作用する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体をコードするものを含む。
免疫療法の例には、限定されないが、がん細胞を認識するためにTリンパ球を誘導するように設計された養子T細胞療法またはがんワクチン製剤、および抗ＣＤ１３７抗体（例えば、ＢＭＳ－６６３５１３）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ／ＭＫ－３４７５、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１））、抗ＰＤＬ１抗体（例えば、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、または抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピルミマブ（ipilumimab）；例えば、Kruger et al. (2007) Histol Histopathol. 22(6): 687-96; Eggermont et al. (2010) Semin Oncol. 37(5): 455-9; Klinke (2010) Mol. Cancer. 9: 242; Alexandrescu et al. (2010) J. Immunother. 33(6): 570-90; Moschella et al. (2010) Ann N Y Acad Sci. 1194: 169-78; Ganesan and Bakhshi (2010) Natl. Med. J. India 23(1): 21-7;およびGolovina and Vonderheide (2010) Cancer J. 16(4): 342-7を参照されたい）などのチェックポイント阻害剤が含まれる。
本明細書に記載される方法に使用され得る例示的な抗ＰＤ－１抗体には、ヒトＰＤ－１に結合するものが含まれ、例示的なＰＤ－１タンパク質配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００５００９．２で提供される。例示的な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書；同第９，０７３，９９４号明細書；および米国特許出願公開第２０１１／０２７１３５８号明細書に記載されており、例えば、ＰＦ－０６８０１５９１、ＡＭＰ－２２４、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ７５４０９１、ＪＳ００１、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ－１２１０、ＴＳＲ－０４２、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アベルマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、ピジリズマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、およびアテゾリズマブが含まれる。
本明細書に記載される方法に使用され得る例示的な抗ＣＤ４０抗体には、ヒトＣＤ４０に結合するものが含まれ、例示的なＣＤ４０タンパク質前駆体配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２４１．１、ＮＰ＿６９０５９３．１、ＮＰ＿００１３０９３５１．１、ＮＰ＿００１３０９３５０．１およびＮＰ＿００１２８９６８２．１で提供される。例示的な抗体には、国際公開第２００２／０８８１８６号パンフレット；国際公開第２００７／１２４２９９号パンフレット；国際公開第２０１１／１２３４８９号パンフレット；国際公開第２０１２／１４９３５６号パンフレット；国際公開第２０１２／１１１７６２号パンフレット；国際公開第２０１４／０７０９３４号パンフレット；米国特許出願公開第２０１３／００１１４０５号明細書；同第２００７／０１４８１６３号明細書；同第２００４／０１２０９４８号明細書；同第２００３／０１６５４９９号明細書；および米国特許第８，５９１，９００号明細書に記載されているものが含まれ、例えば、ダセツズマブ、ルカツムマブ、ブレセルマブ、テネリキシマブ、ＡＤＣ－１０１３、ＣＰ－８７０、８９３、Ｃｈｉ Ｌｏｂ ７／４、ＨＣＤ１２２、ＳＧＮ－４、ＳＥＡ－ＣＤ４０、ＢＭＳ－９８６００４、およびＡＰＸ００５Ｍが含まれる。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０アゴニストであり、ＣＤ４０アンタゴニストではない。
本明細書に記載される方法に使用され得る例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体には、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合するものが含まれ、例示的なＰＤ－Ｌ１タンパク質配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＰ＿００１３００９５８．１、およびＮＰ＿０５４８６２．１で提供される。例示的な抗体は、米国特許出願公開第２０１７／００５８０３３号明細書；国際公開第２０１７／１１８３２１Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１６／０６１１４２Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１６／００７２３５Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１４／１９５８５２Ａ１号パンフレット；および国際公開第２０１３／０７９１７４Ａ１号パンフレットに記載されており、例えば、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、アテゾリズマブ（テセントリク、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（バベンチオ）、デュルバルマブ（イミフィンジ、ＭＥＤＩ－４７３６）、エンバフォリマブ（ＫＮ０３５）、ＣＫ－３０１、ＣＳ－１００１、ＳＨＲ－１３１６（ＨＴＩ－１０８８）、ＣＢＴ－５０２（ＴＱＢ－２４５０）、ＢＧＢ－Ａ３３３、およびＢＭＳ－９８６１８９が含まれる。非抗体ペプチド阻害剤、例えば、ＡＵＮＰ１２、ＣＡ－１７０も使用され得る。Akinleye & Rasool, Journal of Hematology & Oncology 12:92 (2019) doi:10.1186/s13045-019-0779-5も参照されたい。
一部の実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合部分、例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＰＤ－Ｌ１．Ｈｕ）に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体であるか、またはそれらを含み、抗ＰＤＬ１抗体ｓｃＦｖをコードする例示的な配列は、配列番号１０５に示されるか、または例えば、シグナルペプチド、ＨＡ－タグ、およびＭｙｃ－タグの１つ、２つまたはそれ以上を欠き、例えば、配列番号１０５のアミノ酸（ａａ）３１～５１３を含む、その部分である。
例示的な抗ＰＤＬ１ ｓｃＦｖ配列（シグナルペプチド（ａａ１～２１）；ＨＡ－タグ、ａａ２１～３０；Ｍｙｃ－タグ、ａａ５１４～５２３）
以下は、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１核酸配列（シグナルペプチド（ｎｔ１～６３）；ＨＡ－タグ、ｎｔ６４～９０；Ｍｙｃ－タグ、ｎｔ１５４０～１５６９）である
他の抗体、およびそのような抗体をコードする核酸を生成するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Li et al., Int J Mol Sci. 2016 Jul; 17(7): 1151; Engeland et al., Mol Ther. 2014 Nov; 22(11): 1949-1959、および上記の参考文献を参照されたい。
ウイルスはまた、導入遺伝子の発現を促進する１つまたは複数の配列、例えば、１つもしくは複数のプロモーター配列；エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；および／またはインスレーター配列を含み得る。一部の実施形態では、プロモーターは、脳組織特異的プロモーター、例えば、神経細胞特異的またはグリア特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、神経核（ＮｅｕＮ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＭｅＣＰ２、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、神経細胞特異的エノラーゼおよび血小板由来成長因子ベータ鎖から選択される遺伝子のプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、汎細胞型プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターである。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答エレメント（ＷＰＲＥ）も使用され得る。一部の実施形態では、ヒトシグナルまたはリーダー配列、例えば、ＩｇＫリーダー配列が使用される。一部の実施形態では、以下の表に示されるように、ヒトシグナル配列が代わりに使用される（表は、novoprolabs.com/support/articles/commonly-used-leader-peptide-sequences-for-efficient-secretion-of-a-recombinant-protein-expressed-in-mammalian-cells-201804211337.htmlから編集した）。
一部の実施形態では、例えば、von Heijne, J Mol Biol. 1985 Jul 5;184(1):99-105; Kober et al., Biotechnol. Bioeng. 2013; 110: 1164-1173; Tsuchiya et al., Nucleic Acids Research Supplenzent No. 3 261 -262 (2003)に記載されているように、抗体の分泌を促進する分泌配列が使用される。
一部の実施形態では、ＡＡＶはまた、標的組織、例えば、ＣＮＳへの送達を増加させるか、もしくは組織のオフターゲティングを低減させる１つもしくは複数のさらなる変異、例えば、ＣＮＳ、心臓、もしくは筋肉送達が意図される場合、肝臓送達を減少させる変異（例えば、Pulicherla et al. (2011) Mol Ther 19:1070-078に記載されている）；または例えば、Chen et al. (2008) Nat Med 15:1215-1218もしくはXu et al., (2005) Virology 341:203-214もしくは米国特許第９１０２９４９号明細書；米国特許第９５８５９７１号明細書；および米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書に記載されているように、他の標的化ペプチドの追加を有する。また、sfn.org/~/media/SfN/Documents/Short%20Courses/2011%20Short%20Course%20I/2011_SC1_Gray.ashxで入手可能な、Gray and Samulski (2011) “Vector design and considerations for CNS applications,” in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders ed. Glorioso J., editor. (Washington, DC: Society for Neuroscience;) 1-9も参照されたい。
使用方法
本明細書に記載される方法および組成物は、免疫療法組成物を、組織、例えば、中枢神経系（脳）、心臓、筋肉、または後根神経節もしくは脊髄（末梢神経系）に送達するために使用され得る。一部の実施形態では、方法は、特定の脳領域、例えば、大脳皮質、小脳、海馬、黒質、または扁桃体への送達を含む。一部の実施形態では、方法は、神経細胞、星状膠細胞、および／またはグリア細胞への送達を含む。
本明細書に記載される方法および組成物は、免疫療法組成物を、組織、例えば、中枢神経系（脳）、心臓、筋肉、または後根神経節もしくは脊髄（末梢神経系）に送達するために使用され得る。一部の実施形態では、方法は、特定の脳領域、例えば、大脳皮質、小脳、海馬、黒質、または扁桃体への送達を含む。一部の実施形態では、方法は、神経細胞、星状膠細胞、および／またはグリア細胞への送達を含む。
一部の実施形態では、方法および組成物、例えば、ＡＡＶは、免疫療法剤をコードする核酸配列を、脳腫瘍を有する対象に送達するために使用される。脳腫瘍には、神経膠腫（例えば、多形性膠芽腫（ＧＢＭ））、転移（例えば、肺がん、乳がん、黒色腫、または結腸がんから）、髄膜腫、下垂体腺腫、および聴神経腫が含まれる。したがって、方法は、本明細書に記載される標的化ペプチドを含み、免疫療法剤をコードするＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）（例えば、本明細書ではＡＡＶ．ＣＰＰ１６としても称される、ＣＰＰ１６が挿入されたＡＡＶ９）を、脳腫瘍と診断された対象に、全身、例えば、静脈内投与することを含み得る。
一部の実施形態では、方法はまた、化学療法剤を同時投与することを含む。一部の実施形態では、化学療法剤は、限定されないが、テモゾラミド、ロムスチン、またはそれらの組合せを含む、毒素または細胞傷害性薬物である。例えば、Herrlinger et al., Lancet. 2019 Feb 16;393(10172):678-688を参照されたい。方法はまた、放射線、外科的切除、またはその両方を投与することを含み得る。
医薬組成物および投与方法
本明細書に記載される方法は、（ｉ）標的化ペプチド、および（ｉｉ）有効成分として免疫療法剤をコードする配列を含むＡＡＶを含む医薬組成物の使用を含む。
本明細書に記載される方法は、（ｉ）標的化ペプチド、および（ｉｉ）有効成分として免疫療法剤をコードする配列を含むＡＡＶを含む医薬組成物の使用を含む。
医薬組成物は、典型的に、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という言語は、医薬投与と適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
医薬組成物は、典型的に、その意図する投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または注射もしくは注入投与が含まれる。したがって、送達は、全身的であってもよいか、または局所的であってもよい。
適切な医薬組成物を製剤化する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005;およびシリーズのDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)の書籍を参照されたい。例えば、非経口適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入することができる。
注射用使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散系および滅菌注射溶液もしくは分散系の即時調製のための滅菌粉末を含むことができる。静脈内投与について、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射可能である限りにおいて流体であるべきである。これは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合、必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌濾過することによって調製され得る。一般に、分散系は、基本的な分散媒および上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、有効成分に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液から任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
一実施形態では、治療用化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの身体からの急速な排出から治療用化合物を保護する担体により調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーが使用されてもよい。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製され得るか、または例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得られ得る。リポソーム懸濁液（細胞性抗原に対するモノクローナル抗体により選択された細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
医薬組成物は、投与のための使用説明書と一緒にキット、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例にさらに記載される。
材料および方法
以下の材料および方法を以下の実施例において使用した。
以下の材料および方法を以下の実施例において使用した。
１．カプシドバリアントの生成
カプシドバリアントプラスミドを生成するために、細胞透過性ペプチド（表３）をコードするＤＮＡ断片を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＣｌｏｎｅＥＺシームレスクローニング技術（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用してアミノ酸位置５８８および５８９（ＶＰＡアミノ酸番号付け）の間でＡＡＶ９ Ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド（ｐＲＣ９）の主鎖に挿入した。ＣＰＰ ＢＩＰ１（ＶＰＡＬＲ、配列番号１）およびＢＩＰ２（ＶＳＡＬＫ、配列番号２）、ならびにそれらの誘導体、例えば、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６におけるＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１におけるＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）は、Ｋｕ７０タンパク質に由来し、その配列は以下に提供される：
カプシドバリアントプラスミドを生成するために、細胞透過性ペプチド（表３）をコードするＤＮＡ断片を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＣｌｏｎｅＥＺシームレスクローニング技術（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用してアミノ酸位置５８８および５８９（ＶＰＡアミノ酸番号付け）の間でＡＡＶ９ Ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド（ｐＲＣ９）の主鎖に挿入した。ＣＰＰ ＢＩＰ１（ＶＰＡＬＲ、配列番号１）およびＢＩＰ２（ＶＳＡＬＫ、配列番号２）、ならびにそれらの誘導体、例えば、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６におけるＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１におけるＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）は、Ｋｕ７０タンパク質に由来し、その配列は以下に提供される：
さらに、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１についてのＶＰ１タンパク質配列は、以下に提供される：
２．組換えＡＡＶの製造
標準的な３プラスミド共トランスフェクションプロトコール（ｐＲＣプラスミド、ｐヘルパープラスミド、およびｐＡＡＶプラスミド）を使用して、組換えＡＡＶをパッケージングした。導入遺伝子（例えば、ユビキタスＥＦ１ａプロモーターにより駆動される核指向性（nucleus-directed）ＲＦＰ Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を有するｐＲＣ９（またはそのバリアント）、ｐヘルパー、およびｐＡＡＶを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。ｒＡＡＶベクターを、トランスフェクションの７２時間および１２０時間後に血清フリー培地から回収し、ならびにトランスフェクションの１２０時間後に細胞から回収した。この培地中のＡＡＶ粒子を、８％のＰＥＧ－８０００（重量／体積）によるＰＥＧ沈殿法を使用して濃縮した。ウイルス粒子を含む細胞ペレットを再懸濁させ、超音波処理により溶解させた。ＰＥＧ沈殿および細胞溶解物から組み合わせたウイルスベクターを、３０分にわたり３７℃でＤＮアーゼおよびＲＮアーゼにより処理し、次いで超遠心分離（ＶＴｉ ５０ローター、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ、１８℃、１時間）によるイオジキサノール勾配（１５％、２５％、４０％、および６０％）によって精製した。次いで、ｒＡＡＶを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎフィルタユニット（ＵＦＣ９１０００８、１００Ｋ ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で製剤化した。
標準的な３プラスミド共トランスフェクションプロトコール（ｐＲＣプラスミド、ｐヘルパープラスミド、およびｐＡＡＶプラスミド）を使用して、組換えＡＡＶをパッケージングした。導入遺伝子（例えば、ユビキタスＥＦ１ａプロモーターにより駆動される核指向性（nucleus-directed）ＲＦＰ Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を有するｐＲＣ９（またはそのバリアント）、ｐヘルパー、およびｐＡＡＶを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。ｒＡＡＶベクターを、トランスフェクションの７２時間および１２０時間後に血清フリー培地から回収し、ならびにトランスフェクションの１２０時間後に細胞から回収した。この培地中のＡＡＶ粒子を、８％のＰＥＧ－８０００（重量／体積）によるＰＥＧ沈殿法を使用して濃縮した。ウイルス粒子を含む細胞ペレットを再懸濁させ、超音波処理により溶解させた。ＰＥＧ沈殿および細胞溶解物から組み合わせたウイルスベクターを、３０分にわたり３７℃でＤＮアーゼおよびＲＮアーゼにより処理し、次いで超遠心分離（ＶＴｉ ５０ローター、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ、１８℃、１時間）によるイオジキサノール勾配（１５％、２５％、４０％、および６０％）によって精製した。次いで、ｒＡＡＶを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎフィルタユニット（ＵＦＣ９１０００８、１００Ｋ ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で製剤化した。
３．ＡＡＶ滴定
ウイルス力価を、定量ＰＣＲを使用してＤＮアーゼ耐性ゲノムコピーを測定することにより決定した。ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰをＰＶＵＩＩ（ＮＥＢ）で消化してプラスミドＩＴＲ用のフリー末端を生成し、標準曲線の生成に使用した。ウイルス試料をＤＮアーゼＩと共にインキュベートして夾雑ＤＮＡを除去し、続いて水酸化ナトリウム処理してウイルスカプシドを溶解させてウイルスゲノムを放出させた。定量ＰＣＲを、ＩＴＲフォワードプライマー５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ（配列番号９１）およびＩＴＲリバースプライマー５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ（配列番号９２）を使用して実施した。ベクター力価を、ｒＡＡＶ－２参照標準物質（ＲＳＭ、ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＶＲ－１６１６、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に対して正規化した。
ウイルス力価を、定量ＰＣＲを使用してＤＮアーゼ耐性ゲノムコピーを測定することにより決定した。ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰをＰＶＵＩＩ（ＮＥＢ）で消化してプラスミドＩＴＲ用のフリー末端を生成し、標準曲線の生成に使用した。ウイルス試料をＤＮアーゼＩと共にインキュベートして夾雑ＤＮＡを除去し、続いて水酸化ナトリウム処理してウイルスカプシドを溶解させてウイルスゲノムを放出させた。定量ＰＣＲを、ＩＴＲフォワードプライマー５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ（配列番号９１）およびＩＴＲリバースプライマー５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ（配列番号９２）を使用して実施した。ベクター力価を、ｒＡＡＶ－２参照標準物質（ＲＳＭ、ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＶＲ－１６１６、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に対して正規化した。
４．マウスでのＡＡＶの投与
静脈内投与のために、滅菌生理食塩水（０．２ｍｌ）で希釈したＡＡＶを、成体マウス（６週齢超）で尾静脈注射により投与した。次いで、動物を３週間にわたり生存させた後、安楽死させて組織を採取した。脳内注射のために、ＰＢＳ（１０ｕｌ）で希釈したＡＡＶを、十字縫合から１．０ｍｍ右、０．３後方、２．６ｍｍ深さの座標に、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して注射した。全ての動物実験を、ＩＡＣＵＣにより承認されたＡＡＡＬＡＣ認定施設で実施した。
静脈内投与のために、滅菌生理食塩水（０．２ｍｌ）で希釈したＡＡＶを、成体マウス（６週齢超）で尾静脈注射により投与した。次いで、動物を３週間にわたり生存させた後、安楽死させて組織を採取した。脳内注射のために、ＰＢＳ（１０ｕｌ）で希釈したＡＡＶを、十字縫合から１．０ｍｍ右、０．３後方、２．６ｍｍ深さの座標に、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して注射した。全ての動物実験を、ＩＡＣＵＣにより承認されたＡＡＡＬＡＣ認定施設で実施した。
５．マウス組織の処理
麻酔した動物に、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経心的に灌流させ、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に灌流させた。組織を、一晩４％ＰＦＡで後固定し、次いで、２日にわたり３０％ショ糖溶液に浸漬した後、ＯＣＴに埋め込んでスナップ凍結させた。典型的には、８０ｕｍ厚の脳切片を、自然蛍光の画像化のために切断し、４０ｕｍ厚の脳切片を、ＩＨＣのために切断した。
麻酔した動物に、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経心的に灌流させ、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に灌流させた。組織を、一晩４％ＰＦＡで後固定し、次いで、２日にわたり３０％ショ糖溶液に浸漬した後、ＯＣＴに埋め込んでスナップ凍結させた。典型的には、８０ｕｍ厚の脳切片を、自然蛍光の画像化のために切断し、４０ｕｍ厚の脳切片を、ＩＨＣのために切断した。
６．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＢＢＢスフェロイドモデル
熱い１％アガロース（重量／体積、５０ｕｌ）を９６ウェルプレートに入れて、冷却した／固化させた。次いで、このアガロースゲル上に、初代ヒト星状膠細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒト脳微小血管周皮細胞（ＨＢＶＰ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびヒト脳微小血管内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を、１：１：１の比（各タイプ１５００個の細胞）で播種した。細胞を、４８～７２時間にわたり５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で培養して、多細胞ＢＢＢスフェロイドの自発的構築を可能にした。このスフェロイドの周辺では、ＢＢＢを模倣する多細胞による関門が形成されることが報告された。この培養培地にＡＡＶ－Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加し、４日後に、全てのスフェロイドを、４％ＰＦＡを使用して固定し、Ｎｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ薄ガラス８ウェルチャンバーカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用して画像化した。このスフェロイド内のＲＦＰシグナルの強度を調べて、「リードアウト」として使用した。
熱い１％アガロース（重量／体積、５０ｕｌ）を９６ウェルプレートに入れて、冷却した／固化させた。次いで、このアガロースゲル上に、初代ヒト星状膠細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒト脳微小血管周皮細胞（ＨＢＶＰ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびヒト脳微小血管内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を、１：１：１の比（各タイプ１５００個の細胞）で播種した。細胞を、４８～７２時間にわたり５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で培養して、多細胞ＢＢＢスフェロイドの自発的構築を可能にした。このスフェロイドの周辺では、ＢＢＢを模倣する多細胞による関門が形成されることが報告された。この培養培地にＡＡＶ－Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加し、４日後に、全てのスフェロイドを、４％ＰＦＡを使用して固定し、Ｎｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ薄ガラス８ウェルチャンバーカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用して画像化した。このスフェロイド内のＲＦＰシグナルの強度を調べて、「リードアウト」として使用した。
７．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）でのＡＡＶ投与
全てのＮＨＰ試験を、ＩＡＣＵＣにより承認されたＡＡＡＬＡＣ認定施設でＣＲＯにより実施した。カニクイザルを、ＡＡＶ９に対する中和抗体がほぼ存在しないかまたは存在しないかに関して予めスクリーニングした（＜１：５の力価）。ＰＢＳ／０．００１％Ｆ６８で希釈したＡＡＶを、蠕動ポンプを使用して（橈側皮静脈または大腿静脈を介して）静脈内注射した。３週間後、動物にＰＢＳを経心的に灌流させ、続いて４％ＰＦＡを経心的に灌流させた。次いで、組織を回収し、パラフィン埋め込みおよび切片化のために処理した。
全てのＮＨＰ試験を、ＩＡＣＵＣにより承認されたＡＡＡＬＡＣ認定施設でＣＲＯにより実施した。カニクイザルを、ＡＡＶ９に対する中和抗体がほぼ存在しないかまたは存在しないかに関して予めスクリーニングした（＜１：５の力価）。ＰＢＳ／０．００１％Ｆ６８で希釈したＡＡＶを、蠕動ポンプを使用して（橈側皮静脈または大腿静脈を介して）静脈内注射した。３週間後、動物にＰＢＳを経心的に灌流させ、続いて４％ＰＦＡを経心的に灌流させた。次いで、組織を回収し、パラフィン埋め込みおよび切片化のために処理した。
８．免疫組織化学
１０％ロバ血清および２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳで希釈した一次抗体により、マウス組織切片のフローティング染色を実施した。使用した一次抗体には、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００）；ウサギ抗ＲＦＰ（１：１０００）；マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００）；ラット抗ＧＦＡＰ（１：５００）；ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：５００）；マウス抗ＣＤ３１（１：５００）が含まれる。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のフルオロフォアにコンジュゲートした二次抗体を、１：２００の希釈で、一次抗体の宿主種に対して適用した。
１０％ロバ血清および２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳで希釈した一次抗体により、マウス組織切片のフローティング染色を実施した。使用した一次抗体には、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００）；ウサギ抗ＲＦＰ（１：１０００）；マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００）；ラット抗ＧＦＡＰ（１：５００）；ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：５００）；マウス抗ＣＤ３１（１：５００）が含まれる。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のフルオロフォアにコンジュゲートした二次抗体を、１：２００の希釈で、一次抗体の宿主種に対して適用した。
ＮＨＰ組織のパラフィン切片の場合には、ＤＡＢ染色を実施して、ＡＡＶ－ＡＡＤＣにより形質導入された細胞を可視化した。ウサギ抗ＡＡＤＣ抗体（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、一次抗体として使用した。
９．ＡＡＶ結合アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で培養した。１つのウェル当たり２５０，０００個の細胞の密度での２４ウェルプレートへのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の播種の１日後に、２００ｕｌのＤＭＥＭ（３１０５３０２８；Ｇｉｂｃｏ）、１ｕｇのＤＮＡプラスミド、および３ｕｇのＰＥＩのトランスフェクション混合物を使用して、この細胞に、ＬＹ６ＡのｃＤＮＡプラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷上に置いて１０分にわたり冷却した。次いで、培地を、１００００のＭＯＩでｒＡＡＶ－ｍＣｈｅｒｒｙを含む５００ｕｌの氷冷血清フリーＤＭＥＭ培地に交換した。１時間にわたる氷上でのインキュベーション後、おそらくＡＡＶが表面に結合している細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いでゲノムＤＮＡを単離した。細胞に結合しているウイルス粒子を、ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマーによるｑＰＣＲを使用することにより定量し、参照としてヒトＧＣＧを使用してＨＥＫ２９３Ｔゲノムに対して正規化した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で培養した。１つのウェル当たり２５０，０００個の細胞の密度での２４ウェルプレートへのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の播種の１日後に、２００ｕｌのＤＭＥＭ（３１０５３０２８；Ｇｉｂｃｏ）、１ｕｇのＤＮＡプラスミド、および３ｕｇのＰＥＩのトランスフェクション混合物を使用して、この細胞に、ＬＹ６ＡのｃＤＮＡプラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷上に置いて１０分にわたり冷却した。次いで、培地を、１００００のＭＯＩでｒＡＡＶ－ｍＣｈｅｒｒｙを含む５００ｕｌの氷冷血清フリーＤＭＥＭ培地に交換した。１時間にわたる氷上でのインキュベーション後、おそらくＡＡＶが表面に結合している細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いでゲノムＤＮＡを単離した。細胞に結合しているウイルス粒子を、ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマーによるｑＰＣＲを使用することにより定量し、参照としてヒトＧＣＧを使用してＨＥＫ２９３Ｔゲノムに対して正規化した。
１０．膠芽腫のマウスモデル
全ての実験を、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌにてＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコールに従って実施した。２０＋／－１ｇ（Ｅｎｖｉｇｏ）の重量の同系免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを使用した。２μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させたＧＬ２６１－Ｌｕｃ（１００，０００個のマウス膠芽腫細胞）を、２６ゲージ針（８００７５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を備えた１０μｌのシリンジを使用して、頭蓋内に注射した。定位固定フレームを使用して、移植部位の位置を決めた（十字縫合からの座標（ｍｍ）：２右、０．５前方、大脳皮質への３．５の深さで）。７日後、２００ｕｌのＡＡＶ－ＨＳＶ－ＴＫ１（１Ｅ＋１２個のウイルスゲノム、ＩＶ）を１回投与し、ガンシクロビル（５０ｍｇ／ｋｇ）を１０日にわたり毎日投与した。
全ての実験を、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌにてＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコールに従って実施した。２０＋／－１ｇ（Ｅｎｖｉｇｏ）の重量の同系免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを使用した。２μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させたＧＬ２６１－Ｌｕｃ（１００，０００個のマウス膠芽腫細胞）を、２６ゲージ針（８００７５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を備えた１０μｌのシリンジを使用して、頭蓋内に注射した。定位固定フレームを使用して、移植部位の位置を決めた（十字縫合からの座標（ｍｍ）：２右、０．５前方、大脳皮質への３．５の深さで）。７日後、２００ｕｌのＡＡＶ－ＨＳＶ－ＴＫ１（１Ｅ＋１２個のウイルスゲノム、ＩＶ）を１回投与し、ガンシクロビル（５０ｍｇ／ｋｇ）を１０日にわたり毎日投与した。
[実施例１]
ＡＡＶ９カプシドの改変
血液脳関門を横断する生体分子またはウイルスの浸透を増強するであろうペプチド配列を同定するために、ＡＡＶペプチドディスプレイ技術を使用した。表３で列挙されている個々の細胞透過性ペプチドを、図１Ａに例示されているように、アミノ酸５８８および５８９（ＶＰ１番号付け）の間でＡＡＶ９カプシドに挿入した。この挿入を、ＡＡＶパッケージングのために共トランスフェクトされる３種のプラスミドの内の１つであるＲＣプラスミドを改変することにより実行し、図１Ｂは、この実験の例示的な模式図を示す。個々のＡＡＶバリアントを、別々に製造してスクリーニングした。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１～３を参照されたい。
ＡＡＶ９カプシドの改変
血液脳関門を横断する生体分子またはウイルスの浸透を増強するであろうペプチド配列を同定するために、ＡＡＶペプチドディスプレイ技術を使用した。表３で列挙されている個々の細胞透過性ペプチドを、図１Ａに例示されているように、アミノ酸５８８および５８９（ＶＰ１番号付け）の間でＡＡＶ９カプシドに挿入した。この挿入を、ＡＡＶパッケージングのために共トランスフェクトされる３種のプラスミドの内の１つであるＲＣプラスミドを改変することにより実行し、図１Ｂは、この実験の例示的な模式図を示す。個々のＡＡＶバリアントを、別々に製造してスクリーニングした。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１～３を参照されたい。
[実施例２]
ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングの最初のラウンド
核ＲＦＰ（Ｈ２Ｂ－ＲＦＰ）を発現するＡＡＶを、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子背景およびＢＡＬＢ／ｃ遺伝子背景が混在している成体マウスに静脈内注射した。３週間後、脳組織を採取して切片化して、ＲＦＰ標識細胞を明らかにした（図２Ａおよび図２Ｃでの白色の点、それぞれ図２Ｂおよび図２Ｄで定量されている）。ＣＰＰ ＢＩＰ１およびＢＩＰ２を、それぞれＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２のカプシドに挿入した。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃４～５を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングの最初のラウンド
核ＲＦＰ（Ｈ２Ｂ－ＲＦＰ）を発現するＡＡＶを、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子背景およびＢＡＬＢ／ｃ遺伝子背景が混在している成体マウスに静脈内注射した。３週間後、脳組織を採取して切片化して、ＲＦＰ標識細胞を明らかにした（図２Ａおよび図２Ｃでの白色の点、それぞれ図２Ｂおよび図２Ｄで定量されている）。ＣＰＰ ＢＩＰ１およびＢＩＰ２を、それぞれＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２のカプシドに挿入した。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃４～５を参照されたい。
[実施例３]
改変ＡＡＶ９カプシドの最適化
ＢＩＰ標的化配列を最適化することにより、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２をさらに操作した。ＢＩＰインサートは、タンパク質Ｋｕ７０に由来した（完全な配列に関しては、図３Ａおよび材料／方法＃１を参照されたい）。「合成」起源であるＢＩＰ配列ＶＳＡＬＫを、操作ＡＡＶベクターの潜在的な種特異性を最小限に抑えるための研究焦点として選択した。ＡＡＶを製造し、ＡＡＶ９と比較して脳形質導入効率に関して別々に試験した（図３Ｂ～Ｃを参照されたい）。レポーター遺伝子ＲＦＰを送達するいくつかのＡＡＶバリアントのＩＶ注射後３週間でのマウス肝臓における細胞形質導入の割合を、図３Ｄに示す。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１～５を参照されたい。
改変ＡＡＶ９カプシドの最適化
ＢＩＰ標的化配列を最適化することにより、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２をさらに操作した。ＢＩＰインサートは、タンパク質Ｋｕ７０に由来した（完全な配列に関しては、図３Ａおよび材料／方法＃１を参照されたい）。「合成」起源であるＢＩＰ配列ＶＳＡＬＫを、操作ＡＡＶベクターの潜在的な種特異性を最小限に抑えるための研究焦点として選択した。ＡＡＶを製造し、ＡＡＶ９と比較して脳形質導入効率に関して別々に試験した（図３Ｂ～Ｃを参照されたい）。レポーター遺伝子ＲＦＰを送達するいくつかのＡＡＶバリアントのＩＶ注射後３週間でのマウス肝臓における細胞形質導入の割合を、図３Ｄに示す。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１～５を参照されたい。
[実施例４]
ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル－ＢＢＢ浸透スクリーニング
ＡＡＶバリアントの一部を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスフェロイドＢＢＢモデルを使用して、ヒトＢＢＢを超える能力に関してスクリーニングした。このスフェロイドは、表面で関門を形成するヒト微小血管内皮細胞と、ヒト周皮細胞および星状膠細胞とを含む。レポーターとして核ＲＦＰを有するＡＡＶを、周囲の培地からこのスフェロイドの内部に透過させて内部で細胞に形質導入する能力に関して評価した。図４Ａは、実験の概要を示す。図４Ｂ～Ｄは、ｗｔ ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１それぞれの結果を示し、これらのおよび他のペプチドを図４Ｅで定量する。このモデルでは、ペプチド１１、１５、１６、および２１が、スフェロイドへの最大の浸透を引き起こした。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃６を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル－ＢＢＢ浸透スクリーニング
ＡＡＶバリアントの一部を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスフェロイドＢＢＢモデルを使用して、ヒトＢＢＢを超える能力に関してスクリーニングした。このスフェロイドは、表面で関門を形成するヒト微小血管内皮細胞と、ヒト周皮細胞および星状膠細胞とを含む。レポーターとして核ＲＦＰを有するＡＡＶを、周囲の培地からこのスフェロイドの内部に透過させて内部で細胞に形質導入する能力に関して評価した。図４Ａは、実験の概要を示す。図４Ｂ～Ｄは、ｗｔ ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１それぞれの結果を示し、これらのおよび他のペプチドを図４Ｅで定量する。このモデルでは、ペプチド１１、１５、１６、および２１が、スフェロイドへの最大の浸透を引き起こした。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃６を参照されたい。
[実施例５]
ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＢＢ浸透スクリーニング
実施例２に関して上述したように実施した実験において、ｉｎ ｖｉｖｏでのモデルでのさらなる評価のために、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を選択した。全てのＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した。両方とも、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウス（図５Ａでの脳切片における白色の点、図５Ｂで定量されている）およびＢＡＬＢ／ｃ成体マウス（図６Ａでの脳切片における白色の点、図６Ｂで定量されている）において、ＡＡＶ９に対して、静脈内投与後に脳細胞に形質導入する能力の増強を示した。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＢＢ浸透スクリーニング
実施例２に関して上述したように実施した実験において、ｉｎ ｖｉｖｏでのモデルでのさらなる評価のために、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を選択した。全てのＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した。両方とも、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウス（図５Ａでの脳切片における白色の点、図５Ｂで定量されている）およびＢＡＬＢ／ｃ成体マウス（図６Ａでの脳切片における白色の点、図６Ｂで定量されている）において、ＡＡＶ９に対して、静脈内投与後に脳細胞に形質導入する能力の増強を示した。
高用量のＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１（１匹のマウス当たり４×１０１２ｖｇ、ＩＶ投与）により、マウスでは広範な脳形質導入がもたらされた。両方のＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した（図７Ａでの脳切片における白色の点、図７Ｂで定量されている）。
[実施例６]
改変ＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏでの分布
図８Ａで示すように、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、大脳皮質、中脳、および海馬を含む、マウスにおける複数の脳領域にわたり、神経細胞（ＮｅｕＮ抗体により標識されている）を優先的に標的とした。両方のＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した。
改変ＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏでの分布
図８Ａで示すように、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、大脳皮質、中脳、および海馬を含む、マウスにおける複数の脳領域にわたり、神経細胞（ＮｅｕＮ抗体により標識されている）を優先的に標的とした。両方のＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した。
ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１はまた、マウスにおける脊髄および運動神経細胞の標的化において、ＡＡＶ９に対して能力の増強も示した。全てのＡＡＶがレポーターとして核ＲＦＰを有しており、新生仔マウスに静脈内投与された（４×１０１０ｖｇ）。運動神経細胞を、ＣＨＡＴ抗体染色を使用して可視化した。図８ＢでのＲＦＰシグナルおよびＣＨＡＴシグナルの共局在化は、運動神経細胞の特異的な形質導入を示唆した。
マウスにおける様々な組織に形質導入するＡＡＶ－ＣＡＧ－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰおよびＡＡＶ．ＣＰＰ．１６－ＣＡＧ－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰの相対能力も評価した。１×１０１１ｖｇを静脈内注射した。形質導入された細胞の数を、ＤＡＰＩ核染色により標識された全細胞の数に対して正規化した。この結果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６が、マウスにおける心臓組織（図９Ａ）；骨格筋組織（図９Ｂ）、および後根神経節組織（図９Ｃ）の標的化において、ＡＡＶ９と比べて効率的であることを示した。
[実施例７]
非ヒト霊長類モデルでのＢＢＢ浸透
２×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶｓ－ＣＡＧ－ＡＡＤＣ（レポーター遺伝子として）を、３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。図１０Ａ～Ｄに示すように、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、ＡＡＶ９に対して、非ヒト霊長類での静脈内投与後に脳組織に形質導入する能力の増強を示した。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６は、一次視覚野（図１０Ａ）、頭頂葉皮質（図１０Ｂ）、視床（図１０Ｃ）、および小脳（図１０Ｄ）において、ｗｔ ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃７～８を参照されたい。
非ヒト霊長類モデルでのＢＢＢ浸透
２×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶｓ－ＣＡＧ－ＡＡＤＣ（レポーター遺伝子として）を、３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。図１０Ａ～Ｄに示すように、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、ＡＡＶ９に対して、非ヒト霊長類での静脈内投与後に脳組織に形質導入する能力の増強を示した。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６は、一次視覚野（図１０Ａ）、頭頂葉皮質（図１０Ｂ）、視床（図１０Ｃ）、および小脳（図１０Ｄ）において、ｗｔ ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃７～８を参照されたい。
[実施例８]
ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１はＬＹ６Ａに結合しない
ＬＹ６ＡはＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの受容体として機能し、ある特定のマウス株でのＢＢＢの横断におけるＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの頑強な効果を媒介する。培養された２９３細胞におけるマウスＬＹ６Ａの過剰発現により、細胞表面へのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの結合が有意に増加した（図１１Ａを参照されたい）。逆に、ＬＹ６Ａの過剰発現により、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１に関するウイルス結合は増加しない（図１１Ｂを参照されたい）。このことは、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１が受容体としてＬＹ６ＡをＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢと共有しないことを示唆する。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃９を参照されたい。
ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１はＬＹ６Ａに結合しない
ＬＹ６ＡはＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの受容体として機能し、ある特定のマウス株でのＢＢＢの横断におけるＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの頑強な効果を媒介する。培養された２９３細胞におけるマウスＬＹ６Ａの過剰発現により、細胞表面へのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの結合が有意に増加した（図１１Ａを参照されたい）。逆に、ＬＹ６Ａの過剰発現により、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１に関するウイルス結合は増加しない（図１１Ｂを参照されたい）。このことは、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１が受容体としてＬＹ６ＡをＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢと共有しないことを示唆する。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃９を参照されたい。
[実施例９]
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用する脳への治療用タンパク質の送達
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して、脳腫瘍のマウスモデルにおいて「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達した（材料および方法＃１０）。ＨＳＶ．ＴＫ１は、その他の方法で「休眠」しているガンシクロビルを腫瘍死滅剤へと変える。静脈内投与されたＡＡＶ．ＣＰＰ．２１－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ（図１２Ａ、左下および右中央のパネル）は、腫瘤、特に、腫瘍が拡がるフロンティアを標的とすることが示された。図１２Ｂ～Ｃに示すように、「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達するためのＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の使用により、プロドラッグであるガンシクロビルと併用した場合に、脳腫瘤の縮小がもたらされた。これらの結果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して脳腫瘍に治療用遺伝子を全身送達し得ることを示す。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１０を参照されたい。
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用する脳への治療用タンパク質の送達
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して、脳腫瘍のマウスモデルにおいて「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達した（材料および方法＃１０）。ＨＳＶ．ＴＫ１は、その他の方法で「休眠」しているガンシクロビルを腫瘍死滅剤へと変える。静脈内投与されたＡＡＶ．ＣＰＰ．２１－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ（図１２Ａ、左下および右中央のパネル）は、腫瘤、特に、腫瘍が拡がるフロンティアを標的とすることが示された。図１２Ｂ～Ｃに示すように、「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達するためのＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の使用により、プロドラッグであるガンシクロビルと併用した場合に、脳腫瘤の縮小がもたらされた。これらの結果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して脳腫瘍に治療用遺伝子を全身送達し得ることを示す。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１０を参照されたい。
[実施例１０]
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の脳内投与
（例えば実施例２での）全身投与に加えて、本明細書で記載されているＡＡＶを、マウス脳に局所的に投与した。ＡＡＶ９－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰおよびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰの脳内注射（図１３）により、ＡＡＶ９で処置された脳切片に対して、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１で処置された脳切片において広範なかつ高強度のＲＦＰシグナルが生じた。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃４を参照されたい。
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の脳内投与
（例えば実施例２での）全身投与に加えて、本明細書で記載されているＡＡＶを、マウス脳に局所的に投与した。ＡＡＶ９－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰおよびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１－Ｈ２Ｂ－ＲＦＰの脳内注射（図１３）により、ＡＡＶ９で処置された脳切片に対して、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１で処置された脳切片において広範なかつ高強度のＲＦＰシグナルが生じた。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃４を参照されたい。
[実施例１１]
膠芽腫腫瘍微小環境へのＡＡＶ．ＣＰＰ．１６の全身送達
（例えば実施例２での）全身投与を使用して、本明細書に記載されているＡＡＶを、同所性免疫応答性マウスの膠芽腫モデル（ＧＬ２６１モデル）の脳へ送達する（材料および方法＃１０に記載されている）。図１４に示すように、ＡＡＶ．ＣＲＰ１６は、腫瘍および周囲の微小環境の両方への有意な送達に関して、ＡＡＶ９をはるかに上回った。
膠芽腫腫瘍微小環境へのＡＡＶ．ＣＰＰ．１６の全身送達
（例えば実施例２での）全身投与を使用して、本明細書に記載されているＡＡＶを、同所性免疫応答性マウスの膠芽腫モデル（ＧＬ２６１モデル）の脳へ送達する（材料および方法＃１０に記載されている）。図１４に示すように、ＡＡＶ．ＣＲＰ１６は、腫瘍および周囲の微小環境の両方への有意な送達に関して、ＡＡＶ９をはるかに上回った。
この送達の効率の増加が、治療効果の改善につながるかどうかを判断するために、マウスＧＢＭモデルに様々な処置を投与した。図１５Ａは、実験プロトコールの概要を提供する。その結果を図１５Ｂ～Ｃに示し、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６抗ＰＤ－Ｌ１媒介性免疫療法が、マウスＧＢＭモデルの生存期間を有意に延長したことを実証した。図１５Ｂに示すように、ＡＡＶ９抗ＰＤ－Ｌ１で処置した８匹のマウスの内の１匹が長期間生存したが、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６抗ＰＤ－Ｌ１で処置した６／８マウスが長期間生存した（１００日より長い）。図１５Ｃは、長期間生存したものの６匹全てが（ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６－抗ＰＤ－Ｌ１で処置した５匹と、ＡＡＶ９－抗ＰＤ－Ｌ１で処置した１匹；ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６－抗ＰＤ－Ｌ１で処置した長期間生存したものの内の１匹は、技術的な理由のために再チャレンジ手術の間に死んだ）、腫瘍移植後２００日でも生存していたことを示す。したがって、マウスＰＤ－Ｌ１を標的化する抗体を発現するＡＡＶ．ＣＰＰ．１６の静脈内注射により、マウスの７５％においてＧＢＭ腫瘍が根絶したが、未処置のマウスは、腫瘍移植から１ヶ月以内に死んだ。
長期間生存マウスを２００日目に屠殺し、それらの脳を調べた。図１６Ａに示すように、腫瘍の証拠は存在しなかった。図１６Ｂは、生存期間を延長したマウスの内の１匹から撮影した生物発光画像を示し、移植後７日目に腫瘍細胞が存在したことを示す。図１６Ｃは、最初の腫瘍移植が残存腫瘍を欠き、グリオーシス瘢痕組織のみが存在したことを示し、完全な腫瘍根絶を示す。
さらに、免疫組織化学により、ＣＢ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が、ＧＢＭ腫瘍部位にも存在し、免疫反応についてのさらなる証拠が示された。
[実施例１２]
ＧＢＭ腫瘍におけるＨＡタグ化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現
ウェスタンブロッティングによって測定したＧＢＭ腫瘍におけるＨＡタグ化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現を、図１７Ａ～１７Ｂに示す。マウスでの腫瘍移植から５日後に１ｅ１２ｖｇのＡＡＶまたはＰＢＳを静脈内注射した。ＩＶ注射から１４日後に腫瘍組織を採取した。ＨＡタグ染色の強度（図１７Ａ）を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体発現の尺度として定量した（図１７Ｂ）。
ＧＢＭ腫瘍におけるＨＡタグ化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現
ウェスタンブロッティングによって測定したＧＢＭ腫瘍におけるＨＡタグ化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現を、図１７Ａ～１７Ｂに示す。マウスでの腫瘍移植から５日後に１ｅ１２ｖｇのＡＡＶまたはＰＢＳを静脈内注射した。ＩＶ注射から１４日後に腫瘍組織を採取した。ＨＡタグ染色の強度（図１７Ａ）を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体発現の尺度として定量した（図１７Ｂ）。
参考文献
他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と併せて記載しているが、上記の記載は、添付の特許請求の範囲により画定される本発明の範囲を例示することが意図されており限定することは意図されていないことを理解しなければならない。他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内である。
本発明を、その詳細な説明と併せて記載しているが、上記の記載は、添付の特許請求の範囲により画定される本発明の範囲を例示することが意図されており限定することは意図されていないことを理解しなければならない。他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内である。
Claims (15)
- 対象におけるがんに免疫療法剤を送達する方法であって、（ｉ）配列ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）免疫療法剤をコードする導入遺伝子とを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、前記対象に投与するステップを含み、必要に応じて、がん細胞がヒト対象の脳内にある、前記方法。
- 前記アミノ酸配列が、配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列が、配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも６個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
- 対象におけるがんに免疫療法剤を送達する方法であって、（ｉ）配列Ｖ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号７９）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号８０）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＫ（配列番号８１）、またはＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＦＫ．（配列番号８２）からの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）免疫療法剤をコードする導入遺伝子とを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、前記対象に投与するステップを含み、必要に応じて、がん細胞がヒト対象の脳内にある、前記方法。
- 標的化配列が、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）；ＶＳＡＬＫ（配列番号２）；ＴＶＰＡＬＲ（配列番号３）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＰＭＬＫ（配列番号１２）；ＴＶＰＴＬＫ（配列番号１３）；ＦＴＶＳＡＬＫ（配列番号５）；ＬＴＶＳＡＬＫ（配列番号６）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＰＡＬＦＲ（配列番号９）；ＴＶＰＭＬＦＫ（配列番号１０）またはＴＶＰＴＬＦＫ（配列番号１１）を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記免疫療法剤をコードする導入遺伝子が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的化する抗体をコードする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- 前記対象が、哺乳動物対象である、請求項６に記載の方法。
- 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項７に記載の方法。
- 前記ＡＡＶ９が、ＡＡＶ９ ＶＰ１を含む、請求項８に記載の方法。
- 前記標的化配列が、配列番号８５を含むＡＡＶ９ ＶＰ１のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入されている、請求項９に記載の方法。
- 前記細胞が、前記対象の脳内にあり、前記ＡＡＶが、非経口送達、脳内、または髄腔内送達によって投与される、請求項７に記載の方法。
- 前記非経口送達が、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内送達による、請求項１１に記載の方法。
- 前記髄腔内送達が、腰椎注射、大槽注射、または実質内注射による、請求項１２に記載の方法。
- 化学療法剤、放射線、および／または外科的切除を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
- 前記化学療法剤が、テモゾラミド、ロムスチン、またはそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
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