ES2844181T3 - Vectores rAAV con alta eficiencia de transducción, composiciones y métodos de uso - Google Patents

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Vliet Kim M Van
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Abstract

Una proteína de AAV VP3 que comprende: a) un ácido glutámico (E) sustituido en una posición que corresponde a uno o más de K490, K527, K549 o K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2; y/o, (b) una arginina (R) sustituida en una posición que corresponde a K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores rAAV con alta eficiencia de transducción, composiciones y métodos de uso
Antecedentes
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente estadounidense n.° 13/840.224, presentada el 15 de marzo de 2013 (en trámite), y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/647.318, presentada el 15 de mayo de 2012 (en trámite). La presente solicitud también reivindica la prioridad de la solicitud de patente estadounidense n.° 12/595/196, presentada el 31 de diciembre de 2009 (para su publicación el 21 de mayo de 2013 como el documento U.S. 8.445.267), la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2008/059647 presentada el 8 de abril de 2008 (nacionalizada), y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 60/910.798, presentada el 9 de abril de 2007 (expirada). La presente solicitud también se refiere a la solicitud de patente estadounidense n.° 13/854.011, presentada el 29 de marzo de 2013 (en trámite); y la solicitud de patente estadounidense n.° 13/855.640, presentada el 2 de abril de 2013 (en trámite).
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO SUBVENCIONADO FEDERALMENTE
No aplicable.
Campo de la divulgación
Los grandes avances en el campo de la terapia génica se han logrado usando virus para suministrar material genético terapéutico. El virus adenoasociado (AAV) ha atraído una atención considerable como un vector viral altamente eficaz para la terapia génica debido a su baja inmunogenicidad y capacidad para transducir de manera eficaz células que no se encuentran en división. Se ha demostrado que los AAV infectan a varios tipos de células y tejidos y se han hecho avances significativos durante la última década para adaptar este sistema viral para su uso en terapia génica humana.
En esta forma de "tipo silvestre" normal, el ADN de AAV recombinante (rAAV) se empaqueta en la cápside viral en forma de una molécula monocatenaria de aproximadamente 4600 nucleótidos (nt) de longitud. Después de la infección de las células por el virus, la maquinaria molecular de la célula convierte la hebra monocatenaria de ADN en una forma bicatenaria.
El AAV tiene muchas propiedades que favorecen su uso como vehículo de administración génica: 1) el virus de tipo silvestre no se asocia con ninguna patología humana; 2) la forma recombinante no contiene secuencias codificantes virales nativas; y 3) se ha observado una expresión transgénica persistente en diversas aplicaciones. Uno de los principales obstáculos de la terapia génica, la inducción de la inmunocompetencia en las respuestas inmunitarias celulares contra los epítopos derivados de vectores y derivados de transgenes, puede superarse mediante la deficiencia para replicación y ausencia de proteínas virales expresadas por AAV recombinante.
La eficiencia de transducción de los vectores de virus adenoasociados recombinantes varía enormemente en diferentes células y tejidos in vitro e in vivo. Se han realizado estudios sistemáticos para dilucidar las etapas fundamentales en el ciclo de vida del AAV. Por ejemplo, se ha documentado que una proteína celular, FKBP52, fosforilada en los residuos de tirosina por la proteína tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR-PTK), inhibe la síntesis de la segunda hebra de ADN de AAV y, por consiguiente, la expresión transgénica in vitro, así como in vivo. También se ha demostrado que la señalización de EGFR-PTK modula el tráfico intracelular mediado por la vía de ubiquitina/proteasoma, así como la síntesis de la segunda hebra de ADN mediada por FKBP52 de los vectores AAV. En esos estudios, la inhibición de la señalización de EGFR-PTK ocasionó una ubiquitinación reducida de las proteínas de la cápside de AAV, lo que a su vez, facilitó el transporte nuclear limitando la degradación mediada por el proteasoma de vectores AAV, lo que implica la fosforilación mediada por EGFR-PTK de los residuos de tirosina de las cápsides de AAV.
Yan et al., 2002 (J. Virol., 75(5): 2043-2053) se refieren a vectores AAV2 recombinantes pseudotipados con la proteína de la cápside de AAV5 y su administración a líneas celulares en presencia o ausencia de inhibidores del proteasoma. Lochrie et al., 2006 (J. Virol., 80(2): 821-834) se refieren a la proteína de la cápside de AAV2 en la que se realizaron 127 mutaciones diferentes en 64 posiciones de la superficie externa en regiones que se espera que se unan a anticuerpos, incluyendo 57 sustituciones sencillas de alanina, 41 sustituciones sencillas de no alanina, 27 mutaciones múltiples, y 2 inserciones. Kern et al., 2003 (J. Virol., 77(20): 11072-11081) se refieren al análisis mutacional de la proteína de la cápside de AAV2 con el fin de identificar los aminoácidos asociados con la unión a heparina. El documento WO 2004/111248 se refiere a vectores AAV recombinantes que transportan modificaciones de la proteína de la cápside que dan lugar a una función de unión a heparina reducida o eliminada. Opie et al., 2003 (J. Virol., 77(12): 6995-7006) se refieren al análisis mutacional de la proteína de la cápside de AAV2 con el fin de identificar los aminoácidos que contribuyen a la unión de proteoglicano de heparán sulfato. El documento WO 2004/027019 se refiere a vectores AAV recombinantes que tienen mutaciones en una o más proteínas de la cápside, particularmente las proteínas de la cápside que han alterado la afinidad por la heparina o heparina sulfato. El documento WO 2006/119150 se refiere a proteínas de la cápside viral con un mayor direccionamiento hacia las neuronas y un mayor transporte retrógrado. El documento WO 2008/145400 se refiere a una proteína estructural de un parvovirus con una inserción de aminoácidos en el sitio de inserción 1-453.
Breve sumario de la divulgación
La presente invención se refiere a proteínas de AAV VP3, ácidos nucleicos aislados que codifican dichas proteínas de AAV VP3, composiciones que comprenden dichas proteínas de AAV VP3, dichas composiciones para su uso en terapia, uso de dichas composiciones en la fabricación de un medicamento, kits que comprenden dichas composiciones, y métodos in vitro de transducción de una población de células. La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la invención se describen en los siguientes párrafos numerados:
(1) . Una proteína de AAV VP3 que comprende:
a) un ácido glutámico (E) sustituido en una posición que corresponde a uno o más de K490, K527, K549, o K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2; y/o,
(b) una arginina (R) sustituida en una posición que corresponde a K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
(2) . La proteína de AAV VP3 de acuerdo con el párrafo 1, que comprende además un residuo de aminoácido no serina sustituido en una posición que corresponde a uno o más de S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, o S721 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2, en donde el residuo de aminoácido no serina se selecciona entre valina (V), ácido aspártico (D), o histidina (H).
(3) . La proteína de AAV VP3 de acuerdo con el párrafo 1 o 2 que comprende además:
(d) un residuo de aminoácido no treonina sustituido en una posición que corresponde a uno o más de T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, o T716 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2; y/o
(e) un residuo de aminoácido no tirosina sustituido en una posición que corresponde a uno o más de Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, o Y730 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
(4) . La proteína de AAV VP3 de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 1 a 3, (b) que comprende el ácido glutámico (E) sustituido en la posición que corresponde a uno o más de K490 o K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
(5) . La proteína de AAV VP3 de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 1 a 4, que comprende ácido glutámico (E) sustituido en posiciones que corresponden a K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
(6) . La proteína de AAV VP3 de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 1 a 5, que comprende además un residuo de aminoácido no serina sustituido en una posición que corresponde a S662 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
(7) . El AAV VP3 de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 1 a 6, en donde la proteína de AAV VP3 es de un serotipo de AAV seleccionado entre AAV2 o AAV8.
(8) . Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de AAV VP3 de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 1 a 7.
(9) . Un virión de AAV que comprende la proteína de AAV VP3 de uno cualquiera de los párrafos 1 a 8, opcionalmente, en donde el virión comprende además un ácido nucleico que codifica uno o más productos terapéuticos.
(10) . Una composición que comprende (a) la proteína de AAV VP3 de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 1 a 7, la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con el párrafo 8, o el virión de AAV de acuerdo con el párrafo 9; y (b) un tampón, diluyente, o vehículo farmacéuticamente aceptable.
(11) . Un kit para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, lesión, trastorno, traumatismo o disfunción en mamíferos, en donde el kit comprende la composición del párrafo 10.
(12) . La composición de acuerdo con el párrafo 10, para su uso en terapia, o para su uso en el tratamiento, la prevención, o la mejora de uno o más síntomas de cáncer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, nefropatía, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreática, enfermedad intestinal, hepatopatía, enfermedad neurológica, trastorno neuromuscular, déficit neuromotor, deterioro neuroesquelético, discapacidad neurológica, disfunción neurosensorial, ictus, isquemia, trastorno alimentario, deficiencia de ai-antitripsina (AAT), enfermedad de Batten, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esquelética, traumatismo, o enfermedad pulmonar en un mamífero.
(13) . Uso de una composición de acuerdo con el párrafo 10 o el párrafo 12, en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, un trastorno, una disfunción, una lesión, una afección anormal, un defecto congénito, o un traumatismo en un mamífero.
(14) . Un método in vitro de transducción de una población de células de mamífero, que comprende introducir en una o más células de la población, una composición que comprende una cantidad eficaz de un virión de AAV del párrafo 9, opcionalmente en donde la célula es una célula endotelial, epitelial, vascular, hepática, pulmonar, del corazón, pancreática, intestinal, renal, muscular, ósea, dendrítica, cardíaca, neuronal, sanguínea, cerebral, fibroblástica o cancerosa.
La presente divulgación proporciona proteínas de la cápside de AAV que comprenden la modificación de uno o una combinación de residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en la región de VP3. También se proporcionan viriones de rAAV que comprenden las proteínas de la cápside de AAV de la presente divulgación, así como moléculas de ácido nucleico y vectores de rAAV que codifican las proteínas de la cápside de AAV de la presente divulgación. Ventajosamente, los vectores y viriones de rAAV de la presente divulgación tienen una eficiencia mejorada en la transducción de varias células, tejidos y órganos de interés, cuando se comparan con los vectores y viriones de rAAV de tipo silvestre.
En una opción, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV, en donde la región VP3 de la proteína de la cápside de AAV comprende un residuo no lisina en una posición que corresponde a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre [p. ej., SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; y en una opción, preferentemente la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)], en donde el residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de AAV de tipo silvestre es uno o más de K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665, y K706, o cualquier combinación de los mismos.
En una opción, se modifica el residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a K532 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En una opción, el residuo de lisina expuesto en la superficie de la cápside de AAV se modifica en ácido glutámico (E) o arginina (R). En opciones específicas, se modifica el residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a K532 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en arginina (K532R).
En determinadas opciones, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K490, K544, K549, y K556 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En determinadas opciones específicas, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K490, K544, K549, y K556 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en ácido glutámico (E).
En una opción, la presente divulgación proporciona vectores AAV2 en donde los residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a los residuos K544 y K556 de la cápside de AAV2 de tipo silvestre se modifican en ácido glutámico (E).
En determinadas opciones, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K530, K547, y K569 de la secuencia de la cápside de AAV8 de tipo silvestre. En determinadas opciones específicas, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K530, K547, y K569 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en ácido glutámico (E).
En una opción, se modifica una combinación de residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie de la cápside de AAV, en donde la modificación se produce en las posiciones correspondientes a (Y444F+Y500F+Y730F+T491V)
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V)
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T659V)
(T491V+T550V+T659V)
(Y440F+Y500F+Y730F)
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+S662V), y/o
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V+T659V)
de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre [p. ej., una o más de SEQ ID NOs:1-10; y en una opción particular, de la proteína de la cápside de la secuencia de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)].
En opciones relacionadas, la divulgación proporciona métodos para usar los vectores y composiciones divulgados en el presente documento, y proporciona además procesos para la transducción de una o más células, uno o más tejidos, y/o uno o más órganos de interés, y particularmente los de un animal mamífero que usa las construcciones de vectores virales divulgadas. En un sentido global y general, dichos métodos incluir en general al menos la etapa de introducir en una célula hospedadora de interés adecuada, al menos una primera composición que comprende, consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, una cantidad eficaz de un vector de rAAV y/o una partícula viral infecciosa de AAV, o un virión de AAV recombinante de la presente divulgación en una cantidad y durante un tiempo suficiente para transformar al menos una primera célula o una primera población de células con el vector viral. En opciones particulares, los vectores, viriones, o partículas virales infecciosas de la presente divulgación son preferentemente útiles como vectores para introducir uno o más segmentos de ácido nucleico en una célula hospedadora de interés seleccionada. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero, con las células hospedadoras humanas siendo particularmente preferidas como dianas para los vectores y los viriones recombinantes descritos en el presente documento. En determinadas opciones, dichos vectores comprenderán además uno o más segmentos aislados de ADN que codifican un agente terapéutico y/o de diagnóstico seleccionado, incluyendo, por ejemplo, uno o más polinucleótidos que comprenden uno o más genes de interés que son capaces de expresarse en una célula hospedadora de mamífero que ha sido transformada por uno o más de los vectores, virus, o viriones infecciosos descritos y proporcionados en el presente documento.
En un aspecto, la divulgación proporciona además composiciones que comprenden vectores virales adenoasociados (AAV) recombinantes, viriones, partículas virales y formulaciones farmacéuticas de los mismos, útiles en métodos para administrar material genético que codifica uno o más productos beneficiosos o terapéuticos a células y tejidos de mamífero. En particular, las composiciones y métodos de la divulgación proporcionan un avance significativo en la técnica a través de su uso en el tratamiento, prevención y/o mejora de los síntomas de una o más enfermedades de mamífero. Se contempla que la terapia génica humana se beneficiará particularmente de las presentes enseñanzas al proporcionar construcciones de vectores virales nuevas y mejoradas para su uso en el tratamiento de una serie de diversas enfermedades, trastornos y disfunciones.
En otro aspecto, la divulgación se refiere al vector rAAV modificado que codifica uno o más agentes terapéuticos de mamífero para la prevención, tratamiento y/o mejora de uno o más trastornos en el mamífero en el que se administra la construcción del vector. En particular, la divulgación proporciona construcciones de expresión basadas en rAAV que codifican uno o más agentes terapéuticos de mamíferos (incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo, proteína(s), polipéptido(s), péptido(s), enzima(s), anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, así como variantes, y/o fragmentos activos de los mismos, para su uso en el tratamiento, profilaxis y/o mejora de uno o más síntomas de una enfermedad, disfunción, lesión y/o trastorno en mamíferos.
En otra opción, la divulgación se refiere a vectores rAAV modificados genéticamente que comprenden al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica uno o más agentes terapéuticos que alteran, inhiben, reducen, previenen, eliminan o afectan la actividad de uno o más procesos biológicos endógenos en la célula. En opciones particulares, dichos agentes terapéuticos pueden ser aquellos que incluyen o reducen selectivamente los efectos de uno o más procesos metabólicos, disfunciones, trastornos o enfermedades. En determinadas opciones, el defecto puede ser causado por una lesión o traumatismo en el mamífero para el que se desea el tratamiento. En otras opciones, el defecto puede ser causado por la sobreexpresión de un compuesto biológico endógeno, mientras que en aún otras opciones; el defecto puede ser causado por la baja expresión o incluso la falta de uno o más compuestos biológicos endógenos.
Cuando se contempla el uso de dichos vectores para la introducción de una o más proteínas exógenas, polipéptidos, péptidos, ribozimas, ARNips y/u oligonucleótidos antisentido, en una célula particular transfectada con el vector, se pueden emplear los vectores AAV modificados divulgados en el presente documento incorporando en el vector al menos un primer polinucleótido exógeno posicionado operativamente corriente abajo y bajo el control de al menos un primer promotor heterólogo que expresa el polinucleótido en una célula que comprende el vector para producir el agente terapéutico codificado, incluyendo, por ejemplo, péptidos, proteínas, polipéptidos, anticuerpos, ribozimas, ARNips y oligo- o polinucleótidos antisentido. Dichas construcciones pueden emplear uno o más promotores heterólogos para expresar el agente terapéutico de interés. Dichos promotores pueden ser constitutivos, inducibles o incluso específicos de células o tejidos. Los promotores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un promotor de CMV, un promotor de p-actina, un promotor de CMV híbrido, un promotor de p-actina híbrido, un promotor EF1, un promotor U1a, un promotor U1b, un promotor inducible por Tet, un promotor VP16-LexA, un promotor específico de articulación y un promotor específico de humanos.
Los vectores rAAV genéticamente modificados o los sistemas de expresión de la divulgación también pueden comprender además un segundo segmento de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, uno o más potenciadores, elementos reguladores, elementos transcripcionales, para alterar o efectuar la transcripción del gen heterólogo clonado en los vectores rAAV. Por ejemplo, los vectores rAAV de la presente divulgación pueden comprender además un segundo segmento de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, al menos un primer potenciador de CMV, un potenciador sintético, o un potenciador específico de células o de tejidos. El segundo segmento de ácido nucleico también puede comprender además, consistir esencialmente en, o consistir en, uno o más secuencias intrónicas, elementos reguladores postranscripcionales o similares. Los vectores y los sistemas de expresión de la divulgación también pueden comprender además un tercer segmento de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, uno o más polienlazadores o sitios de restricción/región(es) de clonación múltiple para facilitar la inserción de uno o más elementos genéticos seleccionados, polinucleótidos, y similares en los vectores rAAV en un sitio de restricción conveniente.
En aspectos de la divulgación, los polinucleótidos exógenos que están comprendidos dentro de uno o más de los vectores rAAV mejorados divulgados en el presente documento son preferentemente de origen mamífero, con polinucleótidos que codifican polipéptidos y péptidos de origen humano, primate, murino, porcino, bovino, ovino, felino, canino, equino, epino, caprino o lupino siendo particularmente preferidos.
Como se ha descrito anteriormente, el polinucleótido exógeno codificará preferentemente una o más proteínas, polipéptidos, péptidos, enzimas, anticuerpos, ARNips, ribozimas o polinucleótidos antisentido, oligonucleótidos, moléculas de p Na o una combinación de dos o más de estos agentes terapéuticos. De hecho, el polinucleótido exógeno puede codificar dos o más de dichas moléculas, o una pluralidad de tales moléculas como se desee. Cuando se desean terapias génicas combinacionales, pueden producirse dos o más moléculas diferentes a partir de un único sistema de expresión de rAAV, o como alternativa, una célula hospedadora seleccionada puede transfectarse con dos o más sistemas de expresión únicos de rAAV, cada uno de los cuales puede comprender uno o más polinucleótidos distintos que codifican un agente terapéutico.
En otras opciones, la divulgación también proporciona vectores rAAV genéticamente modificados que están comprendidos dentro de una partícula viral adenoasociada infecciosa o un virión, o pluralidades de dichas partículas, que, a su vez, pueden estar comprendidos dentro de uno o más diluyentes, tampones, soluciones fisiológicas o vehículos farmacéuticos, formulados para su administración a un mamífero tal como un humano para regímenes de terapia génica terapéutica y/o profiláctica. Dichos vectores, partículas de virus, viriones, y pluralidades de los mismos también se pueden proporcionar en formulaciones de excipientes que son aceptables para la administración veterinaria a ganado seleccionado, animales exóticos o domésticos, animales de compañía (incluidas mascotas y similares), así como a primates no humanos, especímenes de zoológico o de otro modo en cautividad y similares, en donde se indica que el uso de tales vectores y terapia génica relacionada produce un efecto beneficioso tras la administración a un animal de este tipo.
La divulgación también se refiere a células hospedadoras que comprenden al menos uno de los vectores rAAV divulgados, partículas de virus, o viriones. Dichas células hospedadoras son particularmente células hospedadoras de mamífero, con células hospedadoras humanas siendo particularmente altamente preferidas, y pueden estar aisladas, en cultivo de células o tejidos. En el caso de modelos animales genéticamente modificados, las células hospedadoras transformadas pueden incluso estar comprendidas dentro del cuerpo del propio animal no humano.
En determinadas opciones, la creación de células hospedadoras recombinantes no humanas y/o células hospedadoras humanas recombinantes aisladas que comprenden uno o más de los vectores rAAV divulgados también se contempla por ser útil para diversos protocolos de diagnóstico, y de laboratorio, incluyendo, por ejemplo, medios para la producción de cantidades a gran escala de los vectores rAAV descritos en el presente documento. Dichos métodos de producción de virus se contemplan particularmente como una mejora sobre las metodologías existentes, incluyendo en particular, aquellas que requieren títulos muy altos de las reservas virales para ser útiles como una herramienta de terapia génica. Los inventores contemplan que una ventaja muy significativa de los presentes métodos será la capacidad de utilizar títulos más bajos de partículas virales en los protocolos de transducción de mamífero, y aún así mantener las tasas de transfección a un nivel adecuado.
Las composiciones que comprenden uno o más de los vectores rAAV divulgados, sistemas de expresión, partículas de AAV infecciosas, o células hospedadoras también forman parte de la presente divulgación, y particularmente aquellas composiciones que comprenden además al menos un primer excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en terapia, y para su uso en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de una o más enfermedades, trastornos, disfunciones o traumatismos en mamíferos. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente además uno o más diluyentes, tampones, liposomas, un lípido, un complejo lipídico; o los vectores rAAV modificados en tirosina pueden estar comprendidos dentro de una microesfera o una nanopartícula. Se prefieren particularmente formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección intramuscular, intravenosa o directa en un órgano o tejido o una pluralidad de células o tejidos de un mamífero humano u otro, sin embargo, las composiciones divulgadas en el presente documento también pueden encontrar utilidad en la administración a áreas discretas del cuerpo de los mamíferos, incluyendo, por ejemplo, formulaciones que son adecuadas para inyección directa en uno o más órganos, tejidos o tipos de células en el cuerpo. Dichos sitios de inyección incluyen, pero no se limitan a, el cerebro, una articulación o cápsula articular, un tejido sinovial o subsinovial, tendones, ligamentos, cartílagos, hueso, músculo periarticular o un espacio articular de una articulación de mamífero, así como administración directa a un órgano, tal como el corazón, hígado, pulmón, páncreas, intestino, cerebro, vejiga, riñón, u otro sitio dentro del cuerpo del paciente, incluyendo, por ejemplo, la introducción de los vectores virales mediante administración intrabdominal, intratorácica, intravascular o intracerebroventricular.
Otros aspectos de la divulgación se refieren a partículas de virión de virus adenoasociados recombinantes, composiciones y células hospedadoras que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, uno o más de los vectores rAAV divulgados en el presente documento, tales como, por ejemplo, formulaciones farmacéuticas de los vectores destinados a la administración a un mamífero mediante medios adecuados, tales como, por inyección intramuscular, intravenosa, intrarticular o directa a una o más células, tejidos u órganos de un mamífero seleccionado. Normalmente, dichas composiciones pueden formularse con excipientes farmacéuticamente aceptables como se describen en el presente documento más adelante, y pueden comprender uno o más liposomas, lípidos, complejos lipídicos, microesferas o formulaciones de nanopartículas para facilitar la administración a los órganos, tejidos y células seleccionados para los que se desea terapia.
Los kits que comprenden uno o más de los vectores rAAV divulgados, viriones, partículas virales, células hospedadoras transformadas o composiciones farmacéuticas que comprenden tales; e instrucciones para usar el kit en una opción terapéutica, de diagnóstico, o clínica, también representan aspectos preferidos de la presente divulgación. Dichos kits pueden comprender además uno o más reactivos, enzimas de restricción, péptidos, agentes terapéuticos, compuestos farmacéuticos, o medios para administrar la composición o composiciones a las células hospedadoras, o a un animal (p. ej., jeringas, inyectables y similares). Dichos kits pueden ser kits terapéuticos para tratar, prevenir o mejorar los síntomas de una enfermedad, deficiencia, disfunción y/o lesión, y pueden comprender una o más de las construcciones de vectores rAAV modificados, sistemas de expresión, partículas de virión, o una pluralidad de dichas partículas, e instrucciones para usar el kit en un régimen terapéutico y/o de diagnóstico. Dichos kits también pueden usarse en metodologías de producción a gran escala para producir grandes cantidades de los propios vectores virales (con o sin un agente terapéutico codificado en ellos) para venta comercial, o para su uso por otros, incluyendo, p. ej., virólogos, profesionales médicos y similares.
Otro aspecto importante de la presente divulgación se refiere a métodos de uso de los vectores de rAAV divulgados, viriones, sistemas de expresión, composiciones y células hospedadoras descritas en el presente documento en la preparación de medicamentos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de diversas enfermedades, disfunciones o deficiencias en un animal, tal como un mamífero vertebrado. Dichos métodos generalmente implican la administración a un mamífero, o humano en necesidad de los mismos, uno o más de los vectores, viriones, partículas virales, células hospedadoras, composiciones o pluralidades de los mismos divulgados, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar o disminuir los síntomas de dicha enfermedad, disfunción o deficiencia en el animal afectado. Los métodos también pueden abarcar el tratamiento profiláctico de animales que se sospecha que tienen dichas afecciones, o la administración de dichas composiciones a aquellos animales en riesgo de desarrollar dichas afecciones, ya sea después del diagnóstico, o antes del inicio de los síntomas.
Como se ha descrito anteriormente, el polinucleótido exógeno codificará preferentemente una o más proteínas, polipéptidos, péptidos, ribozimas, u oligonucleótidos antisentido, o una combinación de los mismos. De hecho, el polinucleótido exógeno puede codificar dos o más de dichas moléculas, o una pluralidad de tales moléculas como se desee. Cuando se desean terapias génicas combinacionales, pueden producirse dos o más moléculas diferentes a partir de un único sistema de expresión de rAAV, o como alternativa, una célula hospedadora seleccionada puede transfectarse con dos o más sistemas de expresión únicos de rAAV, cada uno de los cuales proporcionará polinucleótidos heterólogos únicos que codifican al menos dos moléculas diferentes de este tipo.
En otras opciones, la divulgación también se refiere a los vectores rAAV divulgados comprendidos dentro de una partícula viral adenoasociada infecciosa, comprendidos en uno o más vehículos farmacéuticos, y pueden formularse para su administración a un mamífero tal como un humano para regímenes de terapia génica terapéutica y/o profiláctica. Dichos vectores también se pueden proporcionar en formulaciones farmacéuticas que son aceptables para la administración veterinaria a ganado seleccionado, animales domésticos, mascotas, y similares.
La divulgación también se refiere a células hospedadoras que comprenden los vectores rAAV divulgados y sistemas de expresión, particularmente células hospedadoras de mamífero, con células hospedadoras humanas siendo particularmente preferidas.
Las composiciones que comprenden uno o más de los vectores rAAV divulgados, sistemas de expresión, partículas de AAV infecciosas, células hospedadoras también forman parte de la presente divulgación, y particularmente aquellas composiciones que comprenden además al menos un primer excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en la fabricación de medicamentos y métodos que implican la administración terapéutica de dichos vectores rAAV. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente además liposomas, un lípido, un complejo lipídico; o los vectores rAAV pueden estar comprendidos dentro de una microesfera o una nanopartícula. Se prefieren particularmente formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección intramuscular, intravenosa o directa en un órgano o tejido de un humano.
Otros aspectos de la divulgación se refieren a partículas de virión de virus adenoasociados recombinantes, composiciones, y células hospedadoras que comprenden uno o más de los vectores AAV divulgados en el presente documento, tales como, por ejemplo, formulaciones farmacéuticas de los vectores destinados a la administración a un mamífero mediante medios adecuados, tales como, por inyección intramuscular, intravenosa o directa a células, tejidos u órganos de un mamífero seleccionado. Normalmente, dichas composiciones pueden formularse con excipientes farmacéuticamente aceptables como se describen en el presente documento más adelante, y pueden comprender uno o más liposomas, lípidos, complejos lipídicos, microesferas o formulaciones de nanopartículas para facilitar la administración a los órganos, tejidos y células seleccionados para los que se desea terapia.
Los kits que comprenden uno o más de los vectores, viriones, células hospedadoras, partículas virales o composiciones divulgados; y (ii) instrucciones para usar el kit en opciones terapéuticas, de diagnóstico, o clínicas, también representan aspectos preferidos de la presente divulgación. Dichos kits pueden comprender además uno o más reactivos, enzimas de restricción, péptidos, agentes terapéuticos, compuestos farmacéuticos, o medios para la administración de las composiciones a las células hospedadoras, o a un animal, tales como jeringas, inyectables y similares. Dichos kits pueden ser kits terapéuticos para tratar o mejorar los síntomas de enfermedades particulares, y normalmente comprenderán una o más de las construcciones de vectores AAV modificados, sistemas de expresión, partículas de virión, o composiciones terapéuticas descritas en el presente documento, e instrucciones para usar el kit.
Otro aspecto importante de la presente divulgación se refiere a métodos de uso de los vectores, viriones, sistemas de expresión, composiciones y células hospedadoras divulgados descritos en el presente documento en la preparación de medicamentos para tratar o mejorar los síntomas de diversas deficiencias de polipéptidos en un mamífero. Dichos métodos generalmente implican la administración a un mamífero, o humano en necesidad de los mismos, uno o más de los vectores, viriones, células hospedadoras, o composiciones divulgados, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar los síntomas de tal deficiencia en el mamífero afectado. Los métodos también pueden abarcar el tratamiento profiláctico de animales que se sospecha que tienen dichas afecciones, o la administración de dichas composiciones a aquellos animales en riesgo de desarrollar dichas afecciones, ya sea después del diagnóstico, o antes del inicio de los síntomas.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO:1 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 1 de tipo silvestre (AAV1);
La SEQ ID NO:2 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 2 de tipo silvestre (AAV2);
La SEQ ID NO:3 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 3 de tipo silvestre (AAV3);
La SEQ ID NO:4 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 4 de tipo silvestre (AAV4);
La SEQ ID NO:5 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 5 de tipo silvestre (AAV5);
La SEQ ID NO:6 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 6 de tipo silvestre (AAV6);
La SEQ ID NO:7 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 7 de tipo silvestre (AAV7);
La SEQ ID NO:8 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 8 de tipo silvestre (AAV8);
La SEQ ID NO:9 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 9 de tipo silvestre (AAV9);
La SEQ ID NO:10 es una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del virus adenoasociado de serotipo 10 de tipo silvestre (AAV10);
La SEQ ID NO:11 es una secuencia de cebador oligonucleotídico útil de acuerdo con la presente divulgación; y La SEQ ID NO:12 es una secuencia de cebador oligonucleotídico útil de acuerdo con la presente divulgación.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra un modelo esquemático a modo de ejemplo para el tráfico de AAV2 en el interior de una célula hospedadora de mamífero;
Las FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C, y FIG. 2D muestran el alineamiento de aminoácidos de las cápsides de AAV1-10 de tipo silvestre. La FIG. 2A muestra el alineamiento de aminoácidos de las cápsides del serotipo AAV1-10 de tipo silvestre (SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO: 10). La FIG. 2B muestra residuos de lisina expuestos en la superficie conservados en las cápsides de AAV1-12 de tipo silvestre, así como opciones de modificaciones de aminoácidos. Los residuos de lisina conservados entre AAV1-12 se muestran en negrita. La FIG. 2C muestra el alineamiento de aminoácidos de las cápsides del serotipo AAV1-10 de tipo silvestre, así como los residuos de tirosina expuestos en la superficie que se conservan entre cápsides de AAV1-10 (los residuos expuestos en la superficie conservados se muestran en negrita). La FIG. 2D muestra el alineamiento de aminoácidos de las cápsides del serotipo AAV1-10 de tipo silvestre, así como los residuos de serina y treonina expuestos en la superficie que se conservan entre cápsides de AAV1-10 (los residuos expuestos en la superficie conservados se muestran en negrita);
Las FIG. 3A y FIG. 3B muestran el efecto de varios inhibidores de la quinasa en la expresión de EGFP mediada por ssAAV y scAAV en células HEK293. Las células fueron pretratadas con inhibidores durante 1 hora antes de la infección y luego fueron transducidas con 1 x 103 vgs/célula. FIG. 3A: La expresión transgénica fue detectada por microscopía de fluorescencia 48 h después de la infección. FIG. 3B: Las imágenes de tres campos visuales fueron analizadas como se describe en el presente documento. *P < 0,005, **P < 0,001 vs. AAV2 de TS;
Las FIG. 4A y FIG. 4B muestran un análisis de la expresión de EGFP después de la transducción de células 293 con mutantes de la cápside de AAV2 dirigidos a un sitio individual. Cada una de las 15 serinas (S) expuestas en la superficie en las cápside de AAV2 fue sustituida con valina (V) y se evaluó su eficacia para mediar la expresión transgénica. FIG. 4A: Análisis de la expresión de EGFP a las 48 h después de la infección a una MDI de 1 x 103 vgs/célula. FIG. 4B: Cuantificación de eficiencia de transducción de cada uno de los vectores AAV2 con mutantes de serina. *P < 0,005, **P < 0,001 vs. AAV2 de TS;
La FIG. 5 muestra las eficiencias de empaquetado y transducción de diversos vectores AAV2 con mutantes de serina-valina en relación con los vectores AAV2 de tipo silvestre (TS). Resumiendo, se realizaron ensayos de empaquetado e infectividad de vectores al menos dos veces para cada uno de los vectores de los mutantes de AAV. La eficiencia de empaquetado se determinó mediante análisis de PCR cuantitativa. La eficiencia de transducción se estimó mediante la intensidad de la fluorescencia. *No se detectó fluorescencia en la MDI analizada;
Las FIG. 6A y FIG. 6B muestran la evaluación del efecto de la sustitución de serina en la posición 662 en la cápside de AAV2 con diferentes aminoácidos para mediar la expresión transgénica. Se generaron los siguientes 8 mutantes de serina con diferentes aminoácidos: S662^Valina (V), S662^Alanina (A), S662^-Asparagina (N), S662^Ácido aspártico (D), S662^Histidina (H), S662^Isoleucina (I), S662^Leucina (l ) y S662^Fenilalanina (F), y se analizó su eficiencia de transducción en células 293. FIG. 6A: Análisis de la expresión de EGFP a las 48 h después de la infección de células 293 a una MDI de 1 x 103 vgs/célula. FIG. 6B: Cuantificación de la eficiencia de transducción de cada uno de los vectores AAV2 con mutantes de serina. *P < 0,005, **P < 0,001 vs. AAV2 de TS;
La FIG. 7 ilustra las eficiencias de empaquetado y transducción de vectores con mutantes de serina a modo de ejemplo de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación que se han reemplazado con varios aminoácidos en relación con el vector AAV2 de tipo silvestre (TS). Se realizaron ensayos de empaquetado e infectividad como se describe en el presente documento. V = Valina; A = Alanina; D = Ácido aspártico; F = Fenilalanina H = Histidina; N = Asparagina; L = Leucina; e I = Isoleucina;
Las FIG. 8A y FIG. 8B muestran un análisis de correlación de la eficiencia de transducción de los vectores AAV2-S662V con actividad de la p38 MAPK en varios tipos celulares. FIG. 8A: Cuantificación de la eficiencia de transducción de los vectores de TS y S662V-AAV2 en 293, HeLa, NIH3T3, H2.35 y CDmos. FIG. 8B: Análisis de transferencia de Western de lisados de diferentes líneas celulares para los niveles de expresión de p-p38 MAPK. Se midieron los niveles totales de p38 MAPK y GADPH y se usaron como controles de carga. *P < 0,005, **P < 0,001 vs. AAV2 de TS;
Las FIG. 9A, FIG. 9B, y FIG. 9C demuestran la expresión de transgenes mediada por vectores AAV en células dendríticas derivadas de monocitos (CDmos) de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación. La FIG. 9A muestra el efecto de inhibidores de JNK y p38 MAPK y la sustitución dirigida al sitio del residuo de serina en la posición 662 en la expresión de EGFP. La FIG. 9B cuantificación de los datos de la FIG.9A a las 48 h después de la infección y del inicio de la maduración. La FIG. 9C muestra un análisis representativo de la expresión de marcadores coestimuladores, tales como CD80, CD83, CD86 en CDmos infectadas con un vector particular de acuerdo con la presente divulgación -- AAV2-S662V -- a una MDI de 5 x 104 vgs/célula. Las CDis (células dendríticas inmaduras) y las CDms (células dendríticas maduras) estimuladas con citocinas y generadas como se describe en el presente documento, se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Se muestra un ejemplo representativo. *P < 0,005, **P < 0,001 vs. AAV2 de TS.
La FIG. 10 ilustra una actividad de eliminación de linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos para hTERT en células K562. Los LTCs se generaron después de la transducción de CDmos mediante vectores AAV2-S662V que codifican la telomerasa humana truncada (hTERT). Las CDmos transducidas con el vector AAV2-S662V-EGFP se usaron para generar LTCs no específicos. Teñidas previamente con 3,3-dioctadeciloxacarbocianina (DiOC18(3)), una tinción de membrana fluorescente verde, se cultivaron 1 x 105 células K562 diana durante una noche con diferentes relaciones de LTCs (en este ejemplo ilustrativo 80:1, 50:1,20:1, 10:1, y 5:1). Se añadió una contratinción de ácido nucleico permeable a membrana, yoduro de propidio, para marcar las células con membranas plasmáticas comprometidas. Se analizaron por citometría de flujo los porcentajes de células eliminadas con doble tinción positiva;
Las FIG. 11A y FIG. 11B demuestran que la mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de serina expuestos en la superficie aumentó la eficiencia de transducción de células 293 en vectores scAAV a modo de ejemplo preparados de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación;
Las FIG. 12A y FIG. 12B revelan que la mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de treonina expuestos en la superficie aumentó la eficiencia de transducción de células 293 en vectores scAAV a modo de ejemplo preparados de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación;
Las FIG. 13A y FIG. 13B ilustran que la mutagénesis dirigida al sitio de combinaciones a modo de ejemplo de residuos de serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie aumentó significativamente la eficiencia de transducción de células H2.35 cuando se prepararon y usaron particularmente vectores scAAV a modo de ejemplo de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento;
Las FIG. 14A, FIG. 14B, FIG. 14C, FIG. 14D, y FIG. 14E demuestran una respuesta inmunitaria innata inducida por vectores AAV en ratones in vivo. La FIG. 14A muestra un perfil de expresión génica de los mediadores inmunitarios innatos llevado a cabo, y se muestran los datos para los cambios múltiplos en la expresión génica en el punto de tiempo de 2 h comparando los vectores AAV con Bay11 (barras sombreadas o abiertas) con los vectores AAV sin Bay11 (barras negras o grises). El umbral mínimo de coeficiente de aumento (línea negra horizontal) fue de 2,5. La FIG. 14B muestra un análisis de transferencia de Western de homogeneizados de hígado de ratones a las 9 horas después de las inyecciones de tratamiento simulado o inyecciones con vectores scAAV, con y sin administración previa de Bay11. Las muestras se analizaron usando un anticuerpo anti-p52 para la detección de la señalización de NF-KB en respuesta a la exposición a AAV. Se usó un anticuerpo anti-p-actina como control de carga. La FIG. 14C muestra la respuesta humoral a vectores AAV a modo de ejemplo en ausencia o presencia del inhibidor de NF-KB. Se determinaron los niveles de IgG2a anti-AAV2 en sangre periférica de ratones en el Día 10 después de las inyecciones de vectores scAAV, con y sin administración previa de Bay11 (n = 4 cada uno). La FIG. 14D muestra la expresión de transgenes en hepatocitos murinos 10 días después de la inyección de 1 x 1011 vgs de cada uno de los vectores WT-scAAV-EGFP o TM-scAAV-EFGP/animal a través de la vena caudal. La FIG. 14E ilustra los análisis cuantitativos de los datos representativos del estudio representado en la FIG. 14D;
Las FIG. 15A, FIG. 15B, Las FIG. 15C, y FIG. 15D ilustran el análisis de la expresión de transgenes mediada por AAV3 en células T47D y T47D+hHGFR. FIG. 15A: Números equivalentes de células T47D y T47D+hHGFR se infectaron con diversas multiplicidades de infección (MDI) indicadas de vectores scAAV3-CBAp-EGFP en condiciones idénticas. La expresión transgénica fue determinada por microscopía de fluorescencia 72 h después de la infección. FIG. 15B: Las células T47D+hHGFR se transdujeron con 2000 vgs/célula de vectores scAAV3 en ausencia o presencia de 5 pg/ml de hHGF. La expresión transgénica fue determinada como se ha señalado anteriormente. FIG. 15C: El efecto del inhibidor específico de la quinasa HGFR, BMS-777607 (BMS), se muestra en la expresión transgénica mediada por AAV3. Las células T47D y T47D+hHGFR se trataron de manera simulada o se pretrataron con BMS durante 2 h. Se prepararon lisados de células completas y se analizaron en transferencias de Western usando diversos anticuerpos primarios indicados. Como control de carga, se usó p-actina. FIG. 15D: Se muestra la eficiencia de transducción de vectores AAV3 de TS y único, doble y triple mutantes en tirosina. Se transdujeron células Huh7 con vectores de TS o varios vectores scAAV3-CBAp-EGFp mutantes en Y-F indicados en condiciones idénticas;
La FIG. 16 muestra la cuantificación de la expresión transgénica por AAV2-K544E, AAV2-K556E, AAV2-K544/566E, y AAV2-Y444/500/730F;
La FIG. 17 ilustra la eficiencia de transducción de vectores de WT y scAAV8 mutantes en lisina en hepatocitos primarios in vivo (ratones C57BL/6; inyecciones de 1 x 1010 de vectores scAAV-2-CBAp-Fluc a través de la vena caudal; 2 semanas) (experimento 2);
La FIG. 18 demuestra la cuantificación de la expresión transgénica por AAV8-K530E, AAV8-K547E, y AAV8-K569E de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación.
Las FIG. 19A y FIG. 19B muestran la eficiencia de transducción de vectores de WT y scAAV2 mutantes en lisina en hepatocitos primarios in vivo (ratones C57BL/6; inyecciones de 1 x 1010 de vectores scAAV-2-CBAp-EGFP a través de la vena caudal; 2 semanas);
La FIG. 20 muestra la eficiencia de transducción de vectores de TS y scAAV2 mutantes sustituidos con lisina o tirosina a modo de ejemplo de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación en un estudio con hepatocitos primarios in vivo (ratones C57BL/6; inyecciones de 1 x 1010 de vectores scAAV-2-CBAp-Fluc a través de la vena caudal; 2 semanas);
La FIG. 21 muestra la eficiencia de transducción de los vectores de TS y scAAV2 que contienen una cápside con mutación en lisina a modo de ejemplo en células HeLa in vitro (2000 vgs/célula; 48 h) de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación;
La FIG. 22 muestra que la mutagénesis dirigida al sitio de una combinación de residuos de serina treonina y/o tirosina expuestos en la superficie aumentan la eficiencia de transducción de las células dendríticas derivadas de los monocitos por los vectores scAAV, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación;
La FIG. 23 muestra la eficiencia de transducción de mutantes de AAV2 en lisina a modo de ejemplo preparados de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento en las células HeLa y HEK293 in vitro (MDI 2000). El coeficiente de aumento relativo en la expresión génica se muestra como insertos;
La FIG. 24 muestra la eficiencia de transducción de vectores de WT y scAAV8 que expresan una cápside con mutantes en lisina a modo de ejemplo en hepatocitos murinos in vivo (ratones C57BL/6; inyecciones de 1 x 1010 de vectores scAAV-2-CBAp-Fluc a través de la vena caudal; 2 semanas) (experimento 1); y
La FIG. 25 muestra la cuantificación de la expresión transgénica mediante vectores AAV8 a modo de ejemplo que expresan mutantes particulares de la proteína de la cápside sustituida con lisina. Se muestran las construcciones representativas AAV8-K530E, AAV8-K547E y AAV8-K569E.
Descripción de opciones ilustrativas
La presente divulgación proporciona proteínas de la cápside de AAV que comprenden la modificación de uno o una combinación de residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en la región de VP3. También se proporcionan viriones de rAAV que incluyen una o más de las mutaciones de la proteína de la cápside de AAV que se divulgan en el presente documento, así como moléculas de ácido nucleico y vectores de rAAV que codifican las proteínas de la cápside de AAV de la presente divulgación. Ventajosamente, los vectores y viriones de rAAV de la presente divulgación tienen una eficiencia mejorada en la transducción de varias células, tejidos y órganos de interés y/o reduce las respuestas inmunitarias del huésped a los vectores, cuando se comparan con los vectores y viriones de rAAV de tipo silvestre.
En una opción, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV, en donde la región VP3 de la proteína de la cápside de AAV comprende un residuo no lisina en una o más posiciones que corresponden a uno o más residuos de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre [p. ej., Se Q ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; y en una opción particularmente a modo de ejemplo, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)], en donde uno o más de los residuos de lisina en la región VP3 del a Av de tipo silvestre se selecciona entre el uno o más residuos de lisina como se ilustra en las FIG. 2A y FIG. 2B.
En una opción específica, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a uno o más residuos de lisina seleccionados entre el grupo que consiste en K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665, y K706 de la proteína de la cápside de AAV de tipo silvestre [p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)].
En una opción, se modifica el residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a K532 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En una opción, el residuo de lisina expuesto en la superficie de la cápside de AAV se modifica en ácido glutámico (E) o arginina (R). En una opción específica, se modifica el residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a K532 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en arginina (K532R).
En determinadas opciones, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K490, K544, K549, y K556 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En determinadas opciones específicas, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K490, K544, K549, y K556 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en ácido glutámico (E).
En una opción, la presente divulgación proporciona vectores AAV2 en donde los residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a los residuos K544 y K556 de la cápside de AAV2 de tipo silvestre se modifican en ácido glutámico (E).
En determinadas opciones, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K530, K547, y K569 de la secuencia de la cápside de AAV8 de tipo silvestre. En determinadas opciones específicas, se modifican uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K530, K547, y K569 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en ácido glutámico (E).
Además, la presente divulgación proporciona un método para la transducción de células, tejidos y/u órganos de interés, que comprende introducir en una célula, una composición que comprende una cantidad eficaz de un vector y/o virión de rAAV de la presente divulgación.
La fosforilación residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en las cápsides de AAV puede dar como resultado la ubiquitinación/degradación del proteasoma de los vectores. Las proteínas serina/treonina quinasas están implicadas en una gran variedad de procesos celulares que incluyen diferenciación celular, regulación de la transcripción, y desarrollo. La fosforilación de los residuos de serina y/o treonina expuestos en la superficie en la cápside viral induce una degradación de los vectores mediada por el proteasoma y reduce la eficiencia de transducción de los vectores. La proteína tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico celular (EGFR-PTK) también fosforila las cápsides en los residuos de tirosina en la superficie, y, por tanto, tiene un impacto negativo en el transporte nuclear y en la subsiguiente expresión de transgenes por los vectores AAV2 recombinantes.
Se identifican los residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en las cápsides de AAV (FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C, y FIG. 2D). Por ejemplo, la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV2 de tipo silvestre contiene varios residuos de lisina (K) expuestos en la superficie (K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665, K706), residuos de serina (S) expuestos en la superficie (S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, S721), residuos de treonina (T) expuestos en la superficie (T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, T716), residuos de tirosina expuestos en la superficie (Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, Y730). Como se muestra en las FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C, y FIG. 2D, estas residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie de las cápsides están muy conservados entre AAV1-12.
Se realizó mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie y los resultados muestran que la modificación o sustitución de uno o una combinación de los residuos expuestos en la superficie puede permitir que el vector AAV sortee las etapas de ubiquitinación y degradación mediada por el proteasoma, produciendo así nuevos vectores AAV con alta eficiencia de transducción. La sustitución de residuos de tirosina expuestos en la superficie en cápsides de AAV permite que los vectores escapen de la ubiquitinación y, por tanto, inhibe la degradación mediada por el proteasoma. Aunque los vectores AAV fosforilados podrían entrar en células tan eficientemente como su homólogo sin fosforilar, su eficiencia de transducción se redujo significativamente. Esta reducción no fue debida a la síntesis de ADN de la segunda hebra viral alterada, ya que disminuyó la eficiencia de transducción de tanto vectores AAV monocatenarios (ssAAV) como AAV autocomplementarios (rAAV).
Los vectores AAV recombinantes que contienen mutaciones puntuales en residuos de tirosina expuestos en la superficie confieren una mayor eficiencia de transducción a dosis más bajas, cuando se comparan con los vectores AAV de tipo silvestre (TS).
Además, de acuerdo con la presente divulgación, (i) la mutagénesis dirigida al sitio de los 15 residuos de serina (S) expuestos en la superficie en la cápside de AAV2 con residuos de valina (V) origina una eficiencia de transducción mejorada de vectores mutantes S458V, S492V, y S662V en comparación con el vector AAV2 de TS; (ii) el vector mutante S662V transduce de manera eficaz las células dendríticas derivadas de monocitos (CDmos) humanas primarias, un tipo de célula que no se presta fácilmente a la transducción por los vectores AAV convencionales; (iii) la alta eficiencia de transducción de CDmos mediante el mutante S662V no induce cambio fenotípico alguno en estas células; y (iv) los vectores S662V-rAAV recombinantes que transportan un gen de telomerasa humano truncado (hTERT) usado para transducir CDs da como resultado una rápida proliferación clonal de células T específicas y la generación de LTCs robustos, que provoca una lisis celular específica de células K562. Los resultados demuestran que los vectores rAAV2 modificados con serina de la presente divulgación dan como resultado una alta eficiencia de transducción de las CDmos.
En el marco de la inmunoterapia tumoral, el tiempo de la activación de células T y la potencia y longevidad de las respuestas de células T CD8 son factores cruciales a la hora de determinar el resultado terapéutico. De acuerdo con la presente divulgación, el aumento de la eficiencia de transducción de CDmo por los vectores AAV2 con mutantes en serina dio como resultado un cebado superior de células T. Se usó la telomerasa humana como una diana específica ya que numerosos estudios han demostrado que la telomerasa humana es un candidato atractivo para un antígeno de rechazo ampliamente expresado por muchos pacientes con cáncer. Además, la eficiencia de transducción del vector mutante S662V aumentó aún más por el pretratamiento de células con inhibidores específicos de JNK y p38 MAPK, lo que indica que es muy probable que uno o más residuos de treonina (T) expuestos en la superficie en cápsides de AAV2 sean fosforilados por estas quinasas.
VECTORES Y VIRIONES DE AAV RECOMBINANTES
Un aspecto de la divulgación proporciona proteínas de la cápside de AAV que comprenden la modificación de uno o una combinación de residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en la región VP3. También se proporcionan viriones de rAAV que comprenden las proteínas de la cápside de AAV de la presente divulgación, así como moléculas de ácido nucleico y vectores de rAAV que codifican las proteínas de la cápside de AAV de la presente divulgación. Ventajosamente, los vectores y viriones de rAAV de la presente divulgación tienen una eficiencia mejorada en la transducción de varias células, tejidos y órganos de interés, cuando se comparan con los vectores y viriones de rAAV de tipo silvestre.
En una opción, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV, en donde la proteína de la cápside de AAV comprende la modificación de uno o una combinación de los residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en la región VP3. Ventajosamente, la modificación de los residuos de lisina, serina treonina y/o tirosina expuestos en la superficie previene o reduce el nivel de ubiquitinación de los vectores AAV, y, de este modo, previene o reduce el nivel de degradación mediada por el proteasoma. Además, la modificación de los residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie de acuerdo con la presente divulgación mejora la eficiencia de transducción.
En una opción, la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV, en donde la región VP3 de la proteína de la cápside de AAV comprende una o una combinación de las siguientes características:
(a)
(i) un residuo de no lisina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665 y K706, en donde dicho residuo de no lisina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de lisina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., s Eq ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K665, K649, K655 y K706, en donde dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(iii) un residuo de no lisina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., s Eq ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K530, K547 y K569, en donde dicho residuo de no lisina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(iv) un residuo de lisina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K530, K547 y K569, en donde dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(b)
(i) un residuo de no serina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de serina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de serina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707 y S721, en donde dicho residuo de no serina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de serina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de serina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de serina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707 y S721, en donde dicho residuo de serina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(c)
(i) un residuo de no treonina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de treonina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de treonina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713 y T716, en donde dicho residuo de no treonina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de treonina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de treonina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de treonina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713 y T716, en donde dicho residuo de treonina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(d)
(i) un residuo de no tirosina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de tirosina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs: 1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de tirosina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 y Y730, en donde dicho residuo de no tirosina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de tirosina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de tirosina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de tirosina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 y Y730, en donde dicho residuo de tirosina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
En otra opción, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV, en donde uno o más residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en la región VP3 se modifican de la siguiente manera:
(a)
(i) al menos un residuo de lisina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no lisina, en donde el residuo modificado corresponde a K258, K32l, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, o K706 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs: 1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) al menos un residuo de lisina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no lisina, en donde el residuo modificado corresponde a K530, K547, o K569 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs: 1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8)), en donde dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(b) al menos un residuo de serina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no serina, en donde el residuo modificado corresponde a S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, o S721 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no serina o dicho residuo de serina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(c) al menos un residuo de treonina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no treonina, en donde el residuo modificado corresponde a T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, o T716 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no treonina o dicho residuo de treonina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y
(d) al menos un residuo de tirosina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no tirosina, en donde el residuo modificado corresponde a Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, o Y730 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no tirosina o dicho residuo de tirosina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
La presente divulgación también proporciona proteínas de la cápside de AAV VP3 que tienen una modificación de uno o más residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie. En una opción, la presente divulgación proporciona la proteína de la cápside de AAV VP3 que comprende una o una combinación de las siguientes características:
(a)
(i) un residuo de no lisina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665 y K706, en donde dicho residuo de no lisina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de lisina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665 y K706, en donde dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(iii) un residuo de no lisina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K530, K547 y K569, en donde dicho residuo de no lisina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(iv) un residuo de lisina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de lisina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8)), en donde dicho residuo de lisina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en K530, K547 y K569, en donde dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(b)
(i) un residuo de no serina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de serina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de serina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707 y S72 I, en donde dicho residuo de no serina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de serina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de serina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de serina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707 y S721, en donde dicho residuo de serina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; (c)
(i) un residuo de no treonina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de treonina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de treonina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713 y T716, en donde dicho residuo de no treonina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de treonina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de treonina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de treonina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713 y T716, en donde dicho residuo de treonina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(d)
(i) un residuo de no tirosina en una o más posiciones que corresponden a un residuo de tirosina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs: 1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de tirosina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 y Y730, en donde dicho residuo de no tirosina no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) un residuo de tirosina modificado químicamente en una o más posiciones que corresponden a un residuo de tirosina en la región VP3 de la proteína de la cápside del AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de tirosina en la región VP3 de AAV de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 y Y730, en donde dicho residuo de tirosina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
En otra opción, la presente divulgación proporciona una proteína de la cápside de AAV, en donde uno o más residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie en la región VP3 se modifican de la siguiente manera:
(a)
(i) al menos un residuo de lisina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no lisina, en donde el residuo modificado corresponde a K258, K32l, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665, o K706 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(ii) al menos un residuo de lisina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no lisina, en donde el residuo modificado corresponde a K530, K547, o K569 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs: 1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8)), en donde dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(b) al menos un residuo de serina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no serina, en donde el residuo modificado corresponde a S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, o S721 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no serina o dicho residuo de serina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(c) al menos un residuo de treonina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no treonina, en donde el residuo modificado corresponde a T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, o T716 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no treonina o dicho residuo de treonina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y
(d) al menos un residuo de tirosina en la región VP3 se modifica químicamente o se modifica en un residuo de no tirosina, en donde el residuo modificado corresponde a Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, o Y730 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)), en donde dicho residuo de no tirosina o dicho residuo de tirosina modificado químicamente no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV. Como se muestra en las FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C, y FIG. 2D, los residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie situados en la región VP3 de la proteína de la cápside están muy conservados entre varios serotipos de AAV (AAV1 a 12). En una opción, la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV, en donde el serotipo de AAV se selecciona de AAV1 a 12. En determinadas opciones, la proteína de la cápside de AAV de tipo silvestre tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOs: 1-10.
En una opción específica, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV2. El virus adenoasociado 2 (AAV2) es un parvovirus humano no patógeno. Se ha demostrado que los vectores AAV2 recombinantes transducen una amplia variedad de células y tejidos in vitro e in vivo, y están actualmente en uso en ensayos clínicos de fase I/II para terapia génica de varias enfermedades, tales como fibrosis quística, deficiencia de alfa-1 antitripsina, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Batten y distrofia muscular.
En una opción, la presente divulgación proporciona una proteína de la cápside de AAV, en donde la proteína de la cápside de AAV comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2), excepto que uno o más de los residuos de aminoácidos de la cápside de AAV2 de tipo silvestre se modifican de la siguiente manera:
(a) se modifica al menos un residuo de lisina de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre que se selecciona entre el grupo que consiste en K258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665, y K706 en un residuo de no lisina, o dicho residuo de lisina se modifica químicamente para que dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado químicamente no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(b) se modifica al menos un residuo de serina de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre que se selecciona entre el grupo que consiste en S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, y S721 en un residuo de no serina, o dicho residuo de serina se modifica químicamente para que dicho residuo de no serina o dicho residuo de serina modificado químicamente no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV;
(c) se modifica al menos un residuo de treonina de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre que se selecciona entre el grupo que consiste en T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, y T716 en un residuo de no treonina, o dicho residuo de treonina se modifica químicamente para que dicho residuo de no treonina o dicho residuo de treonina modificado químicamente no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV; y/o
(d) se modifica al menos un residuo de tirosina de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre que se selecciona entre el grupo que consiste en Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, y Y730 en un residuo de no treonina, se modifica en un residuo de no tirosina, o dicho residuo de tirosina se modifica químicamente para que dicho residuo de no tirosina o dicho residuo de tirosina modificado químicamente no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV. En una opción, un residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a un residuo de lisina seleccionado entre K532, K459, K490, K544, K549, K556, K527, K490, K143, o K137 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)) se modifica en un residuo de no lisina y/o se modifica químicamente para que dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
En otra opción, la presente divulgación proporciona una proteína de la cápside de AAV, en donde la proteína de la cápside de AAV comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside del AAV8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:8), excepto que uno o más residuos de lisina expuestos en la superficie correspondientes a K530, K547, y K569 de la cápside de AAV8 de tipo silvestre se modifican en un residuo de no lisina (tal como, ácido glutámico (E), arginina (R)) y/o se modifican químicamente, en donde dicho residuo de no lisina o dicho residuo de lisina modificado no da como resultado la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV. En determinadas opciones, los residuos de lisina expuestos en la superficie de la secuencia de AAV se modifican en ácido glutámico (E), arginina (R), serina (S), o isoleucina (I) para evitar la fosforilación y/o ubiquitinación del vector AAV.
La presente divulgación también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP3) de la presente divulgación.
En una opción específica, se modifica el residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a K532 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En una opción, el residuo de lisina expuesto en la superficie de la cápside de AAV se modifica en ácido glutámico (E) o arginina (R). En una opción específica, se modifica el residuo de lisina expuesto en la superficie correspondiente a K532 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en arginina (K532R).
En una opción, al menos un residuo de lisina expuesto en la superficie de una cápside de AAV correspondiente a una posición de lisina de una secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre se modifica como se indica en la FIG. 2B.
En una opción, al menos un residuo de serina expuesto en la superficie correspondiente a un residuo de serina seleccionado entre S662, S261, S468, S458, S276, S658, S384, o s 492 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)) se modifica en un residuo de no serina y/o se modifica químicamente para que dicho residuo de no serina o dicho residuo de serina modificado no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
En una opción específica, se modifica el residuo de serina expuesto en la superficie correspondiente a S662 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En una opción, el residuo de serina expuesto en la superficie de la cápside de AAV se modifica en valina (V), ácido aspártico (D), o histidina (H). En una opción específica, se modifica el residuo de serina expuesto en la superficie correspondiente a S662 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en valina (S662V).
En una opción, un residuo de treonina expuesto en la superficie correspondiente a un residuo de treonina seleccionado entre T455, T491, T550, T659, o T671 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre [p. ej., SEQ ID NOs:1-10; y en una opción particular, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)) se modifica en un residuo de no treonina y/o se modifica químicamente para que dicho residuo de no treonina o dicho residuo de treonina modificado no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
En una opción específica, se modifica el residuo de treonina expuesto en la superficie correspondiente a T491 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre. En una opción, el residuo de treonina expuesto en la superficie de la cápside de AAV se modifica en valina (V). En una opción específica, se modifica el residuo de treonina expuesto en la superficie correspondiente a T491 de la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo silvestre en valina (T491V).
En una opción, el vector AAV comprende una modificación de los residuos de treonina expuestos en la superficie en posiciones correspondientes a (T550V+T659V+T491V) de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre [p. ej., SEQ ID NOs: 1-10; y en una opción particular, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)]. En una opción, un residuo de tirosina expuesto en la superficie correspondiente a un residuo de tirosina seleccionado entre Y252, Y272, Y444, Y500, Y704, Y720, Y730, o Y673 de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NOs:1-10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)) se modifica en un residuo de no tirosina y/o se modifica químicamente para que dicho residuo de no tirosina o dicho residuo de tirosina modificado no resulte en la fosforilación y/o ubiquitinación de un vector AAV.
En una opción, el residuo de tirosina expuesto en la superficie de la cápside de AAV se modifica en fenilalanina (V). En una opción, el vector AAV comprende una modificación de los residuos de tirosina expuestos en la superficie en posiciones correspondientes a (Y730F+Y500F+Y444F) de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre [p. ej., SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10; y en una opción particular, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID NO:2)].
En una opción, se modifica una combinación de residuos de lisina, serina, treonina y/o tirosina expuestos en la superficie de la cápside de AAV, en donde la modificación se produce en las posiciones correspondientes a (Y444F+Y500F+Y730F+T491V),
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V),
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T659V),
(T491V+T550V+T659V), (Y440F+Y500F+Y730F),
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+S662V), y/o
(Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V+T659V) de la secuencia de la cápside de AAV de tipo silvestre [p. ej., SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10; en una opción, la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre (SEQ ID n O:2)]. También se proporcionan proteínas de la cápside de AAV codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación.
En una opción, la presente divulgación proporciona un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV de la divulgación. En otra opción, la presente divulgación proporciona un virión de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV de la divulgación. En una opción, el vector y virión de rAAV han mejorado la eficiencia de transducción, cuando se comparan con el vector y virión de rAAV de tipo silvestre. En otra opción, el vector y virión de rAAV es capaz de una transducción eficiente de células, tejidos y/u órganos de interés.
En una opción, el vector rAAV comprende además un transgén (también denominado molécula de ácido nucleico heterólogo) unido operativamente a un promotor y, opcionalmente, otros elementos reguladores. En una opción, el transgén codifica un agente terapéutico de interés.
Los promotores a modo de ejemplo incluyen uno o más promotores constitutivos o inducibles heterólogos específicos de tejido, incluyendo, pero sin limitación, un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de citomegalovirus (CMV), desmina (DES), promotores de beta-actina, promotores de insulina, promotores de enolasa, promotores de BDNF, promotores de NGF, promotores de EGF, promotores del factor de crecimiento, promotores específicos de axones, promotores específicos de dendritas, promotores específicos del cerebro, promotores específicos del hipocampo, promotores específicos de riñón, promotores de elafina, promotor de citocinas, promotor de interferón, promotores del factor de crecimiento, promotores de alfa-1 antitripsina, promotores específicos del cerebro, promotores específicos de células neuronales, promotores específicos de células del sistema nervioso central, promotores específicos de células del sistema nervioso periférico, promotores de interleucina, promotores de serpina, promotores de CMV híbrido, promotores de beta-actina híbrido, promotores EF1, promotores U1a, promotores U1b, promotores inducibles por Tet y promotores de VP16-LexA. En opciones a modo de ejemplo, el promotor es un promotor de beta-actina de mamífero o aviar.
Las secuencias potenciadoras a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una o más seleccionadas de entre el grupo que consiste en potenciadores de c Mv , potenciadores sintéticos, potenciadores específicos del hígado, potenciadores específicos vascular, potenciadores específicos del cerebro, potenciadores específicos de células neurales, potenciadores específicos de pulmón, potenciadores específicos de músculo, potenciadores específicos de riñón, potenciadores específicos de páncreas y potenciadores específicos de células de los islotes.
Los agentes terapéuticos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un agente seleccionado entre el grupo que consiste en polipéptidos, péptidos, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, ribozimas, ácidos peptidonucleicos, ARNip, ARNi, oligonucleótidos antisentido y polinucleótidos antisentido.
En opciones a modo de ejemplo, los vectores rAAV de la divulgación codificarán una proteína o polipéptido terapéutico seleccionado entre el grupo que consiste en agonistas adrenérgicos, factores antiapoptosis, inhibidores de la apoptosis, receptores de citocina, citocinas, citotoxinas, agentes eritropoyéticos, descarboxilasas de ácido glutámico, glucoproteínas, factores de crecimiento, receptores del factor de crecimiento, hormonas, receptores hormonales, interferones, interleucinas, receptores de interleucina, quinasas, inhibidores de quinasa, factores de crecimiento nervioso, netrinas, péptidos neuroactivos, receptores de péptidos neuroactivos, factores neurogénicos, receptores del factor neurogénico, neuropilinas, factores neurotróficos, neurotrofinas, receptores de neurotrofina, antagonistas de N-metil-D-aspartato, plexinas, proteasas, inhibidores de proteasas, proteínas descarboxilasas, proteínas quinasas, inhibidores de proteína quinasa, proteínas proteolíticas, inhibidores de la proteína proteolítica, semaforina, receptores de semaforina, proteínas transportadoras de serotonina, inhibidores de la captación de serotonina, receptores de serotonina, serpinas, receptores de serpina y supresores tumorales.
En determinadas aplicaciones, los vectores con alta eficiencia de transducción modificados pueden comprender un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, gonadotropina, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, TGF-B2, TNF, VEGF, prolactina, somatotropina, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10(187A), IL-10 viral, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 y IL-18. Dichos agentes terapéuticos pueden ser de origen humano, murino, aviar, porcino, bovino, ovino, felino, canino, equino, epino, caprino, lupino o de primate.
Los vectores AAV recombinantes útiles de acuerdo con la divulgación incluyen vectores monocatenarios (ss) o autocomplementarios (sc).
Los vectores rAAV de la presente divulgación también pueden estar dentro de una célula hospedadora de mamífero aislada, incluyendo, por ejemplo, células hospedadoras de ser humano, primate, murino, felino, canino, porcino, ovino, bovino, equino, epino, caprino y lupino. Los vectores rAAV pueden estar dentro de una célula hospedadora de mamífero aislada, tal como una célula humana endotelial, epitelial, vascular, hepática, pulmonar, del corazón, pancreática, intestinal, renal, cardíaca, cancerosa o tumoral, muscular, ósea, neuronal, sanguínea o cerebral.
USOS TERAPÉUTICOS
Otro aspecto de la divulgación concierne a los usos de los vectores y viriones de rAAV de la divulgación para la transducción eficiente de células, tejidos, y/u órganos de interés, y/o para su uso en terapia genética.
En una opción, la presente divulgación proporciona un método para la transducción de células, tejidos y/u órganos de interés, que comprende introducir en una célula, una composición que comprende una cantidad eficaz de un vector y/o virión de rAAV de la presente divulgación.
En determinadas opciones, los vectores y viriones de rAAV de la divulgación se usan para la transducción de células hospedadoras de mamífero, incluyendo, por ejemplo, células hospedadoras de ser humano, primate, murino, felino, canino, porcino, ovino, bovino, equino, epino, caprino y lupino. En determinadas opciones, los vectores y viriones de rAAV de la divulgación se usan para la transducción de células endoteliales, epiteliales, vasculares, hepáticas, pulmonares, del corazón, pancreáticas, intestinales, renales, musculares, óseas, dendríticas, cardíacas, neuronales, sanguíneas, cerebrales, fibroblásticas o cancerosas.
En una opción, células, tejidos, y/o órganos de un sujeto son transducidos usando los vectores y/o viriones de rAAV de la presente divulgación.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, describe un organismo, incluyendo mamíferos tales como primates, a los que se puede proporcionar tratamiento con las composiciones de acuerdo con la presente divulgación. Las especies de mamíferos que pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento divulgados incluyen, pero no se limitan a, simios; chimpancés; orangutanes; seres humanos; monos; animales domésticos tales como perros y gatos; ganado tales como caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras y pollos; y otros animales tales como ratones, ratas, cobayas y hámsteres.
Además, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad, en donde el método comprende administrar, a un sujeto con necesidad de tal tratamiento, una cantidad eficaz de una composición que comprende el vector y/o virión de rAAV de la divulgación.
El término "tratamiento" o cualquier variación gramatical del mismo (p. ej., tratar, que trata y tratamiento, etc.), como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, aliviar un síntoma de una enfermedad o afección; y/o reducir, suprimir, inhibir, minimizar, mejorar o afectar a la progresión, gravedad, y/o alcance de una enfermedad o afección.
La expresión "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad que es capaz de tratar o mejorar una enfermedad o afección, o de otra manera es capaz de producir un efecto terapéutico pretendido.
La divulgación también proporciona el uso de una composición divulgada en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar los síntomas de una enfermedad, trastorno, disfunción, lesión o traumatismo, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento, prevención y/o profilaxis de una enfermedad, trastorno o disfunción, y/o la mejora de uno o más síntomas de tal enfermedad, trastorno o disfunción. Las condiciones a modo de ejemplo para las que la terapia génica basada en rAAV viral puede encontrar utilidad particular incluyen, pero no se limitan a, cáncer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, nefropatía, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreática, enfermedad intestinal, hepatopatía, enfermedad neurológica, trastorno neuromuscular, déficit neuromotor, deterioro neuroesquelético, discapacidad neurológica, disfunción neurosensorial, ictus, deficiencia de a1-antitripsina (AAT), enfermedad de Batten, isquemia, un trastorno alimentario, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esquelética y enfermedad pulmonar.
La divulgación también proporciona un método para tratar o mejorar los síntomas de tal enfermedad, lesión, trastorno o disfunción en un mamífero. Dichos métodos generalmente implican al menos la etapa de administrar a un mamífero que lo necesite, uno o más de los vectores y viriones de rAAV de la presente divulgación, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar los síntomas de tal enfermedad, lesión, trastorno o disfunción en el mamífero.
Dichos regímenes de tratamiento se contemplan particularmente en terapia en humanos, mediante la administración de una o más composiciones ya sea por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, intratecal, intraperitoneal o mediante inyección directa en un órgano o un tejido del sujeto que se encuentre en tratamiento.
La divulgación también proporciona un método para proporcionar a un mamífero que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones de rAAV de la presente divulgación, en una cantidad, y durante un tiempo eficaz para proporcionar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de agente o agentes terapéuticos deseados codificados por uno o más segmentos de ácido nucleico comprendidos dentro del vector rAAV. Preferentemente, el agente terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno, una ribozima, un ácido nucleico peptídico, un ARNip, un ARNi, un oligonucleótido antisentido y un polinucleótido antisentido.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
La presente divulgación también proporciona composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden el principio activo en una forma que puede combinarse con un portador terapéutico o farmacéuticamente aceptable. Las construcciones genéticas de la presente divulgación pueden prepararse en diversas composiciones, y también pueden formularse en vehículos farmacéuticos apropiados para administración a sujetos humanos o animales.
Las moléculas de rAAV de la presente divulgación y las composiciones que las comprenden proporcionan terapéuticos nuevos y útiles para el tratamiento, control y mejora de síntomas de diversos trastornos, y en particular, enfermedades articulares, trastornos y disfunciones, incluyendo, por ejemplo, osteoartritis, artritis reumatoide y trastornos relacionados.
La divulgación también proporciona composiciones que comprenden uno o más de los vectores rAAV divulgados, sistemas de expresión, viriones, partículas virales; o células de mamífero. Como se describe a continuación en el presente documento, dichas composiciones pueden comprender además un excipiente, tampón o diluyente farmacéutico, y pueden formularse para su administración a un animal, y particularmente un ser humano. Dichas composiciones pueden comprender además opcionalmente un liposoma, un lípido, un complejo lipídico, una microesfera, una micropartícula, una nanoesfera, o una nanopartícula, o pueden formularse de otro modo para su administración a las células, tejidos, órganos o cuerpo de un sujeto en necesidad de los mismos. Dichas composiciones pueden formularse para su uso en varias terapias, tales como, por ejemplo, en la mejora, prevención y/o tratamiento de afecciones, tales como deficiencia de péptidos, deficiencia de polipéptidos, sobreexpresión de péptidos, sobreexpresión de polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, afecciones que producen enfermedades o trastornos, tales como cánceres, tumores, u otros crecimientos malignos, disfunción por déficit neurológico, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades articulares, enfermedades cardíacas o pulmonares, isquemia, ictus, accidentes cerebrovasculares, ataques isquémicos transitorios (AIT); diabetes y/u otras enfermedades del páncreas; enfermedad o disfunción cardiocirculatoria (incluyendo, p. ej., hipotensión, hipertensión, ateroesclerosis, hipercolesterolemia, daño o enfermedad vascular; enfermedades neurales (incluyendo, p. ej., enfermedad de Alzheimer, de Huntington, de Tay-Sach y de Parkinson, pérdida de memoria, traumatismo, deterioro motor, neuropatía y trastornos relacionados); enfermedad o disfunción biliar, renal o hepática; enfermedades musculoesqueléticas o neuromusculares (incluyendo, p. ej., artritis, parálisis, fibrosis quística (FQ), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), distrofia muscular (DM) y similares).
En una opción, el número de partículas de vector y/o virión de rAAV administrado a un mamífero puede ser del orden que varía de 103 a 1013 partículas/ml, o cualquier valor entre estos, tales como, por ejemplo, aproximadamente 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, o 1013 partículas/ml. En una opción, se administran partículas del vector y/o virión de rAAV de más de 1013 partículas/ml. Los vectores y/o viriones de rAAV pueden administrarse como una dosis única, o dividirse en dos o más administraciones, según sea necesario, para lograr la terapia de la enfermedad o trastorno particular que se está tratando. En la mayoría de los regímenes de terapia génica basados en rAAV, los inventores creen que se requerirán títulos más bajos de partículas infecciosas cuando se usan los vectores de rAAV de la cápside modificada, en comparación con los protocolos convencionales de terapia genética.
En determinadas opciones, la presente divulgación se refiere a una formulación de una o más composiciones basadas en rAAV divulgadas en el presente documento en soluciones farmacéuticamente aceptables para su administración a una célula o un animal, ya sea en solitario o en combinación con una o más modalidades de terapia, y en particular, para terapia de células humanas, tejidos y enfermedades que afectan al hombre.
Si se desea, segmentos de ácido nucleico, composiciones de ARN, ADN o PNA que expresan uno o más productos génicos terapéuticos pueden administrarse también en combinación con otros agentes, tales como, p. ej., proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos, incluyendo una o más administraciones sistémicas o tópicas de polipéptidos terapéuticos, fragmentos biológicamente activos, o variantes de los mismos. De hecho, prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse, dado que los agentes adicionales no causan un efecto adverso significativo al contacto con las células diana o los tejidos del huésped. Por tanto, las composiciones genéticas basadas en rAAV pueden administrarse junto con diversos otros agentes según se requiera en el caso particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de células hospedadoras u otras fuentes biológicas, o como alternativa, pueden sintetizarse químicamente como se describe en el presente documento. Del mismo modo, dichas composiciones pueden comprender además ARN sustituido o derivatizado, ADN, ARNip, ARNm, ARNt, ribozima, moléculas de ARN catalíticas, o composiciones de PNA y similares.
La formulación de excipientes y soluciones transportadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la técnica, como lo es el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en el presente documento en diversos regímenes de tratamiento, incluyendo, p. ej., administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intrarticular, intramuscular.
Normalmente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente un 0,1 % de compuesto activo o más, aunque el porcentaje del o de los principios activos puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 1 o el 2 % y aproximadamente el 70 % o el 80 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuesto o compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida media del producto, así como otras consideraciones farmacológicas se contemplarán por un experto en la técnica de preparación de dichas formulaciones farmacéuticas, y como tales, pueden ser deseables diversas dosificaciones y regímenes de tratamiento.
En determinadas circunstancias será deseable administrar las construcciones terapéuticas basadas en vector AAV en composiciones farmacéuticas formuladas de manera adecuada, divulgadas en el presente documento tanto por vía subcutánea, intraocular, intravítrea, parenteral, subcutánea, intravenosa, intracerebro-ventricular, intramuscular, intratecal, oral, intraperitoneal, por inhalación oral o nasal, o por inyección directa a una o más células, tejidos u órganos por inyección directa. Los métodos de administración también pueden incluir aquellas modalidades como se describen en las patentes estadounidenses 5.543.158, 5.641.515 y/o 5.399.363. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua estéril y también pueden mezclarse adecuadamente con uno o más tensioactivos, tales como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas de las composiciones virales basadas en AAV adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente estadounidense 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos.
El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de aceite de petróleo, tal como aceite mineral, aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite de sésamo, aceite animal, o aceite de origen sintético. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos.
Las composiciones de la presente divulgación se pueden administrar al sujeto que se está tratando por rutas estándar incluyendo, pero sin limitación, por vía pulmonar, intranasal, oral, inhalación, parenteral, tal como intravenosa, tópica, transdérmica, intradérmica, transmucosal, intraperitoneal, intramuscular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e inyección intraesternal. En opciones preferidas, la composición se administra por vía intranasal, pulmonar u oral.
Para la administración de una solución acuosa inyectable, por ejemplo, la solución puede tamponarse de forma adecuada, si es necesario, y el diluyente líquido se vuelve en primer lugar isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán, a la luz de la presente divulgación, un medio acuoso estéril que se puede emplear. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y se añade tanto a 1000 ml de fluido de hipodermocilisis o se inyecta en el sitio propuesto de la infusión, (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración, en todo caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. Por otra parte, para la administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, y los estándares generales de seguridad y pureza según las exigencias de los estándares de la Oficina de Productos Biológicos de la FDA.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los fragmentos de ADN que codifican polipéptidos terapéuticos administrados en vectores a Av activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros principios necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de la solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.
Las composiciones de vectores AAV divulgadas en el presente documento pueden también formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres procedentes de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas farmacéuticas, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos, y similares.
La cantidad de composiciones de AAV y el tiempo de administración de dichas composiciones estarán dentro del alcance del experto en la técnica que se beneficia de las presentes enseñanzas. Es probable, sin embargo, que la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de las composiciones divulgadas pueda lograrse mediante una única administración, tal como, por ejemplo, una sola inyección de un número suficiente de partículas infecciosas para proporcionar un beneficio terapéutico al paciente sometido a dicho tratamiento. Como alternativa, en algunas circunstancias, puede ser deseable proporcionar administraciones múltiples o sucesivas de las composiciones de vectores AAV, ya sea durante un período relativamente corto, o durante un período relativamente prolongado, según se puede determinar por el médico que supervisa la administración de dichas composiciones.
VECTORES DE EXPRESIÓN
La presente invención contempla varios sistemas de expresión basados en AAV, y vectores. En una opción, los vectores de expresión de AAV preferidos comprenden al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica un péptido terapéutico, proteína o polipéptido. En otra opción, los vectores de expresión de AAV preferidos divulgados en el presente documento comprenden al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica una molécula antisentido. En otra opción, un promotor está operativamente unido a una región de secuencia que codifica un ARNm funcional, un ARNt, una ribozima o un ARN antisentido.
La elección de qué vector de expresión y, por último lugar, a qué promotor está operativamente enlazada una región codificante de polipéptido, depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, p. ej., la ubicación y el momento elegido de la expresión de proteínas, y la célula hospedadora que va a transformarse. Estas son limitaciones muy conocidas inherentes en la técnica de la construcción de moléculas de ADN recombinantes. Sin embargo, un vector útil en la práctica de la presente divulgación es capaz de dirigir la expresión del ARN funcional al que está operativamente unido.
Se ha desarrollado varios métodos para enlazar operativamente el ADN a vectores mediante extremos terminales cohesivos complementarios o extremos romos. Por ejemplo, pueden añadirse tractos homopoliméricos complementarios al segmento de ADN que va a insertarse y al ADN de vector. El vector y el segmento de ADN se unen entonces por un enlace de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinantes.
Para expresar un agente terapéutico de acuerdo con la presente divulgación, se puede preparar un vector de expresión de rAAV modificado en tirosina que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica un agente terapéutico bajo el control de uno o más promotores. Para poner una secuencia "bajo el control de" un promotor, se pone el extremo 5' del sitio de iniciación de la transcripción del marco de lectura transcripcional generalmente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "corriente abajo" (es decir, 3') del promotor elegido. El promotor "corriente arriba" estimula la transcripción del ADN y promueve la expresión del polipéptido codificado. Esto es el significado de "expresión recombinante" en este contexto. Construcciones de vectores recombinantes particularmente preferidas son aquellas que comprenden un vector rAAV. Dichos vectores se describen detalladamente en el presente documento.
Cuando se contempla el uso de dichos vectores para la introducción de una o más proteínas exógenas, polipéptidos, péptidos, ribozimas y/u oligonucleótidos antisentido, en una célula particular transfectada con el vector, se pueden emplear los vectores rAAV o los vectores rAAV modificados en tirosina divulgados en el presente documento modificando genéticamente los vectores para comprender además al menos un primer polinucleótido exógeno posicionado operativamente corriente abajo y bajo el control de al menos un primer promotor heterólogo que expresa el polinucleótido en una célula que comprende el vector para producir el péptido codificado, proteína, polipéptido, ribozima, ARNip, ARNi u oligonucleótido antisentido. Dichas construcciones pueden emplear promotores heterólogos que son constitutivos, inducibles, o incluso promotores específicos de célula. A modo de ejemplo, dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores virales, de mamífero y aviares, incluyendo, por ejemplo, un promotor de CMV, un promotor de beta-actina, un promotor de CMV híbrido, un promotor de beta-actina híbrido, un promotor EF1, un promotor U1a, un promotor U1b, un promotor inducible por Tet, un promotor de VP16-LexA, y similares.
Los vectores o sistemas de expresión también pueden comprender además uno o más potenciadores, elementos reguladores, elementos transcripcionales, para alterar o efectuar la transcripción del gen heterólogo clonado en los vectores rAAV. Por ejemplo, los vectores rAAV de la presente divulgación pueden comprender además al menos un primer potenciador del CMV, un potenciador sintético, o un potenciador específico de células o de tejidos. El polinucleótido exógeno también puede comprender además una o más secuencias de intrones.
KITS TERAPÉUTICOS
La divulgación también abarca una o más de las composiciones de vectores rAAV genéticamente modificados descritas en el presente documento junto con uno o más excipientes, vehículos, diluyentes, adyuvantes y/u otros componentes farmacéuticamente aceptables, como pueden emplearse en la formulación de administración de polinucleótido de rAAV particular, y en la preparación de agentes terapéuticos para su administración a un sujeto, y particularmente, a un humano. En particular, dichos kits pueden comprender una o más de las composiciones de rAAV divulgadas en combinación con instrucciones para usar el vector viral en el tratamiento de dichos trastornos en un sujeto, y pueden normalmente incluir además recipientes preparados para el envasado comercial conveniente.
Como tales, los animales preferidos para la administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento incluyen mamíferos, y particularmente, humanos. Otros animales preferidos incluyen murinos, bovinos, equinos, porcinos, caninos y felinos. La composición puede incluir composiciones de rAAV parcialmente o significativamente purificadas, bien en solitario, o en combinación con uno o más de principios activos adicionales, que pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o recombinantes, o que pueden ser obtenidas naturalmente o sintetizarse químicamente, o producirse alternativamente in vitro a partir de células hospedadoras recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican dichos principios activos adicionales.
Los kits terapéuticos también pueden prepararse para que comprendan al menos una de las composiciones divulgadas en el presente documento e instrucciones para usar la composición como un agente terapéutico. Los medios de recipiente para dichos kits pueden comprender normalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa u otros medios de recipiente, en los que pueden colocarse la o las composiciones de rAAV divulgadas, y preferentemente, dividirse convenientemente en alícuotas. Si también se proporciona una segunda composición de polipéptido terapéutica, el kit también puede contener un segundo medio de recipiente distinto en el que esta segunda composición puede colocarse. Como alternativa, la pluralidad de composiciones biológicamente activas terapéuticas puede prepararse en una única composición farmacéutica, y pueden envasarse en un único medio de recipiente, tal como un vial, matraz, jeringa, botella, u otros medios únicos de recipiente adecuados. Los kits de la presente divulgación también incluirán normalmente un medio para contener el o los viales en confinamiento cerrado para la venta comercial, tal como, p. ej., recipientes de plástico inyectables o moldeados por soplado en los que se guarda el o los viales deseados.
PROTEÍNAS DE LA CÁPSIDE DE AAV
El ensamblaje supramolecular de 60 subunidades individuales de proteína de la cápside en una estructura reticular icosaédrica T-1 no envuelta capaz de proteger un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb es una etapa crítica en el ciclo de vida del parvovirus humano dependiente de auxiliar, el virus adenoasociado 2 (AAV2). La partícula madura de AAV2 de 20 nm de diámetro está compuesta por tres proteínas estructurales designadas VP1, VP2 y VP3 (masas moleculares de 87, 73 y 62 kDa, respectivamente) en una relación de 1:1:18. Basándose en su simetría y estas estimaciones de peso molecular, de las 60 proteínas de la cápside que comprenden la partícula, tres son proteínas VP1, tres son proteínas VP2, y cincuenta y cuatro son proteínas VP3.
EQUIVALENTES FUNCIONALES BIOLÓGICOS
La modificación y los cambios en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de vectores rAAV de tipo silvestre para proporcionar los viriones de rAAV mejorados como se describe en la presente divulgación para obtener vectores virales funcionales que poseen características deseables, particularmente con respecto a la administración mejorada de construcciones de genes terapéuticos a células, tejidos y órganos de mamífero seleccionados para el tratamiento, prevención y profilaxis de diversas enfermedades y trastornos, así como medios para la mejora de síntomas de dichas enfermedades, y para facilitar la expresión de polipéptidos terapéuticos y/o profilácticos exógenos de interés mediante terapia génica mediada por vectores rAAV. Como se ha mencionado anteriormente, uno de los aspectos clave de la presente divulgación es la creación de una o más mutaciones en secuencias de polinucleótidos específicas que codifican uno o más de los agentes terapéuticos codificados por las construcciones de rAAV divulgadas. En determinadas circunstancias, la secuencia de polipéptidos resultante se altera por estas mutaciones, o en otros casos, la secuencia del polipéptido permanece sin cambios por una o más mutaciones en el polinucleótido codificante para producir vectores modificados con propiedades mejoradas para efectuar la terapia génica en sistemas de mamífero.
Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse con otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras, tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden realizar determinadas sustituciones de secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica, y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto, los inventores contemplan que pueden realizarse diversos cambios en las secuencias de polinucleótidos divulgadas en el presente documento, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.
Al realizar dichos cambios, puede tenerse en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende, en general, en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado por referencia en el presente documento). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobia y de carga (Kyte y Doolittle, 1982), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
DEFINICIONES A MODO DE EJEMPLO
De acuerdo con la presente divulgación, polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico y similares, incluyen, pero no se limitan a, ADNs (incluyendo y no limitado a ADN genómicos o extragenómicos), genes, ARNs de ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) (incluyendo, pero sin limitación, ARNrs, ARNms y ARNts), nucleósidos, y segmentos de ácido nucleico adecuados obtenidos de fuentes naturales, sintetizados químicamente, modificados, o preparados de otro modo o sintetizados en su totalidad o en parte por la mano del hombre.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Aunque puede usarse cualquier método y composición similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente divulgación, en el presente documento se describen los métodos y composiciones preferentes. Para los fines de la presente divulgación, a continuación se definen los siguientes términos:
El término "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a una región o regiones de una secuencia de ácido nucleico que regula la transcripción.
La expresión "elemento regulador", como se usa en el presente documento, se refiere a una región o regiones de una secuencia de ácido nucleico que regula la transcripción. Los elementos reguladores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, potenciadores, elementos postranscripcionales, secuencias de control transcripcional y similares.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico (normalmente compuesta por ADN) capaz de replicarse en una célula hospedadora y/o a la que puede unirse operativamente otro segmento de ácido nucleico para producir replicación del segmento adjunto. Un plásmido, cósmido, o un virus es un vector a modo de ejemplo.
La expresión "corresponde sustancialmente a", "sustancialmente homólogo", o "identidad sustancial", como se usa en el presente documento, representa una característica de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, en donde una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos seleccionada tiene al menos aproximadamente 70 o aproximadamente 75 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de referencia seleccionada. Más normalmente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia tendrán al menos aproximadamente el 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o incluso el 85 por ciento de identidad de secuencia, y más preferentemente, al menos aproximadamente el 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o el 95 por ciento de identidad de secuencia. Aún más preferentemente, las secuencias altamente homólogas a menudo comparten una identidad de secuencia mayor de al menos aproximadamente el 96, 97, 98 o 99 por ciento entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia con la que se comparó.
El porcentaje de identidad de secuencia se puede calcular sobre la longitud total de las secuencias a comparar, o se puede calcular excluyendo pequeñas deleciones o adiciones cuyo total es menos de aproximadamente el 25 por ciento, etc., de la secuencia de referencia elegida. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, tal como una porción de un gen o secuencia de flanqueo, o una porción repetitiva de un cromosoma. Sin embargo, en el caso de la homología de secuencia de dos o más secuencias de polinucleótidos, la secuencia de referencia comprenderá normalmente al menos aproximadamente 18-25 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 26 a 35 nucleótidos, e incluso más normalmente al menos aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, o incluso 100 o más nucleótidos.
De manera deseable, cuando se desean fragmentos altamente homólogos, el grado de identidad porcentual entre las dos secuencias será de al menos aproximadamente el 80 %, preferentemente de al menos aproximadamente el 85 %, y más preferentemente de aproximadamente el 90 % o el 95 % o más, según se determina fácilmente por uno o más de los algoritmos de comparación de secuencias bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como, p. ej., el programa de análisis FASTA descrito por Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(8):2444-8, abril de 1988).
La expresión "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a que las secuencias de ácido nucleico que se unen son normalmente contiguas, o sustancialmente contiguas, y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, dado que los potenciadores generalmente funcionan cuando están separados del promotor por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden tener longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar unidos operativamente pero no son contiguos.
Ejemplos
A continuación se presentan ejemplos que ilustran procedimientos y opciones para poner en práctica la divulgación. Los ejemplos no deben interpretarse como limitantes.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Células y anticuerpos: Se obtuvieron células HEK293, HeLa, NIH3T3 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE. UU.) y se mantuvieron como cultivos en monocapa en DMEM (Invitrogen) complementado con SFB al 10 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y antibióticos (Lonza). Las células mononucleares de sangre periférica derivadas de leucoféresis (CMSPs) (AllCells) se purificaron en Ficoll-Paque (GE Healtcare), se resuspendieron en medio AIM-V exento de suero (Lonza), y se incubaron las fracciones de células semiadherentes durante 7 días con IL-4 humana recombinante (500 U/ml) y GM-CSF (800 U/ml) (R&D Systems). La maduración de las células se inició con una mezcla de citocinas que incluye 10 ng/ml de TNF-a, 10 ng/ml de IL-1, 10 ng/ml de IL-6 y 1 mg/ml de PGE2 (R&D Systems) durante 48 h. Antes de la expresión de EGFP, se caracterizó la expresión de moléculas coestimuladoras de las células para asegurarse de que cumpliesen con el fenotipo típico de las células dendríticas maduras (CDm) (CD80, RPE, IgG1 murina; CD83, RPE, IgG1 murina; CD86, FITC, IgG1 murina; Invitrogen).
Mutagénesis dirigida al sitio: Se realizó una PCR en dos etapas con el plásmido pACG2 como se ha descrito anteriormente (Wang et al., 1999) usando Polimerasa Pfu Turbo® (Stratagene). Resumiendo, en la etapa uno, se realizaron dos reacciones de PCR de extensión en tubos separados para el cebador de PCR directo e inverso durante 3 ciclos. En la etapa dos, se mezclaron las dos reacciones y se realizó una reacción de PCR durante 15 ciclos adicionales, seguida de digestión con Dpnl durante una hora. Los cebadores se diseñaron para introducir cambios de serina (TCA o AGC) a valina (GTA o GTC) para cada uno de los residuos mutados.
Producción de vectores AAVrecombinantes: Se generaron vectores AAV2 recombinantes que contenían el gen de EGFP dirigido por el promotor de ®-actina de pollo, como se ha descrito anteriormente (Zolotukhin, 2002). Resumiendo, se transfectaron células HEK293 usando polietilenimina (PEI, lineal, PM 25.000, Polysciences, Inc.). Setenta y dos horas después de la transfección, se recogieron las células y se purificaron los vectores mediante centrifugación de gradiente de iodixanol (Sigma) y cromatografía en columna de intercambio iónico (HiTrap Sp Hp 5 ml, GE Healthcare). Acto seguido se concentró el virus y se intercambió el tampón en tres ciclos a solución de Ringer lactada usando concentradores por centrifugación (Apollo, corte de 150 kDa, 20 ml de capacidad, CLP (Cheng et al., 2011). Se trataron diez pl del virus purificado con DNAsa I (Invitrogen) durante 2 h a 37 °C, a continuación 2 h adicionales con proteinasa K (Invitrogen) a 56 °C. La mezcla de reacción se purificó con fenol/cloroformo, seguido de un tratamiento con cloroformo. El ADN empaquetado se precipitó con etanol en presencia de 20 pg de glucógeno (Invitrogen). Se determinaron los títulos de partículas de AAV resistentes a DNAsa I mediante RT-PCR con el siguiente par de cebadores, específicos para el promotor de CBA:
directo 5'-TCCCATAGTAACGCCAATAGG-3' (SEQ ID NO:11)
inverso 5'-CTTGGCATATGATACACTTGATG-3' (SEQ ID NO:12)
y mezcla maestra para PCR SYBR Green (Invitrogen).
Ensayos de transducción de vectores AAV recombinantes in vitro: Se transdujeron células HEK293 o dendríticas derivadas de monocitos (CDmo) con vectores AAV2 con 1000 vgs/célula o 2000 vgs/célula, respectivamente, y se incubaron durante 48 h. Como alternativa, las células se pretrataron con 50 pM de los inhibidores selectivos de serina/treonina quinasas, terc-butil éster-9 isopurina del ácido 2-(2-hidroxietilamino)-6-aminohexilcarbámico (para CaMK-II), antra[1,9-cd]pirazol-6(2H)-ona, 1,9-pirazoloantrona (para JNK) y 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1H-imidazol (para MAPK) (c K59, inhibidor 2 de JNK, p D 98059, Calbiochem), 1 h antes de la transducción. La expresión transgénica se evaluó como el área total de fluorescencia verde (píxel2) por campo visual (media ± DT) o por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente (Markusic et al., 2011; Jayandharan et al., 2011). Se usó un análisis de varianza para comparar los resultados de la prueba y el control, que se determinaron como estadísticamente significativos.
Análisis de transferencia de Western: Se realizó un análisis de transferencia de Western como se ha descrito anteriormente (Aslanidi et al., 2007). Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM, Nonidet P-40 al 1 %, glicerol al 10 %, Na4P2O710 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), EDTA 1 mM y EGTA 1 mM complementado con mezcla de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Conjunto 2 y 3, Calbiochem). La suspensión se incubó en hielo durante 1 h y se aclaró por centrifugación durante 30 min a 14.000 rpm a 4 °C. Después de la normalización de la concentración de proteína, las muestras se separaron usando electroforesis en poliacrilamida al 12 %/SDS, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpos primarios, mAb de conejo anti-p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182), mAb de conejo anti-p38 MAPK total y mAb de conejo anti-GAPDH (1:1000, CellSignaling), seguido de anticuerpos secundarios ligados a peroxidasa de rábano picante (1:1000, Cell Signaling).
Generación de linfocitos T citotóxicos específicos y ensayo de citotoxicidad: Se generaron células dendríticas derivadas de monocitos (CDmo) como se ha descrito anteriormente. Las CD inmaduras se infectaron con vectores AAV2-S662V que codifican el ADNc de telomerasa humana, (Dr. Karina Krotova, Universidad de Florida), separado en dos MLA solapantes - hTERT838-2229 y hTERT2042-3454 a una MDI de 2000 vgs/célula de cada uno. A continuación se dejó que las células experimentaran estimulación con suplementos para inducir la maduración. Después de 48 h, se recogieron las CD maduras que expresaban hTERT y se mezclaron con las CMSP a una relación de 20:1. Los LTC se cultivaron en medio AlM-V que contenía IL-15 humana recombinante (20 Ul/ml) e IL-7 (20 ng/ml) a 20 x 106 células en matraces de 25 cm2. Se añadieron citocinas frescas cada 2 días. Después de 7 días tras el cebado, las células se recogieron y se usaron para ensayos de eliminación (Heiser et al., 2002). Se generó una curva de eliminación y se determinó la lisis celular específica mediante análisis FACS de las relaciones de células vivas/muertas como se ha descrito anteriormente (Mattis et al., 1997). La línea celular de leucemia mielógena humana inmortalizada, K562, se usó como diana.
Análisis estadístico: Los resultados se presentan como la media ± DT. Se identificaron las diferencias entre grupos usando una distribución de dos colas agrupadas-independientes de la prueba de la t de Student. Los valores de p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
EJEMPLO 1 - LA INHIBICIÓN DE SERINA/TREONINA QUINASA CELULAR ESPECÍFICA AUMENTA LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN DE VECTORES RAAV2
La inhibición de la actividad de la proteína tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico celular (EGFR-PTK), así como la mutagénesis dirigida al sitio de los siete residuos de tirosina expuestos en la superficie aumentó significativamente la eficiencia de transducción de los vectores AAV2 impidiendo la fosforilación de estos residuos, eludiendo de esa manera la ubiquitinación y la posterior degradación mediada por el proteasoma de los vectores. Las cápsides de AAV2 también contienen quince restos de serina expuestos en la superficie, que potencialmente pueden fosforilarse por las serina/treonina quinasas celulares ampliamente expresadas en diversos tipos de células y tejidos.
Para examinar si la inhibición de dicha actividad quinasa puede impedir la fosforilación de los residuos de serina expuestos en la superficie, y por tanto, mejorar el tráfico intracelular y el transporte nuclear de los vectores AAV2, se usaron varios inhibidores específicos disponibles comercialmente de serina/treonina quinasas celulares, tales como la proteína quinasa II dependiente de calmodulina (CamK-II), quinasa N-terminal c-Jun (JNK); y la proteína quinasa activada por mitógenos (p38 MAPK). Se pretrataron células HEK293 con inhibidores específicos, tales como ferc-butil éster-9 isopropilpurina del ácido 2-(2-hidroxietilamino)-6-aminohexilcarbámico (para CaMK-II), antra[1,9-cd]pirazol-6(2H)-ona, 1,9-pirazoloantrona (para JNK), y 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1H-imidazol (para p38 MAPK) durante 1 h a varias concentraciones. Las células se transdujeron posteriormente con vectores AAV2 tanto monocatenarios (ss) como autocomplementarios (sc) a 1000 genomas de vector (vgs) por célula.
Estos resultados indicaron que todos los inhibidores a una concentración óptima de 50 pM aumentaron significativamente la eficiencia de transducción de los vectores ssAAV2 y scAAV2, siendo el inhibidor de p38 MAPK el más eficaz (FIG. 3A y FIG. 3B). Los resultados indican que el aumento en la eficiencia de transducción se debió a la prevención de la fosforilación de las cápsides del vector en lugar de a una síntesis de ADN mejorada de la segunda hebra viral.
EJEMPLO 2 - LA MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO DE LOS RESIDUOS DE SERINA EXPUESTOS EN LA SUPERFICIE MEJORA LA EXPRESIÓN TRANSGÉNICA MEDIADA POR VECTORES
La cápside de AAV2 contiene 50 residuos de serina (S) en la región común de la proteína viral 3 (VP3) de las tres VP de la cápside, de los cuales 15 residuos (S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, S721) están expuestos en la superficie. Cada uno de los 15 residuos de S se sustituyó con valina (V) mediante mutagénesis dirigida al sitio como se ha descrito anteriormente. La mayoría de los mutantes pudo generarse a títulos similares a los de los vectores AAV2 de TS, con la excepción de S261V, S276V y S658V, que se produjeron con títulos -10 veces menores y S267V y S668V, que no produjeron niveles detectables de partículas de vector resistentes a DNAsa I. Los títulos de los mutantes de S468V y S384V fueron ~3-5 veces mayores que los de los vectores AAV2 de TS. Se evaluó la eficiencia de transducción en células 293 de cada uno de los vectores mutantes de S-V.
Estos resultados, mostrados en las FIG. 4A y FIG. 4B, indicaron que de los 15 mutantes, el mutante S662V transdujo células 293 de un modo ~20 veces más eficaz que su homólogo de TS. La eficiencia de transducción de los vectores mutantes S458V y S492V aumentó en ~4 y 2 veces, respectivamente. La eficiencia de transducción de los mutantes S468V y S384V, que se produjeron a títulos mayores que los vectores AAV2 de TS, permaneció sin cambios (S468V) o se redujo ~10 veces (S384V) a la misma multiplicidad de infección (MDI). La eficiencia de transducción de varios vectores AAV2 con mutantes en serina a valina se resume en la FIG. 5. Sorprendentemente, no se observó ningún otro aumento de la eficiencia de transducción en los vectores que contenían cualquiera de los dobles mutantes (S458V+S662V y S492V+S662V), o en un vector que contenía el triple mutante (S458V+S492V+S662V).
EJEMPLO 3 - SUSTITUCIÓN DE S662 CON VARIOS AMINOÁCIDOS
Además de la sustitución de S a V en la posición 662, también se generaron siete mutantes a continuación con diferentes aminoácidos: S662^Alanina (A), S662^Asparagina (N), S662^Ácido aspártico (D), S662^Histidina (H), S662^Isoleucina (I), S662^Leucina (L), y S662^Fenilalanina (F). La eficiencia de transducción de cada uno de estos vectores mutantes también se evaluó en células 293 similares a lo que se ha descrito anteriormente.
Los resultados, tal como se muestran en las FIG.6A y FIG. 6B, y resumidos en la FIG. 7, demuestran que la sustitución de S con V dio lugar a la producción del mutante más eficaz sin cambio alguno en los títulos de vector, en comparación con otros mutantes. El reemplazo de S con N, I, L o F redujo la eficiencia del empaquetado ~10 veces sin un efecto significativo en la eficiencia de transducción, mientras que la sustitución de D o H aumentó la eficiencia de transducción ~8 veces y ~4 veces, respectivamente, sin efecto en los títulos de vector. La sustitución de S a A aumentó el título viral hasta ~5 veces y mejoró la expresión transgénica ~3 veces en comparación con el vector AAV2 de TS. La variabilidad observada en los títulos y la infectividad de los mutantes de serina en la posición 662 sugiere el papel crítico que desempeña cada uno de los aminoácidos en la modulación tanto de la eficiencia de empaquetado de AAV2 como de su actividad biológica.
EJEMPLO 4 - LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN DE LOS VECTORES S662V SE CORRELACIONÓ CON LA ACTIVIDAD DE P38 MAPK EN VARIOS TIPOS CELULARES
La expresión transgénica mediada por el vector S662V se examina usando los siguientes tipos celulares: (i) NIH3T3 (fibroblastos embrionarios de ratón), (ii) H2.35 (hepatocitos fetales de ratón), (iii) HeLa (células de cáncer cervical humanas), y (iv) células dendríticas derivadas de monocitos humanas primarias (CDmo). Se transdujeron estos tipos celulares con los vectores WT scAAV2-EGFP o S662V scAAV2-EGFP a una MDI de 2000 vgs por célula en condiciones idénticas. Se evaluó la expresión génica de EGFP 48 h después de la infección (p.i.) para HeLa, 293 y CDmo y 5 días p.i. para células H2.35 y NIH3T3.
Los resultados, como se muestra en la FIG. 8A, muestran que las diferencias absolutas en la eficiencia de transducción entre los vectores mutantes de TS y S662V varió de ~3 veces (en células H2.35) a ~20 veces (en células 293), el vector mutante fue consistentemente más eficaz en cada tipo celular analizado.
Para examinar si las diferencias observadas en la eficiencia de transducción de los vectores de TS y mutantes se debe a variaciones en los niveles de expresión y/o la actividad de la p38 MAPK celular, se analizaron lisados celulares preparados a partir de cada tipo celular en transferencias de Western sondadas con anticuerpos específicos para detectar los niveles tanto de p38 MAPK total como de fosfo-p38 MAPK. GAPDH se utilizó como control de carga.
Los resultados, como se muestra en la FIG. 8B, indican que aunque los niveles de proteína p38 MAPK eran similares, la actividad quinasa, determinada mediante el nivel de fosforilación, varió significativamente entre los diferentes tipos celulares y la eficiencia de transducción del vector mutante S662V se correlacionó más o menos con la actividad de p38 MAPK. Los resultados muestran la fosforilación mediada por p38 MAPK de los vectores AAV2. Además, la transducción por los vectores WT-AAV2 no condujo a una regulación positiva de la fosforilación de la p38 MAPK en células 293 o en las CDmos; esto indica que el AAV no induce cambios fenotípicos robustos en las CDmos.
EJEMPLO 5- LA TRANSDUCCIÓN MEDIADA POR EL VECTOR MUTANTE S662V DE LAS CDMOS NO CONDUJO A ALTERACIONES FENOTÍPICAS
Los miembros de la familia de MAPK desempeñan papeles importantes en el desarrollo y la maduración de las CPAs. En este Ejemplo, las CDmos, aisladas de leucoféresis de donantes sanos, se trataron con 50 pM de inhibidores de quinasa selectivos como se ha descrito anteriormente y luego se transdujeron con vectores WT scAAV2-EGFP. Dos horas p.i., las células se trataron con suplementos (TNF-a, IL-1p, 11-6, PGE2) para inducir la maduración. La expresión transgénica de EGFP se evaluó 48 h p.i. mediante microscopía de fluorescencia.
Los resultados muestran que el pretratamiento de las CDmos con inhibidores específicos de JNK y p38 MAPK aumentó los niveles de expresión de EGFp ~2 veces y ~3 veces, respectivamente, y se mejoró la eficiencia de transducción ~5 veces con los vectores mutantes S662V (FlG. 9A, FIG. 9B, y FIG. 9C).
Puesto que se ha informado previamente que la inhibición de estas quinasas impide la maduración de las células dendríticas, también se examinó la capacidad del mutante S662V para inducir cambios fenotípicos en CDs. Resumiendo, Las CDmos se infectaron con una MDI cada vez mayor de hasta 50.000 vgs por célula, se recogieron a las 48 h p.i. y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para la regulación positiva de moléculas coestimuladoras de la superficie. Los análisis por citometría de flujo de los marcadores de maduración de CD, tales como CD80, CD83 y CD86 indicaron que, de manera similar a los vectores AAV2 de TS, los vectores mutantes S662V tampoco indujeron la maduración de las CDmos (FIG. 9C). Los resultados mostraron que los vectores AAV de cápside mutada preparados de acuerdo con la presente divulgación, demostraron una baja inmunogenicidad.
EJEMPLO 6 - GENERACIÓN DE LTC ESPECÍFICOS DE HTERT POR CDMO TRANSDUCIDAS CON VECTORES AAV2-S662V
Ya que la expresión transgénica mediada por el vector AAV2 mutante en serina en CDmo mejoró significativamente en comparación con los vectores AAV2 de TS, este estudio demuestra la capacidad de las CDmos cargadas con S662V para estimular la generación de linfocitos T citotóxicos y la eliminación específica eficaz de células diana. Dado que la telomerasa humana se reconoce como una diana anticancerosa única expresada comúnmente en la mayoría de células cancerosas, se clonó un gen truncado de telomerasa humana (hTERT) bajo el control del promotor de pactina de pollo y se empaquetó el ADN en el mutante AAV2 S662V. Se estimularon células mononucleares de sangre periférica (CMSP) no adherentes que contenían hasta un 25 % de células CD8 positivas una vez con CDmo/hTERT suministrado por el vector S662V. Una línea celular de leucemia mielógena inmortalizada, K562, se usó para un ensayo de fluorescencia de dos colores de citotoxicidad mediada por células para generar una curva de eliminación con la relación celular efectora a diana posteriormente reducida.
Los resultados, mostrados en la FIG. 10, indicaron que las CDmos cargadas con hTERT podrían estimular de manera eficaz la proliferación clonal de células T específicos y la actividad de eliminación en comparación con CDmos que expresan GFP. Estos resultados también indicaron que los métodos de suministro basados en el vector rAAV con mutación en cápside también podrían usarse en varias metodologías de vacunación de mamíferos.
EJEMPLO 7 - VECTORES RAAV2 CON ALTA EFICIENCIA OBTENIDOS POR MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO DE RESIDUOS DE TIROSINA, SERINA Y/O TREONINA EXPUESTOS EN LA SUPERFICIE
Los vectores AAV se usan actualmente en varios ensayos clínicos como vehículo de suministro para dirigirse a varios tejidos con el fin de lograr una expresión sostenida de genes terapéuticos. Sin embargo, se necesitan grandes dosis de vector para observar beneficios terapéuticos. La producción de cantidades suficientes del vector también plantea un desafío, así como el riesgo de iniciar una respuesta inmunitaria contra el vector. Por tanto, es crucial desarrollar nuevos vectores AAV con una alta eficiencia de transducción a dosis más bajas.
La proteína tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR-PTK) afecta negativamente a la expresión transgénica a partir de vectores AAV2 recombinantes, debido principalmente a la fosforilación de las cápsides de AAV2 en los residuos de tirosina. Las cápsides fosforiladas en la tirosina se degradan posteriormente por la maquinaria proteasómica del huésped, que afecta negativamente a la eficiencia de transducción de los vectores AAV. Los inhibidores selectivos de las serina/treonina quinasas JNK y p38 MAPK mejoran la eficiencia de transducción, lo que indica que la fosforilación de ciertos residuos de serina y/o treonina expuestos en la superficie reduce la eficiencia de transducción de los vectores AAV.
Se realizó una mutagénesis dirigida al sitio de la proteína de la cápside del AAV2 de tipo silvestre. Como se muestra en las FIG. 11A, FIG. 11B, FIG. 12A y FIG. 12B, los mutantes de serina (S662V) y treonina (T491V) de la proteína de la cápside del AAV2 de tipo silvestre aumentan sustancialmente la eficiencia de transducción de los vectores AAV.
Las mutaciones de serina (S662V) y treonina (T491V) se combinaron con los mutantes individuales (Y730F) y triples (Y730F+500+444F) de tirosina con mejor rendimiento para generar los siguientes vectores: (i) tres dobles (S662V+T491V; Y730F+ S662V; Y730F+T491V); (ii) uno triple (S662V+Y730F+T491V); (iii) dos cuádruples (Y730+500+444F+ S662V; Y730+500+44F+T491V); y (iv) uno quíntuple (Y730+500+4440F+S662V+ T491V). La eficiencia de transducción de cada uno de los vectores mutantes se evaluó usando una línea celular de hepatocitos murinos primarios H3.25.
Tal como se muestra en las FIG. 13A y FIG. 13B, el vector basado en AAV2 cuádruple mutante (Y730+500+730F+T491V) aumentó la eficiencia de transducción aproximadamente 30 veces más que la del vector AAV2 de tipo silvestre (TS) correspondiente sin modificar, y aproximadamente 3 veces sobre la producida por el vector basado en AAV2 triple mutante (Y730+500+444F). La combinación de la mutación S662V con el vector individual (Y730F) o triple mutante de tirosina (Y730F+500+444F), afectó negativamente a la eficiencia de transducción.
Las células dendríticas (CDs) modificadas genéticamente han sido ampliamente estudiadas, y se han iniciado numerosos ensayos clínicos de fase I y II que evalúan su eficacia en pacientes con cáncer. Sin embargo, los métodos actuales para la carga de CDs son inadecuados en términos de viabilidad celular, incertidumbre sobre la longevidad de la presentación del antígeno, y la restricción por el haplotipo del paciente. Se ha demostrado el éxito de la transducción de diferentes subconjuntos de CDs por diferentes serotipos de vectores del AAV comúnmente usados y se ha analizado la ventaja potencial de una vacuna antitumoral basada en AAV. Sin embargo, se justifican mejoras adicionales en la transferencia génica mediante vectores AAV recombinantes a las CDs en términos de especificidad y eficiencia de transducción para lograr un impacto significativo cuando se usan como vacuna antitumoral.
Las proteínas de serina/treonina quinasas pueden regular negativamente la eficiencia de la expresión transgénica mediada por vectores AAV recombinantes al fosforilar los residuos de serina y/o treonina expuestos en la superficie en la cápside viral y dirigirse a los vectores para su degradación mediada por el proteasoma. La prevención de la fosforilación de los residuos de serina y treonina expuestos en la superficie podría permitir que los vectores evitaran la fosforilación y la subsiguiente ubiquitinación y, por tanto, impedir la degradación del proteasoma.
Se realizó una mutagénesis dirigida al sitio al vector AAV de tipo silvestre de cada uno de los 15 residuos de serina (S) expuestos en la superficie. Los resultados muestran que la sustitución de S662 a valina (V) aumentó la eficiencia de transducción del mutante S662V hasta 6 veces, cuando se compara con el vector AAV2 de tipo silvestre. Además, se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para sustituir cada uno de los 17 residuos de treonina (T) expuestos en la superficie del vector AAV2 de tipo silvestre con V (T251V, T329V, T330V, T454V, T455V, T503V, T550V, T592V, T581V, T597V, T491V, T671V, T659V, T660V, T701V, T713V, T716V). La eficiencia de transducción de cada uno de los vectores mutantes de T-V se evaluó usando células dendríticas derivadas de monocitos (CDmo) humanas primarias a una MDI de 2000 vgs/célula. Tras la maduración con una mezcla de citocinas que incluye 10 ng/ml de TNF-a, 10 ng/ml IL-1, 10 ng/ml IL-6, y 1 mg/ml PGE2, la expresión de EGFP se analizó 48 horas después de la infección bajo un microscopio fluorescente. Las células se caracterizaron por la expresión de moléculas coestimulantes (CD80, CD83, y CD86) para asegurar que cumplieran con el fenotipo típico de las células dendríticas maduras (CDms).
Tal como se muestra en las FIG. 14A y FIG. 14B, las mutaciones de los siguientes residuos de T (T455V, T491V, T550V, T659V, T671V) aumentaron la eficiencia de transducción de las CDmos hasta 5 veces, con el mutante T491V demostrando la mayor eficiencia de transducción entre los analizados en este estudio.
Para examinar si las mutaciones múltiples de los residuos de T podrían mejorar aún más la eficiencia de transducción, también se generaron los siguientes mutantes AAV2: (i) cuatro vectores AAV2 con mutaciones dobles con respecto al vector AAV2 de tipo silvestre (T455V+T491V; T550V+T491V; T659V+T491V; T671V+T491V); (ii) dos vectores AAV2 de triple mutación (T455V+T491V+T550V y T550V+T659V+T491V); y (iii) un vector AAV2 de cuádruple mutación (T455V+T550V+T659V+T491V). Los resultados demostraron que varios de estos vectores mutantes múltiples aumentaron la eficiencia de transducción de las células dendríticas, y el triple mutante (T550V+T659V+T491V), en particular, demostró poseer una eficiencia de transducción óptima (¡aproximadamente diez veces mayor que la del vector AAV2 de tipo silvestre no modificado correspondiente!). Estos resultados se mejoraron aún más al hacer varios mutantes combinatorios de manera "de combinación y adaptación" para generar un número de vectores adecuados con cápside mutada. Una de estas combinaciones, al combinar el mutante de sustitución serina (S662V) con mejor rendimiento con el de sustitución de treonina con mejor rendimiento (T491V), mejoró aún más la eficiencia de transducción en aproximadamente 8 veces en comparación con cualquiera de las mutaciones únicas individuales.
EJEMPLO 8 - LA MUTAGÉNESIS SELECTIVA DE RESIDUOS DE LISINA DE UNIÓN A UBIQUITINA EN LA CÁPSIDE DE AAV2 MEJORA SU EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN
Es ahora un hecho reconocido que la transferencia de genes hepáticos de altas dosis de vectores AAV predispone a una robusta respuesta inmunológica adaptativa, a partir de los datos disponibles de los ensayos clínicos sobre hemofilia. Por tanto, es necesario desarrollar nuevas estrategias que permitan usar dosis más bajas de vectores para lograr una corrección fenotípica sostenida y limitar las inmunotoxicidades relacionadas con los vectores.
Este Ejemplo muestra que los residuos de lisina expuestos en la superficie de la región VP3 de la proteína de la cápside de VVA2 son dianas directas de las ligasas de ubiquitina del huésped, y la mutagénesis de estos residuos de lisina mejora la eficiencia de transducción de los vectores AAV.
En el análisis in silico usando un software de predicción de la ubiquitinación (UbPred) se identificaron siete residuos de lisina (K39, K137, K143, K161, K490, K527 y K532) de la cápside de AAV2 de tipo silvestre que podrían ubiquitinarse. Se llevaron a cabo mutaciones de lisina a arginina en el plásmido codificante Rep/Cap de AAV2 y se generaron reservas altamente purificadas de un vector AAV2 recombinante autocomplementario que expresaba EGFP [scAAV-CBa-EGFP] en cada uno de los siete plásmidos mutantes de lisina. Los títulos de las partículas físicas de los vectores mutantes de lisina eran comparables a los vectores scAAV de tipo silvestre (TS) (-0,5-1 x 1012 vgs/ml), lo que sugiere que estas mutaciones no afectaron la estructura o la capacidad de empaquetado de las cápsides mutantes.
Los vectores scAAV que contenían TS o cada una de las siete cápsides mutantes para lisina se evaluaron entonces por su potencial de transducción in vitro. Aproximadamente 8 x 104 células HeLa o HEK293 estaban infectadas de forma simulada o infectadas con AAV en diferentes multiplicidades de infección (MDI) incluyendo 500, 2000 o 5000 vgs/célula. Cuarenta y ocho horas después de la infección, La expresión transgénica (EGFP) fue medida por microscopía de fluorescencia y por citometría de flujo.
Los resultados presentados en la FIG. 15) demostraron que el vector mutante K532R aumentaba significativamente la expresión génica tanto en las células HeLa (18X) como en HEK 293 (9X) in vitro, cuando se comparan con el vector AAV2 de TS. La mayor eficiencia de transducción del vector K532R fue consistente a través de tres diferentes MDI analizadas, con un aumento promedio de 10 veces sobre el vector de TS.
EJEMPLO 9 - ACTIVACIÓN DE LAS VÍAS DE NF-KB CANÓNICAS Y ALTERNATIVAS IN VIVO MEDIADA POR EL VECTOR AAV
La infección de las células HeLa con vectores virales adenoasociados (AAV) in vitro da como resultado la activación de la vía alternativa de NF-KB, un regulador central de las respuestas inmunitarias e inflamatorias celulares. Además, la activación de la vía alternativa, pero no de la canónica, regula la expresión transgénica mediada por el AAV en estas células.
Este ejemplo define un papel para NF-KB en la transferencia génica mediada por el AAV dirigido al hígado en ratones.
In vivo, La transferencia génica mediada por AAV da como resultado la activación consecutiva de las vías de NF-KB canónicas y alternativas. Se cree que estas vías conducen principalmente a respuestas de inflamación (canónicas) o adaptativas (vía alternativa). Los vectores AAV2 con las cápside de tipo silvestre (TS) o de triple mutante (TM) para tirosina activaron la vía de NF-KB canónica en 2 horas, lo que da lugar a la expresión de citocinas y quimiocinas proinflamatorias (FIG. 14A). Este proceso transitorio depende del receptor de tipo Toll 9 (TLR9) y probablemente refleja la detección inicial del genoma del vector por parte de las células presentadoras de antígeno. Los análisis de transferencia de Western (FIG. 14B) de los homogeneizados del hígado preparados 9 horas después del suministro del vector, mostraron la abundancia del componente de la proteína p52 nuclear de la vía de NF-KB alternativa, probablemente como resultado de la transferencia génica a los hepatocitos.
La administración del inhibidor de NF-KB Bayll antes de la transferencia génica bloqueó de manera eficaz la activación de ambas vías. Esto previno las respuestas inmunitarias innatas pro-inflamatorias y también amortiguó la formación de anticuerpos de la cápside anti-AAV (FIG. 14C). Notablemente, Bay11 no interfirió con la expresión transgénica a largo plazo mediada tanto por los vectores AAV2 de TS como TM (FIG. 14D). Estos resultados demostraron que la inmunosupresión transitoria con el inhibidor de NF-KB antes de la administración del vector eliminó la inflamación (causada por respuestas innatas), y también limitó las respuestas adaptativas.
EJEMPLO 10 - DESARROLLO DE VECTORES RAAV3 OPTIMIZADOS: MECANISMO DE TRANSDUCCIÓN CON ALTA EFICIENCIA DE LAS CÉLULAS CANCEROSAS DE HÍGADO HUMANO
De los 10 serotipos de AAV comúnmente usados, se ha notificado que el AAV3 transduce las células y los tejidos de forma deficiente. Sin embargo, los presentes inventores descubrieron que los vectores AAV3 transducen líneas celulares establecidas de hepatoblastoma humano (HB) y de carcinoma hepatocelular humano (HCC), así como hepatocitos humanos primarios de manera extremadamente eficaz. El AAV3 utiliza HGFR humano como un receptor/co-receptor celular para la entrada viral.
Este Ejemplo muestra que tanto los dominios de quinasa extracelulares como intracelulares del hHGFR están involucrados en la entrada del vector AAV3 y en la expresión transgénica mediada por AAV3. Los resultados muestran que (i) la transducción mediada por el vector AAV3 aumenta significativamente en las células T47D, una línea celular de cáncer de mama humano que expresa niveles indetectables del hHGFR endógeno, después de una transfección estable y una sobreexpresión de hHGFR (FIG. 15A); (ii) la actividad de la tirosina quinasa asociada con el hHGFR afecta negativamente a la eficiencia de transducción de los vectores AAV3 (FIG. 15B, FIG. 15C); (iii) el uso de inhibidores del proteasoma mejora significativamente la transducción mediada por el vector AAV3; (iv) la mutagénesis dirigida al sitio de residuos específicos de tirosina expuestos en la superficie en la cápside del AAV3 conduce a una mayor eficiencia de transducción; y (v) una combinación específica de dos mutaciones de tirosina mejora aún más el alcance de la expresión transgénica (FIG. 15D). Estos vectores AAV3 pueden ser útiles para la terapia genética del cáncer de hígado en humanos.
EJEMPLO 11 - LA MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO DE LOS RESIDUOS DE LISINA EXPUESTOS EN LA SUPERFICIE PROVOCA UNA MEJOR TRANSDUCCIÓN POR LOS VECTORES RAAV2 Y RAAV8 EN LOS HEPATOCITOS MURINOS IN VIVO
La vía de la ubiquitina-proteasoma desempeña un papel fundamental en el tráfico intracelular de vectores AAV2 recombinantes, que afecta negativamente a la eficiencia de transducción de estos vectores. La señal primaria para la ubiquitinación es la fosforilación de residuos específicos de tirosina (Y), serina (S) y treonina (T) expuestos en la superficie en las cápsides del AAV2; la eliminación de algunos de estos residuos aumenta significativamente la eficiencia de transducción de los vectores AAV2 de tipo silvestre (TS).
Este Ejemplo ilustra que la mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de lisina expuestos en la superficie impidió la ubiquitinación de las cápsides del AAV2, lo que a su vez, evitó la degradación del vector por la maquinaria proteasómica celular, produciendo de esta manera mejores vectores para suministrar polinucleótidos terapéuticos o de diagnóstico a las células de mamíferos seleccionados.
Se prepararon y analizaron vectores AAV2 con una sola mutación en los residuos de lisina (K) expuestos en la superficie (K258, K490, K527, K532, K544, 549 y K556) con ácido glutámico (E). La eficiencia de transducción de vectores scAAV2 K490E, K544E, K549E, y K556E que expresan el gen indicador EGFP aumentó tanto como 5 veces, cuando se compara con los correspondientes vectores AAV2 de TS sin modificar (véase la FIG. 16). De las construcciones a modo de ejemplo analizadas en este estudio, el mutante único K556E tenía la mayor eficiencia de transducción (con una tasa de transducción de 2000 vgs/célula in vitro en células Hela) entre los mutantes sustituidos con lisina. También se obtuvieron resultados similares cuando se administró por vía intravenosa 1 x 1010 vgs de cada vector a ratones C57BL/6 in vivo, y la expresión transgénica en hepatocitos se evaluó a las 2 semanas después de la inyección. La formación de imágenes por bioluminiscencia dos semanas después de la inyección tras la administración intravenosa de 1 x 1010 vgs/animal de vectores ssAAV2 de TS o con mutación de lisina que expresan el gen indicador de la luciferasa de la luciérnaga (Fluc) corroboró aún más estos resultados.
Notablemente, dos de las mutaciones únicas más eficaces de residuos de aminoácidos se combinaron para generar un doble mutante (K544E+K556E). La eficiencia de transducción de este vector ssAAV2-Fluc doble mutante en los hepatocitos murinos in vivo aumentó ~2 veces en comparación con cualquiera de los mutantes únicos, y ~10 veces en comparación con el vector de control ssAAV2 sin modificar de TS.
Se ha demostrado anteriormente que los vectores AAV8 transducen sumamente bien los hepatocitos murinos. Como algunos de los residuos de K expuestos en la superficie también se conservan en este serotipo, también se generaron vectores ssAAV8-Fluc con mutante K530E, K547E, o K569E. La eficiencia de transducción de los vectores ssAAV8-Fluc K547E y K569E en los hepatocitos murinos in vivo aumentó ~3 veces y ~2 veces, respectivamente, cuando se compara con los vectores ssAAV8 del TS (FIG. 17 y FIG. 18).
Los resultados (resumidos en el presente documento en las FIG. 19A, FIG. 19B, FIG. 20, FIG. 21, FIG. 22, FIG. 23, FIG. 24, y FIG. 25) demostraron que orientar selectivamente los residuos de lisina expuestos en la superficie también podría ser explotado para crear nuevos y mejores vectores virales basados en AAV para aumentar la transducción de las células humanas, y, notablemente, nuevos vectores de transferencia útiles en la terapia genética.
REFERENCIAS:
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Los términos "un" y "uno/una" y "el/la" y referentes similares que se usan en el contexto de la descripción de la divulgación deben interpretarse de modo que cubran tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente.
La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de AAV VP3 que comprende:
a) un ácido glutámico (E) sustituido en una posición que corresponde a uno o más de K490, K527, K549 o K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2; y/o,
(b) una arginina (R) sustituida en una posición que corresponde a K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del s Eq ID NO:2.
2. La proteína de AAV VP3 de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un residuo de aminoácido no serina sustituido en una posición que corresponde a uno o más de S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707 o S721 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2, en donde el residuo de aminoácido no serina se selecciona entre valina (V), ácido aspártico (D) o histidina (H).
3. La proteína de AAV VP3 de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además:
(d) un residuo de aminoácido no treonina sustituido en una posición que corresponde a uno o más de T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713 o T716 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2; y/o
(e) un residuo de aminoácido no tirosina sustituido en una posición que corresponde a uno o más de Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 o Y730 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
4. La proteína de AAV VP3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el ácido glutámico (E) sustituido en la posición que corresponde a uno o más de K490 o K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
5. La proteína de AAV VP3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ácido glutámico (E) sustituido en posiciones que corresponden a K556 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
6. La proteína de AAV VP3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un residuo de aminoácido no serina sustituido en una posición que corresponde a S662 de la proteína de la cápside de AAV2 de tipo silvestre del SEQ ID NO:2.
7. El AAV VP3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de AAV VP3 es de un serotipo de AAV seleccionado entre AAV2 o AAV8.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de AAV VP3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. Un virión de AAV que comprende la proteína de AAV VP3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, opcionalmente, en donde el virión comprende además un ácido nucleico que codifica uno o más productos terapéuticos.
10. Una composición que comprende (a) la proteína de AAV VP3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 8, o el virión de AAV de acuerdo con la reivindicación 9; y (b) un tampón, un diluyente o un vehículo farmacéuticamente aceptables.
11. Un kit para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, una lesión, un trastorno, un traumatismo o una disfunción en mamíferos, en donde el kit comprende la composición de la reivindicación 10.
12. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso en terapia, o para su uso en el tratamiento, la prevención, o la mejora de uno o más síntomas de cáncer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, nefropatía, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreática, enfermedad intestinal, hepatopatía, enfermedad neurológica, trastorno neuromuscular, déficit neuromotor, deterioro neuroesquelético, discapacidad neurológica, disfunción neurosensorial, ictus, isquemia, trastorno alimentario, deficiencia de arantitripsina (AAT), enfermedad de Batten, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esquelética, traumatismo, o enfermedad pulmonar en un mamífero.
13. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 12, en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, un trastorno, una disfunción, una lesión, una afección anormal, un defecto congénito o un traumatismo en un mamífero.
14. Un método in vitro de transducción de una población de células de mamífero, que comprende introducir en una o más células de la población, una composición que comprende una cantidad eficaz de un virión de AAV de la reivindicación 9, opcionalmente en donde la célula es una célula endotelial, epitelial, vascular, hepática, pulmonar, del corazón, pancreática, intestinal, renal, muscular, ósea, dendrítica, cardíaca, neuronal, sanguínea, cerebral, fibroblástica o cancerosa.
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