ES2874298T3 - Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos - Google Patents

Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un AAV recombinante que tiene una cápside de AAV, en donde la cápside comprende proteínas vp1 de AAV, proteínas vp2 de AAV, y proteínas vp3 de AAV, en donde dicha proteína vp1 de AAV tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, en donde la proteína vp2 de AAV tiene una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos nt 411 a 2211 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, en donde la proteína vp3 de AAV tiene una secuencia de nucleótidos codificada por los nucleótidos nt 609 a 2211 de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, y en donde dicho AAV recombinante comprende además, empaquetado dentro de dicha cápside, un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un transgén que codifica un producto de interés que es heterólogo con dicho AAV recombinante, en donde dicho transgén está operativamente unido a secuencias reguladoras con expresión directa del producto del transgén en una célula hospedadora.

Description

DESCRIPCIÓN
Ciados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos Antecedentes de la invención
El virus adenoasociado (AAV), un integrante de la familia parvovirus, es un virus icosaédrico, pequeño sin envoltura, con genomas de ADN lineal de cadena sencilla de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV está asignado al género, Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como un contaminante en reservorios de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas del AAV, después de la infección, se integran específicamente en el sitio de cromosomas del hospedador y en fase infecciosa en la que, después de la infección por virus del herpes simplex o adenovirus, los genomas integrados se rescatan posteriormente, se replican, y se reempaquetan en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplio rango de infectividad del hospedador, que incluyen células indivisibles y posible integración cromosómica específica del sitio hace al AAV una herramienta atractiva para la transferencia génica.
Estudios recientes sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido para la administración génica. Hasta la fecha, se han caracterizado bien diferentes AAV aislados de primates humanos o no humanos (NHP, por sus siglas en inglés).
Se ha descubierto que los AAV de diferentes serotipos presentan diferentes eficacias de transfección y también presentan tropismo por diferentes células o tejidos. Sin embargo, la relación entre estos diferentes serotipos no se ha explorado anteriormente.
Lo que es deseable son construcciones basadas en AAV para la administración de moléculas heterólogas.
Sumario de la invención
La presente divulgación implica “superfamilias” o “clados” de AAV de secuencias relacionadas filogenéticamente. Estos clados de AAV proporcionan una fuente de secuencias de AAV útiles para dirigir y/o administrar moléculas a células o tejidos diana deseados.
La invención proporciona, en un aspecto, un AAV recombinante que tiene una cápside de AAV, en donde la cápside comprende proteínas vp1 de AAV, proteínas vp2 de AAV y proteínas vp3 AAV, en donde dicha proteína vp1 de AAV tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica con la misma, en donde la proteína vp2 del AAV tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 411 a 2211 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, en donde la proteína vp3 de AAV tiene una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos nt 609 a 2211 de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma y en donde dicho AAV recombinante comprende además, empaquetado dentro de dicha cápside, un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un transgén que codifica un producto de interés que es heterólogo con dicho AAV recombinante, en donde dicho transgén está operativamente unido a secuencias reguladoras que dirigen la expresión del producto del transgén en una célula hospedadora.
La presente invención también proporciona composiciones que contienen estos AAV recombinantes. Ventajosamente, estas composiciones son particularmente bien adecuadas para su uso en composiciones que requieran readministración de vectores de AAV para fines profilácticos o terapéuticos.
Estos y otros aspectos de la divulgación serán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un árbol que muestra la relación filogenética construida utilizando heurística de unión de vecinos con medición de distancia de corrección de Poisson. La relación se determina basándose en la proteína de cápside vp1 de AAV aislada, con el AAV aislado agrupado en clados. Los grupos de clones de la cápside individuales se clasifican en clados basándose en su ancestro común. La nomenclatura de clado va de la A a la F; los subtipos se representan por la letra de clado seguida por un número.
Las figuras 2A-2AE son una alineación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside vp1 de AAV, con la numeración de las secuencias individuales documentadas, y previamente publicadas AAV1 [SEQ ID NO: 219]; AAV2 [SEQ ID NO: 221]; AAV3-3 [SEQ ID NO: 217]; AAV4-4 [SEQ ID NO: 218]; AAV5 [SEQ ID NO: 216]; AAV6 [SEQ ID NO: 220]; AAV7 [SEQ ID NO: 222]; AAV8 [SEQ ID NO: 223], y; rh. 25/42-15; 29.3/bb.1; cy.2; 29.5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24; rh14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (denominada anteriormente 41.10); RH.25 (denominada anteriormente 41.15); rh2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8; y ch.5 [Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada N.° 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)]. Las secuencias incluyen hu.14/AAV9 [SEQ ID NO:123]; hu.17 [SEQ ID NO: 83], hu. 6 [SEQ ID NO: 84], hu.42 [SEQ ID NO: 85], rh.38 [SEQ ID NO: 86], hu.40 [SEQ ID NO: 87], hu.37 [SEQ ID NO: 88], rh.40 [SEQ ID NO: 92], rh.52 [SEQ ID NO: 96]; rh.53 [SEQ ID NO: 97]; rh.49 [SEQ ID NO: 103]; rh.51 [SEQ ID NO: 104]; rh.57 [SEQ ID NO: 105]; rh.58 [SEQ ID NO: 106], rh.61 [SEQ ID NO: 107]; rh.50 [SEQ ID NO: 108]; rh.43 [SEQ ID NO: 163]; rh.62 [SEQ ID NO: 114]; rh.48 [SEQ ID NO: 115]; 4-9/rh.54 (SEQ ID NO: 116); y 4-19/rh.55 (SEQ ID Nos: 117); hu.31 [SEQ ID NO:121]; hu.32 [SEQ ID NO: 122]; hu.34 [SEQ ID NO: 125]; hu.45 [SEQ ID NO: 127]; hu.47 [SEQ ID NO: 128]; hu.13 [SEQ ID NO: 129]; hu.28 [SEQ ID NO: 130]; hu.29 [SEQ ID NO: 132]; hu.19 [SEQ ID NO: 133]; hu.20 [SEQ ID NO: 134]; hu.21 [SEQ ID NO: 135]; hu.23.2 [SEQ ID NO: 137]; hu.22 [SEQ ID NO: 138]; hu.27 [SEQ ID NO: 140]; hu.4 [SEQ ID NO: 141]; hu.2 [SEQ ID NO: 143]; hu.1 [SEQ ID NO: 144]; hu.3 [SEQ ID NO: 145]; hu.25 [SEQ ID NO: 146]; hu.15 [SEQ ID NO: 147]; hu.16 [SEQ ID NO: 148]; hu.18 [SEQ ID NO: 149]; hu.7 [SEQ ID NO: 150]; hu.11 [SEQ ID NO: 153]; hu.9 [SEQ ID NO: 155]; hu.10 [SEQ ID NO: 156]; hu.48 [SEQ ID NO: 157]; hu.44 [SEQ ID NO: 158]; hu.46 [SEQ ID NO: 159]; hu.43 [SEQ ID NO: 160]; hu.35 [SEQ ID NO: 164]; hu.24 [SEQ ID NO: 136]; rh.64 [SEQ ID NO: 99]; hu.41 [SEQ ID NO: 91]; hu.39 [SEQ ID NO: 102]; hu.67 [SEQ ID NO: 198]; hu.66 [SEQ ID NO: 197]; hu.51 [SEQ ID NO: 190]; hu.52 [SEQ ID NO: 191]; hu.49 [SEQ ID NO: 189]; hu.56 [SEQ ID NO: 192]; hu.57 [SEQ ID NO: 193]; hu.58 [SEQ ID NO: 194]; hu.63 [SEQ ID NO: 195]; hu.64 [SEQ ID NO: 196]; hu.60 [SEQ ID NO: 184]; hu.61 [SEQ ID NO: 185]; hu.53 [SEQ ID NO: 186]; hu.55 [SEQ ID NO: 187]; hu.54 [SEQ ID NO: 188]; hu.6 [SEQ ID NO: 84]; y rh.56 [SEQ ID NO: 152]. Estas secuencias de la cápside también se reproducen en el listado de secuencias.
Las figuras 3A-3CN son una alineación de las secuencias de ácido nucleico de las proteínas de la cápside vp1 de AAV, con la numeración de las secuencias individuales documentadas y previamente publicadas AAV5 (SEQ ID NO: 199); AAV3-3 (SEQ ID NO: 200); AAV4-4 (SEQ ID NO: 201); AAV1 (SEQ ID NO: 202); AAV6 (SEQ ID NO: 203); AAV2(SEQ ID NO: 211); AAV7 (SEQ ID NO: 213) y AAV8 (SEQ ID NO: 214); rh. 25/42-15; 29.3/bb.1; cy.2; 29.5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24; rh14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (denominada anteriormente 41.10); rh.25 (denominada anteriormente 41.15; registro de GenBank AY530557); rh2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8; y ch.5 [Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada N.° 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)]. Las secuencias de ácido nucleico incluyen, hu.14/AAV9 (SEQ ID NO: 3); LG-4/rh.38 (SEQ ID NO: 7); LG-10/rh.40 (SEQ ID NO: 14); N721-8/rh.43 (SEQ ID NO: 43); 1-8/rh.49 (SEQ ID NO: 25); 2-4/rh.50 (SEQ ID NO: 23); 2-5/rh.51 (SEQ ID NO: 22); 3-9/rh.52 (SEQ ID NO: 18); 3-11/rh.53 (SEQ ID NO: 17); 5-3/rh.57 (SEQ ID NO: 26); 5-22/rh.58 (SEQ ID NO: 27); 2-3/rh.61 (SEQ ID NO: 21); 4-8/rh.64 (SEQ ID NO: 15); 3.1/hu.6 (SEQ ID NO: 5); 33.12/hu.17 (SEQ ID NO:4); 106.1/hu.37 (SEQ ID NO: 10); LG-9/hu.39 (SEQ ID NO: 24); 114.3/hu.40 (SEQ ID NO: 11); 127.2/hu.41 (SEQ ID NO:6); 127.5/hu.42 (SEQ ID NO: 8); y hu.66 (SEQ ID NO: 173); 2-15/ rh.62 (SEQ ID NO: 33); 1-7/rh.48 (SEQ ID NO: 32); 4-9/rh.54 (SEQ ID NO: 40); 4-19/rh.55 (SEQ ID NO: 37); 52/hu.19 (SEQ ID NO: 62), 52.1/hu.20 (SEQ ID NO: 63), 54.5/hu.23 (SEQ ID NO: 60), 54.2/hu.22 (SEQ ID NO: 67), 54.7/hu.24 (SEQ ID NO: 66), 54.1/hu.21 (SEQ ID NO: 65), 54.4R/hu.27 (SEQ ID NO: 64); 46.2/hu.28 (SEQ ID NO: 68); 46.6/hu.29 (SEQ ID NO: 69); 128.1/hu.43 (SEQ ID NO: 80); 128.3/hu.44 (SEQ ID NO: 81) y 130.4/hu.48 (SEQ ID NO: 78); 3.1/hu.9 (SEQ ID NO: 58); 16.8/hu.10 (SEQ ID NO: 56); 16.12/hu.11 (SEQ ID NO: 57); 145.1/hu.53 (SEQ ID NO: 176); 145.6/hu.55 (SEQ ID NO: 178); 145.5/hu.54 (SEQ ID NO: 177); 7.3/hu.7 (SEQ ID NO: 55); 52/hu.19 (SEQ ID NO: 62); 33.4/hu.15 (SEQ ID NO: 50); 33.8/hu.16 (SEQ ID NO: 51); 58.2/hu.25 (SEQ ID NO: 49); 161.10/hu.60 (SEQ ID NO: 170); H-5/hu.3 (SEQ ID NO: 44); H-1/hu.1 (SEQ ID NO: 46); 161.6/hu.61 (SEQ ID NO: 174); hu.31 (SEQ ID NO: 1); hu.32 (SEQ ID NO: 2); hu.46 (SEQ ID NO: 82); hu.34 (SEQ ID NO: 72); hu.47 (SEQ ID NO: 77); hu.63 (SEQ ID NO: 204); hu.56 (SEQ ID NO: 205); hu.45 (SEQ ID NO: 76); hu.57 (SEQ ID NO: 206); hu.35 (SEQ ID NO: 73); hu.58 (SEQ ID NO: 207); hu.51(SEQ ID NO: 208); hu.49 (SEQ ID NO: 209); hu.52 (SEQ ID NO: 210); hu.13 (SEQ ID NO: 71); hu.64 (SEQ ID NO: 212); rh.56 (SEQ ID NO: 54); hu.2 (SEQ ID NO: 48); hu.18 (SEQ ID NO: 52); hu.4 (SEQ ID NO: 47); y hu.67 (SEQ ID NO: 215). Estas secuencias también se reproducen en la lista de secuencias acompañante.
Las figuras 4A-4D proporcionan una evaluación de la eficacia de transferencia génica in vitro e in vivo de vectores basados en AAV de primates. Los vectores de AAV fueron pseudotipados como se describe [Gao et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 99:11854-11859 (3 de septiembre de 2002)] con cápsides de AAV 1, 2, 5, 7, 8 y 6 y ch.5, rh.34, cy.5, rh.20, rh.8 y AAV9. Para el estudio in vitro, figura 4A, las células 84-32 (células 293 que expresan E4 de serotipos de adenovirus) se sembraron en una placa de 95 pocillos se infectaron con vectores de a Av CMVEGFP pseudotipados en una MDI de 1 x 104 GC por célula. Se estimó la eficacia de transducción de EGFP relativa como porcentaje de células verdes utilizando un microscopio UV en 48 horas después de la infección y se muestra en el eje Y. Para el estudio in vivo, los vectores que expresan el gen A1AT indicador secretado se administran al hígado (Figura 4B), pulmón (Figura 4C) y músculo (Figuro 4D) de ratones sin pelo NCR (de 4-6 semanas) en una dosis de 1 x 1011 Ge por animal mediante inyección intraportal (Figura 4B), intratraqueal (Figura 4C) e intramuscular (Figura 4D), respectivamente. Se compararon los niveles de suero A1AT (ng/ml) en el día 28 después de transferencia génica y se presenta en el eje Y. El eje X indica el AAV analizado y los clados a los que pertenecen.
Descripción detallada de la invención
En cualquier arsenal de vectores útiles en terapia o profilaxis, se desea una variedad de distintos vectores capaz de llevar una macromolécula a una célula diana, con el fin de permitir la selección de una fuente de vector para una aplicación deseada. Hasta la fecha, una de las preocupaciones con respecto al uso de AAV como vectores es la falta de una variedad de fuentes de virus diferentes. Los clados de AAV tratados en el presente documento son útiles para seleccionar AAV relacionados filogenéticamente, o si se desea para un régimen seleccionado, filogenéticamente distintos, y para función de predicción.
El término “% idéntico” en el contexto de secuencias de ácidos nucleicos se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para la máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, o la longitud completa de una secuencia codificante del gen.
Se realizan alineaciones utilizando cualquiera de una variedad de programas de alineación de múltiples secuencias disponibles comercialmente o públicamente. Ejemplos de dichos programas incluyen, “Clustal W”, “CAP Sequence Assembly”, “MAP”, y “MEME”, que son accesibles a través de servidores de red en la internet. Otras fuentes para dichos programas son conocidas para los expertos en la técnica. Como alternativa, también se utilizan utilidades del vector NTI. También existe una serie de algoritmos conocidos en la técnica que se pueden utilizar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos, que incluyen aquellos contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, se pueden comparar secuencias de polinucleótidos utilizando Fasta™, un programa en GCG versión 6.1. Fasta™ proporciona alineamientos y % de identidad de secuencia de las regiones de mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de ácidos nucleicos se puede determinar utilizando Fasta™ con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de calificación) como se proporciona en GCG versión 6.1. Los programas de alineación de secuencia múltiple también están disponibles para secuencias de aminoácidos, por ejemplo, los programas “Clustal X”, “MAP”, “PIMA”, “MSA”, “BLOCk Ma KER”, “MEME”, y “Match-Box”. En general, cualquiera de estos programas se utiliza en configuraciones predeterminadas, aunque el experto en la técnica puede alterar esta configuración según se necesite. Como alternativa, un experto en la técnica puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione al menos el nivel de identidad o alineación como aquel proporcionado por los algoritmos y programas referenciados. Véase, por ejemplo, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999).
El término “serotipo” es una distinción con respecto a un AAV que tiene una cápside que es serológicamente distinto de otros serotipos de AAV. Se determina la distintividad serológica basándose en la falta de reactividad cruzada entre anticuerpos del AAV según se compara con otros AAV.
La reactividad cruzada se mide normalmente en un ensayo de anticuerpos neutralizantes. Para este ensayo se genera suero policlonal contra un AAV específico en un conejo u otro modelo de animal adecuado utilizando los virus adenoasociados. En este ensayo, el suero generado contra un AAV específico se prueba luego en su capacidad de neutralizar la misma (homóloga) o un AAV heterólogo. La dilución que alcanza el 50 % de neutralización se considera el título de anticuerpo neutralizante. Si para dos AAV el cociente del título heterólogo dividido entre el título homólogo es menor de 16 en una forma recíproca, aquellos dos vectores se consideran como el mismo serotipo. Por el contrario, si la relación del título heterólogo sobre el título homólogo es 16 o más en una forma recíproca los dos AAV se consideran serotipos distintos.
Según se define en el presente documento, para formar el serotipo 9, los anticuerpos generados para una cápside de AAV seleccionada deben no tener reactividad cruzada con cualquiera de AAV 1, AAV2, AAV3, AAV4, AAv 5, AAV6, AAV7 o AAV8.
Como se utiliza a lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las expresiones “que comprenden” y “que incluyen” son incluyentes de otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares. Por el contrario, la expresión “que consiste” y sus variantes son excluyentes de otros componentes, elementos, enteros, etapas y similares.
I. Clados
Un clado es un grupo de AAV que se relaciona filogenéticamente con otro determinado según se determina utilizando el algoritmo de unión de vecino mediante un valor de remuestreo de al menos 75% (de al menos 1000 réplicas) y una medición de distancia de corrección de Poisson de uno o más de 0,05, basándose en la alineación de la secuencia de aminoácidos de vp1 de AAV.
El algoritmo de unión de vecino se ha descrito extensamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, M. Nei y S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nueva York (2000). Están disponibles programas informáticos que se pueden utilizar para implementar este algoritmo. Por ejemplo, el programa MEGA v2.1 implementa el método Nei-Gojobori modificado. Utilizando estas técnicas y programas informáticos y la secuencia de una proteína de la cápside vp1 de AAV, un experto en la técnica puede determinar fácilmente si un AAV seleccionado está contenido en uno de los clados identificados en el presente documento, en otro clado, o está en el exterior de estos clados.
Aunque los clados definidos en el presente documento se basan principalmente en vp1 de la cápside de AAV que se presentan en forma natural, los clados no se limitan a los AAV que se presentan de forma natural. Los clados pueden abarcar AAV que se presentan de forma no natural, que incluyen, sin limitación, AAV recombinante, modificado o alterado, quimérico, híbrido, sintético, artificial, etcétera que se relacionan filogenéticamente según se determina utilizando un algoritmo de unión de vecino en al menos el 75 % (de al menos 1000 réplicas) y una medición de distancia de corrección de Poisson de no más de 0,05, basándose en la alineación de la secuencia de aminoácidos de vp1 de AAV.
Los ciados descritos en el presente documento Ciado A (representado por AAV1 y AAV6), Ciado B (representado por AAV2) y Clado C (representado por el híbrido AAV2-AAV3), el Clado D (representado por AAV7), Clado E (representado por AAV8), y Clado F (representado por AAV9 humano). Estos clados se representan por un miembro del clado que es un serotipo de AAV descrito anteriormente. Los AAV1 y AAV6 descritos anteriormente son integrantes de un único clado (clado A) en el que 4 aislados se recuperan de 3 humanos. Los serotipos AAV3 y AAV5 descritos anteriormente son claramente distintos uno del otro, pero no se detectan en una clasificación descrita en el presente documento y no se han descrito en ninguno de estos clados.
El clado B (AAV2) y el clado C (el híbrido AAV2-AAV3) son los más abundantes de aquellos encontrados en humanos (22 aislados de 12 individuos para AAV2) y 17 aislados de 8 individuos para el clado C.
Existe un gran número de secuencias agrupadas en el clado D (AAV7) o clado E (AAV8). De manera interesante, ambos clados son prevalentes en diferentes especies. El clado D es único para macacos rhesus y cynomologus con 15 elementos que se aíslan de 10 animales diferentes. El clado E es interesante porque se encuentra tanto en humanos como en primates no humanos: se recuperan 9 aislados de 7 humanos y se obtienen 21 aislados en 9 primates no humanos diferentes que incluyen macacos rhesus, un babuino y un mono coleta.
En otros dos animales se prueba la naturaleza híbrida de determinadas secuencias, aunque todas las secuencias en este caso parecen haberse originado a través de diferentes recombinaciones y recombinaciones individuales de dos virus de coinfección (en ambos animales como un Clado D con un virus de Clado E). Ninguno de estos recombinantes se identificó en otros animales o sujetos.
Dado que el clado C (el híbrido AAV2-AAV3) se identificó en 6 humanos diferentes, el evento de recombinación da como resultado una progenie alta. En el caso de híbridos AAV7-AAV8 de otra parte, sólo se pueden extraer pocas conclusiones en cuanto a la implicación de la recombinación en la evolución del AAV. Estos eventos de recombinación muestran que el AAV es capaz de recombinación, creando por lo tanto genes en marco y en algunos casos estructuras de la cápside infecciosas y/o que se puede empaquetar. El clado C (el clado híbrido AAV2-AAV3) de otra parte es un grupo de virus que ha adquirido una ventaja selectiva a través de la recombinación que los ha hecho sostener determinadas presiones ambientales.
A. Clado A (representado por AAV1 y AAV6):
El Clado A se caracteriza por que contiene el AAV1 y AAV6 publicado anteriormente. Véase, por ejemplo, la publicación internacional N.° WO 00/28061, 18 de mayo de 2000; Rutledge et al, J Virol, 72(1):309-319 (enero de 1998). Adicionalmente, este clado contiene AAV que incluye, sin limitación, 128.1/hu. 43 [sEQ ID NO: 80 y 160]; 128,3/hu. 44 [SEQ ID NO: 81 y 158]; 130.4/Hu.48 [SEQ ID NO: 78 y 157]; y hu.46 [SEQ ID NO: 82 y 159]; cápside hu.
43 modificado [SEQ ID NO: 236] y cápside hu. 46 modificado [SEQ ID NO: 224].
Uno o más de los elementos de este clado tienen una cápside con una identidad de aminoácidos de al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o al menos 97% de identidad sobre la longitud completa del vp1, el vp2, o el vp3 de la cápside de AAV1 y/o AAV6.
El Clado A también contiene AAV que no comprende una cápside de cualquiera de AAV1 o AAV6. Estos AAV pueden incluir, sin limitación, un AAV que tiene una cápside que proviene de uno o más de 128.1/hu. 43 [SEQ ID NO: 80 y 160]; hu.43 modificado [SEQ ID NO: 236] 128.3/hu. 44 [SEQ ID NO: 81 y 158]; Hu.46 [SEQ ID NO: 82 y 159]; hu. 46 modificado [SEQ ID NO: 224]; y 130.4/hu.48 [SEQ ID NO: 78 y 157].
B. Clado B (Clado AAV2):
El Clado B se caracteriza por que contiene, en un mínimo, el AAV2 y AAV descritos anteriormente que incluyen, 52/hu.19 [SEQ ID NO: 62 y 133], 52.1/hu.20 [SEQ ID NO: 63 y 134], 54.5/hu.23 [SEQ ID NO: 60 y 137], 54.2/hu.22 [SEQ ID no. : 67 y 138], 54.7/hu.24 [SEQ ID NO: 66 y 136], 54.1/hu.21 [SEQ ID NO: 65 y 135], 54.4R/hu.27 [SEQ ID NO: 64 y 140]; 46.2/hu.28 [SEQ ID NO: 68 y 130]; 46.6/hu.29 [SEQ ID NO: 69 y 132]; hu. 29 modificado [SEQ ID NO: 225]; 172.1/Hu.63 [SEQ ID NO: 171 y 195; número de registro de GenBank AY530624]; 172.2/hu. 64 [SEQ ID NO: 172 y 196; número de registro de GenBank AY530625]; 24.5/hu.13 [SEQ ID NO: 71 y 129; número de registro de GenBank AY530578]; 145.6/hu.56 [SEQ ID NO: 168 y 192]; hu.57 [SEQ ID NO: 169 y 193]; 136.1/hu.49 [SEQ ID NO: 165 y 189]; 156.1/Hu.58 [SEQ ID NO: 179 y 194]; 72.2/hu.34 [SEQ ID NO: 72 y 125; número de registro de GenBank AY530598]; 72.3/hu.35 [SEQ ID NO: 73 y 164; número de registro de GenBank AY530599]; 130.1/hu.47 [SEQ ID NO: 77 y 128]; 129.1/hu.45 (SEQ ID NO: 76 y 127; número de registro de GenBank AY530608); 140.1/hu.51 [SEQ ID NO: 161 y 190; número de registro de GenBank AY530613]; y 140.2/hu.52 [SEQ ID NO: 167 y 191; número de registro de GenBank AY530614].
Uno o más de los elementos de este clado tiene una cápside con una identidad de aminoácidos de al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o al menos 97% de identidad sobre la longitud completa del vp1, el vp2, o el vp3 dla cápside de AAV2.
El Ciado B también contiene AAV que no tiene una cápside de AAV2. Estos AAV pueden incluir, sin limitación, un AAV que tiene una cápside que proviene de uno o más de los siguientes: 52/hu.19 [SEQ ID NO: 62 y 133], 52.1/hu.20 [SEQ ID NO: 63 y 134], 54.5/hu.23 [SEQ ID NO: 60 y 137], 54.2/hu.22 [SEQ ID no. : 67 y 138], 54.7/hu.24 [SEQ ID NO: 66 y 136], 54.1/hu.21 [SEQ ID NO: 65 y 135], 54.4R/hu.27 [SEQ ID NO: 64 y 140]; 46.2/hu.28 [SEQ ID NO: 68 y 130]; 46.6/hu.29 [SEQ ID NO: 69 y 132]; hu. 29 modificado [SEQ ID NO: 225]; 172.1/hu.63 [SEQ ID NO: 171 y 195]; 172.2/hu.
64 [SEQ ID NO: 172 y 196]; 24.5/hu.13 [SEQ ID NO: 71 y 129]; 145.6/hu.56 [SEQ ID NO: 168 y 192; número de registro de GenBank AY530618]; hu.57 [SEQ ID NO: 169 y 193; número de registro de GenBank AY530619]; 136.1/hu.49 [SEQ ID NO: 165 y 189; número de registro de GenBank AY530612]; 156.1/hu.58 [SEQ ID NO: 179 y 194; número de registro de GenBank AY530620]; 72.2/hu.34 [SEQ ID NO: 72 y 125]; 72.3/hu.35 [SEQ ID NO: 73 y 164]; 129.1/hu.45 [SEQ ID NO: 76 y 127]; 130.1/hu.47 [SEQ ID NO: 77 y 128; número de registro de GenBank AY530610]; 140.1/hu.51 [SEQ ID NO: 161 y 190; número de registro de GenBank AY530613]; y 140.2/hu.52 [SEQ ID NO: 167 y 191; número de registro de GenBank AY530614].
C. Clado C (Clado híbrido AAV2-AAV3)
El Clado C se caracteriza por que contiene AAV que son híbridos de los AAV2 y AAV3 publicados anteriormente tal como H-6/hu.4; H-2/hu.2 [solicitud de patente de Ee .UU. 2003/0138772 (24 de junio de 2003). Adicionalmente, este clado contiene AAV que incluye, sin limitación, 3.1/hu.9 [SEQ ID NO: 58 y 155]; 16.8/hu.10 [SeQ ID NO: 56 y 156]; 16.12/hu.11 [SEQ ID NO: 57 y 153]; 145.1/hu.53 [SEQ ID NO: 176 y 186]; 145.6/hu.55 [SEQ ID NO: 178 y 187]; 145.5/hu.54 [SEQ ID NO: 177 y 188]; 7.3/hu.7 [SeQ ID NO: 55 y 150; depositado ahora como número de registro de GenBank AY530628]; hu. 7 modificado [SEQ ID NO: 226]; 33.4/Hu.15 [SEQ ID NO: 50 y 147]; 33.8/hu.16 [SEQ ID NO: 51 y 148]; hu.18 [SEQ ID NO: 52 y 149]; 58.2/hu.25 [SEQ ID NO: 49 y 146]; 161.10/hu.60 [SEQ ID NO: 170 y 184]; H-5/hu.3 [SEQ ID NO: 44 y 145]; H-1/hu.1 [SEQ ID NO: 46 y 144]; y 161.6/hu.61 [SEQ ID NO: 174 y 185].
Uno o más de los integrantes de este clado tiene una cápside con una identidad de aminoácidos de al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o al menos 97% de identidad sobre la longitud completa del vp1, el vp2. o el vp3 dla cápside hu.4 o hu.2.
Clado C (el clado híbrido AAV2-AAV3 también contiene AAV que no comprende una cápside de hu.2 o hu.4. Estos AAV puede incluir, sin limitación, un AAV que tiene una cápside que proviene de uno o más de 3.1/hu.9 [SEQ ID NO: 58 y 155]; 16.8/Hu.10 [SEQ ID NO: 56 y 156]; 16.12/Hu.11 [SEQ ID NO: 57 y 153]; 145.1/hu.53 [SEQ ID NO: 176 y 186]; 145.6/Hu.55 [SEQ ID NO: 178 y 187]; 145.5/hu.54 [SEQ ID NO: 177 y 188]; 7.3/hu.7 [SEQ ID NO: 55 y 150]; hu.7 modificado [SEQ ID NO: 226]; 33.4/hu.15 [SEQ ID NO: 50 y 147]; 33.8/hu.16 [SEQ ID NO: 51 y 148]; 58.2/hu.25 [SEQ ID NO: 49 y 146]; 161.10/hu.60 [SEQ ID NO: 170 y 184]; H-5/hu.3 [SEQ ID NO: 44 y 145]; H-1/hu.1 [SEQ ID NO: 46 y 144]; y 161.6/hu.61 [SEQ ID NO: 174 y 185].
D. Clado D (Clado AAV7)
El Clado D se caracteriza por que contiene el AAV7 descrito anteriormente AAV7 [G. Gao et al, Proc. Natl Acad. Sci EE.UU., 99:11854-9 (3 de septiembre de 2002). Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la cápside de AAV7 se reproducen en la SEQ ID NO: 184; las secuencias de aminoácidos de la cápside de AAV7 se reproducen en la SEQ ID NO: 185. Adicionalmente, el clado contiene un número de secuencias de AAV descritas anteriormente, que incluyen: cy.2; cy.3; cy.4; cy.5; cy.6; rh.13; rh.37; rh. 36; y rh.35 [Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada N.° 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)]. Adicionalmente, el clado AAV7 contiene secuencias de AAV, que incluyen, sin limitación, 2-15 / rh.62 [SEQ ID NO: 33 y 114]; 1-7/rh.48 [SEQ ID NO: 32 y 115]; 4-9/rh.54 [SEQ ID NO: 40 y 116]; y 4-19/rh.55 [SEQ ID NO: 37 y 117]. La divulgación incluye adicionalmente cy. 5 modificado [SeQ ID NO: 227]; rh.13 modificado [SEQ ID NO: 228]; y rh. 37 modificado [SEQ ID NO: 229].
Uno o más de los elementos de este clado tiene una cápside con una identidad de aminoácidos de al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o al menos 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2, o la vp3 de la cápside de AAV7, SEQ ID NO: 184 y 185.
El clado D también contiene AAV que no comprende una cápside de cualquiera de cy.2; cy.3; cy.4; cy.5; cy.6; rh.13; rh.37; rh. 36; y rh.35. Estos AAV pueden incluir, sin limitación, un AAV que tiene una cápside que proviene de uno o más de los siguientes 2-15/rh.62 [SEQ ID NO: 33 y 114]; 1-7/rh.48 [SEQ ID NO: 32 y 115]; 4-9/rh.54 [SEQ ID NO: 40 y 116]; y 4-19/rh.55 [SEQ ID NO: 37 y 117].
E. Clado E (Clado AAV8)
El Clado E se caracteriza por que contiene el AAV8 descrito anteriormente [G. Gao et al, Proc. Natl Acad. Sci EE.UU., 99:11854-9 (3 de septiembre de 2002)], 43.1/rh.2; 44.2/rh.10; rh. 25; 29.3/bb.1; y 29.5/bb.2 [Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada N.° 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)].
Este clado comprende las secuencias de AAV, que incluyen, sin limitación, por ejemplo, 30.10/pi.1 [SEQ ID NO: 28 y 93], 30.12/pi.2 [SEQ ID NO: 30 y 95, 30.19/pi.3 [SEQ ID NO: 29 y 94], LG-4/rh.38 [SEQ ID NO: 7 y 86]; LG-10/rh.40 [SEQ ID NO: 14 y 92]; N721-8/rh.43 [SEQ ID NO: 43 y 163]; 1-8/rh.49 [SEQ ID NO: 25 y 103]; 2-4/rh.50 [SEQ ID NO: 23 y 108]; 2-5/rh.51 [SEQ ID NO: 22 y 104]; 3-9/rh.52 [SEQ ID NO: 18 y 96]; 3-11/rh.53 [SEQ ID NO: 17 y 97]; 5-3/rh.57 [SEQ ID NO: 26 y 105]; 5-22/rh.58 [SEQ ID NO: 27 y 58]; 2-3/rh.61 [SEQ ID NO: 21 y 107]; 4-8/rh.64 [SEQ ID NO: 15 y 99]; 3.1/hu.6 [SEQ ID NO: 5 y 84]; 33.12/Hu.17 [SEQ ID NO: 4 y 83;] 106.1/Hu.37 [SEQ ID NO: 10 y 88]; LG-9/hu.39 [SEQ ID NO: 24 y 102]; 114.3/hu. 40 [SEQ ID NO: 11 y 87]; 127.2/Hu.41 [SEQ ID NO: 6 y 91;] 127.5/Hu.42 [SEQ ID NO: 8 y 85]; hu. 66 [SEQ ID NO: 173 y 197]; y hu.67 [SEQ ID NO: 174 y 198]. Este clado incluye adicionalmente rh. 2 modificado [SEQ ID NO: 231]; rh. 58 modificado [SEQ ID NO: 232]; rh. 64 modificado [SEQ ID NO: 233].
Uno o más de los elementos de este clado tiene una cápside con una identidad de aminoácidos de al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o al menos 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2, o la vp3 de la cápside de AAV8. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la cápside de AAV8 se reproducen en la SEQ ID NO: 186 y las secuencias de aminoácidos de la cápside se reproducen en la SEQ ID NO: 187.
El Clado E también contiene AAV que no comprenden una cápside de cualquiera de AAV8, rh.8; 44.2/rh.10; rh. 25; 29.3/bb.1; y 29.5/bb.2 [Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada N.° 2003/0138772 A1 (24 de julio de 2003)]. Estos AAV pueden incluir, sin limitación, un AAV que tiene una cápside que proviene de uno o más de los siguientes: 30.10/pi.1 [SEQ ID NO: 28 y 93], 30.12/pi.2 [SEQ ID NO: 30 y 95, 30.19/pi.3 [SEQ ID NO: 29 y 94], LG-4/rh.38 [SEQ ID NO: 7 y 86]; LG-10/rh.40 [SEQ ID NO: 14 y 92]; N721-8/rh.43 [SEQ ID NO: 43 y 163]; 1-8/rh.49 [SEQ ID NO: 25 y 103]; 2-4/rh.50 [SEQ ID NO: 23 y 108]; 2-5/rh.51 [SEQ ID NO: 22 y 104]; 3-9/rh.52 [SEQ ID NO: 18 y 96]; 3-11/rh.53 [SEQ ID NO: 17 y 97]; 5-3/rh.57 [SEQ ID NO: 26 y 105]; 5-22/rh.58 [SEQ ID NO: 27 y 58]; rh. 58 modificado [SEQ ID NO: 232]; 2-3/rh.61 [SEQ ID NO: 21 y 107]; 4-8/rh.64 [SEQ ID NO: 15 y 99]; rh. 64 modificado [SEQ ID NO: 233]; 3.1/hu.6 [SEQ ID NO: 5 y 84]; 33.12/hu.17 [SEQ ID NO: 4 y 83;] 106.1/hu.37 [SEQ ID NO: 10 y 88]; LG-9/hu.39 [SEQ ID NO: 24 y 102]; 114.3/hu. 40 [SEQ ID NO: 11 y 87]; 127.2/hu.41 [SEQ ID NO: 6 y 91;] 127.5/hu.42 [SEQ ID NO: 8 y 85]; hu. 66 [SEQ ID NO: 173 y 197]; y hu.67 [SEQ ID NO: 174 y 198].
F. Clado F (Clado AAV 9)
Este clado se identifica por el número de un serotipo AAV identificado en el presente documento como hu.14/AAV9 [SEQ ID NO: 3 y 123]. Adicionalmente, este clado contiene otras secuencias que incluyen, hu.31 [SEQ ID NO: 1 y 121]; y hu.32 [SEQ ID NO: 2 y 122].
Uno o más elementos de este clado tienen una cápside con una identidad de aminoácidos de al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o al menos 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2, o la vp3 de la cápside de AAV9, SEQ ID NO: 3 y 123.
El Clado F incluye, sin limitación, un AAV que tiene una cápside que proviene de uno o más de hu.14/AAV9 [SEQ ID NO: 3 y 123], hu.31 [SEQ ID NO: 1 y 121] y hu.32 [SEQ ID NO: 1 y 122].
Los clados de AAV son útiles para una variedad de propósitos, que incluyen proporcionar colecciones listas de AAV relacionadas para generar vectores víricos, y para la generación moléculas diana. Estos clados también pueden ser utilizados como herramientas para una variedad de propósitos que serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica.
II. Secuencias de AAV
La invención proporciona los AAV recombinantes y composiciones, como se define en las reivindicaciones. Las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos de una serie de AAV también son de interés. Muchas de estas secuencias incluyen aquellas descritas anteriormente como elementos de un clado, como se resume a continuación.
128.1/hu. 43 [SEQ ID NO: 80 y 160 número de registro de GenBank AY530606]; hu. 43 modificado [SEQ ID NO: 236]; 128.3/hu. 44 [SEQ ID NO: 81 y 158; número de registro de GenBank AY530607] y 130.4/hu.48 [SEQ ID NO: 78 y 157; número de registro de GenBank AY530611]; del Clado A;
52/hu.19 [SEQ ID NO: 62 y 133; número de registro de GenBank AY530584], 52.1/hu.20 [SEQ ID NO: 63 y 134; número de registro de GenBank AY530586], 54.5/hu.23 [SEQ ID NO: 60 y 137; número de registro de GenBank AY530589], 54.2/hu.22 [SEQ ID NO: 67 y 138; número de registro de GenBank AY530588], 54.7/hu.24 [SEQ ID NO: 66 y 136; número de registro de GenBank AY530590], 54.1/hu.21 [SEQ ID NO: 65 y 135; número de registro de GenBank AY530587], 54.4R/hu.27 [SEQ ID NO: 64 y 140; número de registro de GenBank AY530592]; 46.2/hu.28 [SEQ ID NO: 68 y 130; número de registro de GenBank AY530593]; 46.6/hu.29 [SEQ ID NO: 69 y 132; número de registro de GenBank AY530594]; hu. 29 modificado [SEQ ID NO: 225]; 172.1/hu.63 [SEQ ID NO: 171 y 195]; y 140.2/hu.52 (SEQ ID NO: 167 y 191; del Clado B;
3.1/hu.9 [SEQ ID NO: 58 y 155; número de registro de GenBank AY530626]; 16.8/hu.10 [SEQ ID NO: 56 y 156; número de registro de GenBank AY530576]; 16.12/hu.11 [SEQ ID NO: 57 y 153; número de registro de GenBank AY530577]; 145.1/hu.53 [SEQ ID NO: 176 y 186; número de registro de GenBank AY530615]; 145.6/hu.55 [SEQ ID NO: 178 y 187; número de registro de GenBank AY530617]; 145.5/hu.54 [SEQ ID NO: 177 y 188; número de registro de GenBank AY530616]; 7.3/hu.7 [SEQ ID NO: 55 y 150; número de registro de GenBank AY530628]; modificado hu. 7 [SEQ ID NO: 226]; hu.18 [SEQ ID NO: 52 y 149; número de registro de GenBank AY530583]; 33.4/hu.15 [SEQ ID NO: 50 y 147; número de registro de GenBank AY530580]; 33.8/hu.16 [SEQ ID NO: 51 y 148; número de registro de GenBank AY530581]; 58.2/hu.25 [SEQ ID NO: 49 y 146; número de registro de GenBank AY530591]; 161.10/hu.60 [SEQ ID NO: 170 y 184; número de registro de GenBank AY530622]; H-5/hu.3 [SEQ ID NO: 44 y 145; número de registro de GenBank AY530595]; H-1/hu.1 [SEQ ID NO: 46 y 144; número de registro de GenBank AY530575]; y 161.6/hu.61 [SEQ ID NO: 174 y 185; número de registro de GenBank AY530623] del Clado C;
2-15 / rh.62 [SEQ ID NO: 33 y 114; número de registro de GenBank AY530573]; 1-7/rh.48 [SEQ ID NO: 32 y 115; número de registro de GenBank AY530561]; 4-9/rh.54 [SEQ ID NO: 40 y 116; número de registro de GenBank AY530567]; y 4-19/rh.55 [SEQ ID NO: 37 y 117; número de registro de GenBank AY530568]; cy. 5 modificado [SEQ ID NO: 227]; rh.13 modificado [SEQ ID NO: 228]; y rh. 37 modificado [SEQ ID NO: 229] del Clado D;
30.10/pi.1 [SEQ ID NO: 28 y 93; número de registro de GenBank AY53055], 30.12/pi.2 [SEQ ID NO: 30 y 95; número de registro de GenBank AY 530554], 30.19/pi.3 [SEQ ID NO: 29 y 94; número de registro de GenBank AY530555], LG-4/rh.38 [SEQ ID NO: 7 y 86; número de registro de GenBank AY 530558]; LG-10/rh.40 [SEQ ID NO: 14 y 92; número de registro de GenBank AY530559]; N721-8/rh.43 [SEQ ID NO: 43 y 163; número de registro de GenBank AY530560]; 1-8/rh.49 [SEQ ID NO: 25 y 103; número de registro de GenBank AY530561]; 2-4/rh.50 [SEQ ID NO: 23 y 108; número de registro de GenBank AY530563]; 2-5/rh.51 [SEQ ID NO: 22 y 104; número de registro de GenBank 530564]; 3-9/rh.52 [SEQ ID NO: 18 y 96; número de registro de GenBank AY530565]; 3-11/rh.53 [SEQ ID NO: 17 y 97; número de registro de GenBank AY530566]; 5-3/rh.57 [SEQ ID NO: 26 y 105; número de registro de GenBank AY530569]; 5-22/rh.58 [SEQ ID NO: 27 y 58; número de registro de GenBank 530570]; rh. 58 modificado [SEQ ID NO: 232]; 2-3/rh.61 [SEQ ID NO: 21 y 107; número de registro de GenBank AY530572]; 4-8/rh.64 [SEQ ID NO: 15 y 99; número de registro de GenBank AY530574]; rh. 64 modificado [SEQ ID NO: 233]; 3.1/hu.6 [SEQ ID NO: 5 y 84; número de registro de GenBank AY530621]; 33.12/hu.17 [SEQ ID NO: 4 y 83; número de registro de GenBank AY530582]; 106.1/hu.37 [SEQ ID NO: 10 y 88; número de registro de GenBank AY530600]; LG-9/hu.39 [SEQ ID NO: 24 y 102; número de registro de GenBank AY530601]; 114.3/hu.
40 [SEQ ID NO: 11 y 87; número de registro de GenBank AY530603]; 127.2/hu.41 [SEQ ID NO: 6 y 91; número de registro de GenBank AY530604]; 127.5/hu.42 [SEQ ID NO: 8 y 85; número de registro de GenBank AY530605]; y hu. 66 [SEQ ID NO: 173 y 197; número de registro de GenBank AY530626]; y hu.67 [SEQ ID NO: 174 y 198; número de registro de GenBank AY530627]; y rh.2 modificado [SEQ ID NO: 231]; del Clado E;
hu.14/AAV9 [SEQ ID NO: 3 y 123; número de registro de GenBank AY530579], hu.31 [SEQ ID NOs: 1 y 121; AY530596] y hu.32 [SEQ ID NO: 1 y 122; número de registro de GenBank AY530597] del Clado F.
Adicionalmente, las secuencias de AAV, que incluyen, rh.59 [SEQ ID NO: 49 y 110]; rh.60 [SEQ ID NO: 31 y 120; número de registro de GenBank AY530571], ch.5 modificado [Se Q ID NO: 234]; y rh. 8 modificado [SEQ ID NO: 235], están fuera de la definición de los clados descritos anteriormente.
También son de importancia los fragmentos de las secuencias de AAV. Cada uno de estos fragmentos se puede utilizar fácilmente en una variedad de sistemas de vectores y células hospedadoras. Entre los fragmentos de AAV deseables están las proteínas cap, que incluyen las regiones vp1, vp2, vp3 e hipervariables. Cuando se desea, la metodología descrita en la publicación de patente de EE.UU. N.° U.S. 2003/0138772 A1 publicada (24 de julio de 2003)] se puede utilizar para obtener las secuencias rep de los clones de AAV identificados anteriormente. Dichas secuencias rep incluyen, por ejemplo, rep 78, rep 68, rep 52, rep 40 y las secuencias que codifican estas proteínas. Del mismo modo, se pueden obtener otros fragmentos de estos clones utilizando las técnicas descritas en la publicación de patente referenciada, que incluyen la repetición terminal invertida (RTI) de AAV, secuencias P19 de AAV, secuencias P40 de AAV, el sitio de unión rep, y el sitio de resolución terminal (TRS). Todavía otros fragmentos adecuados serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica.
Las cápsides de la divulgación se pueden utilizar fácilmente en una variedad de sistemas de vectores y células hospedadoras. Se pueden utilizar solos, en combinación con otras secuencias de AAV o fragmentos, o en combinación con elementos de otras secuencias víricas de AAV o no de AAV. En un ejemplo particularmente deseable, un vector contiene las secuencias cap y/o rep de AAV.
Las secuencias de AAV y fragmentos de estos son útiles en la producción de rAAV, y también son útiles como vectores de administración anticodificantes, vectores de terapia génica, o vectores de vacunas. La divulgación proporciona adicionalmente moléculas de ácidos nucleicos, vectores de administración génica, y células hospedadoras que contienen secuencias de AAV descritas en el presente documento.
Los fragmentos adecuados se pueden determinar utilizando la información proporcionada en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, los vectores que contienen las proteínas de la cápside de AAV son particularmente bien adecuadas para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la eficacia de otros vectores basados en serotipos AAV, así como otros vectores víricos. Los vectores rAAV son particularmente ventajosos en readministración rAAV y terapia génica de repetición.
Éstas y otras realizaciones y ventajas de la invención se describen en más detalle a continuación.
A. Secuencias 9/hu14 de Serotipo de AAV
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de un AAV son de interés, se denominan intercambiablemente en el presente documento como clon hu.14 (denominada anteriormente 28.4) y huAAV9. Como se define en el presente documento, el serotipo AAV9 se refiere al AAV que tiene una cápside que genera anticuerpos que reaccionan en forma cruzada serológicamente con la cápside que tiene la secuencia de hu. 14 [SEQ ID NO: 123] y cuyos anticuerpos no reaccionan en forma cruzada serológicamente con anticuerpos generados para las cápsides de cualquiera de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 o AAV8.
1. Secuencias de ácidos nucleicos
Las secuencias de ácidos nucleicos AAV9 incluyen las secuencias de ADN de la SEQ ID NO: 3, que consiste en 2211 nucleótidos.
Las secuencias de ácidos nucleicos abarcan adicionalmente la cadena que es complementaria para la SEQ ID NO: 3, así como las secuencias de ARN y ADNc que se corresponden con la SEQ ID NO: 3 y su cadena complementaria. También se incluyen las secuencias de ácido nucleico variantes naturales y modificaciones por ingeniería genética de la SEQ ID NO: 3 y su cadena complementaria. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas que se conocen en la técnica, metilación, y sustitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan en forma natural con un nucleótido degenerado.
Adicionalmente se incluyen secuencias de ácidos nucleicos que son mayores de aproximadamente 90%, más preferentemente al menos aproximadamente 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente 98 a 99%, idéntico u homólogo a la SEQ ID NO: 3.
También se incluyen fragmentos de la SEQ ID NO: 3, su cadena complementaria, y ADNc y ARN complementario a los mismos. Los fragmentos adecuados tienen al menos 15 nucleótidos de longitud, y abarcan fragmentos funcionales, es decir, fragmentos que tienen interés biológico. Dichos fragmentos incluyen las secuencias que codifican tres proteínas variables (vp) de la cápside de AAV9/HU.14 que son variantes de corte y empalme alternativo: vp1 [nt 1 a 2211 de SEQ ID NO: 3]; vp2 [aproximadamente nt 411 a 2211 de SEQ ID NO: 3]; y vp 3 [aproximadamente nt 609 a 2211 de SEQ ID NO: 3]. Otros fragmentos adecuados de SEQ ID NO: 3, incluyen el fragmento que contiene el codón de inicio para la proteína de la cápside de AAV9/HU.14 y los fragmentos que codifican las regiones hipervariables de la proteína de la cápside vp1, que se describen en el presente documento.
Adicionalmente a incluir las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en las figuras y en el Listado de Secuencias, la presente divulgación incluye secuencias y moléculas de ácidos nucleicos que se diseñan para expresar las secuencias de aminoácidos, proteínas y péptidos de los serotipos de AAV descritos en el presente documento. Sin embargo, la divulgación incluye las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las siguientes secuencias de aminoácidos de AAV y los serotipos de AAV artificiales generados utilizando estas secuencias y/o fragmentos únicos de los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, los serotipos AAV artificiales incluyen, sin limitación, AAV con una proteína de la cápside que se presenta de forma no natural. Dicha cápside artificial se puede generar mediante cualquier técnica adecuada, utilizando secuencias de AAV descritas en el presente documento (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que se pueden obtener de otro serotipo AAV (conocido o novedoso), porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente vírica de no AAV, o de una fuente no vírica. Un serotipo de AAV artificial puede ser, sin limitación, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante, o una cápside de AAV “humanizada”.
2. Secuencias de aminoácidos hu.14/AAV9, proteínas y péptidos
De interés son las proteínas y fragmentos de los mismos que se codifican por los ácidos nucleicos hu.14/AAV9 y las proteínas hu.14/AAV9 y fragmentos que se generan mediante otros métodos. Como se utiliza en el presente documento, las proteínas incluyen la cápside ensamblada. La divulgación abarca adicionalmente serotipos de AAV generados utilizando secuencias de los serotipos de AAV descritos en el presente documento, que se generan utilizando técnicas sintéticas, recombinantes u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. La divulgación no se limita a secuencias de aminoácidos de AAV, péptidos y proteínas expresados de las secuencias de ácidos nucleicos de AAV descritas en el presente documento, pero abarcan secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas generadas mediante otros métodos conocidos en la materia, que incluyen, por ejemplo, síntesis química, otras técnicas sintéticas, o mediante otros métodos. Las secuencias de cualquiera de las cápsides de AAV proporcionados en el presente documento se pueden generar fácilmente utilizando una variedad de técnicas.
Las técnicas de producción adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Como alternativa, los péptidos también se pueden sintetizar mediante métodos de síntesis de péptidos de fase sólida bien conocidos (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62). Estos y otros métodos de producción están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica y no son una limitación de la presente divulgación.
Las proteínas particularmente deseables incluyen proteínas de la cápside de AAV, que se codifican mediante las secuencias de nucleótidos identificadas anteriormente. La cápside de AAV está compuesta de tres proteínas, vp1, vp2 y vp3, que son variantes de corte y empalme alternativas. La secuencia de longitud completa proporcionada en la figura 2 es la de vp1. Las proteínas de la cápside de AAV9/HU.14 incluyen vp1 [aminoácidos (aa) 1 a 736 de la SEQ ID NO: 123], vp2 [aproximadamente aa 138 a 736 de la SEQ ID NO: 123], vp3 [aproximadamente aa 203 a 736 de la SEQ ID NO: 123], y fragmentos funcionales de los mismos. Otros fragmentos deseables de la proteína de la cápside incluyen las regiones constantes y variables, ubicadas entre las regiones hipervariables (HVR). Otros fragmentos deseables de la proteína de la cápside incluyen las HVR propiamente dichas.
Un algoritmo desarrollado para determinar áreas de divergencia de secuencia en AAV2 ha producido 12 regiones hipervariables (HVR) de las cuales 5 se superponen o hacen parte de las cuatro regiones variables descritas anteriormente. [Chiorini et al, J. Virol, 73:1309-19 (1999); Rutledge et al, J. Virol., 72:309-319] utilizando este algoritmo y/o las técnicas de alineación descritas en el presente documento, se determina la HVR de los serotipos de AAV. Por ejemplo, la HVR se ubica como sigue: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262-264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581­ 594; HVR11, aa 658-667; y HVR12, aa 705-719 [el sistema de numeración se basa en una alineación que utiliza la vp1 del AAV2 como un punto de referencia]. Utilizando la alineación proporcionada en el presente documento realizada utilizando el programa Clustal X en configuraciones predeterminadas, o utilizando otros programas de alineación públicamente disponibles o comercialmente disponibles en configuraciones predeterminadas tal como se describe en el presente documento, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los fragmentos correspondientes de las cápsides de AAV.
Todavía otros fragmentos deseables de la proteína de la cápside de AAV9/HU.14 incluyen los aminoácidos 1 a 184 de la SEQ ID NO: 123, aminoácidos 199 a 259; aminoácidos 274 a 446; aminoácidos 603 a 659; aminoácidos 670 a 706; aminoácidos 724 a 736 de la SEQ ID NO: 123; aa 185-198; aa 260-273; aa 447-477; aa 495-602; aa 660-669; y aa 707-723. Adicionalmente, los ejemplos de otros fragmentos de las cápsides de AAV incluyen, con respecto a la numeración de AAV9 [SEQ ID NO: 123], aa 24-42, aa 25-28; aa 81-85; aa 133-165; aa 134-165; aa 137-143; aa 154­ 156; aa 194-208; aa 261-274; aa 262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581-601; aa 660-671; aa 709-723. Utilizar la alineación proporcionada en el presente documento realizada utilizando el programa Clustal X en configuraciones predeterminadas, o utilizando otros programas de alineación públicamente disponibles o comercialmente disponibles, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los fragmentos correspondientes de las cápsides de AAV.
Todavía otras proteínas AAV9/HU.14 deseables incluyen las proteínas rep que incluyen rep68/78 y rep40/52.
En forma adecuada, los fragmentos tienen al menos 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, los fragmentos de otras longitudes deseadas se pueden utilizar fácilmente. Dichos fragmentos se pueden producir en forma recombinante o mediante otros medios adecuados, por ejemplo, síntesis química.
También son de interés otras secuencias de AAV9/HU.14 que se identifican utilizando la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, dadas las secuencias de AAV9/HU.14 proporcionadas en el presente documento, el AAV9/HU.14 infeccioso se pueden aislar utilizando tecnología de encaminamiento a genoma (Siebert et al., 1995, Nucleic Acid Research, 23:1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). El encaminamiento a genoma es particularmente bien adecuado para identificar y aislar las secuencias adyacentes a las secuencias identificadas de acuerdo con el método descrito en el presente documento. Esta técnica también es útil para aislar repeticiones terminales invertidas (ITR) del serotipo AAV9/HU.14, basándose en las secuencias rep de la cápside de AAV proporcionadas en el presente documento.
Las secuencias, proteínas, y fragmentos de la divulgación se pueden producir mediante cualquier medio adecuado, que incluyen producción recombinante, síntesis química, otros medios sintéticos. Dichos métodos de producción están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitación de la presente divulgación.
III. Producción de rAAV con cápsides de AAV
La divulgación abarca secuencias de la cápside de AAV de las cuales están libres de material celular y/o ADN con las que estos virus se asocian en la naturaleza. Para evitar repetir todas las cápsides de AAV desveladas en el presente documento, se hace referencia a través de esto y las siguientes secciones al cápside hu.14/AAV9. Sin embargo, se debe apreciar que las otras secuencias de la cápside de AAV se pueden utilizar de una forma similar.
En otro aspecto, la presente divulgación abarca moléculas que utilizan las secuencias de AAV descritas en el presente documento, para la producción de moléculas útiles en la administración de un gen heterólogo u otras secuencias de ácido nucleico a una célula diana.
En otro aspecto, la presente divulgación abarca moléculas que utilizan las secuencias de AAV descritas en el presente documento, para la producción de vectores víricos útiles en la administración de un gen heterólogo u otras secuencias de ácido nucleico a una célula diana.
Las moléculas de la divulgación que contienen las secuencias de AAV incluyen cualquier elemento genético (vector) que pueden ser administradas a una célula hospedadora, por ejemplo, ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, una proteína en un vehículo de administración no vírico (por ejemplo, un vehículo basado en lípidos), virus, etc., que transfiere las secuencias llevadas en éste. El vector seleccionado se puede administrar mediante cualquier método adecuado, que incluye transfección, electroporación, administración de liposomas, técnicas de fusión de membranas, gránulos recubiertos con ADN a alta velocidad, infección vírica y fusión de protoplastos. Los métodos utilizados para construir cualesquiera ejemplos de la presente divulgación son conocidos por los expertos en manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
En un ejemplo, los vectores contienen, entre otros, secuencias que codifican la cápside de AAV tal como se desvela en el presente documento. Opcionalmente, los vectores pueden contener proteínas rep y cap de AAV. En vectores en los que se proporcionan rep y cap de AAV, las secuencias de rep de AAV y cap de AAV se pueden originar a partir de un AAV del mismo clado. Como alternativa, la presente divulgación abarca vectores en los que las secuencias rep son de una fuente de AAV que difiere de aquella que está proporcionando las secuencias cap. En un ejemplo, las secuencias rep y cap se expresan de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados, o una célula hospedadora y un vector). En otra realización, las secuencias rep se fusionan en marco a las secuencias cap de una fuente AAV diferente para formar un vector AAV quimérico. Estos vectores y otros vectores descritos en el presente documento pueden contener adicionalmente un mini gen que comprende un transgén seleccionado que se flanquea por AAV 5' ITR y AAV 3' ITR.
De esta manera, por ejemplo, los vectores descritos en el presente documento contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una cápside de AAV intacta que puede ser de una única secuencia de AAV (por ejemplo, AAV9/HU.14). Dicha cápside puede comprender los aminoácidos 1 a 736 de la SEQ ID NO: 123. Como alternativa, estos vectores contienen secuencias que codifican cápsides artificiales que contienen uno o más fragmentos de la cápside de AAV9/HU.14 fusionados a proteínas de la cápside de AAV o no AAV heterólogas (o fragmentos de las mismas). Estas proteínas de la cápside artificial se seleccionan de porciones no contiguas de la cápside de AAV9/HU.14 o de cápsides de otros AAV. Por ejemplo, un rAAV puede tener una proteína de la cápside que comprende una o más de las regiones de cápside de AAV9/HU.14 seleccionadas del vp2 y/o vp3, o de la vp1, o fragmentos de los mismos seleccionados de los aminoácidos 1 a 184, aminoácidos 199 a 259; aminoácidos 274 a 446; aminoácidos 603 a 659; aminoácidos 670 a 706; aminoácidos 724 a 738 de la cápside de AAV9/HU.14, SEQ ID NO: 123. En otro ejemplo, puede ser deseable alterar el codón de inicio de la proteína vp3 a GTG. Como alternativa, el rAAV puede contener una o más de las regiones hipervariables de proteína de la cápside de serotipo 9 de AAV que se identifican en el presente documento, u otro fragmento que incluye, sin limitación, aa 185-198; aa 260-273; aa 447­ 477; aa 495-602; aa 660-669; y aa 707-723 de la cápside de AAV9/HU.14. Véase, la SEQ ID NO: 123. Estas modificaciones pueden ser para aumentar la expresión, el rendimiento, y/o mejorar la purificación en los sistemas de expresión seleccionados, o para otro propósito deseado (por ejemplo, cambiar el tropismo o alterar los epítopos de anticuerpos neutralizantes).
Los vectores descritos en el presente documento, por ejemplo, un plásmido, son útiles para una variedad de propósitos, pero son particularmente bien adecuados para su uso en la producción de rAAV que contiene una cápside que comprende secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores, incluyendo rAAV, sus elementos, construcción, y sus usos se describen en el presente documento en detalle.
Los componentes requeridos para ser cultivados en la célula hospedadora para empaquetar un minigén de AAV en una cápside de AAV se pueden proporcionar a la célula hospedadora en trans. Como alternativa, uno cualquiera o más de los componentes requeridos (por ejemplo, minigén, secuencias rep, secuencias cap, y/o funciones auxiliares) se pueden proporcionar mediante una célula hospedadora estable que ha sido diseñada con ingeniería para contener uno o más de los componentes requeridos utilizando los métodos conocidos por aquellos conocidos en la técnica. En forma más adecuada, dichas células hospedadoras estables contendrán los componentes requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, los componentes requeridos pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores inducibles y constitutivos se proporcionan en el presente documento, en la discusión de elementos reguladores adecuados para uso con el transgén. En todavía otra alternativa, una célula hospedadora estable seleccionada puede contener componentes seleccionados bajo el control de un promotor constitutivo y otros componentes seleccionados bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula hospedadora estable que se obtiene de células 293 (que contienen funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contienen proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Todavía otras células hospedadoras estables se pueden generar por el experto en la técnica.
El minigén, las secuencias rep, las secuencias cap, y las funciones auxiliares requeridas para producir el rAAV de la divulgación se pueden administrar en la célula hospedadora de empaquetamiento en la forma de cualquier elemento genético que transfiere las secuencias llevadas en el mismo. El elemento genético seleccionado se puede administrar mediante cualquier método adecuado, que incluye los descritos en el presente documento. Los métodos utilizados para construir cualquier ejemplo de la presente divulgación se conocen por los expertos en manipulación de ácidos nucleicos incluye incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Del mismo modo, se conocen bien métodos para generar viriones rAAV y la selección de un método adecuado no es una limitación en la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Fisher et al, j Virol, 70:520-532 (1993) y la patente de EE.UU. N.° 5.478.745.
A menos que se especifique otra cosa, las ITR de AAV y otros componentes de AAV seleccionados descritos en el presente documento, se pueden seleccionar fácilmente entre cualquier AAV, que incluye, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9 y una de las otras secuencias de AAV descritas en el presente documento. Estas ITR u otros componentes de AAV se pueden aislar fácilmente utilizando técnicas disponibles para los expertos en la técnica a partir de una secuencia AAV. Dicho AAV se puede aislar u obtener a partir de fuentes académicas, comerciales, o públicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia). Como alternativa, las secuencias de AAV se pueden obtener a través de medios sintéticos u otros medios adecuados mediante referencia a secuencias publicadas tal como está disponible en la bibliografía o en bases de datos tal como, por ejemplo, GenBank®, PubMed® o similares.
A. El minigén
El minigén está compuesto de, como mínimo, un transgén y su secuencia reguladora, y repeticiones de terminal invertido (ITR) de AAV 5' y 3'. En un ejemplo deseable, se utiliza el ITR del serotipo 2 de AAV. Sin embargo, se puede seleccionar ITR de otras fuentes adecuadas. Este es el minigén que se empaqueta en una proteína de la cápside y se administra a una célula hospedadora seleccionada.
1. El transgén
El transgén es una secuencia de ácido nucleico heteróloga para las secuencias de vectores que flanquean el transgén, que codifican un polipéptido, proteína, u otro producto de interés. La secuencia codificante de ácido nucleico se vincula funcionalmente a los componentes reguladores a una forma que permite transcripción del transgén, traducción, y/o expresión en una célula.
La composición de la secuencia del transgén dependerá del uso que se le dará al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia indicadora, que después de la expresión produce una señal detectable. Dicha secuencia indicadora incluye, sin limitación, secuencias de ADN que codifican p- lactamasa, pgalactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina quinasa, proteína fluorescente verde (GFP), GFP mejorada (EGFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas de unión a membrana que incluyen, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, proteína de hemaglutinina de la gripe, y otras bien conocidas en la técnica, a la que los anticuerpos de alta afinidad dirigidos a estos existen o se pueden producir mediante medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión a membrana fusionada adecuadamente a un dominio de etiqueta de antígeno de, entre otros, hemaglutinina o Myc.
Estas secuencias codificantes cuando se asocian con elementos reguladores que pueden activar su expresión, proporcionan señales detectables mediante medios convencionales, que incluyen ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación celular de activación de fluorescencia y ensayos inmunológicos, que incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) e inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando una secuencia marcadora, es el gen LacZ, la presencia del vector que lleva la señal se detecta mediante ensayos para actividad beta-galactosidasa. Cuando el transgén es proteína fluorescente verde o luciferasa, el vector que lleva la señal se puede medir visualmente mediante producción de luz o color en un luminómetro.
Sin embargo, es deseable que el transgén sea una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, mutantes negativos dominantes, o a Rn catalítico. Las moléculas ARN deseables incluyen ARNt, ARNdc, ARN ribosómico, ARN catalítico, ARNip, ARN de horquilla pequeña, ARN de trans-corte y empalme, y ARN anticodificante. Un ejemplo de una secuencia ARN útil es una secuencia que inhibe o extingue la expresión de una secuencia de ácido nucleico diana en el animal tratado. Normalmente, las secuencias diana adecuadas incluyen dianas oncológicas y enfermedades víricas. Véase, como ejemplo de dichas dianas, las dianas oncológicas y virus identificados a continuación en la sección que se relaciona con inmunógenos.
El transgén se puede utilizar para corregir o aliviar deficiencias génicas, que puede incluir deficienciass en la cuales los genes normales se expresan en niveles menores que los normales o deficiencias en las que el producto génico funcional no se expresa. Como alternativa, el transgén puede proporcionar un producto a una célula que no se expresa naturalmente en el tipo celular o en el hospedador. Un tipo preferido de secuencia transgénica codifica una proteína terapéutica o polipéptido que se expresa en una célula hospedadora. La divulgación incluye adicionalmente utilizar múltiples transgenes. En determinadas situaciones, un transgén diferente se puede utilizar para codificar cada subunidad de una proteína, o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo, para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, o una proteína distrofina. Con el fin de que la célula produzca la proteína de múltiples subunidades, se infecta una célula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Como alternativa, se pueden codificar diferentes subunidades de una proteína mediante el mismo transgén. En este caso, un único transgén incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, con el ADN para cada subunidad separado mediante un sitio interno de entrada de ribozima (IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo, el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y el IRES es menor de 5 kilobases. Como una alternativa a un IRES, el ADN se puede separar mediante secuencias que codifican un péptido 2A, que se autodivide en un evento postranduccional. Véase, por ejemplo, M.L. Donnelly, et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1):13-21 (enero de 1997); Furler, S., et al, Gene Ther., 8(11):864-873 (junio de 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10):811-817 (mayo de 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, haciéndolo bien adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitante. Más frecuentemente, cuando el transgén es grande, consiste en múltiples subunidades, o se cosuministran dos transgenes, rAAV que lleva el transgén deseado o subunidades que se coadministran para permitirles concatamerizar in vivo para formar un único genoma de vector. En dicho ejemplo, un primer AAV puede llevar un casete de expresión que expresa un único transgén y un segundo AAV puede llevar un casete de expresión que expresa un diferente transgén para la expresión en la célula hospedadora. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo, un producto deseable para estudio.
Los transgenes adecuados se pueden seleccionar fácilmente por el experto en la técnica. La selección del transgén no se considera que sea una limitación de la presente divulgación.
2. Elementos reguladores
Además de los elementos principales identificados anteriormente para el minigén, el vector también incluye elementos de control convencionales que se unen operablemente al transgén en una forma que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector plásmido o infectada con el virus producido tal como se describe en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, secuencias “unidas operablemente” incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o en una distancia para controlar el gen de interés. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de iniciación de transcripción adecuada, secuencias de terminación, secuencias promotoras y potenciadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de poliadenilación (poliA) y de corte y empalme; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que mejoran la eficacia de traducción (es decir, secuencias consenso Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de proteínas; y cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción del producto codificado. Un gran número de secuencias de control de la expresión, que incluyen promotores que son naturales, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido, se conocen en la técnica y se pueden utilizar.
Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR de virus de sarcoma de Rous (RSV) retrovírico (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Celular, 41:521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de reductasa dihidrofolato, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y se pueden regular mediante compuestos administrados exógenamente, factores ambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solamente en células de replicación. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Muchos otros sistemas se han descrito y se pueden seleccionar fácilmente por el experto en la técnica. Ejemplos de promotores inducibles regulados mediante compuestos administrados exógenamente, incluyen, el promotor metalotionina (MT) de ovejas inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por (Dex), el sistema promotor de polimerasa T7 [Publicación de patente internacional n.° WO 98/10088]; el promotor de ecdisoma de insectos [No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 93:3346-3351 (1996)], el sistema represible de tetraciclina [Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:5547-5551 (1992)], el sistema inducible de tetraciclina [Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), véase también Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)], el sistema inducible por RU 486 [Wang et al., NAT Biotech., 15:239-243 (1997) y Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] y el sistema inducible de rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]. Otros tipos de promotores inducibles, que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que se regulan mediante un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solamente en células de replicación.
En otro ejemplo, se utilizará el promotor natural para el transgén. El promotor natural se puede preferir cuando se desea que la expresión del transgén deba imitar la expresión natural. El promotor natural se puede utilizar cuando la expresión del transgén se debe regular temporalmente o en forma desarrollada, o en una forma específica del tejido, o en respuesta a un estímulo transcripcional. En un ejemplo adicional, otros elementos de control de expresión natural, tal como los elementos potenciadores, los sitios de poliadenilación o las secuencias consenso Kozak también se pueden utilizar para imitar la expresión natural.
Otro ejemplo del transgén incluye un gen ligado funcionalmente a un promotor específico de tejido. Por ejemplo, si se desea la expresión en el músculo esquelético, se debe utilizar un promotor activo en el músculo. Estos incluyen los promotores de los genes que codifican la p-actina esquelética, la cadena ligera 2A de la miosina, distrofina, creatina quinasa muscular, así como también promotores musculares sintéticos con mayores actividades que los promotores que se presentan en forma natural (véase Li et al., NAT Biotech., 17:241-245 (1999)). Se conocen ejemplos de promotores que son específicos de tejido para el hígado (albumin, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotores de núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol REP, 24:185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de linfocitos T), promotores neuronales tales como enolasa específica de neuronas (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamentos (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88:5611-5 (1991)) y gen vgf específico de neuronas (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), entre otros.
Opcionalmente, los plásmidos que llevan los transgenes terapéuticamente útiles también pueden incluir genes indicadores o marcadores seleccionables que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a purimicina, higromicina o geneticina, entre otros. Dichos indicadores seleccionables o genes marcadores (preferentemente ubicados fuera del genoma vírico que se va a rescatar por el método descrito en el presente documento) se pueden utilizar para señalizar la presencia de plásmidos en células bacterianas, tal como la resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación. La selección de estos y otros promotores y elementos de vectores son convencionales y están disponibles muchas de dichas secuencias [véase, por ejemplo, Sambrook et al y referencias citadas en ese documento].
La combinación del transgén/promotor/potenciador, e ITR 5' y 3' de AAV se refieren como un “minigén” para facilidad de referencia en el presente documento. Con las enseñanzas de la presente divulgación, el diseño de dicho minigén se puede hacer recurriendo a técnicas convencionales.
3. Administración del Minigén a una célula hospedadora de empaquetamiento
El minigén se puede llevar sobre cualquier vector adecuado, por ejemplo, un plásmido, que se administra a una célula hospedadora. Los plásmidos útiles en esta divulgación se pueden diseñar con ingeniería genética, de tal manera que sean adecuados para la replicación y, opcionalmente, la integración en células procariotas, células de mamíferos, o ambos. Estos plásmidos (u otros vectores que llevan el ITR AAV 3'-molécula heteróloga-ITR de AAV 5') contienen secuencias que permiten la replicación del minigén en eucariotas y/o procariotas y marcadores de selección para estos sistemas. Los marcadores seleccionables o genes indicadores pueden incluir secuencias que codifican geneticina, higromicina o resistencia a la purimicina, entre otros. Los plásmidos también pueden contener determinados indicadores seleccionables o genes marcadores que se pueden utilizar para señalizar la presencia del vector en células bacterianas, tal como la resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tal como el sistema amplicón que emplea el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr. Este sistema de amplicón, u otros componentes amplicones similares permiten la replicación episomica de altas copias. Preferentemente, la molécula que lleva el minigén se transfecta en la célula, en donde esta puede existir transitoriamente. Como alternativa, el minigén (que lleva el ITR 3'-molécula heteróloga-ITR de AAV 5') se puede integrar en forma estable en el genoma de la célula hospedadora, ya sea cromosómicamente o como un episoma. En determinados ejemplos, el minigén se puede presentar en múltiples copias, opcionalmente en concatameros cabeza a cabeza, cabeza a cola o cola a cola. Dichas técnicas de transfección adecuadas se conocen y se pueden utilizar fácilmente para administrar el minigén a la célula hospedadora.
En general, cuando se administra el vector que comprende el minigén mediante transfección, el vector se administra en una cantidad de aproximadamente 5 |jg a aproximadamente 100 |jg de ADN, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 50 jg de ADN, hasta aproximadamente 1 x 104 células, hasta aproximadamente 1 x 1013 células, o aproximadamente 1 x 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas del ADN del vector para hospedar las células se pueden ajustar, teniendo en consideración factores como el vector seleccionado, el método de administración y las células hospedadoras seleccionadas.
B. Secuencias Rep y Cap
Además del minigén, las células hospedadoras contienen las secuencias que activan la expresión de una proteína de la cápside de AAV tal como se describe en el presente documento (o una proteína de la cápside que comprende un fragmento de la misma) en la célula hospedadora y secuencias rep de la misma fuente que la fuente de ITR de AAV encontrada en el minigén o una fuente de complementos cruzados. Las secuencias cap y rep del AAV se pueden obtener independientemente de una fuente de a Av como se describió anteriormente y se puede introducir en la célula hospedadora en cualquier forma conocida por alguien en la técnica como se describió anteriormente. Adicionalmente, cuando se pseudotipifica un vector de AAV (por ejemplo, una cápside de AAV9/HU.14), las secuencias que codifican cada una de las proteínas rep esenciales se puede administrar mediante diferentes fuentes de AAV (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, a Av 5, AAV6, AAV7, AAV8). Por ejemplo, las secuencias rep 78/68 pueden ser de AAV2, mientras que las secuencias rep52/40 pueden ser de AAV8.
En un ejemplo, las células hospedadoras contienen de manera estable la proteína de la cápside bajo el control de un promotor adecuado, tal como aquellas descritas anteriormente. En forma más deseable, en este ejemplo, la proteína de la cápside se expresa bajo el control de un promotor inducible. En otro ejemplo, la proteína de la cápside se administra a la célula hospedadora en trans. Cuando se administra a las células hospedadoras en trans, la proteína de la cápside se puede administrar a través de un plásmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresión de la proteína de la cápside seleccionada de la célula hospedadora. De manera más deseable, cuando se administra a la célula hospedadora en trans, el plásmido que lleva la proteína de la cápside también lleva otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo, las secuencias rep.
En otro ejemplo, la célula hospedadora contiene de manera estable las secuencias rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como aquellas descritas anteriormente. En este ejemplo, es más deseable, que las proteínas rep esenciales se expresen bajo el control de un promotor inducible. En otro ejemplo, se administran proteínas rep a las células hospedadoras en trans. Cuando se administra a las células hospedadoras en trans, las proteínas rep se pueden administrar a través de un plásmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresión de las proteínas rep seleccionadas en la célula hospedadora. Cuando se administra a la célula hospedadora en trans, es más deseable que el plásmido lleve la proteína de la cápside que también lleva otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo, las secuencias rep y cap.
Sin embargo, en un ejemplo, las secuencias rep y cap se pueden transfectar en la célula hospedadora en una única molécula de ácido nucleico y existe de manera estable en la célula como un episoma. En otro ejemplo, las secuencias rep y cap se integran de manera estable en el cromosoma de la célula. Otro ejemplo tiene las secuencias rep y cap expresadas transitoriamente en la célula hospedadora. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico útil para dicha transfección comprende, un promotor, de 5' a 3', un separador opcional interpuesto entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia génica rep, una secuencia de gen rep AAV y una secuencia de gen cap AAV.
Opcionalmente, se pueden ser administrar secuencias rep y/o cap en un vector que contiene otras secuencias de ADN que se van a introducir en las células hospedadoras. Por ejemplo, el vector puede contener la construcción rAAV que comprende el minigén. El vector puede comprender uno o más de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo, las proteínas E1, E2a y E4 ORF6 adenovíricas, y el gen para ARN VAI.
Preferentemente, el promotor utilizado en esta construcción puede ser cualquiera de los promotores constitutivos, inducibles o naturales conocidos por el experto en la técnica o como se discutió anteriormente. En un ejemplo, se emplea una secuencia promotora P5 de AAV. La selección del AAV para proporcionar cualquiera de estas secuencias no limita la divulgación.
En otro ejemplo, el promotor para rep es un promotor inducible, tal como se discutió anteriormente en relación con los elementos reguladores de transgenes. Otro promotor preferido para la expresión de rep es el promotor T7. El vector que comprende el gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, se transfecta o transforma en una célula que expresa constitutivamente o induciblemente la polimerasa T7. Véase publicación de patente internacional n.° WO 98/10088, publicada el 12 de marzo, 1998.
El separador es un elemento opcional en el diseño del vector. El separador es una secuencia de ADN interpuesta entre el promotor y el sitio de inicio ATG del gen rep. El separador puede tener cualquier diseño deseado; es decir, puede ser una secuencia de nucleótidos aleatoria, o como alternativa, puede codificar un producto génico, tal como un gen marcador. El separador puede contener genes que normalmente incorporan sitios de inicio/detención y sitios poliA. El separador puede ser una secuencia de ADN no codificante de un procariota o eucariota, una secuencia no codificante repetitiva, una secuencia codificante sin controles transcripcionales o una secuencia codificante con controles transcripcionales. Dos secuencias de fuentes de separadores de ejemplo son las secuencias de escalera de fago o secuencias de escalera de levadura, que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Gibco o Invitrogen, entre otros. El separador puede tener cualquier tamaño suficiente para reducir la expresión de los productos génicos rep78 y rep68, que dejan al rep52 y rep40 y los productos génicos cap expresados en niveles normales. La longitud del separador puede, por tanto, variar de aproximadamente 10 pb hasta aproximadamente 10,0 kpb, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 100 pb hasta aproximadamente 8,0 kpb. Para reducir la posibilidad de recombinación, el separador es preferentemente de menos de 2 kpb de longitud; sin embargo, la divulgación no se limita.
Aunque las moléculas que proporcionan rep y cap pueden existir en la célula hospedadora transitoriamente (es decir, a través de transfección), se prefiere que una o ambas de las proteínas rep y cap y los promotores que controlan su expresión se expresen de manera estable en la célula hospedadora, por ejemplo, como un episoma o mediante integración en el cromosoma de la célula hospedadora. Los métodos empleados para construir ejemplos de la presente divulgación son técnicas de ingeniería recombinante o de ingeniería genética convencional tal como aquellas descritas en las referencias anteriores. Aunque la presente memoria descriptiva proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones específicas, utilizando la información proporcionada en el presente documento, un experto en la técnica puede seleccionar y diseñar otras construcciones adecuadas, utilizando una elección de separadores, promotores P5, y otras realizaciones, que incluyen al menos una señal de inicio y detención traduccional, y la adición opcional de sitios de poliadenilación.
En otro ejemplo, la proteína rep o cap se puede proporcionar establemente mediante una célula hospedadora.
C. Funciones auxiliares
Las células hospedadoras de empaquetamiento también requieren funciones auxiliares con el fin de empaquetar el rAAV tal como se describe en el presente documento. Opcionalmente, estas funciones se pueden administrar mediante un herpesvirus., Las funciones auxiliares necesarias más deseables se proporcionan cada una a partir de una fuente de adenovirus de primate humano o no humano, tal como aquellas descritas anteriormente y/o están disponibles de una variedad de fuentes, que incluyen el American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA(US). En un ejemplo, se proporcionan células hospedadoras con y/o contienen un producto génico E1a, un producto génico E1b, un producto génico E2a y/o un producto génico e4 ORF6. La célula hospedadora puede contener otros genes adenovíricos tal como ARN VAI, pero estos genes no se requieren. En un ejemplo, ningún otro gen de adenovirus o funciones génicas se presentan en la célula hospedadora.
“ADN adenovírico que expresa el producto génico E1a”, significa cualquier secuencia de adenovirus que codifica E1a o cualquier parte E1a funcional. El ADN adenovírico que expresa el producto génico E2a y el ADN adenovírico expresa productos génicos E4 ORF6 se definen de forma similar. También se incluyen cualquier alelo u otras modificaciones del gen adenovírico o porción funcional del mismo. Dichas modificaciones se pueden introducir deliberadamente al reclasificar a técnicas mutagénicas o de ingeniería genética convencional para mejorar la función adenovírica en alguna forma, así como también variantes alélicas que se presentan en forma natural de las mismas. Dichas modificaciones y métodos para manipular ADN para alcanzar aquellas funciones génicas de adenovirus se conocen por los expertos en la técnica.
Los productos génicos E1a, E1b, E2a y/o E4ORF6 de adenovirus, así como cualquier otra función auxiliar deseada, se pueden proporcionar utilizando cualquier medio que permita su expresión en una célula. Cada una de las secuencias que codifican estos productos pueden estar sobre un vector separado, o uno o más genes pueden estar en el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en la técnica o divulgado anteriormente, que incluye plásmidos, cósmidos y virus. La introducción en la célula hospedadora del vector se puede lograr mediante cualquier medio conocido en la técnica o como se divulgó anteriormente, incluyendo transfección, infección, electroporación, administración de liposomas, técnicas de fusión de membrana, gránulos de ADN recubiertos a alta velocidad, infección vírica y fusión de protoplastos, entre otros. Uno o más de los genes adenovíricos se pueden integrar establemente en el genoma de la célula hospedadora, expresado establemente como episomeros o expresado transitoriamente. Todos los productos génicos se pueden expresar transitoriamente, sobre un episoma o integrados establemente, o algunos de los productos génicos se pueden expresar de manera estable mientras que otros se expresan transitoriamente. Adicionalmente, los promotores para cada uno de los genes adenovíricos se pueden seleccionar independientemente de un promotor constitutivo, y un promotor inducible o un promotor adenovírico natural. Los promotores se pueden regular mediante un estado fisiológico específico del organismo o célula (es decir, mediante el estado de diferenciación o en células en reposo o en replicación) o mediante factores adicionados exógenamente, por ejemplo.
D. Células hospedadoras y líneas celulares de empaquetamiento
Las células hospedadoras propiamente dichas se pueden seleccionar de cualquier organismo biológico, que incluye células procarióticas (por ejemplo, bacterianas), y células eucarióticas, que incluyen células de insectos, células de levadura y células de mamíferos. Particularmente se desean células hospedadoras deseables de entre cualquier especie de mamíferos, que incluyen, sin limitación, células tales como A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293 (que expresan E1 adenovírico funcional) , Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y fibroblastos primarios, hepatocitos y células de mioblastos que provienen de mamíferos que incluyen humanos, monos, ratones, ratas, conejos, y hámsteres. La selección de las especies de mamíferos que proporcionan las células no es una limitación de la presente divulgación; ni es el tipo de célula de mamífero, es decir, fibroblastos, hepatocitos, células tumorales, etcétera. Los requerimientos para las células utilizadas es que no lleven ningún gen de adenovirus diferente de E1, E2a y/o E4 ORF6; que no contengan ningún otro gen vírico que pueda dar como resultado la recombinación homóloga de un virus contaminante durante la producción de rAAV; y que sea capaz de infección o transfección de ADN y expresión del ADN transfectado. En un ejemplo preferido, la célula hospedadora es una que tiene rep y cap establemente transfectado en la célula.
Una célula hospedadora útil en la presente divulgación es una célula hospedadora transformada de manera estable con las secuencias que codifican rep y cap, y que se transfectan con el adenovirus E1, E2a, y ADN E4ORF6 y una construcción que lleva el minigén como se describió anteriormente. Las líneas celulares que expresan rep y/o cap estables, tal como B-50 (solicitud de publicación de patente internacional N.° WO 99/15685), o aquellas descritas en la patente de EE.UU. N.° 5.658.785, también se pueden emplear en forma similar. Otras células hospedadoras deseables contienen el ADN adenovírico mínimo que es suficiente para expresar E4 ORF6. Aún se pueden expresar otras líneas celulares construidas utilizando las secuencias cap de AAV9 descritas en el presente documento.
La preparación de una célula hospedadora de acuerdo con la presente divulgación implica técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje se puede lograr utilizando técnicas convencionales. Dichas técnicas incluyen la clonación genómica y de ADNc, que son bien conocidas y se describen en Sambrook et al., citado anteriormente, utilizan secuencias de oligonucleótidos de superposición de los genomas de AAV y adenovirus, combinadas con métodos sintéticos, de reacción en cadena de la polimerasa, y cualquier otro método adecuado que proporciona la secuencia de nucleótidos deseada.
La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula hospedadora también se puede lograr utilizando técnicas conocidas por los expertos y que se discuten a través de la memoria descriptiva. En ejemplos preferidos, se utilizan técnicas de transfección estándar, por ejemplo, transfección CaPO4 o electroporación y/o infección mediante vectores de AAV/adenovirus híbrido en líneas celulares tales como la línea HEK 293 de célula embriónica de riñón humano (una línea celular de riñón humano que contiene genes E1 de adenovirus funcional que proporciona proteínas E1 de acción trans).
Los vectores basados en AAV9/HU.14 que son generados por el experto en la técnica se benefician para administración génica a células hospedadoras seleccionadas y pacientes de terapia génica ya que no se han encontrado anticuerpos de neutralización para AAV9/HU.14 en la población humana. Un experto en la técnica puede preparar fácilmente otros vectores víricos rAAV que contienen las proteínas de la cápside de AAV9/HU.14 proporcionadas en el presente documento utilizando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Uno puede del mismo modo preparar aún otros vectores víricos rAAV que contienen la secuencia AAV9/HU.14 y cápsides de AAV de otra fuente.
Un experto en la técnica comprenderá fácilmente que las secuencias de AAV descritas en el presente documento se pueden adaptar fácilmente para su uso en estos y otros sistemas de vectores víricos para la administración génica in vitro, ex vivo o in vivo. Del mismo modo, un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente otros fragmentos del genoma de AAV de la divulgación para su uso en una variedad de sistemas de vectores de rAAV y no rAAV. Dichos sistemas de vectores pueden incluir, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, poxvirus, virus vaccinia, y sistemas adenovíricos, entre otros. La selección de estos sistemas víricos no es una limitación de la presente divulgación. Sin embargo, la divulgación abarca adicionalmente vectores generados utilizando secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos del AAV descritas en el presente documento. Dichos vectores son útiles para una variedad de propósitos, que incluyen administración de moléculas terapéuticas y para su uso en regímenes de vacunas. Particularmente es deseable, para administración de moléculas terapéuticas, cápsides que contienen AAV recombinante del AAV de la divulgación. Éstas, u otras construcciones de vectores que contienen secuencias de AAV descritas en el presente documento se pueden utilizar en regímenes de vacunas, por ejemplo, para coadministración de una citoquina, o para administración del inmunógeno propiamente dicho.
IV. Virus recombinante y usos de los mismos
Utilizando las técnicas descritas en el presente documento, un experto en la técnica puede generar un rAAV que tiene una cápside de un AAV de la invención o tiene una cápside que contiene uno o más fragmentos de un AAV. En un ejemplo, se puede utilizar una cápside de longitud completa de un único AAV. Como alternativa, se puede generar una cápside de longitud completa que contiene uno o más fragmentos de la cápside de AAV fusionado en marco con las secuencias de otros AAV seleccionados, o de partes heterólogas (es decir, no contiguas) del mismo AAV. Por ejemplo, un rAAV puede contener una o más secuencias de región hipervariable de AAV9/HU.14. Como alternativa, las secuencias de AAV de la divulgación se pueden utilizar en construcciones que contienen otras secuencias víricas y no víricas. Opcionalmente, un virus recombinante puede llevar secuencias rep de AAV que codifican una o más de las proteínas rep de AAV.
A. Administración de virus
Los métodos para la administración son bien conocidos por los expertos en la técnica y no son una limitación de la presente divulgación.
En un ejemplo, la divulgación permite un método para el administración mediado por AAV de un transgén a un hospedador. Este método implica transfectar o infectar una célula hospedadora seleccionada con un vector vírico recombinante que contiene un transgén seleccionado bajo el control de secuencias que dirigen la expresión del mismo y proteínas de la cápside del AAV.
Opcionalmente, una muestra del hospedador se puede ensayar primero para detectar la presencia de anticuerpos para una fuente de AAV seleccionada (por ejemplo, un serotipo). Una variedad de formatos de ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes son bien conocidos por los expertos en la técnica. La selección de dicho ensayo no es una limitación de la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Fisher et al, nature Med., 3:306-312 (marzo de 1997) y W. C. Manning et al, Human Gene Therapy, 9:477-485 (1 de marzo de 1998). Los resultados de este ensayo se pueden utilizar para determinar cuál vector de AAV contiene proteínas de la cápside de una fuente particular que se prefiere para la administración, por ejemplo, por la ausencia de anticuerpos neutralizantes específicos para esa fuente de la cápside.
En un aspecto de este método, la administración del vector con proteínas de la cápside de AAV tal como se describe en el presente documento pueden preceder o seguir la administración de un gen a través de un vector con una proteína de la cápside de AAV diferente. De esta manera, la administración génica a través de vectores rAAV se puede utilizar para la administración génica de repetición a una célula hospedadora seleccionada. En forma deseable, los vectores de rAAV administrados posteriormente llevan el mismo transgén que el primer vector de rAAV, pero los vectores administrados posteriormente contienen proteínas de la cápside de fuentes (y, preferentemente, diferentes serotipos) que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene proteínas de la cápside de AAV9/HU.14, los vectores administrados posteriormente pueden tener proteínas de la cápside seleccionadas de entre otros AAV, opcionalmente de otros serotipos o de otro clado.
Opcionalmente, se pueden utilizar múltiples vectores rAAV para administrar grandes transgenes o múltiples transgenes mediante coadministración de vectores rAAV concatamerizados in vivo para formar un único vector de genoma. En dicho ejemplo, un primer AAV puede llevar un casete de expresión que expresa un único transgén (o una subunidad del mismo) y un segundo AAV puede llevar un casete de expresión que expresa un segundo transgén (o una subunidad diferente) para la coexpresión en la célula hospedadora. Un primer AAV puede llevar un casete de expresión que es una primera pieza de una construcción policistrónica (por ejemplo, un promotor y un transgén o subunidad) y un segundo AAV puede llevar un casete de expresión que es una segunda pieza de una construcción policistrónica (por ejemplo, transgén o subunidad y una secuencia poliA). Estas dos piezas de construcción policistrónica concatamerizan in vivo para formar un único vector de genoma que coexpresa los transgenes administrados por el primero y segundo AAV. En dichos ejemplos, el vector rAAV que lleva el primer casete de expresión y el vector rAAV que lleva el segundo casete de expresión se pueden administrar en una única composición farmacéutica. En otros ejemplos, dos o más vectores rAAV se administran como composiciones farmacéuticas separadas que se pueden administrar sustancialmente de manera simultánea, o brevemente antes o después del otro.
Los vectores recombinantes descritos anteriormente se pueden administrar a células hospedadoras de acuerdo con los métodos publicados. El rAAV, preferentemente en un vehículo fisiológicamente compatible, se puede administrar a un paciente mamífero humano o no humano. Los vehículos adecuados se pueden seleccionar fácilmente por el experto en la técnica en vista de la indicación para el que se dirige el virus de transferencia. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye solución salina, que se puede formular con una variedad de soluciones reguladoras (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros vehículos de ejemplo incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del vehículo no es una limitación de la presente divulgación.
Opcionalmente, las composiciones de la divulgación pueden contener, adicionalmente a los rAAV y vehículos, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tal como conservantes, o estabilizantes químicos. Los conservantes de ejemplo incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
Los vectores se administran en cantidades suficientes para transfectar las células y proporcionar suficientes niveles de transferencia y expresión génica para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicamente y médicamente aceptables, que se pueden determinar por los expertos en las áreas médicas. Las vías de administración farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, administración directa a un órgano deseado (por ejemplo, el hígado (opcionalmente a través de la arteria hepática) o pulmón), oral, inhalación, intranasal, intratraqueal, intrarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, y otras vías de administración parenterales. Las vías de administración se pueden combinar, si se desea.
Las dosificaciones del vector vírico dependerán principalmente de factores tales como la condición que se trata, la edad, peso y salud del paciente, y puede de esta manera variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosificación humana eficaz del vector vírico está generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml hasta aproximadamente 100 ml de solución que contiene concentraciones desde aproximadamente 1 x 109 hasta 1 x 1016 genomas de vector vírico. Una dosificación humana preferida para administración a órganos mayores (por ejemplo, hígado, músculo, corazón y pulmón) puede ser de aproximadamente 5 x 1010 hasta 5 x 1013 genomas de AAV por 1 kg, en un volumen de aproximadamente 1 a 100 ml. Una dosificación preferida para administración al ojo es de aproximadamente 5 x 109 a 5 x 1012 copias de genoma, en un volumen de aproximadamente 0,1 ml a 1 ml. La dosificación se ajustará hasta el equilibrio del beneficio terapéutico contra cualquier efecto secundario tal como dosificaciones que pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la que se emplea el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén se pueden monitorear para determinar la frecuencia de dosificación que resulta en vectores víricos, preferentemente vectores de AAV que contienen el minigén. Opcionalmente, los regímenes de dosificación similares a los descritos para propósitos terapéuticos se pueden utilizar para inmunización utilizando las composiciones tal como se describe en el presente documento.
A continuación, se proporcionan ejemplos de productos terapéuticos y productos inmunogénicos para administración mediante vectores que contienen AAV tal como se describe en el presente documento. Estos vectores se pueden utilizar para una variedad de regímenes terapéuticos o de vacuna, como se describe en el presente documento. Adicionalmente, estos vectores se pueden administrar en combinación con uno o más de otros vectores o principios activos en un régimen terapéutico y/o de vacuna deseado.
B. Transgenes terapéuticos
Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de diferenciación y crecimiento, que incluyen, sin limitación, insulina, glucagón, hormona de crecimiento (GH), hormona paratiroide (PTH), factor de liberación de hormona (GRF), hormona foliculoestimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejidos conjuntivos (CTGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor ácido de crecimiento de fibroblastos (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I e IGF-II), uno cualquiera de la superfamilia del factor a de crecimiento de transformación, que incluye TGFa, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMP 1-15, una cualquiera de la familia de factor de diferenciación de heregluina/neuregulina/ARIA/ factor de diferenciación neu (NDF) de factores de crecimiento, factor de crecimiento neuronal (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de estirpe de células gliales (GDNF), neurturina, agrina, una cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), efrinas, noginas, sonic hedgehog y tirosina hidroxilasa.
Otros productos de transgén útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmunitario que incluyen, sin limitación, citocinas y linfocinas tal como trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL) IL-1 a IL-25 (que incluyen, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-12 e IL-18), proteína quimioatrayente de monocitos, factor inhibidor de leucemia, factor estimulador de colonia de macrófagos-granulocitos, ligando Fas, factor a y p de necrosis de tumor, interferones a, p y y, factor de células madre, ligando flk-2/flt3. Los productos génicos producidos por el sistema inmunitario también son útiles. Estos incluyen, sin limitaciones, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, receptores de linfocitos T, receptores de linfocitos T quiméricos, receptores de linfocitos T de cadena sencilla, moléculas del MHC de clase I y clase II, así como moléculas del MHC e inmunoglobulinas diseñadas por ingeniería genética. Los productos génicos útiles también incluyen proteínas reguladoras del complemento tal como proteínas reguladoras del complemento, proteínas de cofactor de membrana (MCP), factor de aceleración de decaimiento (DAF), CR1, CF2 y CD59.
Otros productos génicos útiles incluyen uno cualquiera de los receptores para hormonas, factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, proteínas reguladoras y proteínas del sistema inmunitario. La divulgación abarca receptores para regulación de colesterol y/o modulación de lípidos, que incluyen receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y receptores antioxidantes. La divulgación también abarca productos génicos tal como integrantes de la superfamilia de receptores de hormona esteroide que incluyen receptores glucocorticoides, y receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos génicos útiles incluyen factores de transcripción tal como jun, fos, max, mad, factores de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen la caja ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteína de unión de caja CCAAT, factor de regulación de interferón (IRF-1), proteína del tumor de Wilms, proteína de unión ETS, STAT, proteínas de unión de caja GATA por ejemplo, GATA-3 y la familia de cabeza de horquilla de proteínas de hélice alada.
Otros productos génicos útiles incluyen, sintetasa I Carbamoilo transcarbamilasa ornitina, sintetasa arginosuccinato, liasa arginosuccinato, arginasa, hidrolasa fumarilacetacetato, hidroxilasa fenilalanina, antitripsina alfa-1, glucosa-6-fosfatasa, desaminasa porfobilinógeno, beta-sintasa cistationa, decarboxilada cetoacido de cadena ramificada, albúmina, deshidrogenasa isovaleril-coA, carboxilasa CoA propionilo, mutasa CoA malonil metilo, deshidrogenasa CoA glutarilo, insulina, beta-glucosidasa, carboxilato de piruvato, fosforilasa hepática, cinasa fosforilasa, descarboxilasa glicina, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis quística (CFTR), y un producto génico distrofina [por ejemplo, una mini - o micro-distrofina]. Todavía otros productos génicos útiles incluyen enzimas tal como puede ser útil en terapia de reemplazo de enzimas, que es útil en una variedad de condiciones que resultan de actividad deficiente de enzimas. Por ejemplo, enzimas que contienen manosa-6-fosfato que se pueden utilizar en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, un gen adecuado incluye aquel que codifica p-glucuronidasa (GUSB)).
Todavía otros productos génicos útiles incluyen aquellos utilizados para el tratamiento de la hemofilia, que incluyen hemofilia B (que incluyen factor IX) y hemofilia A (que incluyen factor VIII y sus variantes, tal como la cadena ligera y la cadena pesada del heterodímero y el dominio eliminado B suprimido; la patente de EE.UU. N.° 6.200.560 y la patente de EE.UU. N. 6.221.349). El gen del factor VIII codifica 2351 aminoácidos y la proteína tiene seis dominios, designados desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal como A1-A2-B-A3-C1-C2 [Wood et al, Nature, 312:330 (1984); Vehar et al., Nature 312:337 (1984); y Toole et al, Nature, 342:337 (1984)]. El factor VIII humano se procesa dentro de la célula para producir un heterodímero principalmente que comprende una cadena pesada que contiene los dominios A1, A2 y B y una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2. Tanto el polipéptido de cadena sencilla como el heterodímero circulan en el plasma como precursores inactivos, hasta ser activados por división de trombina entre los dominios A2 y B, que liberan el dominio B y resultan en una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B se elimina en la forma de procoagulante activado de la proteína. Adicionalmente, en la proteína natural, dos cadenas de polipéptidos (“a” y “b”), flanquean el dominio B, que se unen a un catión de calcio divalente.
En algunos ejemplos, el minigén comprende los primeros 57 pares de bases de la cadena pesada del factor VIII que codifican 10 aminoácidos de la secuencia señal, así como la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano (hGH). En ejemplos alternativos, el minigén comprende adicionalmente los dominios A1 y A2, así como 5 aminoácidos del extremo N-terminal del dominio B y/o 85 aminoácidos del extremo C-terminal del dominio B, así como los dominios A3, C1 y C2. En aún otros ejemplos, los ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera y pesada del factor VIII se proporcionan en un único minigén separado por 42 ácidos nucleicos que codifican los l4 aminoácidos del dominio B [Patente de EE.UU. N.° 6.200.560].
Como se utiliza en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad del vector AAV que produce cantidades suficientes del factor VIII para reducir el tiempo que le toma coagular la sangre a un sujeto. En general, pacientes hemofílicos severos tienen menos del 1 % de niveles normales de factor VIII que tienen tiempo de coagulación de sangre completa además de 60 minutos en comparación con 10 minutos aproximadamente para no hemofílicos.
La presente divulgación no se limita a ninguna secuencia del factor VIII específica. Se han aislado y generado muchas formas naturales y recombinantes del factor VIII. Ejemplos de formas recombinantes y que se presentan de forma natural de Factor VII se pueden encontrar en la bibliografía científica y de patentes que incluyen, la Patente de EE.UU. N.° 5.563.045, la Patente de EE.UU. N.° 5.451.521, la Patente de EE.UU. N.° 5.422.260, la Patente de EE.UU. N.° 5.004.803, la Patente de EE.UU. N.° 4.757.006, la Patente de EE.UU. N.° 5.661.008, la Patente de EE.UU. N.° 5.789.203, la Patente de EE.UU. N.° 5.681.746, la Patente de EE.UU. N.° 5.595.886, la Patente de EE.UU. N.° 5.045.455, la Patente de EE.UU. N.° 5.668.108, la Patente de EE.UU. N.° 5.633.150, la Patente de EE.UU. N.° 5.693.499, la Patente de EE.UU. N.° 5.587.310, la Patente de EE.UU. N.° 5.171.844, la Patente de EE.UU. N.° 5.149.637, la Patente de EE.UU. N.° 5.112.950, la Patente de EE.UU. N.° 4.886.876; la Publicación de patente internacional. WO 94/11503, 87/07144, WO 92/16557, WO 91/09122, WO 97/03195, WO 96/21035 y WO 91/07490; Solicitud de patente Europea N.° EP 0672 138 EP 0270618 EP 0182448, EP 0162067, EP 0786474, EP 0533 862, EP 0506757, EP 0874057, EP 0795021, EP 0670332, EP 0500734, EP 0232 112 y EP 0160457; Sanberg et al., int. de XX Congreso de la Fed del mundo. De hemofilia (1992) y Lind et al., EUR j Biochem., 232:19 (1995).
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para el factor VIII descrito anteriormente se puede obtener utilizando métodos recombinantes o al obtener la secuencia de un vector conocido por incluir la misma. Adicionalmente, se puede aislar la secuencia deseada directamente de las células y tejidos que contienen el mismo, utilizando técnicas estándar, tal como extracción con fenol y PCR de ADNc o ADN genómico [Véase, por ejemplo, Sambrook et al.]. Las secuencias de nucleótidos también se pueden producir sintéticamente, a diferencia de las clonadas. La secuencia completa se puede ensamblar a partir de superposición de oligonucleótidos preparados mediante métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa [Véase, por ejemplo, Edge, Nature 292:757 (1981); Nambari et al, Science, 223:1299 (1984); y Jay et al, J. Biol. Chem. 259:6311 (1984).
Adicionalmente, la divulgación no se limita al factor VIII humano. De hecho, se pretende que la presente divulgación abarque el factor VIII de animales diferentes a humanos, que incluye pero no se limita a animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos y equinos), ganado (por ejemplo, bovinos, caprinos y ovinos), animales de laboratorio, mamíferos marinos, grandes felinos, etcétera.
Los vectores de AAV pueden contener un ácido nucleico que codifica fragmentos para el factor VIII que propiamente no es biológicamente activo, aun cuando se administra en el sujeto mejora o restaura el tiempo de coagulación sanguínea. Por ejemplo, como se discutió anteriormente, la proteína de factor VIII comprende dos cadenas de polipéptidos: una cadena pesada y una cadena ligera separadas por un dominio B que se divide durante el procesamiento. Como se demuestra por la presente divulgación, las células receptoras de cotransducción con cadenas ligeras y pesadas del factor VIII para la expresión del Factor VIII biológicamente activo. Debido a que la mayoría de los hemofílicos contienen una mutación o deleción en solamente una de las cadenas (por ejemplo, cadena ligera o pesada), puede ser posible administrar solamente el defecto de la cadena en el paciente para administrar la otra cadena.
Otros productos génicos útiles incluyen polipéptidos que se presentan en forma no natural, tal como polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácidos que se presentan en forma no natural que contienen inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, inmunoglobulinas de cadena sencilla diseñadas por ingeniería genética que pueden ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias génicas que se presentan en forma no natural incluyen moléculas anticodificantes y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que se pueden utilizar para reducir la sobreexpresión de una diana.
La reducción y/o modulación de la expresión de un gen es particularmente deseable para el tratamiento de afecciones hiperproliferativas caracterizadas por ser células hiperproliferativas, como son el cáncer y la psoriasis. Los polipéptidos diana incluyen los polipéptidos que se producen exclusivamente o en mayores niveles en células hiperproliferativas cuando se compara con células normales. Los antígenos diana incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tal como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a los productos del oncogén como antígenos diana, los polipéptidos diana para tratamientos anticancerígenos y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos hechos mediante linfomas de linfocitos B y regiones variables de receptores de linfocitos T de linfomas de linfocitos T que, en algunos ejemplos, también se utilizan como antígenos diana para enfermedades autoinmunitarias. Se pueden utilizar otros polipéptidos asociados a tumores como polipéptidos diana tal como polipéptidos que se encuentran en mayores niveles en células tumorales que incluyen polipéptidos reconocidos mediante anticuerpo 17-1A monoclonal y polipéptidos de unión de folato.
Otros polipéptidos y proteínas terapéuticos incluyen aquellos que pueden ser útiles para tratar individuos que sufren de enfermedades autoinmunitarias y trastornos al conferir una respuesta inmunitaria protectora de base amplia contra dianas que se asocian con autoinmunidad que incluye células y receptores celulares que producen anticuerpos “auto” dirigidos. Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos T incluyen artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS), síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmunitaria, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por receptores de linfocitos T (TCR) que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con enfermedades autoinmunitarias.
C. Transgenes inmunogénicos
En forma adecuada, los vectores de AAV descritos en el presente documento evitan la generación de respuestas inmunitarias de las secuencias de AAV contenidas dentro del vector. Sin embargo, estos vectores se pueden formular no obstante en una forma que permita la expresión de un gen llevado por los vectores para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno seleccionado. Por ejemplo, con el fin de promover una respuesta inmunitaria, el transgén se puede expresar a partir de un promotor constitutivo, el vector puede ser un adyuvante como se describe en el presente documento, y/o el vector se puede poner en un tejido degenerativo.
Ejemplos de transgenes inmunógenicos adecuados incluyen los seleccionados de una variedad de familias víricas. Ejemplos de familias víricas deseadas contra los que sería deseable una respuesta inmunitaria incluyen, la familia picornavirus, que incluye el género rinovirus, que son responsables de aproximadamente el 50 % de casos de resfriado común; el género enterovirus, que incluye poliovirus, coxsakievirus, Ecovirus y enterovirus humano tal como el virus de la hepatitis A; y el género aptovirus, que son responsables de enfermedades de pie y boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de picornavirus de virus, los antígenos diana incluyen el VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otras familias víricas incluyen los astrovirus y la familia calcivirus. La familia calcivirus abarca el grupo de virus Norwalk, que es un importante agente causante de gastroenteritis epidémica. Todavía otra familia vírica deseable para su uso en antígenos diana para inducir respuestas inmunitarias en animales humanos y no humanos es la familia togavirus, que incluye el género alfavirus, que incluye virus Sindbis, virus RossRiver, y virus de la encefalitis equina oriental y occidental venezolana, y rubivirus, que incluye virus de la rubéola. La familia flaviviridae incluye dengue, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos se pueden generar a partir de la Hepatitis C o la familia coronavirus, que incluyen una serie de virus no humanos tal como el virus de la bronquitis infecciosa (aviar), virus gastroentérico transmisible de porcinos (cerdos), virus de la encefalomielitis hemaglutinatina porcina (cerdos), virus de la peritonitis infecciosa de felinos (gatos), coronavirus entérico felino (gatos), coronavirus canino (perros), y coronavirus respiratorio humano, que pueden provocar el resfriado común y/o o la hepatitis A, B o C, y que incluyen una causa putativa del síndrome respiratorio agudo repentino (SARS). Dentro de la familia coronavirus, los antígenos diana incluyen el E1 (también denominado proteína de matriz o M), E2 (también denominada proteína de la espícula o S), E3 (también denominada hemaglutininaelterosa o he), glucoproteína (no presente en todos los coronavirus) o N (nucleocápside). Todavía otros antígenos pueden ser tratados contra la familia arterivirus y la familia rabdovirus. La familia rabdovirus incluye el género vesiculovirus (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular), y el lisavirus general (por ejemplo, rabia). Dentro de la familia rabdovirus, se pueden obtener antígenos adecuados de la proteína G o la proteína N. La familia filoviridae, que incluye el virus de la fiebre hemorrágica tal como el virus Marburg o Ébola puede ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el virus de parainfluenza de tipo 1, el virus de parainfluenza tipo 3, el virus de parainfluenza bovina tipo 3, rubulavirus (virus de la parotiditis, Virus de parainfluenza tipo 2, virus de parainfluenza tipo 4, virus de enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morbillivirus, que incluye sarampión y moquillo, y neumovirus, que incluye virus respiratorio sincicial. El virus de la gripe se clasifica dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígenos (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye el género bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (fiebre del Valle del Rift), hantavirus (puremala es un virus de la fiebre de hemahagina), nairovirus (enfermedad de las ovejas de Nairobi) y diversos bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos contra el virus de la fiebre de Lassa y LCM. Otra fuente de antígenos es la familia bornavirus. La familia reovirus incluye el género reovirus, rotavirus, que provoca gastroenteritis aguda en niños, orbivirus y cultivirus (fiebre de la garrapata de Colorado, Lebombo, (humanos), encefalosis equina, lengua azul). La familia retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que abarca dichas enfermedades veterinarias y humanas como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye VIH, virus de la inmunodeficacia del simio, virus de la inmunodeficacia felina, virus de anemia infecciosa equina y espumavirinal). La familia papovavirus incluye la subfamilia Poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociada con cánceres o progresión maligna de papiloma). La familia adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que provoca enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia parvovirus incluye parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felina, parvovirus canina y parvovirus porcina. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alphaherpesvirinae, que abarca el género simplexvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (pseudorrabia, zoster varicela) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye el género citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye el género linfocriptovirus, EBV (linfoma de Burkitt), Herpesvirus humano 6A, 6B y 7, herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi y herpesvirus de cercopitecina (virus B), rinotraqueítis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, que abarca el género ortopoxvirus (Variola mayor (viruela) y Vaccinia (viruela bovina)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antígenos es el virus de la Hepatitis delta, virus de la Hepatitis E, y priones. Otro virus que es una fuente de antígenos es el Virus Nipan. Todavía otras fuentes víricas pueden incluir virus de la enfermedad de bursitis infecciosa aviar y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. La familia alfavirus incluye virus de la arteritis equina y diversos virus de encefalitis.
La presente divulgación también abarca inmunógenos que son útiles para inmunizar un animal humano o no humano contra otros patógenos que incluyen bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos multicelulares que infectan a vertebrados humanos y no humanos, o de una célula cancerígena o una célula tumoral. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen cocos gran positivos patógenos que incluyen neumococos; estafilococos (y las toxinas producidas, por lo tanto, por ejemplo, enterotoxina B); y estreptococos. Los cocos gran negativos patógenos incluyen meningococos; gonococos. Los bacilos Gram negativos entéricos patógenos incluyen enterobacteriaceae; Pseudomonas, acinetobacterias y eiquenela; melioidosis; Salmonella; Shigella; Haemofilus; moraxela; H. ducreyi (que provoca carcinoides); especies Brucella (brucelosis); francisella Tularensis (que provoca tularemia); Yersinia pestis (plaga) y otra yersinia (pasteurela); Streptobacillus moniliformis y Spirillum; los bacilos Gram positivos incluyen Monocitogenes listeria; Erisipelotrix rhusiopathiae; Corynebacterium dihtheria(difteria); cólera; B. anthracis (antrax); donovanosis (granuloma inguinal); y Bartonelosis. Enfermedades provocadas por bacterias anaeróbicas patógenas incluyen tétano; botulismo (Clostridum botulinum y su toxina); Clostridium perfringens y su toxina épsilon; otro clostridio; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Enfermedades espiroquetales patógenas incluyen sífilis; treponematosis: frambesia, sífilis endémica y pinta; y leptospirosis. Otras infecciones provocadas por bacterias patógenas y hongos patógenos mayores incluyen muermo (Burkholderia mallei); Actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis, y mucormicosis; Esporotricosis; paracoccidioidomicosis, petrielidiosis, torulopsosis, micetoma y Cromomicosis; y dermatofitosis. Infecciones por Rickettsia incluyen fiebre Tifoidea, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, fiebre Q (Coxiella burnetti) y rickettsiosis exantemática. Ejemplos de infecciones de Clamidia y Micoplasma: Micoplasma neumoniae; Linfogranuloma venéreo; psitacosis; e infecciones de clamidia perinatales. Eucariotes Patogénicos abarcan protozoarios patogénicos y helmintos e infecciones producidas en consecuencia incluyen: amebiasis; Malaria; Leismaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii, babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; tremátodos o tremátodos; e infecciones por céstodos (tenia).
Muchos de estos organismos y/o las toxinas producidas por lo tanto se han identificado por los centros de Control de Enfermedades [(CDC), Department of Heath and Human Services, EUA], como agentes que tienen potencial para su uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de estos agentes biológicos, incluyen, Bacillus anthracis (ántrax), Clostridium botulinumand y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), Variola mayor (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebres hemorrágicas víricas [filovirus (por ejemplo, Ebola, Marburg] y Arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo]), todo los cuales se clasifican actualmente como agentes categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); Especies Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (maleidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), Especies de Staphilococcus y sus toxinas (enterotoxina B), Clamidia psittaci (psitacosis), amenazas de seguridad para el agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), fiebre tifoidea (Richettsia powazekii) y encefalitis vírica (alfavirus, por ejemplo, encefalitis equina venezolana, encefalitis equina oriental; encefalitis equina occidental); todas las cuales se clasifican actualmente como agentes de categoría B; y hantavirus y virus Nipan, que se clasifican actualmente como agentes de categoría C. Adicionalmente, otros organismos, que también se clasifican o se clasifican en forma diferentemente, se pueden identificar y/o utilizar para dicho propósito en el futuro. Se entenderá fácilmente que los vectores víricos y otras construcciones descritas en el presente documento son útiles para administrar antígenos a partir de estos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que evitarán y/o tratarán la infección u otras reacciones adversas con estos agentes biológicos.
La administración de los vectores de la invención para administrar inmunógenos contra la región variable de los linfocitos T provoca una respuesta inmunitaria que incluye CTL para eliminar aquellos linfocitos T. En artritis reumatoide (RA), se han caracterizado diversas regiones variables específicas de t Cr que están implicadas en la enfermedad. Estos TCR incluyen V-3, V-14, V-17 y V-17. Sin embargo, la administración de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los linfocitos T implicados en la RA. En esclerosis múltiple (MS), se han caracterizado diversas regiones variables específicas de TCR que están implicadas en la enfermedad. Estos TCR incluyen V-7 y V-10. Sin embargo, la administración de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los linfocitos T implicados en MS. En escleroderma, se han caracterizado diversas regiones variables específicas de TCR que están implicadas en la enfermedad. Estos TCR incluyen V-6, V-8, V-14 y V-16, V-3C, V-7, V-14, V-15, V-16, V-28 y V-12. Sin embargo, la administración de una molécula de ácido nucleico que codifica al menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los linfocitos T implicados en escleroderma.
Sin embargo, un vector vírico recombinante derivado de rAAV tal como se describe en el presente documento proporciona un vehículo de transferencia génica eficaz que puede administrar un transgén seleccionado a una célula hospedadora seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo ha neutralizado anticuerpos a una o más fuentes de AAV. En un ejemplo, el rAAV en las células se mezcla ex vivo, las células infectadas se cultivan utilizando metodologías convencionales; y las células transducidas se reinfunden en el paciente.
Estas composiciones son particularmente bien adecuadas para la administración génica con propósitos terapéuticos y de inmunización, que incluyen inducir inmunidad protectora. Adicionalmente, las composiciones tal como se describen en el presente documento también se pueden utilizar para la producción de un producto génico deseado in vitro. Para la producción in vitro, se puede obtener un producto deseado (por ejemplo, una proteína) a partir de un cultivo deseado después de la transfección de células hospedadoras con una molécula que tiene rAAV que codifica el producto deseado y cultivar la célula de cultivo bajo condiciones que permitan la expresión. El producto expresado puede luego ser purificado y aislado, según se desee. Las técnicas adecuadas para la transfección, el cultivo celular, la purificación, y el aislamiento son conocidas por los expertos en la materia.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos y realizaciones de la invención.
Ejemplo 1 - Análisis computacional de secuencias de AAV de primates
A. Recolección de tejidos de primates
Las fuentes de tejidos de primates no humanos se describieron previamente [N. Muzyczka, K. I. Berns, in Fields Virology D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001), vol. 2, pp. 2327-2359]. Se recolectan tejidos humanos de procedimientos quirúrgicos o exámenes post mortem o donantes de órganos a través de dos proveedores de tejidos humanos nacionales, Cooperative Human Tissue Network (CHTN) y National Disease Research Interchange (NDRI). Los tejidos humanos utilizados para este estudio están comprendidos de 18 tipos de tejidos diferentes que incluyen colon, hígado, pulmón, bazo, riñón, cerebro, intestino delgado, médula ósea, corazón, ganglios linfáticos, músculo esquelético, ovarios, páncreas, estómago, esófago, cuello uterino, testículos y próstata. Las muestras de tejidos vienen de un grupo diverso de individuos de diferente género, raza (Caucásica, afroamericana, asiática, e hispánica) y edad (23-83 años). Entre 259 muestras de 250 individuos analizados, aproximadamente el 28 % de los tejidos se asocia con patología.
B. Detección y aislamiento de secuencias de AAV
Se extrae ADN celular total de tejidos de primates humanos y no humanos como se describió anteriormente [R. W. Atchison, et al., Science 194, 754-756 (1965)]. La distribución de tejidos y prevalencia molecular de AAV en humanos se determina mediante la firma o el PCR de cap de longitud completa utilizando los cebadores y condiciones que fueron similares para aquellos utilizados para el análisis de primates no humanos. La misma estrategia de clonación con PCR utilizada para el aislamiento y caracterización de una familia expandida de AAV en primates no humanos se despliega en el aislamiento de AAV a partir de tejidos humanos seleccionados. En resumen, un fragmento de 3,1 kb que contiene una parte de la secuencia cap de longitud completa y rep se amplifica a partir de ADN de tejido mediante PCR y Topo-clonado (Invitrogen). Los clones de AAV humanos se analizaron inicialmente mediante mapeo de restricción para ayudar a identificar la diversidad de las secuencias de AAV, que se sometieron posteriormente a análisis de secuencia completa mediante SeqWright (SeqWright, Houston, TX) con una precisión del 99,9 %. Se caracterizaron un total de 67 clones de cápside aislados de tejido humano (hu.1 - hu.67). Se secuenciaron 86 clones cap de tejidos de primates no humanos, entre los cuales 70 clones fueron de macacos rhesus, 6 clones de macacos cynomologus, 3 clones de macacos cola de cerdo, 2 clones de babuinos y 5 clones de chimpancé.
C. Análisis de secuencias de AAV
De todas las secuencias contiguas, se analiza los marcos de lectura abierto (ORF) de la proteína vírica (vp1) de la cápside del AAV. Se alinean secuencias de proteína VP1 de cápside de AAV con el programa ClustalX1.81™ [H. D. Mayor, J. L. Melnick, Nature 210, 331-332 (1966)] y se produce una alineación de a Dn en marco con el paquete de software BioEdit™ [U. Bantel-Schaal, H. Zur Hausen, Virology 134, (1984) 52-63]. Se infiere filogenia con el paquete MEGA™ v2.1 y TreePuzzle™. Se utilizaron los algoritmos de Unión de Vecino, Máxima Parsimonia y Máxima Probabilidad [M. Nei, S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nueva York, 2000); H. A. Schmidt, K. Strimmer, M. Vingron, A. von Haeseler, Bioinformatics 18, 502-4 (marzo de 2002); N. Saitou, M. Nei, Mol Biol Evol 4, 406-25 (julio de 1987)] para confirmar el ago lpamiento de secuencias similares en grupos monofiléticos.
Luego se definieron los clados de un árbol filogenético de Unión de Vecino de todas las secuencias de proteínas. Las distancias de aminoácidos se estimaron al hacer uso de la corrección de Poisson. Se realizó análisis bootstrap con 1000 réplicas. Las secuencias se consideraron monofiléticas cuando tuvieron un nodo de conexión dentro de una distancia genética de 0,05. Un grupo de secuencias que se originan de 3 o más fuentes fue considerado un clado. La filogenia de AAV se evalúa adicionalmente para detectar la evidencia de recombinación a través de un análisis secuencial. Se detecta la homoplasia mediante implementación del algoritmo de Descomposición y División Split [H. J. Bandelt, A. W. Dress, Mol Phylogenet Evol 1, 242-52 (septiembre de 1992)]. Las divisiones que se recogen de esta forma se analizan adicionalmente para la recombinación haciendo uso del algoritmo Bootscan en el software Simplot [M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nueva York, 2000)]. Se utiliza una ventana deslizante de 400 nt (10nt/etapa) para obtener 100 árboles de Unión de Vecino de réplicas bootstrap. Posteriormente, se infieren la filogenia de Unión de Vecino y Descomposición y División de fragmentos de recombinación putativos. La mejora significativa de los valores bootstrap, la reducción de las divisiones y la reagrupación de las secuencias híbridas con sus fuentes se consideraron el criterio para la recombinación.
Una serie de secuencias cap diferentes amplificadas de 8 sujetos humanos diferentes mostró relaciones filogenéticas con AAV2 (5') y AAV3 (3') alrededor de un punto de ruptura en la posición 1400 de la secuencia de ADN de cap, consistente con la recombinación de la formulación de un virus híbrido. Esto es la región general del gen cap en donde se detecta la recombinación de aislados de un ganglio linfático mesentérico de un macaco rhesus [Gao et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 100, 6081-6086 (13 de mayo de 2002)]. Se realizó una prueba Z basada en codón general para la selección implementando el método Neib-Gojobori [R. M. Kotin, Hum Gene Ther 5, 793-801 (julio de 1994)].
Se repiten los análisis filogenéticos excluyendo los clones que se identificaron positivamente como híbridos. En este análisis, se incluyen AAv aviar y de ganso como grupos externos [(Bossis I., J. A. Chiorini, J Virol 77, 6799-810 (junio de 2003)]. La figura 1 es un árbol de Unión de Vecino; se obtienen relaciones similares utilizando análisis de máxima parsimonia y máxima probabilidad.
Este análisis demuestra 11 grupos filogenéticos, que se resumen en la Tabla 1. El origen de las especies de los 6 clados de AAV y 5 clones AAV individuales (o grupos de clones) se representa mediante el número de fuentes desde las cuales se recupera en la muestra. El número total de secuencias recolectadas por especie y por agrupamiento se muestra entre llaves. Las referencias para secuencias descritas anteriormente por clado están en la columna derecha. Rhesus- macacos rhesus; cyno- macacos cynomologus; chimp- chimpancés; cola de cerdo- macacos cola de cerdo.
Tabla 1
Clasificación del número de fuentes (secuencias) por especie y por clado o clon ________________________ Humano Rhesus Cyno Babuino Chimpancé_____ Cola de cerdo Clado/representativo
A/AAV1(AAV6) 3(4)
B/AAV2 12(22)
C/AAV2-AAV3 8(17)
Híbrido
D/AAV7 5(10) 5(5)
E/AAV8 7(9) 7(16) 1(2) 1(3) F/AAV9 3(3)
Clones
AAV3
AAV4 1(3)
AAV5
Ch.5 1(1)
Rh.8 2(2)
Dado que, como se indicó anteriormente, la recombinación no se implementa en los algoritmos filogenéticos estándar utilizados, con el fin de construir un árbol filogenético adecuado, se excluyen aquellas secuencias del análisis, de la que se establecen sus ancestros recombinantes. Un análisis de Unión de Vecino de todas las secuencias no recombinadas se representa lado a lado con los clados que evolucionaron haciendo uso de recombinación. Se genera un resultado similar con el algoritmo diferente utilizado y con la secuencia de nucleótidos como se ingresa.
Se realizan experimentos adicionales para evaluar la relación de la relación filogenética para funcionar según se mide mediante actividad serológica y tropismo, como se describe en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2 - Análisis serológico de AAV humano
El último clado obtenido como se describe en el ejemplo precedente se obtiene de aislados de 3 humanos y no contienen un serotipo descrito previamente. El antisuero policlonal se genera contra un integrante representativo de este ciado y se realizó un estudio comprensivo de reactividad cruzada serológica entre los serotipos descritos anteriormente. Esto mostró que el nuevo ciado humano es serológicamente distinto de los otros serotipos conocidos y por lo tanto se denomina Clado F (representado por AAV9).
Los anticuerpos policlonales de conejo contra serotipos 1-9 de AAV se generan mediante inoculación intramuscular a animales con 1 x 1013 copias genómicas cada uno de los vectores de AAV junto con un volumen igual de adyuvante de Freud incompleto. Las inyecciones se repiten en el día 34 para reforzar los títulos de anticuerpo. Se determinó la reactividad cruzada serológica entre AAV 1-9 al evaluar el efecto inhibidor de antisuero de conejo en la transducción de 293 células mediante vectores que llevan un gen indicador (AAVCMVEGFP, que lleva proteína fluorescente verde mejorada) pseudotipada con cápsides derivadas de diferentes fuentes de AAV. Se evalúa la transducción de células 84-31 mediante vectores de AAVCMVEGFP bajo un microscopio UV. En la evaluación de relaciones serológicas entre dos AAV, se prueba la capacidad de ambos sueros heterólogos y homólogos para neutralizar los vectores de cada AAV. Si la neutralización mediante el suero fue de al menos 16 veces menor contra vectores heterólogos que vectores homólogos en una forma recíproca, los 2 AAV se consideran serotipos distintos. Se definen títulos de neutralización como se describió anteriormente [(G. P. Gao et al, Proc Natl Acad Sci USA 99, 11854-9 (3 de Sep, 2002)].
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Estos datos confirman los ago lpamientos filogenéticos de los diferentes clones y ciados salvo para reactividad serológica no anticipada de serotipos AAV5 y AAV1 estructuralmente distintos (es decir, la relación de títulos heterólogos/homólogos fue 1/4 y 1/8 en titulaciones recíprocas).
El resultado adicional indica que el AAVhu.14 tiene una propiedad serológica distinta y no tiene reactividad cruzada significativa con antisuero generado de cualquier serotipo de AAV conocido. La distintividad serológica de AAVhu.14 se soportó adicionalmente mediante su singularidad en la estructura de la cápside que comparte menos del 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con todos los otros serotipos AAV comparados en este estudio.
Los hallazgos proporcionan la base para nombrar al AAVhu.14 como un nuevo serotipo, AAV9.
Ejemplo 3 - Evaluación de AAV de primates como vectores de transferencia génica
Los tropismos biológicos de AAV se estudian al generar vectores pseudotipados en el que los genomas AAV2 recombinantes que expresan el GFP o el gen indicador secretado antitripsina a-1 (A1AT) se empacan con cápsides derivados de diversos clones y un elemento representativo de cada clado AAV de primate para comparación. Por ejemplo, los datos obtenidos de AAV1 se utilizan para representar el Clado A, seguido por AAV2 para Clado B, Rh.34 para AAV4, AAV7 para Clado D, AAV8 para Clado E y AAVHu.14 para Clado F. AAV5, AAVCh.5 y AAVRh.8 representan genotipos AAV individuales para comparación.
Los vectores se evalúan para eficacia de transducción in vitro basándose en la transducción GFP, y la eficacia de transducción in vivo en hígado, músculo o pulmón (Figura 4).
A. In vitro
Se utilizan vectores que expresan proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) para examinar su eficacia de transducción in vitro en células 84-31 y para estudiar sus propiedades serológicas. Para análisis funcional, se mide la transducción in vitro de diferentes vectores de AAVCMVEGFP en células 84-31 que luego se siembran en una placa de 96 pocillos y se infectan con vectores de AAVCMVEGFP pseudotipados en una MDI de 1 * 104 GC por célula. Los vectores de a Av se pseudotipan con cápside de AAV 1, 2, 5, 7, 8 y 6 otros AAV (Ch.5, Cy5, Rh.34, rh.20, Rh.8 y AAV9) utilizan la técnica descrita en G. Gao et al, Proc Natl Acad Sci USA 99, 11854-9 (3 de septiembre de 2002). Se califica la eficacia de transducción EGFP relativa como 0, 1, 2 y 3 que corresponden a 0-10%, 10-30%, 30-70% y 70-100% de células verdes estimadas utilizando un microscopio UV en 48 horas tras la infección.
B. In vivo
Para estudios in vivo, se selecciona a-antitripsina (A1AT) humana como un gen indicador cuantitativo y sensitivo en los vectores y se expresa bajo el control del promotor de p-actina de pollo mejorado por CMV. El empleo del promotor de CB permite que se alcancen altos niveles de transferencia génica A1AT constitutiva y no específica de tejido y también permite el uso de la misma preparación de vectores para estudios de transferencia génica en cualquier tejido de interés. Se tratan cuatro de seis ratones sin pelo NCR de seis semanas de edad con vectores de AAV novedosos (AAVCBhA1AT) en una dosis de 1 * 1011 copias de genoma por animal a través de inyección intraportal, intratraqueal e intramuscular para transferencia génica dirigida a hígado, pulmón y músculo, respectivamente. Las muestras de suero se recolectan en diferentes puntos de tiempo después de transferencia génica y se determinan concentraciones A1AT mediante un ensayo basado en ELISA y se califican como 0, 1, 2 y 3 con relación a diferentes niveles A1AT de suero en el día 28 después de transferencia génica, dependiendo de la ruta de la administración de vector (hígado: 0 = A1AT < 400 ng/ml, 1 = A1AT 400-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000-10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml; Pulmón: 0 = A1AT < 200 ng/ml, 1 = A1AT 200-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000-10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml; Músculo: 0 = A1AT < 100 ng/ml, 1 = A1AT 100-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000-10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml).
Un AAV humano, clon 28.4/hu.l4 (denominado ahora AAV9), tiene la capacidad de transducir hígado en una eficacia similar a AAV8, pulmón 2 registros mejor que AAV5 y músculo superior a AAV1, mientras que el desempeño de los otros dos clones humanos, 24.5 y 16.12 (hu.12 y hu.13) fueron marginales en todos los 3 tejidos diana. El clon N721.8 (AAVrh.43) también tiene un alto desempeño en los tres tejidos.
Para analizar adicionalmente la eficacia de transferencia génica de AAV9 y rh 43 en comparación con la de los marcadores comparativos para hígado (AAV8), pulmón (AAV5) y músculo (AAV1), se lleva a cabo un experimento de respuesta de dosis. Ambos vectores nuevos demuestran al menos 10 veces más transferencia génica que el AAV1 en músculo, desempeño similar para AAV8 en hígado y 2 registros más eficientes que AAV5 en pulmón.
Un grupo de AAV demuestra transferencia génica eficaz en los 3 tejidos que es similar o superior al desempeño de su marcador comparativo en cada tejido que ha surgido. Hasta la fecha, 3 AAV han caído en esta categoría, dos de rhesus (rh10 y 43) y uno de humano (hu.14 o AAV9). Una comparación directa de eficacia de transferencia génica relativa de aquellos 3 AAV con sus marcadores comparativos en hígado de murino, pulmón y músculo sugiere que algo del AAV primate con la mejor aptitud puede haber evolucionado de la evolución y selección biológica rigurosa como “súper” virus. Estos son particularmente bien adecuados para aplicaciones de transferencia génica.
C. Perfiles de actividad biológica
Los perfiles únicos de actividad biológica, en términos de eficacia de transferencia génica, se demostraron para diferentes AAV con concordancia sustancial dentro de elementos de un grupo de clones o clados. Sin embargo, la transducción in vitro no predijo la eficacia de la transferencia génica in vivo. Se desarrolló un algoritmo para comparar la actividad biológica entre dos pseudotipos de AAV basándose en la calificación relativa del nivel de expresión de transgenes y un análisis acumulado de diferencias.
Las diferencias acumuladas de las calificaciones de transferencia génica in vitro en in vivo entre pares de AAV se calcula y presenta en la tabla (ND = no determinado) de acuerdo con la siguiente fórmula. Diferencia funcional acumulada en términos de calificación entre vectores A y B = in vitro (A - B) pulmón (A - B) hígado (A - B) músculo (A - B). Cuanto más pequeño es el número, mayor es la similitud en función con el AAV. En el área gris sombreada, la diferencia de porcentaje en la secuencia se representa en negrilla cursiva. La diferencia de porcentaje en la estructura cap se determina al dividir el número de diferencias de aminoácidos después de una eliminación en forma de pares de espacios en 750, la longitud de la alineación de secuencia de proteína VP1.
AAV1 AAV2 AAV3 Ch.5 AAV4 AAV5 AAV7 AAV8 Rh.8 AAV9
AAV1 0 5 ND 4 4 4 2 4 5 4
AAV2 16,3 0 ND 3 2 4 7 7 6 9
AAV3 13,2 12,3 0 ND ND ND ND ND ND ND
Ch.5 15,5 10,5 11,5 0 2 4 6 6 5 8
AAV4 33,7 36,7 34,8 34,9 0 2 7 6 5 8
AAV5 39,1 38,8 38,5 38,4 42,7 0 4 4 3 6
AAV7 14,1 16,7 14,9 15,6 33, 2 38,5 0 2 3 2
AAV8 15,6 16,4 14 15,6 33, 2 38,9 11,6 0 1 2
Rh.8 14,1 15,2 14,3 14,4 33, 7 39,6 12,1 8,8 0 3
AAV9 17,2 17,3 15,6 14,8 34,5 39,7 17,5 14,3 12,5 0
Estos estudios indican una serie de tejidos relevantes para el estudio de parvovirus en humanos. La prevalencia de secuencias de AAV endógenas en una matriz amplia de tejidos humanos sugiere que las infecciones naturales con este grupo de virus son bastante comunes. La amplia distribución de tejido de secuencias víricas y la frecuente detección en hígado, bazo e intestino indican que ocurre transmisión a través del tubo gastrointestinal y que la viremia puede ser una característica de la infección.
La tremenda diversidad de secuencias presentes tanto en primates humanos como no humanos tiene correlación funcional en términos de tropismo y serología, lo que sugiere que se activa mediante presiones biológicas reales tal como escape inmunitario. Claramente, la recombinación contribuye con esta diversidad, como se evidencia mediante el segundo clado humano más común, que es un híbrido de dos AAV descritos anteriormente.
La inspección de la topología de los análisis filogenéticos revela información en la relación entre la evolución de los virus y su restricción de hospedador. El género completo de dependovirus parece ser derivado de AAV aviar consistente con Lukashov y Goudsmit [(V. V. Lukashov, J. Goudsmit, J Virol 75, 2729-40 (Mar, 2001)]. Los aislados AAV4 y AAV5 divergen tempranamente del desarrollo posterior de otros AAV. El siguiente nodo importante divide las especies en dos grupos monofílicos principales. El primer grupo contiene clones aislados únicamente de humanos e incluye Clado B, clon AAV3, Clado C y Clado A; la única excepción a la restricción de especies de este grupo es el único clon de chimpancés, denominado ch.5. El otro grupo monofílico, que representa el resto de integrantes del género, se deriva tanto de primates humanos como no humanos. Este grupo incluye el Clado D y el clon rh.8, que se aíslan exclusivamente de macacos, y el Clado F, que es específico de humanos. El clado restante dentro de este grupo (es decir, Clado E) tiene elementos tanto de primates humanos como no humanos que sugieren la transmisión de este clado a través de barreras de especies. Es interesante que las estructuras de cápside del elemento de Clado E aislado de algunos humanos es esencialmente idéntico a algunos de los primates no humanos, que indican que ha ocurrido muy poca adaptación del hospedador. Los análisis de biología de vectores derivados de AAV8 demuestran un amplio rango de tropismo de tejido con altos niveles de transferencia génica, que es consistente con un rango de infectividad más promiscuo, y puede explicar su zoonosis evidente. En un rango y eficacia incluso mayores de transferencia génica se observa para el Clado F, resaltando el potencial para la transmisión de especies cruzadas, que no se ha detectado hasta la fecha.
La presencia de AAV latente ampliamente diseminada a través de primates humanos y no humanos y su aparente predisposición para recombinarse y cruzar barreras de especies surgen problemas importantes. Esta combinación de eventos tiene el potencial de conducir a la emergencia de nuevos agentes infecciosos con virulencia modificada. La evaluación de este potencial se confunde por el hecho de que la secuela clínica de infecciones AAV en primates aún no se ha definido. Adicionalmente, la alta prevalencia de secuencias de AAV en hígado puede contribuir a la diseminación de los virus en la población humana en la configuración de trasplante de hígado alogénico o xenogénico. Finalmente, el hallazgo de AAV endógeno en humanos tiene implicaciones en el uso de AAV para terapia génica humana. El hecho de que el AAV tipo natural sea tan prevalente en primates sin incluso estar asociado con una malignidad sugiere que no es particularmente oncogénico. De hecho, la expresión de los genes rep AAV se ha mostrado que suprime la transformación P. L. Hermonat, Virology 172, 253-61 (Sep, 1989)].
Ejemplo 4 - Vector AAV 2/9 para el tratamiento de enfermedades de fibrosis quística de vías respiratorias Hasta la fecha, la transferencia génica CFTR al pulmón para el tratamiento de enfermedades de CF de vías respiratorias se ha limitado por el pobre desempeño del vector combinado con barreras significativas que posee el epitelio de las vías respiratorias para transferencia génica efectiva. El genoma AAV2 empacado en la cápside de AAV9 (AAV2/9) se compara con AAV2/5 en diversos sistemas de modelos de vías respiratorias.
Una única dosis de 50 pl de 1 x 1011 copias de genoma (gc) de AAV2/9 que expresan el gen p-galactosidasa objetivo nuclear (nLacZ) o el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control transcripcional del promotor p-actina de pollo se instiló por vía nasal en ratones C57B1/6 y en ratones sin pelo. Veintiún días después, se procesan la nariz y los pulmones para expresión génica. En animales de control transducidos con AAV2/9-GFP, no se observaron células positivas para LacZ. 9/AAV2-nLacZ las vías respiratorias principalmente transducidas exitosamente, el AAV2/9-nLacZ transdujo exitosamente vías respiratorias principalmente, mientras que el AAV2/5-nLacZ transdujo principalmente alvéolos y pocas vías respiratorias. A través del epitelio de las vías respiratorias nasal, el AAV2/5 y AAV2/9 transdujeron células epiteliales ciliadas y no ciliadas.
Los promotores específicos de células especiales actualmente se evalúan para mejorar la orientación hacia las células de las vías respiratorias in vivo. Basándose en los hallazgos in vivo, la eficacia de transferencia génica de AAV2/9 a células epiteliales de vías respiratorias humanas se probó luego. Se aislaron células epiteliales de vías respiratorias de tráquea humana y bronquios y se cultivaron en una interfaz aire-líquido (ALI) en soportes de membrana recubiertos con colágeno. Una vez las células se polarizaron y diferenciaron, se trasdujeron con AAV2/9 o AAV2/5 que expresa GFP de ápice, así como el lado basolateral. El AAV2/5 y AAV2/9 fueron exitosos en transducir células epiteliales de la superficie basolateral. Sin embargo, cuando se aplica en la superficie apical de AAV2/9 resulta en un aumento de 10 veces en el número de células transducidas en comparación con AAV2/5. Actualmente, el desempeño de transferencia génica de AAV2/9 en vías respiratorias nasales y de pulmón de primates no humanos se está evaluando. Este experimento demuestra que el AAV2/9 puede transducir eficientemente las vías respiratorias de pulmones de murinos y células epiteliales de vía respiratorias humanas bien diferenciadas cultivadas en ALI.
Ejemplo 5 - Comparación de inyección directa de AAV1(2/1) y AAV9(2/9) en corazones de rata adulta
Dos ratas adultas (3 meses de edad) reciben una única inyección de 5 * 1011 partículas de AAV2/1 o AAV2/9 en el ventrículo izquierdo
Los resultados fueron espectaculares, con expresión más significativa observada en el corazón de la rata adulta con vectores de AAV2/9 en comparación con AAV2/1, como se evalúa por histoquímica lacZ. AAV2/9 también muestra transferencia génica superior en corazones de ratones neonatales.
Ejemplo 6 - Vector AAV2/9 para terapia génica de hemofilia b
En este estudio, se muestran vectores de AAV2/9 que son más eficientes y vectores menos inmunogénicos para terapia génica dirigida a músculo e hígado y para hemofilia B que las fuentes AAV tradicionales.
Para un método dirigido al hígado, se realiza la evaluación del vector pseudotipado AAV2/9 en modelos de perros y ratones hemofílicos. En ratones con hemofilia B inmunocompetentes (en C57BL/6 de fondo), los niveles superfisiologicos a largo plazo del Factor IX canino (cFIX, 41-70 pg/ml) y tiempo de tromboplastina parcial activada acortada (aPTT) se han alcanzado después de inyección intraportal de 1 * 1011 copias de genoma (GC) / ratón de vectores de AAV2/7, 2/8 y 2/9 en el que se expresa cFIX bajo un promotor específico de hígado (LSP) y elemento de respuesta postranscripcional de la hepatitis B de la marmota (WPRE). Una dosis 10 veces menor (1 * 1010 GC/ratón) de vector AAV2/8 genera un nivel normal de tiempo aPTT y cFIX. En perros con hemofilia B de la Universidad de Carolina del Norte (UNC), se demostró previamente que la administración de un vector AAV2/8 en un perro previamente tratado con un vector AAV2 fue exitosa; la expresión cFIX máxima en 10 pg/ml en el día 6 después de la segunda inyección intraportal (dosis = 5 * 1012 GC/kg), se redujo luego gradualmente y se estabilizó aproximadamente 700ng/ml (16% de nivel normal) a través del estudio (1 año y medio). Este nivel fue aproximadamente 3 veces mayor que aquel de un perro con hemofilia B que recibió una única inyección de AAV2-cFIX en la dosis similar. Recientemente, se inyectaron dos perros neófitos con hemofilia B con vectores de AAV2/8 intraportalmente en la dosis de 5.25 * 1012 GC/kg. Niveles de cFIX en un perro (macho) alcanza el 30% del nivel normal (1.5 pg/ml) diez semanas después de inyección y se ha sostenido en 1.3-1.5 pg/ml, mientras que el segundo perro (hembra) mantuvo la expresión cFIX en aproximadamente 10% del nivel normal. El tiempo de coagulación de sangre total (WBCT) y aPTT se acortaron después de inyección, lo que sugiere que el antígeno era biológicamente activo. Enzimas hepáticas (amino transferasa aspartato (SGOT), amino transferasa alanina (SGPT) en ambos perros se mantuvo en el rango normal después de cirugía. Estos AAV también se evaluaron para terapia génica dirigida al músculo de hemofilia B. AAV-CMV-cFIX-WPRE [un AAV lleva cFIX bajo el control de un promotor CMV y contiene el WPRE] empacado con seis fuentes AAV diferentes comparado en ratones con hemofilia B inmunocompetentes (en C57BL/6 de fondo) después de inyección intramuscular en la dosis de 1 * 1011 GC/ratón. Se monitorizó la formación de anticuerpos y expresión génica cFIX. Se detectó la expresión más alta en el plasma de ratones inyectados con vectores de AAV2/8 (1460±392 ng/ml en el día 42), seguido por AAV2/9 (773±171 ng/ml en el día 42) y AAV2/7 (500±311 ng/ml en el día 42). Los niveles se mantienen durante 5 meses. De manera sorprendente, la expresión cFIX por AAV2/1 varía de 0­ 253 ng/ml (promedio: 66±82 ng/ml). Se detectó inhibidor Anti-cFIX (IgG) en algunos de los ratones AAV2/1 inyectados. Los niveles de expresión cFIX en estos ratones se correlacionan bien con los niveles inhibidores. Se realizó una selección adicional de la formación de inhibidor en las muestras del día 28 para todos los AAV. Ratones con hemofilia B mostraron la más alta formación de inhibidor contra AAV2/2, seguido por AAV2/5, y AAV2/1. Solamente se detectaron inhibidores de bajo nivel y esporádicos en animales inyectados con AAV2/7, AAV2/8 y AAV2/9. De esta manera, se muestran las ventajas de los nuevos vectores serotipo 2/9 de AAV para terapia génica dirigida a músculo para hemofilia B como vectores más eficientes y seguros sin provocar ninguna formación de anticuerpos anti-FIX significativa.
Ejemplo 7 - Vectores rh.43
A. comparación de AAVrh.43 basándose en el vector de expresión A1AT con AAV8 y AAV9 en transferencia génica dirigida a hígado de ratón
AAVrh.43, que pertenece al Clado E mediante el vector de análisis filogenético se compara con AAV8 y AAV9 para niveles hA1AT después de infusión intraportal al hígado de ratón. Más particularmente, se comparan vectores de AAV2/8, AAVrh.43 y AAV2/9 pseudotipados en transferencia génica dirigida a hígado de ratones. Vectores pseudotipados en dosis de 1 * 1o11 GC, 3 x 1010 GC y 1 * 1010 GC por animal se administra intramuscularmente a ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad. Se recolectan muestras de suero de animales en el día 28 después de infusión del vector para el ensayo de anti tripsina alfa 1 humana (hAIAT).
Los datos indican que el vector AAVrh.43 de hecho tiene un desempeño similar a aquel del AAV9 en el modelo de ratón.
B. Transferencia génica LacZ dirigida nuclear a músculo e hígado de ratones mediado por vectores de AAV pseudotipados.
Vectores basados en AAV9 y AAVrh.43 se comparan con vectores basados en AAV1 y AAV2. Los vectores se inyectan en una dosis de 1 * 1011 GC por ratón intraportalmente al hígado objetivo o intramuscularmente al músculo tibialis anterior derecho intramuscularmente de ratones C57BL/6. Los animales se sacrifican en el día 28 después de transferencia génica y se cultivan los tejidos de interés para tinción histoquímica X-gal.
El vector AAVrh.43 demuestra eficacia de transferencia génica que estuvo cerca al AAV9 pero fue al menos 5 veces mayor que el AAV 1. La propiedad del AAVrh.43 se analizó adicionalmente tanto en hígado como en músculo utilizando el gen LacZ dirigido nuclear como un indicador para visualizar el grado de transferencia génica histoquímicamente. C. Comparación de AAVrh.43 basándose en el vector de expresión A1AT con AAV5 en transferencia génica dirigida a pulmón de ratón
Un vector basado en rh.43 también demuestra potencia de transferencia génica superb en tejido pulmonar. Se administran diferentes dosis (1 * 1010, 3 * 1010 y 1 * 1011 GC por animal) de vectores pseudotipados a pulmones de ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad intratraquealmente. Se recolectan muestras de suero de animales en diferentes momentos de tiempo para el ensayo hA1AT.
Este vector se compara con a AAV5 en diferentes dosis para niveles de hA1AT detectados sistemáticamente después de instilación intratraqueal a pulmones de ratón. Los datos indican que este vector novedoso fue al menos 100 veces más eficiente que el AAV5 en el modelo de ratón.
Ejemplo 8 - vectores basados en AAV humano en modelos de ratón para transferencia génica dirigida a pulmón e hígado
Se pseudotipan y examinan clones humanos, AAVhu.37, AAVhu.41 y AAVhu.47 para potencia de transferencia génica en tejidos de ratón. Los vectores de AAVCBA1AT pseudotipados con cápsides de hu.37, hu.41 y hu.47 se preparan utilizando los métodos descritos en el presente documento y se administran a ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad a través de inyecciones intraportal e intratraqueal. Las muestras se recolectan de animales en el día 14 después de inyección de vector para el ensayo hA1AT, que se realiza de acuerdo con técnicas publicadas. El AAVhu.47 pertenece a la familia AAV2 (Clado B) AAV2 y se aísla de la muestra de médula ósea humana. El AAVhu.37 y AAVhu.41 vienen de un tejido testicular humano y una muestra de médula ósea respectivamente. Filogenéticamente, caen en el clado AAV 8 (clado E).
Los análisis de A1AT en suero de animales inyectados AAV hu.41 y AAV hu.47 se desempeñaron pobremente en tres tejidos probados. Sin embargo, la potencia de transferencia génica del vector derivado de AAVhu.37 fue similar a aquel del AAV8 en hígado y AAV9 en pulmón
Aunque la invención se ha descrito con referencia a realizaciones particulares preferidas, se apreciará que se pueden hacer modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un AAV recombinante que tiene una cápside de AAV, en donde la cápside comprende proteínas vp1 de AAV, proteínas vp2 de AAV, y proteínas vp3 de AAV, en donde dicha proteína vp1 de AAV tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, en donde la proteína vp2 de AAV tiene una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos nt 411 a 2211 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, en donde la proteína vp3 de AAV tiene una secuencia de nucleótidos codificada por los nucleótidos nt 609 a 2211 de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótidos al menos el 99 % idéntica a la misma, y en donde dicho AAV recombinante comprende además, empaquetado dentro de dicha cápside, un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un transgén que codifica un producto de interés que es heterólogo con dicho AAV recombinante, en donde dicho transgén está operativamente unido a secuencias reguladoras con expresión directa del producto del transgén en una célula hospedadora.
2. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos de vp1 de AAV codifica los aminoácidos 1 a 736 de la SEQ ID NO: 123.
3. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos de vp2 de AAV codifica los aminoácidos 138 a 736 de la SEQ ID NO: 123.
4. El AAV recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de nucleótidos de vp3 de AAV codifica los aminoácidos 203 a 736 de la SEQ ID NO: 123.
5. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las repeticiones terminales invertidas de AAV son de AAV2.
6. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las secuencias reguladoras incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV).
7. El AAV de acuerdo con la reivindicación 6, en donde las secuencias reguladoras incluyen el promotor del citomegalovirus y el potenciador del CMV.
8. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las secuencias reguladoras incluyen el promotor de la p-actina de pollo o el promotor de p-actina de pollo con potenciador de CMV.
9. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén es factor IX, factor VIII, factor de crecimiento de hepatocitos, glucosa-6-fosfatasa, factor de crecimiento de nervios, interleucina 10 o eritropoyetina.
10. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén es una enzima.
11. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén se selecciona de insulina, glucagón, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroide (PTH), factor de liberación de hormona (GRF), hormona de estimulación de folículos (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejidos conjuntivos (CTGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor ácido de crecimiento de fibroblastos (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I e IGF-II), uno cualquiera de la superfamilia del factor a de crecimiento de transformación, que incluye TGFa, activinas, inhibinas, BMP 1-15, una cualquiera de la familia de factor de diferenciación de heregluina/neuregulina/ARIA/ factor de diferenciación neu (NDF) de factores de crecimiento, agrina, una cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrin-1 y netrin-2, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), efrinas, noginas, sonic hedgehog y tirosina hidroxilasa.
12. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén se selecciona del factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de la línea celular de la glía (GDNF) y neurturina.
13. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén se selecciona de citocinas y linfocinas tales como trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL) IL-1 a la IL-25 (incluyendo, por ejemplo, IL-2, IL-4, iL-12 e IL-18), proteína quimioatrayente de monocitos, factor inhibidor de leucemia, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, ligando Fas, factores de necrosis tumoral a y p, interferones a, p y y, factor de células madre y ligando flk-2/flt3.
14. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén se selecciona de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de linfocitos T, receptores quiméricos de linfocitos T, receptores de linfocitos T de cadena simple, moléculas del MHC de clase I y de clase II, así como inmunoglobulinas diseñadas genéticamente y moléculas del MHC, proteínas reguladoras del complemento, proteína del cofactor de membrana (MCP), factor de aceleración de decaimiento (DAF), CR1, CF2 y CD59.
15. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén se selecciona de receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), receptores antioxidantes, receptores de glucocorticoide y receptores de estrógenos, receptores de Vitamina D y otros receptores nucleares, factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta al suero (s Rf ), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de unión a CCAAT-box, factor de regulación de interferón (IRF-1), proteína del tumor de Wilms, proteína de unión a ETS, STAT, proteínas de unión a GATA-box, por ejemplo, GATA-3, y la familia de cabeza de horquilla de proteínas de hélice alada.
16. El AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el transgén se selecciona de carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, antitripsina alfa-1, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, cistatión beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilassa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, betaglucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, proteína H, proteína T, una secuencia de regulador transmembrana de fibrosis quística (CFTR), un producto génico de distrofina (por ejemplo, una mini- o microdistrofina), y p-glucuronidasa (GUSB).
17. Una composición que comprende el AAV recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un vehículo fisiológicamente compatible.
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