JP7347933B2 - 血友病ａ治療に対する遺伝子療法 - Google Patents

Description

電子形式で提出された材料の参照による援用
これによって、出願人は、本明細書と共に電子形式で提出された配列表資料を参照により援用する。このファイルには「ＵＰＮ－１６－７７９８ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というラベルが付いている。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１５日に出願の米国仮特許出願第６２／３２３，３３６号、２０１６年５月４日に出願の第６２／３３１，８０７号、及び２０１６年１２月１日に出願の第６２／４２８，８６６号の優先権を主張するものである。これらの出願の全体は、本明細書において参照により援用されている。

本出願は、血友病Ａ治療に対する遺伝子療法に有用な実施形態に関する。

血友病Ａ（ＨＡまたはＨｅｍＡ）は、最も一般的な遺伝性出血障害である。米国疾病管理予防センターによれば、血友病Ａは約５０００人中１人の出生児に発症している。米国には血友病Ａ患者が約２万人いる。血友病Ａは血友病Ｂの４倍に達し、血友病Ａ患者の過半数が重篤な形態の血友病である。ＨＡは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏を病因とし、主としてＦＶＩＩＩレベルの僅かな上昇（通常の１％超）によって重篤な出血表現型を寛解できるため、遺伝子置換アプローチによく適している。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、優れた安全性プロファイル、及び肝臓のような有糸分裂後組織から長期導入遺伝子を発現するように仕向ける能力を有するという点で、現在、遺伝子療法の応用に向けて絶大に有望であることが明らかにされているが、ＨＡ遺伝子療法用ＡＡＶベクターの使用にあたって、ヒトＦＶＩＩＩ（「ｈＦＶＩＩＩ」）の別個の分子及び生化学的特性に関して新たな課題が浮上している。同様のサイズの他のタンパク質と比較して、ｈＦＶＩＩＩの発現は非常に非効率的である。ＦＶＩＩＩ分子を対象とした生物工学により、ＦＶＩＩＩの発現に対し改良が施されてきた。例えば、共存因子の活性に必要とされないｈＦＶＩＩＩ Ｂドメインが欠失して（ＢＤＤ）、短縮型１４アミノ酸リンカー（ＦＶＩＩＩ ＳＱ）で置換された結果、野生型ＦＶＩＩＩの全長にわたってｍＲＮＡレベルが１７倍増加し、分泌タンパク質が３０％増分する。Ｗａｒｄ，Ｎａｔａｌｉｅ Ｊ．，ｅｔ
ａｌ．”Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ １１７．３（２０１１）：７９８－８０７、及び米国特許第９，３９３，３２３号を参照のこと。この特許文献は国際公開第２０１１／００５９６８号としても公開されている。組み換えＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱは、置換組み換えＦＶＩＩＩ製品（Ｒｅｆａｃｔｏ，Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａ；Ｘｙｎｔｈａ，Ｐｆｉｚｅｒ）として臨床的に使用されている。ＨＡ遺伝子療法用のＡＡＶ媒介性遺伝子導入に対するもう１つの障害は、ＦＶＩＩＩコード配列のサイズが、７．０ｋｂでＡＡＶベクターの通常のパッケージング能力をはるかに上回ることである。ＡＡＶベクターへの大型発現カセットのパッケージングが報告されてきたが、これは極めて一貫性に乏しいプロセスであり、結果として、ベクター粒子が低収率となり、感染率が低下して高用量を必要とするため、肝臓損傷を誘発する恐れがある。例えば、Ｓａｒｋａｒ，Ｒ．，Ｗ．Ｘｉａｏ、及びＨ．Ｈ．Ｋａｚａｚｉａｎ．”Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）‐ｍｕｒｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｖｅｃｔｏｒ ｐａｒｔｉａｌｌｙ
ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １．２（
２００３）：２２０－２２６；ａｎｄ ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｊｅｎｎｙ，ｅｔ ａｌ．”Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖｅｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｒＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ．”Ｂｌｏｏｄ １２１．１７（２０１３）：３３３５－３３４４を参照のこと。したがって、ＨＡ治療用の効率に優れたＡＡＶ．ＦＶＩＩＩベクターが必要とされている。

本明細書に記載されている実施形態は、通常のヒトＦＶＩＩＩを、それを必要とする被験者に送達し、次いでベクターの静脈内投与後に、臨床的に意義ある出血欠陥を長期間（おそらく１０年またはそれ以上）にわたって矯正する結果をもたらす、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターに関する。被験者の患者集団は、中等度～重篤な血友病Ａ患者である。意図されるベクター用量は、約３～１０％または５％という血中ＦＶＩＩＩレベルを送達するものである。ＡＡＶベクター治療の目標は、重篤な血友病Ａ患者を中等度または軽度の血友病Ａのいずれかに変換することにより、そのような患者の予防措置の必要性が軽減される。

本明細書に記載の遺伝子療法製品によって、重篤な血友病Ａの処置に対する現在利用可能な予防的アプローチにとって重要な複数の利点が得られる。第一に、治験薬による前臨床結果が、標的患者集団において形質転換可能となる通常レベルの１０％またはこれらを上回る割合の第ＶＩＩＩ因子の循環レベルが達成される可能性と一貫することである。第二に、本製品が必然的に、現在、外因子を投与した際に見られるトラフレベルを回避し、血中第ＶＩＩＩ因子が一定の濃度に効率的に達することである。第三に、長期間（おそらく１０年以上）にわたって単回投与しか必要としない、すなわち、静脈内投与を必ずしも頻回行わなくても差し支えないことである。

本出願は、血友病Ａと診断された患者（ヒト被験者）の肝臓細胞にヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩまたはｈＦ８）遺伝子を送達するための、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を提供する。ｈＦＶＩＩＩ遺伝子（「ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ」）を送達する目的に使用される組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は必然的に、肝臓に対する向性（例えば、ＡＡＶｈｕ．３７またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドを有するｒＡＡＶ）を有するので、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を、肝臓特異的発現制御エレメントを介して制御する必要がある。一実施形態では、発現制御エレメントは、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター；及びポリＡシグナルの１つ以上を含む。別の実施形態において、発現制御エレメントは、短縮型α１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体（ＡＢＰＳ）エンハンサー；及びｅｎＴＴＲ；トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター；ならびにポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。一実施形態では、発現制御エレメントは、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）；α１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター；及びポリＡシグナルの１つ以上を含む。別の実施形態において、発現制御エレメントには、ＡＢＰＳエンハンサー及びｅｎＴＴＲ、Ａ１ＡＴプロモーター、ならびにポリＡシグナルのうちの１つ以上が含まれる。そのような要素は、本明細書中で更に説明されている。

一実施形態において、ｈＦＶＩＩＩ遺伝子は、Ｂドメインが短縮型アミノ酸リンカー（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱ、本明細書中でｈＦＶＩＩＩとも呼ばれる）で置換されるＢドメイン欠失（ＢＤＤ）型の第ＶＩＩＩ因子をコードする。一実施形態ではＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱタンパク質配列を配列番号：３で示し、一実施形態ではＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱコード配列を配列番号：１で示す。ｈＦＶＩＩＩ用コード配列は、一実施形態においてヒトにおける発現用にコドン最適化される。そのような配列は、ネイティブｈＦＶＩＩＩコード配列（配列番号：１）に対して８０％未満の同一性を共有する場合がある。一実
施形態において、ｈＦＶＩＩＩコード配列は、配列番号：２に示すとおりである。

別の態様では、本明細書に記載されているｒＡＡＶを含む血友病Ａ患者への投与に適した水性懸濁液が、本明細書中に提供されている。一部の実施形態において、懸濁液は、水性懸濁液及びｒＡＡＶ／ｍＬの約１×１０^１２～約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）を含む。一実施形態において、懸濁液は静脈内注射に適している。他の実施形態において、懸濁液は、水性懸濁液中に溶解された界面活性剤、防腐剤、及び／または緩衝剤を更に含む。

別の実施形態では、血友病Ａ患者を、本明細書に記載のｒＡＡＶで治療する方法が、本明細書中に提供されている。一実施形態では、ｒＡＡＶ／ｋｇ患者体重の約１×１０^１１～約３×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）が、水性懸濁液にて患者に送達される。

この治療の目標は、この疾患を治療し現行の療法に対する応答を向上させる実現性あるアプローチとしてのｒＡＡＶベースの肝臓特異的な遺伝子療法を通して、患者の欠陥ｈＦＶＩＩＩを機能的に置き換えることにある。本出願に記載された実施形態は、幾分かは、有効用量の安全な送達を可能にする治療組成物及び方法の開発に基づき、ヒト被験者における有効用量の精製生産要件を満たすように改良された製造方法に基礎を置くものである。

ｐＡＡＶ．Ｅ０３．Ｐ３．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５シスプラスミドの概略図である。 ｐＡＡＶ．Ｅ１２．Ｐ３．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５シスプラスミドの概略図である。 ｐＡＡＶ．Ｅ０３．Ｐ２．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５シスプラスミドの概略図である。 ｐＡＡＶ．Ｅ１２．Ｐ２．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５シスプラスミドの概略図である。 ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおける抗体産生に先立つｈＦＶＩＩＩ活性の変動を示す。４２通りのエンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの１つからｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを発現させるＡＡＶｒｈ１０ベクターの１０^１０ＧＣを、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに静脈投与した。各エンハンサーのアレンジメント（表１のＥ０１～Ｅ１４として示す）を、ＴＢＧ－Ｓ１（各グルーピングからの左コホート）、Ａ１ＡＴ（中間コホート）及びＴＴＲ（右コホート）プロモーターと併用した。ＣＯＡＴＥＳＴアッセイ及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、それぞれｈＦＶＩＩＩ活性（Ａ）及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価（Ｂ）を測定した。ベクター投与後第２週目に単離されたマウス血漿に対してアッセイを実施した。図示されている活性について平均±ＳＥＭ値（ｎ＝１０／群）でマウスが個々にプロットされている。 ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおけるＩＶベクター投与後の第８週で、ｈＦＶＩＩＩ活性及び抗ｈＦＶＩＩＩ抗体力価を示す。４２通りのエンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの１つからｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを発現させるＡＡＶｒｈ１０ベクターの１０^１０ＧＣを、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに静脈投与した。各エンハンサーのアレンジメント（表１のＥ０１～Ｅ１４として示す）を、ＴＢＧ－Ｓ１（各グルーピングからの左コホート）、Ａ１ＡＴ（中間コホート）及びＴＴＲ（右コホート）プロモーターと併用した。ＣＯＡＴＥＳＴアッセイ及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、それぞれｈＦＶＩＩＩ活性（Ａ）及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価（Ｂ）を測定した。ベクター投与後第８週目に単離されたマウス血漿に対してアッセイを実施した。図示されている活性について平均±ＳＥＭ値（ｎ＝１０／群）でマウスが個々にプロットされている。 ４２通りのエンハンサー／プロモーターの組み合わせベクターを静脈内投与した後の、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおけるｈＦＶＩＩＩ活性を経時的に示す。４２通りのエンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの１つからｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを発現させるＡＡＶｒｈ１０ベクターの１０^１０ＧＣを、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに静脈投与した。各エンハンサーのアレンジメント（表１のＥ０１～Ｅ１４として示す）を、ＴＢＧ－Ｓ１（各グルーピングからの左コホート）、Ａ１ＡＴ（中間コホート）及びＴＴＲ（右コホート）プロモーターと併用した。ベクター投与後に隔週単離されたマウス血漿に関するＣＯＡＴＥＳＴアッセイで、ｈＦＶＩＩＩ活性を定量した。マウスを平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０／群）で個別にプロットした。 ４２通りのエンハンサー／プロモーターの組み合わせベクターを静脈内投与した後の、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおける抗ｈＦＶＩＩＩ抗体価を経時的に示す。４２通りのエンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの１つからｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを発現させるＡＡＶｒｈ１０ベクターの１０^１０ＧＣを、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに静脈投与した。各エンハンサーのアレンジメント（表１のＥ０１～Ｅ１４として示す）をＴＢＧ－Ｓ１（左コホート）、Ａ１ＡＴ（中コホート）及びＴＴＲ（右コホート）プロモーターと組み合わせた。抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価は、隔週単離されたマウス血漿に対する抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって測定した。マウスは個々にプロットされている（ｎ＝１０／群）。 様々なベクターカプシドを介して導入されたＥ０６．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱゲノムを静脈内投与した後の、ｈＦＶＩＩＩ活性と抗ｈＦＶＩＩＩ抗体力価の比較を示す。ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに、Ｅ０６．ＴＴＲからｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを発現する１０^１０ＧＣのＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３７、またはＡＡＶｒｈ６４Ｒ１ベクターを静脈内投与した。血漿を隔週採取し、それぞれＣＯＡＴＥＳＴアッセイ及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、ｈＦＶＩＩＩ活性（Ａ）及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価（Ｂ）を測定した。図示されている活性について平均±ＳＥＭ値（ｎ＝１０／群）でマウスが個々にプロットされている。 パイロット非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究においてｈＦＶＩＩＩの発現を提供する。（Ａ）２頭のアカゲザルに、３×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｒｈ１０．ＡＢＰ２．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを静脈内投与した。（Ｂ）２頭のカニクイザルに、３×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＡＢＰ２．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱを静脈内投与した。ｈＦＶＩＩＩ発現及びｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子に対する抗体の存在を評価することを目的に、カニクイザルを毎週または隔週で採血した。ｈＦＶＩＩＩ発現を、ＥＬＩＳＡ（実線）によって血漿中で測定し、値を平均±ＳＥＭとして表す。同様に、抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価を、ＥＬＩＳＡ（点線）によって血漿中で定量する。 カニクイザルにおけるｈＦＶＩＩＩの発現を提供する。５頭のアカゲザルに、１．２×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｒｈ１０．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、ＡＡＶｒｈ１０．Ｅ１２．Ａ１ＡＴ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、ＡＡＶｈｕ３７．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、またはＡＡＶｈｕ３７．Ｅ１２．Ａ１ＡＴ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５のうちの１つを静脈内投与した。カニクイザルを隔週で採血し、ＥＬＩＳＡで血漿中のｈＦＶＩＩＩ発現を評価して、値を平均±ＳＥＭとして表した。 カニクイザルにおける抗ｈＦＶＩＩＩ抗体の生成を示す。５頭のアカゲザルに、ＡＡＶｒｈ１０．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５，ＡＡＶｒｈ１０．Ｅ１２．Ａ１ＡＴ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、ＡＡＶｈｕ３７．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、またはＡＡＶｈｕ３７．Ｅ１２．Ａ１ＡＴ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５のうちの１つを、１．２×１０^１３ＧＣ／ｋｇ静脈内投与した。隔週にカニクイザルを採血して、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子に対する抗体の存在を評価した。抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって血漿中で評価した。統計解析を図１４に示す。 製造スキームを提供する。 図１２に示す抗ＦＶＩＩＩ抗体の生成の時間イベント解析を提供する。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いたことで、ＡＡＶｒｈ．１０とＡＡＶｈｕ．３７との間に統計的に有意な差が見られた。 ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ５ベクター（第１ベクター注入）によるｒｈＣＧ発現レベルの比較を示す。 図１６Ａ－図１６Ｄは、異なる時点における肝臓中のｒｈＣＧベクターＤＮＡコピー（ＡＡＶｒｈ１０、図１６Ａ；ＡＡＶ８、図１６Ｂ；ＡＡＶ３Ｂ、図１６Ｃ；ＡＡＶ５、図１６Ｄ）を示す。 図１７Ａ－図１７Ｂは、ｒｈＡＦＰを発現するＡＡＶ３Ｂ（図１７Ａ）ベクターまたはＡＡＶ５（図１７Ｂ）ベクターを再投与（第２のベクター注射）した後の、ｒｈＡＦＰレベルを示す。 図１８Ａ－図１８Ｂは、肝臓内のｒｈＡＦＰベクターゲノムコピー（図１８Ａ、ＡＡＶ３Ｂ．ＴＢｇ．ｒｈＡＦＰ；図１８Ｂ、ＡＡＶ５．ＴＢＧ．ｒｈＡＦＰ）を示す。 カニクイザルにおけるＡＡＶ Ｎａｂの差次的応答を示す。 図２０Ａ－図２０Ｂは、第６．３．８節に記載されているように、ｈＦＶＩＩＩｃｏ ＩＶを発現するＡＡＶｒｈ１０エンハンサー／プロモーターベクターを注射されたマウスの肝臓における肝臓ベクターＧＣ（図２０Ａ）またはＲＮＡ転写レベル（図２０Ｂ）を提供する。 第６．３．８節に記載されているように、ｈＦＶＩＩＩｃｏ ＩＶを発現するＡＡＶｒｈ１０エンハンサー／プロモーターベクターを注射されたマウスの、筋肉（右腓腹筋）、右精巣、膵臓、右腎臓、脾臓、右肺、及び心臓におけるｈＦＶＩＩＩ ＲＮＡ転写レベルを提供する。 ＡＡＶｈｕ３７．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ．ＰＡ７５を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇにて単回静脈注射した後の、カニクイザル（３５か月）におけるヒトＦＶＩＩＩの長期安定発現を示したグラフである。 図２２のカニクイザルにおける肝臓酵素レベル（ＡＬＴ、Ｕ／ｍＬ、矩形；ＡＳＴ、Ｕ／ｍＬ、円形）を示したグラフである。 ＡＡＶｈｕ．３７カプシドに対して応答する中和抗体（Ｎａｂ）を示したグラフである。 ｈＦＶＩＩＩｃｏ配列（配列番号：２）、対ｈＦＶＩＩＩネイティブ（配列番号：１）配列のアラインメントである。

本出願に記載の実施形態は、血友病Ａ（ＨＡ）と診断された患者（ヒト被験者）の肝臓細胞にヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）遺伝子を送達するための、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関する。ｈＦＶＩＩＩ遺伝子（「ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ」）の送達に用いられる組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は必然的に、肝臓（例えば、ＡＡＶｈｕ．３７またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドを有するｒＡＡＶ）に対する向性を有するので、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を肝臓特異的発現制御エレメントで制御する必要がある。一実施形態において、発現制御要素は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）エンハンサー；トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター；及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。そのような要素は、本明細書中で更に説明されている。

本明細書において、「ＡＡＶｈｕ．３７カプシド」は、ＧｅｎＢａｎｋ、寄託：ＡＡＳ９９２８５、配列番号：１７のアミノ酸配列を有するｈｕ．３７を指し、本文献は本明細書中で参照により援用されている。このコード化配列に基づいて幾つかバリエーションが可能であり、本明細書中で参照により援用されているＡＡＳ９９２８５、及び米国特許第２０１５／０３１５６１２号中の参照アミノ酸配列に対して約９９％の同一性を有する配列を含む）（すなわち、１％未満の参照配列からの変異）。カプシド、そのコード配列を
生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されてきた。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及び米国特許出願公開第２０１５／０３１５６１２号を参照のこと。

本明細書中で、「ＡＡＶｒｈ１０カプシド」は、本明細書中で参照により援用されているＧｅｎＢａｎｋ、寄託：ＡＡＯ８８２０１、配列番号：１８アミノ酸配列を有するｒｈ．１０を指す。このコード化配列に基づいて幾つかバリエーションが可能であり、ＡＡＯ８８２０１号及び米国特許出願公開第２０１３／００４５１８６（Ａ１）号における参照アミノ酸配列に対して約９９％の同一性（すなわち、参照配列からの１％未満のバリエーション）を有する配列を含むことができ、ただし、親和性に対するリガンド結合部位の完全性捕獲精製が維持され、且つ配列が変更されても、イオン交換樹脂精製用カプシドのｐＨ範囲は実質的に変化しない（詳細は、本明細書中で更に考察する）。カプシド、そのコード配列を生成方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されてきた。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）、及び米国特許出願公開第２０１３／００４５１８６（Ａ１）号を参照のこと。

本明細書において、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的エピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）の産生量の尺度である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、本明細書中で参照により援用されているＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているようにして測定できる。

アミノ酸配列の文脈における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」という用語は、対応のために整列された場合に２つの同じ配列中の残基を指す。パーセント同一性は、タンパク質、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、またはそのペプチドフラグメントもしくは対応する核酸配列をコードするシーケンサーの全長にわたってアミノ酸配列に対して容易に定量できる。好適なアミノ酸フラグメントは、少なくとも約８アミノ酸長である場合もあれば、最高約７００アミノ酸である場合もある。２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」または「類似性」を指す場合、「整列した」配列に関して「同一性」、「相同性」または「類似性」が定量されるのが一般的である。「アラインされた」配列または「アラインメント」は、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。この配列は、多くの場合、参照配列と比較して欠損または追加の塩基もしくはアミノ酸の補正を含む。アラインメントは、公的にまたは市販されている多様な配列アラインメントプログラムのいずれかを用いて、実行される。配列アラインメントプログラムは、アミノ酸配列、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムに対して利用可能である。概して、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者であれば、必要に応じて、これらの設定のうちの１つを変更することができる。代替的に、当業者は、参照されたアルゴリズム及びプログラムを介して提供されるものと少なくとも同一性または整列のレベルを提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照のこと。本明細書に
おいて、「作動可能に連結された」という用語は、関心対象の遺伝子に隣接する発現制御配列と、トランスまたは遠隔で作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、関心対象の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージングされている組み換え、合成もしくは人工のウイルス粒子を指し、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は複製欠損性；すなわち、子孫ビリオンを生成できないが、標的細胞を感染させる能力は保持される。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムが複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（このゲノムは、「ガットレス」（すなわち、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する関心対象の導入遺伝子のみを含有するようにエンジニアリングできる）にもかかわらず、これらの遺伝子が産生中に供給される場合がある。したがって、複製に必要なウイルス酵素の存在を除き、子孫ビリオンによる複製及び感染は起こる恐れがないので、遺伝子療法における使用は安全であると見なされる。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上のものを指すことに留意されたい。そのため、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において同義に用いられている。

「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「を具備する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈するべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という単語、及びその変形は、包括的ではなく、排他的に解釈する必要がある。本明細書中の様々な実施形態は、「含む」という語を使用して提示されているが、他の状況下では、関連する実施形態もまた、「からなる」または「から本質的になる」という語を使用して解釈し且つ記載されることが意図される。

本明細書において、「約」という用語は、別途指定しない限り、与えられた基準からのばらつきが１０％であることを意味する。本明細書中で別途定義されていない限り、本明細書中に使用されている技術用語及び科学用語の意味は、当業者に一般的に理解されている意味と同じである。当業者であれば、公表された文献を参照することによって、本出願中に用いられている多くの用語に関する概括的な手引が得られる。

５．１遺伝子療法ベクター
一態様では、ヒト凝固因子８（ｈＦ８またはｈＦＶＩＩＩ）遺伝子を有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが、遺伝子療法用に提供されている。ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは必然的に、肝臓（例えば、ＡＡＶｈｕ．３７またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドを有するｒＡＡＶ）に対する向性を有するので、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を、肝臓特異的発現制御エレメントによって制御する必要がある。ベクターは、ヒト被験者における注入に好適な緩衝液／担体中に調合される。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入管に付着するのを防止するが、インビボではｒＡＡＶ結合活性を妨害しない成分を含むべきである。

５．１．１．ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクター
５．１．１．１．ｈＦＶＩＩＩ配列
ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子は、ドメイン構造Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２を有する大型３３０ｋＤａの糖タンパク質として産生され、同じドメイン構造を共有する第Ｖ因子（ＦＶ）のＡドメイン及びＣドメインに対して内部配列相同性ならびに約４０％の配列同一性を有する。全配列の３８％を構成するＢドメインは、凝固促進活性に必要不可欠であ
る。Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）によって、配列Ｂドメインが短縮型１４アミノ酸リンカー（ＦＶＩＩＩ ＳＱ）で置き換えられたＦＶＩＩＩは、代替組み換えＦＶＩＩＩ製品として臨床的に使用されており、完全長の野生型ＦＶＩＩＩよりもｍＲＮＡレベルが１７倍、及び分泌タンパク質が３０％増加することを示す。ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖｅｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ
ＶＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ，Ｂｌｏｏｄ，１２１（１７）：３３３５－４４（Ｆｅｂ ２０１３） ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｌｏｏｄ，１１７（３）：７９８－８０７（Ｊａｎ ２０１１）を参照のこと。これらの文献は本明細書中で参照により援用されている。

一実施形態において、ｈＦＶＩＩＩ遺伝子は配列番号：３に示すｈＦＶＩＩＩタンパク質をコードする。このｈＦＶＩＩＩでは、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）によって、配列Ｂドメインが短縮型１４アミノ酸リンカー（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱ）で置換される。故に、一実施形態において、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子には、限定されるものではないが、本明細書中で参照により援用されている添付の配列表中に記載されている配列番号：１または配列番号：２によって提供される１つ以上の配列を含むことができる。配列番号：１には、天然ヒトＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱのｃＤＮＡを提供する。配列番号：２は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されたヒトＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱ用にエンジニアリングされたｃＤＮＡを提供する（本明細書中ではｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱまたはｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＢＤＤ－ＳＱと呼ばれることがある）。当然のことながら、本明細書中でｈＦＶＩＩＩに言及した場合、一部の実施形態においてｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱネイティブまたはコドン最適化された配列を指すことがある。代替的にまたは追加的に、ウェブベースもしくは市販のコンピュータプログラムならびにサービスベースの企業を利用して、アミノ酸配列を、ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡの両方を含む核酸コード配列に逆翻訳できる。例えば、ＥＭＢＯＳＳのｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）；Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ－／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照のこと。記載のｈＦＶＩＩＩポリペプチド配列をコードする全ての核酸、例えば、所望の標的被験者における発現用に最適化された核酸配列（例えば、コドン最適化によるもの）などことが包含されることが、意図される。一実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：１のネイティブｈＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：１のネイティブｈＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも９０、８５、８０、７５、７０、または６５％の同一性を共有する。一実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：１のネイティブｈＦＶＩＩＩコード配列に対して約７７％の同一性を共有する。一実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：２である。別の実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：１または配列番号：２のｈＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも９９％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％の同一性を共有する。別の実施形態において、配列番号：１９のｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、別の実施形態において、配列番号：１９のｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、ｈＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも９０、８５、８０、７５、７０、または６５％の同一性を共有する。更に別の実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：１または配列番号：２のｈＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５
９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を共有する。更に別の実施形態において、ｈＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号：１９のｈＦＶＩＩＩコード配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を共有する。Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ
ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｌｏｏｄ，１１７（３）：７９８－８０７（Ｊａｎ ２０１１）を参照のこと。本文献は、コドン最適化変異体をはじめとするＦＶＩＩＩ－ＳＱの多様な変異体について考察できるように、本明細書中で参照により援用されている。

コドン最適化コード領域は、多種多様な方法で設計できる。この最適化は、オンライン（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、または例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ，ＣＡ）のようなコドン最適化サービスを提供する企業を利用して行うことができる。１つのコドン最適化アプローチは、例えば、本文献は本明細書中で参照により援用されている国際特許出願第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されている。例えば、米国特許出願公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許出願公開第２００６／０１３６１８４号も参照のこと。適切には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。ただし、一部の実施形態では、ＯＲＦのフラグメントのみが変更される可能性がある。これらの方法のうちの１つを用いることにより、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸フラグメントを生成できる。

本明細書に記載されているように、コドンを実際に変更するための、または設計されたコドン最適化コード領域を合成するための、多くのオプションが利用可能である。そのような修飾または合成は、当業者に周知の標準的及び日常的な分子生物学的操作を用いて行うことができる。１つのアプローチでは、長さがそれぞれ８０～９０ヌクレオチドであって、所望の配列の長さにわたる一連の相補的オリゴヌクレオチド対を、標準的な方法で合成する。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングの際に、それらが８０～９０塩基対の二本鎖フラグメントを形成し、例えば、この塩基対の各オリゴヌクレオチドは、塩基対内の他のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、もう１つの対のオリゴヌクレオチドの一本鎖末端とアニールされるようになっている。オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、約５～６個のこれらの二本鎖フラグメントを凝集一本鎖末端を介して一体的にアニールさせ、次に、これらを一体的に連結し、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローンされる。続いて、構築物を標準的な方法によって配列決定する。一体的に連結された８０～９０塩基対フラグメントの５～６個のフラグメント、すなわち約５００塩基対のフラグメントからなるこれらの構築物の幾つかが調製され、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表される。その後、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一体的に連結して最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クロー
ニングベクターにクローニングし、配列決定する。更なる方法は、直ちに当業者に明らかになるであろう。加えて、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能となっている。

５．１．１．２．ｒＡＡＶベクター
ｈＦＶＩＩＩは肝臓においてネイティブに発現するので、肝臓に対する向性を示すＡＡＶを使用することが所望される。一実施形態において、カプシドを供給するＡＡＶはＡＡＶｒｈ．３７である。別の実施形態において、カプシドを供給するＡＡＶはＡＡＶｒｈ．１０であるが、肝向性を有する幾つかのｒＡＡＶベクターのいずれかを使用できる。以下の実施例に記載されている特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターは、ｒＡＡＶｈｕ．３７．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩと呼ばれるトランスサイレチンプロモーターの制御下で、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を発現するＡＡＶｈｕ．３７ベクターである。外部ＡＡＶベクター成分は、３通りのＡＡＶウイルスタンパク質（１：１：１０の比率のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）６０コピー分からなる、血清型ｈｕ．３７（Ｔ＝１）の正２０面体カプシドである。このカプシドには、一本鎖ＤＮＡ ｒＡＡＶベクターゲノムが含有されている。

ｒＡＡＶｈｕ．３７．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩゲノムには、２つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）に隣接するｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子が含有される。ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子は、エンハンサーと、プロモーターと、ｈＦＶＩＩＩコード配列と、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルとを含む。これらの制御配列は、ｈＦＶＩＩＩ遺伝子配列に対し「作動可能に連結されている」。発現カセットは、ウイルスベクターの産生に使用されるプラスミドに対してエンジニアリングできる。

ＩＴＲは、ベクター産生中にゲノムの複製及びパッケージングに対する責務を担う遺伝的エレメントであって、ｒＡＡＶを生成するのに必要とされる唯一のウイルス性シスエレメントである。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子にパッケージングするのに必要とされる最小限の配列は、ＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲであり、カプシド、またはカプシドと同じＡＡＶ起源であってもよいし、または（ＡＡＶ偽型を生成するために）異なるＡＡＶ起源のものであってもよい。一実施形態では、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が使用されるが、他のＡＡＶ源からＩＴＲを選択できる。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、結果として得られるベクターはシュードタイピングと呼ばれる場合がある。ＡＡＶベクター用の発現カセットは典型的に、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＦＶＩＩＩコード配列及び任意の調節配列、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ただし、これらの要素の他の構成も好適でありうる。Ｄ－配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失した、ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮版が記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲが使用される。一実施形態において、５’ＩＴＲ配列を、配列番号：１１に示す。一実施形態において、３’ＩＴＲ配列を、配列番号：１２に示す。ｈＦＶＩＩＩコード配列の発現は、肝臓特異的プロモーターから駆動される。ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子のサイズに合うような比較的小型サイズのプロモーターを使用することが望ましい。本明細書に記載されている例示的なプラスミド及びベクターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）（本明細書においてＰ３とも呼ばれる）プロモーター、またはその修正バージョンを用いる。ＴＴＲプロモーター配列を、配列番号：７に示す。代替的に、他の肝臓特異的プロモーターとしては、例えば、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）（本明細書においてＰ１とも呼ばれる）プロモーター、またはその短縮バージョンであるＴＢＧ－Ｓ１（配列番号：８に示してある配列）を使用できる。別の好適なプロモーターは、α１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、またはその修正バージョン（本明細書中でＰ２とも呼ばれる）、配列番号：９に示す。他の好適なプロモーターとしては、ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７））、ｈｕｍＡｌｂ；及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００
２ ９（１９９６）が挙げられる。例えば、参照により援用されているＴｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照のこと。あまり所望されないが、他のプロモーター、例えばウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号及び国際公開第２０１３／０４９４３号を参照］、または生理学キュー（ｃｕｅ）に応答するプロモーターを使用して、本明細書に記載のベクターにおいて利用できる。

一実施形態において、発現制御配列は１つ以上のエンハンサーを含む。一実施形態では、トランスサイレチン（ｅｎＴＴＲ）（トランスサイレチンからの１００ｂｐエンハンサー配列）が含まれる。この配列は、配列番号：５で示してある。Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２）：２８０－２８９，Ｆｅｂ．２００８を参照のこと。本文献は本明細書中で参照により援用されている。別の実施形態では、配列番号４に示すＥｎ３４エンハンサー（ヒトアポリポタンパク質肝制御領域からの３４ｂｐコアエンハンサー）が含まれる。更に別の実施形態において、ＡＢＰＳ（α１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体［ＡＢＰ］から４２ｂｐへの１００ｂｐ遠位エンハンサーの短縮バージョン）エンハンサーが含まれる。そのような配列を、配列番号：６に示す。別の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。そのような組み合わせとしては、２コピー以上の任意のエンハンサー、本明細書に記載されている、及び／または２つ以上のエンハンサーを挙げることができる。様々な実施形態において、エンハンサーは以下の組み合わせのうちの１つに存在する。

一実施形態において、エンハンサーは、以下の配列：５’－ＥｎＴＴＲ－ＡＢＰＳ－Ｅｎ３４－プロモーター－３’内で結合される。別の実施形態において、エンハンサーは、以下の配列：５’－プロモーター－ＥｎＴＴＲ－ＡＢＰＳ－Ｅｎ３４－３’内で結合される。一実施形態において、発現制御配列はｅｎＴＴＲを含む。別の実施形態において、発現制御配列は、ＡＢＰＳの２つのコピーとｅｎＴＴＲの１つのコピーとを含む。プロモーターに加えて、発現カセット及び／またはベクターは、他の適切な転写開始、転写終結、
エンハンサー配列、ならびに効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含みうる。そのような配列は、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率（すなわち、コザックコンセンサス配列）を増強する配列；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。一実施形態では、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを取り入れることによって、ｈＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの転写終結が媒介される。本明細書において有用なポリＡシグナルは、約７５ｂｐサイズが、（ＰＡ７５）配列番号：１０に示す人工ポリＡである。他の適切なポリＡ配列の実施例としては、例えば、数ある中でも、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、ウサギベータグロビン、及びＴＫポリＡが挙げられる。

一実施形態において、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、約５～約５．５キロベースサイズになるように調節配列が選択される。別の実施形態において、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、約５．１ｋｂサイズになるように調節配列が選択される。別の実施形態において、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、約５．２ｋｂサイズになるように調節配列が選択される。別の実施形態において、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、５ｋｂサイズ未満である。一実施形態においてベクターゲノムは配列番号：１３のｎｔ１～ｎｔ５１１０であり、実施形態においてベクターゲノムは配列番号：１４のｎｔ１～ｎｔ５１９４であり、一実施形態においてベクターゲノムは配列番号：１５のｎｔ１～ｎｔ５１３８であり、別の実施形態において、ベクターゲノムは配列番号：１６のｎｔ１～ｎｔ５２２２である。

５．１．２．ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ製剤
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、水性担体、賦形剤、希釈剤または緩衝剤を含む医薬組成物中に提供される。一実施形態において、緩衝剤はＰＢＳである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ製剤は、０．００１％プルロニックＦ－６８のＴＭＮ２００（２００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）溶液を含有する水溶液中に懸濁させた、有効量のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターを含有する懸濁液である。その一方で、様々な好適な溶液が公知となっており、例えば、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）に等しいイオン強度に調整された生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性の塩または塩類の混合物、あるいは、塩化ナトリウム、または同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものが挙げられる。
例えば、本明細書中に提供されている懸濁液は、ＮａＣｌ及びＫＣｌの両方を含有しうる。ｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲内でありうる。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、つまりポリオキシエチレン（ポリエチレンオキシド）の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなるノニオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（ヒドロキシステアリン酸マクロゴール１５）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリリックグリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールのなかから選択できる。一実施形態において、製剤にはポロキサマーが含有されている。これらのコポリマーは一般的に、英字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）で始まり、その後に３桁の数字が続く。最初の２桁×１００はポリオキシプロピレンコアの分子量の概算を示し、最後の桁×１０はポリオキシエチレン含有率を示す。一実施形態において、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液中に最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在しうる。別の実施形態において、ベクターを、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．００１％ポロキサマー１８８（ｐＨ７．３）を含有する水溶液中に懸濁させる。

一実施形態において、本製剤は、はヒト被験者における使用に好適であり、静脈内投与される。一実施形態において、本製剤は、ボーラス注射により末梢静脈経由で送達される
。一実施形態において、本製剤は、約１０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。一実施形態において、本製剤は、約９０分（±１０分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約２０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約３０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約４０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約５０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約６０分（±５分）間の注入によって末梢静脈（１５ ａ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖｅｉｎ）経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約７０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。別の実施形態において、本製剤は、約８０分（±５分）間の注入によって末梢静脈経由で送達される。ただし、この時間は、必要に応じてまたは所望される場合、調整可能である。任意の好適な方法または経路を使用して、本明細書に記載のＡＡＶ含有組成物を投与することができ、任意選択的に、本明細書に記載のｈＦＶＩＩＩのＡＡＶ媒介性送達と併せて、他の活性薬物または療法を共投与する。投与経路には、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路が含まれる。

一実施形態において、本製剤は、例えば、約１．０×１０^１１ゲノムコピー／患者体重１キログラム（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ゲノムコピー／患者体重１キログラム（ＧＣ／ｋｇ）～約３×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇを含有する（例えば、本明細書中で参照により援用されているＭ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４に記載されているようなｏｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）で測定された場合）。一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ製剤は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ（上記）に記載されているｏｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）で測定される、少なくとも１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ以上を含有する懸濁液である。

患者に投与されるＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩの用量から中空カプシドが確実に除去されるように、ベクター精製プロセス中に（例えば、本明細書で考察している方法を用い）、例えば本明細書に記載の方法を用いてベクター粒子から中空カプシドを分離する。一実施形態において、本明細書中で参照により援用されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６６０１３号（２０１６年１２月９日出願）及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ．１０」と題する米国特許出願第６２／３２２，０５５号（２０１６年４月１３日出願）に記載されているプロセスを用いてパッケージングされたゲノムを含有するベクター粒子を中空カプシドから精製する。概略説明すると、ｒＡＡＶ産生細胞培養の精製濃縮上清からゲノム含有ｒＡＡＶベクター粒子を選択的に捕捉して単離することの、２工程からなる精製スキームが記載されている。このプロセスは、高い塩濃度で実施された親和性捕捉法、続いて高ｐＨで行われるアニオン交換樹脂法を利用して、ｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子を提供する。同様の精製方法を、ＡＡＶｈｕ．３７ベースのベクターに対しても使用できる。他の精製方法は、例えば、米国特許出願第６２／２６６，３４７号、同第６２／２６６，３５７号、同第６２／３２２，０７１号、同第６２／２６６，３５１号、同第６２／３２２，０８３号、同第６２／２６６，３４１号、及び同第６２／３２２，０９８号に記載されている。これらの文献はそれぞれ本明細書中で参照により援用されている。

任意に従来の製造プロセスを利用できるが、本明細書（及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６６０１３号）に記載されているプロセスでは、５０～７０％の粒子がベクターゲノム、すなわち５０～７０％の完全な粒子を有するベクター製剤が産生される。
故に、例示的な用量の１．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、及び総粒子用量は、２．３×１０^１２～３×１０^１２の粒子となる。別の実施形態において、推奨用量は、１／２ ｌｏｇ超、または５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、総粒子用量は７．６×１０^１２～１．１×１０^１３粒子となる。一実施形態において、本製剤は、「中空」ないし「完全」のｒＡＡＶストックが、１以下、好ましくは０．７５未満、より好ましくは０．５、好ましくは０．３未満の比率を有することにより特徴づけられる。

概略説明すると、一実施形態において、組み換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む混合物を高速液体クロマトグラフィーにかけることを含む、ＡＡＶカプシド中間体からＡＡＶウイルス粒子を分離する方法であって、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ中間体を、ｐＨ約１０．０にて平衡化された陰イオン交換樹脂に結合させ、塩勾配にかけながら、約２６０及び約２８０の紫外吸光度で溶出液をモニターし、Ａ２６０／Ａ２８０の比率が変曲点に達したときに溶出する画分からＡＡＶフルカプシドを採取する方法が提供される。

一実施形態において、本方法は、（ａ）組み換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体と、２０ｍＭ～５０ｍＭのビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）とｐＨ約１０．０の緩衝液Ａとを含む懸濁液を混合することと、（ｂ）（ａ）の懸濁液を強陰イオン交換樹脂カラムに充填することと、（ｃ）充填された陰イオン交換樹脂を、ＮａＣｌイオン強度が１０ｍＭ～４０ｍＭである塩とｐＨが約１０．０であるＢＴＰとを含む緩衝液１％Ｂで洗浄することと、（ｄ）約１０ｍＭ～約４０ｍＭのＮａＣｌの当量に等しい塩濃度を上昇させた勾配を、充填し洗浄した陰イオン交換樹脂に適用することと、（ｅ）少なくとも７０ｍＭのＮａＣｌに等しい塩濃度で得られた溶離液からｒＡＡＶ粒子を採取すること、を更に含む。一実施形態において、これはゲノムコピーによって決定される。

一実施形態において、中間体は、塩濃度が約５０ｍＭ ＮａＣｌより大きい等価物である場合に陰イオン交換樹脂から溶出される。更に別の実施形態では、緩衝液Ｂを形成または調製するために、緩衝液ＡをＮａＣｌと最終濃度１Ｍに更に混合する。更に別の実施形態において、塩勾配のイオン強度は、１０ｍＭ～約１９０ｍＭのＮａＣｌに等しい。溶出勾配は、１％緩衝液Ｂ～約１９％緩衝液Ｂであってもよい。任意に選択的に、陰イオン交換樹脂を含む容器はモノリスカラムであり、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ及び塩勾配は約６０カラム容量である。ｒＡＡＶ粒子のストックまたは製剤（パッケージされたゲノム）は、ＡＡＶ中空カプシド（及び他の中間体）を「実質的に含まない」、ストック中のｒＡＡＶ粒子が、ストック中のｒＡＡＶの少なくとも約７５％～約１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも９９％であり、且つ「中空カプシド」が、ストックまたは製剤中のｒＡＡＶの約１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満である。

更なる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の平均収率は少なくとも約７０％である。これは、カラムに充填された混合物中の力価（ゲノムコピー）、及び最終溶離液中の存在量を定量することによって計算できる。更に、これらは、ｑ－ＰＣＲ分析、及び／または本明細書に記載のものなどのＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術、あるいは当該技術分野において記載されてきたものに基づいて定量できる。例えば、中空及びフル粒子内容を計算し、選択されたサンプルに対するＶＰ３バンドボリューム（例えば、ＧＣの数＝粒子の数であるイオジキサノール勾配精製調製）を、充填されたＧＣ粒子に対してプロットする。結果として得られた一次方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物のピークのバンド容積中の粒子の数を計算する。次いで、充填された２０μＬ当りの粒子数（ｐｔ）に５０を乗じて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを与える。ＧＣ／ｍＬで除算されたＰｔ／ｍＬは、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を与える。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、中空ｐｔ／ｍＬを与える。ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割った中空ｐｔ／ｍＬ×１００は、中空粒子の割合を示す。

概して、パッケージされたゲノムを有する中空カプシド及びＡＡＶベクター粒子についてアッセイするための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｇｒｉｍｍ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照のこと。変性カプシドを試験するため、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離できる任意のゲル（例えば３～８％トリス－アセテート含有の勾配ゲルを緩衝液中に溶かした溶液）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いで、サンプル材料が分離されるまでゲルを流し、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロン上にゲルを吸い取ることを含む。次いで、変性カプシドタンパク質、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として、抗ＡＡＶカプシド抗体を使用する（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、二次抗体を使用する。この二次抗体は、一次抗体に結合し、且つ一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体であり、より好ましくはその次抗体に共有結合した検出分子であり、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体である。一次抗体と二次抗体との結合を半定量的に算定するために、結合を検出する方法を使用する。本方法は、好ましくは放射性同位体放出、電磁放射、または比色変化を検出できる検出方法であり、最も好ましくは化学発光検出キットである例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラム画分から試料を採取し、還元剤（例えばＤＴＴ）とカプシドタンパク質とを含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中で加熱して、プレキャストグラジエントポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で分離させる。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を製造元の指示に従って用い、シルバー染色を行うことができる。一実施形態において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）で測定できる。試料を希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化して、外因性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼが不活性化された後、プライマーとプライマー間とのＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用い、サンプルを更に希釈して増幅する。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで、定義済の蛍光レベル（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要なサイクル数を、サンプルごとに測定する。ＡＡＶベクターに含有されているものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用い、Ｑ－ＰＣＲ反応で標準曲線を生成する。サンプルから得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用い、プラスミド標準曲線のＣｔ値に正規化することによって、ベクターゲノム力価を算出する。デジタルＰＣＲベースの評価項目アッセイも使用できる。

一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ製の市販品など）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ法が、本明細書中に提供されている。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは標準アッセイと類似している。異なる点は、ＤＮアーゼＩ消化後、サンプルをプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理した後に熱失活させることである。試料を、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈するのが、好適である。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮してもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変化させることができる。処理工程は、約５５℃で約１５分間行うのが一般的であるが、低温（例えば、約３７℃～約５０℃）で長時間（例えば、約２０分～約３０分間）行うこともできるし、または高温（例えば、約６０℃まで）で短時間（例えば、約５～１０分間）行うこともできる。同様に、熱不活性化は、約９５℃で約１５分間行うのが一般的であるが、低温（例えば、約７０℃～約９０℃）で長時間（例えば、約２０分～約３０分間）かけて行うこともできる。次いで、サンプルを希釈し（例えば、１０００倍）、標準アッセイに記載されているようにしてＴ
ａｑＭａｎ解析にかける。

加えて、または代替的に、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補的ＡＡＶベクターゲノム力価を定量するための方法が、記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照のこと。

５．１．３製造
ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、図１３に示す製造工程図に図示されているように製造できる。概略説明すると、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）は好適な細胞培養系で増殖され、ベクター生成用にトランスフェクトされる。次いで、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターを収穫し、濃縮し、精製してバルクベクターを調製でき、続いて、この製剤を下流プロセスで充填して仕上げることができる。

本明細書に記載されている遺伝子療法ベクターの製造方法としては、当該分技術野において周知の方法（例えば、遺伝子療法ベクター、ベクターの生成、及びベクター精製の生産に使用されるプラスミドＤＮＡの生成）が挙げられる。一部の実施形態において、遺伝子療法ベクターはＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び関心のある遺伝子をコードするＡＡＶシスプラズマ、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスとしては、細胞培養の開始、細胞の通過、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、無血清培地へのトランスフェクション後の培地交換、ならびにベクター含有細胞の回収及び培養培地などの方法工程を挙げることができる。収穫されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書において粗細胞収穫と呼ばれる。その後の粗細胞収穫物としては、ベクター収穫物の濃縮、ベクター収穫物の透析濾過、ベクター収穫物のミクロ流動化、ベクター収穫物のヌクレアーゼ消化、ミクロ流動化中間物の濾過、クロマトグラフィーによる精製、超遠心分離による精製、タンジェント流濾過による緩衝液交換、ならびに調合及び濾過によるバルクベクターの調製などの方法工程が挙げられる。

一実施形態において産生プラスミドは、配列番号：１３に示すとおりであり、一実施形態において産生プラスミドは配列番号：１４に示すとおりであり、一実施形態において産生プラスミドは配列番号：１５に示すとおりであり、別の実施形態において産生プラスミドは配列番号：１６に示すとおりである。特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターの製造に使用される方法は、以下の第８節に記載されている。

５．２患者集団
重篤または中等度の血友病Ａ（ＨｅｍＡ）患者は、幾つかの理由から選択された研究集団である。重篤な血友病Ａ患者は、通常の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性が１％に満たないと定義されている。したがって、出血性素因を制御するにはＦＶＩＩＩを頻繁に注入する必要がある。これは、通常の生活を維持する上で有意な負担となり、しかも、血中ＦＶＩＩＩレベルが周知のピーク及びトラフパターンを経るが、これは至適ではない。重篤な患者の血中ＦＶＩＩＩ濃度が１％未満であるという事実は、ｒＡＡＶ．ｈＶＩＩＩを投与した後の血中ＦＶＩＩＩレベルの低～中等度の上昇でさえも確実に測定することを可能にしている。最近の臨床試験はこのアプローチの妥当性を裏付けている。中程度のＨｅｍＡ患者は、血中ＦＶＩＩＩレベルが１％～最高５％であると定義される。

治療の候補である患者は、好ましくは、中等度／重篤または重篤な血友病Ａと診断され
た１８歳以上の成人男性である。一実施形態において、患者のベースラインＦＶＩＩＩ活性は、通常または記録済既往歴の２％以下である。一部の実施形態において、１８歳未満の年齢の患者を治療できる。治療の候補者としては、ＦＶＩＩＩでのオンデマンド治療を必要とし、１年に少なくとも３回の出血エピソードがある被験者が挙げられる。他の治療の候補には、ＦＶＩＩＩの予防レジメンで治療される被験者が含まれる。被験者が治療対象として好適であることを示す他の基準は、ＦＶＩＩＩに対する曝露歴が少なくとも１００日間であること、外因性ＦＶＩＩＩに対する阻害剤（中和抗体）の既往歴のないこと、外因性ＦＶＩＩＩまたはｒＡＡＶ．ＦＶＩＩＩベクター組成物の任意成分に対する既知のアレルギー反応がないことである。

血友病Ａ患者は、治療に先立って、ｈＦＶＩＩＩ遺伝子を送達する目的に使用されるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｈｕ．３７またはＡＡＶｒｈ．１０）に対するＮＡｂについて評価する必要がある。そのようなＮＡｂは形質導入の効率を妨げ、治療の効能を低下させてしまう恐れがある。血友病Ａ基準の血清ＮＡｂ力価が１：５以下である患者は、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ遺伝子療法プロトコールを用いた治療の対象としてふさわしい候補者である。被験者は、診療医の裁量により、遺伝子療法による治療に先立って及び同時に、標準ケア療法（複数可）（例えば、組み換えＦＶＩＩＩ療法）を継続できる。代わりに、医師は、遺伝子療法治療剤投与に先立って標準ケア療法を中止し、任意選択的に、遺伝子治療剤投与後の併用療法として標準ケア療法を再開することを好む場合がある。

遺伝子療法レジメンの所望される評価項目は、ベースラインから遺伝子療法治療の投与後５２週までにＦＶＩＩＩ活性の正常値の３％まで増加させることである。一実施形態において、患者は、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩでの治療後に、単独で且つ／あるいは補助治療法と併用して、循環ＦＶＩＩＩレベル（例えば、５％またはこれらを上回る割合）を達成する。別の実施形態において、患者は、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩでの治療後に、単独で且つ／あるいは補助治療法と併用して、循環ＦＶＩＩＩレベル１０％、１５％、２０％またはこれらを上回る割合を達成する。別の実施形態において、患者は、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩでの治療後に、単独で且つ／あるいは補助治療法と併用して、循環ＦＶＩＩＩレベル２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９５％またはこれらを上回る割合を達成する。にもかかわらず、以下の特徴のうちの１つ以上に当てはまる患者は、診療医の裁量で治療の対象から除外される可能性がある。
１．有意な肝疾患（すなわち、門脈圧亢進症）の既往歴があること。
２．有意な肝炎または肝硬変。
３．活動性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した証拠があること。
４．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の既往歴があること、且つ以下のいずれかに該当すること：
ＣＤ４＋細胞計数＜３５０細胞／ｍｍ^３、第０日目より６か月以内に抗レトロウイルス療法レジメンに変更が生じた場合、または血漿ウイルス負荷が２００コピー超／ｍｌ（２つの別々の機会にＰＣＲで測定された値）であった場合。
５．抗ＡＡＶｈｕ．３７（または抗ＡＡＶｒｈ１０、適宜に）中和抗体力価＞１：５または≧１：１０。
６．別の遺伝子療法研究への参加（現在または以前）
７．スクリーニングの３か月以内に別の治験薬の調査に参加。

他の実施形態において診療医は、下記の物理的特性（既往歴）のうちの１つ以上に該当する場合、本明細書中に提供されている治療を排除すべきでないと判定する場合がある。

５．３投薬、及び投与経路
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、患者１人当りの単回用量として送達される。別の実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、患者１人当りの複数回用量として送達される。更なる実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、患者１人当り２回用量として送達される。一実施形態では、被験者に対し、最小限の有効用量（ＭＥＤ）（すなわち、本明細書において実施例に記載の前臨床試験によって判別された用量）が送達される。本明細書において、ＭＥＤは、通常の第ＶＩＩＩ因子活性の５％を達成するために必要なｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ用量を指す。

従来のように、ベクター力価が、ベクター製剤のＤＮＡ含量に基づいて定量される。一実施形態において、実施例に記載の定量ＰＣＲまたは最適化定量ＰＣＲを用いて、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクター製剤のＤＮＡ含量を定量する。一実施形態では実施例に記載のデジタル液滴ＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクター製剤のＤＮＡ含量を定量する。一実施形態において、投薬量は、約１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／体重１キログラム～約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ（評価項目を含む）である。一実施形態において、投薬量は、５×１０^１１ＧＣ／ｋｇである。別の実施形態において、投薬量は、５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。特定の実施形態において、患者に投与されたｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩの用量は、少なくとも５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、２．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、７．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、または７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。また、複製欠損ウイルス組成物を、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲の複製欠損ウイルス量を含有する投与量単位で調合できる。本明細書において、「投薬量」という用語は、治療の過程で被験者に送達された総投薬量、または単回（複数回のうちの）投与で送達された量を指す場合がある。

別の実施形態では、組成物を後日再投与する。任意選択的に、１回を超える再投与を行うことが可能である。そのような再投与は、本明細書中に記載されているのと同じタイプのベクターまたは異なるウイルスベクターでありうる。一実施形態では、第１の投与後約６か月目に、ベクターを再投与する。別の実施形態では、第１の投与後約１年目に、ベクターを再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約２年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約３年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約４年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約５年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約６年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約７年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約８年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約９年目に再投与する。別の実施形態では、ベクターを第１の投与後約１０年以上経過してから再投与する。

一実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の１％まで上昇させるのに十分である。一実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の２％まで上昇させるのに十分である。一実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の３％まで上昇させるのに十分である。別の実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の４％まで上昇させるのに十分である。別の実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の５％まで上昇させるのに十分である。別の実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはこれらを上回る割合まで上昇させるのに十分である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩは、組み換えＦＶＩＩＩの投与のような、血友病Ａ治療用のうちの１つ以上の療法と併用投与される。

５．４臨床目標の測定
治療の効能の測定は、血漿第ＶＩＩＩ因子のレベル及び第ＶＩＩＩ因子の活性によって定量された導入遺伝子の発現及び活性を基準に、測定できる。効能に対する更なるアセスメントは、置換第ＶＩＩＩ因子の要件及び自発的な出血エピソードの頻度の臨床的アセスメントによって算定できる。そのようなアセスメントは、製品の投与後４週間、週２回、第６週から第１２週まで毎週、第１年の残りの期間にわたって毎月、及び６か月の間隔で合計５年間実施できる。投与後の遺伝子療法ベクターの安全性は、有害事象の数、身体検査の際に書き留められた変化、及び／またはベクター投与後約５２週間までの複数の時点で評価された臨床ラボパラメーターによって評価することが可能である。生理学的効果は早期に（例えば約１週間で）観察される場合があるが、一実施形態において、定常状態レベルの発現レベルには約１２週間で達する。以下のアセスメントは、製品投与後の４週間にわたって週２回、第６週目から第１２週目まで毎週、第１年目の残りの期間にわたって毎月、及び合計５年間にわたって６か月間隔で、実施される場合がある。そのようなアセスメントとしては、以下が挙げられる。
ａ．身体検査
ｂ．ＥＣＧ
ｃ．生化学アセスメント：血清電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、カルシウム、リン酸塩、総タンパク質、アルブミン、ＬＤＨ、ＣＰＫ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ビリルビン
ｄ．血液学的アセスメント：ＣＢＣ、及び差次的な凝固プロファイル
ｅ．尿検査
ｆ．免疫学的アセスメント：
ｇ．ｈｕ．３７カプシド（またはｒｈ．１０カプシド、適宜に）及び第ＶＩＩＩ因子に対する血清学的応答。
ｈ．ｈｕ．３７カプシド（または、適宜にｒｈ．１０カプシド）及び第ＶＩＩＩ因子抗原に対するＴ細胞応答。
ｉ．ベクターＤＮＡのアセスメント；血漿、尿及び唾液中のｑＰＣＲ測定。

ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ投与で達成されるｈＦＶＩＩＩの増加は、血友病Ａに罹患していない患者のｈＦＶＩＩＩレベルと比較して、約１２週間または他の所望の時点でのｈＦＶＩＩＩの定義されたパーセント変化、すなわち、いわゆる約１００％の通常ｈＦＶＩＩＩレベルとして評価できる。別の実施形態において、その変化を患者のベースラインｈＦＶＩＩＩレベルと比較する。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の３％まで上昇させる程度の効能が所望される。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の４％まで上昇させる程度の効能が所望される。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の５％まで上昇させる程度の効能が所望される。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の６％まで上昇させる程度の効能が所望される。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の７％まで上昇させる程度の効能が所望される。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の８％まで上昇させる程度の効能が所望される。一実施形態では、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の９％まで上昇させる程度の効能が所望される。別の実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の１０％まで上昇させるのに十分である。別の実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の１５％まで上昇させるのに十分である。別の実施形態において、投薬量は、患者における第ＶＩＩＩ因子のレベルを通常の２０％またはこれらを上回る割合まで上昇させるのに十分である。一実施形態において、凝固パネルは、ＦＶＩ
ＩＩ活性を推測するための標準試験の一部として実施される。

本明細書において、本明細書中のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、患者がこれらの臨床的評価項目のうちの少なくとも１つを達成するのに十分なレベルのＦＶＩＩＩを発現する場合、患者の欠損のあるＦＶＩＩＩを活性なＦＶＩＩＩで「機能的に置換」または「機能的に補充する」。ｈＦＶＩＩＩの発現レベルが、非血友病患者における通常の野生型臨床評価項目レベルである最小約１％～１００％未満を達成するレベルであれば、機能的置換を行うことが可能である。一実施形態において、投薬後早くも約８時間～約２４時間発現が観察される場合がある。上記の所望される臨床効果のうちの１つ以上は、投薬後数日から数週間以内に観察される場合がある。

長期間（最大２６０週間）の安全性と効能は、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ投与後に評価できる。一態様において、ｈＦＶＩＩＩ遺伝子産物をヒト患者に送達するためのレジメンが提供される。本レジメンは、（ａ）本明細書に記載されている発現カセットを含む第１のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターを送達することと、（ｂ）本明細書に記載されている発現カセットを含む第２のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターを送達することと、を含み、第１の組み換えＡＡＶベクターまたは第２のＡＡＶベクターがＡＡＶ３Ｂカプシドを有する。ＡＡＶ３Ｂの配列を、配列番号：２０及び寄託番号ＡＡＢ９５４５２．１に示す。一実施形態では、第１または第２のＡＡＶベクターのうちの他方が、ｒｈ．１０カプシドを有する。別の実施形態では、第１または第２のＡＡＶベクターのうちの他方が、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドを有する。そのようなレジメンは国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２４７２号に記載されており、本文献は本明細書中で参照により援用されている。本明細書に記載されているウイルスベクターは、ｈＦＶＩＩＩを、それを必要とする被験者（例えば、ヒト患者）に送達し、被験者に機能性ｈＦＶＩＩＩを供給し、且つ／あるいは血友病Ａの疾患を治療するための医薬の調製に使用できる。

別の態様において、本明細書に記載されているｒＡＡＶ．ｈＦＩＩＩベクターは、血友病Ａの治療に用いる目的に提供される。一実施形態において、血友病Ａの治療に使用するための複数の用量が提供される。別の態様において、本明細書に記載されているｒＡＡＶ．ｈＦＩＩＩベクターは、血友病Ａを治療するための医薬製造用に提供される。
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターの第２の投与を行う。一実施形態において、第２の投与のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、第１の投薬量で供給されたのと同じＡＡＶカプシドを有する。一実施形態において、第２の投与のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドを有する。別の実施形態では、第２の投与のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、第１の用量のベクターとして別のＡＡＶカプシドを有する。一実施形態では、第２の投与のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは肝臓に対し向性を有する。一実施形態では、第２の投与のｒＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩベクターは、ＡＡＶ３Ｂカプシドを有する。更なる態様において、本発明は、患者の肝細胞を標的とすることを含む。一態様において、第１のｒＡＡＶ及び第２のｒＡＡＶの送達は、少なくとも約１か月間、少なくとも約３か月間、または約１年～約１０年間、時間的に分離されている。

下記の実施例は、専ら例証を目的としたものであって、本発明を限定することを意図したものではない。

６．実施例１：前臨床試験
６．１ ｈＦＶＩＩＩベクター
ヒト第ＦＩＸ因子（ｈＦＩＸ）とは異なり、ｈＦＶＩＩＩのｃＤＮＡは、はるかに大きく、この導入遺伝子を標準的なＡＡＶゲノムに適合させるために、調整を行う必要がある
。Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子が、１４５７アミノ酸であり、他の転写に必要なエレメントを含めると、ＡＡＶベクターは依然として、充填容量の限界にある。それ故、導入遺伝子発現制御エレメントを含む他のエレメントのサイズを低減させるステップがとられている。

エレメントのサイズを可能な限り小さく保ちながら、ｈＦＶＩＩＩの発現を肝臓に限定するために、いくつかの強力な肝臓特異的プロモーターを、短くし、多くとも３つの肝臓特異的エンハンサー配列の組み合わせと結合させて、４２のエンハンサー／プロモーターの組み合わせを得た。導入遺伝子のｈＦＶＩＩＩ活性及び免疫原性を、ＡＡＶベクターの投与後のＦＶＩＩＩ ＫＯマウスで評価した。

６．１．１ 前臨床試験のＡＡＶベクター作製
エンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの１つを含有する４２のプラスミドを作製した。３つのエンハンサー配列：Ｅｎ３４（ヒトアポリポタンパク質肝臓制御領域由来の３４ｂｐのコアエンハンサー）、ＡＢＰＳ（４２ｂｐまでのα１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体［ＡＢＰ］由来の短縮型の１００ｂｐの遠位エンハンサー）、及びＥｎＴＴＲ（トランスサイレチン由来の１００ｂｐエンハンサー配列）、を使用して、１４のエンハンサーの組み合わせを作製した。ＩＴＲ－ＩＴＲの合計サイズのために、次の配列：５’－ＥｎＴＴＲ－ＡＢＰＳ－Ｅｎ３４－プロモーター－３’におけるエンハンサーの組み合わせにより、エンハンサーの組み合わせの数を制限した。表１。１４のエンハンサーの組み合わせのそれぞれを、３つのプロモーター：ＴＢＧ－Ｓ１（Ｐ１、短縮型肝臓特異的チロキシン結合グロブリンまたはＴＢＧプロモーター）、Ａ１ＡＴ（Ｐ２、改変ＳＥＲＩＮＡ１［α１－抗トリプシン］プロモーター）、及びＴＴＲ（Ｐ３、トランスサイレチンプロモーター）、のうちの１つの上流に挿入した。Ｂドメインが欠失し、かつ短い１４アミノ酸リンカーで置換されるコドン最適化型ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質であるｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ（配列番号２）を発現するように、得られるコンストラクトを設計した。

参照により本明細書に組み込まれるＧａｏ Ｇ，Ｌｕ Ｙ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，ｅｔ
ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６；１３（１）：７７－８７に記載されているように、全てのＡＡＶベクターを作製した。要約すると、４２のエンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの１つからｈＦＶＩＩＩを発現するプラスミドを、ＡＡＶｒｈ１０ウイルスカプシドでパッケージングした。ｈＦＶＩＩＩをＥ０６．ＴＴＲから発現するプラスミドもまた、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３７、及びＡＡＶｒｈ６４Ｒ１ウイルスカプシドにパッケージングした。

６．１．２ ベクターのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
参照により本明細書に組み込まれるＬｏｃｋ Ｍ，Ａｌｖｉｒａ Ｍ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－１２７１に記載されるように、本研究で使用されたＡＡＶｒｈ１０エンハンサー／プロモーターの組み合わせベクターロットを、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動による純度評価にかけた。要約すると、５×１０^９ＧＣを含有する変性及び還元ベクター試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。タンパク質を、固定後に、ＳＹＰＲＯルビー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）により染色し、視覚化し、次に、Ｓｙｎｇｅｎｅイメージング解析システム及びＧｅｎｅＴｏｏｌソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ、メリ
ーランド州フレデリック）を使用して定量化した。カプシドのパーセント純度（総タンパク質に対して示されるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質）を計算した。４２のベクターの純度百分率は、２９％（ＡＡＶｒｈ１０．Ｅ１２．Ｐ３）から１００％の範囲であり、平均純度は、９０％であった（データを示さない）。

６．１．３ マウス
ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの繁殖ペアを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メイン州バーハーバー）から入手し、コロニーを、特定の病原体を含まない条件下で、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ’ｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで維持した。全ての動物の手順及びプロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ
Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより承認された。６～１２週齢の雄のＦＶＩＩＩ ＫＯの尾静脈に、マウス１匹当たり１０^１０ＧＣのベクターをＩＶ注射した。ベクターを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、１００μｌのベクター希釈液を注射した。血漿を、隔週で後眼窩静脈叢から、クエン酸ナトリウム収集チューブに収集した。

６．１．４ ｈＦＶＩＩＩ活性の測定
製造者（ＤｉａＰｈａｒｍａ、米国オハイオ州）のプロトコールに従い、ＣＯＡＴＥＳＴ ＳＰ４キットにより、血漿中のｈＦＶＩＩＩ活性を測定した。注入の２週後に、マウスは、０．１２～２．１２ＩＵ／ｍｌのｈＦＶＩＩＩ活性の幅広さを示した（図５）。

５つのコンストラクトは、他のもの；Ｅ０３．ＴＴＲ、Ｅ０５．Ａ１ＡＴ、Ｅ０５．ＴＴＲ、Ｅ０６．ＴＴＲ、及びＥ１２．Ａ１ＡＴより有意に増加した活性レベルを実証した（図５Ａ）。２週目に見られたｈＦＶＩＩＩ活性レベルの変動は、導入遺伝子の抗体が生成される前にあった（図５Ｂ）。したがって、活性レベルには、コンストラクトに応じた有意差があった。

６．１．５ マウス血漿中の抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧの検出
マウス血漿中のｈＦＶＩＩＩに対するＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡで測定し、全ての試薬は、別途記載のない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）製であった。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌのＢＤＤ－ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ（Ｘｙｎｔｈａ、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、米国テキサス州ダラス）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の５％の無脂肪乳（Ｂｉｏ Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ヘラクレス）でブロックした。ブロッキング緩衝液を除去した後、５％の無脂肪乳に希釈した血漿試料を、プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ナイーブマウス由来の血漿試料を、対照として使用した。次に、プレートを５回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧを、無脂肪乳中１：１０００希釈で添加した。室温で９０分間インキュベートした後、プレートを、８回洗浄し、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、検出のために添加した。２Ｎの硫酸を使用して、反応を室温で５分後に停止し、ＢｉｏＴｅｋのμＱｕａｎｔプレートリーダー（米国バーモント州ウィノスキー）を使用して、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。

ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスは、ベクター投与後４週目に、ｈＦＶＩＩＩの抗体生成を示し、８週目までに、４２のベクター群の大部分のマウスは、検出可能な抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧレベルを有しており、ｈＦＶＩＩＩ活性レベルの対応する減少があった（図６）。力価で定量化されたｈＦＶＩＩＩ活性及び抗体生成の時間経過はそれぞれ、図７及び８に示される。コンストラクトＥ０５．Ａ１ＡＴ、Ｅ１０．Ａ１ＡＴ、及び、Ｅ０６エンハンサ
ーの組み合わせを有する全てのプロモーター、を注射したマウスの５０％超が、８週目までに導入遺伝子の抗体を有していた。しかし、導入遺伝子の抗体は、全ての群で見られなかった。４２のベクター群のうちの６つ（Ｅ１１．ＴＴＲ、Ｅ１３．ＴＢＧ－Ｓ１、Ｅ１３．Ａ１ＡＴ、及び、Ｅ０１を使用する全てのコンストラクト）の場合、ｈＦＶＩＩＩ抗体は、８週目では検出されず（図６）、２つの群は、１２週間の研究期間を通して検出可能な抗体を有さなかった（Ｅ０１．Ａ１ＡＴ及びＥ１１．ＴＴＲ）。ｈＦＶＩＩＩの抗体の生成についての時間事象解析も実施した。発現のためにＥ０１．Ａ１ＡＴ、Ｅ１１．ＴＴＲ、Ｅ０１．ＴＢＧ－Ｓ１、Ｅ１１．Ａ１ＡＴ、及びＥ１３．ＴＢＧ－Ｓ１を使用したベクターを注射したマウスは、抗体発現までの時間が最も長かったが、Ｅ０６．ＴＴＲ、Ｅ０６．Ａ１ＡＴ、Ｅ０５．Ａ１ＡＴ、Ｅ０９．ＴＢＧ－Ｓ１、及びＥ１４．ＴＴＲを含有するコンストラクトは、抗体発現までの時間が最も短かった。

６．１．６ 統計分析
２週目の血漿中のｈＦＶＩＩＩ活性に従い、類似の処置群を同定するために、Ｔｕｋｅｙ事後試験を用いる単一固定因子ＡＮＯＶＡモデルを使用してデータを解析して、互いに異なる平均活性レベルの群を同定した。ｈＦＶＩＩＩの抗体の生成についての時間事象解析を実施した。

６．１．９ 様々なＡＡＶカプシドによる活性及び免疫原性の比較
次に、活性レベルの差異を測定し、使用したＡＡＶカプシドによる免疫原性への潜在的な寄与を確認した。本研究では、以前の研究から、最も免疫原性の高いゲノムを選択した（Ｅ０６．ＴＴＲ）。興味深いことに、このコンストラクトは、２週目に他のコンストラクトの大部分よりも有意に高い発現を生じたが、次の数週間で、注射したマウスの８０％で、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子の抗体が生成された。

Ｅ０６エンハンサーの肝臓特異的ＴＴＲプロモーターとの組み合わせを使用する同じベクターゲノムを、５つのＡＡＶカプシド：ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３７、及びＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、のうちの１つでパッケージングした。再度、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに、マウス１匹当たり１０^１０ＧＣの用量で静脈内注射し、血漿ｈＦＶＩＩＩ活性レベル及び抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ力価を、１２週間の研究を通して追跡した。遺伝子導入に使用されたＡＡＶベクターを基準にした、導入遺伝子の発現及び免疫原性におけるＳｔａｒｋの差異が見られた（図９）。ベクター投与後２週目に、血漿中のｈＦＶＩＩＩ活性は、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１投与後の０．５１ＩＵ／ｍｌから、ＡＡＶｒｈ１０の１．２６ＩＵ／ｍｌまで変動した（図９Ａ）。研究の経過中、マウスのうちのいくつかは、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体を生成し、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターが投与されたマウスの２０％から、ＡＡＶｒｈ１０が投与されたマウスの６３％までの範囲に及ぶ（図９Ｂ）。それ故、高い免疫原性のエンハンサー及びプロモーターの組み合わせでさえ、導入遺伝子に対する免疫応答は、遺伝子導入に使用されたＡＡＶカプシドに基づいて変動する可能性がある。

６．１．１０ 考察
ＨＬＰプロモーターが発現のために使用されたＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおける以前の研究は、研究期間を通して、導入遺伝子の抗体を検出しなかった。ＨＬＰプロモーター配列は、Ｅ０１．Ａ１ＡＴエンハンサー／プロモーターの組み合わせと類似しており、このＡＡＶｒｈ１０ベクターが投与されたマウスは、１２週間の研究期間を通して、検出可能な抗体を有していなかった。残念ながら、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスにおけるこのベクターによる活性は、比較的低く、ベクター投与後２週目の血漿中で検出可能なわずか０．１８９ＩＵ／ｍｌ及び６週目の０．３０３ＩＵ／ｍｌのピークレベルを有した。

興味深いことに、同じ導入遺伝子カセットの遺伝子導入に使用されたＡＡＶカプシドは
、ｈＦＶＩＩＩＩに対する免疫原性及びピークｈＦＶＩＩＩ活性の両方に著しく影響した。カプシドが抗ｈＦＶＩＩＩ抗体の生成に及ぼす影響を研究するために、最も免疫原性の高い導入遺伝子カセットを使用した（Ｅ０６．ＴＴＲ）。試験した５つのベクターカプシドは、２つのグループに分けることができた；それらは、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体を生成したマウスの２０％以下であり（ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）、それらは、体液性免疫反応を生じたマウスの２０％を超えた（ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、及びＡＡＶｒｈ６４Ｒ１）。ＡＡＶ８カプシドと組み合わされるｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子に対する免疫寛容は、このカプシドのＩＶ送達が肝臓の免疫寛容性との関連で導入遺伝子特異的制御性Ｔ細胞を活性化し得ることを実証する以前の研究があるために、おそらく驚くに足らない。加えて、以前に、本発明者らは、ＡＡＶ８を血友病ＢマウスにＩＭ注射した後に、検出可能なＦＩＸインヒビターが存在しないことを示している。それ故、高い免疫原性のエンハンサー及びプロモーターの組み合わせでさえ、導入遺伝子に対する免疫応答は、遺伝子導入に使用されたＡＡＶカプシドに基づいて変動する可能性がある。

５つの異なるＡＡＶカプシドの投与後の血漿中のｈＦＶＩＩＩ活性レベルもまた、ベクター投与後２週目にＡＡＶｒｈ６４Ｒ１の０．５１ＩＵ／ｍｌから、ＡＡＶｒｈ１０の１．２６ＩＵ／ｍｌまで著しく変動した。ＡＡＶｒｈ１０ベクターからの発現は、ＡＡＶ８と比較して有意に上昇し、マウスの６３％における抗ｈＦＶＩＩＩ抗体の生成と一致した。免疫原性の高い導入遺伝子カセットを使用して、このカプシド比較研究を実施した。この研究はおそらく、ヒトに見られるものをモデル化せず、血友病Ａ患者の約３０％は、組換えタンパク質の抗体を生成する。それ故、ＡＡＶｒｈ１０ベクターの投与後に生じる高い発現レベルは、より低用量のベクターが、出血事象の発生率の著しい改善及び組換えｈＦＶＩＩＩタンパク質での補充に必要とされる臨床状況にとってより有益であり得る。

この研究結果から、Ｅ０３．ＴＴＲ（図１；配列番号１３）、Ｅ０３．Ａ１ＡＴ（図３；配列番号１５）、Ｅ１２．ＴＴＲ（図２、配列番号１４）、及びＥ１２．Ａ１ＡＴ（図４；配列番号１６）コンストラクトを、さらなる試験のために選択した。

６．２ 投薬量試験
６．２．１ ほぼ正確なＭＥＤに関する情報を与えるＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの研究
Ｃ５７ＢＬ／６及び１２９のバックグラウンドのＦＶＩＩＩ ＫＯマウスは、４つのベクター用量のうちの１つのＡＡＶｈｕ３７．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５の尾静脈注射を投与される。このようなベクター用量は、５×１０^１０ＧＣ／ｋｇ、５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、及び５×１０^１３ＧＣ／ｋｇである。対照物品のみ（ビヒクル緩衝液）を投与されている動物のコホートは、ビヒクル対照として含まれる。ベクター投与後、動物を、一般的な観察のために毎日監視する。ｈＦＶＩＩＩ活性レベルを捕捉するために、血液を、好適な時点で動物から収集する。部分集合Ａの動物を、投与後６０日目に死亡させ、部分集合Ｂの動物を、投与後２８日目に死亡させ、部分集合Ｃの動物を、投与後３日目に死亡させる。血清化学パネル及び血液学のための剖検時に、血液も収集する。死亡させた動物は剖検されることになる；器官、例えば、右鼠径リンパ節、右精巣、膵臓、十二指腸、結腸、脳、右腓腹筋、胃、右腎臓、右肺、脾臓、心臓、肝臓、及び、もしあれば、全体的な病変を、生体内分布及び組織病理学実験のために採取する。最高用量のベクターを投与されたマウス及び対照物を投与されたマウスに対して、全細胞ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出する。抽出されたＤＮＡ／ＲＮＡで、ｑＰＣＲ及びＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを実施して、器官のベクターゲノムコピー及び転写レベルをそれぞれ測定する。試験物品の有効性を、ＣＯＡＴＥＳＴアッセイによる血漿中のｈＦＶＩＩＩタンパク質活性レベルにより判定する。更に、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体を、抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイで監視し、凝固の外因系経路を、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイにより評価する。

６．３ 非ヒト霊長類における研究
６．３．１ ＮＨＰにおける発現研究
この非ＧＬＰ研究の第１の目的は、ＮＨＰにおける潜在的なベクター関連毒性及び生体内分布を評価することである。

雄のアカゲザル及びカニクイザルを、本研究に使用した。血友病Ａは、Ｘ連鎖遺伝性疾患であるので、雄の動物のみを、研究に使用した。全てのマカクは、研究の開始時に、以前に記載されたように（ＣＡＬＣＥＤＯ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ
ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｔｏ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１９９，３８１－９０）、測定された１：５未満のＮＡｂ力価を有した。ベクター投与の前に、マカクに、ケタミン（１０～１５ｍｇ／ｋｇ）及びデクスメデトミジン（０．０５～０．１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物をＩＭ注射で麻酔した。マカクに、伏在静脈を介してベクターＩＶを投与した。大腿静脈の静脈穿刺を介して、研究の開始前、及び試験中隔週で、血液試料を採取した。完全血球算定及び分類（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）、完全臨床化学、ならびに凝固パネルを含む血液資料に関する臨床病理試験は全て、Ａｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（カリフォルニア州アーバイン）が行った。

ＮＨＰにおけるｈＦＶＩＩＩの発現のためのパイロット研究を実施した。２匹のアカゲザル及び２匹のカニクイザルに、ＡＢＰ２．ＴＧＢ－Ｓ１エンハンサー／プロモーターの組み合わせからそれぞれｈＦＶＩＩＩを発現する３×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｒｈ１０（図１０Ａ）及びＡＡＶｈｕ３７（図１０Ｂ）ベクターをＩＶ投与した。高ピーク発現は、全ての動物で見られたが、６～８週目までに見られた。ＡＡＶｒｈ１０が注射されたマカクに、ｈＦＶＩＩＩに対する体液性免疫応答が見られた。ＡＡＶｈｕ３７を投与された１匹の動物で、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体の発生を遅延させ、ベクター投与の１２週後において発生し、他の動物のための研究過程を通して発生しなかった。ＡＡＶｈｕ３７．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ．ＰＡ７を投与されたマカクを注射後３５ヶ月間追跡した（図２２～２４）。

ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの研究及びこの小規模のパイロットアカゲザルの研究に基づいて、発現のための２つの異なるクレードＥカプシドを使用して、元の４２のエンハンサー／プロモーターの組み合わせのうちの２つを、カニクイザルにおけるさらなる評価のために選択した。

６．３．２ ＮＨＰにおけるさらなる研究
続いて、２０匹のカニクイザルに、４つのベクター；ＡＡＶｒｈ１０．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、ＡＡＶｒｈ１０．Ｅ１２．Ａ１ＡＴ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、ＡＡＶｈｕ３７．Ｅ０３．ＴＴＲ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、及びＡＡＶｈｕ３７．Ｅ１２．Ａ１ＡＴ．ｈＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５、のうちの１つを投与した（ｎ＝５ ベクター当たりのマカク）。ベクターを、（中程度のｏｑＰＣＲ力価を基準にして）１．２×１０^１３ＧＣ／ｋｇの用量でＩＶ投与した。１つのカプシド及びエンハンサー／プロモーターの組み合わせでは、正常なＦＶＩＩＩレベルの３７％のピーク発現が、ベクター投与後２週目に見られ、次に、正常の２０％でプラトーに達した（図１１）。ｈＦＶＩＩＩの抗体は、大部分のマカクにおいて第８週までに検出されたが、抗体は、ベクター投与後３０週目に２匹の動物で検出不可能のままであった（図１２）。以下に検討された方法。抗体の生成のための時間事象解析を使用することにより、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｈｕ３７の間に有意差があると判定した（図１４）。

６．３．３ ＮＨＰ血漿中のｈＦＶＩＩＩ発現の測定
ｈＦＶＩＩＩ発現をＥＬＩＳＡで測定し、全ての試薬は、別途記載のない限り、Ｓｉｇ
ｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）製であった。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中１：５００希釈（ｐＨ９．６）の抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、米国バーモント州）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ中の０．１％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中の５％の無脂肪乳（Ｂｉｏ Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ヘラクレス）でブロックした。ブロッキング緩衝液を除去した後、５％の無脂肪乳に希釈した血漿試料を、プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを４回洗浄し、抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州）を、無脂肪乳中１：１０００希釈で添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを、４回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒツジＩｇＧを、無脂肪乳中１：１０００希釈で添加した。室温で９０分間インキュベートした後、プレートを、５回洗浄し、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、検出のために添加した。２Ｎの硫酸を使用して、反応を室温で５分後に停止し、ＢｉｏＴｅｋのμＱｕａｎｔプレートリーダー（米国バーモント州ウィノスキー）を使用して、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。図１１。

ＡＡＶｈｕ３７．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ．ＰＡ７５の単回静脈内注射後の、カニクイザル（３５ヶ月）におけるヒトＦＶＩＩＩの長期間の安定発現の結果は、図２２に示される。結果は、３５ヶ月の剖検まで、安定した発現を示す。肝臓酵素試験の結果は、図２３に示される。結果は、肝臓生検後の一過性の上昇を除いて、肝臓酵素レベルが正常範囲内にあることを示す。ＡＡＶｈｕ．３７カプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）応答は、図２４に示される。

単一細胞技術を使用して、上述した、３Ｅ１２ ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ．ＰＡ７５の静脈内投与を受けた、ＮＨＰ Ｍ１１２６９の肝細胞のＡＡＶベクターＤＮＡ及びＲＮＡを検出した。単一細胞肝細胞を、ＡＡＶゲノムの存在、及び発現ついて評価した。ベクターの１５０週後に、コラゲナーゼ／プロテアーゼの混合物を灌流させることにより、肝細胞を、肝臓くさび型から単離した。単一細胞を、９６ウェルプレートの個々のウェルに選別した。１つの９６ウェルプレートの細胞を、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）し、ヒトＦＶＩＩＩのプローブを使用するデジタルＰＣＲにより、細胞内のＡＡＶゲノムを定量化した。第２の９６ウェルプレートは、ＦＶＩＩＩ発現を評価するために全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）した。

以下の表３に示される結果。ＡＡＶゲノムは、評価された単一細胞の約２５％で検出することができた。ＤＮＡを取り込む細胞の約４％または２０％において、ＲＮＡ発現のみを検出した。ＲＮＡ発現細胞は、低及び高のような２つのタイプに層別化することができた。相当数の細胞がベクターを取り込むが、導入遺伝子を発現しない理由は不明である。これらの結果を、ＣＭＣコアで実施したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究により実証した（データを示さない）。

６．３．４ ＮＨＰ血漿中の抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧの検出
ＨＲＰコンジュゲート抗ＮＨＰ ＩｇＧを検出のために無脂肪乳中１：２０００希釈で添加したことを除いて、以前に記載されたように、ＥＬＩＳＡで、ＮＨＰ血漿中のｈＦＶＩＩＩのＩｇＧ抗体を測定した（図１２）。

６．３．５ ＮＨＰ血漿中のＢｅｔｈｅｓｄａ力価の検出
ヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体を、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｅｔｈｅｓｄａｙ ａｓｓａｙ（Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）で測定した。１Ｂｅｔｈｅｓｄａ単位は、正常ヒト血漿の凝固活性の５０％阻害を表す。

６．３．６ 肝臓生検
各群からの２つのＮＨＰは、小開腹術により実施されたベクター投与後５週目に肝臓生検を受けた。動物の選択は、４週目の血漿中のｈＦＶＩＩＩ発現に基づいた。選択された最初の動物は、中央値ｈＦＶＩＩＩレベルの動物であり、選択された第２の動物は、（最も近いものが中央値のものである場合に）平均レベルに最も近いかまたは２番目に近いｈＦＶＩＩＩレベルの動物であった。肝臓組織の試料を、組織病理学、ベクター生体内分布、及び導入遺伝子ｍＲＮＡ分析のために採取した。肝臓生検後３日目に、完全血球算定及び分類、完全な臨床化学、ならびに凝固パネルについて血液を採取した。

６．３．７ 免疫抑制プロトコール
ベクター投与後の検出可能なｈＦＶＩＩＩの抗体（１Ｂｅｔｈｅｓｄａ単位を超える）の存在下で、ｈＦＶＩＩＩ発現を検出する能力が失われた動物に、免疫抑制レジメンを必要に応じて開始させた。以前に記載されるように（Ｍｃｉｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖｅｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ．Ｂｌｏｏｄ，１２１，３３３５－４４．）、リツキシマブ（２５０ｍｇ／ｍ^２、４週間間隔でＩＶ、合計４回の注入）及びシクロホスファミド（３００ｍｇ／ｍ^２、１５日毎に遅い静脈内注入、合計４ヶ月間にわたり８用量）を用いて、免疫抑制レジメンを実施した。

６．３．８ ベクター生体内分布
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの組織試料（鼠径リンパ節、腰椎リンパ節、筋肉［右腓腹筋］
、右精巣、膵臓、右腎臓、脾臓、右肺、心臓、及び肝臓）を、剖検時に急速凍結し、ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（米国カリフォルニア州バレンシア）使用して抽出した。抽出されたＤＮＡ中のベクターゲノムコピー（ＧＣ）及び抽出されたＲＮＡ中の相対的なｈＦＶＩＩＩ転写物発現の検出及び定量化を、以前に記載されたようにリアルタイムＰＣＲにより実施した。要約すると、ベクターのｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子配列に対して設計されたプライマー／プローブを使用して、ベクターＧＣ及びＲＮＡを定量化した。肝臓からのＧＣの定量を、各マウスの１つの肝臓試料（ｎ＝３／グループ）で実施した。１８Ｓ発現に対して正規化された各試料のΔΔＣＴを使用して、ＲＮＡ相対転写発現を判定した。

ベクター生体内分布を、ＡＡＶｒｈ１０エンハンサー／プロモーターベクターの１８のサブセットについて評価した。ｈＦＶＩＩＩｃｏ ＩＶを発現するＡＡＶｒｈ１０ベクターを、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに、マウス１匹当たり１０^１１ＧＣの用量で投与した。マウスを、ベクター投与後１４日目に剖検し、筋肉（右腓腹筋）、右精巣、膵臓、右腎臓、脾臓、右肺、心臓、及び肝臓を収集した。ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、ベクターＧＣ及びＲＮＡ転写レベルを、それぞれ、ベクターのｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子配列に対して設計したプライマー／プローブを使用して定量化した。ベクター投与群にわたって、肝ベクターＧＣ（図２０Ａ）またはＲＮＡ転写物レベル（図２０Ｂ）に有意差はなく、検出可能なＧＣまたはＲＮＡは、対照（ＰＢＳ）投与群になかった。しかし、エンハンサー配列に関係なく、発現のためのＡ１ＡＴプロモーターを使用したベクターの場合、肝臓内のＲＮＡ転写物レベルがより高くなる傾向があった（図２０Ｂ）。収集された他の組織では、ｈＦＶＩＩＩ ＲＮＡ転写レベルは、肝臓よりも平均１０００分の１低かったが、高い肝臓外発現は、Ｅ０１．ＴＢＧ－Ｓ１、Ｅ０２．Ａ１ＡＴ、Ｅ０９．Ａ１ＡＴ、及びＥ０９．ＴＴＲの投与後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの筋肉及び心臓に見られた（図２１）。

６．４． ベクターの試験
血清型同一性、中空粒子含有量、及び導入遺伝子生成物の同一性を含む特性決定アッセイを実施する。全てのアッセイの説明が以下に示される。

６．４．１ ゲノムコピー（ＧＣ）力価
最適化された定量的ＰＣＲ（ｏｑＰＣＲ）アッセイを使用して、同族プラスミド標準と比較してゲノムコピー力価を測定する。ｏｑＰＣＲアッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ及びプロテイナーゼＫを用いる逐次消化、続いて、カプシド化ベクターゲノムコピーを測定するｑＰＣＲ分析を利用する。この同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせてＰＡ７５ポリＡ領域を標的とする配列特異的プライマーを使用して、ＤＮＡ検出を達成する。プラスミドＤＮＡ標準曲線と比較すると、任意のＰＣＲ後の試料操作を必要とせずに、力価測定が可能になる。多数の標準、検証試料、及び対照（バックグラウンド及びＤＮＡ汚染の場合）は、アッセイに導入されている。このアッセイは、感度、検出限界、適格性の範囲、ならびにアッセイ内及びアッセイ間精度を含むアッセイパラメーターを確立及び規定することにより適格とされている。内部ＡＡＶｒｈ．１０参照ロットを確立し、使用して適格性試験を実施した。

６．４．２ ベクターカプシド同一性：ＶＰ３のＡＡＶカプシド質量分析
ＡＡＶ２／ｈｕ．３７またはＡＡＶ２／ｒｈ．１０血清型のベクターの確認を、質量分析（ＭＳ）によるＶＰ３カプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイにより達成する。方法は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから切除されたＶＰ３タンパク質バンドのマルチ酵素消化（トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテアーゼＧｌｕ－Ｃ）、続いて、カプシドタンパク質を配列決定するＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計のＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳでの特性決定、を含む。特定の汚染タンパク質の同定及びペプ
チド配列を質量スペクトルから導出することを可能にするタンデム質量分析（ＭＳ）法を開発した。

６．４．３ 中空粒子対完全粒子の比
ベクター粒子プロファイルは、巨大分子構造の不均一性、コンフォメーションの違い、及び会合または凝集の状態に関する情報を得るための優れた方法である、分析用超遠心分離機で測定されるような分析用超遠心分離（ＡＵＣ）沈降速度を使用している。試料を、セルにロードし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｌａｂ ＸＬ－Ｉ分析用超遠心分離器中１２０００ｒｐｍで沈降させた。屈折率スキャンを２分毎に３．３時間記録した。データを、ｃ（ｓ）モデル（Ｓｅｄｆｉｔプログラム）により分析し、計算された沈降係数を、正規化されたｃ（ｓ）値に対してプロットする。単量体ベクターを表す主要ピークは、観察すべきである。主要な単量体ピークよりも遅く移動するピークの出現は、中空の／アセンブルされない粒子を示す。中空ＡＡＶ８粒子の調製物を使用して、中空粒子ピークの沈降係数を確立する。主要な単量体ピーク及び先行ピークの直接定量により、中空対完全粒子の比の測定が可能になる。

６．４．４ 感染力価
ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２発現ＨｅＬａ細胞）内でのベクターの生産的取り込み及び複製を測定するために、感染単位（ＩＵ）アッセイを使用される。要約すると、９６ウェルプレート中のＲＣ３２細胞を、ベクターの連続希釈及びｒＡＡＶの各希釈時に１２回反復したＡｄ５の均一希釈により同時感染させる。感染の７２時間後に、細胞を、溶解させ、入力に対するｒＡＡＶベクターの増幅を検出するために定量ＰＣＲを実施する。ＩＵ／ｍｌとして表される追試可能な力価を測定するために、エンドポイント希釈ＴＣＩＤ５０算出（Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ）を実施する。「感染性」値は、細胞と接触する粒子、受容体結合、内在化、核への輸送、及びゲノム複製に依存するので、アッセイ形状及び使用される細胞株における好適な受容体及び結合後の経路の存在により影響される。ＡＡＶベクター移入に重要な受容体及び結合後の経路は通常、不死化細胞株で維持され、したがって、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的な尺度ではない。しかし、（ＧＣ／ＩＵ比として記載される）カプシド化ＧＣの「感染単位」に対する比は、ロット間での生成物の一貫性の尺度として使用することができる。

７．実施例２：ヒト対象を処置するためのプロトコール
この実施例は、凝固第８因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の変異に起因する、遺伝的に確認されたＸ連鎖血友病Ａを有する患者のための遺伝子治療の処置に関する。本実施例では、ｈＦＶＩＩＩを発現する複製能欠損アデノ随伴ウイルスベクターｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）である遺伝子治療ベクターＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩを、血友病Ａ患者に投与される。処置の有効性は、導入遺伝子発現の代用物としてのＦＶＩＩＩレベルを使用してアッセイすることができる。１次有効性評価は、処置の約１２週間後のＦＶＩＩＩレベルを含み、その後続いた効果は、少なくとも１年間持続する。導入遺伝子発現の長期間の安全性及び持続性は、肝臓生検試料において処置後に測定されてもよい。

７．１． 遺伝子治療ベクター－ＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩ
７．１．１． ＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩ
ＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩベクターは、ＡＡＶベクター活性成分及び製剤緩衝液からなる。外側のＡＡＶベクターコンポーネントは、１：１：１０の予測比の３つのＡＡＶウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の６０コピーからなる血清型ｈｕ．３７、Ｔ＝１正２０面体カプシドである。カプシドは、一本鎖ＤＮＡ組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含有する（図１～図４）。

ゲノムは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するヒト第ＶＩＩＩ因子（Ｆ
ＶＩＩＩ）導入遺伝子を含有する。エンハンサー、プロモーター、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）コード配列、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルは、Ｂドメイン欠失コドン最適化ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む。ＩＴＲは、ベクター産生中のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝的エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要な唯一のウイルスシスエレメントである。一実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩコード配列の発現を、トランスサイレチンプロモーター（配列番号７）で駆動する。別の実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩコード配列の発現を、改変Ａ１ＡＴプロモーター（配列番号９）で駆動する。コンストラクトは、プロモーター活性を刺激するために、少なくとも１つのエンハンサーエレメントを含む。一実施形態では、ｅｎＴＴＲエンハンサー（配列番号５）が含まれる。別の実施形態では、ＡＢＰ－Ｓエンハンサー（配列番号６）の２つのコピーは、ｅｎＴＴＲエンハンサー（配列番号５）の１つのコピーを進める。ヒトＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ転写物の終結を媒介するために、約７５ｎｔ（配列番号１０）の合成ポリＡシグナルが含まれる。

ベクターは、製剤化緩衝液中のＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩベクターの懸濁液として供給される。一実施形態では、製剤緩衝液は、ＴＭＮ２００（２００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中の０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８である。

ベクター製造及びベクターの特性決定の詳細は、以下のセクションで説明される。

７．１．２． ＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩ
ＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩベクターは、ＡＡＶベクター活性成分及び製剤緩衝液からなる。外部ＡＡＶベクターコンポーネントは、１：１：１０の予測比の３つのＡＡＶウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の６０コピーからなる血清型ｒｈ．１０、Ｔ＝１正２０面体カプシドである。カプシドは、一本鎖ＤＮＡ組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含有する（図１～図４）。

ゲノムは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接するヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）導入遺伝子を含有する。エンハンサー、プロモーター、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）コード配列、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルは、Ｂドメイン欠失コドン最適化ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む。ＩＴＲは、ベクター産生中のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝的エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要な唯一のウイルスシスエレメントである。一実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩコード配列の発現を、トランスサイレチンプロモーター（配列番号７）で駆動する。別の実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩコード配列の発現を、改変Ａ１ＡＴプロモーター（配列番号９）で駆動する。コンストラクトは、プロモーター活性を刺激するために、少なくとも１つのエンハンサーエレメントを含む。一実施形態では、ｅｎＴＴＲエンハンサー（配列番号５）が含まれる。別の実施形態では、ＡＢＰ－Ｓエンハンサー（配列番号６）の２つのコピーは、ｅｎＴＴＲエンハンサー（配列番号５）の１つのコピーを進める。ヒトＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ転写物の終結を媒介するために、約７５ｎｔ（配列番号１０）の合成ポリＡシグナルが含まれる。

ベクターは、製剤化緩衝液中のＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩベクターの懸濁液として供給される。一実施形態では、製剤緩衝液は、ＴＭＮ２００（２００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中の０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８である。

７．２．患者集団
重篤な血友病Ａ患者は、いくつかの根拠で選択された研究集団である。重篤な血友病Ａ
患者は、正常な第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性が１％未満であると定義され、したがって、出血性素因をコントロールするためにＦＶＩＩＩを頻繁に注入する必要がある。これは、正常な生活を送ることに関して重大な負担になり、加えて、ＦＶＩＩＩの血中レベルは、よく知られているピーク及びトラフパターンを通過するが、これは最適ではない。重篤な患者のＦＶＩＩＩ血中レベルが１％未満であるという事実は、ＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩを投与した後のＦＶＩＩＩ血中レベルの低～中等度の増加さえも確実に測定することを可能にする。最近の臨床試験は、この手法の妥当性を証明している。

処置の候補である患者は、好ましくは、中等度／重度または重篤な血友病Ａと診断された１８歳以上の成人男性である。一実施形態では、患者は、正常の２％以下のベースラインのＦＶＩＩＩ活性または２％以下のＦＶＩＩＩ活性の文書化された履歴を有する。一部の実施形態では、１８歳未満の患者を処置することができる。処置の候補者は、ＦＶＩＩＩを用いるオンデマンド処置を必要とする、年に少なくとも３回の出血エピソードを有している対象を含む。処置の他の候補は、ＦＶＩＩＩの予防レジメンで処置される対象を含む。対象が処置に適することを実証する他の基準には、少なくとも１００日のＦＶＩＩＩへの曝露歴；ＦＶＩＩＩのインヒビター（中和抗体）の文書化された履歴がない；外因性ＦＶＩＩＩまたはＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩの任意のコンポーネントに対する既知のアレルギー反応がない、を含む。

処置される患者は、１：５以下の（選択されたベクターに適するような）ベースライン血清ＡＡＶｈｕ．３７またはＡＡＶｒｈ．１０中和抗体（Ｎａｂ）力価を有する可能性がある。

対象は、対象のケアをする医師の裁量で、遺伝子治療の処置の前及び同時に、対象の標準ケアの処置（複数可）（例えば、ＦＶＩＩＩの取り替え）を継続することを許可され得る。あるいは、医師は、遺伝子治療の処置の投与前に標準ケア療法の処置を停止し、任意に、遺伝子治療の投与後の併用療法として標準ケアの処置を再開することを好み得る。

７．３．投与及び投与経路
患者は、注入により末梢静脈を介して投与される単回用量のＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩまたはＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩを投与される。患者に投与されるＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩまたはＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩの用量は、約５×１０^１１ＧＣ／ｋｇまたは１．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇまたは５×１０^１２ＧＣ／ｋｇまたは１×１０^１３ＧＣ／ｋｇである。中空カプシドが、患者に投与されるＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩまたはＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩの用量から除去されることを確認するために、塩化セシウム勾配超遠心分離、またはベクター精製プロセス中のイオン交換クロマトグラフィーにより、中空カプシドをベクター粒子から分離させる。

７．４．臨床目的の測定
１次評価は、投与された生成物の安全性に関するものである。次の評価を、生成物の投与後４週間では週２回、６週目から１２週目では毎週、１年目の残りでは月１回、合計５年間では６ヶ月間隔で行う。
ａ．身体検査
ｂ．ＥＣＧ
ｃ．生化学的評価：血清電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、カルシウム、ホスファート、総タンパク質、アルブミン、ＬＤＨ、ＣＰＫ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ビリルビン
ｄ．血液学的評価：ＣＢＣ及び分類、凝固プロファイル
ｅ．尿検査
ｆ．免疫学的評価：
ｇ．ｈｕ．３７またはｒｈ．１０カプシド及び第ＶＩＩＩ因子に対する血清学的応答
ｈ．ｈｕ．３７またはｒｈ．１０カプシド及び第ＶＩＩＩ因子抗原に対するＴ細胞応答
ｉ．ベクターＤＮＡの評価；血漿、尿、及び唾液中でのｑＰＣＲ測定

２次評価は、
ａ．血漿第ＶＩＩＩ因子レベル及び第ＶＩＩＩ因子活性
ｂ．置換第ＶＩＩＩ因子要件の臨床的評価及び自発的出血エピソードの頻度、
で測定される場合、導入遺伝子の発現及び活性の測定に基づく。

８．実施例３：ＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩの製造
８．１．ＡＡＶ．ｈＦＶＩＩＩを産生するために使用されるプラスミド
（ｉ）セクション８．２．１．１～８．２．１．４に記載されるようなベクタープラスミド
（ｉｉ）セクション８．２．２．１に記載のＡＡＶ ｒｅｐ２及びｃａｐ ｒｈ１０野生型遺伝子を含有するｐＡＡＶ２．ｒｈ１０．ＫａｎＲと称されるＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに
（ｉｉｉ）セクション８．２．３に記載のｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）と称されるヘルパーアデノウイルスプラスミド、
を用いるヒトＨＥＫ２９３ＭＣＢ細胞の３つのプラスミドＤＮＡトランスフェクションにより、ＡＡＶｒｈ．１０．ｈＦＶＩＩＩを産生させる。

（ｉ）セクション８．２．１．１～８．２．１．４に記載されるようなベクタープラスミド
（ｉｉ）セクション８．２．２．２に記載のＡＡＶ ｒｅｐ２及びｃａｐ ｈｕ．３７野生型遺伝子を含有するｐＡＡＶ２．ｈｕ．３７．ＫａｎＲと称されるＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに
（ｉｉｉ）セクション８．２．３に記載のｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）と称されるヘルパーアデノウイルスプラスミド、
を用いるヒトＨＥＫ２９３ＭＣＢ細胞の３つのプラスミドＤＮＡトランスフェクションにより、ＡＡＶｈｕ．３７．ｈＦＶＩＩＩを産生させる。

８．２．１ シスプラスミド（ベクターゲノム発現コンストラクト）
８．２．１．１ ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含有するｐＡＡＶ．Ｅ０３．ｐ３．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５（図１）
このシスプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムをコードする。ヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱｃｏ ｃＤＮＡの発現を、ｅｎＴＲエンハンサーを伴うＴＴＲプロモーターで駆動する。発現カセットのポリＡシグナルは、約７５ｎｔの人工ポリＡ配列である。

配列エレメントの説明
１．逆方向末端反復（ＩＴＲ）：ＡＡＶ ＩＴＲは、両端で同一であるが、反対方向で見出される配列である。ＡＡＶ及びアデノウイルス（ａｄ）ヘルパー機能がトランスで提供される場合、ＡＡＶ２（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）ＩＴＲ配列は、ベクターＤＮＡ複製の起点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。このようなものであるから、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノム複製及びパッケージングに必要とされる唯一のシス作用配列を表す。例示されたベクターに使用される５′ＩＴＲ配列は、配列番号１１に示される。例示されたベクターに使用される３′ＩＴＲ配列は、配列番号１２に示される。
２．ＴＴＲプロモーター：トランスサイレチンプロモーター（配列番号７）であり、高レベルの肝臓特異的ｈＦＶＩＩＩ遺伝子発現を駆動するために使用される。
３．ＴＴＲエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）：トランスサイレチンの１００ｂｐエンハンサ
ー配列（配列番号５）は、ＦＶＩＩＩの発現を増加させるために、ベクター発現カセット中に存在する。
４．ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡ（配列番号１は、天然配列を示し；配列番号２は、コドン最適化配列を示す）。ヒト凝固第８因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡは、血塊の形成に必須の凝固因子をコードする。ｈＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されているように、Ｂドメインが短い「ＳＱ」配列で置換されているＢドメイン欠失配列である。ｈＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを、ヒトにおける発現のためにコドン最適化する。
５．人工ポリアデニル化シグナル：（配列番号１０）７５ｂｐの人工ポリアデニル化シグナルは、ｈＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためのシス配列を提供する。このエレメントは、転写終結のためのシグナル、新生転写物の３′末端での特異的切断事象、続いて、ポリアデニル尾部の付加、として機能する。

８．２．１．２ ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含有するｐＡＡＶ．Ｅ１２．ｐ３．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５（図２）
このシスプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムをコードする。ヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱｃｏ ｃＤＮＡの発現を、ＡＢＰＳ及びｅｎＴＴＲエンハンサーを伴うＴＴＲプロモーターで駆動する。発現カセットのポリＡシグナルは、約７５ｎｔの人工ポリＡ配列である。

配列エレメントの説明
１．逆方向末端反復（ＩＴＲ）：８．２．１．１と同じ
２．ＴＴＲプロモーター：８．２．１．１と同じ。
３．エンハンサー：トランスサイレチン由来の１００ｂｐのエンハンサー配列（ｅｎＴＴＲ）（配列番号５）の２つのコピーと共に、４２ｂｐまでのα１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体［ＡＢＰ］由来の短縮型の１００ｂｐの遠位エンハンサー（配列番号６）は、ＦＶＩＩＩの発現を増加させるために、ベクター発現カセットに存在する。
４．ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡ：８．２．１．１と同じ
５．人工ポリアデニル化シグナル：８．２．１．１と同じ

８．２．１．３ ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含有するｐＡＡＶ．Ｅ０３．ｐ２．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５（図３）
このシスプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムをコードする。ヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱｃｏ ｃＤＮＡの発現を、ｅｎＴＴＲエンハンサーを用いて、修飾Ａ１ＡＴプロモーターで駆動する。発現カセットのポリＡシグナルは、約７５ｎｔの人工ポリＡ配列である。

配列エレメントの説明
１．逆方向末端反復（ＩＴＲ）：８．２．１．１と同じ
２．Ａ１ＡＴプロモーター：修飾ＳＥＲＩＮＡ１［α１－抗トリプシン］プロモーター（配列番号９）であり、高レベルの肝臓特異的ｈＦＶＩＩＩ遺伝子発現を駆動するために使用される。
３．ＴＴＲエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）：トランスサイレチンの１００ｂｐのエンハンサー配列は、ＦＶＩＩＩの発現を増加させるために、ベクター発現カセット中に存在する。
４．ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡ：８．２．１．１と同じ
５．人工ポリアデニル化シグナル：８．２．１．１と同じ

８．２．１．４ ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含有するｐＡＡＶ．Ｅ１２．ｐ２．ｈＦ８ｃｏ－ＳＱ．ＰＡ７５（図４）
このシスプラスミドは、ｒＡＡＶベクターゲノムをコードする。ヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱｃｏ ｃＤＮＡの発現を、ＡＢＰＳ及びｅｎＴＲエンハンサーを伴うＴＴＲプロモーターで駆動する。発現カセットのポリＡシグナルは、約７５ｎｔの人工ポリＡ配列である。

配列エレメントの説明
１．逆方向末端反復（ＩＴＲ）：８．２．１．１と同じ
２．Ａ１ＡＴプロモーター：８．２．１．３と同じ
３．エンハンサー：８．２．１．１と同じ
４．ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡ：８．２．１．１と同じ
５．人工ポリアデニル化シグナル：８．２．１．１と同じ

８．２．２ ヘルパープラスミド
８．２．２．１ ＡＡＶｒｈ１０ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２．ｒｈ１０．ＫａｎＲ
このＡＡＶｒｈ１０ヘルパープラスミド（８，０３６ｂｐ）は、４つの野生型ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質及び血清型ｒｈ１０の３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードする。新規ＡＡＶ配列は、アカゲザルの肝臓組織ＤＮＡから得られ、ＡＡＶ血清型ＲＨ１０と称された。キメラパッケージングコンストラクトを作製するために、ＡＡＶ２
ｃａｐ遺伝子を、プラスミドｐ５Ｅ１８から除去し、霊長類肝臓ＤＮＡから増幅されたＡＡＶｒｈ１０ ｃａｐ遺伝子のＰＣＲフラグメントで置換して、プラスミドｐ５Ｅ１８ＶＤ２／ＲＨ１０を得た。通常ｒｅｐ発現を駆動するＡＡＶ ｐ５プロモーターは、このコンストラクト中で、ｒｅｐの５′末端からｒｈ１０ ｃａｐ遺伝子の３′末端に移動することに留意されたい。この配置は、ｒｅｐの発現を下方制御し、高力価のベクターの産生をサポートする能力を増加させるために、スペーサーを、プロモーター及びｒｅｐ遺伝子（すなわち、プラスミドバックボーン）の間に導入するのに役立つ。ｐ５Ｅ１８中のプラスミドバックボーンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ由来である。プラスミドの全てのコンポーネント部分は、直接配列決定により確認されている。最終的に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子で置換して、ｐＡＡＶ２／ｒｈ１０（Ｋａｎ）を得た。

８．２．２．２ ＡＡＶｈｕ．３７ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２．ｈｕ．３７．ＫａｎＲ
このＡＡＶｈｕ．３７ヘルパープラスミド（８，０３６ｂｐ）は、４つの野生型ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質及び血清型ｈｕ．３７の３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードする。ｐＡＡＶ２．ｒｈ１０．ＫａｎＲプラスミドの模式図は、以下示される。キメラパッケージングコンストラクトを作製するために、ＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子を、プラスミドｐ５Ｅ１８から除去し、霊長類肝臓ＤＮＡから増幅されたＡＡＶｈｕ．３７ ｃａｐ遺伝子のＰＣＲフラグメントで置換して、プラスミドｐ５Ｅ１８ＶＤ２／ｈｕ．３７を得た。ｐ５Ｅ１８中のプラスミドバックボーンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ由来である。プラスミドの全てのコンポーネント部分は、直接配列決定により確認されている。最終的に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子で置換して、ｐＡＡＶ２／ｈｕ．３７（Ｋａｎ）を得た。

８．２．３ ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミド
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）は、１５，７７４ｂｐのサイズである。このプラスミドは、ＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含有する（アデノウイルスＥ１機能は、２９３細胞により提供される）が、他のアデノウイルス複製または構造遺伝子を含有しない。このプラスミドは、アデノウイルス逆方向末端反復などの複製にとって重要なシスエレメントを含有せず、それ故、感染性アデノウイルスは、生成されないことが予想されるそれは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３のＥ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。不必要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、かつ３２ｋｂ～約１２ｋｂのアデノウイルスＤＮＡの量を低減させるために、欠失をＡｄ５ ＤＮＡに導入した。最終的に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子で置換して、ｐＡｄΔＦ
６（ｋａｎ）を得た。プラスミドＤＮＡ製造のためにＡｌｄｅｖｒｏｎＩｎｃ．に送付したプラスミド供給源ストックに、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓが実施したＤＮＡプラスミド配列決定により、これらの３つのアデノウイルス遺伝子の同一性を確認した。ＤＮＡ分析は、３つのアデノウイルス５型遺伝子領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６９９６５）と１００％の相同性を示した。

８．２．４ 細菌マスター細胞バンク（ＭＣＢ）
ＤＴＸ１０１の製造をサポートするために使用される３つのＤＮＡ産生プラスミド用の細菌のＭＣＢを、Ａｌｄｅｖｒｏｎ Ｉｎｃ．が作製した。細胞バンクを、選択された培地の増殖から作製し、Ａｌｄｅｖｒｏｎの標準操作後に、ＣＢＥＲの勧告に従って、各細菌ＭＣＢの認可に関する広範な試験を実施した。細菌ＭＣＢ作製の詳細及び３つのプラスミドのそれぞれの試験に関する情報を、実施及び記録する。

８．２．５ プラスミドＤＮＡの製造
ＧＭＰ－Ｓ（商標）品質システムならびにｃＧＭＰ製造の最も顕著な特徴：追跡可能性、文書管理、及び材料の分離、を利用する生産基盤の下、産生プロセスで使用される全てのプラスミドを、Ａｌｄｅｖｒｏｎ Ｉｎｃ．が作製した。プラスミドＤＮＡ作製及び各プラスミドの試験の詳細に関する情報を、実施及び記録する。

８．２．６ ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３マスター細胞バンク（ＭＣＢ）
元々、ＨＥＫ ２９３細胞は、Ｆｒａｎｋ Ｇｒａｈａｍ及び同僚が、剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡでＨＥＫ細胞を形質転換することにより作製した。細胞は、高力価のｒＡＡＶ産生に必要とされるＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子生成物を発現する。ＨＥＫ２９３細胞は、ＤＮＡプラスミドのトランスフェクション時に、接着性であり、高力価のｒＡＡＶを生じるトランスフェクション可能性が高い。

８．３ 組換えＡＡＶベクターの製造
８．３．１ 製造プロセスの説明
１．細胞播種：
適格なヒト胚性腎臓２９３細胞株を、産生プロセスに使用する。１０％のガンマ線照射ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中で、細胞を培養する。細胞は、足場依存性であり、非動物細胞解離試薬であるＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して、細胞の解離を達成する。細胞を、３７℃（＋／－１℃）、５％（＋／－０．５％）ＣＯ_２雰囲気中で維持する。

２． 一過性トランスフェクション：
成長の３日後（ＤＭＥＭ培地＋１０％のＦＢＳ）、Ｈｙｐｅｒｓｔａｃｋ細胞培地を、新しい無血清ＤＭＥＭ培地と交換し、最適化されたＰＥＩ沈殿法を使用して、３つの産生プラスミドでトランスフェクトする。

十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション複合体をＢＳＣ中で調製し、（ＢＤＳロット当たり）２０のＣｏｒｎｉｎｇ ３６層のＨｙｐｅｒＳｔａｃｋｓにトランスフェクトする。最初に、３．０ｍｇのｐＤＴＸ．ｈＦＩＸ．１０１ベクタープラスミド、６０ｍｇのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）、３０ｍｇのｐＡＡＶ２．ｒｈ１０．ＫａｎＲ ＡＡＶヘルパープラスミド、及びＧＭＰグレードＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）を含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を調製する。よく混合した後、溶液を、室温で２５分間放置させ、次に、反応をクエンチするために、無血清培地に添加し、次に、Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６層のＨｙｐｅｒｓｔａｃｋｓに添加する。トランスフェクション混合物を、Ｈｙｐｅｒｓｔａｃｋの３６層全ての間で均等化し、細胞を、５％（＋／－０．５％）ＣＯ_２雰囲気中、３７℃（＋／－２℃）で５日間インキュ
ベートする。

３．細胞培地採取：
培地から無菌的に排液することにより、使い捨てのバイオプロセスバッグを使用して、トランスフェクトされた細胞及び培地を、各Ｈｙｐｅｒｔａｃｋから採取する。培地の採取後、約８０リットルの容量に、ＭｇＣｌ_２（ベンゾナーゼの補因子）を、２ｍＭの最終濃度まで補充して、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（カタログ番号：１．０１６７９７．０００１、Ｍｅｒｃｋグループ）を２５単位／ｍｌの濃度まで添加する。（使い捨てのバイオプロセスバッグ中）生成物を、インキュベーター中、３７℃で２～３時間インキュベートして、残留細胞の酵素消化に対し十分な時間を提供し、プラスミドＤＮＡは、トランスフェクション手順の結果として、採取物中に存在する。最終ベクターＤＰ中の残留ＤＮＡの量を最小化するために、このステップを実施する。インキュベーション期間後に、ろ過及び下流タンジェンシャルフローろ過中の生成物の回収を助けるために、ＮａＣｌを、５００ｍＭの最終濃度まで添加する。

４．明確化：
蠕動ポンプにより駆動される滅菌閉鎖チューブ及びバッグセットとして、直列に接続された深層フィルターカプセル（１．２μｍ／０．２２μｍ）を使用して、細胞及び細胞破片を生成物から除去する。培地を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳカプセルフィルター（１．２μｍ／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ
Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）に通過させる。

５．大規模タンジェンシャルフローろ過：
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓが作製したカスタム滅菌閉鎖バイオプロセシングチューブ、バッグ、及び膜セットを使用するタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を使用して、透明化された生成物の体積低減（１０～２０分の１）を達成する。

８．４ 第２のベクターの再投与
８．４．１ ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶ５の再投与
以前にＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ８ベクターで処置したアカゲザルにおいて、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶ５を使用するベクター再投与の効率を評価した。表４に示されるようなベクターを、上述したように作製し、ＨＥＫ２９３細胞に３回トランスフェクトして、イオジキサノール勾配で精製した後に、ベクターを上清から回収した。ベクター力価を、デジタルＰＣＲ法で測定した。

２４匹の雄のアカゲザル（３～５才）を、既存のＮＡｂの状態に基づいて、８群（ｎ＝３／群；表１）の研究に登録した。マカクに、０日目に、表４に示されるようなＡＡＶベクターと共に、１．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＣＧ．ＷＰＲＥを注射した。１２週目に、マカクは、１．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＣＧ．ＷＰＲＥの２回目の注射を投与され、ＡＡＶベクターは、表４に示されるようなものであった。肝生検を、２週目及び１４週目に実施し、剖検を２６週目に実施した。

血清中の導入遺伝子（ｒｈＣＧ－アカゲザル絨毛ゴナドトロピンｂサブユニット；ｒｈＡＦＰ－アカゲザルαフェトプロテイン）の発現レベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した。肝臓におけるベクターＤＮＡコピーを測定するために、ＱＰＣＲアッセイを、肝生検及び剖検中に収集された肝臓試料から抽出された全細胞ＤＮＡに実施した。ＡＡＶ ＮＡｂアッセイを、以前に記載されたように実施した。肝臓切片を、イメージング用の抗ＣＧ抗体で染色した。

図１５は、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ５ベクターによるｒｈＣＧ発現レベルの比較（第１ベクター注入）を示す。図１６Ａ～１６Ｄは、異なる時点の肝臓のｒｈＣＧベクターＤＮＡコピーを示す。図１７Ａ～１７Ｂは、ｒｈＡＦＰを発現するＡＡＶ３Ｂベクター（図１７Ａ）またはＡＡＶ５ベクター（図１７Ｂ）の再投与（２回目のベクター注入）後のｒｈＡＦＰレベルを示す。図１８Ａ及び図１８Ｂは、肝臓中のｒｈＡＦＰベクターゲノムコピーを示す。図１９は、マカクの差次的なＡＡＶ Ｎａｂ応答を示す。

ナイーブ動物では、クレードＥベクター（ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶ８）は、最低レベルのＡＡＶ５ベクターを用いて、最高レベルの門脈周囲遺伝子導入を実証し；門脈周囲領
域は、流入する血管供給の最も近くにあり、最も酸素化された血液を受け、代謝プロセスにとっての肝臓の重要領域である。ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶ５は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ３Ｂよりも高いレベルの中和抗体（ＮＡｂ）を誘発した。血清陰性動物のＡＡＶ３Ｂを用いる導入遺伝子発現における有意な動物間の変動が認められた。試験した短時間の枠内で、ＡＡＶｒｈ１０から誘発されたＮＡｂは、血清学的に異なるＡＡＶ３Ｂ血清型によるその後のインビボ形質導入を阻害しているようである；ＡＡＶ８への事前曝露は、ＡＡＶ３Ｂ形質導入を妨げなかった。

本明細書に引用された全ての刊行物ならびに米国仮特許出願第６２／３２３，３３６号、同第６２／３３１，８０７号、及び同第６２／４２８，８６６号は、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書で参照され、かつ添付の配列表、及び配列表自体に現れる配列番号は、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態に関して説明されているが、変更が本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができることは理解されるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
（配列表フリーテキスト）

数字識別子＜２２３＞の次にフリーテキストを含む配列のための次の情報が提供される。

Claims (16)

1. 血友病Ａに対する肝臓向性治療剤として有用な組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｈｕ３７カプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、前記ベクターゲノムが
   ａ）ＡＡＶ ５’逆方向末端リピート（ＩＴＲ）；
   ｂ）トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）；
   ｃ）トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター；
   ｄ）凝固作用を有するヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするコード配列；および
   ｅ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲとを具備し、
   前記コード配列が、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である核酸を含む、
   前記ｒＡＡＶ。
2. 前記トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターが配列番号：７に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記ｅｎＴＴＲが配列番号：５に記載のヌクレオシド配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記ベクターゲノムがポリＡ配列を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記ポリＡ配列が配列番号：１０に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記ベクターゲノムが約５キロベース～約５．５キロベースのサイズである、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ベクターゲノムが配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列のｎｔ１～５１１０を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
9. 血友病Ａ患者への投与に適した水性懸濁液であって、前記懸濁液が、水性懸濁液と、１×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬの請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶとを含む、前記水性懸濁液。
10. 前記懸濁液が静脈内注射に適する、請求項９に記載の水性懸濁液。
11. 前記懸濁液が、界面活性剤、防腐剤、及び／または前記水性懸濁液中に溶解される緩衝液を更に含む、請求項９または請求項１０に記載の水性懸濁液。
12. 前記ｒＡＡＶが約１×１０^１２～約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇのｒＡＡＶの水性懸濁液が患者に送達される、血友病Ａ患者の治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記ｒＡＡＶを後の時点で再投与する、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
14. 前記ｅｎＴＴＲが配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含み；
    前記ＴＴＲプロモーターが配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含み；および
    前記コード配列が配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、
    請求項１に記載のｒＡＡＶ。
15. 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲが配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、且つ前記ＡＡＶ ３’ＩＴＲが配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。
16. 前記ベクターゲノムが更にポリＡ配列を含み、前記ポリＡ配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。