JP2016500519A - 血友病の肝臓指向性遺伝子治療のためのベクター並びにその方法及び使用 - Google Patents

血友病の肝臓指向性遺伝子治療のためのベクター並びにその方法及び使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、肝臓特異的制御配列及びコドン最適化された第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子を含むベクター、これらのベクターを用いた方法、及びこれらのベクターの使用に関する。これらの肝臓特異的制御要素及びコドン最適化された第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子を含む発現カセット及びベクターも開示される。本発明は遺伝子治療を用いた応用、特に血友病Ａ及びＢの処置に特に有用である。

Description

本発明は、改善された肝臓特異的発現能を有する遺伝子治療のための、具体的には、血友病を処置するための遺伝子治療手段として用いるための、より具体的には、血友病Ｂ及び血友病Ａの肝臓指向性（ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）遺伝子治療においてそれぞれ凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び／又は凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を回復するための、発現ベクターに関する。
血友病Ｂは、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠損によって生じる、Ｘ連鎖性で劣性遺伝性の出血性障害である。血友病Ｂの臨床症状は、自然発生的な長引く出血のエピソードを特徴とする。２０，０００人に１人が血友病Ｂに苦しむと推定されている。現在、血友病Ｂは、血漿由来ＦＩＸ又は組換えＦＩＸのいずれかを用いたタンパク質補充療法で処置される。ＦＩＸタンパク質補充は、血友病に苦しむ患者の平均余命を顕著に改善したが、患者には依然として、精製ＦＩＸの短い半減期、１００，０００ドル／患者／年に近くなり得る高いコスト、及び利用可能性が限られていることによる予防的処置の制限のため、重度の出血エピソード及び慢性的な関節損傷のリスクがある。更に、汚染された血液源から得られた血漿由来因子の使用はウイルス感染のリスクを増大させる。遺伝子治療は、治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）が比較的広く、通常の生理学的レベルからたった１％高いレベルで治療効果があるので、血友病Ｂの新規な処置方法として有望である。成功すれば、遺伝子治療はこの疾患の治療につながり得る一定のＦＩＸ合成を提供することができる。血友病の遺伝子治療のための種々の様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）が広く概説されている（Chuah et al., 2012a, 2012b, 2012c; VandenDriessche et al., 2012; High 2001, 2011; Matrai et al., 2010a, 2010b）。
血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠損又はこれが全く存在しないことにより生じる重度の出血性障害である。血友病Ａ及び血友病Ｂの重症度は、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子に関する小委員会であるScientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasisにより、それぞれＦ
ＶＩＩＩレベル及びＦＩＸレベルに応じて３つの形態に分類されている：（１）重症形態（０．０１国際単位（ＩＵ）／ｍｌ未満、すなわち正常ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸレベルの１％未満のＦＶＩＩＩ又はＦＩＸレベル）、（２）中等症形態（０．０１〜０．０５ＩＵ／ｍｌ、すなわち正常ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸレベルの１〜５％のＦＶＩＩＩ又はＦＩＸレベル）、及び（３）軽症形態（０．０５〜０．４ＩＵ／ｍｌ超、すなわち、正常ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸレベルの５〜４０％超のＦＶＩＩＩ又はＦＩＸレベル）。血友病Ａは、発生率が男性５０００人中約１人に近い、最も一般的な遺伝性凝固障害である。
精製又は組換えＦＶＩＩＩを用いたタンパク質補充療法（ＰＳＴ）は患者の生活の質を著しく改善した。しかし、ＰＳＴは根治的でなく、患者は依然として、命を脅かす可能性のある出血及び体を不自由にする（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）関節炎を発症するリスクがある。残念ながら、血友病Ａに苦しむ多くの患者（最大４０％）が、ＰＳＴ後にＦＶＩＩＩに対する中和抗体（すなわち、「インヒビター」）を産生する。これらのインヒビターは、出血エピソードの管理を複雑にし、更なるＰＳＴを無効にし得る。ＰＳＴのこれらの制限のため、血友病処置の潜在的代替物としての遺伝子治療の開発が必要である。更に、治療上の利益のために必要なＦＶＩＩＩ血漿濃度の上昇がわずかであり、正常レベルの１％超のレベルで自然発症的出血及び長期関節症の率を顕著に低減することができる。
ＦＩＸ及びＦＶＩＩＩ合成の主な生理学的部位は肝臓であるので、肝細胞が血友病遺伝
子治療の非常に好適な標的細胞である。この場所からＦＩＸタンパク質は容易に循環に入ることができる。更に、肝臓ニッチ（ｈｅｐａｔｉｃ ｎｉｃｈｅ）が導入遺伝子産物に対する免疫寛容の誘導に好ましいと考えられる（Annoni et al., 2007; Follenzi et al., 2004; Brown et al., 2007; Herzog et al., 1999; Matrai et al., 2011; Matsui et al., 2009）。血友病の肝臓指向性遺伝子治療は、レトロウイルス（Axelrod et al., 1990; Kay et al., 1992; VandenDriessche et al., 1999、Xu et al., 2003, 2005）、レンチウイルス（Ward et al., 2011、Brown et al., 2007、Matrai et al., 2011）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Herzog et al., 1999）、及びアデノウイルスベクター（Brown
et al., 2004）（Ehrhardt & Kay, 2002）を含む種々のウイルスベクターで実現するこ
とができる。特に、ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡゲノムを有する天然の複製欠損非病原性ウイルスである。ＡＡＶベクターは、好ましい安全性プロファイルを有し、持続的な導入遺伝子発現を実現することができる。長期発現はエピソームに保持されたＡＡＶゲノムに主に仲介される。安定に形質導入されたベクターゲノムの９０％超が染色体外であり、大部分が高分子量コンカテマーとして組織化される。したがって、特に形質導入された細胞の選択的増殖が起こることが予想されない血友病遺伝子治療の状況において、挿入による発癌リスクは最小限である。それにも関わらず、ＡＡＶベースの遺伝子導入後の発癌イベントが報告されている（Donsante et al., 2007）が、その発見を他のモデル系で再現するこ
とは困難であった（Li et al., 2011）。ＡＡＶベクターの主な制限は、ベクター粒子の
パッケージング容量が限定的（すなわち、約４．７ｋｂ）であり、機能的ベクターを得るための導入遺伝子発現カセットのサイズが限定されることである（Jiang et al., 2006）。血友病遺伝子治療のためのほとんどのベクターは最初、最も一般的なＡＡＶ血清型２に由来したが、複数の免疫学的に異なるＡＡＶ血清型がヒト及び非ヒト霊長類から単離されている（Gao et al., 2002、Gao et al. 2004）。先天性失明のためのＡＡＶベースの遺
伝子治療の最初の臨床的成功により、遺伝子導入技術の可能性に脚光が当たっている（Bainbridge et al., 2008）。
ＡＡＶ仲介肝臓遺伝子導入は、肝臓及び筋肉指向性遺伝子治療の両方において、血友病の遺伝子治療の魅力的な代替的治療法である（Herzog et al., 1997, 1999, 2002; Arruda et al., 2010; Fields et al., 2001; Buchlis et al., 2012; Jiang et al., 2006; Kay et al., 2000）。非ヒト霊長類又は血友病のマウス及びイヌモデル中でＡＡＶベクタ
ーを用いた前臨床試験により、血友病モデルの出血表現型の部分的又は完全な補正につながる持続的な治療的発現が示された（Snyder et al., 1997, 1999; Wang et al., 1999, 2000; Mount et al., 2002; Nathwani et al., 2002）。特に、肝臓形質導入は、都合の
良いことに、抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導に必要なＦＩＸに対する免疫寛容を誘導する（Mingozzi et al., 2003; Dobrzynski et al., 2006）。肝臓指向性ＡＡＶ２−ＦＩＸ遺伝子治療で処置されたインヒビターを生じやすいヌル変異血友病Ｂイヌで、インヒビターが生じない血友病表現型の長期補正が達成された（Mount et al, 2002）。ベクターの
用量を更に減らすために、より強力なＦＩＸ発現カセットが開発された。これは、より強力なプロモーター／エンハンサー要素、コドン最適化ＦＩＸ、又はＡＡＶ形質導入の制限的ステップの１つ（すなわち、一本鎖から二本鎖へのＡＡＶの変換）を克服する自己相補的二本鎖ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を用いることにより実現することができた（McCarty, 2001, 2003; Nathwani et al, 2002, 2006, 2011; Wu et al., 2008）。肝細胞への形質導入を向上させ、核内ベクター移入を向上させ、Ｔ細胞活性化リスクを軽減する、代替的なＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８又はＡＡＶ５）を用いることができた（Gao et al., 2002; Vandenberghe et al., 2006）。ＡＡＶ８又はＡＡＶ９を用いた血友病Ｂの肝
臓指向性遺伝子治療は、少なくともマウスにおいて、レンチウイルスベクターを用いた場合より効率的であり、炎症がより少なかった（VandenDriessche et al., 2007, 2002）。更に、最近の研究で、表面露出チロシン残基の変異により、ベクター粒子がリン酸化及びその後のユビキチン化を避けることができ、したがって、プロテアソームが仲介する分解を防止することができることが示され、これにより、マウスの肝臓におけるＦＩＸ発現が
１０倍増加した（Zhong et al., 2008）。
これらの肝臓指向性前臨床試験により、重度の血友病Ｂに苦しむ患者の臨床的遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの使用への道が開けた。ＡＡＶ−ＦＩＸベクターの肝臓送達により、肝動脈カテーテル法によりＡＡＶ−ＦＩＸを受けた対象で一過的な治療的ＦＩＸレベル（正常レベルの最大１２％）が得られた（Kay et al., 2000）。しかし、形質導入された肝細胞は、ＭＨＣクラスＩに会合したＡＡＶカプシド由来抗原をＴ細胞に提示することができた（Manno et al., 2006、Mingozzi et al., 2007）。抗原提示は中程度であっ
たが、形質転換された肝細胞のＴ細胞に仲介される破壊を誘導するのに充分であった。近年、血友病の遺伝子治療は重要な一歩を進めた（Nathwani et al., 2011; Commentary by
VandenDriessche & Chuah, 2012）。重度の血友病Ｂ（ＦＩＸ１％未満）に苦しむ対象に肝臓特異的プロモーターからコドン最適化ＦＩＸを発現する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。このＡＡＶ８血清型は、予め存在する抗ＡＡＶ２抗体との交差反応性が低減している。興味深いことに、樹状細胞によるその取込みが従来のＡＡＶ２ベクターと比べて低減し得、その結果、Ｔ細胞活性化が低減する（Vandenberghe et al.,
2006）。マウスにおいて、ＡＡＶ８は、ＡＡＶ２と比べて肝臓形質導入のかなりの増加
を可能にする。但し、この利点はイヌ、アカゲザル、及びヒトのような高等な種では失われ得る。対象は、１用量当たり２参加者で、漸増用量（ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ ｄｏｓｅ）のｓｃＡＡＶ８−ＦＩＸベクターを受けた。処置された全ての対象が、ベクター投与後に治療閾値である１％を超えるＦＩＸを数ヶ月発現し、持続的で変わり易い発現レベルを示した（すなわち、正常レベルの２〜１１％）。以前の肝臓指向性ＡＡＶ治験との主な差は、初めて遺伝子治療後に持続的な治療的ＦＩＸレベルを達成できたことである。この進歩にも関わらず、患者の一部における上昇した肝臓酵素レベルと一致する、ＡＡＶ形質転換肝細胞のＴ細胞が仲介するクリアランスが問題のままである。このベクター特異的免疫応答を制限する試みに、短期間のグルココルチコイドを用いた一過的な免疫抑制が用いられた。
遺伝子治療により血友病Ａを処置するための効率的ウイルス遺伝子送達系の作製における重要な制限の１つは、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡのサイズが大きいことである。血友病Ａの以前のウイルスベクターをベースとする遺伝子治療実験は通常、小さいが弱いプロモーターの使用に頼っており、過度に高いベクター用量が必要であり、これは臨床的に適切でないか、ベクターのタイターを非常に損なうものであった。ＡＡＶのパッケージングの制限を克服するためのスプリットベクター又はデュアルベクターのデザインの使用等、その他の複数の臨時的な戦略が研究されたが、これらのアプローチは概して比較的非効率的であり、更なる免疫原性の問題を生じさせた（Petrus et al., 2010に概説）。ＦＶＩＩＩの
Ｂドメインは凝固促進活性に不要であることが見出されている。したがって、Ｂドメインが欠失したＦＶＩＩＩコンストラクトが、それらのより小さいサイズはベクターにより容易に組み込まれるので、遺伝子導入目的に用いられる。更に、Ｂドメインの欠失により、ｍＲＮＡ及び一次翻訳産物が１７倍増加することが示されている。Ｂドメインを欠失させて短い１４アミノ酸リンカーで置換したＦＶＩＩＩが現在、組換え産物として生産されており、臨床用途にＲｅｆａｃｔｏ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａ）として販売されている（Sandberg et al., 2001）。Miao et al. (2004)は、Ｂドメイン欠失ＦＶＩ
ＩＩに短いＢドメイン配列（最適には２２６アミノ酸であり、Ｎ結合型グリコシル化のための６個の部位を保持している）を付加し直して分泌を改善した。McIntosh et al. (2013)は、Miao et al.の２２６アミノ酸スペーサーを、Ｂドメインに由来する６個のグリコ
シル化トリプレットが並置された１７アミノ酸ペプチドで置換した。しかし、生産は治療目的にはまだ充分でなかった。
非ウイルスベクターは通常、場合によってはトランスフェクションを容易にする物理化学的方法と組み合わせられる、裸のＤＮＡだけが送達されるプラスミドベースの遺伝子送
達系に頼っている。したがって、非ウイルス的アプローチは、自然免疫反応が依然として起こり得るが、ウイルスベクターより免疫原性が低くなり得、潜在的により安全であり得る。非ウイルス的遺伝子導入法は簡便であるが、効率は通常、ほとんどのウイルスベクター仲介遺伝子導入アプローチより低い。非ウイルスベクターの効率的なインビボ遺伝子送達がボトルネックのままである。典型的には、肝臓遺伝子送達のためには、プラスミドは流体力学的注射（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により投与される。この場合、目的の遺伝子を肝臓中に送達するために大容量のＤＮＡ溶液を循環中に迅速に注射することにより流体力学的圧力が生成する（Miao et al., 2000）。遺伝子導入のた
めの局所的な流体力学的圧力を維持しながら注射の体積を減らすことにより流体力学的注射を臨床的に適当な様式に適応させるための努力がなされている。標的化可能なナノ粒子に基づく別のアプローチが、肝細胞中へのＦＩＸの標的特異的送達を実現するために探求されている。長期発現を妨げる細菌骨格配列（すなわち、ミニサークルＤＮＡ）を除去することにより発現を長引かせることができた。更に、非ウイルストランスフェクション後のＦＩＸ発現の安定性を増すために、導入遺伝子の安定なゲノム組込みを実現するトランスポゾンを用いることができた。本発明者ら及び他の人々により、インビボ遺伝子治療後の安定な凝固因子発現を得るためにトランスポゾンを用いることができることが示されている（Yant et al., 2000; Mates, Chuah et al., 2009、VandenDriessche et al., 2009; Kren et al., 2009; Ohlfest et al., 2004)。
ＦＩＸを肝臓特異的に発現させるための最新のベクターの例が国際公開第２００９／１３０２０８号に記載されており、これは、因子ｃＤＮＡを駆動するＴＴＲ／Ｓｅｒｐ制御配列を含む一本鎖ＡＡＶベクターで構成される。ポリアデニル化シグナルと共にＦＩＸの第１イントロンがベクター中に含まれている。前記改善されたベクターを用いることで約２５〜３０％の安定な循環第ＩＸ因子が得られた。
血友病のためのウイルスベクターに基づく遺伝子治療を臨床へと応用するためには、肝臓に高用量のベクターを投与することに関連する安全上の問題及び臨床グレードのベクターを大量に製造する必要性に取り組む必要がある。遺伝子転移ベクターの効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）（用量当たりの有効性）の向上はこれらの目標の実現にとって重大である。これにより、より低い用量で治療上の利益を得ることができ、したがって、インビボ投与に関連する潜在的な毒性及び免疫活性化が低減し、製造ニーズが緩和される。
効力を増大させるための方法の１つは、ベクターコピー当たりの発現及び生物学的活性が最大化されるように導入遺伝子配列自体を操作することである。本発明者らは、コドン使用頻度について最適化した、高凝固活性及び血栓形成傾向に関連するＲ３３８Ｌアミノ酸置換を有するＦＩＸ導入遺伝子（Simioni et al., 2009）が、血友病Ｂマウスにおいて、検出可能な有害作用なしに、レンチウイルスベクターを用いた遺伝子治療の有効性を最大１５倍上昇させ、治療効果を得るために必要な用量をかなり低減し、したがって将来のスケールアップ及びその臨床への応用を容易にすることを示した（Cantore et al., 2012）。
ヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのコドン最適化によっても高レベルの発現が得られる。コドン最適化ｃＤＮＡ配列からＦＶＩＩＩを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した新生仔血友病Ａマウスの血漿中で有意に高いレベル（最大４４倍の上昇及び正常ヒトレベルの２００％超）の活性ＦＶＩＩＩタンパク質が検出され、これにより疾患モデルの補正に成功した（Ward et al., 2011）。
血友病Ａ及びＢのための肝臓指向性遺伝子治療の効率及び安全性を向上させることが本
発明の目的である。
血友病Ｂのための肝臓指向性遺伝子治療の効率及び安全性を向上させることが本発明の目的である。上記目的は、高活性化変異及び／又はコドンが最適化された導入遺伝子を含むヒトＦＩＸ遺伝子の使用と組み合わせた、組織特異性は保持しながら肝臓指向性遺伝子発現を増強する特異的制御要素を有する核酸発現カセットを含むウイルスベクター（特にＡＡＶべースのベクター）又は非ウイルスベクター（特にトランスポゾンベースのベクター）のいずれかのベクターを提供することによって達成される。
得られたベクター及び核酸発現カセットにより、制御要素とベクターの種類及び導入遺伝子の選択との特別な組合せによって肝臓中におけるＦＩＸの予期されない高い発現レベルが得られる。これらの要素の併用効果は予想されなかったと考えられる。例えば、国際公開第２００９／１３０２０８号では、所与のＡＡＶベースのベクターにより、約２５〜３０％の安定な循環第ＩＸ因子レベルが得られている。本願では、新規なベクターにより、５００〜６００％の安定な循環第ＩＸ因子レベルが得られた。これは、本発明の核酸発現カセットの要素及びベクターの特別な組合せによる２０倍を超えるＦＩＸレベルの上昇に相当する。特に、本発明者らは、実施例７において、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（本明細書中では「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」と呼ぶ）とコドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子との、又はＳｅｒｐｉｎエンハンサーとＰａｄｕａ変異を含むｈＦＩＸをコードする導入遺伝子との特異的組合せがＦＩＸ活性に相乗効果をもたらすことを示した。ＳｅｒｐｉｎエンハンサーとＰａｄｕａ変異を含むｈＦＩＸをコードするコドン最適化導入遺伝子との特別な組合せを含むプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおいて最大のｈＦＩＸ活性が測定された。これらのマウスにおけるｈＦＩＸ活性は、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー、コドン最適化、及びＰａｄｕａ変異のない対応するｈＦＩＸプラスミドを注射されたマウスにおけるｈＦＩＸ活性より最大２６５倍高かった。このｈＦＩＸ活性の上昇は相乗的であることが示された。
血友病Ａのための肝臓指向性遺伝子治療の効率及び安全性を向上させることが本発明のもう１つの目的である。実験セクションに示されているように、この目的は、コドン最適化ヒトＦＶＩＩＩコンストラクト（特にコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩコンストラクト）の使用と組み合わせた、組織特異性を保持しながら肝臓指向性遺伝子発現を増大させる特異的制御要素（特にＳｅｒｐｉｎエンハンサー）を有する核酸発現カセットを含むウイルスベクター（特にＡＡＶベースのベクター）又は非ウイルスベクター（特にトランスポゾンベースのベクター）のいずれかのベクターを提供することによって実現される。
得られたＡＡＶベースのベクター及び核酸発現カセットにより、比較的低いベクター用量（５×１０９ｖｇ／マウス）を用いて前例のない超生理学的ＦＶＩＩＩ発現レベル（すなわち、正常レベルの２００％超）が得られた。これは、切断型の肝臓特異的プロモーターからコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを発現したＡＡＶベクターと比べてＦＶＩＩＩ発現レベルの強固な（ｒｏｂｕｓｔ）５０倍の向上である（McInthosh et
al. 2013）。これは、最新の世代のＡＡＶ−ＦＶＩＩＩベクターと比較して著しい改善
であり、臨床応用への重要な一歩である。本発明者らは、実施例６において、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーとコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ導入遺伝子との特異的組合せが、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー又はコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ導入遺伝子のいずれかを含む発現カセットと比べてＦＶＩＩＩ発現レベルに相乗効果をもたらすことを示した。
本発明者らは更に、実施例５において、本明細書に開示されている核酸発現カセット中にＭＶＭイントロンを含めることにより、そこに作動可能に連結された導入遺伝子の発現
が予期されず増加することを示した。
したがって、本発明は以下の態様を提供する。
態様１．肝臓特異的制御要素、プロモーター、場合によりマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、導入遺伝子、好ましくはコドン最適化導入遺伝子、及び転写終止シグナルを含む核酸発現カセットを含むベクター。
態様２．前記導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子をコードする、態様１に記載のベクター。
態様３．前記凝固第ＶＩＩＩ因子のＢドメインが欠失している、態様２に記載のベクター。
態様４．前記ＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインが、配列番号１６を有するリンカーで置換されている、態様３に記載のベクター。
態様５．前記凝固第ＩＸ因子が高活性化変異を含む、態様２に記載のベクター。
態様６．凝固第ＩＸ因子中の前記高活性化変異がＲ３３８Ｌアミノ酸置換に相当する、態様５に記載のベクター。
態様７．凝固第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子をコードする前記導入遺伝子がコドン最適化されている、態様２〜６のいずれかに記載のベクター。
態様８．凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする前記導入遺伝子が、配列番号７を有する、態様１〜４又は７に記載のベクター。
態様９．前記肝臓特異的制御要素が、セルピンプロモーターに由来する配列を含む、態様１〜８のいずれかに記載のベクター。
態様１０．前記肝臓特異的制御要素が、配列番号８又は前記配列と９５％の同一性を有する配列を含み又はからなり、好ましくは、前記肝臓特異的制御要素がＳｅｒｐｉｎエンハンサーである、態様１〜９のいずれかに記載のベクター。
態様１１．前記プロモーターが、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーターに由来する、態様１〜１０のいずれかに記載のベクター。
態様１２．前記転写終止シグナルが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルに又はサルウイルス４０ポリアデニル化シグナルに由来する、態様１〜１１のいずれかに記載のベクター。
態様１３．前記ベクターがウイルスベクターである、態様１〜１２のいずれかに記載のベクター。
態様１４．前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、好ましくはＡＡＶ血清型９に由来する、態様１３に記載のベクター。
態様１５．前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶ、好ましくは一本鎖ＡＡＶ血清型９である、態
様１４に記載のベクター。
態様１６．配列番号６を有する態様１〜４、７〜１５のいずれかに記載のベクター又は配列番号１若しくは２を有する態様１、２、５〜７、９〜１５、若しくは１７のいずれかに記載のベクター。
態様１７．前記ベクターが、自己相補的ＡＡＶ、好ましくは自己相補的ＡＡＶ血清型９である、態様１４に記載のベクター。
態様１８．前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項１〜１２のいずれかに記載のベクター。
態様１９．前記ベクターがトランスポゾンベースのベクターである、態様１８に記載のベクター。
態様２０．前記ベクターが、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ベースのベクター、例えば配列番号１３を有するＰＢベースのベクター、好ましくは微小逆方向反復を含むＰｉｇｇｙＢａｃベースのベクター、より好ましくは配列番号１４若しくは１５を有するＰＢベースのベクター、又はＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）ベースのベクター、好ましくは配列番号１６を有するＳＢベースのベクターである、態様１９に記載のベクター。
態様２１．請求項１〜４、７〜２０のいずれかに記載のベクターの対象への形質導入又はトランスフェクションを含む、対象中で治療閾値濃度の１０ｍＵ／ｍｌ血漿以上の血漿中第ＶＩＩＩ因子レベルを得る方法。
態様２２．請求項１〜４、７〜１７のいずれかに記載のベクターの対象への形質導入が、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇより低い用量で行われる、態様２１に記載の方法。
態様２３．態様１、２、５〜１５、１７〜２０のいずれかに記載のベクターの対象への形質導入又はトランスフェクションを含む、対象中で治療閾値濃度の１０ｍＵ／ｍｌ血漿以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得る方法。
態様２４．態様１、２、５〜１５、１７のいずれかに記載のベクターの対象への形質導入が、２×１０１１ｖｇ／ｋｇより低い用量で行われる、態様２３に記載の方法。
態様２４．対象中で１００ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、態様１、２、５〜１５、１７のいずれかに記載のベクターの対象への形質導入が、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、態様２３に記載の方法。
態様２５．対象中で５０ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、態様１、２、５〜１５、１７のいずれかに記載のベクターの対象への形質導入が、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、態様２３に記載の方法。
態様２６．対象中で２００ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、態様１、２、５〜１５、１７の対象への形質導入が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、態様２３に記載の方法。
態様２７．対象中で１５０ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、請求項１、２、５〜１５、１７のいずれか一項に記載のベクターの対象への形質導入が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、態様２３に記載の方法。
態様２８．前記形質導入又はトランスフェクションが静脈内投与によるものである、態様２１〜２７のいずれかに記載の方法。
態様２９．前記トランスフェクションが、流体力学的トランスフェクションによるものである、態様２１又は２３に記載の方法。
態様３０．態様１９又は２０に記載のベクターが、トランスポザーゼをコードするベクター、好ましくは高活性トランスポザーゼをコードするベクターと組み合わせて投与される、態様２１、２３、２８、又は２９のいずれかに記載の方法。
態様３１．前記対象が、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象である、態様２１〜３０のいずれかに記載の方法。
態様３２．態様２１、２２、２８〜３１のいずれかに記載の方法を行うことを含む、哺乳動物対象の血友病Ａを処置する方法。
態様３３．血友病Ａを処置するための医薬の製造における、態様１〜４、７〜２０のいずれかに記載のベクターの使用。
態様３４．血友病Ａの処置における使用のための、態様１〜４、７〜２０のいずれかに記載のベクター。
態様３５．態様２３〜３１のいずれかに記載の方法を行うことを含む、哺乳動物対象の血友病Ｂを処置する方法。
態様３６．血友病Ｂを処置するための医薬の製造における、態様１、２、５〜１５、１７〜２０のいずれかに記載のベクターの使用。
態様３７．血友病Ｂの処置における使用のための、態様１、２、５〜１５、１７〜２０のいずれかに記載のベクター。
態様３８．態様１〜４、７〜２０のいずれかに記載のベクターと薬学的に許容されるキャリアとを含み、場合により血友病Ａを処置するための活性成分を更に含む、医薬組成物。
態様３９．血友病Ａの処置における使用のための、態様３８に記載の医薬組成物。
態様４０．前記処置により、処置された対象の血漿中における第ＶＩＩＩ因子のレベルが対象中での治療閾値濃度の１０ｍＵ／ｍｌ血漿以上となる、態様３９に記載の使用のための医薬組成物又は態様３４に記載の使用のためのベクター。
態様４１．前記処置が、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で対象中に請求項１〜４、７〜１７のいずれかに記載のベクターを形質導入することを含む、態様３９若しくは４０に記載の使用のための医薬組成物又は態様３４若しくは４０に記載の使用のためのベクター。
態様４２．態様１、２、５〜１５、１７〜２０のいずれかに記載のベクターと、薬学的に許容されるキャリアとを含み、場合により血友病Ｂを処置するための活性成分を更に含む、医薬組成物。
態様４３．血友病Ｂの処置における使用のための、態様４２に記載の医薬組成物。
態様４４．前記処置により、処置された対象の血漿中の第ＩＸ因子レベルが、対象中で治療閾値濃度の１０ｍＵ／ｍｌ血漿以上、好ましくは対象中で治療濃度の５０ｍＵ／ｍｌ血漿以上、より好ましくは対象中で治療濃度の１００ｍＵ／ｍｌ血漿以上、更により好ましくは対象中で治療濃度の１５０ｍＵ／ｍｌ血漿以上、更により好ましくは対象中で治療濃度の２００ｍＵ／ｍｌ血漿以上となる、態様４３に記載の使用のための医薬組成物又は態様３７に記載の使用のためのベクター。
態様４５．前記処置が、態様１、２、５〜１５、１７〜２０のいずれかに記載のベクターを２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量、好ましくは６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量、より好ましくは２×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で対象に形質導入することを含む、態様４３若しくは４４に記載の使用のための医薬組成物又は態様３７若しくは４４に記載の使用のためのベクター。
以下に図面を用いて本発明を説明するが、これは説明のみを目的とするものと見なされるべきであり、そこに開示されている実施形態に発明を限定するものではない。
トランスサイレチンミニマルプロモーター（ＴＴＲｍ）の上流に肝臓特異的Ｓｅｒｐｉｎ制御要素（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）が挿入されているＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクト（ｐｄｓＡＡＶｓｃ ＳｅｒｐＴＴＲｍＭＶＭＦ９ｃｏｐｔｐＡ）の表示付き（ｗｉｔｈ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の模式図である。使用されている略語は以下の通りである：ＩＴＲ：ウイルス逆方向末端反復；ｍＴＴＲ：ミニマルトランスサイレチンプロモーター；ＭＶＭ：微小ウイルスマウス；ｈｕＦＩＸｃｏｐｔＭＴ：コドン最適化ＦＩＸ；ｂＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクトの配列（配列番号１）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの配列（配列番号２）を示す図である。 ＦＩＸ欠損血友病ＢマウスにおけるＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸコンストラクト（ｐｄｓＡＡＶｓｃ ＳｅｒｐＴＴＲｍＭＶＭＦ９ｃｏｐｔｐＡ）又はＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌコンストラクトの静脈内注射後のＦＩＸ活性を示す図である。ヒトコドン最適化ＦＩＸ ｃＤＮＡを発現するＡＡＶベクターをＡＡＶ−ｃｏ−ｈＦＩＸ、ヒトコドン最適化ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ ｃＤＮＡを発現するＡＡＶベクターをＡＡＶ−ｃｏ−ｐａｄｕａ−ｈＦＩＸと命名した。クエン酸添加血漿に発色活性アッセイを用いてｈＦＩＸ活性レベルを決定した。種々のベクター用量の同族自己相補的ＡＡＶ９ベクター（１０９ｖｇ、５×１０９ｖｇ、２×１０１０ｖｇ）をマウスに注射した。 （Ａ）ＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターの模式図である。発現カセットが自己相補的（ｓｃ）アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）にパッケージングされ、５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接している。肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターが、Ｒ３３８Ｌ変異を有するコドン最適化ヒトＦＩＸ（ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）導入遺伝子を駆動する。肝細胞特異的制御要素（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）がＴＴＲｍプロモーターの上流に位置する。マウス微小ウイルスミニイントロン（ＭＶＭ）イントロン及びウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｐＡ）も示されている。（Ｂ）ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターと同じであるが、導入遺伝子であるコドン最適化ｈＦＩＸがＲ３３８Ｌ変異を含まない、対照ベクターＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸの模式図である。（Ｃ）ｈＦＩＸを高活性にするヒトＦＩＸフラグメント（配列番号２３）中のＲ３３８ＬすなわちＰａｄｕａ変異をヒトＦＩＸフラグメント（配列番号２４）と比較した図である。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ、Ｂ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ、Ｄ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｅ、Ｆ）のＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−（ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターをマウスに静脈内投与した。ＡＡＶ投与後の記載されている時間に採取された血漿サンプルについて、発色性ＦＩＸ活性アッセイを用いた凝固活性（ｎ＝３）及びＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によりそれぞれｈＦＩＸ活性（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｈＦＩＸタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を測定した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ、Ｂ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ、Ｄ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｅ、Ｆ）のＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−（ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターをマウスに静脈内投与した。ＡＡＶ投与後の記載されている時間に採取された血漿サンプルについて、発色性ＦＩＸ活性アッセイを用いた凝固活性（ｎ＝３）及びＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によりそれぞれｈＦＩＸ活性（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｈＦＩＸタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を測定した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ、Ｂ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ、Ｄ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｅ、Ｆ）のＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−（ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターをマウスに静脈内投与した。ＡＡＶ投与後の記載されている時間に採取された血漿サンプルについて、発色性ＦＩＸ活性アッセイを用いた凝固活性（ｎ＝３）及びＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によりそれぞれｈＦＩＸ活性（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｈＦＩＸタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を測定した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ、Ｂ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ、Ｄ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｅ、Ｆ）のＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−（ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターをマウスに静脈内投与した。ＡＡＶ投与後の記載されている時間に採取された血漿サンプルについて、発色性ＦＩＸ活性アッセイを用いた凝固活性（ｎ＝３）及びＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によりそれぞれｈＦＩＸ活性（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｈＦＩＸタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を測定した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ、Ｂ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ、Ｄ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｅ、Ｆ）のＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−（ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターをマウスに静脈内投与した。ＡＡＶ投与後の記載されている時間に採取された血漿サンプルについて、発色性ＦＩＸ活性アッセイを用いた凝固活性（ｎ＝３）及びＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によりそれぞれｈＦＩＸ活性（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｈＦＩＸタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を測定した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ、Ｂ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ、Ｄ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｅ、Ｆ）のＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−（ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターをマウスに静脈内投与した。ＡＡＶ投与後の記載されている時間に採取された血漿サンプルについて、発色性ＦＩＸ活性アッセイを用いた凝固活性（ｎ＝３）及びＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によりそれぞれｈＦＩＸ活性（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｈＦＩＸタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を測定した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。（Ｇ、Ｈ、Ｉ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｇ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｈ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｉ）のＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌを血友病マウスに静脈内投与した（ｎ＝３）。各用量で、ｈＦＩＸ発現（ｈＦＩＸタンパク質）を対応するＦＩＸ凝固活性と比較した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。（Ｇ、Ｈ、Ｉ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｇ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｈ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｉ）のＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌを血友病マウスに静脈内投与した（ｎ＝３）。各用量で、ｈＦＩＸ発現（ｈＦＩＸタンパク質）を対応するＦＩＸ凝固活性と比較した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。（Ｇ、Ｈ、Ｉ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｇ）、５×１０９ｖｇ／マウス（Ｈ）、又は２×１０１０ｖｇ／マウス（Ｉ）のＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌを血友病マウスに静脈内投与した（ｎ＝３）。各用量で、ｈＦＩＸ発現（ｈＦＩＸタンパク質）を対応するＦＩＸ凝固活性と比較した。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。（Ｊ）ＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ＡＡＶ ｃｏｈＦＩＸ Ｒ３３８Ｌと表記）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ（ＡＡＶ ｃｏｈＦＩＸと表記）ベクターを表記の用量で注射されたマウスでＤ−ダイマーレベル及びｈＦＩＸ活性を測定し、非注射対照マウスと比較した。ＥＬＩＳＡによりＤ−ダイマーレベルを測定し、発色アッセイによりｈＦＩＸ活性を分析した。Ｄ−ダイマー陽性対照が示されている。結果は平均値±ＳＥＭで表されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｔ検定）。 血友病マウスにおけるＡＡＶ９送達によるコドン最適化及び高活性ＦＩＸ導入遺伝子の評価を示す図である。（Ｋ）５×１０９ｖｇ／マウスのＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記、ｎ＝４）を注射された血友病Ｂマウスにおける免疫寛容誘導の分析。記載されているように、ｈＦＩＸタンパク質で免疫化した後２週間目（ｗ２）、ｗ４、ｗ６、及びｗ８にＥＬＩＳＡでＦＩＸ特異的抗体を測定した。免疫化はベクター投与の２週間後に開始した。免疫化されたＰＢＳ注射血友病Ｂマウス（ｎ＝４）を対照として用いた。 ＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記、ｎ＝３）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ（ｃｏｈＦＩＸと表記、ｎ＝３）を注射したマウスの種々の器官における体内分布及び形質導入効率を示す図である。（Ａ、Ｂ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｂ）の用量で両方のコンストラクトについて１００ｎｇのゲノムＤＮＡに対するＡＡＶコピー数を決定した。（Ｃ、Ｄ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｄ）の用量で、両方のコンストラクトについて、肝臓中ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルに対する種々の器官中の発現ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルの定量的逆転写酵素（ｑＲＴ）−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを標準化に用いた。結果は平均値±ＳＥＭで示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｔ検定）。 ＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記、ｎ＝３）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ（ｃｏｈＦＩＸと表記、ｎ＝３）を注射したマウスの種々の器官における体内分布及び形質導入効率を示す図である。（Ａ、Ｂ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｂ）の用量で両方のコンストラクトについて１００ｎｇのゲノムＤＮＡに対するＡＡＶコピー数を決定した。（Ｃ、Ｄ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｄ）の用量で、両方のコンストラクトについて、肝臓中ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルに対する種々の器官中の発現ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルの定量的逆転写酵素（ｑＲＴ）−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを標準化に用いた。結果は平均値±ＳＥＭで示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｔ検定）。 ＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記、ｎ＝３）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ（ｃｏｈＦＩＸと表記、ｎ＝３）を注射したマウスの種々の器官における体内分布及び形質導入効率を示す図である。（Ａ、Ｂ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｂ）の用量で両方のコンストラクトについて１００ｎｇのゲノムＤＮＡに対するＡＡＶコピー数を決定した。（Ｃ、Ｄ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｄ）の用量で、両方のコンストラクトについて、肝臓中ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルに対する種々の器官中の発現ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルの定量的逆転写酵素（ｑＲＴ）−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを標準化に用いた。結果は平均値±ＳＥＭで示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｔ検定）。 ＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（ｃｏｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌと表記、ｎ＝３）又はＡＡＶ９ｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ（ｃｏｈＦＩＸと表記、ｎ＝３）を注射したマウスの種々の器官における体内分布及び形質導入効率を示す図である。（Ａ、Ｂ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ａ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｂ）の用量で両方のコンストラクトについて１００ｎｇのゲノムＤＮＡに対するＡＡＶコピー数を決定した。（Ｃ、Ｄ）１×１０９ｖｇ／マウス（Ｃ）及び５×１０９ｖｇ／マウス（Ｄ）の用量で、両方のコンストラクトについて、肝臓中ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルに対する種々の器官中の発現ｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルの定量的逆転写酵素（ｑＲＴ）−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを標準化に用いた。結果は平均値±ＳＥＭで示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｔ検定）。 ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡベクターの模式図である。発現カセットが一本鎖（ｓｓ）アデノ随伴ウイルス中にパッケージングされており、５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接している。肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターがヒトコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）の転写を制御する。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）がＴＴＲｍプロモーターの上流にクローニングされている。マウス微小ウイルスミニイントロン（ＭＶＭ）及びＳＶ４０ポリアデニル化部位（ｐＡ）が示されている。 トランスサイレチンミニマルプロモーター（ＴＴＲｍ）の上流に肝臓特異的Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）が挿入されているＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡコンストラクト（ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡ）の表示付きの模式図である。使用されている略語は以下の通りである：ＩＴＲ：ウイルス逆方向末端反復；ＭＶＭイントロン：微小ウイルスマウスイントロン；ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ：コドン最適化Ｂドメイン欠失ヒトＦＩＸ；ＳｖポリＡ：ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル。 ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡコンストラクトの配列（配列番号６）を示す図である。隣接する逆方向末端反復配列がイタリック体、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）が太字（７２ｂｐ）、ミニマルトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）が下線（２０２ｂｐ）で示され、ｍＴＴＲ／５’非翻訳領域がボックスで囲まれ（２１ｂｐ）、ＭＶＭイントロンが下線の引かれたイタリック体（９２ｂｐ）、コドン最適化Ｂドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）が下線の引かれた太字（４３７７ｂｐ）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列が下線の引かれた太字のイタリック体（１３４ｂｐ）で示されている。 ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡコンストラクトの配列（配列番号６）を示す図である。隣接する逆方向末端反復配列がイタリック体、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）が太字（７２ｂｐ）、ミニマルトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）が下線（２０２ｂｐ）で示され、ｍＴＴＲ／５’非翻訳領域がボックスで囲まれ（２１ｂｐ）、ＭＶＭイントロンが下線の引かれたイタリック体（９２ｂｐ）、コドン最適化Ｂドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）が下線の引かれた太字（４３７７ｂｐ）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列が下線の引かれた太字のイタリック体（１３４ｂｐ）で示されている。 ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡコンストラクトの配列（配列番号６）を示す図である。隣接する逆方向末端反復配列がイタリック体、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）が太字（７２ｂｐ）、ミニマルトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）が下線（２０２ｂｐ）で示され、ｍＴＴＲ／５’非翻訳領域がボックスで囲まれ（２１ｂｐ）、ＭＶＭイントロンが下線の引かれたイタリック体（９２ｂｐ）、コドン最適化Ｂドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）が下線の引かれた太字（４３７７ｂｐ）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列が下線の引かれた太字のイタリック体（１３４ｂｐ）で示されている。 ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡコンストラクトの配列（配列番号６）を示す図である。隣接する逆方向末端反復配列がイタリック体、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）が太字（７２ｂｐ）、ミニマルトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）が下線（２０２ｂｐ）で示され、ｍＴＴＲ／５’非翻訳領域がボックスで囲まれ（２１ｂｐ）、ＭＶＭイントロンが下線の引かれたイタリック体（９２ｂｐ）、コドン最適化Ｂドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）が下線の引かれた太字（４３７７ｂｐ）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列が下線の引かれた太字のイタリック体（１３４ｂｐ）で示されている。 コドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩのヌクレオチド配列（配列番号７）。 コドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩのヌクレオチド配列（配列番号７）。 Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）のヌクレオチド配列（配列番号８）。 ミニマルトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）のヌクレオチド配列（配列番号９）。 微小ウイルスマウス（ＭＶＭ）イントロンのヌクレオチド配列（配列番号１０）。 ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ポリＡ）のヌクレオチド配列（配列番号１１）。 ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡ（５×１０９ｖｇ／マウス）の静脈内注射後の時間（日）の関数で表したＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現レベルを示す図である。ＦＶＩＩＩレベルをｈＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定し、正常レベル（すなわち、ヒトＦＶＩＩＩの生理学的レベルである正常個体中における２００ｎｇ／ｍｌ又は１ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ）に対する百分率及びｎｇ／ｍｌ血漿で表した。 コドン最適化高活性ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼをコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３＿ｍｏｕｓｅＣＯ＿ｈｙＰｉｇｇｙＢａｃ＿Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ＿ＭＴの模式図である。 ｐｃＤＮＡ３＿ｍｏｕｓｅＣＯ＿ｈｙＰｉｇｇｙＢａｃ＿Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ＿ＭＴプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１２）。 ｐｃＤＮＡ３＿ｍｏｕｓｅＣＯ＿ｈｙＰｉｇｇｙＢａｃ＿Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ＿ＭＴプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１２）。 ｐｃＤＮＡ３＿ｍｏｕｓｅＣＯ＿ｈｙＰｉｇｇｙＢａｃ＿Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ＿ＭＴプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１２）。 ＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ＿Ｄ４Ｚ４トランスポゾンの模式図である。ヒトコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ（ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）の転写を制御するためにＳｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）に肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターが作動可能に連結されている。マウス微小ウイルスミニイントロン（ＭＶＭ）及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）が示されている。 ＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ＿Ｄ４Ｚ４トランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１３）。 ＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ＿Ｄ４Ｚ４トランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１３）。 ＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ＿Ｄ４Ｚ４トランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１３）。 ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンを模式的に示す図である。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）に作動可能に連結された肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターからコドン最適化ヒトＦＩＸ発現が駆動される。マウス微小ウイルスミニイントロン（ＭＶＭ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂｇｈｐＡ）が示されている。 ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１４）。 ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１４）。 ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ＦＩＸｃｏ＿Ｐａｄｕａ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンを模式的に示す図である。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）に作動可能に連結された肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターからコドン最適化ヒトＰａｄｕａＦＩＸ発現が駆動される。マウス微小ウイルスミニイントロン（ＭＶＭ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂｇｈｐＡ）が示されている。 ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ＦＩＸｃｏ＿Ｐａｄｕａ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１５）。 ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ＦＩＸｃｏ＿Ｐａｄｕａ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１５）。 Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンｐＴ２ＢＨ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡトランスポゾンを示す図である。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）に作動可能に連結された肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターからコドン最適化ヒトＦＩＸ発現が駆動される。マウス微小ウイルスミニイントロン（ＭＶＭ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂｇｈｐＡ）が示されている。 高活性ＳＢｍａｘトランスポザーゼをコードするプラスミドｐＣＤＮＡ３＿ＣＭＶＢＧＩ＿ＳＢＭＡＸ＿ｂｇｈｐＡの模式図である。 ｐＣＤＮＡ３＿ＣＭＶＢＧＩ＿ＳＢＭＡＸ＿ｂｇｈｐＡプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７）。 ｐＣＤＮＡ３＿ＣＭＶＢＧＩ＿ＳＢＭＡＸ＿ｂｇｈｐＡプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７）。 ｐＣＤＮＡ３＿ＣＭＶＢＧＩ＿ＳＢＭＡＸ＿ｂｇｈｐＡプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１７）。 コドン最適化ＦＩＸ又は高活性コドン最適化ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ変異体のいずれかを発現する高活性ＰＢトランスポゾンを用いた肝臓指向性遺伝子治療により処置された血友病ＢマウスのＦＩＸ発現レベルを示す図である。トランスポゾン（ＩＲｐＢＡｃｍｉｃｒｏ）及びトランスポザーゼプラスミド（ｈｙｐＢａｓｅ）の量が示されている。ヒトＦＩＸレベルは活性アッセイを用いて決定した。 高活性ＰＢトランスポゾン系、すなわち１μｇのｐｃＤＮＡ３＿ｍｏｕｓｅＣＯ＿ｈｙＰｉｇｇｙＢａｃ＿トランスポザーゼ＿ＭＴプラスミド（ｈｙＰＢプラスミド）＋５μｇのＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ＿Ｄ４Ｚ４トランスポゾン（Ａ）；又は１μｇのｈｙＰＢプラスミド＋５００ｎｇのＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ＿Ｄ４Ｚ４トランスポゾンを用いた肝臓指向性遺伝子治療により処置されたＳＣＩＤマウスのＦＶＩＩＩ発現レベルを示す図である。（Ｂ）（線：ｈｙＰＢあり、破線：ｈｙＰＢなし対照）。生理学的ＦＶＩＩＩ濃度（１００％＝２００ｎｇ／ｍｌ血漿）が示されている。ヒトＦＶＩＩＩレベルはＥＬＩＳＡで検出した。 コドン最適化ｈＦＩＸ肝臓遺伝子送達についてＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの比較を示す図である。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（ｐＴ２ＢＨ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡ）及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿Ｉｎｓ＿ＳｅｒｐＴＴｒｍｉｎＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ＢＧＨｐＡ）を、それぞれ示されている用量のコドン最適化高活性ＰＢトランスポザーゼをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３＿ｍｏｕｓｅＣＯ＿ｈｙＰｉｇｇｙＢａｃ＿トランスポザーゼ＿ＭＴ）又は高活性ＳＢｍａｘトランスポザーゼをコードするプラスミド（ｐＣＤＮＡ３＿ＣＭＶＢＧＩ＿ＳＢＭＡＸ＿ｂｇｈｐＡ）と共に免疫不全（ＮＯＤ ＳＣＩＤ）マウスに注射した。注射の１ヶ月後に、ＥＬＩＳＡにより血漿中のＦＩＸ血漿レベルを測定した。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。（Ａ）野生型ｈＦＩＸをコードするｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡと表記）の模式図。発現カセットに野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復（ＩＲｐＢａｃ）が隣接している。肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターが、エキソン１と続くエキソン２〜８との間にある切断された１；４ｋｂのｈＦＩＸイントロンＡを含むヒトＦＩＸ導入遺伝子を駆動する。肝細胞特異的制御要素（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）がＴＴＲｍプロモーターの上流に位置する。ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｐＡ）も示されている。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。コドン最適化ｈＦＩＸをコードするｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏと表記）の模式図。発現カセットは導入遺伝子以外ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡと同じである。ｈＦＩＸ導入遺伝子はコドン最適化されており（ｈＦＩＸｃｏ）、イントロンＡを含まない。ＭＶＭイントロンがＦＩＸｃｏ導入遺伝子の上流にクローニングされている。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。マウスｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼプラスミド（ｍｐＢａｓｅと表記）の模式図。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動されるマウスコドン最適化天然ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（ｍｐＢ）がβグロビンイントロン（βＧＩ）の上流にクローニングされている。ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｂｇｈｐＡ）も示されている。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。トランスポザーゼ遺伝子のない空の対照プラスミド（空と表記）の模式図。プラスミドはＣＭＶプロモーターとｂｇｈｐａポリアデニル化シグナルとの間にマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。（Ｅ、Ｆ）野生型ｈＦＩＸ導入遺伝子及び切断型イントロンＡを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ、Ｅ）又はコドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子とＭＶＭイントロンとを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏ、Ｆ）を、マウスｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする２μｇのプラスミド（＋ｍｐＢａｓｅ、実線）又は空の対照プラスミド（＋空、点線）と共に血友病Ｂマウスに流体力学的に注射した。ＥＬＩＳＡ及び発色ｈＦＩＸ活性アッセイにより、図示されている時間に採取された血漿サンプルについて、それぞれｈＦＩＸ抗原発現（黒い四角）及びｈＦＩＸ凝固活性（灰色の四角）を測定した。肝生検から抽出した全ＲＮＡから、実験の最後に定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により二倍体ゲノム当たりのトランスポゾンコピー数（Ｇ）及びｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベル（Ｈ）を測定した。ＦＩＸＩＡ ｍＲＮＡレベルに対するｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルをＨに示す。ｐＢ ｈＦＩＸｃｏプラスミドは、ｐＢＦＩＸＩＡプラスミドと比べて５７倍超のｍＲＮＡ発現を示した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。（Ｅ、Ｆ）野生型ｈＦＩＸ導入遺伝子及び切断型イントロンＡを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ、Ｅ）又はコドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子とＭＶＭイントロンとを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏ、Ｆ）を、マウスｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする２μｇのプラスミド（＋ｍｐＢａｓｅ、実線）又は空の対照プラスミド（＋空、点線）と共に血友病Ｂマウスに流体力学的に注射した。ＥＬＩＳＡ及び発色ｈＦＩＸ活性アッセイにより、図示されている時間に採取された血漿サンプルについて、それぞれｈＦＩＸ抗原発現（黒い四角）及びｈＦＩＸ凝固活性（灰色の四角）を測定した。肝生検から抽出した全ＲＮＡから、実験の最後に定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により二倍体ゲノム当たりのトランスポゾンコピー数（Ｇ）及びｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベル（Ｈ）を測定した。ＦＩＸＩＡ ｍＲＮＡレベルに対するｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルをＨに示す。ｐＢ ｈＦＩＸｃｏプラスミドは、ｐＢＦＩＸＩＡプラスミドと比べて５７倍超のｍＲＮＡ発現を示した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。（Ｅ、Ｆ）野生型ｈＦＩＸ導入遺伝子及び切断型イントロンＡを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ、Ｅ）又はコドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子とＭＶＭイントロンとを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏ、Ｆ）を、マウスｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする２μｇのプラスミド（＋ｍｐＢａｓｅ、実線）又は空の対照プラスミド（＋空、点線）と共に血友病Ｂマウスに流体力学的に注射した。ＥＬＩＳＡ及び発色ｈＦＩＸ活性アッセイにより、図示されている時間に採取された血漿サンプルについて、それぞれｈＦＩＸ抗原発現（黒い四角）及びｈＦＩＸ凝固活性（灰色の四角）を測定した。肝生検から抽出した全ＲＮＡから、実験の最後に定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により二倍体ゲノム当たりのトランスポゾンコピー数（Ｇ）及びｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベル（Ｈ）を測定した。ＦＩＸＩＡ ｍＲＮＡレベルに対するｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルをＨに示す。ｐＢ ｈＦＩＸｃｏプラスミドは、ｐＢＦＩＸＩＡプラスミドと比べて５７倍超のｍＲＮＡ発現を示した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 核酸コンストラクトへのＭＶＭイントロンのクローニングが導入遺伝子のインビボ発現に与える影響の評価。（Ｅ、Ｆ）野生型ｈＦＩＸ導入遺伝子及び切断型イントロンＡを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ、Ｅ）又はコドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子とＭＶＭイントロンとを含む１０μｇのトランスポゾンプラスミド（ｐＢ＿ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏ、Ｆ）を、マウスｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする２μｇのプラスミド（＋ｍｐＢａｓｅ、実線）又は空の対照プラスミド（＋空、点線）と共に血友病Ｂマウスに流体力学的に注射した。ＥＬＩＳＡ及び発色ｈＦＩＸ活性アッセイにより、図示されている時間に採取された血漿サンプルについて、それぞれｈＦＩＸ抗原発現（黒い四角）及びｈＦＩＸ凝固活性（灰色の四角）を測定した。肝生検から抽出した全ＲＮＡから、実験の最後に定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により二倍体ゲノム当たりのトランスポゾンコピー数（Ｇ）及びｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベル（Ｈ）を測定した。ＦＩＸＩＡ ｍＲＮＡレベルに対するｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルをＨに示す。ｐＢ ｈＦＩＸｃｏプラスミドは、ｐＢＦＩＸＩＡプラスミドと比べて５７倍超のｍＲＮＡ発現を示した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ａ、Ｂ）左から右に、（ａ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド、（ｃ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド、又は（ｄ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを２μｇのＤＮＡ（Ａ）又は５μｇのＤＮＡ（Ｂ）で流体力学的に注射されたマウスにおける予測（ａ、ｂ）及び測定（ｃ、ｄ）されたｈＦＶＩＩＩレベル。 ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ａ、Ｂ）左から右に、（ａ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド、（ｃ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド、又は（ｄ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを２μｇのＤＮＡ（Ａ）又は５μｇのＤＮＡ（Ｂ）で流体力学的に注射されたマウスにおける予測（ａ、ｂ）及び測定（ｃ、ｄ）されたｈＦＶＩＩＩレベル。 ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ｃ、Ｄ）左から右に（ｂ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおける予測ｈＦＶＩＩＩレベル；（ｃ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＶＩＩＩレベル；（ｂ）を注射されたマウスにおいて予測されたｈＦＶＩＩＩレベル及び（ｃ）を注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＶＩＩＩレベルの和；並びに（ｄ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドでトランスフェクトしたマウスにおいて測定されたｈＦＶＩＩＩレベルを示す棒である。（Ｃ）２μｇのＤＮＡを注射したマウスのデータを示す図である。（Ｄ）５μｇのＤＮＡを注射したマウスのデータを示す図である。 ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ｃ、Ｄ）左から右に（ｂ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおける予測ｈＦＶＩＩＩレベル；（ｃ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＶＩＩＩレベル；（ｂ）を注射されたマウスにおいて予測されたｈＦＶＩＩＩレベル及び（ｃ）を注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＶＩＩＩレベルの和；並びに（ｄ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドでトランスフェクトしたマウスにおいて測定されたｈＦＶＩＩＩレベルを示す棒である。（Ｃ）２μｇのＤＮＡを注射したマウスのデータを示す図である。（Ｄ）５μｇのＤＮＡを注射したマウスのデータを示す図である。 ｈＦＩＸ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ａ、Ｂ）左から右に、（ａ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｂ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｃ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｂ）プラス（ｃ）を注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＩＸ活性の和として計算された（ｂ）足す（ｃ）；並びに（ｄ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおける、注射後２日目（Ａ）及び６日目（Ｂ）のｈＦＩＸ活性を示す棒である。 ｈＦＩＸ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ａ、Ｂ）左から右に、（ａ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｂ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｃ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｂ）プラス（ｃ）を注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＩＸ活性の和として計算された（ｂ）足す（ｃ）；並びに（ｄ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおける、注射後２日目（Ａ）及び６日目（Ｂ）のｈＦＩＸ活性を示す棒である。 ｈＦＩＸ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ｃ、Ｄ）左から右に、（ｃ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｄ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｅ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｄ）及び（ｅ）を注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＩＸ活性の和として計算された（ｄ）プラス（ｅ）；並びに（ｆ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおける、注射後２日目（Ｃ）及び６日目（Ｄ）のｈＦＩＸ活性を示す棒である。 ｈＦＩＸ導入遺伝子を含む核酸発現カセットの比較を示す図である。（Ｃ、Ｄ）左から右に、（ｃ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｄ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｅ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド；（ｄ）及び（ｅ）を注射されたマウスにおいて測定されたｈＦＩＸ活性の和として計算された（ｄ）プラス（ｅ）；並びに（ｆ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおける、注射後２日目（Ｃ）及び６日目（Ｄ）のｈＦＩＸ活性を示す棒である。 ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６の模式図。野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復（ＩＲｗｔ）及び示されている点変異を含むｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン逆方向反復（ＩＲｍｕｔ１６）が発現カセットに隣接している。肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍｉｎ）プロモーターがコドン最適化ｈＦＩＸ（ｈＦＩＸｃｏ）を駆動する。マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンがＦＩＸｃｏ導入遺伝子の上流にクローニングされている。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ＨＳＨ８と表記）がＴＴＲｍｉｎプロモーターの上流に位置している。ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｐＡ）も示されている。 ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏの模式図。トランスポゾンは、微小逆方向反復（ＩＲｍｉｃｒｏ）である逆方向反復以外はｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６と同じである。 ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌの模式図。トランスポゾンは、Ｐａｄｕａ変異を含むコドン最適化ヒトＦＩＸである導入遺伝子（ｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌ）以外はｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏと同じである。 高活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（ｈｙＰＢａｓｅ）プラスミドの模式図。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される高活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（ｈｙＰＢａｓｅ）がβ−グロビンイントロン（βＧＩ）の上流にクローニングされている。高活性化変異が示されている。ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｂｇｈｐＡ）も示されている。 ｐＢトランスポゾンｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ、ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ、又はｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌによるトランスフェクションの３ヶ月後に、組換えｈＦＩＸ抗原及びアジュバントでマウスを免疫化した。免疫化後（ｐ．ｉ．）２週間目（黒色）及び４週間目（灰色）にＥＬＩＳＡにより抗ｈＦＩＸ特異的抗体を測定した。組換えｈＦＩＸ及びアジュバントで免疫化されたＰＢＳ注射血友病Ｂマウスを陽性対照として用いた。結果は平均値±平均値の標準誤差として表されている。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 （Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）１０００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）若しくは１００ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｍＰＢ（三角Ｆ、Ｇ）若しくはｈｙＰＢ発現プラスミド（Ｆ、Ｇ；四角及びＨ〜Ｋ）又は空の対照プラスミド（ハッチングされた線）と共に５００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）又は５０ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（Ｆ〜Ｋ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（Ｈ、Ｉ；三角）、又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（Ｊ、Ｋ；三角）トランスポゾンプラスミドでＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスを流体力学的にトランスフェクトした。特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、示されている時間に採取された血漿サンプルのｈＦＩＸ発現を測定した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 （Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）１０００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）若しくは１００ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｍＰＢ（三角Ｆ、Ｇ）若しくはｈｙＰＢ発現プラスミド（Ｆ、Ｇ；四角及びＨ〜Ｋ）又は空の対照プラスミド（ハッチングされた線）と共に５００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）又は５０ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（Ｆ〜Ｋ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（Ｈ、Ｉ；三角）、又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（Ｊ、Ｋ；三角）トランスポゾンプラスミドでＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスを流体力学的にトランスフェクトした。特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、示されている時間に採取された血漿サンプルのｈＦＩＸ発現を測定した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 （Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）１０００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）若しくは１００ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｍＰＢ（三角Ｆ、Ｇ）若しくはｈｙＰＢ発現プラスミド（Ｆ、Ｇ；四角及びＨ〜Ｋ）又は空の対照プラスミド（ハッチングされた線）と共に５００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）又は５０ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（Ｆ〜Ｋ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（Ｈ、Ｉ；三角）、又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（Ｊ、Ｋ；三角）トランスポゾンプラスミドでＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスを流体力学的にトランスフェクトした。特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、示されている時間に採取された血漿サンプルのｈＦＩＸ発現を測定した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊ ＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 （Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）１０００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）若しくは１００ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｍＰＢ（三角Ｆ、Ｇ）若しくはｈｙＰＢ発現プラスミド（Ｆ、Ｇ；四角及びＨ〜Ｋ）又は空の対照プラスミド（ハッチングされた線）と共に５００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）又は５０ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（Ｆ〜Ｋ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（Ｈ、Ｉ；三角）、又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（Ｊ、Ｋ；三角）トランスポゾンプラスミドでＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスを流体力学的にトランスフェクトした。特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、示されている時間に採取された血漿サンプルのｈＦＩＸ発現を測定した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 （Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）１０００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）若しくは１００ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｍＰＢ（三角Ｆ、Ｇ）若しくはｈｙＰＢ発現プラスミド（Ｆ、Ｇ；四角及びＨ〜Ｋ）又は空の対照プラスミド（ハッチングされた線）と共に５００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）又は５０ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（Ｆ〜Ｋ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（Ｈ、Ｉ；三角）、又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（Ｊ、Ｋ；三角）トランスポゾンプラスミドでＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスを流体力学的にトランスフェクトした。特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、示されている時間に採取された血漿サンプルのｈＦＩＸ発現を測定した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。 （Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）１０００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）若しくは１００ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｍＰＢ（三角Ｆ、Ｇ）若しくはｈｙＰＢ発現プラスミド（Ｆ、Ｇ；四角及びＨ〜Ｋ）又は空の対照プラスミド（ハッチングされた線）と共に５００ｎｇ（Ｆ、Ｈ、Ｊ）又は５０ｎｇ（Ｇ、Ｉ、Ｋ）のｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（Ｆ〜Ｋ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（Ｈ、Ｉ；三角）、又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（Ｊ、Ｋ；三角）トランスポゾンプラスミドでＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスを流体力学的にトランスフェクトした。特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、示されている時間に採取された血漿サンプルのｈＦＩＸ発現を測定した。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した。ｎ．ｓ．は有意でないことを意味する。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｎ＝３マウス／群）。
特定の実施形態との関連において及び特定の図面を参照して本発明を説明するが、発明はそれらに限定されず、請求項によってのみ限定される。請求項中の参照符号は範囲を限定するものと解釈されてはならない。説明されている図面は模式的であり、非限定的である。図面中、図解のため、要素のいくつかのサイズが誇張され、実寸（ｏｎ ｓｃａｌｅ）でないことがある。
本明細書及び請求項中で「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用される場合、これは他の要素又はステップを除外しない。「を含む」という用語は更に、「からなる」及び「から本質的になる」として定義される更に具体的な実施形態を包含する。
特に断りのない限り、単数形の名詞は、その名詞の複数形を包含する。
更に、明細書及び請求項中の第１、第２、第３等の用語は、同様な要素を識別するために用いられ、必ずしも一連の又は経時的な順番を説明するために用いられない。
そのように用いられる用語は適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載されている発明の実施形態は、本明細書に説明又は記載されているのとは異なる順番で実施するこ
とができると理解されるべきである。
以下の用語又は定義は発明の理解を助けるために提供される。本明細書中で特に断りのない限り、本明細書中で使用される全ての用語は、本発明が属する分野の熟練者にとってそれらが有するのと同じ意味を有する。実務者は特に、当該技術分野の定義及び用語について、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989)；及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)を参照されたい。
本明細書中に提供される定義は、当業者によって理解されるよりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
「凝固第ＩＸ因子」という用語は、当該技術分野で知られているのと同じ意味を有する。凝固第ＩＸ因子の同義語は「ＦＩＸ」、「クリスマス因子」、又は「Ｆ９」であり、これらは交換可能に用いることができる。特に、「凝固第ＩＸ因子」という用語は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１３３によって定義されるｍＲＮＡ配列によってコードされるヒトタンパク質を包含する。
好ましくは、前記ＦＩＸは変異ＦＩＸであり、これは、野生型ＦＩＸと比べて高活性（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ）又は高機能性（ｈｙｐｅｒ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）である。生物工学、例えば点変異の導入により、ヒト凝固因子の機能的活性を改変することができる。このアプローチにより、高活性Ｒ３３８Ａバリアントが報告されており、これは、インビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＰＴ）において野生型ヒトＦＩＸの３倍の凝固活性を示し（Chang et al., 1998）、変異ＦＩＸ遺伝子を形質導入された血友病Ｂマウスにおいて２〜６倍高い比活性を示した（Schuettrumpf et al., 2005）
。更に高い凝固活性を有するＦＩＸ点変異体又はドメイン交換変異体の更なる例が報告されている：Ｒ３３８Ａ点変異と組み合わせた又は単独の、ＥＧＦ−１ドメインが、ＦＶＩＩに由来するＥＧＦ−１ドメインで置換されたＦＩＸ（Brunetti-Pierri et al., 2009）、Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａ三重変異体（Lin et al., 2010）、Ｙ２５９Ｆ、Ｋ２６５Ｔ、及び／又はＹ３４５Ｔの、単一、二重、又は三重変異体（Milanov, et al., 2012）、並びにＧ１９０Ｖ点変異体（Kao et al., 2010）。これら全てを参照により本明
細書に援用する。特に好ましい実施形態では、ＦＩＸ変異体は、Ｘ連鎖血栓形成傾向を生じさせる、Simioni et al., (2009)で報告されている「ｆａｃｔｏｒ ＩＸ Ｐａｄｕａ」変異体と命名されたものである。前記変異体第ＩＸ因子は高活性であり、Ｒ３３８Ｌアミノ酸置換を有する。本発明の好ましい実施形態では、発現ベクター中に用いられるＦＩＸ導入遺伝子はヒトＦＩＸタンパク質をコードし、最も好ましくは、ＦＩＸ導入遺伝子はヒトＦＩＸタンパク質のＰａｄｕａ変異体をコードする。
「凝固第ＶＩＩＩ因子」という用語は当該技術分野で知られている意味を有する。凝固第ＶＩＩＩ因子の同義語は、「ＦＶＩＩＩ」、「抗血友病因子」、又は「ＡＨＦ」であり、本明細書中で交換可能に使用され得る。「凝固第ＶＩＩＩ因子」という用語は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ００４５１中で定義されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質を包含する。
実施形態では、前記ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインが欠失したＦＶＩＩＩ（すなわち、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ。本明細書ではＢＤＤ ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩΔＢともいう）である。「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」という用語は、例えば、限定されるものではないが、Ｂドメインの全体又は一部が欠失したＦＶＩＩＩ変異体及びＢドメインがリンカーで置換されたＦＶＩＩＩ変異体を包含する。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの非限定的な例は、
参照により具体的に本明細書に援用するWard et al． (2011)及び国際公開第２０１１／
００５９６８号に記載されている。
好ましい実施形態では、前記ＦＶＩＩＩは、以下の配列を有するリンカーでＢドメインが置換されたＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである：ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＴＲＨＱＲ（配列番号１６）（すなわち、Ward et al. (2011)で定義されているＳＱ ＦＶＩＩＩ）。特に好ましい実施形態では、前記ＦＶＩＩＩは配列番号７（すなわち、コドン最適化Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）を有し、国際公開第２０１１／００５９号にも開示されている。
本発明において、「制御要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、遺伝子の転写、特に遺伝子の組織特異的転写を制御及び／又は調節できる転写調節要素（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｔｏｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）、特に非コードシス作用性転写調節要素を指す。制御要素は、少なくとも１つの転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、より具体的には組織特異的転写因子への少なくとも１つの結合部位、最も具体的には肝臓特異的転写因子への少なくとも１つの結合部位を含む。典型的には、本発明において、制御要素は、プロモーターによって駆動される遺伝子発現を、制御要素なしでプロモーターのみからの遺伝子の転写と比べて、増強又は増大させる。したがって、制御要素は特にエンハンサー配列を含み、但し、転写を増大させる制御要素は典型的なはるか上流のエンハンサー配列に限定されず、それらが制御する遺伝子から任意の距離にあってよいと理解されるべきである。実際、転写を制御する配列は、インビボでそれらが制御する遺伝子の上流（例えば、プロモーター領域中）又は下流（例えば、３’ＵＴＲ中）のいずれにも位置し得、遺伝子のすぐ近く又は更に遠くに位置してもよいことが当該技術分野で知られている。注目すべきことに、本明細書に開示されている制御要素は典型的には天然配列であるが、そのような制御要素の（パーツの）組合せ又は複数コピーの制御要素、すなわち非天然配列も制御要素として想定される。本発明において、制御要素は、転写調節に関わる更に大きな配列の一部、例えばプロモーター配列の一部であり得る。しかし、制御要素単独では通常、転写開始に充分ではなく、この目的のためにはプロモーターを必要とする。
本明細書に開示される核酸発現カセット及びベクターに含まれる制御要素は好ましくは肝臓特異的である。肝臓特異的な制御要素の非限定的な例は、参照により具体的に本明細書に援用する国際公開第２００９／１３０２０８号に開示されている。
好ましい実施形態では、本明細書中に開示されている核酸発現カセット及びベクター中の制御要素は、セルピン遺伝子プロモーターに由来する肝臓特異的制御要素である。前記制御要素は、配列番号８に定義される配列、前記配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列、又はその機能的断片を含む。前記制御要素は、本明細書中、「Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー」、「ＳｅｒｐＥｎｈ」、又は「Ｓｅｒｐ」と呼ばれる。
更なる実施形態では、本明細書に開示される核酸発現カセット及びベクター中の制御要素は、配列番号８（すなわち、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー。本明細書中では「ＳｅｒｐＥｎｈ」、又は「Ｓｅｒｐ」ともいう）によって定義される配列からなる。
本願中、「肝臓特異的発現」とは、他の組織と比べて肝臓中での（ＲＮＡ及び／又はポリペプチドのような）（導入）遺伝子の優先的又は優勢な発現を指す。具体的な実施形態では、（導入）遺伝子発現の少なくとも５０％が肝臓内で起こる。より具体的な実施形態では、（導入）遺伝子発現の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくと
も９７％、少なくとも９９％、又は１００％が肝臓内で起こる。具体的な実施形態によれば、肝臓特異的発現は、発現した遺伝子産物が他の器官、例えば脾臓、筋肉、心臓、及び／又は肺に漏出しないことを必然的に伴う。同じことが、肝臓特異的発現の特定の形態であると見なすことができる肝細胞特異的発現に準用される。本願全体を通して、発現の文脈中で肝臓特異的と言及される場合、肝細胞特異的発現も明確に想定される。同様に、本願中で組織特異的発現が用いられる場合、組織を主に構成する細胞型の細胞型特異的発現も想定される。
本願中、「機能的断片」という用語は、肝臓特異的発現の制御能を保持している本明細書に開示されている配列のフラグメントを指し、すなわち、それらはまだ組織特異性を付与し、それらが由来する配列と同じ方法（但し、おそらくは同じ程度ではない）で（導入）遺伝子の発現を制御することができる。フラグメントは、それらが由来する配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。更に具体的な実施形態では、フラグメントは、それらが由来する配列の少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも４０個の連続するヌクレオチドを含む。
本発明において、「核酸発現カセット」という用語は、１又は複数の所望の細胞型、組織、又は器官中での（導入）遺伝子発現を方向付ける１又は複数の転写調節要素（例えば、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー及び／又は制御要素、ポリアデニル化配列、並びにイントロン）を含む核酸分子を指す。典型的には、それらは、本明細書に定義されているように、ＦＩＸ導入遺伝子又はＦＶＩＩＩ導入遺伝子を更に含む。
本発明において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、核酸分子要素が機能的に連結されて互いに相互作用できるような、それぞれに対する種々の核酸分子要素の配置を指す。そのような要素としては、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー及び／又は制御要素、ポリアデニル化配列、１又は複数のイントロン及び／又はエキソン、並びに発現すべき目的の遺伝子（すなわち、導入遺伝子）のコード配列が含まれ得る。核酸配列要素は、適切に配向された又は作動可能に連結された場合、一緒に作用して互いの活性を調節し、究極的には導入遺伝子の発現レベルに影響を与え得る。調節とは、特定の要素の活性レベルを上昇、低下、又は維持することを意味する。各要素の、他の要素に対する位置は、各要素の５’末端及び３’末端の点から表現することができ、任意の特定の要素間の距離は、要素間の介在ヌクレオチド又は塩基対の数によって言及され得る。
本願において、「プロモーター」という用語は、それらが作動可能に連結されている対応する核酸コード配列（例えば、導入遺伝子又は内因性遺伝子）の転写を直接又は間接的に制御する核酸配列を指す。プロモーターは、単独で転写を制御するように機能してよく、１又は複数の他の制御配列（例えば、エンハンサー又はサイレンサー）と協同して作用してもよい。本願の文脈では、プロモーターは通常、導入遺伝子の転写を制御するための制御要素に作動可能に連結されている。
本明細書に記載の制御要素がプロモーター及び導入遺伝子の両方に作動可能に連結されている場合、制御要素は、（１）導入遺伝子のインビボにおける顕著な肝臓特異的（及び／又はインビトロで肝細胞／肝細胞セルライン中での）発現を付与することができ、且つ／又は（２）肝臓中（及び／又は肝細胞／肝細胞セルライン中）での導入遺伝子の発現レベルを上昇させることができる。
具体的な実施形態では、本明細書に開示されている核酸発現カセット及びベクター中に含まれるプロモーターは肝臓特異的プロモーターである。更なる具体的な実施形態では、肝臓特異的プロモーターはトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子に由来する。更により具
体的な実施形態では、ＴＴＲプロモーターはミニマルプロモーター（本明細書中ではＴＴＲｍ、ｍＴＴＲ、又はＴＲＲｍｉｎともいう）であり、最も具体的には、配列番号９中で定義されるミニマルＴＴＲプロモーターである。
別の具体的な実施形態では、本明細書に開示されている核酸発現カセット及びベクター中のプロモーターはミニマルプロモーターである。
本発明において、「ミニマルプロモーター」とは、発現を駆動することがまだできるが、（例えば組織特異的）発現の制御に寄与する配列の少なくとも一部を欠く、全長プロモーターの一部である。この定義は、遺伝子の発現を駆動できるが組織特異的な様式でその遺伝子を発現させる能力を失った、（組織特異的）制御要素が欠失したプロモーター、及び遺伝子の（おそらくは弱まった）発現を駆動できるが組織特異的様式でその遺伝子を発現させる能力は必ずしも失っていない、（組織特異的）制御要素が欠失したプロモーターの両方を網羅する。ミニマルプロモーターは当該技術分野で広く報告されており、ミニマルプロモーターの非限定的なリストを明細書中に提供する。
典型的には、本発明に係る発現ベクター中の核酸発現カセットは、プラスミドオリジン、プロモーター及び／又はエンハンサー、（導入）遺伝子、転写ターミネーター、並びに選択遺伝子を含む。
実施形態では、本発明に係る発現ベクター中の核酸発現カセットは以下の要素を含む：−ｆ１オリジン等のプラスミドオリジン、
−逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）（変異されている場合もある）、
−エンハンサー、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）、
−プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）、
−ＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化導入遺伝子、
−転写ターミネーター、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばｂＧＨｐＡ、
−逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、
−選択遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子）、及び
−ｐＢＲ３２２オリジン等のプラスミドオリジン。
本明細書に記載の核酸発現カセット中へのＭＶＭイントロンのクローニングにより、そこに作動可能に連結された導入遺伝子の予想外に高い発現レベルが示された。
本発明の典型的な実施形態では、発現ベクター中の前記核酸発現カセットは以下の要素を含む（図１参照）：
−ｆ１オリジン等のプラスミドオリジン、
−逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）（変異されている場合もある）、
−エンハンサー、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）、
−プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）、
−イントロン配列、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはＦＩＸコード遺伝子又はそのＰａｄｕａ変異体形態、
−転写ターミネーター、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばｂＧＨｐＡ、
−逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、
−選択遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子）、及び
−ｐＢＲ３２２オリジン等のプラスミドオリジン。
前記要素の組合せにより、対象の肝臓中で予想外に高い発現レベルのＦＩＸ及び特にそのＰａｄｕａ変異体が得られた。好ましくは、ベクターは、Ｐａｄｕａ変異ＦＩＸ遺伝子と組み合わされたアデノ随伴ウイルスに由来するベクターである。
本発明の別の典型的な実施形態では、ベクター中の前記核酸発現カセットは以下の要素を含む：
−ｆ１オリジン等のプラスミドオリジン、
−逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）（場合により変異されていてもよい）、
−肝臓特異的制御要素、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー、
−プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーター、
−イントロン配列、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、更により好ましくはコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばサル空胞ウイルス４０又はサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、
−逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、
−選択遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子）、及び
−ｐＢＲ３２２オリジン等のプラスミドオリジン。
前記要素の組合せにより、対象の肝臓中に特異的な予想外に高い発現レベルのＦＶＩＩＩが得られた。好ましくは、ベクターは、コドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡと組み合わせたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターである。
本発明の典型的な実施形態では、本明細書に開示されているベクター中の前記核酸発現カセットは以下を含む：
−肝臓特異的制御要素、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー、
−プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーター、
−ＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化導入遺伝子、
−転写ターミネーター、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル。
本発明の別の典型的な実施形態では、本明細書に開示されているベクター中の前記核酸発現カセットは以下を含む：
−肝臓特異的制御要素、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー、
−プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーター、
−イントロン配列、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、更により好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル。
本発明の更に別の典型的な実施形態では、本明細書に開示されているベクター中の前記核酸発現カセットは以下を含む：
−肝臓特異的制御要素、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー、
−プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーター、
−イントロン配列、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、更により好ましくはコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばサル空胞ウイルス４
０又はサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、
本発明において、「導入遺伝子」又は「（導入）遺伝子」という用語は、核酸配列が挿入される細胞中で発現すべきポリペプチド又はポリペプチドの一部をコードする特定の核酸配列を指す。しかし、典型的には核酸配列が挿入される細胞中で特定のポリペプチドの量を減少させるために、導入遺伝子をＲＮＡとして発現させることも可能である。これらのＲＮＡ分子としては、限定されるものではないが、ＲＮＡ干渉（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ制御（ｍｉＲ）、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等を介してその機能を発揮する分子が含まれる。どのようにして核酸配列が細胞に導入されるかは本発明にとって重要ではなく、例えば、ゲノム中への組込みを介して又はエピソームプラスミドとしてであり得る。注目すべきことに、導入遺伝子の発現は、核酸配列が挿入された細胞の一部に限定され得る。「導入遺伝子」という用語は、（１）細胞中に天然には見出されない核酸配列（すなわち、異種核酸配列）；（２）導入された細胞中に天然に見出される核酸配列の変異体形態である核酸配列；（３）導入された細胞中に天然に存在する同じ（すなわち、相同な）又は類似の核酸配列の更なるコピーを付加する役割をする核酸配列；又は（４）導入された細胞中で発現が誘導されるサイレントな天然の又は相同な核酸配列を含むことが意図される。「変異体形態（ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍ）」とは、野生型又は天然の配列とは異なる１又は複数のヌクレオチドを含む核酸配列を意味し、すなわち、変異核酸配列は１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は挿入を含む。場合によっては、導入遺伝子は更に、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるようにリーダーペプチド又はシグナル配列をコードする配列を含み得る。
本願において、「ベクター」という用語は、その中に別の核酸分子（インサート核酸分子）、例えば限定されるものではないがｃＤＮＡ、が挿入されていてよい核酸分子、通常は二本鎖ＤＮＡを指す。ベクターは、インサート核酸分子を好適な宿主細胞中に輸送するために用いられる。ベクターは、インサート核酸分子の転写及び場合により転写産物からポリペプチドへの翻訳を可能にする必要な要素を含み得る。インサート核酸分子は、宿主細胞に由来してよく、あるいは異なる細胞又は生物に由来してもよい。宿主細胞中では、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡから独立して又はそれと同時に複製することができ、複数コピーのベクター及びその挿入核酸分子が生じ得る。
したがって、「ベクター」という用語は、標的細胞中への遺伝子移入を容易にする遺伝子送達媒体としても定義することができる。この定義は非ウイルスベクター及びウイルスベクターの両方を含む。非ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、カチオン性脂質、リポソーム、ナノ粒子、ＰＥＧ、ＰＥＩ等が含まれる。ウイルスベクターは、限定されるものではないが以下を含むウイルスに由来する：レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス等。必ずではないが、典型的には、ウイルスベクターは、複製に必要なウイルス遺伝子がウイルスベクターから除かれており、所与の細胞中で増殖する能力を失っているので、複製欠損である。しかし、一部のウイルスベクターは、例えば癌細胞等の所与の細胞中で特異的に複製するようになっていることがあり、典型的には、（癌）細胞特異的（腫瘍）崩壊を引き起こすために用いられる。
好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、及びアンチウイルスに由来する。あるいは、遺伝子送達系を用いて、ナノ粒子又はビロソーム等、ウイルス成分及び非ウイルス成分を組み合わせることができる（Yamada et al., 2003
）。
レトロウイルス及びアンチウイルスは、感染後に宿主細胞染色体中にそれらの遺伝子を挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子が
欠如しているが、細胞に感染して標的細胞の染色体中に遺伝子を挿入する能力は保持しているレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターが開発されている（Miller, 1990; Naldini et al., 1996、VandenDriessche et al., 1999）。レンチウイルスと古典的なモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）をベースとするレトロウイルスベクターとの差は、レンチウイルスベクターが分裂細胞及び非分裂細胞の両方に形質導入できるのに対し、ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは分裂細胞だけに形質導入できるということである。
アデノウイルスベクターは、生きた対象に直接投与されるように設計されている。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターゲノムのほとんどは宿主細胞の染色体中に組み込まれない。その代わり、アデノウイルスベクターを用いて細胞に導入された遺伝子は、長時間残る染色体外因子（エピソーム）として核内に維持される。アデノウイルスベクターは、気道上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、及び種々の腫瘍を含む多くの異なる組織の分裂及び非分裂細胞にインビボで形質導入する（Trapnell, 1993; Chuah et al., 2003）。別のウイルスベクターは、大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルスに由来する。もう１つのｄｓＤＮＡであるワクシニアウイルスの組換え形態は、大きなインサートを収容することができ、相同組換えによって作製される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及び一部の他の霊長類の種に感染する小さなｓｓＤＮＡウイルスであり、疾患を引き起こすことは知られておらず、そのため非常に軽度の免疫応答しか生じさせない。ＡＡＶは分裂及び非分裂細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムにそのゲノムを組み込むことができる。これらの特徴のため、ＡＡＶは、ベクターのクローニング容量が比較的限定的であるが、遺伝子治療用のウイルスベクター作製のための非常に魅力的な候補である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、使用されるベクターはアデノ随伴ウイルスに由来する（すなわち、ＡＡＶベクター）。
例えばＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型８、及びＡＡＶ血清型９等の種々の血清型のＡＡＶが単離及び特徴解析されており、本明細書では全てのＡＡＶ血清型が想定される。好ましい実施形態では、使用されるベクターはＡＡＶ血清型９である。
本明細書に開示されているＡＡＶベクターは、一本鎖（すなわち、ｓｓＡＡＶベクター）又は自己相補的（すなわち、ｓｃＡＡＶベクター）であり得る。具体的には、本明細書に開示されているＦＩＸ導入遺伝子を含むＡＡＶベクターは好ましくは自己相補的であり、本明細書に開示されているＶＩＩＩ導入遺伝子を含むＡＡＶベクターは好ましくは一本鎖である。「自己相補的ＡＡＶ」という用語は、本明細書中で、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するようにコード領域が設計された組換えＡＡＶ由来ベクターを意味する。
本明細書に開示されているアデノ随伴ウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、ベクターに含まれる導入遺伝子に対する免疫寛容を誘導することが示された。
別の態様では、ベクターはトランスポゾンをベースとしたベクターである。好ましくは、前記トランスポゾンベースのベクターは、好ましくは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）又はＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）に由来する。好ましいＳＢトランスポゾンがIvics et al. (1997)に記載されている。
好ましい実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは、本明細書に開示されている核酸発現カセットを含む。
実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターはＰｉｇｇｙＢａｃベースのトラ
ンスポゾンである。そのようなベクターは、腫瘍発生リスクを高めない点で安全である。更に、これらのベクターを用いた肝臓指向性遺伝子治療は、ベクターに含まれる導入遺伝子、特にｈＦＩＸに対する免疫寛容を誘導することが示された。
更なる実施形態では、前記ＰｉｇｇｙＢａｃベースのベクターは、微小逆方向反復、好ましくは配列番号２９及び配列番号３０を有する逆方向反復を含む。「微小逆方向反復」とは、本明細書中で、天然配列の大部分が除去された逆方向反復を意味する。微小逆方向反復の例はMeir et al.（2011. BMC Biotechnology 11:28）に記載されており、配列ｔｔａａｃｃｃｔａｇａａａｇａｔａａｔｃａｔａｔｔｇｔｇａｃｇｔａｃｇｔｔａａａｇａｔａａｔｃａｔｇｃｇｔａａａａｔｔｇａｃｇｃａｔｇ（配列番号２９）及びｇｃａｔｇｃｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｇｃａｇａｃｔａｔｃｔｔｔｃｔａｇｇｇｔｔａａ（配列番号３０）を特徴とする。そのような微小逆方向反復は、好ましくは、ベクターに含まれる導入遺伝子の発現レベルを上昇させる。
特に好ましい実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーと、ミニマルトランスサイレチンプロモーターと、マウス微小ウイルスのイントロンと、コドン最適化ヒトＦＩＸ Ｐａｄｕａ変異体と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含むＰｉｇｇｙＢａｃベースのトランスポゾン、例えば配列番号１５によって定義されるトランスポゾンである。更なる実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは微小逆方向反復を含む。
別の特に好ましい実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーと、ミニマルトランスサイレチンプロモーターと、マウス微小ウイルスイントロンと、コドン最適化ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含むＰｉｇｇｙＢａｃべースのトランスポゾン、例えば配列番号１４によって定義されるトランスポゾンである。更なる実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは微小逆方向反復を含む。
別の特に好ましい実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーと、ミニマルトランスサイレチンプロモーターと、マウス微小ウイルスイントロンと、コドン最適化ヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡと、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとを含むＰｉｇｇｙＢａｃベースのトランスポゾン、例えば配列番号１３によって定義されるトランスポゾンである。更なる実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは微小逆方向反復を含む。
更に別の特に好ましい実施形態では、前記トランスポゾンベースのベクターは、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーと、ミニマルトランスサイレチンプロモーターと、マウス微小ウイルスイントロンと、コドン最適化ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含むＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベースのトランスポゾンである（図８Ｉ）。
本明細書に開示されているトランスポゾンベースのベクターは、好ましくは、遺伝子治療のためにトランスポザーゼをコードするベクターと組み合わせて投与される。例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ由来トランスポゾンベースベクターは、野生型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（Ｐｂａｓｅ）又はマウスコドン最適化ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（ｍＰＢａｓｅ）と共に投与することができ、好ましくは、前記トランスポザーゼは高活性トランスポザーゼ、例えば、参照により具体的に本明細書に援用するYusa et al. (2011
）に記載されているように７個のアミノ酸置換（Ｉ３０Ｖ、Ｓ１０３Ｐ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５３８Ｋ、Ｎ５７０Ｓ）を含む高活性ＰＢ（ｈｙＰＢ）トランスポザーゼ及びＳＢｍａｘトランスポザーゼである。
トランスポゾン／トランスポザーゼコンストラクトは、流体力学的注射又は非ウイルス性ナノ粒子を用いることにより送達して肝細胞にトランスフェクトすることができる。
更に具体的な態様では、本明細書に記載の核酸制御要素、核酸発現カセット、及びベクターは遺伝子治療に使用することができる。インビトロにおいて、さらにはインビボにおいて標的細胞中で治療遺伝子産物発現を実現することを意図した遺伝子治療プロトコールは当該技術分野で広く報告されている。それらには、限定されるものではないが、プラスミドＤＮＡの筋肉内注射（裸又はリポソーム中）、間質注射（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、気道への滴下、内皮、肝臓内実質、及び静脈内又は動脈内投与（例えば、肝臓内動脈、肝臓内静脈）への適用が含まれる。標的細胞によるＤＮＡの利用能を高めるための種々のデバイスが開発されている。簡便なアプローチは、ＤＮＡを含むカテーテル又は移植可能材料と標的細胞を物理的に接触させることである。もう１つのアプローチは、高圧下で標的組織中に直接液体の柱（ａ ｃｏｌｕｍｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ）を発射する、針のないジェット注射デバイスを用いることである。これらの送達パラダイムを用いてウイルスベクターを送達することもできる。標的化された遺伝子送達のもう１つのアプローチは、細胞に核酸を特異的に標的化するための核酸結合剤又はＤＮＡ結合剤が結合したタンパク質又は合成リガンドからなる分子コンジュゲートの使用である（Cristiano et al., 1993）。
具体的な実施形態では、本明細書に記載の核酸制御要素、核酸発現カセット、又はベクターの使用が肝臓細胞の遺伝子治療に想定される。更なる具体的な実施形態では、制御要素、発現カセット、又はベクターの使用はインビボでの遺伝子治療のためである。更なる具体的な実施形態では、使用は、血友病を処置するため、特に血友病Ｂ又は血友病Ａを処置するための遺伝子治療法のためである。
エクスビボ及びインビボの方法の両方を用いて哺乳動物肝細胞への遺伝子移入が行われた。エクスビボのアプローチは、肝細胞の回収、長期発現ベクターによるインビトロでの形質導入、及び形質導入された肝細胞の門脈循環への再導入が必要である（Kay et al., 1992; Chowdhury et al., 1991）。インビボでの標的化は、肝実質、肝動脈、又は門脈中へのＤＮＡ又はウイルスベクターの注射により、及び転写標的化により行われた（Kuriyama et al., 1991; Kistner et al., 1996）。最近の方法としては更に、裸ＤＮＡの門脈
内送達（Budker et al., 1996）及び流体力学的尾静脈トランスフェクション（Liu et al., 1999; Zhang et al., 1999）が含まれる。
更なる態様では、本明細書に記載の核酸発現カセット（又はベクター）を肝細胞中に導入するステップ及び肝細胞中で導入遺伝子タンパク質産物を発現させるステップを含む肝細胞中でタンパク質を発現させる方法が提供される。これらの方法は、インビトロ及びインビボの両方で行われ得る。
治療タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを対象の肝臓に導入するステップ及び治療量の治療タンパク質を肝臓中で発現させるステップを含む、それを必要とする対象のための遺伝子治療法も提供される。更なる実施形態では、方法は、治療タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓に導入するステップ及び治療量の治療タンパク質を肝臓中で発現させるステップを含む。
非常に具体的な実施形態では、核酸発現カセット中の導入遺伝子にコードされる治療タンパク質は第ＩＸ因子であり、方法は、血友病Ｂを処置する方法である。遺伝子治療により肝臓中で第ＩＸ因子を発現させることにより、血友病Ｂを処置することができる（Snyder et al., 1999）。
別の非常に具体的な実施形態では、核酸発現カセット中の導入遺伝子にコードされる治療タンパク質は第ＶＩＩＩ因子であり、方法は、血友病Ａを処置する方法である。
特に断りのない限り、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」又は「患者」という用語は交換可能に使用され、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物を指し、具体的にはヒト患者及び非ヒト哺乳動物を含む。「哺乳動物」対象としては、限定されるものではないが以下のものが含まれる：ヒト、飼育動物、商用の動物、農場の動物、動物園の動物、競技用の動物、ペット、及び実験動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー；イヌ科、例えばイヌ及びオオカミ；ネコ科、例えばネコ、ライオン、及びトラ；ウマ類、例えばウマ、ロバ、及びシマウマ；食料用の動物、例えば雌ウシ、ブタ、及びヒツジ；有蹄動物、例えばシカ及びキリン；齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等。したがって、本発明において、「対象」又は「患者」は、本発明の組成物が投与され得るあらゆる哺乳動物の患者又は対象を意味する。好ましい患者又は対象はヒト対象である。
本発明において、「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方を指し、目的は、増殖性疾患、例えば癌の発達又は拡散等の望ましくない生理学的変化又は障害を防止又は遅らせる（和らげる）ことである。有益な又は望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であれ検出不能であれ、症状の軽減、疾患の範囲の減少、安定化された（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の軽減又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的）が含まれる。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予想される生存時間と比べて生存時間を長くすることを意味し得る。
本発明において、「処置の必要な対象」等の語句は、血友病Ｂ等の所与の状態の処置による恩恵を受ける哺乳動物対象等の対象を含む。そのような対象としては通常、限定されるものではないが、状態を診断された対象、前記状態を有し易い若しくは発症し易い対象、及び／又は状態を防止すべき対象が含まれる。
「治療有効量」という用語は、対象における疾患又は障害を処置するのに、すなわち所望の局所的又は全身的な効果及び成績を得るのに有効な本発明の化合物又は医薬組成物の量を指す。具体的な実施形態では、この用語は、対象中への本明細書に記載されている実施形態のいずれかに係るベクターの形質導入又はトランスフェクションによって対象中で治療閾値濃度１０ｍＵ／ｍｌ（ミリ単位毎ミリリットル）血漿、５０ｍＵ／ｍｌ血漿、１００ｍＵ／ｍｌ血漿、１５０ｍＵ／ｍｌ、又は２００ｍＵ／ｍｌ血漿以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得ることができることを意味する。本発明のベクター及び核酸発現カセットは非常に高効率であるので、比較的低用量のベクター投与でも、対象中におけるこの高い生理学的レベルの第ＩＸ因子を得ることができる。別の具体的な実施形態では、この用語は、対象中への本明細書に開示されているベクターのいずれかの形質導入又はトランスフェクションにより、治療閾値濃度の１０ｍＵ／ｍｌ（ミリ単位毎ミリリットル）血漿以上、５０ｍＵ／ｍｌ血漿、１００ｍＵ／ｍｌ血漿、１５０ｍＵ／ｍｌ血漿、２００ｍＵ／ｍｌ血漿、又はそれ以上の血漿中第ＶＩＩＩ因子レベルを得ることができることを意味する。本明細書に開示のベクター及び核酸発現カセットは非常に高効率であるので、比較的低用量のベクター投与でも、対象中におけるこの高い生理学的レベルの第ＶＩＩＩ因子を得ることができる。したがって、この用語は、処置されている血友病の症状の軽減を含む研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医が探求している組織、系、動物、又はヒトにおける生物学的又は医学的反応を惹起する化合物又は医薬組成物の量を指す。特に、これらの用語は、１回分又は複数回分の用量で、血友病、特に血友病Ｂ又は血友病Ａに関連する臨床
的な障害、症状、又は合併症を防止、治癒、軽減、又は少なくとも最低限に抑えるために必要な本発明に係る化合物又は医薬組成物の量を指す。
特に、本明細書中で定義される実施形態のいずれかに係るベクターの対象への形質導入は、対象において１０ｍＵ／ｍｌ血漿又は５０ｍＵ／ｍｌ血漿の生理学的第ＩＸ因子レベルが得られるように、２×１０１１ｖｇ／ｋｇ（ウイルスゲノム毎キログラム）より低い用量で行われ得る。
あるいは、対象中で１００ｍＵ／ｍｌ血漿の第ＩＸ因子レベルに達する必要がある場合、本明細書に定義される実施形態のいずれかに係るベクターの対象への形質導入は６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ得る。
更に、１５０ｍＵ／ｍｌ血漿以上の第ＩＸ因子レベルに達する必要がある場合、本明細書に定義される実施形態のいずれかに係るベクターの対象への形質導入は２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ得る。好ましい実施形態では、本明細書に定義される実施形態のいずれかに係るベクターの対象への形質導入を２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行った時、２００ｍＵ／ｍｌ血漿以上の第ＩＸ因子レベルを対象中で達成することができる。
特に、本明細書に定義される実施形態のいずれかに係るベクターの対象への形質導入は、対象中で１０ｍＵ／ｍｌ血漿、５０ｍＵ／ｍｌ血漿、１００ｍＵ／ｍｌ血漿、１５０ｍＵ／ｍｌ血漿、２００ｍＵ／ｍｌ血漿、又はそれ以上の生理学的第ＩＶＩＩＩ因子レベルを得るために、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ（ウイルスゲノム毎キログラム）以下の用量、例えば１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、５×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、５×１０９ｖｇ／ｋｇ、又は１×１０９ｖｇ／ｋｇ以下の用量、好ましくは２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ得る。
血友病治療のためには、例えば対象において血友病により生じる出血を評価することにより処置の有効性を測定することができる。インビトロ試験、例えば、限定されるものではないが、インビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＰＴ）、試験第ＩＸ因子発色活性アッセイ、血液凝固時間、第ＩＸ因子又はヒト第ＶＩＩＩ因子特異的ＥＬＩＳＡも利用可能である。当然、当該技術分野で公知の処置の有効性を評価するための任意の他の試験を用いることもできる。
本発明の化合物又は医薬組成物は、単独で用いてもよく、組換えした又は精製した凝固因子の投与等の公知の血友病治療のいずれかと組み合わせて用いてもよい。したがって、本発明の化合物又は医薬組成物は、単独で投与されてもよく、１又は複数の活性化合物と組み合わせて投与されてもよい。１又は複数の活性化合物は、前記薬剤の投与の前、後、又は同時に投与され得る。
本発明の更なる目的は、治療有効量の本明細書に定義される本発明の発現ベクター並びに薬学的に許容されるキャリア、すなわち１又は複数の薬学的に許容されるキャリア物質及び／又は添加剤、例えばバッファー、キャリア、補形剤、安定化剤等を含む医薬製剤である。本発明において、「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」という用語は、当該技術分野で通常用いられている通りであり、医薬組成物のその他の成分と適合し（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）、そのレシピエントに有害でないことを意味する。本発明において、「薬学的に許容される塩」とは無機酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩又は有機酸付加塩、例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩を意味する。薬学的に許容される金属塩の例とし
ては、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩及びカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばマグネシウム塩及びカルシウム塩、アルミニウム塩、並びに亜鉛塩が挙げられる。薬学的に許容されるアンモニウム塩の例としてはアンモニウム塩及びテトラメチルアンモニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される有機アミン付加塩の例としては、モルホリン及びピペリジンとの塩が挙げられる。薬学的に許容されるアミノ酸付加塩の例としては、リジン、グリシン、及びフェニルアラニンとの塩が挙げられる。本発明に係る医薬組成物は、経口で、例えば、丸剤、錠剤、ラッカー錠剤（ｌａｃｑｕｅｒｅｄ ｔａｂｌｅｔ）、糖衣錠、顆粒剤、硬及び柔ゼラチンカプセル剤、水性、アルコール性、若しくは油性の液剤、シロップ剤、乳剤、又は懸濁剤の形態で投与することができ、あるいは、例えば坐剤の形態で、直腸投与することができる。投与は非経口的に行われてもよく、例えば、注射又は注入のための液剤の形態で皮下、筋肉内、又は静脈内に行われてもよい。その他の好適な投与形態としては、例えば、軟膏、チンキ剤、噴霧剤、若しくは経皮治療系の形態等での経皮若しくは局所投与、点鼻薬若しくはエアゾール混合物の形態での吸入投与、又は例えばマイクロカプセル、移植片、若しくはロッド（ｒｏｄ）が挙げられる。医薬組成物は当業者に公知の方法で製造することができる。そのために、本明細書に定義される本発明に係る発現ベクター、１又は複数の固体又は液体の薬学的に許容される補形剤、及び所望により組み合わせてもよい他の医薬活性化合物を好適な投与形態又は剤形にし、次いでこれをヒト医学又は獣医学における医薬として用いることができる。
別の態様では、治療タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットと薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。別の実施形態では、医薬組成物は、治療タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含むベクターと薬学的に許容されるキャリアとを含む。更に具体的な実施形態では、導入遺伝子が第ＩＸ因子をコードし、医薬組成物は血友病Ｂを処置するためのものであるか、導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子をコードし、医薬組成物は血友病Ａを処置するためのものである。
血友病、好ましくは血友病Ｂ又は血友病Ａの処置に使用するためのこれらの医薬組成物の製造における本明細書に開示の核酸発現カセット、その制御要素、及びベクター成分の使用も想定される。
本発明に係る方法及び応用例のために特定の実施形態、具体的な構成及び配置、並びに材料を本明細書中に記載したが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく種々の変更及び改変を形態及び詳細に加えることができると理解されるべきである。
以下の実施例は具体的な実施形態をより良く説明するために提供するものであり、本願を限定するものと見なされるべきではない。本願は請求項によってのみ限定される。
実施例１：ＡＡＶベクター遺伝子送達を介して高活性ＦＩＸを発現する肝臓特異的制御エンハンサー配列のインビボでの検証
材料及び方法
ベクター構築
Ｓｅｒｐｉｎ制御配列に作動可能に連結したＴＴＲｍプロモーターからコドン最適化第ＩＸ因子又はＰａｄｕａＲ３３８Ｌ変異を有するコドン最適化第ＩＸ因子のいずれかを発現するＡＡＶベースのベクターを構築した。Ｓｅｒｐｉｎ制御配列は国際公開第２００９／１３０２０８号で特定及び説明されている。
更にイントロン及びポリＡ配列を付与した。コドン最適化第ＩＸ因子を含むコンストラクトの全長配列を配列番号１（図１Ｂ）に示し、ＰａｄｕａＲ３３８Ｌ変異を有するコドン最適化第ＩＸ因子を含むコンストラクトの全長配列を配列番号２（図１Ｃ）に示す。ベ
クターは、通常のクローニング及びＤＮＡ合成により構築した。コドン最適化ｈｕＦＩＸを含むＡＡＶベクターの模式的な全体像を図１Ａに示す。ＰａｄｕａＲ３３８Ｌを有するベクターは、ＦＩＸの高活性を生じさせる特異的Ｒ３３８Ｌ変異以外は同一である。
セルライン及び培養条件
２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社、メレルベーケ（Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ）、ベルギー）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２９３Ｔ細胞を培養した。
ＡＡＶベクターの作製
一例として、遺伝子治療の有用なベクターであることが知られている（Vandendriessche et al. 2007）ＡＡＶ血清型９ウイルスベクターをコンストラクトのパッケージングに
選択した。Gao et al. (2002)、Mingozzi et al. (2003)、及びGehrke (2003)に記載されているように、ＡＡＶ２ベクターＤＮＡ（２６μｇ／１０ｃｍｄディッシュ）、アデノウイルスヘルパープラスミド（５２μｇ／１０ｃｍディッシュ）、並びにＡＡＶ９血清型を生成するためのＲｅｐ２及びＣａｐ９を発現するＡＡＶヘルパープラスミド（２６μｇ／１０ｃｍディッシュ）を用いた２９３細胞のメーカーの指示書（リン酸カルシウムトランスフェクションキット、インビトロジェン社）に従うリン酸カルシウムトランスフェクションにより、ヒトＦＩＸを発現するＡＡＶベクターを高いタイターで作製した。
トランスフェクションの２日後、連続的な凍結解凍サイクル及び超音波処理により細胞を溶解した。ライセートをｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社）及びデオキシコラート（シグマ アルドリッチ社）で処理し、その後、連続３回の塩化セシウム密度超遠心に供した。ＡＡＶ粒子を含む画分を、Ａｍｉｃｏｎフィルター（ミリポア社）を用いて濃縮し、ＰＢＳ １ｍＭ ＭｇＣｌ２で洗浄した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ及びポリアデニル化シグナルに特異的なプライマー（フォワードプライマー：５’ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号３）、プローブ：５’ＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号４）、リバースプライマー：５’ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ（配列番号５））を用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によりベクターゲノムのタイターを決定した。
動物実験
動物実験はＶＵＢの動物倫理委員会の承認を受けた。動物をバイオセイフティーレベルＩＩの条件下で収容した。Vandendriessche et al. (2007)に記載されているようにＡＡ
Ｖ９ベクターをマウスに注射した。簡潔に述べると、１０９ｖｇ、５×１０９ｖｇ、２×１０１０ｖｇ（ベクターゲノム＝ｖｇ）を、成体血友病Ｂマウス（３マウス／群）の尾静脈に注射（ｉ．ｖ．）した。全身麻酔下で後眼窩出血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ）により血液を採取した。段階希釈したｈＦＩＸ標準を較正に用いて、メーカー（ハイフン・バイオメド社（Ｈｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ）、ヌーヴィル＝シュル＝オワーズ、フランス）に従い発色ＦＩＸ活性アッセイを用いてクエン酸添加マウス血漿中のヒトＦＩＸ発現を測定した。
結果
キメラ肝臓特異的プロモーター（ＳｅｒｐＥｎｈ／ＴＴＲｍ）からヒトコドン最適化ＦＩＸ ｃＤＮＡ（図２ではＡＡＶ−ｃｏ−ｈＦＩＸと表記）又はヒトコドン最適化ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ ｃＤＮＡ（図２ではＡＡＶ−ｃｏ−ｐａｄｕａ−ｈＦＩＸと表記）のいずれかを発現するＡＡＶベクターを、血友病Ｂを患うＦＩＸ欠損血友病マウスに注射した。用量反応を観察した結果、コドン最適化ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌを発現するＡＡＶベクターは、高活性化変異のないコドン最適化ＦＩＸ対照より有意に高いＦＩＸ活性を生じさせた。
注目すべきことに、ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターは、比較的低用量で治療的ＦＩＸレベルを達成し（５日後に、１×１０９ｇｃ／マウスで正常ＦＩＸレベルの５０％超、５×１０９ｇｃ／マウスで正常ＦＩＸレベルの２５０％超、２×１０１０ｇｃ／マウスで正常ＦＩＸレベルの７００％超）、このことからその効力が明確に示された。これらのレベルは通常、その後の週で２倍超上昇して安定レベルになり、それぞれ１×１０９ｇｃ／マウス、５×１０９ｇｃ／マウス、及び２×１０１０ｇｃ／マウスの用量でそれぞれ約１００％超、５００％超、及び１４００％超のＦＩＸに達した。これらのレベルは、ベクター注射後の日でも上昇していた。したがって、この新規なベクターは、前例のない高レベルのヒトＩＸを生産し、臨床的に関連するモデル動物の血友病Ｂの治癒に当該技術分野で報告されているよりはるかに低い用量で用いることができる。
実施例２：ＡＡＶベクター遺伝子送達によるＦＩＸの増強された肝臓特異的発現
材料及び方法
ベクターコンストラクト
ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡ（ｈＦＩＸ）を含むＦＩＸコンストラクトを、アデノ随伴ウイルスベクター９（ＡＡＶ９）骨格中、肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターの下流にクローニングした。このベクターを更に改良して、ＴＴＲｍプロモーターの上流に更なる肝細胞特異的制御要素、すなわちＳｅｒｐｉｎ制御配列（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）を含むＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｈＦＩＸを得た。このベクターの機能を向上させるために、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンをＴＴＲｍプロモーターとｈＦＩＸ導入遺伝子との間にクローニングした（ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ）。次に、タンパク質の発現を上昇させるためにｈＦＩＸ導入遺伝子のコドン最適化を行った（ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ）。更なる改良として、ｃｏ−ｈＦＩＸフラグメントの変異、すなわちＲ３３８Ｌ、Ｐａｄｕａ変異（図３Ｃ）を含めた（ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）。
ベクター：
−ＡＡＶ９−ＴＴＲｍ−ｈＦＩＸ
−ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｈＦＩＸ
−ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ
−ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ（図３Ｂ）
−ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（図３Ａ、Ｃ）
ベクターの作製及び精製
参照により具体的に本明細書に援用するVandenDriessche T et al. (2007, VandenDriessche T., Thorrez L, Acosta-Sanchez, Petrus I, Wang L, Ma L, De Waele L, Iwasaki
Y, Giillijns V, Wilson JM, Collen D, Chuah MK; Efficacy and safety of adeno-associated viral vectors based on serotype 8 and 9 vs. lentiviral vectors for hemophilia B gene therapy. J Thromb Haemost, 2007. 5(1): p. 16-24)に記載されているよ
うに、目的のＡＡＶプラスミド、キメラパッケージングコンストラクト、及びアデノウイルスヘルパープラスミドによるＡＡＶ−２９３細胞のリン酸カルシウム（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）コトランスフェクションを用いてＡＡＶベクターを作製した。細胞をトランスフェクションの２日後に回収し、凍結／解凍サイクル及び超音波処理により溶解し、次いでｂｅｚｏｎａｓｅ（ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）及びデオキシコール酸（シグマ アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で処理し、連続３回の塩化セシウム（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）密度勾配超遠心を行った。ＡＡＶベクターを含
む画分を回収し、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ、ＢＲＬ社）中に濃縮した。
ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）のプライマーを用いた定量的リアルタイムＰＣＲによりベクターのタイターを決定した。フォワードプライマー配列は５’−ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）である。使用したリバースプライマーは５’−ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号５）である。標準曲線を作製するために、既知のコピー数（１０２〜１０７）の対応するベクタープラスミドを用いた。
動物実験及び凝固アッセイ
１×１０９ｖｇ／マウス、５×１０９ｖｇ／マウス、及び２×１０１０ｖｇ／マウスの用量で、成体の血友病Ｂマウスに、尾静脈注射によりベクター投与を行った。後眼窩神経叢の静脈切開により全血を緩衝クエン酸中に採取した。メーカーのプロトコールを用いてｈＦＩＸ抗原（ダイアゴノスティカ・スターゴ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）、フランス）に特異的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりクエン酸添加血漿中のヒトＦＩＸ抗原濃度を決定した。メーカーのプロトコールに従いＢＩＯＰＨＥＮ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ発色アッセイ（ハイフン・バイオメド社、ヌーヴィル＝シュル＝オワーズ、フランス）を用いてＦＩＸ活性を評価した。両方のアッセイで、段階希釈したｈＦＩＸ標準を較正に用いた。
メーカーの指示書（ハイフン・バイオメド社、ヌーヴィル＝シュル＝オワーズ、フランス）に従い、ＥＬＩＳＡによりＤ−ダイマーレベルを測定した。
テイルクリッピング（ｔａｉｌ−ｃｌｉｐｐｉｎｇ）アッセイを行った。マウスに麻酔をかけ、予め温めた３７℃の生理食塩水溶液中に尾を２分間置いた後、直径２〜３ｍｍで切断した。その後、すぐに尾を３７℃の生理食塩水溶液中に置き、出血及び生存についてモニタリングした。
抗ＦＩＸ抗体の免疫化及び検出
フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（シグマ アルドリッチ社、米国）中５μｇの組換えヒト（ｒｈ）ＦＩＸタンパク質（ＢｅｎｅＦｉｘ、ファイザー社、イタリア）の皮下注射により免疫化を行った。簡潔に述べると、９６ウェルのマイクロタイタープレートをｈＦＩＸ（１μｇ／ｍｌ）と精製マウスＩｇＧ（インビトロジェン、欧州）の段階希釈標準とでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。２日目に、マウス血漿サンプルを希釈バッファーで希釈し、プレコーティングされたプレートにローディングし、４℃で一晩インキュベートした。実験用の血漿サンプルはＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌを注射したマウスから得た。ｒｈＦＩＸで免疫化した、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射したマウスから得た血漿を対照として用いた。次いで、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ヤギ抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン社、欧州）二次抗体とインキュベートした。１２ｍｌの０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、１２ｍｇのｏ−フェニレンジアミン、及び２．５μｌの過酸化水素（インビトロジェン社、欧州）を構成する検出バッファーとインキュベートした後、抗ｈＦＩＸ抗体レベルを測定した。４５０ｎｍの吸光度を測定することにより発色反応をモニタリングした。
ベクターＤＮＡ及びｍＲＮＡの定量化
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア州、米国）を用いて種々の組織からゲノムＤＮＡを抽出した。ｑＰＣＲ
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシテ
ィー／カリフォルニア州、米国）とｂＧＨＰｏｌｙＡ特異的プライマー５’−ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）（フォワード）及び５’−ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号４）（リバース）を用いて１００ｎｇのＤＮＡを分析した。標準曲線を作製するために、既知のコピー数の対応するベクタープラスミドを用いた。
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ抽出キット（マッハライ・ナーゲル社（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）、ドイツ）を用いて種々の器官からｍＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）を用いて、各器官からのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ｂＧＨＰｏｌｙＡ特異的プライマー５’−ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）（フォワード）及び５’−ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号４）（リバース）を用いてｑＰＣＲ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー／カリフォルニア州、米国）によりｃＤＮＡを分析した。発現レベルは、フォワードプライマー５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号１８）及びリバースプライマー５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１９）を用いて得られたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ発現を基準にして標準化した。
統計
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓパッケージを用いてデータを分析した。図に示されているデータは平均値＋ＳＥＭである。ｔ検定を用いた比較により特異的値（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖａｌｕｅ）を得た。
結果
図４は、血友病ＢマウスへのＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターの投与によりＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸベクターと比べて有意に高いＦＩＸのレベル及び活性が得られることを示している。ＦＩＸの反応は用量依存的であった。１×１０９ｖｇｃ／マウス、５×１０９ｖｇｃ／マウス、及び２×１０１０ｖｇｃ／マウスの比較的低いベクター用量で治療的なＦＩＸレベルを得ることができた。更に、血栓溶解が観察されなかったことから、これらのベクター用量は安全である（図４Ｊ）。図５は、ベクターを他の器官に形質導入したにも関わらず（図５Ａ〜Ｂ）ＦＩＸが肝臓中で特異的に発現したことを示している（図５Ｃ〜Ｄ）。
ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターの臨床的意義を更に評価するために、１×１０９ｖｇ／マウスのベクターで処置した血友病Ｂマウス（ｎ＝５）を用いてテイルクリッピングアッセイを行った。野生型（Ｃ５７ＢＬ６）（ｎ＝４）及び非処置血友病Ｂ（ＨｅｍｏＢ）マウス（ｎ＝４）を対照として用いた。各コホートの生存率をモニタリングし、ＦＩＸ凝固活性を分析した。結果は、表１に要約されており、ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターの投与が出血性の表現型の補正を可能にすることを示している。
高機能性ＦＩＸ Pａｄｕａを高レベルで発現させることの免疫結果を評価するために
、野生型ＦＩＸタンパク質及びアジュバントを用いた活性免疫化の前及び後の抗ＦＩＸ抗体反応を分析した。結果は、ＡＡＶ９−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌベクターで処置されなかった対照と比べて、このベクターで処置されたマウスはいずれも抗ＦＩＸ抗体を生成しなかったことから、免疫寛容を達成できたことを示している（図４Ｋ）。
実施例３：ＡＡＶベクター遺伝子送達によるＦＶＩＩＩの肝臓特異的発現
材料及び方法
ベクター構築
参照により具体的に本明細書に援用する国際公開第２００９／１３０２０８号に記載の核酸制御要素Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）に作動可能に連結されたミニマルＴＴＲ（ＴＴＲｍ）プロモーターからコドン最適化Ｂドメイン欠失ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）ｃＤＮＡ（Ward et al., 2011）
を発現するＡＡＶベースのベクターを構築した。コドン最適化Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙプラスミド（プロメガ社、ベルギー）にサブクローニングし、ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩで制限した後、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを、ＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩで制限したｐＡＡＶ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍベクターにクローニングすることによりＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡを作製した（本明細書中ではＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ｓｖ４０ｐＡとも表記）。このベクターに更に、ＦＶＩＩＩ発現レベルをブーストするためにマウス微小ウイルスに由来する小さなイントロンを含めた。
ベクター作製
ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡベクターの用量設定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のために、フォワードプライマーとしての５’−ＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２０）、リバースプライマーとしての５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡ−３’（配列番号２１）、及びプローブとしての５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号２２）を含む、ＳＶ４０ポリＡに結合するプライマーを用いた。正常範囲である２〜５×１０１２ｖｇ／ｍｌのタイターが達成された。簡潔に述べると、ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）で、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）を用いて反応を行った。ＡＡＶベクターの作製に用いた既知のコピー数（１０２〜１０７）のベクタープラスミドを用いて標準曲線を作製した。
動物実験
ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０
ｐＡベクターを５×１０９ｖｇ／マウス又は２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で成体雄ＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７／ＩｃｒＴａｃ／Ｐｒｋｄｃ ｓｃｉｄ）に静脈内注射した。
ＦＶＩＩＩ発現分析
メーカーの指示書に従いヒト（ｈ）ＦＶＩＩＩ特異的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標） ＶＩＩＩ：Ａｇ、ダイアグノスティカ・スタゴ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）、フランス）を用いて、クエン酸添加マウス血漿中のｈＦＶＩＩＩ抗原レベルをアッセイした。提供されたサンプル希釈剤でサンプルを希釈し、３複製分（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）について分析した。正常対照血漿を希釈することによりＦＶＩＩＩ抗原活性百分率の標準曲線を作製した。簡潔に述べると、２００ｍｌの希釈されたサンプル及び標準を、マウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ Ｆａｂフラグメントでプレコーティングされたストリップのウェルにピペッティングし、室温で２時間インキュベートして抗原を固定化した。次いで、ウェルをウォッシュバッファーで５回洗浄した後、ペルオキシダーゼにカップリングしたマウスモノクローナル抗ｈＦＶＩＩＩ抗体２００ｍｌを加えて免疫複合体を固定化した。室温で２時間インキュベートし、洗浄した後、発色させるために２００ｍｌのＴＭＢ基質をウェルに加えた。この混合物を室温で正確に５分間インキュベートした。次いで、５０ｍｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した後、１時間以内に４５０ｎｍで読み取った。
結果
制御要素（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＴＴＲｍ）からコドン最適化Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）を発現する高タイターＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡベクターを、合計インサートサイズ４９１３ｂｐ（ＩＴＲを除く）で作製することができた（図６）。非常に低いベクター用量（５×１０９ｖｇ／マウス）の静脈内注射により、約４２１．８±４．９ｎｇ／ｍｌ（すなわち、正常レベルの２１０．９±３．１％）の治療的ＦＶＩＩＩレベルが得られた（図７）。本発明者らの知る限り、ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡベクターは今日までで最も強力なＡＡＶ−ＦＶＩＩＩベクターデザインである。
実施例４：トランスポゾンに基づく遺伝子送達によるＦＶＩＩＩ及びＦＩＸの増強された肝臓特異的発現
材料及び方法
コドン最適化高活性ＰＢトランスポザーゼ（ｈｕＰＢ）をｐｃＤＮＡ３にクローニングし、ＣＡＧプロモーターから発現させた（図８Ａ、Ｂ）。高活性ＳＢｍａｘトランスポザーゼをｐｃＤＮＡ３にクローニングし、ＣＡＧプロモーターから発現させた（図８Ｋ、Ｌ）。Ward et al. (2011)にＳＱ ＦＶＩＩＩ（ｃｏ）として記載されているコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）を通常のクローニング技術でＰＢトランスポゾンにクローニングしてＰＢ＿Ｍｉｎｉｍａｌ＿Ｔ＿（Ｔ５３Ｃ−Ｃ１３６Ｔ）＿Ｄ４Ｚ４＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ＿ＳＶ４０ｐＡ−Ｄ４Ｚ４を作製した（図８Ｃ、Ｄ）。ヒトコドン最適化ＦＩＸ ｃＤＮＡ及び高活性Ｐａｄｕａ変異を有するコドン最適化ＦＩＸ ｃＤＮＡを通常のクローニング技術でＰＢトランスポゾンにクローニングすることによりそれぞれＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿Ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡ（図８Ｅ、Ｆ）及びＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿Ｉｎｓ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿Ｐａｄｕａ＿ｂｇｈｐＡ（図８Ｇ、Ｈ）を作製した。ヒトコドン最適化ＦＩＸ ｃＤＮＡを通常のクローニング技術でＳＢベースのベクターにクローニングすることによりｐＴ２ＢＨ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐＡを作製した（図８Ｉ、Ｊ）。
Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）及び肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーターから導入遺伝子を発現させた。コンストラクトに更に、マウスミニイントロン（ＭＶＭ）及びポリアデニル化部位を含めた。組換えクローンを制限分析及びシークエンシングにより検証した。
種々のＦＶＩＩＩ−トランスポゾンと同族の高活性トランスポザーゼ（すなわち、それぞれｈｙＰＢ及びＳＢｍａｘ）をコードするマッチングプラスミドとをイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、種々のトランスポゾン／トランスポザーゼ比及び濃度で成体マウスに流体力学的トランスフェクションによりトランスフェクトした。トランスポザーゼのない対照を用いた。血友病ＢマウスでＥＬＩＳＡにより又は発色活性アッセイを用いてＦＩＸ発現をモニタリングした。ヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡを用いてＳＣＩＤマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現を評価した。
結果
ＰＢトランスポゾンにＳｅｒｐｉｎエンハンサーを組み入れることにより、高活性ｈｙＰＢトランスポザーゼを用いた時に、コドン最適化ＦＩＸ Ｐａｄｕａ（ｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌ）の前例のない高い活性を生じさせる、肝細胞中における強固で安定な遺伝子移入効率が得られた（図９Ａ）。逆に、高活性ｈｙＰＢトランスポザーゼがない場合、発現は徐々に基底レベルに下がり、これは肝臓中での安定な遺伝子発現に転移が必要であるという本発明者らの以前の観察結果と一致する。トランスフェクションの１年後に行った分子分析により、ＦＩＸ−トランスポゾンの安定なゲノム組込みが確認された。更に、並べた比較（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）により、早い世代のトランスポゾンデザインと比べてこの最適化ＦＩＸトランスポゾンではＦＩＸ発現がほぼ１００倍上昇していることが明らかになった。
図１０は、コドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）と組み合わせた肝臓特異的Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」）及び高活性ｈｙＰＢ系の使用により、肝細胞中における強固で安定な遺伝子移入効率が得られ、前例のない高いＦＶＩＩＩ発現レベルが得られたことを示している。逆に、高活性ｈｙＰＢトランスポザーゼの非存在下では、発現は徐々に基底レベルまで下がった。これは、肝臓における安定なＦＶＩＩＩ遺伝子発現に、転移による安定なゲノム組込みが必要であることを裏付けている。
記載されている２つの異なる用量を用いて免疫不全ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおいてＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン（ｐＴ２ＢＨ＿ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ｂｇｈｐａ）をＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン（ＰＢ＿ｍｉｃｒｏ＿Ｔ＿Ｎｏ＿Ｉｎｓ＿ＳｅｒｐＴＴｒｍｉｎＭＶＭ＿ｈＦＩＸｃｏ＿ＢＧＨｐＡ））と並べて比較した（図１１）。トランスポゾン及びトランスポザーゼプラスミドを注射した１ヶ月後に血液を採取した。ＦＩＸ発現量を決定するためにＦＩＸのＥＬＩＳＡを行った。約１５００〜２０００ｎｇ／ｍｌのＦＩＸ抗原がＳＢ及びＰＢの両方のトランスポゾンで検出された。これらのデータは、ＳＢ及びＰＢベクターが同等に強力であり、正常ＦＩＸの約３０〜４０％となる高い治療的レベルのＦＩＸ発現量を誘導できることを示している。
導入遺伝子に関係なく、いずれのトランスポゾンを用いた場合にも、種々のモデルマウスで、転移又は一過的トランスポザーゼ発現に起因すると考えられる有害事象は確認されなかった。
ＰＢトランスポゾンの安全性を更に確認するために、本発明者らは、流体力学的トランスフェクションにより、腫瘍になり易いモデルマウスにトランスポゾンを投与した。この
モデルでは、マウスに発癌物質Ｎ，Ｎ−ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を繰り返し注射し、肝細胞癌を発達させた。ＤＥＮ注射の３６週間後に腫瘍量を評価した。トランスポゾンで処置されたマウスと転移なしの対照で腫瘍体積又は腫瘍小結節の数に統計的に有意な差は観察されなかった。これらのデータは、腫瘍になり易いＨＣＣモデルマウスにおいてさえＰＢ転移自体は腫瘍形成能を有意に増大させないことを示しており、その安全性を裏付けている。
実施例５：ＭＶＭイントロンを核酸発現カセット中にクローニングすることによるＦＶＩＩＩ及びＦＩＸの発現増強
材料及び方法
Ｓｅｒｐｉｎ制御配列（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」又は「ＨＳＨ８」）に作動可能に連結された肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍｉｎ）プロモーターの下流にクローニングされたヒトＦＩＸ ｃＤＮＡを含むｐｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾンプラスミドを構築した。ウシ成長ホルモンポリＡ（ｂｇｈｐＡ）を転写終止シグナルとして付与した。ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡは、エキソン１と続くエキソン２〜８との間の切断型の１．４ｋｂイントロンＡを含む。ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡと表記される前記トランスポゾンの模式図を図１２Ａに示す。
イントロンＡを含まない合成コドン最適化ヒトＦＩＸ ｃＤＮＡを含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドを構築した。前記コドン最適化ｈＦＩＸ ｃＤＮＡを、Ｓｅｒｐｉｎ制御配列（「Ｓｅｒｐ」又は「ＳｅｒｐＥｎｈ」又は「ＨＳＨ８」）に作動可能に連結された肝臓特異的ミニマルトランスサイレチン（ＴＴＲｍｉｎ）プロモーターの下流にクローニングした。ＴＴＲｍｉｎプロモーターとｈＦＩＸｃｏ導入遺伝子の間にマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンをクローニングした。ウシ成長ホルモンポリＡ（ｂｇｈｐＡ）を転写終止シグナルとして付与した。ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏと表記される前記トランスポゾンの模式図を図１２Ｂに示す。プラスミドは通常のクローニング及びＤＮＡ合成で構築した。
２ｍｌのＰＢＳ中に希釈した１０μｇのトランスポゾンプラスミド及び２μｇのマウストランスポザーゼプラスミドｍｐＢａｓｅ（図１２Ｃ）又は空の対照プラスミド（図１２Ｄ）を血友病Ｂマウスの尾静脈に流体力学的に注射した。典型的には、注射にかかる時間は各マウスにつき１０秒未満であった。ｈＦＩＸレベル及び活性の測定を実施例２に記載したように行った。
トランスポゾンゲノムコピー数の定量化
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔのプロトコール（キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア州、米国）に従い凍結した肝臓サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。キャリーオーバーされるＲＮＡを除去するためにＲＮａｓｅ Ａ（キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア州、米国）処理を行った。フォワードプライマー５’−ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号２５）及びリバースプライマー５’−ＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴ−３’（配列番号２６）を用いて、両方のトランスポゾンコンストラクトに共通する特異的領域に対するプライマーセットを用いたｑＰＣＲによりトランスポゾンのコピー数を定量化した。簡潔に述べると、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー／カリフォルニア州、米国）及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー／カリフォルニア州、米国）を用いて、各サンプルから得られた５０ｎｇのゲノムＤＮＡを３連（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）でｑＰＣＲにかけた。食塩水注射マウスから得た５０ｎｇの肝臓ゲノムＤＮＡを用いてスパイクした対応する線状化プラスミドの６ｌｏｇ範囲にわたる段階希釈物からなる標
準曲線（傾き≒−３．３、切片≒３５、効率％≒１００）と増幅シグナルを比較することによりコピー数を決定した。１マウスの二倍体ゲノム＝５，９２ｐｇとして、二倍体ゲノム当たりの平均コピーを計算した。
ｈＦＩＸ ｍＲＮＡ発現分析
ｍｉＲＣＵＲＹ（商標） ＲＮＡ単離キット（エキシコン社（Ｅｘｉｑｏｎ）、デンマーク）を用いて凍結肝臓サンプルから全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ（サーモサイエンティフィック社、米国）処理を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）を用いて各サンプルに由来する１μｇの全ＲＮＡから始めて逆転写反応を行った。次に、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００
Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー／カリフォルニア州、米国）及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー／カリフォルニア州、米国）を用いた定量的（ｑ）ＰＣＲにより、各サンプルに由来する１０ｎｇの全ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ量を３連で分析した。以下のプライマーセットを用いた：フォワードプライマー５’−ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）、リバースプライマー５’−ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号４）。全てのサンプルで一貫して均一に発現するハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｍＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡに対するプライマーセット（すなわち、フォワードプライマー５’−ＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡ−３’（配列番号２７）及びリバースプライマー５’−ＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡ−３’（配列番号２８））を用いてｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルを標準化した。ＲＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡが増幅しないように逆転写酵素あり及びなしで増幅した。２−ΔΔＣｔ相対的定量法を用いて、ｈＦＩＸ ｍＲＮＡ発現レベルの相対的変化を測定した。ｈＦＩＸ ｍＲＮＡのＣｔからｍＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのＣｔを引くことによりΔＣｔを計算した（ＣｔｈＦＩＸ − ＣｔＧＡＰＤＨ）。各サンプルのΔＣｔから参照サンプル（最も高いＣｔ）のΔＣｔを引くことによりΔΔＣｔを計算した（ΔＣｔサンプル−ΔＣｔ参照）。式２−ΔΔＣｔを用いて変化倍率を求めた。
結果
図１２Ｅ及びＦに示されているように、空の対照プラスミドを同時に注射されたマウスでは、ｈＦＩＸの発現及び活性は一過性であり、基底レベルまで徐々に低下した（図１２Ｅ：ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ＋空プラスミド：４６±１３ｎｇ／ｍｌ ｈＦＩＸ、０．８７±０．２％正常凝固活性；図１２Ｆ：ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ＋空プラスミド：４８±２２ｎｇ／ｍｌ ｈＦＩＸ、０．９７±０．４９％正常凝固活性）。これらの結果は、持続的な発現には安定な転移が必要であるが、非組込みｐＢ−ｈＦＩＸＩＡ又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏプラスミドはｈＦＩＸ発現の初期上昇に寄与し得ることを示している。
マウストランスポザーゼプラスミドと一緒に送達された時、ＭＶＭイントロンを含むトランスポゾンプラスミドは、ＭＶＭイントロンを含まないプラスミドと比べて有意に高いｈＦＩＸレベル及び活性を生じさせた（図１２Ｅ、Ｆ）。ＭＶＭイントロンを含まないｐＢ−ｈＦＩＸＩＡトランスポゾン（１０μｇ）と２μｇのｍＰＢプラスミドとの肝臓指向性流体力学的コトランスフェクションにより、血友病ＦＩＸ欠損マウスで少なくとも１２ヶ月まで安定な治療的ｈＦＩＸ抗原及び活性レベルが生じた（図１２Ｅ、１１６８±２１８ｎｇ／ｍｌ ｈＦＩＸ及び３２±６％正常凝固活性）。同様に、ＭＶＭイントロンを含むｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏトランスポゾンとｍＰＢプラスミドとの肝臓指向性コトランスフェクションにより、超生理学的範囲で安定化した有意な約１２倍高い（ｐ＜０．００１）ｈＦＩＸタンパク質及び活性レベルが得られた（図１２Ｆ：１３２９０±９９０ｎｇ／ｍｌ
ｈＦＩＸ及び３１３±７％正常凝固活性）。ｈＦＩＸ タンパク質レベルの上昇は、ｐＢ ｈＦＩＸＩＡ及びｐＢ ｈＦＩＸｃｏを注射されたマウスの肝臓中でゲノム量当たりのトランスポゾンコピー数は同様であった（図１２Ｇ）が、ＭＶＭイントロンを含むトランスポゾンと含まないトランスポゾンと比べた時にｈＦＩＸ ｍＲＮＡレベルが５７倍超上昇していたこと（図１２Ｈ）と一致した。
実施例６：ＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含む発現カセットの比較
材料及び方法
実施例３のＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを以下と比較した：
（ａ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡ、
（ｂ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡ、及び
（ｃ）ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡ。
ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドからＳｅｒｐｉｎエンハンサーを切り出すことによりＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡプラスミド（ｃ）を構築した。
２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈した２μｇ又は５μｇのプラスミドＤＮＡをマウスに流体力学的に注射し、尾静脈に注射した。典型的には、注射にかかった時間は各マウスにつき１０秒未満であった。実施例３と同様にＦＶＩＩＩ発現分析を行った。
結果
ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡ（ｃ）及びＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−ＳＶ４０ｐＡ（ｄ）コンストラクトを２μｇ及び５μｇＤＮＡでマウスに流体力学的に注射し、トランスフェクションの１、２、及び６日後にヒトＦＶＩＩＩレベルを測定した。
Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーを発現カセット中にクローニングすることによるｈＦＶＩＩＩレベルへの影響は、コンストラクト（ｄ）を注射されたマウスで測定されたｈＦＶＩＩＩレベルをコンストラクト（ｃ）を注射されたマウスで測定されたレベルで割ることにより計算することができる。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーを発現カセット中にクローニングすることにより３〜６倍高いｈＦＶＩＩＩレベルを得ることができる（表２）。
コドン最適化Ｂドメイン欠失ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）ｃＤＮＡは２９〜４４倍の発現上昇を達成することが報告されている（Ward et al. 2011）。本発明者らは、平均３６．５の発現上昇を用いて、すなわち、コンストラクト（ｄ）でトランスフェクトされたマウスで測定されたｈＦＶＩＩＩレベルを３６．５で割ることにより、ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡコンストラクト（ｂ）でトランスフェクトされたマウスのｈＦＶＩＩＩレベルを予測した。
ＡＡＶ９ｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡコンストラクト（ｂ）を流体力学的に注射されたマウスにおける前記予測ｈＦＶＩＩＩレベルに基づき、更に、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーの発現カセット中へのクローニングによるｈＦＶＩＩＩレベルへの計算された影響で前記予測ｈＦＶＩＩＩレベルを割ることにより、ＡＡＶ９ｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＶＩＩＩ−ＳＶ４０ｐＡコンストラクト（ａ）を流体力学的に注射されたマウスにおけるｈＦＶＩＩＩレベルを予測することができる。
種々のコンストラクトａ〜ｄを流体力学的に注射されたマウスにおいて測定及び予測さ
れたｈＦＶＩＩＩレベルを表３並びに図１３Ａ及び１３Ｂに要約する。
データは、Ward et al. (2011)に記載のコドン最適化Ｂドメイン欠失ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ）ｃＤＮＡ及びＳｅｒｐｉｎエンハンサーの特異的組合せを含む発現カセットが、これらの各要素を単独で含む発現カセットにより得られるｈＦＶＩＩＩレベルの和より有意に高いｈＦＶＩＩＩレベルを誘導できることを示している（表４、図１３Ｃ及び１３Ｄ）。言い換えると、ｈＦＶＩＩＩｃｏｐｔ ｃＤＮＡ及びＳｅｒｐｉｎエンハンサーの前記特異的組合せはｈＦＶＩＩＩレベルに相乗効果をもたらす。
実施例７：ＦＩＸ導入遺伝子を含む発現カセットの比較
材料及び方法
ＦＩＸ導入遺伝子を含むＡＡＶベースのプラスミドを実施例２と同様に構築した。
２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈したそれぞれ２μｇの以下のＦＩＸプラスミドをＦＩＸノックアウトマウスの尾静脈に流体力学的に注射した。
（ａ）：ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ｐＡ；
（ｂ）：ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ｐＡ；
（ｃ）：ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ｐＡ
（ｄ）：ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ｐＡ
（ｅ）：ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ｐＡ
（ｆ）：ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ｐＡ
注射後２及び６日目にこれらのマウスから血液を採取した。実施例２と同様にＦＩＸ活性を決定した。
結果
種々のマウスで測定したＦＩＸ活性を表５に要約する。
データは、コドン最適化ヒト凝固第ＩＸ因子（ｈＦＩＸｃｏ）ｃＤＮＡ及びＳｅｒｐｉｎエンハンサーの特異的組合せにより、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ｂ）又はコドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子（ｃ）のいずれかを含むプラスミド（ｂ）及び（ｃ）を流体力学的に注射されたマウスで測定されたｈＦＩＸ活性の和に基づいて予測されるよりも高いｈＦＩＸ活性が得られることを示している（表６、図１４Ａ及び１４Ｂ）。言い換えると、ｈＦＩＸｃｏ ｃＤＮＡ及びＳｅｒｐｉｎエンハンサーの前記特異的組合せはｈＦＩＸ活性に相乗効果をもたらす。
ｈＦＩＸ活性に対するＳｅｒｐｉｎエンハンサー及びＰａｄｕａ変異の組合せを評価するために、（ｆ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおけるｈＦＩＸ活性を（ｄ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏ−ｐＡプラスミド及び（ｅ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ｐＡプラスミドを流体力学的に注射されたマウスにおけるｈＦＩＸ活性と比較した（表６、図１４Ｃ及び１４Ｄ）。Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー及びＰａｄｕａ変異の組合せはｈＦＩＸ活性に相乗効果をもたらす。
（ｆ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ｐＡプラスミドを注射されたマウスにおけるｈＦＩＸ活性と（ｂ）ＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥ
ｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸ−ｐＡプラスミド、及び（ｅ）ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｈＦＩＸｃｏＰａｄｕａ−ｐＡプラスミドを注射されたマウスにおけるｈＦＩＸ活性の比較により示されるように、ＳｅｒｐｉｎエンハンサーとＰａｄｕａ変異を含むｈＦＩＸをコードするコドン最適化導入遺伝子との組合せもｈＦＩＸ活性への相乗作用を示す。
実施例８：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系の評価
材料及び方法
トランスポゾンコンストラクト
ｐＢ＿ｈＦＩＸＩＡ（図１２Ａ）及びｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ（図１２Ｂ）プラスミドを実施例５と同様に構築した。
ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏの末端逆方向反復（ＩＲｗｔ）を、Ｔ５３Ｃ及びＣ１３６Ｔ点変異を含む末端逆方向反復（ＩＲｍｕｔ１６）で置換してｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６を作製した（図１５Ａ）。
ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏの末端逆方向反復をMeir et al. (2011)に記載の微小末端逆方向反復（ＩＲｍｉｃｒｏ）で置換してｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏを作製した（図１５Ｂ）。
ｐＢ＿ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏを鋳型として用いた部位特異的変異誘発により、Ｐａｄｕａ変異を有する高機能性コドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子を含むｐＢ＿ｈＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌプラスミド（図１５Ｃ）を構築した。
流体力学的注射、ｈＦＩＸのレベル及び活性の分析、並びに抗ｈＦＩＸ抗体
プラスミドを２ｍｌのダルベッコＰＢＳに希釈し、迅速な尾静脈注射により成体マウス（６〜７週齢）に流体力学的に送達した。種々の時間間隔で、本発明者らは、後眼窩神経叢の静脈切開により、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した２０％クエン酸バッファーを予め満たしたエッペンドルフチューブ中に全血（≒２００μｌ）を採取した。クエン酸添加血漿をその後の分析のために−８０℃で保存した。
ｈＦＩＸ抗原のレベル及び活性並びにｈＦＩＸに対する抗体を実施例２に記載されているように分析した。
テイルクリッピングアッセイ
血友病マウスにテイルクリッピングアッセイを用いて出血表現型の表現型補正を評価した。簡潔に述べると、マウスの尾を切除し（末端から１ｃｍ）、マウスを凝固及び生存についてモニタリングした。固定したマウスにテイルクリップを行い、室温で連続的に採血できるようにし、合計血液体積、出血時間、及び生存率をモニタリングした。
結果
ｈＦＩＸＩＡ、ｈＦＩＸｃｏ、又はｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌを発現するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンによる血友病Ｂマウス処置の免疫結果を評価するために、組換えｈＦＩＸ抗原及びアジュバントを用いた活性免疫化の後に抗ＦＩＸ抗体反応を分析した。ｈＦＩＸＩＡ、ｈＦＩＸｃｏ、又はｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌ（Ｐａｄｕａ）を発現するＰＢトランスポゾンで処置された血友病Ｂマウスのいずれも抗ｈＦＩＸ特異的抗体反応を生じなかった（図１５Ｅ）。このことは、ｈＦＩＸＩＡ、ｈＦＩＸｃｏ、又はｈＦＩＸｃｏ−Ｒ３３８Ｌ（Ｐａｄｕａ）のいずれかをコードする種々のＰＢトランスポゾンを用いた肝臓指向性遺伝子治療がｈＦＩＸタンパク質に対する免疫寛容を誘導したことを示している。
テイルクリップアッセイにより、ｐＢ−ｈＦＩＸＩＡ又はｐＢ−ｈＦＩＸｃｏとｍＰＢａｓｅをコードするプラスミドとでトランスフェクトされた血友病Ｂマウスの出血性素因がトランスフェクション１年後に表現型的に補正されていたことが示された（表７）。コドン最適化ｈＦＩＸ導入遺伝子及びＭＶＭイントロンを含むプラスミドでトランスフェクトされたマウスでは、野生型ｈＦＩＸ導入遺伝子でトランスフェクトされたマウスより出血の時間及び体積が少なかった。
Yusa et al. (2011)に記載されている高活性ＰＢトランスポザーゼ（ｈｙＰＢａｓｅ）を用いることによりｐｉｇｇｙＢａｃプラットフォームの効率を向上させることができ（図１５Ｄ）、より低いトランスポゾン／トランスポザーゼ用量の使用が可能になった。このｈｙＰＢａｓｅは、マウスコドン使用頻度最適化ｍＰＢａｓｅと比べて複数の変異残基を含んでいた（図１５Ｄを１２Ｃと比較されたい）。１０００ｎｇのｈｙＰＢと共に５００ｎｇのｐＢ−ｈＦＩＸｃｏトランスポゾンを用いた免疫不全ＳＣＩＤマウスの肝臓指向性流体力学的トランスフェクションにより、正常ｈＦＩＸレベルの２００％に相当する安定な超生理学的ｈＦＩＸレベルが得られた（図１５Ｆ）。これらのＦＩＸレベルは、元のｍＰＢトランスポザーゼで達成できたレベルより有意に高かった（ｐ＜０．００１）。同様に、１００ｎｇのｈｙＰＢと共に５０ｎｇのｐＢ−ｈＦＩＸｃｏトランスポゾンプラスミドを用いたＳＣＩＤマウスの肝臓指向性トランスフェクションにより、正常レベルの２０％に相当する治療的ｈＦＩＸレベルを生じる用量依存的効果が得られた。これは、ｍＰＢトランスポザーゼを用いた時と比べてＦＩＸレベルの有意な２０倍の上昇（ｐ＜０．００１）に相当した（図１５Ｇ）。
ＰＢトランスポゾンのインビボでの効力に対する末端反復ＩＲｍｉｃｒｏ及びＩＲｍｕｔ１６の影響を評価するために、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ（図１２Ｂ）、ｐＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｕｔ１６（図１５Ａ）、又はＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ（図１５Ｂ）をｈｙＰＢａｓｅと共に流体力学的にマウスに注射した。ＩＲｍｉｃｒｏを用いた時、その対応する野生型と比べて、ｈＦＩＸ発現の有意な１．５倍の上昇が見られた（図１５Ｈ〜Ｉ）。１０００ｎｇのｈｙＰＢトランスポザーゼコードプラスミドと組み合わせたＰＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏトランスポゾン（５００ｎｇ）の肝臓指向性トランスフェクションにより、正常ｈＦＩＸレベルの約３００％に達する安定なＦＩＸレベルが得られた（図１５Ｈ）。同様に、１０分の１の用量のＰＢ−ｈＦＩＸｃｏ／ＩＲｍｉｃｒｏ及びｈｙＰＢで、正常ｈＦＩＸレベルの３０％となるｈＦＩＸ発現の用量依存的低下が見られた（図１５Ｉ）。対照的に、ＩＲｍｕｔ１６を用いた時、ＩＲｗｔと比べて、ＦＩＸ発現は上昇しなかった又はわずかに上昇しただけであった（図１５Ｊ〜Ｋ）。
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Claims (46)

  1. 肝臓特異的制御要素、プロモーター、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、導入遺伝子、好ましくはコドン最適化導入遺伝子、及び転写終止シグナルを含む核酸発現カセットを含むベクター。
  2. 前記肝臓特異的制御要素が、配列番号８又は前記配列と９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記肝臓特異的制御要素が、配列番号８又は前記配列と９５％の同一性を有する配列によって定義されるＳｅｒｐｉｎエンハンサーからなる、請求項２に記載のベクター。
  4. 前記導入遺伝子が、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）又は凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードし、好ましくは前記導入遺伝子がコドン最適化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
  5. 前記凝固第ＶＩＩＩ因子のＢドメインが欠失している、請求項４に記載のベクター。
  6. 前記ＦＶＩＩＩのＢドメインが、配列番号１６を有するリンカーで置換されている、請求項４又は５に記載のベクター。
  7. 凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする前記導入遺伝子が配列番号７を有する、請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクター。
  8. 配列番号６を有する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のベクター。
  9. 前記凝固第ＦＩＸ因子が高活性化変異を含む、請求項４に記載のベクター。
  10. 前記高活性化変異がＲ３３８Ｌアミノ酸置換に対応する、請求項９に記載のベクター。
  11. 配列番号１又は２を有する、請求項４、９、又は１０のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 前記プロモーターが、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、好ましくはミニマルＴＴＲプロモーターに由来する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
  13. 前記転写終止シグナルが、サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルに由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
  14. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
  15. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、請求項１４に記載のベクター。
  16. 前記ベクターが一本鎖ＡＡＶである、請求項１５のいずれか一項に記載のベクター。
  17. 前記ベクターが自己相補的ＡＡＶである、請求項１５に記載のベクター。
  18. 前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項１〜７、９、１０、１２、又は１３のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 前記ベクターが、トランスポゾンベースのベクターである、請求項１８に記載のベクター。
  20. 前記ベクターが、ＰｉｇｇｙＢａｃベースのベクター、好ましくは微小逆方向反復を含むＰｉｇｇｙＢａｃベースのベクター、又はＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベースのベクターである、請求項１８又は１９に記載のベクター。
  21. 血友病Ａを処置するための医薬の製造における、請求項４〜８及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  22. 血友病Ｂを処置するための医薬の製造における請求項９〜１１及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  23. 請求項４〜８及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターの対象への形質導入又はトランスフェクションを含む、対象中で１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上の血漿中第ＶＩＩＩ因子レベルを得る方法。
  24. 前記対象への前記ウイルスベクターの形質導入が、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で行われる、請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項９〜１１及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターの対象への形質導入又はトランスフェクションを含む、対象中で１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得る方法。
  26. 前記対象への前記ウイルスベクターの形質導入が、２×１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で行われる、請求項２５に記載の方法。
  27. 対象中で１００ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、前記対象への前記ウイルスベクターの形質導入が、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、請求項２５に記載の方法。
  28. 対象中で５０ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、前記対象への前記ウイルスベクターの形質導入が、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、請求項２５に記載の方法。
  29. 対象中で２００ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、前記対象への前記ウイルスベクターの形質導入が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、請求項２５に記載の態様。
  30. 対象中で１５０ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中第ＩＸ因子レベルを得るために用いられ、前記対象への前記ウイルスベクターの形質導入が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われる、請求項２５に記載の態様。
  31. 前記形質導入又はトランスフェクションが、静脈内投与によるものである、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記トランスフェクションが、流体力学的トランスフェクションによるものである、請
    求項２３又は２５に記載の方法。
  33. 請求項１９又は２０に記載のベクターを、トランスポザーゼをコードするベクター、好ましくは高活性トランスポザーゼをコードするベクターと組み合わせて投与する、請求項２３、２５、又は３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記対象が、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 請求項２３、２４、３１〜３４のいずれか一項に記載の方法を行うことを含む、哺乳動物対象の血友病Ａを処置する方法。
  36. 請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の方法を行うことを含む、哺乳動物対象の血友病Ｂを処置する方法。
  37. 血友病Ａの処置における使用のための、請求項４〜８及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
  38. 血友病Ｂの処置における使用のための、請求項９〜１１及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
  39. 請求項４〜８及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターと、薬学的に許容されるキャリアとを含み、場合により血友病Ａを処置するための活性成分を更に含む、医薬組成物。
  40. 血友病Ａの処置における使用のための、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記処置により、処置された対象の血漿中第ＶＩＩＩ因子レベルが、対象中で１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上となる、請求項４０に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３７に記載の使用のためのベクター。
  42. 前記処置が、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量でベクターを対象に形質導入することを含む、請求項４０若しくは４１に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３７若しくは４１に記載の使用のためのベクター。
  43. 請求項９〜１１及び１２〜２０のいずれか一項に記載のベクターと薬学的に許容されるキャリアとを含み、場合により血友病Ｂを処置するための活性成分を更に含む、医薬組成物。
  44. 血友病Ｂの処置における使用のための、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 前記処置により、処置された対象の血漿中における第ＩＸ因子レベルが、対象中で治療閾値濃度の１０ｍＵ／ｍｌ血漿以上、好ましくは対象中で治療濃度の５０ｍＵ／ｍｌ血漿以上、より好ましくは対象中で治療濃度の１００ｍＵ／ｍｌ血漿以上、更により好ましくは対象中で治療濃度の１５０ｍＵ／ｍｌ血漿以上、更により好ましくは対象中で治療濃度の２００ｍＵ／ｍｌ血漿以上となる、請求項４４に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３８に記載の使用のためのベクター。
  46. 前記処置が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量、好ましくは６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量、より好ましくは２×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で対象にベクターを形質
    導入することを含む、請求項４４若しくは４５に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３８若しくは４５に記載の使用のためのベクター。
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