JP6473416B2 - 第ｖｉｉｉ因子配列 - Google Patents

Description

本発明は、変更されたＢドメイン配列を含む凝固第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列に関する。また、本発明は、血友病、特に血友病Ａの治療におけるこの第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列の使用に関する。

血友病Ａ（ＨＡ）は、約５０００人に１人の男性が冒されるＸ連鎖劣性出血性障害である。凝固カスケードにおける必須の補助因子、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子における突然変異により生じる。重篤なＦＶＩＩＩ欠損の臨床症状は、生死に関わり、恒久的障害を生じ得る、頻繁な非挑発性の出血の発症である。西側諸国における治療は、出血の際に、または予防的に出血の発症を防止するために、血漿由来または遺伝子組換え型ＦＶＩＩＩタンパク質濃縮物の静脈注射からなる。ＦＶＩＩＩ（８〜１８時間）についての短半減期は頻繁な注入を必要とし、このことが、大半の世界の血友病Ａ患者にとって、治療を法外に高価にする（予防のために、１００，０００ポンドより多い／年）。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を向上させるための、化学的修飾（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの直接の結合）およびＦＶＩＩＩのバイオエンジニアリング（例えば、ＦＶＩＩＩ‐ＦＡＢ融合タンパク質）は、見込みを示す。しかしながら、これらの長時間作用性のＦＶＩＩＩ変異体は、生涯ＦＶＩＩＩタンパク質投与の必要性または標準的なＦＶＩＩＩ補充療法での患者の３０％に生じるＦＶＩＩＩインヒビター形成の問題を排除しない。

遺伝子治療は、一方、ベクターの単一の投与後に、ＦＶＩＩＩの継続的な内因性産生を通じて治癒の可能性を提供する。血友病Ａは、その臨床症状が、血漿で微量（２００ｎｇ／ｍｌ）に循環する単一の遺伝子産物（ＦＶＩＩＩ）の欠如にもっぱら起因し得るため、実は遺伝子置換アプローチに十分に適している。堅固に調節された遺伝子発現の制御は必須ではなく、ＦＶＩＩＩのレベルのわずかな増加（通常の１％超）が重篤なフェノタイプを寛解させ得る。遺伝子導入の結果は、ほとんどの臨床検査室で容易に分析され得る簡易な量的エンドポイントを用いて評価され得る。

ＦＶＩＩＩ置換についてのいくつかの異なる遺伝子導入ストラテジーが評価されてきたが、アデノ随伴ウイルスの（ＡＡＶ）ベクターは、最も大きな見込みを示す。それらは、優れた安全性のプロファイルを有し、肝臓のような有糸分裂後の組織からの長期の導入遺伝子発現を導き得る。実際に、血友病Ｂの遺伝子治療に関する進行中の臨床試験は、血友病のフェノタイプが重篤から中程度または軽度に転換するために十分であるレベルでのヒト第ＩＸ因子の発現の安定（１８ヶ月より長い）が、ＡＡＶベクターの単一の末梢静脈投与後に達成可能であることを確立した。この試験における何人かの参加者は、自然に起きる出血の発症に罹ることなく、予防を中止することができた。同様の励みになる結果が、レーバー先天性黒内障の治療のための網膜へのＡＡＶ媒介の遺伝子導入の臨床試験から浮かび出る。

血友病Ａの遺伝子治療についてのＡＡＶベクターの使用は、しかしながら、ヒトＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）の生化学的特性および別個の分子に起因して、新たな挑戦をもたらしている。同等のサイズの他のタンパク質と比較した場合に、ｈＦＶＩＩＩの発現は、ｍＲＮＡ不安定性、小胞体（ＥＲ）シャペロンとの相互作用、およびマンノース結合レクチン、ＬＭＡＮ１との相互作用を通じてゴルジ輸送するための促進されたＥＲについての要求に起因して非常に非能率的である。結果として、より高いベクター投与量が、遺伝子導入後のｈＦＶＩＩＩの治療レベルを達成するために必要とされるであろう。ベクター産生上の圧上昇は別として、ベクター投与量に関連して潜在的毒性が現れるため、このことは、毒性のリスクを増加させるであろう。

ＦＶＩＩＩ分子のバイオエンジニアリングは、ＦＶＩＩＩ発現の向上をもたらした。例えば、補助因子活性を必要としていないＦＶＩＩＩのＢドメインの欠失は、全長野生型ＦＶＩＩＩにわたるｍＲＮＡレベルにおける１７倍の増加および分泌されたタンパク質における３０％の増加をもたらした（非特許文献１，非特許文献２）。このことが、クリニックで現在広く使用されているＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩタンパク質濃縮物の開発を導いた。しかしながら、全長ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの重要な一部が、小胞体（ＥＲ）内に誤って折り畳まれて保持され、最後に分解された。ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ（Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩとして知られる）に対するアスパラギンに連結されたオリゴ糖に富む、短い２２６アミノ酸Ｂドメインスペーサーの追加は、ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩにより達成された１０倍以上に発現をさらに増加させることを現すことが示された（非特許文献２，非特許文献３）。全長およびＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ変異体とは異なり、Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩ変異体は、ネズミの肝細胞の得られたアポトーシスにより小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を誘起しないようであり、よって、それを遺伝子導入との関連でさらなる評価についての有用な変異体にする（非特許文献４）。

また、コドン最適化は、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させるために使用されてきた。コドン最適化Ｎ６（ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６）は、ｗｔ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６で観察されるよりも少なくとも１０倍高いレベルで、細胞からのＦＶＩＩＩの分泌を生じる（特許文献１）。また、全長およびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのコドン最適化バージョンが開発された（特許文献２）。レンチウイルスのベクターを用いる場合、コドン‐最適化ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ（ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ）のインビトロの有効性が、野生型‐ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩよりも多くなることが示された。また、ＦＶＩＩＩ配列のコドン最適化は、特許文献３に記載されている。

血友病Ａの遺伝子治療についてのＦＶＩＩＩのＡＡＶ媒介遺伝子導入に対する他の障壁は、ＦＶＩＩＩ遺伝子のサイズであり、７．０ｋｂでＡＡＶベクターの通常のパッケージングキャパシティをはるかに超える。ＡＡＶベクターへの大きな発現カセットのパッケージングが報告されているが、これは、低減された感染性を有するベクターのパーティクルの低い収率をもたらす、非常に矛盾しているプロセスである。小さなプロモーターのコントロール下で、より小さなＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ（約４．４ｋｂ）変異体をコードするＡＡＶベクターは見込みを示す。特に、１つの実験が、イヌＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩをコードするｒＡＡＶの単一の投与後に、血友病Ａのイヌにおける４年の期間にわたって、通常の２．５〜５％でイヌＦＶＩＩＩの持続する発現を示した（非特許文献５）。このアプローチは、しかしながら、そのイヌ同血族に代えてヒトＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを用いると、決定的には評価されない。サイズ制限を克服するための他の革新的なアプローチは、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）ｃＤＮＡを２つの分離したＡＡＶベクターへとパッケージングすることを伴い、凝固活性を再生するための、ＦＶＩＩＩのＨＣおよびＬＣの生化学的な再会合を利用する。代替的なストラテジーは、２つの分離したＡＡＶベクターにより標的細胞に送達される大きなＦＶＩＩＩ発現カセットの５’および３’領域の鎖状体化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）または分子の再会合を伴う（非特許文献６，非特許文献７）。

国際公開第２０１１／００５９６８号 国際公開第２００５／００５２１７１号 米国特許出願公開第２０１０／０２８４９７１号明細書

Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ， Ｐｉｐｅ ＳＷ， Ｔａｇｌｉａｖａｃｃａ Ｌ， Ｓｗａｒｏｏｐ Ｍ， Ｍｏｕｓｓａｌｌｉ Ｍ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｈｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， ８ Ｓｕｐｐｌ ２， Ｓ３− １４． Ｍｉａｏ ＨＺ， Ｓｉｒａｃｈａｉｎａｎ Ｎ， Ｐａｌｍｅｒ Ｌ， Ｋｕｃａｂ Ｐ， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＭＡ， Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ， Ｐｉｐｅ ＳＷ．（２００４） Ｂｌｏｏｄ， １０３， ３４１２−３４１９． Ｃｅｒｕｌｌｏ Ｖ， Ｓｅｉｌｅｒ ＭＰ， Ｍａｎｅ Ｖ， Ｃｅｌａ Ｒ ， Ｃｌａｒｋｅ Ｃ ， ＫａｕｆｍａｎＲＪ， Ｐｉｐｅ ＳＷ， Ｌｅｅ Ｂ． （２００７） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ， １５， ２０８０−２０８７． Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｊ．Ｄ．， Ｍｉａｏ，Ｈ．， Ｚｈａｎｇ，Ｋ．， Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ａ．， Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ．Ｓ．， Ｐｉｐｅ，Ｓ．ｗ．， ＆ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ， １０５， １８５２５−１８５３０． Ｊｉａｎｇ Ｈ， Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ， Ｏｚｅｉｏ ＭＣ， ｄｅ Ｐａｕｌａ ＥＶ， Ｖａｒｇａｓ ＪＡ， Ｓｍｉｔｈ Ｐ， Ｓｏｍｍｅｒ Ｊ， Ｌｕｋ Ａ， Ｍａｎｎｏ ＣＳ， Ｈｉｇｈ ＫＡ， Ａｒｒｕｄａ ＶＲ． （２００６） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １４， ４５２−４５５． Ｃｈａｏ Ｈ， Ｓｕｎ Ｌ ， Ｂｒｕｃｅ Ａ， Ｘｉａｏ Ｘ， Ｗａｌｓｈ ＣＥ． （２００２） ＭｏｌＴｈｅｒ， ５， ７１６−７２２． Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｌｕ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｓａｒｋａｒ Ｒ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｈｉｇｈ ＫＡ， Ｘｉａｏ ｗ． （２００９） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ， １７， ４１７−４２４．

これらのアプローチは、ＦＶＩＩＩのパッケージングの制限を解決するが、それらは、機能的なＦＶＩＩＩ活性のための２つのＡＡＶベクターについての必要性、並びにＬＣおよびＨＣの発現間の不均衡に起因するまたは半分のゲノムサイズのタンパク質産生物の発現の結果としての免疫原性のリスクを含む他の欠点を作り出す。

本発明は、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１１１塩基対（または、ヌクレオチド）の間の長さであって、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列をコードする。

特定の実施形態においては、本発明は、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１１１塩基対の間の長さであって、６つのアスパラギン残基をコードし、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

好ましくは、ヌクレオチド配列は単離される。用語「単離される」は、本発明の核酸分子に関連して使用される場合、概して、その天然源と通常関連する少なくとも１つの混入物の核酸から同定されて分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、自然界でみられるものと異なる形態または条件（ｓｅｔｔｉｎｇ）で存在することとしてもよい。一方、非単離核酸は、それらが自然界に存在する状態でみられるＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）が、隣接する遺伝子に近接する宿主細胞の染色体にみられ、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列のような、ＲＮＡ配列が多数のタンパク質をコードする数多くの他のｍＲＮＡによる混合物として、細胞内にみられる。本発明の単離された核酸分子は、一本鎖のまたは二本鎖の形態で存在することとしてもよい。単離された核酸分子がタンパク質を発現するために利用される場合、センスまたはコード鎖を概して最小限で含む（つまり、核酸分子が一本鎖であることとしてもよい。）が、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含むこととしてもよい（つまり、核酸分子が二本鎖であることとしてもよい。）。

第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列をコードする。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、アスパラギンではないアミノ酸残基における２つまでのアミノ酸置換を有する、配列番号４の配列を含むアミノ酸配列をコードする。好ましい実施形態では、アスパラギンではないアミノ酸残基における１つまでの置換があることとしてもよい。

好ましい実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号４の配列を含むアミノ酸配列をコードする。

第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むこととしてもよい。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むこととしてもよい。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むこととしてもよい。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する配列を含む。

配列番号１のヌクレオチド配列と特定の同一性のパーセンテージを有する配列は、好ましくは、４８から６０塩基対の間の長さである。好ましくは、この配列は、４８から５７塩基対の間の長さである。より好ましくは、この配列は、４８から５４塩基対の間の長さである。最も好ましくは、この配列は、５１塩基対の長さである。

第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１１１塩基対の間の長さである。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１０８塩基対の間の長さである。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１０５塩基対の間、９０から１０２塩基対の間、９０から９９塩基対の間、９０から９６塩基対の間の長さである。最も好ましくは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９３塩基対の長さである。

本発明のヌクレオチド配列は、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列をコードする。このアミノ酸配列は、第１のフランキング配列により片方に、および第２のフランキング配列によりもう片方に隣接されることとしてもよい。第１のフランキング配列は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の第１の一部であり、第２のフランキング配列は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の第２の一部であり、第１の一部および第２の一部はともに、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の全体を含む。第１の一部および第２の一部は、配列番号７と少なくとも７５％の同一性を有する配列であることとしてもよい。いくつかの実施形態では、第１の一部および第２の一部は、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する配列であることとしてもよい。第１の一部および第２の一部は、配列番号７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列であることとしてもよい。いくつかの実施形態では、第１の一部および第２の一部は、配列番号７であることとしてもよい。例えば、一実施形態では、第１のフランキング配列は、配列番号７の最初の５つのアミノ酸であることとしてもよく、第２のフランキング配列は、配列番号７の最後の９つのアミノ酸（つまり、６番目から１４番目のアミノ酸）であることとしてもよい。このように、第１のおよび第２のフランキング配列はともに、配列番号７の全体を含む。いくつかの実施形態では、第１のフランキング配列は、４から１０アミノ酸の間の長さである。同様に、第２のフランキング配列は、４から１０アミノ酸の間の長さであることとしてもよい。いくつかの実施形態では、第１のフランキング配列は、４から８アミノ酸の間の長さであり、第２のフランキング配列は、６から１０アミノ酸の間の長さである。特定の実施形態においては、第１のフランキング配列は４から６アミノ酸の間の長さであり、第２のフランキング配列は８から１０アミノ酸の間の長さである。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、これらのフランキング領域をコードするであろう。

特定の実施形態においては、本発明は、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１１１塩基対の間の長さであって、６つのアスパラギン残基をコードし、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列一部は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、好ましくは、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する。

一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、配列番号２の配列を有する。

機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸分子、つまり、それは発現される場合に第ＶＩＩＩ因子をコードし、野生型第ＶＩＩＩ因子の機能性を有する。核酸分子は、適切なシステム（例えば、宿主細胞）で発現される場合に、比較的高いレベルで、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生する。産生される第ＶＩＩＩ因子は機能的であるため、野生型第ＶＩＩＩ因子の少なくとも一部と同じであるコンホメーションを有するであろう。本発明により産生された機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、対象において生じる少なくともいくつかの血液凝固を可能にする。このことは、血友病、例えば、血友病Ａに罹っている対象において血液が凝固するためにかかる時間における減少を生じる。正常な第ＶＩＩＩ因子は、凝固カスケードを介して血液凝固に関与する。正常な第ＶＩＩＩ因子は、Ｃａ^＋２およびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を活性型Ｘａに変換する複合体を形成する、第ＩＸａ因子に関する補助因子である。よって、本発明に関する機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、第Ｘ因子を活性型Ｘａに変換し得る第ＩＸａ因子により機能的な複合体を形成し得る。

以前使用した第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、機能的なタンパク質の発現による問題を有していた。このことは、ｍＲＮＡの非効率的発現、その後の細胞内分解によるタンパク質の誤った折り畳み、および小胞体からゴルジ体への一次翻訳産物の非効率的輸送に起因されると考えられる。本発明により提供される核酸分子が、インビトロのおよびインビボの両方で、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の驚くべき高いレベルの発現を生じさせることを発明者は見出した。このことは、この核酸分子は、血友病Ａのような血友病を治療するための遺伝子治療で使用され得たことを意味する。さらに、この核酸は、そのより小さなサイズに起因して、ＡＡＶベクター内に有効にパッケージされ得る。

ＦＶＩＩＩのドメイン構成は、通常、Ａ１‐Ａ２‐Ｂ‐Ａ３‐Ｃ１‐Ｃ２からなる。上記のように、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が変更される。ヌクレオチド配列は、それが機能的ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする限り、他のドメイン（つまり、Ａｌ、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２）についてのあらゆる配列を有し得る。例えば、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＡｌ、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、野生型配列を有することとしてもよい。あるいは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＡｌ、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、変更された配列を有することとしてもよい。例えば、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＡｌ、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、例えば、国際公開第２０１１／００５９６８号、国際公開第２００５／００５２１７１号または米国特許出願公開第２０１０／０２８４９７１号に開示されているもののような、野生型配列のコドン最適化配列を有することとしてもよい。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＡｌ、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、国際公開第２０１１／００５９６８号に開示されているｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６配列のコドン最適化配列を有する。一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。あらゆる事象において、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＡｌ、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、好ましくは、Ｂドメインに対する変更を除いて野生型タンパク質と同じである機能的タンパク質が産生されるように、野生型ドメインをコードする配列を有する。

特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、配列番号４の配列を含むアミノ酸配列をコードすることとしてもよい。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードする。他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列をコードする。さらなる実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列をコードする。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％、さらによりもっと好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列をコードする。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、配列番号５の配列をコードする。

配列番号１のヌクレオチド配列と特定の同一性のパーセンテージを有する配列が、全体として、Ｂドメインヌクレオチド配列内の６つのアスパラギン残基をコードする。さらに、配列番号４と同一性を有する配列が、６つのアスパラギン残基を含む。このことは、Ｂドメインヌクレオチド配列により、コードされる３０〜３７のアミノ酸のうちで、それらの６つがアスパラギン残基であることを意味する。６つのアスパラギン残基は、グリコシル化のために必要とされ、ＦＶＩＩＩタンパク質が発現されるのを補助すると考えられている。これに関し、６つのアスパラギン残基は、それらが細胞プロセス中にグリコシル化され得るように、配列内に配置されるべきである。第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部が、６つのアスパラギン残基よりも多くコードすることが可能である。しかしながら、配列番号１のヌクレオチド配列と特定の同一性のパーセンテージを有する配列は、好ましくは、６つのアスパラギン残基をコードするべきである。同様に、配列番号４と同一性を有する配列は、好ましくは、６つのアスパラギン残基をコードするべきである。

本発明に係る核酸分子を産生するためには、当業者の能力で十分であろう。このことは、例えば、所与の配列の化学合成を用いてなされ得る。

さらに、当業者は、本発明に係る核酸が機能的なタンパク質を発現するかどうかを容易に測定し得るであろう。適切な方法は、当業者にとって明らかであろう。例えば、１つの適切なインビトロの方法は、レンチウイルスまたはＡＡＶベクターのようなベクターに核酸を挿入することと、２９３Ｔまたはヒーラ細胞のような宿主細胞をベクターにより形質導入することと、第ＶＩＩＩ因子活性を測定することを含む。あるいは、適切なインビボの方法は、血友病のマウスに核酸を含むベクターを形質導入することと、マウスの血漿における機能的第ＶＩＩＩ因子を分析することを含む。適切な方法は、国際公開第２０１１／００５９６８号および以下により詳細に記載される。

核酸は、ヌクレオチド構成するあらゆるタイプの核酸であり得る。核酸は、タンパク質が産生されるように発現され得るべきである。好ましくは、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。

上記記載は、塩基対におけるヌクレオチド配列の長さ、例えば、９０から１１１塩基対の間の長さに言及する。用語「塩基対」は、用語「ヌクレオチド」と同等であり、これらの用語は交換可能である。よって、例えば、表現「９０から１１１塩基対の間の長さ」は、「９０から１１１ヌクレオチドの間の長さ」と同等である。用語「塩基対」は、核酸分子が二本鎖であることを意味することを意図しないが、いくつかの実施形態では、これがその場合である。

また、本発明は、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供し、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインは、３０から３７アミノ酸の間の長さであって、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインは、配列番号５の配列を含む。一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号６の配列を有する。核酸に関連する上記の記載のいくつか、特に核酸によりコードされるアミノ酸配列を検討する部分は、また、本発明の本態様と関連する。よって、核酸分子の関連する特徴は、また、本発明のタンパク質の特徴であることを意図される。

特定の実施形態においては、上記の核酸によりコードされる第ＶＩＩＩ因子タンパク質が提供される。

本発明の核酸分子を含むベクターもまた提供される。ベクターは、ウイルス性および非ウイルスのベクターを含むあらゆる適切なベクターであることとしてもよい。ウイルスのベクターは、レンチ、アデノ、ヘルペスウイルスのベクターを含む。ベクターは、好ましくは、遺伝子組換え型アデノ随伴ウイルスの（ｒＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスのベクターである。より好ましくは、ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。あるいは、裸のＤＮＡ（クロマチン付着領域ありまたはなしで）または脂質またはエレクトロポレーションのような種々のトランスフェクション方法により細胞内に導入される共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＤＮＡを用いることを含む、非ウイルス性のシステムが使用されることとしてもよい。

好ましくは、ベクターは、また、プロモーターのような核酸分子の発現のために必要とされるあらゆる他の成分を含む。ＬＰ１、ＨＣＲ‐ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ‐ｈＡＡＴ、およびＬＳＰのような、あらゆる適切なプロモーターが使用されることとしてもよい。これらのプロモーターは、以下の文献により詳細に記載されている。ＬＰ//：Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ， ２００６ＨＣＲ‐ｈＡＡＴ：Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ，２０００；ＡｐｏＥ‐ｈＡＡＴ：Ｏｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ，１９９６；およびＬＳＰ：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９９。また、より好ましいプロモーターが国際公開第２０１１／００５９６８号に記載されている。

本発明に係るベクターは、遺伝子送達ベクターであることとしてもよい。このような遺伝子送達ベクターは、ウイルス性の遺伝子送達ベクターまたは非ウイルス性の遺伝子送達ベクターであることとしてもよい。

非ウイルス性の遺伝子送達は、非ウイルス性のトランスフェクションの最も簡易な方法である裸のＤＮＡを用いて行われることとしてもよい。例えば、裸のプラスミドＤＮＡを用いる本発明の核酸を投与することができるかもしれない。あるいは、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）または例えば高圧ガスもしくは逆位．２２口径の銃を用いて細胞内にＤＮＡコートされた金の粒子を撃つ「遺伝子銃」の使用のような方法が使用されることとしてもよい。

細胞への核酸の送達を向上させるために、ダメージからそれを保護する必要があり、細胞内へのその侵入が促進されることとしてもよい。この目的を達成するために、トランフェクションプロセス中に望ましくない分解から核酸を保護する性能を有するリポプレックスおよびポリプレックスが使用されることとしてもよい。

プラスミドＤＮＡは、ミセルまたはリポソームのような組織的構造における脂質でコートされることとしてもよい。組織的構造がＤＮＡを有する複合型である場合、それはリポプレックスとよばれる。アニオン性および中性の脂質が、合成ベクターのためのリポプレックスの構成のために使用されることとしてもよい。好ましくは、しかしながら、カチオン性の脂質は、それらの正電荷に起因して、リポソームへのＤＮＡのカプセル化を促進するために、負電荷を帯びたＤＮＡ分子を濃縮するために使用されることとしてもよい。リポプレックスを形成するためにカチオン性の脂質にヘルパー脂質（通常、ＤＯＰＥのような電気的中性の脂質）を加えることを必要とすることとしてもよい。

ポリプレックスとよばれるＤＮＡを有するポリマーの複合体は、本発明の核酸を送達するために使用されることとしてもよい。ほとんどのポリプレックスは、カチオン性のポリマーからなり、それらの産生は、イオン性の相互作用により調節される。ポリプレックスは、概して、細胞質内へのそれらのＤＮＡのロードを放出し得ない。よって、不活性化したアデノウイルスのような、エンドソーム‐溶解剤（エンドサイトーシス中になされるエンドソームを溶解するために、ポリプレックスが細胞に入ることによるプロセス）による同時トランスフェクションが必要とされることとしてもよい。

２つまたは３つの技術を組み合わせる本発明の核酸を送達するために、ハイブリッド法が使用されることとしてもよい。ビロソームが一例であり、それらは、不活性化したＨＩＶまたはインフルエンザウイルスとリポソームを組み合わせる。他の方法は、カチオン性の脂質と他のウイルスのベクターを混合することまたはウイルスをハイブリダイズすることを含み、本発明の核酸を送達するために使用されることとしてもよい。

デンドリマー、特に、カチオン性のデンドリマー、つまり、正の表面電荷を有するものは、本発明の核酸を送達するために使用されることとしてもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡのような遺伝子材料の存在下で、電荷相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）は、カチオン性のデンドリマーとの核酸の一時的関連付けを導く。その目的地に到達したとき、デンドリマー核酸複合体は、その後エンドサイトーシスを介して細胞内に移入される。

より典型的には、適切なウイルス性の遺伝子送達ベクターは、本発明の核酸を送達するために使用されることとしてもよい。本発明で使用されるために適切なウイルスのベクターは、パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、または単純ヘルペスウイルスであることとしてもよい。パルボウイルスは、アデノウイルス‐随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることとしてもよい。

本明細書で使用されるように、遺伝子送達に関連して、用語「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、例えば、エンベロープまたはカプシド内にパッケージされる核酸（つまり、ベクターゲノム）を含む、遺伝子送達ビヒクルとして機能するパーティクルを指すこととしてもよい。あるいは、いくつかの文脈において、用語「ベクター」は、ベクターゲノムのみを指すために使用されることとしてもよい。

よって、本発明は、哺乳動物細胞における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの導入および／または発現のためのベクターとしての使用に関する、動物パルボウイルス、特に、伝染性のヒトまたはサルＡＡＶのようなディペンドウイルス、およびその成分（例えば、動物パルボウイルスゲノム）に基づく遺伝子送達ベクター（本発明の核酸を含む）を提供する。本明細書で使用される用語「パルボウイルスの」は、よって、あらゆるタイプのＡＡＶのようなディペンドウイルスを包含する。

パルボウイルス科ファミリーのウイルスは、小さなＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科ファミリーは、２つのサブファミリーに分けられ、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫に感染するデンソウイルス亜科である。サブファミリーパルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書では、パルボウイルスを指し、ディペンドウイルス属を含む。それらの属の名前から推定すると、ディペンドウイルスのメンバーは、細胞培養における増殖性感染のために、それらは通常アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスと同時感染を必要とすることにおいて独特である。ディペンドウイルス属は、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に通常感染するＡＡＶ、および他の温血動物（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジのアデノ随伴ウイルス）に感染する関連ウイルスを含む。パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーのさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，“Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に記載される。本発明の利便性のために、ＡＡＶに対する参照により、本明細書にさらに例示されおよび記載される。しかしながら、本発明は、ＡＡＶに限定されないが、他のパルボウイルスに同様に適用されることとしてもよいことが理解される。

全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは線形の、長さが約５０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の一本鎖のＤＮＡ分子である。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造（ＶＰ）タンパク質に関する固有のコードヌクレオチド配列と隣接する。

ＶＰタンパク質（ＶＰ１，‐２および‐３）はカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補性であり、Ｔ字状のヘアピンを形成する力強く安定した分子内の二本鎖が形成されるように構築される。これらのヘアピン構造は、細胞性のＤＮＡポリメラーゼ複合体についてのプライマーとして作用するウイルス性のＤＮＡ複製の起点として機能する。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染後に、Ｒｅｐ遺伝子（つまり、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードする）がＰ５プロモーターおよびＰ１９プロモーターからそれぞれ発現され、両方のＲｅｐタンパク質がウイルス性のゲノムの複製における機能を有する。ＲｅｐＯＲＦにおけるスプライシング現象は、実際に４つのＲｅｐタンパク質（つまり、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳動物細胞におけるＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター産生のために十分であることが示された。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質は、ＡＡＶベクター産生のために十分である。

遺伝子治療ベクターとしての使用に関して適切なＡＡＶにおいて、ベクターゲノムは、概して、標的細胞への送達のためにパッケージされる（本明細書に記載される）本発明の核酸を含む。この特定の実施形態によれば、異種性のヌクレオチド配列は、ウイルス性のＩＴＲ間でベクターゲノムの一方の端部に配置される。より好ましい実施形態では、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｃａｐ遺伝子およびパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子がテンプレートゲノムから（よって、それらから産生されたビリオンＤＮＡから）欠失される。この構成は、パルボウイルスカプシドにより行われ得る核酸配列（複数を含む）のサイズを最大化する。

この特定の実施形態によれば、本発明の核酸は、ウイルス性のＩＴＲ間で基質の一方の端部に配置される。パルボウイルスのゲノムが１つのＩＴＲのみにより機能することができる。よって、パルボウイルスに基づく本発明の遺伝子治療ベクターにおいて、ベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲにより、しかし、より典型的には、２つのＡＡＶ ＩＴＲ（概して、ベクターゲノムの１つの両側に、つまり、５’末端に１つおよび３’末端に１つ）により隣接される。ベクターゲノムにおける本発明の核酸と１つまたはそれ以上のＩＴＲとの間を介在する配列があることとしてもよい。

好ましくは、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（哺乳動物細胞における発現に関する）をコードする核酸は、２つの規則的な（ｒｅｇｕｌａｒ）ＩＴＲ間で配置され、または２つのＤ領域により設計されるＩＴＲの両側に配置されるパルボウイルスのゲノム内に組み込まれるであろう。

ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの産生に関する本発明において使用されるＡＡＶ配列は、あらゆるＡＡＶ血清型のゲノム由来であり得る。概して、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸レベルで有意な相同性のゲノムの配列を有し、遺伝子的な機能の同一のセットを提供し、必須の物理的で機能的に同等であるビリオンを産生し、実質的に同一のメカニズムを複製して組み立てる。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列およびゲノムの類似性の概要は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ， １９９８；およびＷｕ ｅｔ ａｌ，２０００参照。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、または９が、本発明で使用されることとしてもよい。しかしながら、ＡＡＶ血清型１、５、または８は、本発明に関連する使用についての、ＡＡＶ配列の好ましいソースである。ＡＡＶ血清型由来に配列は、遺伝子治療ベクターの産生で使用される場合に、変異され、または操作されることとしてもよい。

本発明に関連する使用についてのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、および／またはＡＡＶ６由来である。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２）コード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、および／またはＡＡＶ６由来である。本発明に関連する使用についてのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、しかしながら、あらゆる既知の４２血清型から、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９、または、例えば、カプシドシャッフリング技術（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）およびＡＡＶカプシドライブラリーにより得られる新たに開発されたＡＡＶ様パーティクルから得られることとしてもよい。

ＡＡＶ ＲｅｐおよびＩＴＲ配列は、特に、ほとんどの血清型で保存される。種々のＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば、８９％以上同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ６間のゲノムレベルでの総ヌクレオチド配列の同一性は、約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ‐Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ，１９９９）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列およびＩＴＲは、哺乳動物細胞でのＡＡＶパーティクルの産生における他の血清型からの配列に対応する効率的に相互に補足すること（つまり、機能的置換）が知られる。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＩＴＲ配列も、昆虫細胞での他のＡＡＶ ＲｅｐおよびＩＴＲ配列をも効率的に相互に補足することを報告する。

ＡＡＶ ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞性トロピシティー（ｔｒｏｐｉｃｉｔｙ）を決定することが知られている。ＶＰタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型中のＲｅｐタンパク質および遺伝子よりも有意により少なく保存される。他の血清型の配列に対応して相互に補足するためのＲｅｐおよびＩＴＲ配列の性能は、カプシドタンパク質の血清型（例えば、ＡＡＶ１、５、または８）並びに別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐおよび／またはＩＴＲ配列を含む偽型ＡＡＶパーティクルの産生を可能にする。このような偽型ｒＡＡＶパーティクルは、本発明の一部である。

また、変更された「ＡＡＶ」配列は、本発明に関連して、例えば、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの産生のために使用され得る。このような変更された配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ ＩＴＲと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくはそれ以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含む。Ｒｅｐ、またはＶＰは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、またはＶＰ配列の代わりに使用され得る。

多くの点で他のＡＡＶ血清型と同様であるが、他の既知のヒトおよびサル血清型以上に、ＡＡＶ５は、他のヒトおよびサルＡＡＶ血清型と異なる。そのことに鑑みて、ｒＡＡＶ５の産生は、昆虫細胞における他の血清型の産生とは異なり得る。本発明の方法が、ｒＡＡＶ５を産生するために採用される場合、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列を、１つ以上の構築物である場合に集団的に含む、１つまたはそれ以上の構築物であって、ヌクレオチド配列がＡＡＶ５ Ｒｅｐコード配列を含む（つまり、ヌクレオチド配列がＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８を含む）ことが好ましい。このようなＩＴＲおよびＲｅｐ配列は、ＡＡＶ５または偽型ＡＡＶ５ベクターの効率的な生産を得るために望ましいとして変更され得る。例えば、Ｒｅｐ配列の開始コドンが変更され得、ＶＰスプライス部位が変更もしくは除去され得、並びに／またはＶＰ１開始コドンおよび近くのヌクレオチドがＡＡＶ５ベクターの産生を向上させるために変更され得る。

よって、本発明で使用されるウイルス性のカプシドは、上述のような、あらゆるパルボウイルス、自律的なパルボウイルスまたはディペンドウイルスのいずれかの由来であることとしてもよい。好ましくは、ウイルス性のカプシドは、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６カプシド）である。概して、ＡＡＶ１カプシドまたはＡＡＶ６カプシドが好ましい。パルボウイルスカプシドの選択は、例えば、標的細胞のタイプ、所望のレベルの発現、発現される異種性のヌクレオチド配列の性質、ウイルス性の産生に関する出版物等のような当該技術分野で知られる多くの考慮に基づくこととしてもよい。例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６カプシドは骨格筋に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８は肝臓および中枢神経系の細胞（例えば、脳）に、ＡＡＶ５は気道および肺または脳における細胞に、ＡＡＶ３は骨髄細胞に、並びにＡＡＶ４は脳における特定の細胞（例えば、付加可能な（ａｐｐｅｎｄａｂｌｅ）細胞）に、有利に採用されることとしてもよい。

最も適切なウイルス、ウイルスサブタイプ、またはウイルス血清型を選択することは当業者の技術スキルの範囲内である。いくつかのサブタイプまたは血清型は、所定のタイプの組織について他よりもより適切であることとしてもよい。

例えば、本発明の核酸の肝臓に特異的な発現は、肝臓細胞のＡＡＶ媒介形質導入により、有利に誘導されることとしてもよい。肝臓はＡＡＶ媒介形質導入を受け入れられ、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８）が使用されることとしてもよい。筋肉の形質導入は、血流を介して、本発明の核酸をコードするＡＡＶの投与により達成されることとしてもよい。よって、静脈内または動脈内投与が適用可能である。

本発明により調製されたパルボウイルスの遺伝子治療ベクターは、ウイルス性のＴＲおよびウイルス性のカプシドがパルボウイルスとは異なる、「ハイブリッド」パーティクルであることとしてもよい。好ましくは、ウイルス性のＴＲおよびカプシドは、ＡＡＶの異なる血清型由来である。同様に、パルボウイルスは、「キメラ」カプシド（例えば、異なるパルボウイルス由来の配列、好ましくは異なるＡＡＶ血清型を含む）または「標的」カプシド（例えば、有向性のトロピズム（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒｏｐｉｓｍ））を有することとしてもよい。

本発明の文脈において、「少なくとも１つのパルボウイルスのＩＴＲヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」領域としても言及される、ほとんど相補的、対称的に配置された配列を含むパリンドローム配列を意味することが理解される。ＩＴＲは、複製の起点、例えば、パリンドロームを認識するＲｅｐ７８（またはＲｅｐ６８）およびパリンドロームに対して内部の特定の配列のような、複製における「シス」の役割を有する部位、つまり、トランス作用性複製タンパク質についての認識部位として機能する。ＩＴＲ配列の対称性に対する１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。それは（１つのＩＴＲ内に補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有しておらず）特有である。一本鎖ＤＮＡの切断は、ＡおよびＤ領域間の接合点で生じる。それは新たなＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は、通常、パリンドロームの片側に位置し、核酸複製工程に対する方向性を提供する。哺乳動物細胞で複製されるパルボウイルスは、概して、２つのＩＴＲ配列を有する。しかしながら、結合部位が、対照的に、パリンドロームの両側の１つに配置されるＡ領域およびＤ領域の両方の鎖上にあるように、ＩＴＲを操作することができる。二本鎖の環状のＤＮＡテンプレート（例えば、プラスミド）上で、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８に補助される核酸の複製は、その後、両方の方向に進み、単一のＩＴＲは、環状のベクターのパルボウイルスの複製に十分である。よって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列は、本発明に関連して使用され得る。好ましくは、しかしながら、２つまたは別の同じ数の規則的な（ｒｅｇｕｌａｒ）ＩＴＲが使用される。より好ましくは、２つのＩＴＲ配列が使用される。好ましいパルボウイルスのＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲである。安全性の理由のため、細胞への最初の導入後にさらに伝播できないパルボウイルスの（ＡＡＶ）ベクターを構成することが望ましいこととしてもよい。受容体における望ましくないベクターの伝播の制限についてのこのような安全機構は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載されるように、キメラＩＴＲとともにＡＡＶを用いることにより提供されることとしてもよい。

当業者は、本発明のＡＡＶベクターを産生するために使用されるウイルス性のＲｅｐタンパク質（複数を含む）が、ウイルス性のＩＴＲのソースについての考慮とともに選択されることとしてもよいことを理解するであろう。例えば、ＡＡＶ５ ＩＴＲは、概して、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質とより効率的に相互に作用するが、ＩＴＲの血清型およびＲｅｐタンパク質（複数を含む）がマッチされる必要はない。

本発明で使用されるＩＴＲ（複数を含む）は、概して機能的であり、つまり、それらは十分に分解可能であることとしてもよく、好ましくは、好ましいとされる血清型１、２、３、４、５、または６を有するＡＡＶ配列である。本発明に係る分解可能なＡＡＶ ＩＴＲは、例えば、ＩＴＲがウイルスパッケージング、統合、および／またはプロウイルスのレスキュー等のような望ましい機能を媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列（例えば、野生型配列は挿入、欠失、切断、またはミスセンス突然変異により、変更されることとしてもよい）を有する必要はない。

有利には、これまでのアプローチと比較して遺伝子治療ベクターを用いることにより、タンパク質合成の復元、つまり、第ＶＩＩＩ因子合成は、形質導入された細胞を永続的にまたは一定の持続した期間の間取得し、これにより、治療効果を達成するための継続的な投与の必要性を回避することが特徴である。

よって、本発明のベクターは、それゆえに、肝臓細胞のような適切な細胞タイプを効率的に形質導入する遺伝子治療ベクター内の核酸を操作することにより、本発明の核酸のインビボでの送達に関するストラテジーの開発のためのツールを示す。

本発明のさらなる態様においては、宿主は、上記のベクターを含んで提供される。好ましくは、ベクターは、宿主において、本発明の核酸分子を発現することができる。宿主は、あらゆる適切な宿主であることとしてもよい。

本明細書で使用されているように、用語「宿主」は、本発明の核酸分子もしくはベクターを宿す生物および／または細胞、並びに遺伝子組換え型遺伝子もしくはタンパク質を発現する際の使用に適する生物および／または細胞を指す。本発明があらゆる特定のタイプの細胞または生物に限定されることは意図されない。実際に、あらゆる適切な生物および／または細胞が、宿主としての本発明における使用を見出すであろうことが考慮される。宿主細胞は、単一の細胞、例えば（液体培養または個体基質上での培養のような）培養の形態における、類似のまたは異なる細胞の個体群、生物もしくはその一部で形成されていることとしてもよい。

本発明に係る宿主細胞が、本発明の核酸分子の発現を可能にすることとしてもよい。よって、宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞であることとしてもよい。

遺伝子組換え型パルボウイルスの（ｒＡＡＶ）ベクターの複製を可能にし、培養において維持され得るあらゆる昆虫細胞が、本発明に従って使用され得る。例えば、使用される細胞株は、スポドプテラ・フルギペルダ、ショウジョウバエ細胞株、またはモスキート細胞株、例えば、ヒトスジシマカ由来細胞株由来であり得る。好ましい昆虫細胞または細胞株は、例えば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ‐ＴＮ‐５Ｂ１‐４、ＭＧ‐１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（米国特許第６，１０３，５２６号；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，ＣＴ，ＵＳＡ）を含むバキュロウィルス感染に感受性がある昆虫種由来の細胞である。

さらに、本発明は、パルボウイルス遺伝子送達ベクターの調製のための方法を提供し、その方法は、
（ａ）（ｉ）少なくとも１つのパルボウイルスの逆位末端反復ヌクレオチド配列により隣接される本発明の核酸分子；
（ｉｉ）昆虫細胞におけるＲｅｐタンパク質（複数を含む）の発現を駆動することが可能であるプロモーターに操作可能に連結される、１つまたはそれ以上のパルボウイルスのＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット；
（ｉｉｉ）昆虫細胞におけるカプシドタンパク質（複数を含む）の発現を駆動することが可能であるプロモーターに操作可能に連結される、１つまたはそれ以上のパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセット；を含む、１つまたはそれ以上の核酸構築物を含む昆虫細胞を提供し、
（ｂ）Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質の発現をもたらす条件下で、（ａ）において定義される昆虫細胞を培養し、任意に、
（ｃ）パルボウイルス遺伝子送達ベクターを回収する工程を含む。

概して、本発明の方法は、よって、昆虫細胞における（本発明の核酸を含む）パルボウイルス遺伝子送達ベクターの産生を可能にする。好ましくは、当該方法は、（ａ）パルボウイルスの（例えば、ＡＡＶ）ベクターが産生されるような条件下で上記に定義されるような昆虫細胞を培養し、（ｂ）遺伝子組換え型パルボウイルスの（例えば、ＡＡＶ）ベクターを回収する工程を含む。好ましくは、パルボウイルス遺伝子送達ベクターはＡＡＶ遺伝子送達ベクターである。

ここで、このような方法において産生される（ＡＡＶ）ベクターは、好ましくはパルボウイルスのゲノムを含む伝染性のパルボウイルスのまたはＡＡＶビリオンであり、それ自身が本発明の核酸を含むことが理解される。培養における昆虫細胞の増殖条件、および培養での昆虫細胞における異種性産生物の産生は、当該技術分野でよく知られており、例えば、昆虫細胞の分子工学の上記の引用文献に記載されている。

本発明の方法において、少なくとも１つのパルボウイルスのＩＴＲ配列により隣接される本発明の核酸が提供される。このタイプの配列は、上記に詳細に記載される。好ましくは、本発明の核酸は、２つのパルボウイルスのＩＴＲ配列間に配置される配列である。

第１の発現カセットは、昆虫細胞におけるＲｅｐタンパク質（複数を含む）の発現を駆動することが可能である第１のプロモーターに操作可能に連結される１つまたはそれ以上のパルボウイルスのＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

動物パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせのような、昆虫細胞におけるパルボウイルスのベクター産生のために必要とされるおよび十分である、非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列として本明細書で理解される。

動物パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくは、ディペンドウイルス由来、より好ましくはヒトまたはサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来、および最も好ましくはヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に通常感染するＡＡＶ由来である。Ｒｅｐコード配列は当業者によく知られており、適切な配列は、国際公開第２００７／１４８９７１号におよび国際公開第２００９／０１４４４５号にも参照され、詳細が記載される。

好ましくは、ヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスのベクター産生に必要とされて、十分とされる動物パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする。

第２の発現カセットは、昆虫細胞におけるカプシドタンパク質（複数を含む）の発現を駆動することが可能であるプロモーターに対して操作可能に連結される１つまたはそれ以上のパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。発現されるカプシドタンパク質（複数を含む）は、１つまたはそれ以上の上記のものであることとしてもよい。

好ましくは、ヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスのベクター産生に必要とされて、十分とされる動物パルボウイルスｃａｐタンパク質をコードする。

これらの３つの配列（ゲノム、ｒｅｐをコードするおよびｃａｐをコードする）が、１つまたはそれ以上の核酸構築物、例えば、１つ、２つ、または３つの核酸構築物により、昆虫細胞において提供される。好ましくは、その後、１つまたは複数の核酸はベクターゲノムを構成し、昆虫細胞におけるパルボウイルスのＲｅｐおよびｃａｐタンパク質の発現は昆虫細胞と適合性のあるベクターである。「昆虫細胞と適合性のあるベクター」または「ベクター」は、昆虫または昆虫細胞の生産的なトランスフォーメーションまたはトランスフェクションを可能にする核酸分子であることが理解される。代表的な生物学的ベクターは、プラスミド、線形核酸分子、および遺伝子組換え型ウイルスを含む。あらゆるベクターが、それが昆虫細胞と適合性のある限り、採用され得る。ベクターは、昆虫細胞のゲノム内に組み込むこととしてもよいが、昆虫細胞におけるベクターの存在は永続的である必要はなく、一時的なエピソームのベクターも含まれる。ベクターは、既知のあらゆる手段により、例えば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、または感染により導入され得る。好ましい実施形態では、ベクターは、バキュロウィルス、ウイルスのベクター、またはプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウィルスであり、つまり、構築物はバキュロウィルスのベクターである。バキュロウィルスのベクターおよびこれらの使用についての方法は当業者によく知られている。

概して、パルボウイルス遺伝子送達ベクターを産生するための本発明の方法は、その後、パルボウイルスカプシド内にベクターゲノムの複製およびパッケージングするのに十分な条件下で、パルボウイルス複製を許容する細胞に（ａ）本発明のベクターのゲノムを産生するためのテンプレートをコードするヌクレオチド配列（本明細書に詳細に記載される）；（ｂ）ベクターのゲノムを産生するためのテンプレートの複製のために十分なヌクレオチド配列（上記で定義される第１の発現カセット）；（ｃ）パルボウイルスカプシド内にベクターのゲノムをパッケージするために十分なヌクレオチド配列（上記で定義される第２の発現カセット）を提供することを含み、これにより、パルボウイルスカプシド内にカプシド形成されたベクターのゲノムを含むパルボウイルスパーティクルが細胞で産生される。好ましくは、パルボウイルスの複製および／またはカプシドコード配列は、ＡＡＶ配列である。

本発明の方法は、好ましくは、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ）抗体を用いる遺伝子組換え型パルボウイルスの（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）の親和性精製の工程を含むこととしてもよい。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。特に適している抗体は、例えば、ラクダまたはラマから入手可能な単鎖のラクダ科の抗体またはそのフラグメントである（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１参照）。ｒＡＡＶの親和性精製のための抗体は、好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープと特異的に結合する抗体であり、これにより、好ましくは、エピトープは、２つ以上のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に存在するエピトープである。例えば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドに特異的な結合に基づいて挙げられまたは選択されることとしてもよいが、また同時に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９カプシドに特異的に結合することとしてもよい。

本発明は、また、分裂および非分裂細胞を含む広い範囲の細胞内に本発明の核酸を送達するための手段を提供する。本発明は、例えば、インビトロでこのような核酸分子によりコードされるポリペプチドを産生するために、またはエクスビボの遺伝子治療のために、インビトロで細胞に本発明の核酸を送達するために採用されることとしてもよい。

本発明の核酸分子、ベクター、細胞、および方法／使用が、それを必要とする宿主、典型的には、血友病Ａのような血友病に罹っている宿主に対して本発明の核酸を送達する方法においてさらに有用である。

本発明は、獣医学および医学的な用途における使用を見出す。本明細書に記載されるように、遺伝子送達方法のための適切な対象は、哺乳類と鳥類の両方を含み、哺乳類が好ましいとされる。本明細書で使用される用語「鳥類」は、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、およびキジを含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される用語「哺乳類」は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等を含むがこれらに限定されない。ヒトの対象が最も好ましい。ヒトの対象は、胎児、新生児、幼児、青少年、および成人を含む。

よって、本発明は、本発明の核酸もしくはベクターを含む薬学的組成物、並びに薬学的に許容可能な担体もしくは希釈剤および／または他の薬品、医薬品、もしくはアジュバント等を提供する。

注入のために、担体は、概して液体であろう。投与の他の方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであることとしてもよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、固体または液体の粒子の形態であることが好ましいであろう。注入媒体として、安定剤、塩、もしくは生理食塩水、および／または緩衝液のような通常の注入溶液のための添加剤を含む水を使用することが好ましい。

概して、「薬学的に許容可能な担体」は、細胞に対して毒性または過度に有害ではないものである。代表的な薬学的に許容可能な担体は、無菌のパイロジェンフリーな水、および無菌のパイロジェンフリーなリン酸緩衝食塩水を含む。薬学的に許容可能な担体は、生理学的に許容可能な担体を含む。用語「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性のある、あらゆるおよび全ての溶解剤、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張性の吸収遅延剤等を含む。

「薬学的に許容可能」により、生物学的ではない、または、そうでなければ、望ましくない材料、つまり、材料があらゆる望ましくない生物学的効果を生じることなく、対象に投与されることを意味することとしてもよい。よって、このような薬学的組成物が、例えば、エクスビボでの細胞のトランスフェクションにおいて、または対象への直接的な細胞もしくはウイルスパーティクルの投与において、使用されることとしてもよい。

担体は、静脈内、腹腔内、または筋肉内の投与を含む非経口の投与に適することとしてもよく、あるいは、担体は、舌下または経口の投与に適することとしてもよい。薬学的に許容可能な担体は、無菌の水溶液または分散体並びに無菌の注射液または分散体の即時の調製のための無菌の粉末を含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。あらゆる従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用が考慮される。

薬学的組成物は、概して、製造および保存の条件下で無菌であり安定している。薬学的組成物は、高い薬物濃度を適応させることに適している溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または他の規則構造として配合されることとしてもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、並びにこれらの適切な混合物を含む溶解剤または分散媒体であることとしてもよい。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合における必要とされるパーティクルサイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合において、組成物に、等張性の試剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続性のある吸収は、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤を組成物に含むことによりもたらされ得る。本発明の核酸またはベクターは、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、例えば、速放性に対する化合物を保護するであろう緩効性ポリマーまたは他の担体を含む組成物において、一度でまたは放出制御製剤で投与されることとしてもよい。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ乳酸、ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）のような、生物分解性、生物適合性のポリマーが使用されることとしてもよい。

パルボウイルス、例えば、ＡＡＶ、本発明のベクターは、細胞への遺伝子材料を伝達することに用いることとしてもよい。このような伝達は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行われることとしてもよい。

よって、本発明は、ヌクレオチド配列を細胞へ送達するための方法を提供し、当該方法は、本発明のこのような核酸またはベクターが細胞に入るような条件下で、本明細書に記載される核酸、ベクター、または薬学的組成物を接触させることを含む。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの細胞であることとしてもよい。

また、本発明は、血友病に罹っている患者に対して本発明に係る核酸、タンパク質、またはベクターの有効量を投与することを含む、血友病を治療する方法を提供する。好ましくは、患者は、血友病Ａに罹っている。好ましくは、患者はヒトである。

血友病、例えば、血友病Ａが、上記の方法で「治療」される場合、このことは、血友病の１つまたはそれ以上の症候が寛解される。それは、血友病の症候が、患者においてもはや存在しなくなるように、完全に治療することを意味しないが、いくつかの方法では、このことは本当となるかもしれない。血友病、例えば、血友病Ａの１つまたはそれ以上の症候において、当該治療方法は、治療前よりも重篤さをより少なくすることをもたらす。

さらに、本発明は、また、ヌクレオチド配列を対象に送達または投与するための方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載される核酸、ベクター、または薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む。特に、本発明は、本発明に係るパルボウイルスの遺伝子治療ベクターを、任意に薬学的に許容可能な担体とともに、対象に投与することを含む、対象に本発明の核酸分子を投与する方法を提供する。好ましくは、パルボウイルスの遺伝子治療ベクターは、それを必要とする対象に、治療に有効な量で投与される。つまり、本発明による投与は、概して、それを必要とする対象において、治療効果を提供するレベルで機能的第ＶＩＩＩ因子の発現をもたらす条件下で行われる。

インビボでの宿主細胞への本発明の核酸またはベクターの送達は、例えば、血友病Ａのような血液凝固疾患の１つまたはそれ以上の症候を寛解させるレベルへと、宿主における機能的第ＶＩＩＩ因子の増加をもたらすかもしれない。

血友病Ａに罹っている対象における自然起源の第ＶＩＩＩ因子のレベルは、血友病の重症度により変化する。疾病の重篤な形態を有する患者は、正常に健康な対象でみられるレベルの約１％よりも低い第ＶＩＩＩ因子のレベルを有する（本明細書では「正常なレベル」と言及する。正常なレベルは約５０〜１５０ＩＵ／ｄＬである。）。疾病の中程度の形態を有する患者は、正常なレベルの約１％〜約５％の間の第ＶＩＩＩ因子のレベルを有する。疾病の軽度の形態を有する患者は、正常なレベルの約５％以上の、典型的には正常なレベルの約５％〜約３０％の間の第ＶＩＩＩ因子のレベルを有する。

本発明の治療の方法が使用される場合に、正常なレベルの、つまり、治療前の対象において存在する第ＶＩＩＩ因子のレベルに加えて、少なくとも約１％の機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせ得ることが見出された。血友病Ａに罹っている対象においては、このような増加は、血友病の症候の寛解を生じさせ得る。特に、少なくとも約１％の増加は、血友病Ａに苦しむ者、とりわけ疾病の重篤な形態を有するものに生じる出血の頻度を低減させ得る。一実施形態では、当該治療の方法は、正常なレベルの少なくとも約５％の機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルを増加させる。このことは、重篤から軽度へと疾病のフェノタイプを変更し得る。疾病の軽度な形態を有する患者は、めったに自然に起きる出血がない。他の実施形態では、本発明の治療方法は、正常なレベルの少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％の機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせる。特定の実施形態においては、本発明の治療方法は、正常なレベルの少なくとも約３０％の機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせる。このレベルの増加は、血友病Ａに罹っている患者における血液の凝固を実質的に正常にするであろう。このような対象は、外傷後または手術中に第ＶＩＩＩ因子濃縮物を必要とする可能性がほとんどない。

別の実施形態では、本発明の治療方法は、正常なレベルの少なくとも約１％に、機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせることとしてもよい。治療の方法は、正常なレベルの少なくとも約５％に機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルを増加させることとしてもよい。他の実施形態では、本発明の治療の方法は、正常なレベルの少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％に機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせることとしてもよい。特定の実施形態においては、本発明の治療の方法は、正常なレベルの少なくとも約３０％に機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせることとしてもよい。機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルが３０％またはそれ以上に増加した対象は、実質的に正常な血液凝固を行うであろう。

一実施形態では、本発明の治療方法は、最大で正常なレベルへと機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルにおける増加を生じさせる。

機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルは比較的容易に測定され得、第ＶＩＩＩ因子のレベルを測定する方法は当業者によく知られている。発色性および凝固に基づく分析を含む、多くの凝固分析が可能である。ＥＬＩＳＡ試験は、また、広く使用可能である。具体的な方法は、因子ＶＩＩＩ：Ｃのレベルを測定することであり、第ＶＩＩＩ因子の凝固活性の実験的測定である。因子ＶＩＩＩ：Ｃの正常なレベルは、４６．８から１４１．８ＩＵ／ｄＬまたは０．４６８〜１．４ＩＵ／ｍｌである。

さらなる方法は、凝固する血液の性能の測定である、活性化された部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することである。正常なａＰＴＴは、約２４から約３４秒の間である。血友病、例えば、血友病Ａに罹っている対象は、より長いａＰＴＴを有するであろう。この方法は、プロトロンビン時間測定と組み合わせて使用され得る。

とりわけ血友病、特に血友病Ａの治療における治療での使用のために、本発明の核酸分子、タンパク質、またはベクターもまた提供される。

血友病、特に血友病Ａの治療のための薬物の製造における本発明の核酸分子、タンパク質、またはベクターの使用もまた提供される。

本発明は、また、療法によるヒトまたは動物の身体の治療における使用のための本発明の核酸またはベクターを提供する。特に、本発明の核酸またはベクターは、血友病、例えば、血友病Ａのような血液凝固疾患の治療における使用のために提供される。本発明の核酸またはベクターは、例えば、出血の発症の頻度および／または重症度を低減することにより、血液凝固疾患の１つまたはそれ以上の症候を寛解させることにおける使用のために提供される。

本発明は、さらに、血液凝固疾患の治療の方法を提供し、その方法は、それを必要とする対象に、本発明の核酸またはベクターの有効量を投与する工程を含む。

よって、本発明は、対象への核酸の投与における使用のための薬物の製造における、本明細書に記載されるような核酸またはベクターの使用をさらに提供する。さらに、本発明は、血液凝固疾患の治療における使用のための薬剤の製造において、本明細書に記載されるような核酸またはベクターを提供する。

典型的には、本発明の核酸またはベクターは、遺伝子治療により、特に、ＡＡＶのようなパルボウイルスの遺伝子治療ベクターの使用により、対象に投与されることとしてもよい。遺伝子治療のための一般的な方法は、当該分野で知られている。ベクター、成分、または薬学的組成物は、当該技術分野で知られるあらゆる適切な方法によりインビボで対象に、またはインビトロもしくはエクスビボで細胞に送達されることとしてもよい。あるいは、ベクターがエクスビボで細胞に送達され、当該分野で知られるように、当該細胞が対象に投与されることとしてもよい。概して、本発明は、インビトロで、エクスビボで、またはインビボで、細胞に本発明のあらゆる核酸を送達することを採用し得る。

本発明は、細胞に核酸を送達する方法をさらに提供する。概して、インビトロの方法について、ウイルスは、当該技術分野で知られるような、標準的なウイルスの形質導入方法により細胞内に導入されることとしてもよい。

好ましくは、ウイルスのパーティクルが、特定の標的細胞に適している標準的な形質導入方法により、感染の適切な多重度で細胞に添加される。投与するウイルスの力価は、標的細胞のタイプおよび特定のウイルスベクターにより変化し得、過度の実験を行うことなく、当業者により測定されることとしてもよい。

細胞は対象から取り除かれ、パルボウイルスのベクターが内部に導入され、その後、細胞は対象内に戻って置換される。対象内に戻される前に、エクスビボでの治療のために対象から細胞を取り除く方法は、当該技術分野で知られている。

あるいは、ＡＡＶベクターは、別の対象から細胞内に、培養された細胞内に、またはあらゆる他の適切なソースから細胞内に導入されることとしてもよく、細胞は、それを必要とする対象に投与される。

本発明のさらなる態様は、本発明の核酸またはベクターによりインビボで対象を治療する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明の核酸またはベクターの投与は、ウイルスのベクターを投与するための当該技術分野で知られるあらゆる手段によりなされ得る。

本発明の核酸またはベクターは、概して、上記に提示した薬学的組成物に含まれるであろう。このような成分は、所望の治療的または予防的効果を提供するために十分な有効量での核酸またはベクター、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。「有効量」は、治療的に有効な量または予防的に有効な量を含む。

「治療に有効な量」は、（そのタンパク質の欠如に関連する疾病の症候を寛解させるために十分なレベルに、機能的第ＶＩＩＩ因子の産生を導くために）対象における機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルを上昇させるような、所望の治療的結果を達成するための、有効な量、用量、および必要な期間を指す。

本発明の核酸分子またはベクターの治療に有効な量は、個体の疾病状態、年齢、性別、および体重のような因子、並びに個体における所望の反応を引き出すための核酸分子またはベクターの性能により変化することとしてもよい。用量の投与計画は、最適な治療反応を提供するために、調節されることとしてもよい。また、治療に有効な量は、概して、核酸分子またはベクターのあらゆる毒性または有害な影響を、治療的に有益な効果が上回るものである。

ウイルス性の遺伝子治療ベクターが、生物学的に有効な量で、細胞または宿主に投与されることとしてもよい。ウイルスのベクターの「生物学的に有効な」量は、細胞内に異種性の核酸配列の感染（または形質導入）および発現をもたらすのに十分である量である。ウイルスがインビボで細胞内に投与される場合（例えば、ウイルスが対象に投与される）、ウイルスのベクターの「生物学的に有効な」量は、標的細胞に本発明に係る核酸の形質導入および発現をもたらすのに十分である量である。

遺伝子治療ベクターのような、本発明の核酸分子またはベクターに関し、投与される用量は、治療を受ける対象の状態および大きさ、並びに、治療製剤、治療の頻度、および投与経路に広い範囲で依存することとしてもよい。投与量、製剤、および頻度を含む、療法を継続するための治療計画は、初動対応および臨床判断により導かれることとしてもよい。組織の間質空間への非経口経路の注入が好ましいが、特定の投与では、エアロゾル製剤の吸入のような他の非経口経路が必要とされるかもしれない。いくつかのプロトコールでは、水溶性の担体における遺伝子および遺伝子送達システムを含む製剤が、適切な量で組織内に注入される。

投与の代表的な様式は、経口、直腸、経粘膜的、局所、経皮的、吸入、非経口の（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および関節内）投与等、並びに、直接的な組織または器官注入、あるいは、髄腔内、直接的に筋肉内、心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼球内注入を含む。注射可能なものは、液体の溶液もしくは懸濁液、注入前の液体における溶液もしくは懸濁液に適する固形の形態、または乳濁液のいずれかのような従来の形態で調製され得る。あるいは、例えば、徐放性製剤または持続性放出製剤において、全身的よりもむしろ局所的な様式でウイルスを投与することとしてもよい。

本発明の核酸分子またはベクターを投与される組織／細胞のタイプは、あらゆるタイプであることとしてもよいが、典型的には、肝性／肝臓細胞であろう。本発明は、あらゆる特定の投与の経路に限定されることは意図とされない。しかしながら、肝臓細胞が形質導入されるために、本発明の核酸分子またはベクターは、門脈または動脈の脈管構造を介してうまく投与されることとしてもよい。あるいは、細胞は、あらゆる前駆細胞であることとしてもよい。さらに代替的には、細胞は幹細胞であり得る（例えば、肝臓の幹細胞）。組織の標的は、特定のものであってもよく、または、それは、例えば、肝臓および筋肉組織のようないくつかの組織の組み合わせであることとしてもよい。

遺伝子治療ベクターの場合には、マウスのような小動物の有効な投与量の範囲は、筋肉内注入後に、約１×１０^１１から約１×１０^１２ゲノム複製（ｇｃ）／ｋｇの間、大型動物（ネコ）およびおそらくヒト対象については約１×１０^１０から約１×１０^１３ｇｃ／ｋｇの間であることとしてもよい。本発明のパルボウイルスの遺伝子治療ベクターの用量は、投与の様式、治療される疾病または状態、個体の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達される遺伝子に依存し、通常の方法で測定され得る。概して、容量当たり、約１０^３から約１０^１６のウイルスパーティクルの量が適していることとしてもよい。好ましくは、投与量あたり、約１０^９から約１０^１４のウイルスパーティクルの量が使用される。この方法で治療される場合、対象は、ウイルスパーティクルが単一の投与で治療に作用するようにウイルスパーティクルの単一の投与量を受けることとしてもよい。

本発明の組成物における活性化合物の量は、個体の疾病の状態、年齢、性別、および体重のような因子により変化することとしてもよい。容量の治療計画は、最適な治療応答を提供するために調節されることとしてもよい。例えば、単一の急速投与が投与されることとしてもよく、いくつかの分割された投与量が時間をかけて投与されることとしてもよく、または投与量が、治療状況の緊急性により示されるように比例して減少し、もしくは増加させることとしてもよい。

投与の容易性と容量の均一性のために、単位用量形態における非経口の組成物を配合することが有利であることとしてもよい。本明細書で使用される「単位用量形態」は、治療される対象のための単位容量として適する、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を産生するために算出された所定の量の活性化合物を含む。本発明の単位用量形態の詳細は、活性化合物の特有の特性および達成される特定の治療効果により、並びに個体における状態の治療のための活性化合物のような調合の当該分野における固有の制限により規定されることとしてもよい。

このような製剤の調製のための多くの方法が、特許取得され、または当業者に一般的に知られている。

本発明の宿主細胞により発現されるＦＶＩＩＩタンパク質または糖タンパク質もまた提供される。

本発明に係るベクターを含む細胞を含むトランスジェニック動物もまたさらに提供される。好ましくは、動物は、非ヒト哺乳類、特にマカクのような霊長類である。あるいは、動物は、げっ歯類、とりわけマウスであることとしてもよく、またはイヌ、ネコ、ヒツジ、もしくはブタであることとしてもよい。

上記記載においては、用語「同一性」は、２つの配列の類似性を指すために使用される。本発明の目的のために、２つの核酸配列の同一性のパーセンテージを測定するために、配列が、最適な比較の目的のために配置されることが本明細書で定義される（例えば、間隔が、第２のアミノまたは核酸配列により、最適な配置のために第１の核酸の配列に導入され得る。）。ヌクレオチド位置でのヌクレオチド残基が、その後、比較される。第１の配列の位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基により占められる場合、その結果、分子はその位置で同じである。２つの配列間の同一性のパーセンテージは、配列により共有される同じ位置の数の関数である（つまり、同一性％＝同じ位置の数／全体の位置の数（つまり、重複している位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は、同じ長さである。

配列の比較は、比較される２つの配列の全体の長さにわたって、または２つの配列のフラグメントにわたって行われることとしてもよい。概して、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われるであろう。しかしながら、配列の同一性は、例えば、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約４５００、約５０００、またはより多くの連続する核酸残基の範囲にわたって行われることとしてもよい。

当業者は、いくつかの異なるコンピュータプログラムが２つの配列間で相同性を測定することが可能であるという事実を把握しているであろう。例えば、配列の比較および２つの配列間の同一性のパーセンテージの測定は、数値計算用アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間の同一性のパーセンテージが、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重量（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）を用いて、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）における、ＧＡＰプログラムに組み込まれる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０）アルゴリズムを用いて測定される。当業者は、全てのこれらのパラメーターは、わずかに異なる結果を産み出すが、２つの配列の全体の同一性のパーセンテージは、異なるアルゴリズムを用いる場合に有意には変化しないことを理解するであろう。

本発明の核酸配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を識別するために、パブリックなデータベースに対するサーチを行う「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このようなサーチが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ，１９９０のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチが、本発明のタンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を得るために、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実行され得る。比較目的のための間隔のあけられた配置を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９７に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のホームページ参照。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で本発明の記載に使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみの目的であり、本発明の限定を意図とされない。

本書類とその請求項において、動詞「含むこと」およびその活用変化が、その文言の後に続く項目が含まれることを意味するために非限定的な語義で用いられるが、特に言及されていない項目は排除されない。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素に対する参照は、文脈が明らかに要素の１つおよび１つのみがあることを明らかに必要としない限り、１つ以上の当該要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、よって、「少なくとも１つ」を意味する。

特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインをコードするヌクレオチド配列の一部は、９０から１１１ヌクレオチドの間の長さであって、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
（項目２）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の一部は、６つのアスパラギン残基を含み、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列をコードする、項目１の核酸分子。
（項目３）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の一部は、アスパラギンではないアミノ酸残基における２つまでのアミノ酸置換を有する、配列番号４の配列を含むアミノ酸配列をコードする、項目１または２の核酸分子。
（項目４）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の一部は、配列番号４の配列を含むアミノ酸配列をコードする、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目５）
配列番号４の配列またはこれに対する同一性もしくは置換を有する配列は、４から１０アミノ酸の間の長さであって、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の第１の一部である第１のフランキング配列により片方に、および４から１０アミノ酸の間の長さであって、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の第２の一部である第２のフランキング配列によりもう片方に隣接され、前記第１および第２のフランキング配列は、ともに、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列の全体を含む、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目６）
配列番号４の配列またはこれに対する同一性もしくは置換を有する配列は、４から６アミノ酸の間の長さであって、配列番号７の配列の第１の一部である第１のフランキング配列により片方に、および８から１０アミノ酸の間の長さであって、配列番号７の配列の第２の一部である第２のフランキング配列によりもう片方に隣接され、前記第１および第２のフランキング配列は、ともに、配列番号７の配列の全体を含む、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目７）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の一部は、６つのアスパラギン残基をコードし、配列番号１の前記ヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有する第１の配列を含む、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目８）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、９０から１１１塩基対の間の長さであって、６つのアスパラギン残基をコードし、配列番号１の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する第１の配列を含む、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１の核酸分子。
（項目９）
前記第１配列が、配列番号１の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を有する、項目８の核酸分子。
（項目１０）
前記第１配列は、配列番号１の配列を有する、項目８の核酸分子。
（項目１１）
前記第１配列は、４８から６０塩基対の間の長さである、項目８〜１０のいずれか１つの核酸分子。
（項目１２）
前記第１配列は、５１塩基対の長さである、項目８〜１１のいずれか１つの核酸分子。
（項目１３）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、９３塩基対の長さである、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目１４）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、野生型配列のコドンの最適化された配列である、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目１５）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、配列番号２の前記ヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列を有する、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目１６）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、配列番号２の前記ヌクレオチド配列を含む、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目１７）
前記核酸分子が、配列番号３の前記ヌクレオチド配列を含む、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目１８）
前記第１配列は、配列番号４の配列を有するアミノ酸配列をコードする、項目８〜１２のいずれか１つの核酸分子。
（項目１９）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードする、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目２０）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の前記一部は、配列番号５の配列を有するアミノ酸配列をコードする、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目２１）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６の配列を含むタンパク質をコードする、上記のいずれかの項目の核酸分子。
（項目２２）
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインが３０から３７アミノ酸の間の長さであり、配列番号４の配列を含む、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
（項目２３）
前記Ｂドメインが配列番号５の配列を有する、項目２２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
（項目２４）
配列番号６の配列を有する、項目２２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
（項目２５）
項目１〜２１のいずれか１つの核酸分子を含む、ベクター。
（項目２６）
項目１〜２１のいずれか１つの前記核酸分子または項目２５の前記ベクターを含む、宿主細胞。
（項目２７）
項目２６の宿主細胞により発現される第ＶＩＩＩ因子タンパク質または糖タンパク質。
（項目２８）
項目１〜２１のいずれか１つの前記核酸分子または項目２５の前記ベクターを含む細胞を含むトランスジェニック動物。
（項目２９）
項目２５のベクターまたは項目２２のタンパク質を、血友病に罹っている患者に投与することを含む血友病を治療する方法。
（項目３０）
治療における使用のための、項目１〜２１のいずれか１つの核酸分子、項目２２のタンパク質、または項目２５のベクター。
（項目３１）
血友病の治療における使用のための、項目１〜２１のいずれか１つの核酸分子、項目２２のタンパク質、または項目２５のベクター。
（項目３２）
対象への機能的第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列の送達の方法であって、項目１〜２１のいずれか１つの核酸分子または項目２５のベクターを、前記対象に投与することを含む方法。
（項目３３）
パルボウイルス遺伝子送達ベクターの調製の方法であって、
（ａ）（ｉ）少なくとも１つのパルボウイルスの逆位末端反復ヌクレオチド配列により隣接される、項目１〜２１のいずれか１つの核酸分子；
（ｉｉ）昆虫細胞におけるＲｅｐタンパク質の発現を駆動することが可能であるプロモーターに操作可能に連結される、１つまたはそれ以上のパルボウイルスのＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット；
（ｉｉｉ）前記昆虫細胞におけるカプシドタンパク質の発現を駆動することが可能であるプロモーターに操作可能に連結される、１つまたはそれ以上のパルボウイルスの前記カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセット；
を含む、１つまたはそれ以上の核酸構築物を含む前記昆虫細胞を提供し、
（ｂ）Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質の発現に対して助けになる条件下で、（ａ）において定義される前記昆虫細胞を培養し、
任意に、（ｃ）前記パルボウイルス遺伝子送達ベクターを回収する工程を含む、方法。
本明細書で挙げられる全ての特許および参照文献は、これらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。

当業者は、本発明の全ての態様が、それらが例えば、核酸、ベクター、宿主細胞、またはその使用に関していても、本発明の全ての他の態様に対して等しく適用可能であることを理解するであろう。特に、当該治療方法の態様は、例えば、核酸またはベクターの投与が、例えば、血友病、例えば血友病Ａを治療するための核酸またはベクターの使用に関し、本発明の他の態様のいくつかにおけるものより、さらにより詳細に記載されることとしてもよい。しかしながら、当業者は、より詳細な情報が本発明の特定の態様について与えられ、この情報が本発明の他の態様に等しく適用可能であるとみられることを理解するであろう。さらに、当業者は、また、治療の方法に関する記載が、血友病、例えば血友病Ａを治療することにおける核酸またはベクターの使用に等しく適用可能であることを理解するであろう。

本発明は、図面に対する参照により、例示にのみによって、ここに詳細に記載されるであろう。

図１は、ｒＡＡＶプラスミドをコードするコドン最適化ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６（上のパネル）、コドン最適化Ｂドメイン欠失形態（中央右のパネル）、およびグリコシル化を必要とすると考えられる６つのアスパラギン部分（太字）を含むｈＦＶＩＩＩ変異体（下のパネル）の概略図である。Ｂドメインは、より淡いグレーで示される構築物の中間である。さらに、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに対して、発現カセットは、より小さなＨＬＰプロモーターおよび合成ポリアデニル化（Ｓｙｎｔｈ ｐＡ）シグナルも含む。ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡのサイズ並びにｒＡＡＶ発現カセットの全体もまた示される。ｈＦＶＩＩＩ変異体（変異体１および３）のＢドメインの全配列は、また、各変異体について示される配列と隣接する１４のアミノ酸配列を有する。さらに、Ｂドメイン欠失形態は、両側のドメイン（Ａ２およびＡ３ドメイン）間のリンカーとして作用する同じ１４のアミノ酸配列を有する。 図２は、血清型８カプシドの偽型ｒＡＡＶ‐ｈＦＶＩＩＩ構築物の単一の尾静脈投与後のネズミの血漿における、平均ｈＦＶＩＩＩレベル±ＳＥＭを示す（投与量＝１×１０^１１ｖｇ／マウス、Ｎ＝６／グループ）。 図３は、高用量のｒＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩベクターの単一の尾静脈投与後のＦ８‐／‐マウスにおける、ＦＶＩＩＩ活性レベルを示す（投与量＝１×１０^１２ｖｇ／マウス、Ｎ＝５／６動物／グループ）。 図４は、Ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ，グループ３＝低用量（３ｅ１３／ｍｌ），グループ５＝高用量（９ｅ１３／ｍｌ）；Ｃｏｄｏｐ‐ｈｆＦＶＩＩＩ‐Ｎ６，グループ４＝低用量（３ｅ１３／ｍｌ），グループ６＝高用量（９ｅ１３／ｍｌ）；およびＣｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ‐Ｖ３＝グループ７（高用量，９ｅ１３／ｍｌ）由来の、ｒＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩウイルス性ゲノムのアルカリゲル分析を示す。高い質量ＤＮＡラダーがグループ１により示され、定量化標準がグループ２に示される。約５ｋｂで分離したバンドが、ｒＡＡＶ‐Ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ、およびｒＡＡＶ‐Ｃｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ‐Ｖ３から抽出されたゲノムにより観察される。しかしながら、ｒＡＡＶ‐Ｃｏｄｏｐ‐ｈｆＦＶＩＩＩ‐Ｎ６におけるゲノムは、より異種性のようである。 Ａ：血清型８カプシドの偽型ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ変異体の収率、Ｂ：ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ，（ＢＤＤ，グループ１）；ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩ，（Ｎ６，グループ２）；およびｃｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ‐Ｖ３（Ｖ３，グループ３）由来のＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩウイルス性ゲノムのアルカリゲル分析。高い質量ＤＮＡラダーがグループ１により示され、定量化標準がグループ２に示される。約５ｋｂで分離したバンドが、ＡＡＶ‐Ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ、およびＡＡＶ‐Ｃｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ‐Ｖ３から抽出されたゲノムにより観察される。しかしながら、ＡＡＶ‐Ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈｆＦＶＩＩＩにおけるゲノムは、より異種性のようである。 Ａ：血清型８カプシドの偽型ＡＡＶ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ構築物の単一の尾静脈投与後のネズミの血漿における、平均ｈＦＶＩＩＩレベル±ＳＥＭ（投与量＝４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、Ｎ＝６／グループ）。Ｂ：遺伝子導入後９週間で、肝臓に導入遺伝子の複製数について修正された２×１０^１３ｖｇ／ｋｇで形質導入されたマウスのｈＦＶＩＩＩ発現レベル。 ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩベクターの低（２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ，パネルＡ）または高用量（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ，パネルＢ）の単一の尾静脈投与後の、Ｆ８‐／‐マウスにおけるＦＶＩＩＩ活性レベル。 ビヒクル（Ｖ）単体または遺伝子組換え型ヒトＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）で治療されたノックアウトマウスと比較して、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ Ｎ６）、およびＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３（ＦＶＩＩＩ Ｖ３）の単一の尾静脈投与後のＦ８‐／‐マウスにおける失血。 抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ抗体反応。ＡおよびＢ：低および高用量のＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ（円）、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩ（四角）、およびＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３（三角）のそれぞれによる遺伝子導入後の、抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ抗体レベル。Ｃは、遺伝子組換え型ｈＦＶＩＩＩタンパク質の投与後の抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ抗体反応の比較のために示される。 ４×１０^１３ＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３の末梢静脈投与後のベクターの生体内分布。ゲノムＤＮＡのｑＰＣＲ分析の結果は、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩに対する特有のプライマーを用いて４ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８ベクターの尾静脈投与後９週間で示される器官から単離される。ＧＡＰＤＨプライマーを用いてロードおよび増幅効率における変化について修正された二倍体ゲノムあたりの導入遺伝子複製数±ＳＥが示される。

血友病Ａ（ＨＡ）、最も多い遺伝性の出血性疾患の治療のための安全で効率的な遺伝子導入ストラテジーの開発のために、発明者は、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３とよばれる新規なＦＶＩＩＩ変異体を開発した（図１）。この変異体は、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６とよばれる５０１３ｂｐのコドン最適化ＦＶＩＩＩを、これまでの変異体上に構築する。発明者は、その有効性をインビボで損なうことなく、ｒＡＡＶ内にパッケージされている、効率性を向上させるためにｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６をさらに変更した。

ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３におけるｃＤＮＡは、ＦＶＩＩＩの効率的な細胞プロセスに必要とされると考えられる６つのアスパラギン部分を含む、１７のアミノ酸が特有である３１のアミノ酸をコードする９３ｂｐのリンカーによる、６７８ｂｐのＢドメインスペーサー配列の置換を通じて、４４２４ｂｐ（図１）へとそのサイズを低減させるために変更された。

これらの６つのアスパラギン部分が接合されることが重要である。ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ１をコードするｒＡＡＶベクターは、１×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）／マウスの単一の尾静脈注入後のマウスのコホートにおいて、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３およびｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩｌｌ‐Ｎ６をそれぞれコードするベクターよりも１６倍および１０倍低いＦＶＩＩＩの発現を媒介した（図２）。この差は、非常に有意であった（ｐ＝０．００１５）。重要なことに、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３およびｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６の両方が、ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩよりも有意により高いレベルの発現を媒介した（図３）。

発明者のデータは、５．２ｋｂのｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３をコードするｒＡＡＶ発現カセットは、図４に示されるように、全長プロウイルスとして均一にパッケージされることを示す。これに対し、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６発現カセットのパッケージングは、異種性である。このことは、５．７ｋｂでＡＡＶのパッケージングのキャパシティを有意に超える、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６発現カセットのより大きなサイズに起因する。異種性のプロウイルス性のＤＮＡのパッケージングは、免疫応答を誘発し得る、ＦＶＩＩＩの切断型を合成および発現する可能性を理由に、安全性の懸念を生じさせる。

ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｎ６変異体のＢドメインを短くするが、Ｂドメイン配列、特にＮ結合グリコシル化コンセンサス配列の必須の特徴を保持することにより、発明者は、ＡＡＶへの導入遺伝子のより効率的なパッケージングを可能にすることができた。この目的で、新規な配列を作成する中で、１つの特定の配列Ｎ６Ｖ３が、ＡＡＶ内に非常に効率的なパッケージングに関連することを証明した。また、この配列は、動物性の遺伝子導入研究における導入遺伝子発現の注目すべきおよび予測されていないさらなる向上を示した。

第ＶＩＩＩ因子の構造の示性分析、およびシャペロンタンパク質ＬＭＡＮＮ‐１による相互作用に必要である、その既知の分泌経路に基づいて、発明者は、発現の向上が以下の理由に起因するものであるかもしれないことを推定した。

レクチンＬＭＡＮＮ‐１による第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの相互作用は、初期のグリコペプチドおよびレクチン間で結合するための特定のコンホメーションにそれらを適合させるために、存在する複数のＮ連結された炭水化物側鎖を必要とする。

野生型Ｂドメインは、二次構造がないようであるほぼ１０００のアミノ酸長である。よって、この非常に長いペプチドは、ゴルジ内への合成のためにかなりの時間、およびレクチン（ＬＭＡＮＮ‐１）に対して結合可能なコンホメーション内に広く分離された炭水化物側鎖を連結するために、確率的に適切な構造を取り入れるためのランダムコイルのためにさらなる時間を要する。

６つの見込みのあるＮ‐グリコシル化部位（１７ｍｅｒ）を保持したままにすることが可能な最小の長さに配列を短くすることにより、合成のために必要とされる時間は、大幅に減少する。

さらに、非常に小さな数のコンホメーションのみまたは見込みのあるただ１つが、レクチンを結合するために必要とされる三次構造である中で、グリコシル化されたペプチドにおいて生じ得る。発明者は、このペプチドの長さが、５３オングストロームでＢドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子の結晶構造におけるＡ３ドメインのＮ‐末端およびＡ２ドメインのＣ‐末端間の距離に及ぶのにちょうど十分なだけの長さであることを算出した。よって、Ｎ６Ｖ３ペプチドは、立体的に可能なコンホメーションの数を制限するであろう、ほぼ線形構造であることをさらに強いられ、炭水化物側鎖が適切な場所で添加されれば、実質的に、シャペロンが同時翻訳で結合することを可能にし、よって、第ＶＩＩＩ因子の特定の分泌経路におけるこの必須の工程を可能にする最大の範囲に最適化する。

新規なＮ６Ｖ３配列の特有の特異性は、各Ｎ‐グリコシル化コンセンサス配列の三量体間で、単一の余分なアミノ酸を保持するように、この配列からの非常にわずかなずれが、切断されたＢドメインの他のバージョンにより得たものと比較して、第ＶＩＩＩ因子の合成および分泌の効率性を大きく低減するという事実によってさらに支持される。

新規なより短いコドン最適化ＦＶＩＩＩ変異体：ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３
発明者は、インビボでのその有効性を損なうことなく全長ウイルスゲノムとして、ＡＡＶビリオン内にパッケージされる効率性を向上させるために、ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩを変更した。このことは、Ｂドメイン欠失のＦＶＩＩＩにおける１４のアミノ酸リンカー配列および特有である１７のアミノ酸を含む、３１のアミノ酸（９３ｂｐ）ペプチドによる、２２６のアミノ酸のＢドメインスペーサーの置換を伴った。このペプチドは、効率的な内部‐細胞プロセスのために必要とされる、ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩに存在する６つのアスパラギン残基を含んだ。当該ペプチドは、これらの残基をより近く近接する状態にする。結果として、この新たなｈＦＶＩＩＩ変異体（ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３）は、５．１Ｋｂのサイズであり、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩ（５．７ｋｂ）よりも６００ｂｐ小さく、約５．０ｋｂのＡＡＶのパッケージングキャパシティにより近い（図１）。ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ１は、ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩにおける２２６のアミノ酸スペーサーに代えて、同じ６つのアスパラギン残基を含む４４のアミノ酸ペプチドを含む。比較のために、他のＡＡＶベクター（ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ、約５．０ｋｂのサイズ）が、Ｂドメインが欠失されて、１４のアミノ酸の小さなリンカー配列を保持する、コドン最適化ｈＦＶＩＩＩのｃＤＮＡを含み、作成された。

スタンダードなＨＥＫ２９３の一時的なトランスフェクション方法を用いるＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３ベクターの収率は、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ＦＶＩＩＩおよびＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩのそれに対して同等であった（図５）。アルカリアガロースゲル上での分離後に、各ベクター調製物の２．５×１０^１０パーティクルから抽出されたウイルスのＤＮＡの分析は、約５ｋｂのバンド、ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩ（レーン１、図５Ｂ）およびＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３（レーン３）についての予想されるサイズを示した。比較において、より異種性のプロウイルスのスピーシーズのパッケージングを示唆する、ＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩから抽出されたゲノムについて、予想以上の拡散シグナルが観察された（図５Ｂ、レーン２）。

ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３は、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩよりも効能がある。
異なるコドン最適化ＦＶＩＩＩ変異体を含むＡＡＶベクター、血清型８のカプシドの偽型が、インビボでのそれらの有効性を比較するために、４×１０^１３ｖｇ／ｋｇの投与量で、４〜６週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６マウスの（Ｎ＝６）尾静脈内に、ボーラスとして注射された。最も高いレベルのｈＦＶＩＩＩ発現が、遺伝子導入後４週間で、１．５２＋０．１５ＩＵ／ｍｌ（正常の１５２±１５％、図６）でＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ‐Ｖ３により観察された。これに対し、ＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩおよびＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩは、０．８６＋０．１１および０．６７＋０．１２ＩＵ／ｍｌでそれぞれｈＦＶＩＩＩ発現を媒介した。マウスのＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩとＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３コホート間の血漿ＦＶＩＩＩレベルの差は、非常に有意であった（ｐ＝０．００１５、スチューデントｔ検定）。ｈＦＶＩＩＩ発現の最も低いレベルは、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ１（０．１０±０．０１ＩＵ／ｍｌ）により観察された。これは、マウスのＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３コホートにおけるＦＶＩＩＩ発現よりも有意に（ｐ＜０．０００１）低く、６つのアスパラギン残基が合成Ｂドメインアミノ酸ペプチドと連結されることが重要であることを示唆する。ベクター（２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）のより高い投与量の尾静脈投与は、９週間での肝臓における導入遺伝子の複製数（図６Ｂ）についての訂正後に、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩおよびＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩにより形質導入されたマウスのコホートにおいて達成されたレベルと比較した場合に、ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３により形質導入されたコホートにおいて血漿ｈＦＶＩＩＩの４〜３０倍の間のより高いレベルをもたらした。ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３とＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩとの間のｈＦＶＩＩＩレベルの差は、非常に有意であった（ｐ＝０．００６２、スチューデントｔ検定）。

Ｆ８‐／‐マウスにおけるＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３の生物学的な有効性
ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ＦＶＩＩＩ、ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ、およびｃｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ‐Ｖ３の生物学的な有効性の直接的な比較がＦ８‐／‐マウスで行われた。これらのＦＶＩＩＩ変異体、血清型８カプシドを有する偽型のそれぞれをコードするベクターが、４×１０^１２（低用量コホート、ｎ＝５／６）または４×１０^１３（高用量コホート，ｎ＝５／６）ｖｇ／ｋｇの投与量で、雄Ｆ８‐／‐マウスの尾静脈内に投与された。全ての３つの構築物について、発現の動態は、遺伝子導入後２〜６週間の間でピークレベルに達する血漿ｈＦＶＩＩＩレベルと広く類似していた。所与の構築物に関し、ｈＦＶＩＩＩレベルは、低用量と比較した場合に、高用量ベクターにより形質導入された動物においてざっと２倍高かった（図７）。ベクター投与量に関わらず、ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩにより形質導入されたマウスのコホートにおけるピークｈＦＶＩＩＩ発現は、ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩまたはｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩｌｌ‐Ｖ３により形質導入された動物において観察されるよりも約２倍低かった。高用量レベルでは、遺伝子導入後４〜８週間の、ｃｏｄｏｐ‐ＢＤＤ‐ｈＦＶＩＩＩコホートとｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３間のｈＦＶＩＩＩ発現の差は、非常に有意であった（ｐ＜０．００１ 両側ＡＮＯＶＡ）。ｈＦＶＩＩＩ抗原に対するｈＦＶＩＩＩ凝固活性（ｈＦＶＩＩＩ：Ｃ）の割合の平均の比は、わずかに１．０上回り、遺伝子導入したｈＦＶＩＩＩ分子が生物学的に活性化したことを示唆する。

ＦＶＩＩＩ活性がＡＡＶ治療マウスにおけるフェノタイプ修正に関連するかどうかを立証するために、失血が、遺伝子導入後８週間で、テイルクリップ（ｔａｉｌ ｃｌｉｐ）分析により分析された（図８）。ＡＡＶ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ注射マウスにおける失血の量は、３つのｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ変異体と２つの投与量レベルについてほぼ類似であったが、ＡＡＶに代えてビヒクルで治療されたＦＶＩＩＩ‐／‐マウスで観察されたよりも実質的に低かった。ＡＡＶとビヒクルで治療されたＦ８‐／‐マウス間のこの差は、非常に有意であった（ｐ＜０．００１ 片側ＡＮＯＶＡ試験）。ＡＡＶで治療された動物における失血の量は、ＦＶＩＩＩのｒＡＡＶ媒介発現が遺伝子組換え型ＦＶＩＩＩで観察されるレベルに止血を回復することを示唆する、遺伝子組換え型ヒトＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）で治療されたＦ８‐／‐マウスで観察されるものに対して同等であった。抗ｈＦＶＩＩＩ抗体が、高用量ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３コホートにおいて観察される最も高いレベルで、全てのＡＡＶ形質導入された動物において、時間の経過にわたって検出された。遺伝子組換え型ｈＦＶＩＩＩタンパク質の投与後に観察された反応に対して比較される場合に（６週間の間、１週間に２ＵのＦＶＩＩＩ）、ＡＡＶ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ形質導入された動物における反応は、少なくとも４００倍低く、テイルクリップ（ｔａｉｌ ｃｌｉｐ）分析により示されるＦＶＩＩＩ活性を完全に中和するために不十分であった（図９）。凝固のこの阻害による一貫性は、最も高い抗ＦＶＩＩＩ ＩｇＧレベルを有する２匹のネズミのサンプルがベセスダアッセイ法（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ａｓｓａｙ）で評価された場合には観察されず、これらの抗体が中和活性を有しないことを示唆した。

高感度のｑＰＣＲに基づく分析を用いる生体内分布研究（図１０）は、ＡＡＶ８‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ‐Ｖ３プロウイルスのＤＮＡが、遺伝子導入後８週でマウスの４×１０^１３ｖｇ／ｋｇコホートにおける５６±１５プロウイルスの複製／細胞の平均を有する肝臓で主にみられ、心臓における２．１±１複製／細胞、脾臓および腎臓における０．５±０．２複製／細胞、並びに肺における０．２±０．０．０５がそれに続いたことを示した。ＱＰＣＲの検出限界は、０．０００３複製／二倍体ゲノムである。

材料および方法
ＡＡＶ‐ｈＦＶＩＩＩベクター産生および精製：野生型ＤＮＡ配列を含む、ＢＤＤ欠失Ｎ６（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｓｔｅｖｅｎ Ｐｉｐｅ（Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ，２００４）により提供される）ヒトＦＶＩＩＩ変異体は、これまでに記載された肝臓に特異的なＬＰ１プロモーター（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ， ２００６）の下流でクローン化された。５０１２ｂｐのコドン最適化ヒトＮ６ ＦＶＩＩＩ（ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩ）は、高発現の真核生物遺伝子で最も頻繁にみられるコドンを用いて生成され、（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ，１９９６）、合成され、また、ＬＰ１プロモーターの下流でクローン化された。より小さなＨＬＰエンハンサー／プロモーターは、遠位のＸおよび近位のＡ＋Ｂ制御ドメインのみからなる変更された２１７ｂｐのアルファ‐１‐アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）遺伝子プロモーター上流のヒトアポリポタンパク質の肝臓制御領域（ＨＣＲ）由来の、３４ｂｐのコアエンハンサーを含む２５１ｂｐのフラグメントを合成することにより構築された。ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩは、ＨＬＰプロモーターの下流であるが、６０ｂｐ合成のポリアデニル化シグナルの上流である、ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ｈＦＶＩＩＩのｃＤＮＡをクローニングすることにより生成された。ＡＡＶ‐ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐ＦＶＩＩＩ変異体１および３は、それぞれ、１４８５および１４４６ｂｐのフラグメントの合成により作成された。ＨＬＰ‐ｃｏｄｏｐ‐Ｎ６‐ＦＶＩＩＩはＫｐｎＩにより切断され、２０２８ｂｐのフラグメントは、ＫｐｎＩにより切断された合成フラグメントにより置換された。ＡＡＶベクターは、以前に記載された（Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ，２００４）、アデノウイルスフリーの一時的なトランスフェクション方法により作成された。ＡＡＶ５偽型ベクターパーティクルは、ＸＸ２（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ，１９９８）およびｐＡＡＶ５‐２（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９９）に基づき、以前に記載された構成（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，２００２）と類似する、ｐＬＴ‐ＲＣＯ３とよばれるキメラＡＡＶ２ Ｒｅｐ‐５Ｃａｐパッケージングプラスミドを用いて生成された。また、ＡＡＶ８偽型ベクターは、パッケージングプラスミドｐＡＡＶ８‐２（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，２００２）を用いて作成された。ＡＡＶ２／５および２／８ベクターは、以前に記載されたイオン交換クロマトグラフィー方法（Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ，２００４）により精製された。ベクターゲノム（ｖｇ）の力価は、これまで記載された定量的ＰＣＲおよびゲルベースの方法（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，２００１）、（Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ，２０１２）により測定された。パッケージされたゲノムのサイズを測定するために、以前にＦａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ，２０１２に記載されたようなアルカリ性のゲル上にベクターのストックを流した。

動物の実験：全ての手順が、米国および欧州における動物のケアおよび使用のための産業および／または国家委員会により認可されたプロトコールに基づいて制度上のガイドラインに従って行われた。（エクソン１６に欠失を有するＣ５７Ｂ１６／Ｊ‐１２９ Ｓｖバックグラウンドと混合された）ＦＶＩＩＩ欠損マウスは、屋内で育てられ、８から１０週齢の間で実験に使用された。ｒＡＡＶベクターパーティクルの尾静脈投与は、以前に記載されたように（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，２００１）、７〜１０週齢の雄のマウスにおいて行われた。

形質導入の効率性とベクターの生体内分布の測定：
ヒトＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡ：ネズミのサンプルにおけるヒトのＦＶＩＩＩ抗原レベルは、ペアのＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｉｏｇｉｃａｌｓ，Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ，Ｄｏｒｋｉｎｇ，ＵＫ）を用いて、ＥＬＩＳＡにより測定された。平底の９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）は、５０ｍＭカーボネート緩衝液中に、５０μｌの１００μｇ／ｍＬの２つのマウスのモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎｃａｌ）抗体（ＥＳＨ２（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ａｘｉｓ‐Ｓｈｉｅｌｄ，Ｄｕｎｄｅｅ，ＵＫ）、およびＮ７７１１０Ｍ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＡＭＳ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ））の組み合わせにより、ｐＨ９．６、４℃で一晩コートされ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（＝ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄され、３７℃で１時間のインキュベーションの間に２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴにおける６％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌ，ＵＫ）でブロックされた。スタンダードは、開始濃度４ＩＵ／ｍＬ（１１^ｔｈＢＳ ９５／６０８ ６．９ＩＵ／ｍＬ，ＮＩＢＳＣ，Ｓｏｕｔｈ Ｍｉｍｍｓ）の遺伝子組換え型ヒトＦＶＩＩＩを添加されたネズミの血漿の段階希釈により作成された。ネズミのサンプルおよびスタンダードは、二重に５０μｌのキット緩衝液で１：１０に希釈された。３７℃での２時間のインキュベーション後に、プレートは洗浄され、１００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗‐ヒトＦＶＩＩＩポリクローナル二次抗体によりさらに１時間インキュベートされた。最終的な洗浄工程後に、プレートは、ｏ‐フェニレンジアミンジヒドロクロリドペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ）により発展され、４９２ｎｍで光学密度が分光光度的に評価された。実験グループ間の統計的有意差の確率が、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍバージョン４．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、１ウェイＡＮＯＶＡおよびペアスチューデントｔ検定により測定された。ＦＶＩＩＩ活性が、ヒト血漿をスタンダードとして用い、二段凝固分析で測定された。

失血分析：マウスはトリブロモエタノール（０．１５ｍＬ／１０ｇ体重）で麻酔され、遠位の尾の３ｍｍがメスで切断された。尾は、すぐに３７℃の５０ｍｌ生理食塩水の緩衝液に浸され、３０分間血液が収集された。２つのパラメーターがモニタリングされた：１つ目は、切断の瞬間から出血の停止までの時間が測定された。２つ目は、収集された赤血球を１５００ｇでペレットにし、水で溶解した。放出されたヘモグロビンの量は、４１６ｎｍで光学密度を計測し、マウスの血液の２０〜１００マイクロリットルの溶解で調製されたスタンダードカーブを用いることにより測定された。

ベクター複製数の定量：ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を用いてネズミの組織から抽出され、種々のネズミの組織から抽出された３７ｎｇのゲノムＤＮＡは、以前記載したように（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１１）、ｃｏｄｏｐ‐ｈＦＶＩＩＩ（５’プライマー：５’ＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧ３’および３’プライマー：５’ＧＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧ３’）の２９９ｂｐ領域を増幅したプライマーを用いる定量的なリアルタイムＰＣＲに供された。

抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体の検出：マウスからの血漿サンプルは、ＥＬＩＳＡを用いてｈＦＶＩＩＩに対する抗体の存在についてスクリーニングされた。９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）が、５０ｍカーボネート緩衝液における２ＩＵ／ｍＬ遺伝子組換え型ＦＶＩＩＩ ５０μｌにより、ｐＨ９．６、４℃で一晩コートした。プレートはＰＢＳ‐Ｔで洗浄され、３％ＢＳＡ／ＴＢＳ‐Ｔ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ，ｐＨ７．５）でブロックされた。血漿サンプルの段階希釈の５０μｌが３％ＢＳＡ／ＴＢＳ‐Ｔで調製された。３７℃で２時間のインキュベーション後に、プレートは洗浄され、１００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ａ８９２４，Ｓｉｇｍａ）により、さらに１時間インキュベートされた。最終的な洗浄工程後に、プレートは、ｏ‐フェニレンジアミンジヒドロクロリドペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ）により発展され、４９２ｎｍで光学密度が分光光度的に評価された。結果は、５回の平均吸光バックグラウンド値に等しい吸光値で補間された希釈の逆数として定義される、エンドポイント力価として表された。

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ， Ｇｉｓｈ ｗ， Ｍｉｌｌｅｒ ｗ， Ｍｙｅｒｓ ＥＷ， Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ． （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２１５， ４０３− １０．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ， Ｍａｄｄｅｎ ＴＬ， Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＡＡ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｍｉｌｌｅｒ ｗ， Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２５， ３３８９−４０２
Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ Ｕ， Ｄｅｌｉｕｓ Ｈ， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｒ， ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ Ｈ． （１９９９） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７３， ９３９−４７
Ｃｅｒｕｌｌｏ Ｖ， Ｓｅｉｌｅｒ ＭＰ， Ｍａｎｅ Ｖ， Ｃｅｌａ Ｒ ， Ｃｌａｒｋｅ Ｃ ， ＫａｕｆｍａｎＲＪ， Ｐｉｐｅ ＳＷ， Ｌｅｅ Ｂ． （２００７） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ， １５， ２０８０−２０８７．
Ｃｈａｏ Ｈ， Ｓｕｎ Ｌ ， Ｂｒｕｃｅ Ａ， Ｘｉａｏ Ｘ， Ｗａｌｓｈ ＣＥ． （２００２） ＭｏｌＴｈｅｒ， ５， ７１６−７２２．
Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｓａｆｅｒ Ｂ， Ｋｏｔｉｎ ＲＭ． （１９９７） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７１， ６８２３−３３
Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ， Ｋｉｍ Ｆ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｋｏｔｉｎ ＲＭ． （１９９９） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７３， １３０９−１９
Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｌｕ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｓａｒｋａｒ Ｒ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｈｉｇｈ ＫＡ， Ｘｉａｏ ｗ． （２００９） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ， １７， ４１７−４２４．
Ｄａｖｉｄｏｆｆ ＡＭ， Ｎｇ ＣＹ， Ｓｌｅｅｐ Ｓ， Ｇｒａｙ Ｊ， Ａｚａｍ Ｓ， Ｚｈａｏ Ｙ， Ｍｃｉｎｔｏｓｈ ＪＨ， Ｋａｒｉｍｉｐｏｏｒ Ｍ， Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ． （２００４） Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２， ２０９−１５．
Ｆａｇｏｎｅ Ｐ， Ｗｒｉｇｈｔ ＪＦ， Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ， Ｎｉｅｎｈｕｉｓ ＡＷ， Ｄａｖｉｄｏｆｆ ＡＭ， Ｇｒａｙ ＪＴ． （２０１２） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３， １−７．
Ｇａｏ ＧＰ， Ａｌｖｉｒａ ＭＲ， Ｗａｎｇ Ｌ， Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ， Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ． （２００２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９９， １１８５４−９
Ｈａａｓ Ｊ， Ｐａｒｋ ＥＣ， Ｓｅｅｄ Ｂ． （１９９６） Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ， ６， ３１５−２４．
Ｊｉａｎｇ Ｈ， Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ， Ｏｚｅｉｏ ＭＣ， ｄｅ Ｐａｕｌａ ＥＶ， Ｖａｒｇａｓ ＪＡ， Ｓｍｉｔｈ Ｐ， Ｓｏｍｍｅｒ Ｊ， Ｌｕｋ Ａ， Ｍａｎｎｏ ＣＳ， Ｈｉｇｈ ＫＡ， Ａｒｒｕｄａ ＶＲ． （２００６） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １４， ４５２−４５５．
Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ， Ｐｉｐｅ ＳＷ， Ｔａｇｌｉａｖａｃｃａ Ｌ， Ｓｗａｒｏｏｐ Ｍ， Ｍｏｕｓｓａｌｌｉ Ｍ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｈｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， ８ Ｓｕｐｐｌ ２， Ｓ３− １４．
Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｊ．Ｄ．， Ｍｉａｏ，Ｈ．， Ｚｈａｎｇ，Ｋ．， Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ａ．， Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ．Ｓ．， Ｐｉｐｅ，Ｓ．ｗ．， ＆ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ， １０５， １８５２５−１８５３０．
Ｍｉａｏ ＣＨ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＲ， Ｌｏｅｂ Ｋ， Ｙｅ Ｘ． （２０００） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３， ９４７−５７．
Ｍｉａｏ ＨＺ， Ｓｉｒａｃｈａｉｎａｎ Ｎ， Ｐａｌｍｅｒ Ｌ， Ｋｕｃａｂ Ｐ， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＭＡ， Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ， Ｐｉｐｅ ＳＷ．（２００４） Ｂｌｏｏｄ， １０３， ３４１２−３４１９．
Ｍｕｙｉｄｅｒｍａｎｓ Ｓ． （２００１） Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ７４， ２７７−３０２
Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ， Ｄａｖｉｄｏｆｆ Ａ， Ｈａｎａｗａ Ｈ， Ｚｈｏｕ ＪＦ， Ｖａｎｉｎ ＥＦ， Ｎｉｅｎｈｕｉｓ Ａｗ． （２００１） Ｂｌｏｏｄ， ９７， １２５８−６５．
Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ， Ｇｒａｙ ＪＴ， Ｎｇ ＣＹ， Ｚｈｏｕ Ｊ， Ｓｐｅｎｃｅ Ｙ， Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ ＳＮ， Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ ＥＧ， Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ Ｇ， ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊ， Ｂｏｏｎ−Ｓｐｉｊｋｅｒ Ｍ， Ｍｅｒｔｅｎｓ Ｋ， Ｄａｖｉｄｏｆｆ ＡＭ． （２００６） Ｂｌｏｏｄ， １０７， ２６５３−６１．
Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ， Ｒｅｓａｌｅｓ Ｃ， Ｍｃｉｎｔｏｓｈ Ｊ， Ｒａｓｔｅｇａｒｌａｒｉ Ｇ， Ｎａｔｈｗａｎｉ Ｄ， Ｒａｊ Ｄ， Ｎａｗａｔｈｅ Ｓ， Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ ＳＮ， Ｂｒｏｎｓｏｎ Ｒ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｓ， Ｄｏｎａｈｕｅ ＲＥ， Ｈｉｇｈ ＫＡ， Ｍｉｎｇｏｚｚｉ Ｆ， ＮｇＣＹ， Ｚｈｏｕ Ｊ， Ｓｐｅｎｃｅ Ｙ， ＭｃＣａｒｖｉｌｌｅ ＭＢ， Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ Ｍ， Ａｌｌａｙ Ｊ， Ｃｏｌｅｍａｎ Ｊ， Ｓｌｅｅｐ Ｓ， Ｇｒａｙ ＪＴ， Ｎｉｅｎｈｕｉｓ Ａｗ， Ｄａｖｉｄｏｆｆ ＡＭ． （２０１１） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １９， ８７６−８５．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＳＢ， Ｗｕｎｓｃｈ ＣＤ． （１９７０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，４８， ４４３−５３．
Ｏｋｕｙａｍａ Ｔ， Ｈｕｂｅｒ ＲＭ， Ｂｏｗｌｉｎｇ ｗ， Ｐｅａｒｌｉｎｅ Ｒ， Ｋｅｎｎｅｄｙ ＳＣ， Ｆｌｙｅ ＭＷ， Ｐｏｎｄｅｒ ＫＰ．（１９９６） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ， ７， ６３７−４５．
Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ， Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｆ， Ｌｉ Ｃ， Ｃｏｎｒａｔｈ Ｈ， Ｘｉａｏ ｗ， Ｘｉａｏ Ｘ， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ． （２００２） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７６， ７９１ −８０１．
Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ＥＡ， Ｈａｌｂｅｒｔ ＣＬ， Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄｗ． （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７２， ３０９−１９．
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ， Ｌｕｓｂｙ ＥＷ， Ｂｅｒｎｓ ＫＩ． （１９８３） ／ Ｖｉｒｏｌ， ４５， ５５５−６４．
Ｗａｎｇ Ｌ， Ｔａｋａｂｅ Ｋ， Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ ＳＭ， Ｉｌｌ ＣＲ， Ｖｅｒｍａ ＩＭ． （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９６， ３９０６−１０．
Ｗｕ Ｐ， Ｘｉａｏ ｗ， Ｃｏｎｌｏｎ Ｔ， Ｈｕｇｈｅｓ Ｊ， Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ， Ｆｅｒｋｏｌ Ｔ， Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ， Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ． （２０００） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７４， ８６３５−４７．
Ｘｉａｏ Ｘ， Ｌｉ Ｊ， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ． （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７２， ２２２４−３２．

Claims (21)

1. 機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
   前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質のＢドメインスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、３７アミノ酸以下の長さである、核酸分子。
2. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１の核酸分子。
3. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーは、配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項１または２の核酸分子。
4. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーが３０から３７アミノ酸の間の長さである、請求項１または２の核酸分子。
5. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーが３１アミノ酸の長さである、請求項１または２の核酸分子。
6. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーが、配列番号１を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１または２の核酸分子。
7. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーが、配列番号２を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１または２の核酸分子。
8. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質の前記Ｂドメインスペーサーが、配列番号２からなるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１または２の核酸分子。
9. 配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１または２の核酸分子。
10. 配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１または２の核酸分子。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
12. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
13. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
14. 請求項１３の宿主細胞により発現される第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
15. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項１２のベクターを含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
16. 請求項１〜１０のいずれか１項の核酸分子を含む、パルボウイルス遺伝子送達ベクター。
17. 請求項１２に記載のベクター、請求項１４に記載のタンパク質、または請求項１６に記載のパルボウイルス遺伝子送達ベクターを含む、血友病を治療するための組成物。
18. 治療における使用のための組成物であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１４に記載のタンパク質、または請求項１６に記載のパルボウイルス遺伝子送達ベクターを含む、組成物。
19. 血友病の治療における使用のための組成物であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１４に記載のタンパク質、または請求項１６に記載のパルボウイルス遺伝子送達ベクターを含む、組成物。
20. 対象への機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質の送達のための組成物であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、または請求項１６に記載のパルボウイルス遺伝子送達ベクターを含む、組成物。
21. パルボウイルス遺伝子送達ベクターの調製の方法であって、
    （ａ）（ｉ）少なくとも１つのパルボウイルスの逆位末端反復ヌクレオチド配列により隣接される、請求項１〜１０のいずれか１つの核酸分子；
    （ｉｉ）昆虫細胞におけるＲｅｐタンパク質の発現を駆動することが可能であるプロモーターに操作可能に連結される、１つまたはそれ以上のパルボウイルスのＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット；
    （ｉｉｉ）前記昆虫細胞におけるカプシドタンパク質の発現を駆動することが可能であるプロモーターに操作可能に連結される、１つまたはそれ以上のパルボウイルスの前記カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセット；
    を含む、１つまたはそれ以上の核酸構築物を含む前記昆虫細胞を提供し、
    （ｂ）Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質の発現に対して助けになる条件下で、（ａ）において定義される前記昆虫細胞を培養し、
    （ｃ）前記パルボウイルス遺伝子送達ベクターを回収する工程を含む、方法。