ES2640586T3

ES2640586T3 - Secuencias del factor VIII

Info

Publication number: ES2640586T3
Application number: ES13728823.9T
Authority: ES
Inventors: Amit Nathwani; Jenny MCINTOSH; Edward Tuddenham; Andrew Davidoff
Original assignee: UCL Business Ltd; St Jude Childrens Research Hospital
Current assignee: UCL Business Ltd; St Jude Childrens Research Hospital
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2033-06-12
Also published as: US20250108093A1; CA2875449A1; US20170049859A1; WO2013186563A3; WO2013186563A2; JP2015521465A; US11419920B2; US9447168B2; US10124041B2; EP2859016A2; US10792336B2; US20150158930A1; US20200390866A1; AU2013276247B2; GB201210357D0; JP6473416B2; EP2859016B1; US20230241180A1; AU2013276247A1; US20180311317A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de factor VIII funcional, en donde la parte de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio B de la proteína de factor VIII está comprendida entre 90 y 111 nucleótidos de longitud y codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 y que comprende seis restos de asparagina.

Description

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(iii) un segundo casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de la cápsida parvovirales que está unida operativamente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la proteína o proteínas de la cápsida en la célula de insecto;

(b): cultivar la célula de insecto definida en (a) en condiciones que conducen a la expresión de las proteínas Rep y de la cápsida; y, opcionalmente,

(c): recuperar el vector parvoviral de liberación de genes.

En general, por lo tanto, el método de la invención permite la producción de un vector parvoviral de liberación de genes (que comprende un ácido nucleico de la invención) en una célula de insecto. Preferentemente, el método comprende las etapas de: (a) cultivar una célula de insecto como se ha definido anteriormente en condiciones tales que se produzca el vector parvoviral (por ejemplo, AAV); y, (b) recuperar el vector parvoviral (por ejemplo, AAV) recombinante. Preferentemente, el vector parvoviral de liberación de genes es un vector de liberación de genes AAV.

En el presente documento se entiende que, el vector (AAV) producido en dicho método, preferentemente, es un virión infeccioso parvoviral o de AAV que comprende un genoma parvoviral, que por sí mismo comprende un ácido nucleico de la invención. Las condiciones de crecimiento para las células de insecto en cultivo y la producción de productos heterólogos en células de insecto son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las referencias citadas anteriormente sobre ingeniería genética molecular de células de insecto.

En un método de la invención, se proporciona un ácido nucleico de la invención que está flanqueado por al menos una secuencia de ITR parvoviral. Este tipo de secuencia se ha descrito con detalle anteriormente. Preferentemente, el ácido nucleico de la invención es la secuencia localizada entre dos secuencias de ITR parvovirales.

El primer casete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas Rep parvovirales que están unidas operativamente a un primer promotor que es capaz de dirigir la expresión de la proteína o proteínas Rep en la célula de insecto.

En el presente documento, una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep de parvovirus animales se entiende como una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas Rep no estructurales que son necesarias y suficientes para la producción del vector parvoviral en células de insecto tales como las proteínas Rep78 y Rep52, o las proteínas Rep68 y Rep40, o la combinación de dos o más de las mismas.

La secuencia de nucleótidos de parvovirus animal preferentemente procede de un dependovirus, más preferentemente de un virus adenoasociado (AAV) humano o de simio y, aún más preferentemente, de un AAV que normalmente infecta a seres humanos (por ejemplo, los serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o a primates (por ejemplo, los serotipos 1 y 4). Los expertos en la materia conocen secuencias codificantes de Rep y se mencionan y describen con detalle secuencias adecuadas en el documento WO2007/148971 y también en el documento WO2009/014445.

Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica proteínas Rep de parvovirus animales que son necesarias y suficientes para la producción de vectores parvovirales en células de insecto.

El segundo casete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de la cápsida parvovirales que está unida operativamente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la proteína o proteínas de la cápsida en la célula de insecto. La proteína o proteínas de la cápsida expresadas pueden ser una o más de las descritas anteriormente.

Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica proteínas cap de parvovirus animales que son necesarias y suficientes para la producción de vectores parvovirales en células de insecto.

Estas tres secuencias (genoma, que codifica rep y que codifica cap) se proporcionan en una célula de insecto por medio de uno o más constructos de ácido nucleico, por ejemplo, uno, dos o tres constructos de ácido nucleico. Entonces, preferentemente, dichos uno o más constructos de ácido nucleico para el genoma del vector y la expresión de las proteínas Rep y cap parvovirales en células de insecto es un vector compatible con células de insecto. Se entiende que un "vector compatible con células de insecto" o "vector" es una molécula de ácido nucleico capaz de transformar o transfectar de forma productiva un insecto o una célula de insecto. Los vectores biológicos ejemplares incluyen plásmidos, moléculas de ácido nucleico lineales y virus recombinantes. Puede emplearse cualquier vector, siempre que sea compatible con las células de insecto. El vector puede integrarse en el genoma de las células de insecto, pero no es necesario que sea permanente la presencia del vector en la célula de insecto y también se incluyen vectores episomales. Los vectores pueden introducirse por cualquier medio conocido, por ejemplo, por tratamiento químico de las células, electroporación o infección. En una realización preferida, el vector es un baculovirus, un vector viral o un plásmido. En una realización más preferida, el vector es un baculovirus, es decir, el constructo es un vector baculoviral. Los expertos en la materia conocen bien vectores baculovirales y métodos para su uso.

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cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención.

Las composiciones farmacéuticas típicamente son estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma de una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para acomodar altas concentraciones de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivo. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina. Un ácido nucleico o vector de la invención puede administrarse en un momento o en una formulación de liberación controlada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta u otros vehículos que protejan al compuesto frente a la liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Por ejemplo, pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros poliglicólicos (PLG) polilácticos.

El vector parvoviral, por ejemplo, AAV, de la invención puede utilizarse para transferir material genético a una célula. Dicha transferencia puede tener lugar in vitro, ex vivo o in vivo.

Por consiguiente, la invención proporciona un método para liberar una secuencia de nucleótidos a una célula, comprendiendo dicho método poner en contacto un ácido nucleico, un vector o una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento, en condiciones tales que el ácido nucleico o vector de la invención entre en la célula. La célula puede ser una célula in vitro, ex vivo o in vivo.

La invención también proporciona un método para tratar la hemofilia, que comprende administrar una cantidad eficaz de un ácido nucleico, una proteína o un vector de acuerdo con la invención, a un paciente que padece hemofilia. Preferentemente, el paciente padece hemofilia A. Preferentemente, el paciente es humano.

Cuando en el método anterior se "trata" la hemofilia, por ejemplo, la hemofilia A, esto significa que se mejoran uno o más síntomas de la hemofilia. No significa que se eliminen completamente los síntomas de la hemofilia de manera que ya no se presenten nunca más en el paciente, aunque en algunos métodos, esto puede ocurrir. El método de tratamiento tiene como resultado que uno o más de los síntomas de la hemofilia, por ejemplo, hemofilia A, sean menos graves que antes del tratamiento.

Además, la invención también proporciona un método para liberar o administrar una secuencia de nucleótidos a un sujeto, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto un ácido nucleico, un vector o una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento. En particular, la presente invención proporciona un método para administrar una molécula de ácido nucleico de la invención a un sujeto, que comprende administrar al sujeto un vector parvoviral de terapia génica de acuerdo con la invención, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el vector parvoviral de terapia génica se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto que lo necesita. Es decir, la administración de acuerdo con la invención típicamente se realiza en condiciones que den como resultado la expresión del factor VIII funcional a un nivel que proporcione un efecto terapéutico en un sujeto que lo necesita.

La liberación de un ácido nucleico o vector de la invención en una célula hospedadora in vivo puede dar como resultado un aumento de factor VIII funcional en el hospedador, por ejemplo, a un nivel que mejore uno o más síntomas de un trastorno de la coagulación sanguínea tal como la hemofilia A.

El nivel de factor VIII natural en un sujeto que padece hemofilia A varía dependiendo de la gravedad de la hemofilia. Los pacientes con una forma severa de la enfermedad tienen niveles de factor VIII menores de aproximadamente un 1 % del nivel encontrado en un sujeto sano normal (denominado en el presente documento "un nivel normal". Un nivel normal es de aproximadamente 50-150 UI/dl). Los pacientes con una forma moderada de la enfermedad tienen niveles de factor VIII comprendidos entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 % de un nivel normal. Los pacientes con una forma leve de la enfermedad tienen niveles de factor VIII mayores de aproximadamente un 5 % de un nivel normal; típicamente entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 30 % de un nivel normal.

Se ha descubierto que, cuando se usa el método de tratamiento de la presente invención, puede provocar un aumento en el nivel de factor VIII funcional de al menos aproximadamente un 1 % de los niveles normales, es decir, además del nivel del factor VIII presente en el sujeto antes del tratamiento. En un sujeto que padece hemofilia A, dicho aumento puede causar una mejoría de un síntoma de la hemofilia. En particular, un aumento de al menos un 1 % puede reducir la frecuencia de las hemorragias que se producen en pacientes de hemofilia A, especialmente en los que tienen una forma severa de la enfermedad. En una realización, el método de tratamiento provoca un

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banda discreta a ~5 kb con el genoma extraído de rAAV-Codop-BDD-hFVIII y rAAV-Codop-FVIII-V3. Sin embargo, el genoma en rAAV-Codop-hfFVIII-N6 parece ser más heterogéneo.

Figura 5. A: Rendimiento de variantes de AAV-HLP-codop-hFVIII seudotipificadas con la cápsida del serotipo 8

B: análisis en gel alcalino del genoma viral AAV-HLP-codop-hFVIII derivado de: codop-BDD-hFVIII, (BDD, grupo 1); codop-N6-hFVIII, (N6, grupo 2); y codop-FVIII-V3 (V3, grupo 3). Se muestra el marcador High Mass DNA Ladder por el grupo 1 y el patrón de cuantificación por el grupo 2. Se observa una banda discreta a ~5 kb con el genoma extraído de AAV-codop-BDD-hFVIII y AAV-codop-FVIII-V3. Sin embargo, el genoma en AAV-codop-N6hfFVIII parece ser más heterogéneo.

Figura 6. A: Niveles medios de hFVIII ± SEM en plasma murino después de una sola administración en la vena de la cola de constructos de AAV-codop-hFVIII seudotipificados con la cápsida del serotipo 8 (dosis = 4x1012 gv/ratón, N = 6/grupo). B: niveles de expresión de hFVIII en ratones transducidos con 2x1013 gv/kg corregidos con respecto al número de copias de transgenes en el hígado 9 semanas después de la transferencia génica.

Figura 7. Nivel de actividad de FVIII en ratones F8-/- después de una sola administración en la vena de la cola de una dosis baja (2x1013 gv/kg, Panel A) o alta (2x1014 gv/kg, Panel B) de vectores de AAV-HLP-codop-hFVIII.

Figura 8. Pérdida de sangre en ratones F8-/-después de una sola administración en la vena de la cola de AAV-HLP-codop-BDD-hFVIII (BDD), AAV-HLP-codop-N6-hFVIII (FVIII N6) y AAV-HLP-codop-hFVIII-V3 (FVIII V3) en comparación con ratones knockout tratados con vehículo (V) solo o FVIII humano recombinante (rFVIII).

Figura 9. Respuesta de anticuerpo IgG anti-hFVIII. A y B: Nivel de anticuerpo IgG anti-hFVIII después de la transferencia génica con dosis bajas y altas de AAV-HLP-codop-BDD-hFVIII (círculos), AAV-HLP-codop-N6hFVIII (cuadrados) y AAV-HLP-codop-hFVIII-V3 (triángulos) respectivamente. C. Para comparación, se muestra la respuesta de anticuerpo IgG anti-hFVIII después de la administración de proteína hFVIII recombinante.

Figura 10. Biodistribución del vector después de la administración en la vena periférica de 4x1013AAV8-HLP-codop-hFVIII-V3. Resultados del análisis qPCR de ADN genómico, aislado de los órganos indicados 9 semanas después de la administración en la vena de la cola de 4x1013 gv/kg de vector de AAV8 usando cebadores especiales para codop-hFVIII. Se muestra el número de copias de transgenes por genoma diploide ± SE corregido con respecto a la variación en la carga y la eficacia de amplificación usando cebadores de GAPDH.

Descripción detallada de la invención

Para desarrollar una estrategia de transferencia génica segura y eficaz para el tratamiento de la hemofilia A (HA), el trastorno hemorrágico hereditario más común, los inventores han desarrollado una nueva variante de FVIII denominada codop-hFVIII-V3 (Figura 1). Esta variante se construye sobre una variante previa, un FVIII de 5013 pb con codones optimizados denominado codop-hFVIII-N6. Los inventores han modificado adicionalmente codop-hFVIII-N6 para mejorar la eficacia con la que se empaqueta en rAAV sin comprometer su potencia in vivo.

El ADNc de codop-hFVIII-V3 se ha modificado para reducir su tamaño a 4424 pb (Figura 1) mediante el reemplazo de la secuencia espaciadora del dominio B de 678 pb por un enlazador de 93 pb que codifica 31 aminoácidos de los que 17 aminoácidos son especiales, incluyendo los 6 restos de asparagina que se cree que son necesarios para el procesamiento celular eficaz de FVIII.

Es importante es contexto en el que se juntan estos 6 restos de asparagina. Vectores de rAAV que codifican la expresión de FVIII mediada por codop-hFVIII-V1 que eran 16 y 10 veces menores que los vectores que codifican codop-hFVIII-V3 y codop-hFVIII-N6, respectivamente, en cohortes de ratones después de una sola inyección en la vena de la cola de 1x1011 genomas de vector (gv)/ratón (Figura 2). Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,0015). De manera importante, tanto codop-hFVIII-V3 como codop-hFVIII-N6 mediaban un nivel de expresión significativamente mayor que codop-BDD-hFVIII (Figura 3).

Los datos de los inventores muestran que un casete de expresión de rAAV que codifica el codop-hFVIII-V3 de 5,2 kb se empaqueta uniformemente como un provirus de longitud completa como se muestra en la Figura 4. Por otro lado, el empaquetamiento del casete de expresión de codop-hFVIII-N6 es heterogéneo. Esto se debe al mayor tamaño del casete de expresión de codop-hFVIII-N6, que a 5,7 kb excede significativamente la capacidad de empaquetamiento de los AAV. El empaquetamiento de ADN proviral heterogéneo suscita cuestiones de seguridad debido a la posibilidad de sintetizar y expresar formas truncadas de FVIII, lo cual podría provocar una respuesta inmunológica.

Mediante el acortamiento del dominio B de la variante de codop-hFVIII-N6 pero reteniendo las características esenciales de la secuencia del dominio B, en particular, las secuencias consenso de N-glicosilación, los inventores han podido permitir un empaquetamiento más eficaz del transgén dentro de AAV. En el transcurso de la creación de nuevas secuencias para este fin, una secuencia particular, N6V3, resultó estar asociada con un empaquetamiento muy eficaz en AAV. Esta secuencia también demostró una mejora adicional destacable y no prevista de expresión transgénica en estudios animales de transferencia génica.

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