JP2021087431A - 修飾された第ix因子、並びに、細胞、器官及び組織への遺伝子導入のための組成物、方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
この特許出願は、2015年6月23日に提出された米国特許出願第62/183,599号、2016年3月30日に提出された米国特許出願第62/315,453号、2016年5月18日に提出された米国特許出願第62/338,315号、2016年6月10日に提出された米国特許出願第62/348,781号、及び、2016年6月13日に提出された米国特許出願第62/349,572号の利益を主張する。これらの全出願の全体が参照よりに明示的に本明細書に組み込まれる。
イントロダクション
細胞をターゲットとするレンチウイルスベクター及びパーボウイルスベクター(例えば、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター)を含む。核酸配列送達のためのベクターとして、AAVベクターは、細胞中でポリヌクレオチドを発現させる。第IX因子をコードする修飾された核酸等のような、タンパクをコードするポリヌクレオチドは、投与した後に、任意に治療レベルで発現されることができる。
ヒトα1−抗トリプシン(hAAT)プロモーター、及び/又は、アポリポタンパクE(
ApoE)HCR−1、及び/又は、HCR−2エンハンサー等の肝臓発現のためのもの))、1つ以上のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)(例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74又はAAV−2i8のAAV血清型のいずれかのITR配列)、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列を含むことができる。そのようなさらなる因子の位置は変わってもよい。特別な態様において、イントロンは、ヒトFIXタンパクをコードする配列中に存在し、及び/又は、発現制御因子は、ヒトFIXタンパクをコードする配列に作用可能に連結され、及び/又は、AAV ITRは、ヒトFIXタンパクをコードする配列の5’又は3’に隣接し、及び/又は、前記フィラーポリヌクレオチド配列の末端は、ヒトFIXタンパクをコードする配列の5’末端又は3’末端に隣接する。
poE)HCR−1、及び/又は、HCR−2エンハンサー等の肝臓発現のためのもの))、1又はそれ以上のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)(例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74又はAAV−2i8のAAV血清型のいずれかのITR配列)、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、同等の天然又は野生型の発現制御因子、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列と比較して、CpG(シトシン・グアニン)ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されていてもよい。特別な態様において、発現制御因子、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、天然又は野生型の同等配列より、1〜5個少ない、5〜10個少ない、10〜15個少ない、15〜20個少ない、20〜25個少ない、25〜30個少ない、30〜40個少ない、40−55個少ない、55−75個少ない、75−100個少ない、100−150個少ない、150−200個少ないCpGジヌクレオチドを有する。
子コード核酸配列のそれぞれの5’及び/又は3’の末端に隣接する5’及び/又は3’のITRの内部に配置されている。さらなる態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチドの数が減少したFIXのような第IX因子コード核酸配列のそれぞれの5’及び/又は3’末端に隣接する5’及び/又は3’のITRに隣接して配置されている。さらなる一態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチドの数が減少したFIXのような第IX因子をコードする修飾された(例えば、ゲノム核酸内のイントロンと類似した)核酸の内部に配置されている。
データを示す。
X因子をコードする天然(野生型)の配列より5〜10個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、ヒト第IX因子をコードする天然(野生型)の配列より10〜15個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、ヒト第IX因子をコードする天然(野生型)の配列より15〜20個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、ヒト第IX因子をコードする天然(野生型)の配列より20〜25個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、ヒト第IX因子をコードする天然(野生型)の配列より25〜30個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、ヒト第IX因子をコードする天然(野生型)の配列より30〜40個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、ヒト第IX因子をコードする天然(野生型)の配列より40〜55個少ないCpGジヌクレオチドを有し;又は、あらゆるCpGジヌクレオチドが完全に欠けている。
る。
体が見つからなかったことを意味する。より多くの天然ウイルス分離株が発見され、及び/又は、より多くのキャプシド変異体が生成されても、現在存在する血清型のいずれかと血清学的な違いがあってもよいし、なくてもよい。従って、新しいウイルス(例えば、AAV)が血清学的な違いを有しない場合、この新しいウイルス(例えば、AAV)は対応する血清型のサブグループ又は変異体であろう。多くの場合、キャプシド配列修飾を有する変異ウイルスに対しては、それらが血清型の従来の定義に従って別の血清型のものであるかを判断するための、中和活性に関する血清学的試験がまだおこなわれていない。従って、便宜のために、また、繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に区別されるウイルス(例えば、AAV)及び血清学的に区別されないウイルス(例えば、AAV)であって、所定の血清型のサブグループ又は変異体に属することができるものの両方を広く表す。
DNA、並びに、スプライシングされた若しくはスプライシングされていないmRNA、rRNA、tRNA、及び、阻害性のDNA若しくはRNA(RNAi、例えば、小さい又は短いヘアピン(sh)RNA、マイクロRNA(miRNA)、小さい又は短い干渉(si)RNA、トランススプライシングRNA、又は、アンチセンスRNA)を含む。ポリヌクレオチドは、天然の、合成の、及び、意図的に修飾若しくは変更された(例えば、CpGジヌクレオチドが減少した)ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、単鎖、二重鎖、若しくは、三重鎖、線状、又は、環状であってもよく、また、任意の長さであってもよい。ポリヌクレオチドについて議論する際には、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、5’から3’の方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載されている。
a; Jallatら,1990, supra; Kurachi ら, 1982,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464; Jayeら, 1983, Nucl. Acids Res. 11:2325-2335; Ansonら,1984, EMBO J. 3: 1053-1060; Wuら,1990, Gene 86:275-278; Evansら, Proc Natl Acad Sci USA 86:10095 (1989), Blood 74:207-212; Pendurthiら, 1992, Thromb.Res. 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics 1990, 6:133-143; 及び、Katayamaら, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76:4990-4994に記載されている。
2つのポリペプチド配列が同一である場合、それらのポリペプチド配列は、少なくとも参照された領域又は部分の範囲内において同じアミノ酸配列を有する。2つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、それらのポリヌクレオチド配列は、少なくとも参照された領域又は部分の範囲内において同じアミノ酸配列を有する。同一性は、配列の明らかにされているエリア(領域又はドメイン)に亘るものであってもよい。同一性の「エリア」又は「領域」は、参照される2つ以上の同一の構成要素の一部分を表す。従って、2つのタンパク又は核酸配列が配列の1つ以上のエリア又は領域に亘って同一である場合、それらのタンパク又は核酸配列は、その領域内での同一性を共有する。「整列された」配列は、複数のポリヌクレオチド又はタンパク(アミノ酸)の配列を表し、多くの場合、基準配列と比較して欠損した又は付加された塩基又はアミノ酸(ギャップ)のための訂正を含む。
びFASTA3)及びSSEARCH配列比較プログラムもまた、同一性の程度を定量するために使用される(Pearsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); and Smithら、J. Mol. Biol. 147:195 (1981))。ドローネーをベースとした位相写像を使用してタンパク構造の類似性を定量するためのプログラムも開発されている(Bostickら、Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003))。
本明細書に開示されているように、ベクタープラスミドは、一般に、細胞における増殖のための複製開始点と、1つ又はそれ以上の発現制御因子とを少なくとも含む。
のを含み、本明細書において「組織特異的発現制御因子/プロモーター」と呼ばれる。組織特異的な発現制御因子は、典型的には、特定の細胞又は組織(例えば、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、目、網膜、硬骨、筋肉、肺、膵臓、心臓、腎臓細胞等)において活性である。発現制御因子は、その発現制御因子が、特定の細胞種、組織種又は器官種に対してユニークである転写活性化因子タンパク又は転写の他の制御因子によって認識されるので、典型的にはこれらの細胞、組織又は器官において活性である。
レオチドの発現を減少させる制御可能な因子は、「抑制性因子」と呼ばれる(つまり、そのシグナルは、そのシグナルが除去又は不存在であるときに、発現が増加するように、発現を減少させる)。典型的には、そのような因子によって与えられる増加又は減少は、存在するシグナル又は刺激の量に比例し;シグナル又は刺激の量が多いほど、発現の増加又は減少が大きい。特別な非限定的な例は、亜鉛誘導性のヒツジ・メタロチオネイン(MT)プロモーター;ステロイドホルモン誘導性のマウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター;T7ポリメラーゼ・プロモーター・システム(WO98/10088);テトラサイクリン抑制システム(Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547−5551 (1992));テトラサイクリン誘導系;(Gossenら、Science、268:1766−1769(1995);Harveyら、Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512−518 (1998))も参照;RU486誘導系(Wangら、Nat.Biotech.15:239−243(1997)、及び、Wangら、Gene Ther. 4:432−441 (1997);及び、ラパマイシン誘導系(Magariら、J. Clin. Invest. 100:2865−2872(1997);Riveraら、Nat. Medicine. 2:1028−1032 (1996)。この文脈において有用な他の制御可能な制御因子は、特定の生理的状態(例えば、体温、急性期、発生)によって制御されるものである。
ズに又はそれに近いサイズになるように長さを調節するために、挿入物フラグメント中にスタッファー又はフィラーを含めてもよい。いくつかの実施形態において、フィラー核酸配列/スタッファー核酸配列は、核酸の翻訳されない(タンパクをコードしない)セグメントである。AAVベクターの特定の実施形態において、異種起源ポリヌクレオチド配列は、4.7kb未満の長さを有し、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、その異種起源ポリヌクレオチド配列と結合した(例えば、ベクターに挿入された)場合、概ね3.0kb〜5.5kb、又は、概ね4.0kb〜5.0kb、又は、概ね4.3kb〜4.8Kbの全体長さを有する。
%、98%又は99%同一である配列を含むか、又は、当該ヌクレオチド若しくは配列からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、キャプシドは、4−1 VP1キャプシドタンパク変異体(配列番号:4)及び対応するVP2及びVP2キャプシドタンパクを含む。AAVベクターの特定の非限定的一実施形態において、本明細書において「AAV−FIX39Padua」と呼ばれ、そのベクターは、4−1キャプシド変異体タンパク(VP1、VP2、VP3)から形成されたキャプシド、及び、配列番号:12に由来するヌクレオチド1〜4204に対応する核酸配列を含む単鎖のゲノムを含む。
2003 Jan;7(1):122−8に基づいて)280nmの波長における光学密度による吸光度測定法によって測定することができる。
プシド変異体タンパク(VP1、VP2及びVP3)を含むものを含み、AAVベクター(つまり、ベクターゲノムを含むもの)の濃度より多い過剰な空キャプシドを含む。AAVベクターに対する空キャプシドの比率は、概ね、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10〜1であってもよいし、又は、また別の比率であってもよい。
できる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション、又は、コンピュータをベースとしたデータベーススクリーニング手法を使用して分離することができる。そのような技術は、以下のものを含むが、それらに限定されるものではない。
(1)複数の相同なヌクレオチド配列を検出するためのプローブを有するゲノムDNA又はcDNAライブラリーのハイブリダイゼーション
(2)例えば、発現ライブラリーを使用した、共有された構造的特徴を有する複数のポリペプチドを検出する抗体スクリーニング
(3)対象とする核酸配列にアニールすることができるプライマーを使用したゲノムDNA又はcDNAに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
(4)関連配列に関する配列データベースのコンピュータ調査
(5)サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニング
系において病状を作るために遺伝子導入を使用することができ、その後、病状を打ち消すための取り組みにおいてそのモデル系を使用することができる。さらに、欠乏を治療するための核酸配列の部位特異的な組み込みを使用することもできる。
(a)ベクター又はベクターゲノムなどにおいてCpGジヌクレオチドの数が減少したFIXのような、第IX因子をコードする修飾された核酸を提供するステップであって、
前記修飾された核酸配列が、前記配列の転写を与える発現制御因子に作用可能に連結されているステップと;
(b)第IX因子が哺乳動物中で発現されるように、修飾された核酸の所定量を当該哺乳動物に投与するステップを含む。
い。
あるが、患者が充分なレベルの機能する凝固因子を生産する能力の欠如を補うためには、組み換え技術によって生成されたヒト第IX因子の頻繁な注射を必要とする。
は、一般的に認められている。健康なヒトにみられるFIX活性の1%未満は、重度の血友病Bに関係している。中程度の血友病Bを有する人は、重度の血友病Bを有する人よりも少ない頻度(例えば、1か月当たり約1回)で出血するが、手術、外傷、又は、歯の作業の後に正常な人よりも長い期間に亘って出血するであろうことが、一般的に認められている。中程度の疾病を有するヒトが自然に頻繁には出血しないことは一般的に認められている。正常に対して1%〜5%のFIX活性は、一般的に中程度の血友病Bに関係しており、中程度の血友病Bを有するヒト被検体は、仮にあっても、外科手術又は大きい外傷の結果としてだけ、過度に出血する。一般的に、軽度の血友病は、正常に対して6%〜40%のFIX活性と関係している。一般的に、血友病Bの症状を有しない、健康であると考えられる個体は、正常に対して約50%から150%の範囲のFIX活性を有する。さらなる情報は、Fijnvandraatら、Diagnosis and management of hemophilia, Br. Med. J., 344:36−40 (2012)で見ることができる。
9Padua、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のゲノム配列とを有するものを含む)の治療的有効量は、希望の治療効果を達成するために、被検体の重量の1キログラム当たり少なくとも1×1010ベクターゲノム(vg)(vg/kg)、又は、被検体の重量の概ね1×1010〜1×1011vg/kg若しくは被検体の重量の概ね1×1011〜1×1012vg/kg(例えば、概ね1×1011〜2×1011vg/kg、又は、概ね2×1011〜3×1011vg/kg、又は、概ね3×1011〜4×1011vg/kg、又は、概ね4×1011〜5×1011vg/kg、又は、概ね5×1011〜6×1011vg/kg、又は、概ね6×1011〜7×1011vg/kg、又は、概ね7×1011〜8×1011vg/kg、概ね8×1011〜9×1011vg/kg、又は、概ね9×1011〜1×1012vg/kg)、又は、被検体の体重の概ね1×1012〜1×1013vg/kgであってもよい。さらなる用量は、希望の治療効果を達成するために、被検体の重量1キログラム(vg/kg)当たり概ね5×1010〜1×1010のベクターゲノム(vg)の範囲内、又は、被検体の重量1キログラム当たり概ね1×1010〜5×1011vg/kgの範囲内、又は、被検体の重量1キログラム当たり概ね5×1011〜1×1012vg/kgの範囲内、又は、被検体の重量1キログラム当たり概ね1×1012〜5×1013vg/kgの範囲内であってもよい。他の実施形態において、AAVベクターの治療的有効量は、概ね、2.0×1011vg/kg、2.1×1011vg/kg、2.2×1011vg/kg、2.3×1011vg/kg、2.4×1011vg/kg、2.5×1011vg/kg、2.6×1011vg/kg、2.7×1011vg/kg、2.8×1011vg/kg、2.9×1011vg/kg、3.0×1011vg/kg、3.1×1011vg/kg、3.2×1011vg/kg、3.3×1011vg/kg、3.4×1011vg/kg、3.5×1011vg/kg、3.6×1011vg/kg、3.7×1011vg/kg、3.8×1011vg/kg、3.9×1011vg/kg、4.0×1011vg/kg、4.1×1011vg/kg、4.2×1011vg/kg、4.3×1011vg/kg 4.4×1011vg/kg、4.5×1011vg/kg、4.6×1011vg/kg、4.7×1011vg/kg、4.8×1011vg/kg、4.9×1011vg/kg、5.0×1011vg/kg、5.1×1011vg/kg、5.2×1011vg/kg、5.3×1011vg/kg、5.4×1011vg/kg、5.5×1011vg/kg、5.6×1011vg/kg、5.7×1011vg/kg、5.8×1011vg/kg、5.9×1011vg/kg、6.0×1011vg/kg、6.1×1011vg/kg、6.2×1011vg/kg、6.3×1011vg/kg、6.4×1011vg/kg、6.5×1011vg/kg、6.6×1011vg/kg、6.7×1011vg/kg、6.8×1011vg/kg、6.9×1011vg/kg、7.0×1011vg/kg、7.1×1011vg/kg、7.2×1011vg/kg、7.3×1011vg/kg、7.4×1011vg/kg、7.5×1011vg/kg、7.6×1011vg/kg、7.7×1011vg/kg、7.8×1011vg/kg、7.9×1011vg/kg、若しくは、8.0×1011vg/kg又は他の用量である。これらの実施形態のいずれかにおいて、AAVベクターは、AAV−FIX39Padua、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中に単独で被検体に投与されてもよいし、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共に、ベクターに対する空キャプシドの比率を概ね2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1又は他の比率として被検体に投与されてもよい。
少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月、17か月、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年又はそれ以上の持続時間に亘って、血友病Bを有するヒト被検体の少なくとも1%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも5%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも10%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも15%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも20%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも25%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも30%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも35%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも40%の正常なFIX活性をもたらす。他の実施形態において、AAVベクターの有効量は、少なくとも3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月若しくは17か月、又は、少なくとも1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも45%の正常なFIX活性をもたらす。これらの実施形態のいずれかにおいて、AAVベクターは、AAV−FIX39Padua、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成中に単独で被検体に投与されてもよいし、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共に、ベクターに対する空キャプシドの比率を概ね2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1若しくは他の比率として被検体に投与されてもよい。
のような、異なる希釈比を使用することができる。例えば、WO2015/006743に記載されているようなELISA、FACS又はレポーター遺伝子分析のような、抗体の存在に関するあらゆる適切な分析を用いることができるが、限定されるものではない。さらに、当業者の知識に従って、他の分析を使用することもできる。抗体価は、AAVベクターの最初投与後に異なる回数で測定することができる。
たVP1キャプシドタンパクに由来するペプチド、及び/又は、FIX Paduaのような遺伝子導入された肝細胞によって生産された第IX因子タンパクと共にインキュベートされる。キャプシドタンパク又は第IX因子タンパクを特異的に認識するT細胞は、刺激されてインターフェロンγ又は他のサイトカイン等のようなサイトカインを放出し、その後、それは、ELISPOT分析を使用して又は当業者によく知られている他の分析を使用して検出及び定量することができる(例えば、Mannoら、Nat Med 2006; 12(3):342−347を参照されたい。)。血友病Bを治療するためのAAVベクターの用量を被検体が摂取する前、及び、摂取した後に異なる時点で、例えば、週1回、月1回又はその他の間隔で、T細胞反応を監視することができる。従って、ある実施形態によれば、AAVベクターの治療的有効量は、毎週、毎月、若しくは、他の間隔で、又は、AAVベクターの投与後から2週間後、1か月後、2か月後、3か月後、6か月後、9か月後、1年後、2年後若しくは他の期間の後に測定した場合に、分析した100万個のPBMC当たりに、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000又はそれ以上を超えないスポット・フォーミング・ユニットである、ELISPOTを使用して測定されるT細胞反応を生じさせる一方で、血友病Bを有する被検体において止血を維持するのに適切なFIX活性(例えば、少なくとも1%、5%、10%、20%、30%又はそれ以上のFIX活性)をもたらす。これらの実施形態のいくつかにおいて、ELISPOT分析は、AAVベクター・キャプシドタンパクに由来するペプチドによって促進されたインターフェロンγ(又は他のサイトカイン)生産、及び、遺伝子導入された肝細胞によって生産される第IX因子タンパク(FIXPadua又は異なる変異体を含む)を検出するように設計されている。これらの実施形態のいずれかにおいて、AAVベクターは、AAV−FIX39Padua、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
治療計画、治療プロトコル、プロセス、治療薬又は組成物は、被検体に対する本発明の核酸、ベクター、組み換えベクター(例えば、rAAV)、ベクターゲノム又は組み替えウイルス粒子の投与に先立って、該投与と実質的に同時に、又は、該投与の後で、投与又は実行することができる。
象としている病気を有することが確認されたか、その病気の1つ以上の症状を有しているか、又は、その被験者がその病気の1つ以上の症状を有していないが、本明細書に記載されているように陽性であると選抜されて確認された後、1〜2時間、2〜4時間、4〜12時間、12〜24時間又は24〜72時間以内に実行することができる。もちろん、本発明の方法及び使用は、被験者が、その治療が対象としている病気を有することが確認されたか、その病気の1つ以上の症状を有しているか、又は、その被験者がその病気の1つ以上の症状を有していないが、本明細書に記載されているように陽性であると選抜されて確認された後、1〜7日、7〜14日、14〜21日、21〜48日、若しくは、それ以上の日数、数ヶ月、又は、数年の期間内に実行することができる。
補助薬は、例えば、大豆レシチン及びオレイン酸等のような界面活性剤;ソルビタントリオレエート等のようなソルビタンエステル;及び、ポリビニルピロリドンを含む。
Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippinc
ott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 及び、Poznanskyら, Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253−315を参照されたい。)。
本明細書に記載されている、用途、治療プロトコル、又は、予防計画若しくは治療計画のいずれかを実行するための指示を含んでいてもよい。
実施例1 ベクター設計/調製
ヌクレオチドを完全に欠損している。比較試験のために、FIX19(Mingozziら、Sci. Transl Med. 2013)が調製され、FIX Paduaに起因するあらゆる潜在的な混乱させる結果を除外するために、FIX Paduaを含むように修飾された(「FIX19−Padua」、配列番号:11、図11)。
実施例2 インビトロにおけるAAV変異体4−1の遺伝子導入
実施例3 効果研究
実施例4 AAV−FIX39Padua遺伝子治療
実施例5 臨床結果
各被検体に投与されたすべてのAAV−FIX39Paduaベクターが図20〜図23に示されており、示されているAAV空キャプシドの量と合計されている。
分自身を治療したが、それ以外には、評価期間中に因子は注入せず、出血も無かった。
実施例6 AAV−FIX39Paduaベクターの低減された免疫原性
フォーミング・ユニット(SFU)として報告された。各時点において最も高い応答をするプールが、SFU/100万細胞として示されている。ポジティブとして歴史的に用いられている臨界点は、50超のSFUとメディアコントロールの3倍(青線)である。被検体840−003−001、840−001−002、840−001−004及び840−001−005(黒で示されている)は、26週間、14週間、11週間及び8週間を超えるまでモニターした。ELISPOTは、2つの被検体、CP−16及びPT17が、1e12vg/kgのAAV8−FIX19ベクターを摂取し、1つの被検体が、2e12vg/kgのAAV8−FIX19を摂取した以前の試みから得たものであり、赤で示されている。
Rh74 VP1アミノ酸配列(配列番号:1)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Rh74 VP2アミノ酸(配列番号:2)
TAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Rh74 VP3アミノ酸(配列番号:3)
MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
4−1変異体VP1キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:4)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAV GRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGG
TAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS
541 GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
661 PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
4−1変異体VP2キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:27)
TAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNT
MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTS
GGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEG
TKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCL
EYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLF
SQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMAT
HKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAP
IVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPP
TTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPI
GTRYLTRNL
4−1変異体VP3キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:3)
MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTS
GGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEG
TKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCL
EYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLF
SQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMAT
HKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAP
IVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPP
TTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPI
GTRYLTRNL
15−1の変異体VP1キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:5)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQRQDNGRGLVLPGYRYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDRAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVRTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYRQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTRTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHRDDEERFFPSS
541 GVLMFGRQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIRTTNPVATEQYGVVADNLQQQN AAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
661 PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
15−2変異体VP1キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:6)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQRQD NGRGLVLPGY RYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDRAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVRTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGI GKRGQQPARK RLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYRQISNGTSGGSTNDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTRTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGT QQLLFSQAGP NNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLV NPGVAMATHR DDEERFFPSS
541 GVLMFGKQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIRTTNPVATEQYG VVADNLQQQN AAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPL
MGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP
661 PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPE IQYTSNYYKS TNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
15−3/15−5変異体VP1キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:7)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIR EWWDLKPGAPKPKANQQRQD NGRGLVLPGY RYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDRAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVRTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGI GKRGQQPAKK RLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYRQISNGTSGGSTNDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTRTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGT QQLLFSQAGP NNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLV NPGVAMATHR DDEERFFPSS
541 GVLMFGRQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIRTTNPVATEQYG VVADNLQQQN AAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP
661 PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPE IQYTSNYYKS TNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
15−4変異体VP1キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:8)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAP KPKANQQRQD NGRGLVLPGY RYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDRAYDQQLQAGDNPY LRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVRTAPGKKRPVEPSP QRSPDSSTGI GKRGQQPAKK RLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGA PMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYRQISNGTSGGST NDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNE GTRTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSR TQSTGGTAGT QQLLFSQAGP NNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATK YHLNG
RDSLV NPGVAMATHR DDEERFFPSS
541 GVLMFGKQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIRT TNPVATEQYG VVADNLQQQN AAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGN FHPSPLMGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP
661 PTTFNQARLASFITQYSTGQVSVEIEWELQ KENSKRWNPE IQYTSNYYKS TNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
15−6変異体VP1キャプシド・アミノ酸配列(配列番号:9)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQRQDNGRGLVLPGY RYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDRAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSF GGNLGRAVFQ
121 AKKRVLEPLGLVESPVRTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKK RLNFGQTGDS
181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWH CDSTWLGDRV
241 ITTSTRTWALPTYNNHLYRQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ
301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTRTIANNLTSTIQVFTDSE YQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGN NFEFSYNFED
421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGP NNMSAQAKNW
481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHR DDEERFFPSS
541 GVLMFGRQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIRTTNPVATEQYGVVADNLQQQN AAPIVGAVNS
601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQIL IKNTPVPADP
661 PTTFNQARLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKS TNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
FIX39核酸配列(配列番号:10)
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGAGCCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAATGCCAACAAAATTCTGAATAGACCAAAGAGGTATAACTCTGGCAAGCTTGAAGAGTTTGTACAGGGGAATCTGGAGAGAGAGTGTATGGAAGAGAAGTGCAGCTTTGAGGAAGCCAGAGAAGTGTTTGAAAATACAGAGAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTGGATGGTGATCAATGTGAGAGCAATCCCTGCTTGAATGGGGGGAGCTGTAAAGATGATATCAACAGCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAGGGGAAAAACTGTGAGCTTGATGTGACCTGTAATATCAAGAATGGCAGGTGTGAGCAATTTTGCAAGAATTCTGCTGATAACAAAGTGGTCTGTAGCTGCACTGAGGGATATAGGCTGGCTGAAAACCAGAAGAGCTGTGAACCTGCAG
TGCCTTTTCCCTGTGGGAGAGTGTCTGTGAGCCAAACCAGCAAGCTGACTAGGGCTGAAGCAGTCTTTCCTGATGTAGATTATGTGAATAGCACTGAGGCTGAGACAATCCTTGACAATATCACTCAGAGCACACAGAGCTTCAATGACTTCACCAGGGTGGTAGGAGGGGAGGATGCCAAGCCTGGGCAGTTCCCCTGGCAGGTAGTGCTCAATGGAAAAGTGGATGCCTTTTGTGGAGGTTCAATTGTAAATGAGAAGTGGATTGTGACTGCAGCCCACTGTGTGGAAACTGGAGTCAAGATTACTGTGGTGGCTGGAGAGCACAATATTGAGGAAACTGAGCACACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGGATTATCCCCCACCACAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTACAACCATGACATTGCCCTCCTGGAACTGGATGAACCCCTGGTCTTGAACAGCTATGTGACACCCATCTGTATTGCTGATAAAGAGTACACCAACATCTTCTTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGCTGGGGCAGGGTGTTCCATAAAGGCAGGTCTGCCCTGGTATTGCAGTATTTGAGGGTGCCTCTGGTGGATAGAGCAACCTGCTTGCTGAGCACCAAGTTTACAATCTACAACAATATGTTCTGTGCAGGGTTCCATGAAGGTGGTAGAGACAGCTGCCAGGGAGATTCTGGGGGTCCCCATGTGACTGAGGTGGAGGGAACCAGCTTCCTGACTGGGATTATCAGCTGGGGTGAGGAGTGTGCTATGAAGGGAAAGTATGGGATCTACACAAAAGTATCCAGATATGTGAACTGGATTAAGGAGAAAACCAAGCTGACTTGA
FIX19核酸配列(配列番号:11)
ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCCGAGAGCCCTGGCCTGATTACCATCTGCCTGTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATCCTGAACCGGCCCAAGCGGTACAACTCAGGCAAGCTGGAAGAGTTCGTGCAGGGCAACCTGGAACGGGAGTGCATGGAAGAGAAGTGCAGCTTCGAGGAAGCCCGGGAGGTGTTCGAGAACACCGAGCGGACCACCGAGTTCTGGAAGCAGTACGTGGACGGCGACCAGTGCGAGTCAAACCCCTGCCTGAACGGCGGCAGCTGCAAGGACGATATCAACAGCTACGAGTGCTGGTGCCCCTTCGGCTTCGAGGGCAAGAACTGCGAGCTGGACGTGACCTGCAACATCAAGAACGGCCGCTGCGAGCAGTTCTGCAAGAACAGCGCCGACAACAAGGTGGTGTGCTCATGCACTGAGGGCTACCGGCTGGCCGAGAACCAGAAGAGCTGCGAGCCCGCCGTGCCCTTCCCCTGCGGCAGAGTGTCCGTGAGCCAGACCAGCAAGCTGACCAGGGCCGAGGCCGTGTTCCCTGACGTGGACTACGTGAACTCAACCGAGGCCGAGACAATCCTGGACAACATCACCCAGAGCACCCAGTCCTTCAACGACTTCACCCGGGTGGTGGGCGGCGAGGACGCCAAGCCCGGCCAGTTCCCTTGGCAGGTGGTGCTGAACGGCAAGGTGGACGCCTTCTGCGGCGGCTCAATCGTGAACGAGAAGTGGATCGTGACAGCCGCCCACTGCGTGGAGACAGGCGTGAAGATCACCGTGGTGGCCGGCGAACACAATATCGAGGAAACCGAGCACACCGAGCAGAAACGGAACGTGATCCGGATTATCCCCCACCACAACTACAACGCCGCCATCAACAAGTACAACCACGATATCGCCCTGCTGGAACTGGACGAGCCTCTGGTGCTGAATTCATACGTGACCCCCATCTGTATCGCCGACAAAGAGTACACCAACATCTTTCTGAA
GTTCGGCAGCGGCTACGTGTCCGGCTGGGGCAGGGTGTTCCACAAGGGCCGCAGCGCCCTGGTGCTGCAGTACCTGCGGGTGCCCCTGGTGGACAGAGCCACCTGCCTGCGGTCAACCAAGTTCACCATCTACAACAACATGTTCTGCGCCGGCTTCCACGAGGGCGGCAGGGACAGCTGCCAGGGCGACAGCGGCGGACCCCACGTGACCGAGGTGGAGGGCACCAGCTTTCTGACCGGCATCATCTCATGGGGCGAGGAATGCGCCATGAAGGGCAAGTACGGAATCTACACTAAGGTGTCAAGATACGTGAACTGGATCAAAGAGAAAACCAAGCTGACCTGA
pAAV−ApoE_hAAT−FIX39(配列番号:12)
LOCUS FIX39 11125
bp DNA circular UNA
DEFINITION AKA FIX39 Step 4.
ACCESSION urn.local...e−3um3omk
VERSION urn.local...e−3um3omk
KEYWORDS .
SOURCE
ORGANISM
.
FEATURES Location/Qualifiers
repeat_region 1..141
/Imported_from="<a
href=""http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper"">Pla
sMapper</a>"
/Transferred_From="
LAAV−2_ITR"
/Transferred_Similarity="100.00%"
/modified_by="User"
/label="AAV2 ITR"
enhancer 152..472
/created_by="User"
/modified_by="User"
/Transferred_From="
ApoE HCR−1"
/Transferred_Similarity="100.00%"
/label="ApoE HCR−1"
promoter 482..878
/vntifkey=21
/ApEinfo_fwdcolor=
"#ffff00"
/ApEinfo_revcolor="
#0080ff"
/Transferred_From="
hAAT Promoter"
/Transferred_Simila
rity="100.00%"
/modified_by="User"
/label="hAAT Promot
er"
5'UTR 879..907
/created_by="User"
/label="FIX 5'UTR"
CDS order(908..995,2434..3731)
/created_by="User"
/Transferred_From="
hFIX CDS"
/Transferred_Similarity="79.22%"
/modified_by="User"
/label="hFIX CDS"
intron 996..2433
/created_by="User"
/Transferred_From="
hFIX Intron"
/Transferred_Similarity="100.00%"
/modified_by="User"
/label="hFIX Intron"
3'UTR 3732..3779
/created_by="User"
/label="hF9 3' UTR"
Terminator 3820..4047
/Imported_from="<a
href=""http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper"">Pla
sMapper</a>"
/Transferred_From="
bGH_PA term"
/Transferred_Similarity="100.00%"
/label="bGH_PA term"
repeat_region complement(4097..4204)
/modified_by="User"
/label="AAV2 ITR"
misc_feature 4219..8579
/modified_by="User"
/label="Lambda Stuf
fer"
Gene complement(8491..8580)
/Imported_from="<a
href=""http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper"">Pla
sMapper</a>"
/Transferred_From="
cosN"
/Transferred_Similarity="100.00%"
/label="cosN"
rep_origin 8680..8986
/modified_by="User"
/label="F1 Ori"
misc._marker 9284..10096
/modified_by="User"
/label="Kan R"
rep_origin complement(10453..11120)
/modified_by="User"
/label="pUC Ori"
ORIGIN
1 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
61 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca
121 actccatcac taggggttcc tgcggcctag taggctcaga ggcacacagg agtttctggg
181 ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc
241 ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt
301 gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag
361 aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt
421 cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg
481 ggatcttgct accagtggaa cagccactaa ggattctgca gtgagagcag agggccagct
541 aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact cacgccaccc cctccacctt ggacacagga
601 cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac
661 actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac
721 ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc
781 tcccccgttg cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc
841 tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga cagtgaatac cactttcaca atctgctagc
901 aaaggttatg cagagggtga acatgatcat ggctgagagc cctggcctga tcaccatctg
961 cctgctgggc tacctgctgt ctgctgaa
tg tacaggtttg tttccttttt tataatacat
1021 tgagtatgct tgccttttag atatagaaat atctgattct gtcttcttca ctaaattttg
1081 attacatgat ttgacagcaa tattgaagag tctaacagcc agcacccagg ttggtaagta
1141 ctggttcttt gttagctagg ttttcttctt cttcactttt aaaactaaat agatggacaa
1201 tgcttatgat gcaataaggt ttaataaaca ctgttcagtt cagtatttgg tcatgtaatt
1261 cctgttaaaa aacagtcatc tccttggttt aaaaaaatta aaagtgggaa aacaaagaaa
1321 tagcagaata tagtgaaaaa aaataaccac agtatttttg tttggactta ccactttgaa
1381 atcaaattgg gaaacaaaag cacaaacagt ggccttattt acacaaaaag tctgatttta
1441 agatatgtga caattcaagg tttcagaagt atgtaaggag gtgtgtctct aattttttaa
1501 attatatatc ttcaatttaa agttttagtt aaaacataaa gattaacctt tcattagcaa
1561 gctgttagtt atcaccaaag cttttcatgg attaggaaaa aatcattttg tctctatctc
1621 aaacatcttg gagttgatat ttggggaaac acaatactca gttgagttcc ctaggggaga
1681 aaagcaagct taagaattga cacaaagagt aggaagttag ctattgcaac atatatcact
1741 ttgttttttc acaactacag tgactttatt tatttcccag aggaaggcat acagggaaga
1801 aattatccca tttggacaaa cagcatgttc tcacagtaag cacttatcac acttacttgt
1861 caactttcta gaatcaaatc tagtagctga cagtaccagg atcaggggtg ccaaccctaa
1921 gcacccccag aaagctgact ggccctgtgg ttcccactcc agacatgatg tcagctgtga
1981 aatccacctc cctggaccat aattaggctt ctgttcttca ggagacattt gttcaaagtc
2041 atttgggcaa ccatattctg aaaacagccc agccagggtg atggatcact ttgcaaagat
2101 cctcaatgag ctattttcaa gtgatgacaa agtgtgaagt taagggctca tttgagaact
2161 ttctttttca tccaaagtaa attcaaatat gattagaaat ctgacctttt attactggaa
2221 ttctcttgac taaaagtaaa attgaatttt aattcctaaa tctccatgtg tatacagtac
2281 tgtgggaaca tcacagattt tggctccatg ccctaaagag aaattggctt tcagattatt
2341 tggattaaaa acaaagactt tcttaagaga tgtaaaattt tcatgatgtt ttcttttttg
2401 ctaaaactaa agaattattc ttttacattt cagtttttct tgatcatgaa aatgccaaca
2461 aaattctgaa tagaccaaag aggtataa
ct ctggcaagct tgaagagttt gtacagggga
2521 atctggagag agagtgtatg gaagagaagt gcagctttga ggaagccaga gaagtgtttg
2581 aaaatacaga gagaacaact gaattttgga agcagtatgt ggatggtgat caatgtgaga
2641 gcaatccctg cttgaatggg gggagctgta aagatgatat caacagctat gaatgttggt
2701 gtccctttgg atttgagggg aaaaactgtg agcttgatgt gacctgtaat atcaagaatg
2761 gcaggtgtga gcaattttgc aagaattctg ctgataacaa agtggtctgt agctgcactg
2821 agggatatag gctggctgaa aaccagaaga gctgtgaacc tgcagtgcct tttccctgtg
2881 ggagagtgtc tgtgagccaa accagcaagc tgactagggc tgaagcagtc tttcctgatg
2941 tagattatgt gaatagcact gaggctgaga caatccttga caatatcact cagagcacac
3001 agagcttcaa tgacttcacc agggtggtag gaggggagga tgccaagcct gggcagttcc
3061 cctggcaggt agtgctcaat ggaaaagtgg atgccttttg tggaggttca attgtaaatg
3121 agaagtggat tgtgactgca gcccactgtg tggaaactgg agtcaagatt actgtggtgg
3181 ctggagagca caatattgag gaaactgagc acactgagca gaagaggaat gtgatcagga
3241 ttatccccca ccacaactac aatgctgcta tcaacaagta caaccatgac attgccctcc
3301 tggaactgga tgaacccctg gtcttgaaca gctatgtgac acccatctgt attgctgata
3361 aagagtacac caacatcttc ttgaaatttg ggtctggata tgtgtctggc tggggcaggg
3421 tgttccataa aggcaggtct gccctggtat tgcagtattt gagggtgcct ctggtggata
3481 gagcaacctg cttgctgagc accaagttta caatctacaa caatatgttc tgtgcagggt
3541 tccatgaagg tggtagagac agctgccagg gagattctgg gggtccccat gtgactgagg
3601 tggagggaac cagcttcctg actgggatta tcagctgggg tgaggagtgt gctatgaagg
3661 gaaagtatgg gatctacaca aaagtatcca gatatgtgaa ctggattaag gagaaaacca
3721 agctgacttg atgaaagatg gatttccaag gttaattcat tggaattgaa aattaacaga
3781 gatctagagc tgaattcctg cagccagggg gatcagcctc tactgtgcct tctagttgcc
3841 agccatctgt tgtttgcccc tcccccttgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca
3901 ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcacattg tctgagtagg tgtcattcta
3961 ttctgggggg tggggtgggg caggacag
ca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc
4021 atgctgggga tgcagtgggc tctatggctt ctgaggcaga aagaaccagc tggggctcga
4081 gatccactag ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct
4141 cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc
4201 gcagctgcct gcaggggcag cttgaaggaa atactaaggc aaaggtactg caagtgctcg
4261 caacattcgc ttatgcggat tattgccgta gtgccgcgac gccgggggca agatgcagag
4321 attgccatgg tacaggccgt gcggttgata ttgccaaaac agagctgtgg gggagagttg
4381 tcgagaaaga gtgcggaaga tgcaaaggcg tcggctattc aaggatgcca gcaagcgcag
4441 catatcgcgc tgtgacgatg ctaatcccaa accttaccca acccacctgg tcacgcactg
4501 ttaagccgct gtatgacgct ctggtggtgc aatgccacaa agaagagtca atcgcagaca
4561 acattttgaa tgcggtcaca cgttagcagc atgattgcca cggatggcaa catattaacg
4621 gcatgatatt gacttattga ataaaattgg gtaaatttga ctcaacgatg ggttaattcg
4681 ctcgttgtgg tagtgagatg aaaagaggcg gcgcttacta ccgattccgc ctagttggtc
4741 acttcgacgt atcgtctgga actccaacca tcgcaggcag agaggtctgc aaaatgcaat
4801 cccgaaacag ttcgcaggta atagttagag cctgcataac ggtttcggga ttttttatat
4861 ctgcacaaca ggtaagagca ttgagtcgat aatcgtgaag agtcggcgag cctggttagc
4921 cagtgctctt tccgttgtgc tgaattaagc gaataccgga agcagaaccg gatcaccaaa
4981 tgcgtacagg cgtcatcgcc gcccagcaac agcacaaccc aaactgagcc gtagccactg
5041 tctgtcctga attcattagt aatagttacg ctgcggcctt ttacacatga ccttcgtgaa
5101 agcgggtggc aggaggtcgc gctaacaacc tcctgccgtt ttgcccgtgc atatcggtca
5161 cgaacaaatc tgattactaa acacagtagc ctggatttgt tctatcagta atcgacctta
5221 ttcctaatta aatagagcaa atccccttat tgggggtaag acatgaagat gccagaaaaa
5281 catgacctgt tggccgccat tctcgcggca aaggaacaag gcatcggggc aatccttgcg
5341 tttgcaatgg cgtaccttcg cggcagatat aatggcggtg cgtttacaaa aacagtaatc
5401 gacgcaacga tgtgcgccat tatcgcctag ttcattcgtg accttctcga cttcgccgga
5461 ctaagtagca atctcgctta tataacga
gc gtgtttatcg gctacatcgg tactgactcg
5521 attggttcgc ttatcaaacg cttcgctgct aaaaaagccg gagtagaaga tggtagaaat
5581 caataatcaa cgtaaggcgt tcctcgatat gctggcgtgg tcggagggaa ctgataacgg
5641 acgtcagaaa accagaaatc atggttatga cgtcattgta ggcggagagc tatttactga
5701 ttactccgat caccctcgca aacttgtcac gctaaaccca aaactcaaat caacaggcgc
5761 cggacgctac cagcttcttt cccgttggtg ggatgcctac cgcaagcagc ttggcctgaa
5821 agacttctct ccgaaaagtc aggacgctgt ggcattgcag cagattaagg agcgtggcgc
5881 tttacctatg attgatcgtg gtgatatccg tcaggcaatc gaccgttgca gcaatatctg
5941 ggcttcactg ccgggcgctg gttatggtca gttcgagcat aaggctgaca gcctgattgc
6001 aaaattcaaa gaagcgggcg gaacggtcag agagattgat gtatgagcag agtcaccgcg
6061 attatctccg ctctggttat ctgcatcatc gtctgcctgt catgggctgt taatcattac
6121 cgtgataacg ccattaccta caaagcccag cgcgacaaaa atgccagaga actgaagctg
6181 gcgaacgcgg caattactga catgcagatg cgtcagcgtg atgttgctgc gctcgatgca
6241 aaatacacga aggagttagc tgatgctaaa gctgaaaatg atgctctgcg tgatgatgtt
6301 gccgctggtc gtcgtcggtt gcacatcaaa gcagtctgtc agtcagtgcg tgaagccacc
6361 accgcctccg gcgtggataa tgcagcctcc ccccgactgg cagacaccgc tgaacgggat
6421 tatttcaccc tcagagagag gctgatcact atgcaaaaac aactggaagg aacccagaag
6481 tatattaatg agcagtgcag atagagttgc ccatatcgat gggcaactca tgcaattatt
6541 gtgagcaata cacacgcgct tccagcggag tataaatgcc taaagtaata aaaccgagca
6601 atccatttac gaatgtttgc tgggtttctg ttttaacaac attttctgcg ccgccacaaa
6661 ttttggctgc atcgacagtt ttcttctgcc caattccaga aacgaagaaa tgatgggtga
6721 tggtttcctt tggtgctact gctgccggtt tgttttgaac agtaaacgtc tgttgagcac
6781 atcctgtaat aagcagggcc agcgcagtag cgagtagcat ttttttcatg gtgttattcc
6841 cgatgctttt tgaagttcgc agaatcgtat gtgtagaaaa ttaaacaaac cctaaacaat
6901 gagttgaaat ttcatattgt taatatttat taatgtatgt caggtgcgat gaatcgtcat
6961 tgtattcccg gattaactat gtccacag
cc ctgacgggga acttctctgc gggagtgtcc
7021 gggaataatt aaaacgatgc acacagggtt tagcgcgtac acgtattgca ttatgccaac
7081 gccccggtgc tgacacggaa gaaaccggac gttatgattt agcgtggaaa gatttgtgta
7141 gtgttctgaa tgctctcagt aaatagtaat gaattatcaa aggtatagta atatctttta
7201 tgttcatgga tatttgtaac ccatcggaaa actcctgctt tagcaagatt ttccctgtat
7261 tgctgaaatg tgatttctct tgatttcaac ctatcatagg acgtttctat aagatgcgtg
7321 tttcttgaga atttaacatt tacaaccttt ttaagtcctt ttattaacac ggtgttatcg
7381 ttttctaaca cgatgtgaat attatctgtg gctagatagt aaatataatg tgagacgttg
7441 tgacgtttta gttcagaata aaacaattca cagtctaaat cttttcgcac ttgatcgaat
7501 atttctttaa aaatggcaac ctgagccatt ggtaaaacct tccatgtgat acgagggcgc
7561 gtagtttgca ttatcgtttt tatcgtttca atctggtctg acctccttgt gttttgttga
7621 tgatttatgt caaatattag gaatgttttc acttaatagt attggttgcg taacaaagtg
7681 cggtcctgct ggcattctgg agggaaatac aaccgacaga tgtatgtaag gccaacgtgc
7741 tcaaatcttc atacagaaag atttgaagta atattttaac cgctagatga agagcaagcg
7801 catggagcga caaaatgaat aaagaacaat ctgctgatga tccctccgtg gatctgattc
7861 gtgtaaaaaa tatgcttaat agcaccattt ctatgagtta ccctgatgtt gtaattgcat
7921 gtatagaaca taaggtgtct ctggaagcat tcagagcaat tgaggcagcg ttggtgaagc
7981 acgataataa tatgaaggat tattccctgg tggttgactg atcaccataa ctgctaatca
8041 ttcaaactat ttagtctgtg acagagccaa cacgcagtct gtcactgtca ggaaagtggt
8101 aaaactgcaa ctcaattact gcaatgccct cgtaattaag tgaatttaca atatcgtcct
8161 gttcggaggg aagaacgcgg gatgttcatt cttcatcact tttaattgat gtatatgctc
8221 tcttttctga cgttagtctc cgacggcagg cttcaatgac ccaggctgag aaattcccgg
8281 accctttttg ctcaagagcg atgttaattt gttcaatcat ttggttagga aagcggatgt
8341 tgcgggttgt tgttctgcgg gttctgttct tcgttgacat gaggttgccc cgtattcagt
8401 gtcgctgatt tgtattgtct gaagttgttt ttacgttaag ttgatgcaga tcaattaata
8461 cgatacctgc gtcataattg attatttg
ac gtggtttgat ggcctccacg cacgttgtga
8521 tatgtagatg ataatcatta tcactttacg ggtcctttcc ggtgatccga caggttacgg
8581 ggcggcgacc tgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg
8641 catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg
8701 gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgcct tagcgcccgc tcctttcgct
8761 ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg
8821 ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg
8881 ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg
8941 gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caactctatc
9001 tcgggctatt cttttgattt agacctgcag gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt
9061 acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc
9121 ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt
9181 gcgcagcctg aatggcgaat gcgatttatt caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg
9241 taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca
9301 tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc
9361 gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt
9421 atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa
9481 aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca
9541 aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa
9601 aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata
9661 cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca
9721 ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg
9781 ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat
9841 gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg
9901 taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct
9961 tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacc
tg attgcccgac attatcgcga gcccatttat
10021 acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cttcgagcaa gacgtttccc
10081 gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg
10141 ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacaacgt
10201 ggctttgttg aataaatcga acttttgctg agttgaagga tcagatcacg catcttcccg
10261 acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa agttcaaaat caccaactgg tccacctaca
10321 acaaagctct catcaaccgt ggctccctca ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg
10381 cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac gaggcagacc tctcgacgga gttccactga
10441 gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta
10501 atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa
10561 gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact
10621 gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca
10681 tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt
10741 accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg
10801 ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag
10861 cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta
10921 agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat
10981 ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg
11041 tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc
11101 ttttgctggc cttttgctca catgt
phFIX39v2(配列番号:26)
LOCUS phFIX39v2 11199
bp DNA circular UNA
FEATURES Location/Qualifiers
repeat_region 1..141
/label="AAV2 ITR"
enhancer 152..472
/label="ApoE HCR−1"
promoter 482..878
/label="hAAT Promot
er"
CDS order(908..995,2434..3731)
/label="hFIX CDS"
intron 996..2433
/label="hFIX Intron"
3'UTR 3732..3779
/label="hF9 3' UTR"
Terminator 3820..4047
/label="bGH_PA term"
repeat_region complement(4097..4237)
/label="AAV2 ITR"
misc_feature 4248..8713
/label="Eukaryotic
Stuffer"
rep_origin 8754..9060
/label="F1 Ori"
CDS complement(9355..10170)
/label="Kanamycin r
esistance"
rep_origin complement(10527..11194)
/label="pUC Ori"
ORIGIN
1 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
61 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca
121 actccatcac taggggttcc tgcggcctag taggctcaga ggcacacagg agtttctggg
181 ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc
241 ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt
301 gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag
361 aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt
421 cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg
481 ggatcttgct accagtggaa cagccactaa ggattctgca gtgagagcag agggccagct
541 aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact cacgccaccc cctccacctt ggacacagga
601 cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac
661 actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac
721 ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc
781 tcccccgttg cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc
841 tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga cagtgaatac cactttcaca atctgctagc
901 aaaggttatg cagagggtga acatgatcat ggctgagagc cctggcctga tcaccatctg
961 cctgctgggc tacctgctgt ctgctgaatg tacaggtttg tttccttttt tataatacat
1021 tgagtatgct tgccttttag atatagaaat atctgattct gtcttcttca ctaaattttg
1081 attacatgat ttgacagcaa tattgaagag tctaacagcc agcacccagg ttggtaagta
1141 ctggttcttt gttagctagg ttttcttctt cttcactttt aaaactaaat agatggacaa
1201 tgcttatgat gcaataaggt ttaataaaca ctgttcagtt cagtatttgg tcatgtaatt
1261 cctgttaaaa aacagtcatc tccttggttt aaaaaaatta aaagtgggaa aacaaagaaa
1321 tagcagaata tagtgaaaaa aaataaccac agtatttttg tttggactta ccactttgaa
1381 atcaaattgg gaaacaaaag cacaaacagt ggccttattt acacaaaaag tctgatttta
1441 agatatgtga caattcaagg tttcagaagt atgtaaggag gtgtgtctct aattttttaa
1501 attatatatc ttcaatttaa agttttagtt aaaacataaa gattaacctt tcattagcaa
2101 cctcaatgag ctattttcaa gtgatgacaa agtgtgaagt taagggctca tttgagaact
2161 ttctttttca tccaaagtaa attcaaatat gattagaaat ctgacctttt attactggaa
2221 ttctcttgac taaaagtaaa attgaatttt aattcctaaa tctccatgtg tatacagtac
2281 tgtgggaaca tcacagattt tggctccatg ccctaaagag aaattggctt tcagattatt
2341 tggattaaaa acaaagactt tcttaagaga tgtaaaattt tcatgatgtt ttcttttttg
2401 ctaaaactaa agaattattc ttttacattt cagtttttct tgatcatgaa aatgccaaca
2461 aaattctgaa tagaccaaag aggtataact ctggcaagct tgaagagttt gtacagggga
2521 atctggagag agagtgtatg gaagagaagt gcagctttga ggaagccaga gaagtgtttg
2581 aaaatacaga gagaacaact gaattttgga agcagtatgt ggatggtgat caatgtgaga
2641 gcaatccctg cttgaatggg gggagctg
ta aagatgatat caacagctat gaatgttggt
2701 gtccctttgg atttgagggg aaaaactgtg agcttgatgt gacctgtaat atcaagaatg
2761 gcaggtgtga gcaattttgc aagaattctg ctgataacaa agtggtctgt agctgcactg
2821 agggatatag gctggctgaa aaccagaaga gctgtgaacc tgcagtgcct tttccctgtg
2881 ggagagtgtc tgtgagccaa accagcaagc tgactagggc tgaagcagtc tttcctgatg
2941 tagattatgt gaatagcact gaggctgaga caatccttga caatatcact cagagcacac
3001 agagcttcaa tgacttcacc agggtggtag gaggggagga tgccaagcct gggcagttcc
3061 cctggcaggt agtgctcaat ggaaaagtgg atgccttttg tggaggttca attgtaaatg
3121 agaagtggat tgtgactgca gcccactgtg tggaaactgg agtcaagatt actgtggtgg
3181 ctggagagca caatattgag gaaactgagc acactgagca gaagaggaat gtgatcagga
3241 ttatccccca ccacaactac aatgctgcta tcaacaagta caaccatgac attgccctcc
3301 tggaactgga tgaacccctg gtcttgaaca gctatgtgac acccatctgt attgctgata
3361 aagagtacac caacatcttc ttgaaatttg ggtctggata tgtgtctggc tggggcaggg
3421 tgttccataa aggcaggtct gccctggtat tgcagtattt gagggtgcct ctggtggata
3481 gagcaacctg cttgctgagc accaagttta caatctacaa caatatgttc tgtgcagggt
3541 tccatgaagg tggtagagac agctgccagg gagattctgg gggtccccat gtgactgagg
3601 tggagggaac cagcttcctg actgggatta tcagctgggg tgaggagtgt gctatgaagg
3661 gaaagtatgg gatctacaca aaagtatcca gatatgtgaa ctggattaag gagaaaacca
3721 agctgacttg atgaaagatg gatttccaag gttaattcat tggaattgaa aattaacaga
3781 gatctagagc tgaattcctg cagccagggg gatcagcctc tactgtgcct tctagttgcc
3841 agccatctgt tgtttgcccc tcccccttgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca
3901 ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcacattg tctgagtagg tgtcattcta
3961 ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc
4021 atgctgggga tgcagtgggc tctatggctt ctgaggcaga aagaaccagc tggggctcga
4081 gatccactag ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct
4141 cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaa
ag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg
4201 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc ccatgggcag atgcaccacc
4261 tgtctcagtg caaagccctg cctaagtagg ctggtcataa gaccatgtgt ctggctgtaa
4321 ctccaattga ttgtcagcat caataaaact tggccaacac tgttatatac tggtattgat
4381 agttacaact gaacatattt gtttaagcaa ttggaattaa gaattcacat gcaatgatat
4441 cagggtcctt ctcctctggt tagtgtattg gggggaaatt ggacatctct cagctcagta
4501 ggctagttag gccaggatgg atgacatcca cagcccctgg gcagagagat tatgatgtag
4561 ctagtctgac tcctgacaaa gacttgcttc ctggagcttc tactactttc tggtggatgg
4621 ctaagaaata tggttgtgtt cttttaagtc tgaagagcat tatttttgcc aacccctgac
4681 caaacatcct tgccaaggaa aaggcctaaa atatatttgc atttaaagat attacaaact
4741 acttggtttt ggaatgtttg gcctttcagg atcatagcta tcaaaatatt agctatttgg
4801 ggtatgagat gtctgcttgg tcaaggacaa gttcttaaag acatcatgtt ggggaataat
4861 ggggaaaatg ggaaggctta tgctctgagt aagacatctg agttatcatc tgtcaaacat
4921 ttttgttagt catagtctaa tgggagcctg ttttccctct ttaatataca ttcacatctg
4981 aatttatgct cttcattgac aatgccagcc cagaacaaca gctcttaccc tttggttttc
5041 ttcctaacct ttaactccaa tgtaaccatt acctgccatt tcagtaaaac cattattctc
5101 cctacttacc cacccaagtt gtacaataaa gagtgtttgc tctcactcat atacaaagca
5161 aattcatttg tttgtgatgt acagcttgct atgcccacag atgtggtttg cctagtcctt
5221 tgctctaggt catttgactg ggaacagatg ggatgctcac tttggttttt aatggttaac
5281 tagtcattga aatgcatttc atcaaataat cttagaggat aattgtttaa atgtctgtcc
5341 agactagctt tgtagagcca ggtgccatta cacatgtcac cttcttattt ctcttaattg
5401 aatttttatc atctgagata ggaataatag agggcttttt caagtgaaga tattactata
5461 gtctaaagac cttagtgtaa catcctggcc cctaaggaaa aacaagttct ggttcataca
5521 tataataact ttgcatgtta tctgccactg agatgtgtcc taatccaaca gaaaggattg
5581 aatctctgta gctaggtgta cagggcaaga gctgtacagg gaacctttaa agatagcttc
5641 aggccaaagc tgaggaaagt ggatggag
ac tggggaaaat gctaagacat tttaaagatt
5701 ttctttaggt caaaaataga ataagaaata gaccatttcc ctggacattt tctgtaggtt
5761 aatactgtta actattggta aatgcatatg ctacaactta atatgtctgc tttgtgagtt
5821 tagcattgtc tccttgtcat tccagaaatg aaatggcaaa tacatttaaa tcagaactaa
5881 aaaggggaac agggtataaa ggctcaattt agtcacatca tttccctttc tcacccaccc
5941 cctttaaacc agatgtttgc caatgcatta acaatgcaga tgtttcctga aagaaagttt
6001 agtaactcaa gcagacacct tattttcttt tcaagcagaa aagactatga gatggtggtt
6061 gtggttgttc tgggagggag aagatataaa tgatacacat tatttcaaat catttcatga
6121 cctcactgca cacttatagt tattgtacct gttgtctttt tgctgtcaag cctagctaag
6181 atcatttgga atgttcaaga tcactcatac atgcatgtgc acacatacac atgcacatat
6241 gttcactccc tatttcatcc acatgaacta agattactga tgtgtacaga ttcaaagcac
6301 ttttattctt ttccaaaggc aagaagctga gctactttcc agaatagttg tgaaagaccc
6361 tgtcatactt ctgcattgtt tcctccacac cacctccatc cagttcctta tgaatggtta
6421 ctggttttca aaaatatgag ataaattgag tgtataaaag tcatttttag acaaaatgaa
6481 acaggaaatg aaagaaacca gaatctctcc tcatttgtgg atgggccagc tccaccatgt
6541 catggttaat ctgcagggag gaaatactag atttgattgc agatcagact gcagcaaacc
6601 tgctgtgact aaggcatcaa gagaaagcaa gcaacagctg gggcttcagt ggtgaaaaca
6661 ttatatatct agctttgaaa tatgaaatac tgtttagcag tgtcacctag aaaagagtgt
6721 ttcaaaatgc tgatgcttca taagaacctt tctcttcaga gttgtttctt ttatctttca
6781 aattagccag ggtgggaaat aaagtgatca cttggtgaag aaatctcaca aagaagaaca
6841 tagagagttc actttcatct ggagtaatga acagattgaa caaactagaa atggttagtc
6901 tgttaaagaa aaggtgtagg tgagctgttt gcaagagcca caagggaaag gggaagacaa
6961 cttctttgtg gacttaaggg tgaaagttgc aagcaggcaa gaccattctg acctccatta
7021 agaaagccct ttccaaccaa caaccactgg gttggttact caggttgggc agcattggga
7081 gcaaatgttg attgaacaaa tgtttgtcag aattgttgac ttaaagagct gttctgtcac
7141 tggggacagc agcagctaga tagccccatt cagggagagg gcatttgttc acctggccag
7201 agatcagagc aggctaaggg actgctggga tcctgtccag ctttgagacc ctacagagcc
7261 atgttcacct agcaggtatc ccttctgagg tcactctcat ttcttacctt attccagggc
7321 tttcacctca gcttgccagg ctggagccaa gggccaaggc agcctcacct tgttggctat
7381 ggtagcttcc caggagcccc ctatggttca ggaacagctc tgcctgcccc atcctgtttg
7441 ctacctccta aagccaaagg cactggtggg ccaggccagc ttctaaagtc acacaaggtt
7501 agaaggttcc tgacaggaag ggcttgaggc caatggaagg aggtacttca gtttccctcc
7561 agatgcccag tgatgggctc agagctcctt gagaacttgg gaaaggaagc agggtctctg
7621 aagaaatact tcaggagtag aaagaggaag ctagagggtt aaatgcacta cacaggaaca
7681 gaaatgagtt tttcttagag ttagtatatg tctagaggtg tagtaaacta aaacaagtct
7741 tgaattgcat acagccactt agggaagaaa tgaaaacctt tgaatattag tgaaaaaagg
7801 gaaactgcaa cccctgtatt actagatagc tttcatcaac agctcaaaac agacagattt
7861 ttataggttt actgtgtgca ctttaataca agggcagtgg ttcagaacta gtcaggtcct
7921 gaaaaggatt taccaaatgt tgagtgtgcc ctctagtgtt cacacttccc agctttcttc
7981 ctataaaggt ggatcaaggc acttgcttac aactggaact gaaatcctcc aagtggaact
8041 agacattgag atggagaaaa tattcattgt ccactgtaat tatgcaagga atatccagtt
8101 gagataatgg acttgcctct tatctaataa tacccaggct caatgggtca ctgctttgtc
8161 cactttgccc aaaattcaag cacagctaag ttgatatttt aggacaaagg cagcttacta
8221 tccagccaga ggggagtaga atatggttaa gagagagtgg aaagaatgaa tgagccctgc
8281 tattcctcac tgcctggatg gctataagca cagcccttat ggaggcctta ggtcttgctt
8341 cataatattc cagtttgaaa agggtttgaa aagacctcct agaaaaatca gtagtttttc
8401 tcttttgagt aacatgtagc aaaaaaaatt tcatcatgta ggtacaggga acaccctaat
8461 aactattaat ctcaaggagt caagccagtg tgtttcctaa tgtatctgct gtatccccat
8521 gaagcaaatt ttgccatcag agaaactgac tcatggggaa aaaatccaag gacctcaaat
8581 caccaaaaga agccattcct cagatttgcc taagcttaag cttccctgtc tctcattgtg
8641 tgttgctttc aatgcagtta cataaatggc ttttttgttt atgcaccaaa aacactaatt
8701 catctgcaaa gctataggtc aaagcaacca tagtatgcac cctgctagct ggcgcattaa
8761 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccttagcgc
8821 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag
8881 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca
8941 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc
9001 gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa
9061 cactcaactc tatctcgggc tattcttttg atttagacct gcaggcatgc aagcttggca
9121 ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc
9181 cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc
9241 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgcgatt tattcaacaa agccgccgtc
9301 ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa
9361 aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata
9421 tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat
9481 ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa
9541 tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc
9601 cggtgagaat ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt
9661 acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg
9721 agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa
9781 ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc
9841 taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg
9901 agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct
9961 gaccatctca tctgtaacat cattggca
ac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc
10021 tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc
10081 gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcttcga
10141 gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc
10201 agacagtttt attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt
10261 ttgagacaca acgtggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat
10321 cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa
10381 ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga
10441 tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctctcga
10501 cggagttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt
10561 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt
10621 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc
10681 agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg
10741 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg
10801 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt
10861 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac
10921 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg
10981 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg
11041 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat
11101 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt
11161 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt
//
イントロンA核酸配列(配列番号:17)
GTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAA
TTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTGGGAAACAAAAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGACAATTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAAGGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCTCAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATTGCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAG
図15
イントロンAを含むFIX39核酸配列(イントロンAに下線)(配列番号:25)
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGAGCCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCTGCTGAATGTACAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTGGGAAACAAAAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGACAATTCAAGGTTTCAGA
AGTATGTAAGGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCTCAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATTGCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAATGCCAACAAAATTCTGAATAGACCAAAGAGGTATAACTCTGGCAAGCTTGAAGAGTTTGTACAGGGGAATCTGGAGAGAGAGTGTATGGAAGAGAAGTGCAGCTTTGAGGAAGCCAGAGAAGTGTTTGAAAATACAGAGAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTGGATGGTGATCAATGTGAGAGCAATCCCTGCTTGAATGGGGGGAGCTGTAAAGATGATATCAACAGCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAGGGGAAAAACTGTGAGCTTGATGTGACCTGTAATATCAAGAATGGCAGGTGTGAGCAATTTTGCAAGAATTCTGCTGATAACAAAGTGGTCTGTAGCTGCACTGAGGGATATAGGCTGGCTGAAAACCAGAAGAGCTGTGAACCTGCAGTGCCTTTTCCCTGTGGGAGAGTGTCTGTGAGCCAAACCAGCAAGCTGACTAGGGCTGAAGCAGTCTTTCCTGATGTAGATTATGTGAATAGCACTGAGGCTGAGACAATCCTTGACAATATCACTCAGAGCACACAGAGCTTCAATGACTTCACCAGGGTGGTAGGAGGGGAGGATGCCAAGCCTGGGCAGTTCCCCTGGCAGGTAGTGCTCAATGGAAAAGTGGATGCCTTTTGTGGAGGTTCAATTGTAAATGAGAAGTGGATTGTGACTGCAGCCCACTGTGTGGAAACTGGAGTCAAGATTACTGTGGTGGCTGGAGAGCACAATATTGAGGAAACTGAGCACACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGGATTATCCCCCACCACAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTACAACCATGACATTGCCCTCCTGGAACTGGATGAACCCCTGGTCTTGAACAGCTATGTGACACCCATCTGTATTGCTGATAAAGAGTACACCAACATCTTCTTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGCTGGGGCAGGGTGTTCCATAAAGGCAGGTCTGCCCTGGTATTGCAGTATTTGAGGGTG
CCTCTGGTGGATAGAGCAACCTGCTTGCTGAGCACCAAGTTTACAATCTACAACAATATGTTCTGTGCAGGGTTCCATGAAGGTGGTAGAGACAGCTGCCAGGGAGATTCTGGGGGTCCCCATGTGACTGAGGTGGAGGGAACCAGCTTCCTGACTGGGATTATCAGCTGGGGTGAGGAGTGTGCTATGAAGGGAAAGTATGGGATCTACACAAAAGTATCCAGATATGTGAACTGGATTAAGGAGAAAACCAAGCTGACTTGA
Claims (129)
- ヒト第IX因子タンパクをコードする核酸配列であって、
前記核酸は、ヒト第IX因子をコードする野生型配列と比較して減少した数のCpGジヌクレオチドを有する核酸配列。 - ヒト第IX因子タンパクをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はプラスミドであって、
前記核酸は、ヒト第IX因子をコードする天然の配列と比較して減少した数のCpGジヌクレオチドを有し、及び/又は、ヒト第IX因子をコードする核酸配列に1つ以上のさらなる配列が、前記ベクター又は前記プラスミドの中に存在する場合に、前記さらなる配列は、任意に、同等の天然の又は野生型の配列と比較して減少した数のCpGジヌクレオチドを有する、発現ベクター又はプラスミド。 - イントロン、発現制御因子、1つ以上のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列をさらに含み、
任意に、前記イントロン、前記発現制御因子、前記アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、及び/又は、前記フィラーポリヌクレオチド配列は、同等の天然の又は野生型の発現制御因子、同等の天然の又は野生型のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、及び/又は、同等の天然の又は野生型のフィラーポリヌクレオチド配列と比較して減少した数のCpGジヌクレオチドを有する、請求項1に記載の、ヒト第IX因子タンパクをコードする核酸配列、請求項2に記載の発現ベクター若しくはプラスミド、又は、請求項3に記載の組成物。 - 前記イントロンが、前記ヒト第IX因子タンパクをコードする配列内に存在するか、又は、
前記発現制御因子が、前記ヒト第IX因子タンパクをコードする配列と作用可能に連結されているか、又は、
前記AAVITRが、前記ヒト第IX因子タンパクをコードする配列の5’末端又は3’末端に隣接しているか、又は、
前記フィラーポリヌクレオチド配列は、前記ヒト第IX因子タンパクをコードする配列の5’末端又は3’末端に隣接している、
請求項4に記載の、ヒト第IX因子タンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より1〜5個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より5〜10個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より10〜15個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より15〜20個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より20〜25個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より25〜30個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より30〜40個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子をコードする天然配列より40〜55個少ない数のCpGジヌクレオチドを有する、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ITR、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、すべてのCpGジヌクレオチドを欠損している、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列は、配列番号:10に対して80%又はそれ以上の同一性を有する配列を含み、凝固分析によって測定される機能する因子IXをコードする、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列は、配列番号:10に対して90%又はそれ以上の同一性を有する配列を含み、凝固分析によって測定される機能する因子IXをコードする、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列は、配列番号:10に対して95%又はそれ以上の同一性を有する配列を含み、凝固分析によって測定される機能する因子IXをコードする、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列は、配列番号:10、配列番号:25又は配列番号:26を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒト第IX因子をコードする天然配列は、配列番号:11に記載されている配列を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記イントロン配列は、配列番号:17に記載されている配列を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記発現制御因子は、配列番号:14に記載されている配列を含むエンハンサー配列を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記発現制御因子は、配列番号:15に記載されている配列を含むプロモーター配列を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記1つ以上のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)の配列は、配列番号:13及び/又は配列番号:20に記載されている配列を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記フィラーポリヌクレオチド配列は、配列番号:21に記載されている配列を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列は、免疫反応を誘導する能力を低下させる、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒトFIXタンパクをコードする配列は、CpGジヌクレオチドの数が減少していないヒト第IX因子をコードする天然配列よりも高いレベル又は該天然配列と同等のレベルで発現される、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記発現制御因子は、恒常的な若しくは制御可能な制御因子、又は、組織特異的な発現制御因子若しくはプロモーターを含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記発現制御因子は、肝臓において発現を与える因子を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記発現制御因子は、ヒトα1−抗トリプシン(hAAT)プロモーター、アポリポタンパクE(ApoE)HCR−1、及び/又は、HCR−2エンハンサーを含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒト第IX因子をコードする核酸配列の3’に配置されたポリアデニル化配列をさらに含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒト第IX因子をコードする核酸配列の3’に配置された前記ポリアデニル化配列は、bGHポリアデニル化配列を含む、
請求項29に記載の、ヒト第IX因子タンパクをコードする核酸配列。 - 前記ヒト第IX因子をコードする核酸配列の3’に配置された前記ポリアデニル化配列は、すべてのCpGジヌクレオチドが除去されたポリアデニル化配列を含む、
請求項29に記載の、ヒト第IX因子タンパクをコードする核酸配列。 - 前記ポリアデニル化配列は、配列番号:19に記載されている配列を含む、
請求項31に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記フィラーポリヌクレオチド配列は、前記ヒトFIXタンパクをコードする配列の3’に配置されている、
請求項4又は請求項5に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記AAVは、前記ヒトFIXタンパクをコードする配列の3’末端に隣接する、
請求項4又は請求項5に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記フィラーポリヌクレオチド配列は、前記ヒトFIXタンパクをコードする配列の3’末端に隣接するAAV ITRの3’に配置されている、
請求項34に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 前記フィラーポリヌクレオチド配列は、ラムダファージ配列を含む、
請求項4又は請求項5に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列。 - 請求項1〜請求項36のいずれかに記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列を含む、ヒトFIXタンパクをコードするプラスミド配列であって、
1つ以上の複製開始点及び/又は抗生物質に対する耐性をコードする核酸をさらに含む、プラスミド配列。 - 配列番号:12又は配列番号:26を含むヒトFIXタンパクをコードするプラスミド配列。
- ヒトFIXタンパク又は発現ベクターをコードする配列を含むウイルスベクターであって、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の、ヒトFIXタンパクをコードする核酸配列を含む、
ウイルスベクター。 - 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項39に記載のウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項39に記載のウイルスベクター。
- 以下のいずれか:
AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74又はAAV−2i8のAAV血清型のITR配列を含む請求項41に記載のAAVベクター。 - 前記ベクターのキャプシド配列は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、又は、AAV−2i8のVP1配列、VP2配列又はVP3に対して90%以上の同一性を有するVP1キャプシド配列、VP2キャプシド配列及び/又はVP3キャプシド配列を含む、
請求項41に記載のAAVベクター。 - 前記ベクターのキャプシド配列は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、又は、AAV−2i8のAAV血清型から選択されるVP1キャプシド配列、VP2キャプシド配列又はVP3キャプシド配列を含む、請求項41に記載のAAVベクター。
- 前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号:1に対して90%以上の配列同一性を有し、若しくは、当該配列において1〜50個のアミノ酸が置換、欠損若しくは付加されたVP1配列;
配列番号:2に対して90%以上の配列同一性を有し、若しくは、当該配列において1〜50個のアミノ酸が置換、欠損若しくは付加されたVP2配列;及び/又は、
配列番号:3に対して90%以上の配列同一性を有し、若しくは、当該配列において1〜50個のアミノ酸が置換、欠損若しくは付加されたVP3配列を含む、
請求項41に記載のAAVベクター。 - 配列ベクターの前記キャプシドは、配列番号:1に記載されているVP1キャプシド配列のアミノ酸位置195、199、201又は202のいずれか1つにおいてアミノ酸置換を有し、又は、
配列番号:1に記載されているVP1キャプシド配列のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸置換を有する、請求項41に記載のAAVベクター。 - 前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号:1に記載されているVP1キャプシド配列のアミノ酸位置195、199、201又は202のいずれか1つにおいてA、V、P又はNアミノ酸のいずれかの残基を有する、請求項41に記載のAAVベクター。
- 前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号:1に記載されているVP1キャプシド配列のアミノ酸位置195のA残基、アミノ酸位置199のV残基、アミノ酸位置201のP残基、又は、アミノ酸位置202のN残基を有する、
請求項41に記載のAAVベクター。 - 前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号:4として記載されたVP1キャプシド配列のアミノ酸位置195のA残基、アミノ酸位置199のV残基、アミノ酸位置201のP残基、又は、アミノ酸位置202のN残基のいずれか2つ、3つ又は4つを有する、
請求項41に記載のAAVベクター。 - 前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号:4−9のいずれかに対して90%以上の同一性を有するVP1キャプシド配列を含む、
請求項41に記載のAAVベクター。 - 前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号:4−9のいずれか含むVP1キャプシド配列を含む、
請求項41に記載のAAVベクター。 - 請求項1〜38のいずれか一項に記載のヒトFIXタンパクをコードする核酸配列、及び/又は、請求項39〜51のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
- 空キャプシドAAVをさらに含む、請求項52に記載の医薬組成物。
- 前記空キャプシドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及びAAV11の血清型AAVから選択される、
請求項53に記載の医薬組成物。 - 配列番号:11又は配列番号:25を含む発現ベクター。
- 配列番号:14に記載されている配列を含むエンハンサー配列をさらに含む、
請求項55に記載の発現ベクター。 - 配列番号:15に記載されている配列を含むプロモーター配列をさらに含む、
請求項55に記載の発現ベクター。 - 配列番号:12又は配列番号:26に記載されている上流の及び/又は下流のAAV2
ITRをさらに含み、
前記上流のITRが、前記エンハンサーの5’に配置されており、及び/又は、前記下 流のAAV2 ITRが、配列番号12又は26に記載されているhFIXエクソン2〜8の3’に配置されている、
請求項55に記載の発現ベクター。 - 配列番号:12又は26に記載されているhFIXエクソン2〜8の3’に配置され、かつ、前記下流のAAV2 ITRの5’に配置されたpolyA配列をさらに含む、
請求項55に記載の発現ベクター。 - 請求項55〜59のいずれか1項に記載の発現ベクターを含むAAVベクター。
- 前記キャプシド配列は、配列番号:4−9のいずれかを含むVP1キャプシド配列を含む、
請求項60に記載のAAVベクター。 - 細胞中に核酸配列を届け又は移す方法であって、
前記細胞の遺伝子導入を可能にする条件下で、請求項1〜61のいずれかに記載の核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターを哺乳動物細胞と接触させ、それによって前記哺乳動物細胞中に核酸配列を届け又は移すステップを含む、方法。 - 哺乳動物又は哺乳動物の細胞の中に核酸配列を届け又は移す方法であって、
請求項1〜61のいずれかに記載の核酸配列、発現ベクター、又は、ウイルスベクターを哺乳動物又は哺乳動物の細胞に投与し、それによって前記哺乳動物又は前記哺乳動物の細胞の中に前記核酸配列を届け又は移すステップを含む、方法。 - 第IX因子タンパクの必要がある哺乳動物を治療する方法であって、
(a)核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターを提供するステップと、
(b)請求項1〜61のいずれかに記載の核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターの所定量を前記哺乳動物に投与するステップを含み、
前記第IX因子が前記哺乳動物中で発現される、方法。 - 前記哺乳動物の細胞、組織又は器官において前記第XI因子タンパクが発現される、
請求項62〜64のいずれかに記載の方法。 - 前記細胞が分泌細胞を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記細胞が内分泌細胞を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記細胞が、肝細胞、神経系細胞、膠細胞、網膜細胞、上皮細胞、肺細胞、又は、分化全能性の、複数分化性の若しくは多能性の幹細胞を含む、
請求項65に記載の方法。 - 前記哺乳動物の組織又は器官が、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、目、網膜又は肺を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、不充分な量の第IX因子タンパク、又は、不完全な若しくは異常な第IX因子タンパクを生産する、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - 前記哺乳動物が血友病Bを有する、請求項62〜69のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターは、
静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経口、挿管によって、カテーテルによって、皮膚、頭蓋内、吸入によって、腔内、又は、粘膜の経路で哺乳動物に届けられる、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項62〜69のいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳動物は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11又はAAV−Rh74の血清型に対して血清反応ポジティブ又は血清反応ネガティブである、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - 空キャプシドAAVを投与するステップをさらに含む、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及び/又はAAV−Rh74の血清型の空キャプシドを投与するステップをさらに含む、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - 投与されたAAVベクターと同じ血清型の空キャプシドAAVを投与するステップをさらに含む、請求項62〜69のいずれかに記載の方法。
- 前記第IX因子タンパクが、前記哺乳動物に対して治療効果を有するレベルで前記哺乳動物において発現される、請求項62〜69のいずれかに記載の方法。
- 前記の第IX因子タンパクは、哺乳動物において、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日、数週間、又は、数ヶ月間に亘って治療効果を有するレベルで発現される、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第IX因子タンパクは、哺乳動物において、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日の連続した日、数週間、又は、数か月に亘って、約20%のFIX活性又は20%を超える活性のレベルで存在する、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ウイルスベクターは、哺乳動物1キログラム当たり、概ね、1×1010〜1×1011、1×1011〜1×1012、1×1012〜1×1013、又は、1×1013〜1×1014のベクターゲノム(vg/kg)の範囲内の用量で投与される、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - 前記ウイルスベクターは、哺乳動物1キログラム(vg/kg)当たり1×1012ベクターゲノム未満の用量で投与され、その哺乳動物において、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って、約20%の活性又は20%を超える活性のレベルで第IX因子タンパクが生産される、
請求項62〜69のいずれかに記載の方法。 - 前記ウイルスベクターは、哺乳動物1キログラム(vg/kg)当たり約5×1011ベクターゲノムの用量で投与され、その哺乳動物において、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日、数週間又は数ヶ月間に亘って、約20%の活性又は20%を超える活性のレベル第IX因子タンパクが生産される、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物に投与される核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターは、第IX因子タンパク及び/又はウイルスベクターに対する本質的な免疫反応を生じない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 第IX因子タンパク及び/又は前記ウイルスベクターに対する本質的な免疫反応は、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って生じない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、第IX因子タンパクに対する本質的な免疫反応を生じない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、第IX因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分な、第IX因子タンパクに対する免疫反応を発達させない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日、数週間又は数ヶ月間に亘って、第IX因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分な第IX因子タンパクに対する本質的な免疫反応を生じない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記の哺乳動物は、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13若しくは14日の連続した日、数週間又は数ヶ月に亘って、第IX因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分な第IX因子タンパクに対する免疫反応を発達させない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、第IX因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分なAAVベクターに対する免疫反応を発達させない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日の連続した日、数週間、又は、数ヶ月間に亘って、第IX因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分なAAVベクターに対する免疫反応を発達させない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第IX因子タンパクは、前記哺乳動物において、免疫抑制剤(例えば、ステロイド)を投与することなく、前記哺乳動物に治療効果を有する量又は活性レベルで発現される、請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第IX因子タンパクは、前記哺乳動物において、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13若しくは14日、数週間又は数ヶ月に亘って、免疫抑制剤(例えば、ステロイド)を投与することなく、治療効果を有する量で又は活性レベルで発現される、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って、肝臓のALT酵素、AST酵素及び/又はLDH酵素の異常に高い値を生じない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳動物は、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って、免疫抑制剤(例えば、ステロイド)を使用することを必要とする肝臓のALT酵素、AST酵素及び/又はLDH酵素の異常に高い値を生じない、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第IX因子タンパクは、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日、数週間又は数ヶ月間に亘って、自然に生じる間接出血又は脳出血の期間、重症度又は頻度を低減するために必要とされるFIXの血中濃度より高いレベルで哺乳動物において発現される、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第IX因子タンパクは、少なくとも、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日若しくは14日、数週間又は数ヶ月間に亘って、AAVベクター投与後に組み換えFIXタンパクを必要とすることがない又は投与されることないレベルで哺乳動物において発現される、
請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。 - 血友病Bを治療するための組み換えAAVベクターであって、
前記組み換えAAVベクターは、キャプシド及びゲノムを含み、
前記キャプシドは配列番号:4のアミノ酸配列を有するVP1タンパクを含み、
前記ゲノムは単鎖であり、5’から3’の順序で、
(a)第1のAAV2 ITR
(b)ApoE HCR−1エンハンサー
(c)AATプロモーター
(d)ヒト第IX因子Paduaをコードするコドン最適化された核酸であって、前記核
酸は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを欠損しているか、そうでなければ存在しているもの
(e)ポリアデニル化配列
(f)第2のAAV2 ITR
の因子を含む、組み換えAAVベクター。 - 請求項98に記載のrAAVベクターであって、
(a)第1のAAV2 ITRの核酸配列は、配列番号:12のヌクレオチド1〜141からなり、
(b)ApoE HCR−1エンハンサーの核酸配列は、配列番号:12のヌクレオチド152〜472からなり、
(c)ATTプロモーターの核酸配列は、配列番号:12のヌクレオチド482〜878からなり、
(d)ヒト第IX因子Padua変異体をコードする前記核酸の核酸配列は、配列番号:12のヌクレオチド908〜3731からなり、
(e)前記のポリアデニル化配列の核酸配列は、配列番号:12のヌクレオチド3820〜4047からなり、
(f)前記第2のAAV2 ITRの核酸配列は、配列番号:12のヌクレオチド4097〜4204からなる。 - 前記ゲノムが、配列番号:12のヌクレオチド1〜4204に対応する核酸配列を含む、請求項99に記載のrAAVベクター。
- 請求項98又は99のいずれか1項に記載の治療的有効量のrAAVベクターを前記被検体に投与するステップを含む、血友病Bを有するヒト被検体を治療する方法。
- 前記の被検体が重度の血友病Bを有し、前記治療が血友病Bの症状を重度から中程度又は軽度に緩和するのに有効である、請求項101に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、正常なFIX活性の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%又は50%である血漿FIX活性のレベルを達成するのに有効である、請求項101に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月、17か月、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年又は5年の持続時間に亘って、血漿FIX活性の前記レベルを達成するのに有効である、請求項103に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、6か月、1年、2年、3年、4年又は5年の持続時間に亘って少なくとも1%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、6か月、1年、2年、3年、4年又は5年の持続時間に亘って少なくとも5%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、6か月、1年、2年、3年、4年又は5年の持続時間に亘って少なくとも10%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、6か月、1年、2年、3年、4年又は5年の持続時間に亘って少なくとも20%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、6か月、1年、2年、3年、4年又は5年の持続時間に亘って少なくとも30%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記の治療は、少なくとも、6か月、1年、2年、3年、4年又は5年の持続時間に亘って少なくとも40%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記治療は、少なくとも、6か月の持続時間に亘って少なくとも20%の血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項104に記載の方法。
- 前記AAVベクターの治療的有効量が、約5.0×1011vg/kgである請求項111に記載の方法。
- 前記治療は、重度の血友病Bを有する平均的ヒト被検体が、適切な止血を維持するためのFIXタンパク置換療法を必要とする頻度を、概ね、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%低減するのに有効である、請求項101に記載の方法。
- 前記治療は、重度の血友病Bを有する治療されていない平均的ヒト被検体と比較して、重度の血友病Bを有するヒト被検体の関節中への自然出血の頻度を、概ね、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%低減するのに有効である、請求項101に記載の方法。
- 前記AAVベクターは、投与の少なくとも4週間後に測定した場合、キャプシドに対して、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15又は1:20以下の抗体価をもたらす、請求項103に記載の方法。
- 前記AAVベクターは、ELISPOT分析を使用して測定したときに、投与の少なくとも4週以降に測定した場合、キャプシドに対するT細胞免疫反応が、100万PBMC当たり、10、20、30、40、50、100、200、300、400又は500以下のスポット・フォーミング・ユニットをもたらす、請求項103に記載の方法。
- 前記AAVベクターは、肝臓酵素の上限の正常(ULN)値の0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%又は500%以下の上昇した肝臓酵素レベルをもたらす、請求項103に記載の方法。
- 前記酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)又は乳酸脱水素酵素(LDH)である、請求項117に記載の方法。
- 前記治療は、ベクターを投与した後少なくとも8週間以降に測定した場合、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1未満の標準偏差で、少なくとも、正常値の1%、5%、10%、20%、30%又は40%である平均血漿FIX活性を達成するのに有効である、請求項101に記載の方法。
- 前記のAAVベクターが、空キャプシドを含む医薬組成物の中に投与され、
前記空キャプシドが、配列番号:4のアミノ酸配列を有するVP1タンパクを含む、
請求項101−119のいずれか1項に記載の方法。 - 前記AAVベクターに対する前記空キャプシドの比率は、概ね、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1又は10:1である、請求項120に記載の方法。
- 配列番号:12の1〜4204から得た核酸配列と同一の隣接する核酸配列を含むホスト細胞。
- AAV Repタンパク、AAVキャプシドタンパク、及び、アデノウイルス・ヘルパー・タンパクをさらに含む、請求項122に記載のホスト細胞。
- 前記AAVキャプシドタンパクが、配列番号:4を含む又は当該配列番号に対して90%以上の同一性を有する配列を含む、請求項123に記載の宿主細胞。
- 前記ホスト細胞がFIXPaduaタンパクを発現する、請求項123に記載のホスト細胞。
- 配列番号:12の1〜4204の核酸配列を含むAAVベクターを生産する方法であって、
配列番号:12の1〜4204に由来する核酸配列をAAV粒子中に詰め込むことを可能にする条件下で請求項123に記載のホスト細胞をインキュベートし、それによってAAVベクターを生産するステップを含む、方法。 - そのように生産されたAAVベクターを、精製又は分離するステップをさらに含む、請求項126に記載の方法。
- 請求項126に記載の方法によって生産されたAAVベクター。
- 請求項127に記載の方法によって生産、分離又は精製されたAAVベクター。
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