KR102178322B1 - 변형된 인자 ix, 및 세포, 기관 및 조직으로 유전자를 전달하기 위한 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

변형된 인자 ix, 및 세포, 기관 및 조직으로 유전자를 전달하기 위한 조성물, 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 인자 IX 코딩 서열, 발현 카세트, 벡터 예컨대, 바이러스(예를 들어, 렌티- 또는 아데노-관련 바이러스) 벡터, 및 유전자 전달 방법 및 용도에 관한 것이다. 특히, 인자 IX 핵산을 인자 IX의 발현(전사)을 위한 세포, 조직 또는 기관 내로 표적화시키는 것에 관한 것이다.

Description

변형된 인자 IX, 및 세포, 기관 및 조직으로 유전자를 전달하기 위한 조성물, 방법 및 용도
관련 출원
본 특허 출원은 2015년 6월 23일 출원된 미국 특허 출원 제 62/183,599, 2016년 3월 30일 출원된 출원 번호 제 62/315,453호, 2016년 5월 18일 출원된 출원 번호 제 62/338,315호, 2016년 6월 10일 출원된 출원 번호 제 62/348,781호 및 2016년 6월 13일 출원된 출원 번호 제 62/349,572호의 이익을 청구하며, 이들 출원 모두는 그 전체가 분명히 본원에 참조로 포함된다.
도입
바람직한 유전자의 부재 또는 결함 (기능 상실) 또는 바람직하지 않거나 결함이 있는 유전자의 발현 (기능 획득)에 의해 초래되는 유전자 장애는 다양한 질병을 유발한다. 기능 손실 유전자 장애의 한 예는 혈우병으로서, 응고인자 VIII (FVIII, 혈우병 A) 또는 인자 IX(FIX, 혈우병 B)의 결핍에 의해 초래된 유전 출혈 장애이다. 기능 획득 유전자 장애의 한 예는 헌팅턴병으로서, 특히, 기저핵 및 대뇌 피질의 뉴론 내에서 축적되어 뉴론의 점진적 파괴를 초래하는 변이된 단백질을 인코딩하는 병리학적 "HTT" 유전자 (헌팅턴 단백질을 인코딩함)에 의해 초래되는 질병이다.
현재 혈우병 치료는 출혈 발생시 요구에 따라 또는 예방적으로 재조합 응고 인자를 정맥 내 투여하는 것으로 구성된다. 그러나, 이러한 치료학적 접근법에는 반복적인 주입의 필요성, 치료 비용, 항-치료 인자 면역 반응의 발달 위험성, 및 잠재적으로 치명적인 출혈의 위험성과 같은 수개의 단점이 있다. 이러한 한계는 혈우병에 대한 유전자-기반 치료법의 개발을 촉발시켰다. 이를 위해, 혈우병은 유전자 전달에 기초한 요법에 이상적인데, 1) 정상의 단지 1%를 넘는 수준이 이미 중증 내지 중등증의 표현형 변화를 발생시킬 수 있으며, 100%의 수준은 어떠한 부작용과도 관련되지 않기 때문에 치료 범위가 매우 광범위하며; 2) 치료학적 전이유전자의 조직 특이적 발현이 엄격히 요구되지 않으며; 3) 치료 효능의 종점을 측정하는데 상당한 경험이 존재하기 때문이다.
최근에는, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터가 생체내에서 유전자 전달을 위한 최고의 안전성 및 효능 프로파일을 갖기 때문에 선택되는 유전자 전달 벡터로서 인식된다. 지금까지 분리된 AAV 혈청형 중, AAV2 및 AAV8은 중증의 혈우병 B에 감염된 인간의 간을 표적으로 하는데 사용되어 왔다.
개요
본 발명은 핵산이 인자 IX (예를 들어, 인간 인자 IX)를 인코딩하는, 핵산 서열, 발현 벡터(예를 들어, 벡터 게놈) 및 플라스미드, 조성물 및 바이러스 벡터를 제공한다. 인자 IX를 인코딩하는 핵산은 비교 FIX 코딩 서열과 비교하여 CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된다. 특정 구체예에서, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산은 인간 인자 IX를 인코딩하는 야생형 또는 천연 서열 대비 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 갖는다.
CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 인자 IX 예컨대, FIX를 인코딩하는 변형된 핵산은 벡터 예컨대, 바이러스 벡터 내에 포함될 수 있다. 대표적인 바이러스 벡터는 예를 들어, 기타 세포 유형 중 간의 간세포를 표적으로 하는 렌티- 및 파르보-바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터)를 포함한다. 핵산 서열 전달을 위한 벡터로서, AAV 벡터는 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진한다. 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 예컨대, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산은 선택적으로 치료학적 수준으로 투여 후 발현될 수 있다.
따라서, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 특정 구체예에서, 재조합 AAV 입자는 벡터 게놈을 캡시드화 또는 패키징한다. 본 발명의 재조합 AAV 입자는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)을 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 포함한다. 한 구체예에서, CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈은 AAV 캡시드 또는 AAV 캡시드 변이체에 의해 캡시드화 또는 패키징된다.
본 발명의 재조합 AAV 벡터에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 전사되고 후속하여 단백질로 번역될 수 있다. 다양한 양태에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 치료학적 단백질을 인코딩한다. 특정 양태에서, 단백질은 혈액 응고 인자 (예를 들어, 인자 IX, 인자 XIII, 인자 X, 인자 VIII, 인자 VIIa, 또는 단백질 C)이다. 더욱 특정 양태에서, 벡터는 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산 (예를 들어, CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)을 포함한다.
AAV 및 AAV 변이체 예컨대, 캡시드 변이체는 바람직한 또는 치료학적 이점을 제공하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질을 전달하여, 다양한 질병을 치료할 수 있다. 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 및 이들의 변이체 및 AAV 캡시드 변이체 (예를 들어, 4-1)는 혈우병 A, B 등을 치료하기 위한 치료학적 유전자(예를 들어, 인자 IX)를 세포, 조직 및 기관에 전달하는데 유용한 벡터이다.
본 발명에서, 벡터 게놈 (바이러스 또는 AAV)을 포함(캡슐화, 패키징)하는 재조합 바이러스 및 AAV 벡터는 시스 또는 트랜스로 기능하는 추가적인 요소를 포함한다. 특정 구체예에서, 벡터 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터는 또한 하기를 갖는다: 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)의 5' 또는 3' 말단에 측면인접한 하나 이상의 역방위 말단 반복부(ITR) 서열; 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)의 전사를 추진하는 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서), 예컨대, 항시적 또는 조절가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소; 인트론 서열, 스터퍼 또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열; 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 폴리-아데닐화 서열.
따라서, 벡터는 인트론, 발현 조절 요소 (예를 들어, 예컨대, 간 발현을 위한, 항시적 또는 조절가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터 예를 들어, 인간 α1-항-트립신(hAAT) 프로모터 및/또는 아포지질단백질 E(ApoE) HCR-1 또는 HCR-2 인핸서), 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복부(ITR) (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형의 ITR 서열) 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 첨가 요소의 위치는 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 인트론은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 서열 내부에 있으며/거나 발현 조절 요소는 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되고/거나 AAV ITR(들)은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 서열의 5' 또는 3' 말단에 측면인접하고/거나 여기에서, 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 서열의 5' 또는 3' 말단에 측면인접한다.
다양한 구체예에서, CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX 핵산은 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연 또는 야생형 서열보다 1-5개 더 적은, 5-10개 더 적은, 10-15개 더 적은, 15-20개 더 적은, 20-25개 더 적은, 25-30개 더 적은, 30-40개 더 적은, 40-55개 더 적은, 55-75개 더 적은, 75-100개 더 적은, 100-150개 더 적은, 150-200개 더 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 제시된 변형된 FIX 핵산은 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 갖지 않는 인간 인자 IX를 인코딩하는 야생형 또는 천연 서열보다 높은 수준으로 또는 이와 유사하게 발현되는 인간 FIX 단백질을 인코딩한다.
추가의 구체예에서, 인트론, 발현 조절 요소 (예를 들어, 예컨대, 간 발현을 위한, 항시적 또는 조절가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터 예를 들어, 인간 α1-항-트립신(hAAT) 프로모터 및/또는 아포지질단백질 E(ApoE) HCR-1 또는 HCR-2 인핸서), 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복부(ITR) (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형의 ITR 서열) 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 대응되는 천연 또는 야생형 발현 조절 요소, 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복부(ITR) 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열 대비 CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수가 감소되도록 변형될 수 있다. 특정 양태에서, 발현 조절 요소, 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방향 말단 반복부(ITR) 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 또는 야생형 상대 서열 보다 1-5개 더 적은, 5-10개 더 적은, 10-15개 더 적은, 15-20개 더 적은, 20-25개 더 적은, 25-30개 더 적은, 30-40개 더 적은, 40-55개 더 적은, 55-75개 더 적은, 75-100개 더 적은, 100-150개 더 적은, 150-200개 더 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖는다.
예시적인 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 임의의 것의 AAV 캡시드 서열, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 캡시드 변이체를 포함한다. 본 발명의 재조합 AAV 입자는 또한, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 및 이의 변이체를 포함한다. 특정 캡시드 변이체는 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 캡시드 변이체, 예컨대, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입/추가를 갖는 캡시드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 치환은 Rh74 VP1 캡시드 서열(SEQ ID NO:1), 예를 들어, 아미노산 위치 195, 199, 201 또는 202번 중 어느 하나에서 이루어진다. 더욱 특정 양태에서, 치환된 잔기는 Rh74 VP1 캡시드 서열의 아미노산 위치 195, 199, 201 또는 202번 중 어느 하나에서 A, V, P 또는 N 아미노산에 상응한다. 추가의 특정 양태에서, 캡시드 서열은 Rh74 VP1 캡시드 서열의 아미노산 위치 195번에서 A 잔기; 아미노산 위치 199번에서 V 잔기, 아미노산 위치 201번에서 P 잔기, 또는 아미노산 위치 202번에서 N 잔기를 갖는다. 추가의 특정 양태에서, 캡시드 서열은 하기 중 임의의 2개, 3개 또는 4개 모두를 갖는다: Rh74 VP1 캡시드 서열의 아미노산 위치 195번에서 A 잔기; 아미노산 위치 199번에서 V 잔기, 아미노산 위치 201번에서 P 잔기, 또는 아미노산 위치 202번에서 N 잔기.
더욱 특정 양태에서, 캡시드 변이체는 SEQ ID NO:4-9 중 임의의 서열을 포함한다. 추가의 구체예에서, AAV 벡터는 임의의 AAV 혈청형 중 임의의 VP1, VP2 및/또는 VP3와 90% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 서열을 갖는 캡시드 서열을 갖는다. 특정 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 갖는 캡시드 서열을 갖는다. 더욱 특정 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 선택된 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 서열을 갖는 캡시드 서열을 갖는다.
추가의 구체예에서, 재조합 벡터 게놈은 CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산 및 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산은 약 4.7kb 보다 짧은 길이를 갖는다. 추가의 특정 양태에서, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산은 4.7kb 미만의 길이를 가지며, 하나 이상의 AAV ITR에 의해 측면인접하거나 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 내부에 위치한다. 추가의 특정 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산과 조합될 경우 인자 IX 인코딩 핵산 서열 및 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열의 합친 총 길이가 약 3.0-5.5kb, 또는 약 4.0-5.0kb, 또는 약 4.3kb - 4.8kb가 되는 길이를 갖는다.
필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터의 기능 또는 활성을 방해하지 않도록 임의의 요망되는 위치에서 벡터 서열 내에 위치할 수 있다. 한 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 감소된 수의 CpG(시토신-구아닌) 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX 인코딩 핵산 서열의 각 5' 및/또는 3' 말단에 측면인접한 5' 및/또는 3' ITR (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 ITR, 및 이들의 변이체) 사이에 위치한다. 또 다른 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX 인코딩 핵산 서열의 각 5' 및/또는 3' 말단에 측면인접한 5' 및/또는 3' ITR 내부에 위치한다. 추가의 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX 인코딩 핵산 서열의 각 5' 및/또는 3' 말단에 측면인접한 5' 및/또는 3' ITR에 인접하게 위치한다. 추가의 양태에서, 예를 들어, 게놈 핵산 내부의 인트론과 유사한 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산 내부에 위치한다.
따라서, 다양한 구체예에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 AAV ITR 서열에 인접하게 위치하거나; 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 내부에 위치하거나; 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 외부에 위치하거나; 2개의 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서, 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 내부에 위치한 제1 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열, 및 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 외부에 위치한 제2 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열이 존재한다.
더욱 특정 양태에서, 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 내부에 위치할 때 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산과 조합될 경우, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열의 합친 총 길이가 약 3.0kb-5.5kb, 약 4.0-5.0kb, 또는 약 4.3kb-4.8kb가 되는 길이를 갖는다. 기타 더욱 특정 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 2개의 아데노-관련 바이러스(AAV) ITR 서열 외부에 위치할 때 4.7kb 초과, 약 5.0-10.0kb, 또는 약 6.0-8.0kb의 길이를 갖는다.
전형적으로, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 불활성 또는 무해성이며, 기능 또는 활성을 갖지 않는다. 다양한 특정 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리아 폴리뉴클레오티드 서열이 아니며, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열이 아니며, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산), AAV 역방위 말단 반복부(ITR) 서열, 발현 조절 요소, 복제 기점, 선택 마커 또는 폴리-아데닐화(폴리-A) 신호 서열 중 임의의 것과 구별되는 서열이다.
다양한 추가적인 특정 양태에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)과 관련되거나 관련되지 않은 인트론 서열이다. 특정 양태에서, 인트론 서열은 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산) 내부에 위치한다. 기타 특정 양태에서, 인트론 서열은 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)과 관련되는데, 인트론이 게놈 DNA, 예컨대, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)에 의해 또한 인코딩된 단백질을 인코딩하는 게놈 DNA에 존재하기 때문이다.
본 발명의 재조합 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 및 재조합 AAV 벡터 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 변이체 예컨대, 캡시드 변이체(예를 들어, 4-1) 입자가 세포 내부에 포함될 수 있다. 이러한 구체예에서, 세포는 바이러스(AAV) 입자를 생성하거나 용해되어 바이러스(AAV) 입자를 생성할 수 있는 패키징 세포, 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 발현이 요망되는 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 변형된 인자 IX 인코딩 핵산, 벡터 및 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 및 변이체(예를 들어, 예컨대, 4-1) 입자를 포함하는 세포가 제공된다.
추가의 구체예에서, 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 핵산(여기에서 상기 핵산은 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연 서열 대비 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 가짐), 또는 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 플라스미드(여기에서, 상기 핵산은 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연 서열 대비 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 가짐)가 조성물에 포함된다. 특정 양태에서, 이러한 핵산 서열은 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 및 벡터 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 변이체(예를 들어, 4-1) 입자가 약학적 조성물 내부에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 및 바이러스 입자 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 및 벡터(예를 들어, AAV) 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 변이체(예를 들어, 4-1)의 대상체로의 투여에 유용하다.
본 발명의 재조합 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 및 벡터 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 변이체(예를 들어, 4-1) 입자가 다양한 방법 및 용도에 사용될 수 있다. 따라서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)을 유기체 또는 세포 예컨대, 포유동물 또는 포유동물의 세포 내로 전달하거나 이동시키기 위한 방법 및 용도가 제공된다.
한 구체예에서, 방법 또는 용도는 포유동물 또는 포유동물의 세포 내로 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 전달하거나 이동시키기에 적합한 조건하에 포유동물 또는 포유동물의 세포에 벡터 게놈(캡시드화, 패키징) 중의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산) 입자를 포함하는 렌티- 또는 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 또는 변이체를 투여하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 방법 또는 용도는 이종성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)를 포유동물 및/또는 세포 내로 전달/이동시킨다. 또 다른 양태에서, 방법은 이종성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)의 세포 내로의 전달/이동을 허용하고, 후속 전사에 의해 전사물을 형성시키고 후속 번역하여 유전자 생성물(예를 들어, 인자 IX)을 형성시킨다.
추가의 구체예에서, 단백질 발현 또는 기능이 결핍되거나 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 포유 동물)을 치료하는 방법 또는 용도는 렌티- 또는 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 또는 변이체, 복수의 이러한 바이러스(예를 들어, AAV) 입자, 또는 렌티- 또는 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 또는 변이체, 입자 또는 복수의 이러한 바이러스(예를 들어, AAV) 입자의 약학적 조성물을 제공하고; 바이러스 입자, 복수의 바이러스 입자, 또는 바이러스 입자 또는 복수의 바이러스 입자의 약학적 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에 투여하는 것을 포함한다. 이렇게 투여된 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)은 후속하여 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 발현될 수 있다.
투여 또는 전달을 위한 방법 및 용도는 대상체에 적합한 임의의 방식을 포함한다. 특정 구체예에서, 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 및 변이체, 또는 복수의 이러한 바이러스 입자는 비경구적으로 예컨대, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 또는 카테터를 통해 투여 또는 전달된다.
대상체는 포유동물 예컨대, 인간 및 비-인간(예를 들어, 영장류)를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 유익을 얻거나 이의 발현을 필요로 한다. 더욱 특정 구체예에서, 대상체 예를 들어, 감소된 양의 인자 IX를 발현하는 대상체 예컨대, 혈우병 B를 갖는 대상체는 인자 IX 발현 또는 기능으로부터 유익을 얻을 것이다.
본 발명에 따르면, 벡터 게놈을 포함(캡시드화, 패키징)하는 재조합 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 및 변이체를 생성하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 패키징 세포 내로 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 플라스미드를 도입시켜 생산성 바이러스 감염을 유도하고; 재조합 바이러스 입자를 생성하기 위한 조건하에서 패키징 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터가 오염 핵산을 포함하는, 감소된 양의 재조합 바이러스 입자를 갖는 재조합 바이러스 또는 AAV 입자를 생성하는 방법은 패키징 세포 내로 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 플라스미드를 도입시키고; 재조합 바이러스 입자를 생성하기 위한 조건하에서 패키징 세포를 배양시키는 것을 포함하며, 생성된 재조합 바이러스 입자는 재조합 바이러스 벡터에 필러 또는 스퍼터 폴리뉴클레오티드 서열이 부재하는 조건하에 생성된 오염 핵산을 함유하는 바이러스 입자 수와 비교하여 오염 핵산을 함유하는 벡터 게놈을 갖는 감소된 수의 바이러스 입자를 갖는다. 특정 양태에서, 오염 핵산은 박테리아 핵산; 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 ITR, 프로모터, 인핸서, 복제 기점, 폴리-A 서열, 또는 선택 마커 이외의 서열이다.
패키징 세포는 포유동물 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 패키징 세포는 (이종성 폴리뉴클레오티드) 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산), 발현 벡터(예를 들어, 벡터 게놈)를 바이러스 입자(예를 들어, AAV 입자) 내로 패키징시키는 헬퍼(예를 들어, AAV) 기능을 포함한다. 특정 양태에서, 패키징 세포는 AAV Rep 및/또는 Cap 단백질(예를 들어, Rep78 또는/및 Rep68 단백질)을 제공하고/거나; 패키징 세포는 Rep 및/또는 Cap 단백질 서열(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염되고/거나; 패키징 세포는 Rep78 및/또는 Rep68 단백질 폴리뉴클레오티드 인코딩 서열(들)로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염된다.
본 발명에서, 재조합 렌티- 또는 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터, 및 동반된 시스 (예를 들어, 발현 조절 요소, ITR, 폴리A) 또는 트랜스(예를 들어, 캡시드 단백질, 패키징 기능 예컨대, Rep/Cap 단백질) 요소는 임의의 유기체, 종, 균주 또는 혈청형을 기반으로 할 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 입자는 전형적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 및 이의 변이체를 기반으로 하나, 또한 다양한 혈청형의 하이브리드 또는 키메라를 포함한다. 대표적인 AAV 혈청형은 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8 혈청형을 포함한다. 따라서, 벡터 게놈을 포함하는 본 발명의 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 입자는 상이한 혈청형, 혈청형의 혼합물, 또는 상이한 혈청형의 하이브리드 또는 키메라로부터의 캡시드 단백질 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 혈청형의 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 렌티- 및 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8, 서열, 플라스미드, 벡터 게놈은 어느 하나의 혈청형, 혈청형의 혼합물, 또는 상이한 혈청형의 하이브리드 또는 키메라로부터의 요소를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및/또는 AAV-2i8 혈청형, 또는 상기 AAV 혈청형 중의 임의의 혈청형의 혼합물, 하이브리드 또는 키메라로부터 유래된 ITR, Cap, Rep, 및/또는 서열을 포함한다.
도 1은 Rh74 VP1의 아미노산 서열을 보여준다.
도 2은 Rh74 VP2의 아미노산 서열을 보여준다.
도 3은 Rh74 VP3의 아미노산 서열을 보여준다.
도 4는 캡시드 변이체 4-1 VP1 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
도 5는 캡시드 변이체 15-1의 아미노산 서열을 보여준다.
도 6은 캡시드 변이체 15-2의 아미노산 서열을 보여준다.
도 7은 캡시드 변이체 15-3/15-5의 아미노산 서열을 보여준다.
도 8은 캡시드 변이체 15-4의 아미노산 서열을 보여준다.
도 9는 캡시드 변이체 15-6의 아미노산 서열을 보여준다.
도 10은 FIX39의 핵산 서열을 보여준다.
도 11은 FIX19의 핵산 서열을 보여준다.
도 12a는 FIX39 플라스미드의 서열을 보여준다.
도 12b는 phFIX39v2 플라스미드의 서열을 보여준다.
도 13은 FIX39 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 14는 인트론 A 핵산 서열을 보여준다.
도 15는 FIX39 + 인트론 A의 핵산 서열을 보여준다.
도 16은 시험관 내 환경에서 분석한 AAV-4-1 캡시드 변이체(SEQ ID NO:4)의 형질도입 효율을 보여준다.
도 17은 1x1011 또는 1x1012 vg/kg의 AAV-FIX39-Padua(정사각형/원형) 및 AAV-FIX19-Padua (마름모/육각형)로 생후 8주째에 정맥 내 주사 후 야생형 마우스의 혈장에서의 hFIX 수준을 보여준다. 인간 FIX 혈장 수준은 ELISA에 의해 검정하였고, 연구 과정 동안 동일한 군의 동물에 대해 연속 출혈에 의해 얻어진 다중 측정치를 나타낸다 (각 집단에서 n = 5 마우스). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 의미한다.
도 18은 5㎍의 pFIX19-Padua 또는 pFIX39-Padua 플라스미드의 유체역학적 꼬리 정맥 주입 후 24시간에 마우스 혈장에서 인간 FIX의 순환 수준을 보여준다. P=0.3337.
도 19는 본 발명에 따른 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 4명의 인간 혈우병 B 환자, 및 후속 평가 기간(각각, 183, 102, 69 및 50일)에 걸친 FIX 활성 (%)의 데이터 요약을 보여준다.
도 20a는 183일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제1의 인간 혈우병 B 환자의 FIX 활성(%) 데이터를 보여준다.
도 20b는 183일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제1의 인간 혈우병 B 환자의 간 기능 검사(ALT, AST 및 LDH 효소) 데이터를 보여준다. 플롯팅된 LDH 값(LDH1)을 ALT 및 AST 값과 표시하기 위해 10으로 나누었다.
도 21a는 102일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제2의 인간 혈우병 B 환자의 FIX 활성(%) 데이터를 보여준다.
도 21b는 102일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제2의 인간 혈우병 B 환자의 간 기능 검사(ALT, AST 및 LDH 효소) 데이터를 보여준다. 플롯팅된 LDH 값(LDH1)을 ALT 및 AST 값과 표시하기 위해 10으로 나누었다.
도 22a는 69일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제3의 인간 혈우병 B 환자의 FIX 활성(%) 데이터를 보여준다.
도 22b는 69일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제3의 인간 혈우병 B 환자의 간 기능 검사(ALT, AST 및 LDH 효소) 데이터를 보여준다. 플롯팅된 LDH 값(LDH1)을 ALT 및 AST 값과 표시하기 위해 10으로 나누었다.
도 23a는 50일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제4의 인간 혈우병 B 환자의 FIX 활성(%) 데이터를 보여준다.
도 23b는 50일 평가 기간에 걸쳐 AAV-FIX Padua 변이체(FIX39) 보유 벡터가 단일 주입으로 투여된 제4의 인간 혈우병 B 환자의 간 기능 검사(ALT, AST 및 LDH 효소) 데이터를 보여준다. 플롯팅된 LDH 값(LDH1)을 ALT 및 AST 값과 표시하기 위해 10으로 나누었다.
도 24a는 인간 대상체에서 AAV-FIX39-Padua의 낮은 면역원성 프로파일을 보여준다.
도 24b는 인간 대상체에서 AAV-FIX39-Padua 및 AAV8-FIX19의 유사한 면역원성 프로파일을 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로, 단백질 예컨대, 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 변형된 핵산 서열의 개발을 기반으로 한다. 다양한 구체예에서, 변형된 핵산은 인자 IX를 인코딩하는 참조 핵산 서열 예컨대, 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열 대비 감소된 수의 CpG(시토신-구아닌) 디-뉴클레오티드를 갖는다. 추가의 구체예에서, 참조 인자 IX 인코딩 핵산(예를 들어, 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연 서열) 대비 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 갖는 그러한 변형된 핵산이 발현 벡터(예를 들어, 벡터 게놈) 또는 플라스미드 내부에 포함된다.
본 발명은 또한, 조성물 예컨대, 인간 FIX를 인코딩하는 변형된 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물에서, 변형된 핵산은 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열과 같은 참조 서열과 비교하여 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 갖는다. 조성물은 또한, 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 갖는 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 그러한 변형된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/벡터 게놈) 및 플라스미드를 포함한다.
특정 양태에서, 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연 서열보다 1-5개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 5-10개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 10-15개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 15-20개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 20-25개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 25-30개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 30-40개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 인간 인자 IX를 인코딩하는 천연(야생형) 서열보다 40-55개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 모든 CpG 디-뉴클레오티드가 완전하게 제거된다.
감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산은 하나 이상의 추가의 시스 요소를 추가로 포함할 수 있다. 대표적인 시스 요소는 비제한적으로, 발현 조절 요소, 인트론, ITR, 정지 코돈, 폴리A 서열, 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 시스-작용 요소는 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 시스 작용 요소 예컨대, 발현 조절 요소, 인트론, ITR, 폴리-A 서열, 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 가질 수 있다. 한 양태에서, 하나 이상의 시스 작용 요소 예컨대, 발현 조절 요소, 인트론, ITR, 폴리-A 서열, 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열에는 CpG 디-뉴클레오티드가 존재하지 않는다. 특정 양태에서, 하나 이상의 시스 작용 요소 예컨대, 발현 조절 요소, 인트론, ITR, 폴리-A 서열 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 기준 시스-작용 요소보다 1 내지 5개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스-작용 요소보다 5-10개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스-작용 요소보다 10-15개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스-작용 요소보다 15-20개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스-작용 요소보다 20-25개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스-작용 요소보다 25-30개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스-작용 요소보다 30-40개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 기준 시스 요소보다 40-55개 적은 CpG 디-뉴클레오티드를 갖거나; 임의의 CpG 디-뉴클레오티드가 전혀 없다.
본 발명은 또한 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 변형된 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구체예에서, 벡터는 렌티- 또는 파르보-바이러스 벡터 예컨대, 아데노-바이러스 벡터를 포함한다. 더욱 특정 구체예에서, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 변형된 핵산 서열은 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 포함된다.
추가의 특정 구체예에서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8 뿐만 아니라 이의 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체, 예컨대, 아미노산 삽입, 첨가 및 치환)로부터 유래된 캡시드를 포함한다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, AAV 캡시드 VP1 단백질 및 본질적으로 VP1의 아미노-말단 절두부인 VP2 및 VP3로 불리는 2개의 더 짧은 단백질을 전형적으로 포함한다. 캡시드 및 당업자에게 공지된 다른 인자에 따라, 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3는 각각 대략 1:1:10 비율로 캡시드에 전형적으로 존재하며, 그러나, 특히 VP3의 이러한 비율은 현저하게 변화될 수 있으며 어떠한 면에서도 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
AAV 변이체는 AAV-Rh74 변이체, 예를 들어, 비제한적으로 표 1에 기술된 변이체 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및 15-6을 포함하는 Rh74 VP1 캡시드 서열(SEQ ID NO:1; 도 1)의 AAV 캡시드 변이체를 포함한다. Rh74 VP2 및 Rh74 VP3 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 2(도 2) 및 SEQ ID NO: 3(도 3)에 제공된다.
표 1. AAV 캡시드 변이체
Figure 112018017790524-pct00001
4-1 변이체(SEQ ID NO: 4)는 VP1 캡시드의 아미노산 위치 195, 199, 201 및 202번 각각에서 알라닌, 발린, 프롤린 및 아스파라긴 치환을 가졌다. 밑줄 치고 굵게 표시한 치환된 잔기 a, v, p 및 n을 갖는 4-1 변이체 VP1 캡시드 아미노산 서열은 도 4(SEQ ID NO:4)에 나타내었다. 변이체 4-1에 있어서, VP2 서열은 SEQ ID NO: 27로 구성되고, VP3 서열은 SEQ ID NO: 3으로 각각 구성된다.
15-1, 15-2, 15-3, 15-4, 1-5 및 15-6 변이체는 또한, VP1 캡시드의 아미노산 위치 195, 199, 201 및 202번 각각에서 알라닌, 발린, 프롤린 및 아스파라긴 치환을 가졌다. 또한, 이들 변이체는 다양한 위치에서 리신의 다중 아르기닌 치환을 가졌다. 15-1 변이체 VP1 캡시드 아미노산 서열(SEQ ID NO: 5)은 도 5에 나타내고; 15-2 변이체 VP1 캡시드 아미노산 서열(SEQ ID NO: 6)은 도 6에 나타내고; 15-3/15-5 변이체 VP1 캡시드 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 7)은 도 7에 나타내고; 15-4 변이체 VP1 캡시드 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 8)은 도 8에 나타내고; 15-6 변이체 VP1 캡시드 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 9)은 도 9에 나타낸다. 본원에 사용될 수 있는 캡시드의 예는 비제한적으로, 미국 특허 공개 번호 2015/0023924에 기술된 것들을 포함한다.
따라서, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 변형된 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함(캡시드화 또는 패키징)하는 렌티- 및 파르보-바이러스 벡터 예컨대, AAV 벡터 및 바이러스 벡터 변이체 예컨대, AAV 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체 예컨대, 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및 15-6)가 제공된다.
예시적인 연구에서, AAV-Rh74 매개된 유전자 전달/이동은 수개의 다른 혈청형보다 현저하게 더 높은 단백질 발현 수준을 유도하였다. 특히, AAV-Rh74 벡터 및 캡시드 변이체(예를 들어, 4-1)는 혈우병 B 개 및/또는 마우스 및/또는 마카크에서 간 형질도입을 위한 최고 기준과 적어도 유사한 효율로 AAV8을 간으로 전달하기 위한 유전자를 표적으로 한다.
본원에 제시된 바와 같이, AAV 혈청형 및 변이체를 포함하는 렌티- 및 파르보-바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열을 생체외, 시험관내 및 생체내 세포로 전달하기 위한 수단을 제공하며, 이는 세포가 인코딩된 단백질을 발현하도록 단백질을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는 요망되는 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 인자 IX)를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서, 대상체(예를 들어, 포유 동물)로의 벡터 전달 또는 투여는 대상체에 인코딩된 단백질 및 펩티드를 제공한다. 따라서, AAV 혈청형 및 변이체 예컨대, 캡시드 변이체(예를 들어, 4-1)을 포함하는 바이러스 벡터 예컨대, 렌티- 및 파르보-바이러스 벡터가 발현을 위한 및 선택적으로 다양한 질병을 치료하기 위한 이종성 폴리뉴클레오티드를 전달/이동시키는데 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 재조합 벡터(예를 들어, AAV)는 파르보바이러스 벡터이다. 파르보바이러스는 단일-가닥 DNA 게놈을 갖는 작은 바이러스이다. "아데노-관련 바이러스"(AAV)는 파르보바이러스 과에 속한다.
AAV를 포함하는 파르보바이러스는 유전자 요법 벡터로서 유용한 바이러스인데, 이들은 세포를 침투하여 핵산/유전자 물질을 도입시켜 핵산/유전자 물질이 세포 내에 안정적으로 유지될 수 있게 하기 때문이다. 또한, 이들 바이러스는 핵산/유전자 물질을 특정 부위 예를 들어, 19번 염색체의 특정 부위 내로 도입시킬 수 있다. AAV는 인간에서 병원성 질환과 관련이 없기 때문에, AAV 벡터는 실질적인 AAV 발병기전 또는 질병을 초래하지 않으면서 인간 환자에 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료학적 단백질 및 제제)을 전달할 수 있다.
예를 들어, AAV1-AAV11, Rh74 또는 Rh10 (예를 들어, 임의의 AAV1-AAV11, Rh74 또는 Rh10 혈청형 중 임의의 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열과 구별됨)를 포함하는 AAV 및 AAV 변이체 (예를 들어, 캡시드 변이체 예컨대, 4-1) 혈청형 (예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)은 다른 AAV 혈청형과 구별될 수 있거나 없다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하는데 사용되는 구별법이다. 혈청학적 차별성은 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체 간의 교차 반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 이러한 교차-반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자의 차이(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열 차이로 인한)로 인한 것이다. 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체가 기준 AAV 또는 기타 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 수 있는 가능성에도 불구하고, 이들은 기준 또는 기타 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 구별된다.
전통적인 정의하에, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성을 위한 모든 존재하는 특성규명된 혈청형에 대해 특이적인 혈청에 대해 평가되었으며, 어떠한 항체도 관심 바이러스를 중화시키는 것으로 밝혀지지 않았음을 의미한다. 보다 자연적으로 발생하는 바이러스 분리균이 발견되고/거나 캡시드 돌연변이체가 발생하기 때문에, 현재 존재하는 임의의 혈청형과 혈청학적으로 차이가 있을 수 있거나 없다. 따라서, 새로운 바이러스 (예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이러한 새로운 바이러스 (예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 하위군 또는 변이체일 것이다. 그러나, 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청 검사는 이들이 혈청형의 전통적인 정의에 따라 다른 혈청형인지의 여부를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이체 바이러스에서 수행되어야 한다. 따라서, 편의를 위해 그리고, 반복을 피하기 위해 용어 "혈청형"은 광범위하게는 혈청학적으로 구별되는 바이러스 (예를 들어, AAV)는 물론 주어진 혈청형의 하위군 또는 변이체에 속할 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스 (예를 들어, AAV) 둘 모두를 지칭한다.
재조합 벡터(예를 들어, AAV) 플라스미드, 벡터(예를 들어, AAV) 게놈은 물론 이의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적 예로서, 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 플라스미드 또는 벡터(예를 들어, AAV) 게놈은 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8과 같은 임의의 AAV 게놈을 기반으로 할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형 (또는 하위군 또는 변이체)를 기반으로 할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적 예로서, 하나의 혈청형 게놈을 기반으로 하는 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 플라스미드 또는 벡터(예를 들어, AAV) 게놈은 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 플라스미드 또는 벡터(예를 들어, AAV) 게놈은 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 구별되는 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 게놈을 기반으로 할 수 있으며, 이러한 경우, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 또는 변이체 예컨대, AAV-Rh74 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체 예컨대, 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및 15-6)일 수 있다.
따라서, AAV 벡터는 특정 혈청형에 대한 유전자/단백질 서열 특징과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 "AAV1과 관련된 AAV 벡터"는 AAV1을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. 유사하게, "AAV8과 관련된 AAV 벡터"는 AAV8을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. "AAV-Rh74와 관련된 AAV 벡터"는 AAV-Rh74를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. (예를 들어, 도 1-3의 VP1, VP2, VP3 참조). 따라서, 또 다른 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8과 관련된 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8로부터의 하나 이상의 구별되는 서열을 가지나, 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질과 실질적인 서열 동일성을 나타낼 수 있고/있거나 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 하나 이상의 기능성 특징(예를 들어, 세포/조직 향성)을 가질 수 있다. 예시적인 비제한적 AAV-Rh74 및 관련된 AAV 변이체 예컨대, AAV-Rh74 또는 관련된 AAV 예컨대, AAV-Rh74 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체 예컨대, 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및 15-6) 서열은 본원 예를 들어, 도 1-9에 제시된 VP1, VP2, 및/또는 VP3을 포함한다.
다양한 예시적인 구체예에서, 참조 혈청형과 관련된 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(예를 들어, 도 1-9에 제시된 AAV-Rh74 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)과 적어도 80% 또는 그 초과 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등)로 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이들의 하위서열을 갖는다.
본 발명의 방법 및 용도는 참조 AAV 혈청형, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, 또는 AAV-2i8 예를 들어, AAV-Rh74 유전자 또는 단백질 서열(예를 들어, 도 1-9에 제시된 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열)과 100% 미만의 서열 동일성을 나타내나, 공지된 AAV 유전자 또는 단백질, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 유전자 또는 단백질 등으로부터 구별되고 동일하지 않은 AAV 서열(폴리펩티드 및 뉴클레오티드), AAV-Rh74 서열(폴리펩티드 및 뉴클레오티드) 및 이의 하위서열을 포함한다. 한 구체예에서, AAV 폴리펩티드 또는 이의 하위서열은 임의의 참조 AAV 서열 또는 이의 하위서열, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(예를 들어, 도 1-9에 제시된 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열)과 적어도 80% 또는 그 초과로 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 100% 이하 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 양태에서, AAV 변이체는 4개 아미노산 치환 중 1, 2, 3 또는 4개 (예를 들어, 캡시드 변이체 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및 15-6)를 갖는다.
AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 및 변이체, 관련 하이브리드 및 키메라 서열을 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, AAV)는 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 하나 이상의 기능성 AAV ITR 서열에 측면인접된 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(전이유전자)을 포함하도록 작제될 수 있다. 이러한 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 야생형 AAV 유전자 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있으나, 필요에 따라 AAV 벡터 입자 내로의 재조합 벡터의 구제, 복제 및 패키징을 위한 적어도 하나의 기능성 측면인접 ITR 서열을 보유한다. 따라서, AAV 벡터 게놈은 복제 및 패키징을 위해 시스로 요구되는 서열(예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 포함할 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는, 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀(sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭(si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 감소된 CpG 디뉴클레오티드를 가짐)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일, 이중 또는 삼중의 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 논의함에 있어서, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 서열을 5'에서 3' 방향으로 제공하는 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
"이종성" 폴리뉴클레오티드는 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 벡터 매개된 전달/이동을 위한 벡터(예를 들어, AAV) 내로 삽입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 벡터(예를 들어, AAV) 핵산과 구별되며 즉, 바이러스 (예를 들어, AAV) 핵산과 관련하여 비-천연성이다. 일단 세포 내로 전달/이동되면, 벡터 내부에 함유된 이종성 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있다 (예를 들어, 적절하다면 전사되고 번역될 수 있다). 대안적으로, 벡터 내부에 함유된 세포 중 전달/이동된 이종성 폴리뉴클레오티드는 발현될 필요는 없다. 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 수식어 "이종성"이 없이도 폴리뉴클레오티드에 대한 언급은 이의 생략에도 불구하고 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다. 이종성 서열의 예는 인자 IX 인코딩 핵산 예를 들어, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산 예컨대, 참조 핵산 서열 대비 감소된 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 핵산일 것이다.
"폴리뉴클레오티드 서열"에 의해 인코딩된 "폴리펩티드," "단백질" 및 "펩티드"는 천연 발생 단백질과 마찬가지로 전장 천연 서열, 뿐만 아니라 기능성 하위서열, 변형된 형태, 또는 서열 변이체가 천연 전장 단백질의 소정의 기능성을 보유하는 한, 기능성 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 본 발명의 방법 및 용도에서, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 결함이 있거나, 처리된 포유동물에서 이의 발현이 불충분하거나 결핍된 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일한 필요는 없다.
본 발명에서, 렌티- 및 파르보-바이러스 벡터 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8을 포함하는 아데노-바이러스 벡터 및 AAV 벡터 및 관련된 AAV 변이체 예컨대, AAV-Rh74 변이체 (예를 들어, 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및 15-6과 같은 캡시드 변이체)가 폴리뉴클레오티드를 세포 및 이들의 후손 내로 안정하게 또는 일시적으로 도입/전달하는데 사용될 수 있다. 용어 "전이유전자"는 본원에서 편리하게, 세포 또는 유기체에 도입되도록 의도되거나 도입된 이종성 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용된다. 전이유전자는 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자(예를 들어, 인자 IX)를 포함한다.
예를 들어, 전이유전자를 갖는 세포에서, 전이유전자는 벡터, 예컨대, AAV에 의해, 세포의 "형질도입" 또는 "형질감염"에 의해 도입/전달되었다. 용어 "형질도입하다" 및 "형질감염하다"는 세포 또는 숙주 유기체에 폴리뉴클레오티드와 같은 분자의 도입을 지칭한다.
전이유전자가 도입된 세포는 "형질도입된 세포"라고 한다. 따라서, "형질도입된" 세포(예를 들어, 포유동물에서, 예컨대, 세포 또는 조직 또는 장기 세포)는 세포에 외인성 분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질(예를 들어, 전이유전자)의 혼입 후 세포에서의 유전자 변화를 의미한다. 이에 따라, "형질도입된" 세포는 예를 들어, 외인성 분자가 도입된 세포, 또는 이의 자손이다. 세포(들)는 증식될 수 있고, 도입된 단백질도 발현될 수 있거나, 핵산이 전사될 수 있다. 유전자 요법 사용 및 방법에 있어서, 형질도입된 세포는 대상체에 존재할 수 있다.
도입된 폴리뉴클레오티드는 수용체 세포 또는 유기체의 핵산 내로 통합될 수 있거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드가 수용체 세포 또는 유기체의 핵산(게놈 DNA)에 통합되는 경우, 이는 그러한 세포 또는 유기체에서 안정적으로 유지될 수 있고, 추가로 수용체 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체 쪽으로 진행되거나 이에 의해 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 핵산은 수용체 세포 또는 숙주 유기체에 단지 일시적으로 존재할 수 있다.
형질도입될 수 있는 세포는 임의의 기원(예를 들어, 중배엽, 외배엽 또는 내배엽)의 임의의 조직 또는 장기 유형의 세포를 포함한다. 세포의 비제한적인 예는 간(예를 들어, 간세포, 동모양 내피 세포), 췌장(예를 들어, 베타 섬 세포), 폐, 중추 또는 말초 신경계, 예컨대, 뇌(예를 들어, 신경, 아교 또는 뇌실막 세포) 또는 척추, 신장, 눈(예를 들어, 망막, 세포 요소), 비장, 피부, 흉선, 고환, 폐, 횡격막, 심장(심), 근육 또는 요근, 또는 장(예를 들어, 내분비), 지방 조직(백색, 갈색 또는 베이지), 근육( 예를 들어, 섬유모세포), 윤활막 세포, 연골세포, 파골 세포, 상피 세포, 내피 세포, 타액선 세포, 내이 신경 세포 또는 조혈(예를 들어, 혈액 또는 림프) 세포를 포함한다. 추가적인 예는 줄기 세포 예컨대, 간으로 발달 또는 분화되는 만능성 또는 다능성 전구체 세포(예를 들어, 간세포, 동모양 내피 세포), 췌장(예를 들어, 베타 섬 세포), 폐, 중추 또는 말초 신경계, 예컨대, 뇌(예를 들어, 신경, 아교 또는 뇌실막 세포) 또는 척추, 신장, 눈(망막, 세포 요소), 비장, 피부, 흉선, 고환, 폐, 횡격막, 심장(심), 근육 또는 요근, 또는 장(예를 들어, 내분비), 지방 조직(백색, 갈색 또는 베이지), 근육( 예를 들어, 섬유모세포), 윤활막 세포, 연골세포, 파골 세포, 상피 세포, 내피 세포, 타액선 세포, 내이 신경 세포 또는 조혈(예를 들어, 혈액 또는 림프) 세포를 포함한다.
한 구체예에서 "치료학적 분자"는 세포 또는 대상체에서 단백질의 부재 또는 결함으로부터 발생한 증상을 경감 또는 감소시킬 수 있는 펩티드 또는 단백질이다. 대안적으로, 전이유전자에 의해 인코딩된 "치료학적" 펩티드 또는 단백질은 예를 들어, 유전자 결함을 교정하고, 유전자 (발현 또는 기능) 결핍을 교정하기 위해 대상체에게 이익을 주는 것이다.
본 발명에 따라 유용한 유전자 생성물(예를 들어, 치료학적 단백질)을 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예는 비제한적으로, 혈액 응고 장애 예컨대, 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해 혈증, 및 빈혈을 포함하는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있는 것들을 포함한다.
본원에 기재된 비제한적 유전자 및 단백질을 포함하는 유전자 생성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 모든 포유동물 및 비-포유동물 형태는 공지되거나 비공지된 것으로 명시적으로 포함된다. 따라서, 본 발명은 비-포유동물, 인간 이외의 포유동물, 및 인간으로부터의 유전자 및 단백질을 포함하며, 이러한 유전자 및 단백질은 본원에 기술된 인간 유전자 및 단백질과 실질적으로 유사한 방식으로 기능한다. 포유동물 비-인간 인자 IX 서열의 비제한적 예는 문헌 [Yoshitake et al., 1985, supra;Kurachiet al., 1995, supra;Jallat et al., 1990, supra;Kurachiet al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464; Jaye et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11:2325-2335; Anson et al., 1984, EMBO J. 3: 1053-1060; Wuet al., 1990, Gene 86:275-278; Evans et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:10095 (1989), Blood 74:207-212; Pendurthi et al., 1992, Thromb. Res. 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics 1990, 6:133-143; and, Katayama et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4990-4994.]에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 이의 하위서열은 변형된 및 변이체 형태를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "변형시키다" 또는 "변이체" 및 이의 문법적 변형예는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 하위서열이 참조 서열에서 벗어남을 의미한다. 그러므로, 변형된 및 변이체 서열은 실질적으로 참조 서열과 동일하거나, 참조 서열에 비해 더 크거나 적은 활성 또는 기능을 가질 수 있지만, 적어도 참조 서열의 부분 활성 또는 기능을 보유한다. 특정 구체예에서, 변형된 핵산은 인자 IX를 인코딩하며, 핵산을 인코딩하는 참조 인자 IX 인코딩 핵산과 비교하여 CpG 디뉴클레오티드의 수를 감소하도록 변형시켰다 (예를 들어, 야생형 인자 IX 서열, 예컨대, 인간 또는 기타 포유동물 인자 IX 유전자 서열).
변이체는 또한 기능 변이체의 획득 및 손실을 포함한다. 예를 들어, 야생형 인간 인자 IX DNA 서열에 있어서, 이의 단백질 변이체 또는 돌연변이체는 활성을 보유하거나, 치료학적으로 효과적이거나, 본 발명의 방법 및 용도에서 불변의 인간 인자 IX에 필적하거나 심지어 더욱 치료학적으로 활성이다. "Padua"로 불리는 자연 발생 인간 인자 IX 변이체의 한 비제한적 예에서, 인간 인자 IX는 위치 338번에서 R(아르기닌) 대신 L(류신)을 갖는다. Padau FIX는 Padua 돌연변이가 없는 인간 인자 IX에 비해 더 큰 촉매 및 응고 활성을 갖는다. 인간 인자 IX의 잔기 338번을 아르기닌에서 알라닌으로 변화시키면 촉매 활성 증가를 초래한다 (Chang et al., J. Biol. Chem., 273 : 12089-94 (1998)). 또 다른 특정 예에서, 콜라겐 IV는 인자 IX를 포획하는 작용을 하며, 이는 포유동물의 근육 조직 내로 도입될 경우, 인자 IX의 일부가 혈액 응고에 관여할 수 없음을 의미하는데, 왜냐하면 이들이 근육 조직의 틈새 공간에 보유되기 때문이다. 콜라겐 IV로의 결합이 감소된 (예를 들어, 기능 손실) 단백질을 발생시키는 인자 IX의 서열의 돌연변이는 예를 들어, 혈우병 치료에 유용한 돌연변이이다. 그러한 돌연변이 인자 IX 유전자의 예는 성숙 단백질의 시작부터 5번째 아미노산 위치에서 리신 대신 아미노산 알라닌을 갖는 인간 FIX 단백질을 인코딩한다.
변형의 비제한적인 예는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환(예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 잔기), 예컨대, 전이유전자에서 대체 디뉴클레오티드로의 CpG 치환(예를 들어, 인자 IX 인코딩 유전자 예컨대, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX 인코딩 유전자)을 포함한다. 아미노산 치환의 예는 캡시드 서열에서 보존적 아미노산 치환이다. 아미노산 치환의 또 다른 예는 아르기닌 대신 리신 잔기이다 (예를 들어, 임의의 4-1, 15-1, 15-2, 15-3/15-5, 15-4 및/또는 15-6에 제시된 바와 같은 리신의 하나 이상의 아르기닌 치환). 추가의 변형은 참조 서열의 첨가(예를 들어, 삽입 또는 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 잔기) 및 결실 (예를 들어, 하위서열 또는 단편)을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 또는 변이체 서열은 비변형된 서열의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유한다. 이러한 변형된 형태 및 변이체는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 참조 서열과 동일한, 그 미만의 또는 그 초과의 기능 또는 활성을 가질 수 있으며, 적어도 이의 일부를 가질 수 있다.
본원에 제시된 바와 같이, 변이체는 하나 이상의 비-보존적 또는 보존적 아미노산 서열 차이 또는 변형, 또는 이 둘 모두를 가질 수 있다. "보존적 치환"은 생물학적, 화학적 또는 구조적으로 유사한 잔기에 의한 하나의 아미노산의 대체이다. 생물학적으로 유사하다는 것은 치환이 생물학적 활성을 파괴하지 않음을 의미한다. 구조적으로 유사하다는 것은 아미노산이 유사한 길이를 갖는 측쇄 예컨대, 알라닌, 글리신 및 세린 또는 유사한 크기를 가짐을 의미한다. 화학적 유사성은 잔기가 동일한 전하를 갖거나 친수성 또는 소수성 둘 모두임을 의미한다. 특정 예는 하나의 소수성 잔기 예컨대, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또 다른 극성 잔기로의 치환 예컨대, 아르기닌의 리신으로, 글루탐산의 아스파르트산으로, 또는 글루타민의 아스파라긴으로, 세린의 트레오닌으로의 치환, 및 기타 등등을 포함한다. 보존적 치환의 특정 예는 소수성 잔기 예컨대, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 잔기로의 치환, 극성 잔기의 또 다른 잔기로의 치환 예컨대, 아르기닌의 리신으로, 글루탐산의 아스파르트산으로, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환, 및 기타 등등을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 하기 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. "보존적 치환"은 또한 비치환된 어미 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 생물학적 활성(예를 들어, 혈액 응고 기능 등)을 보유하는 (예를 들어, 본원에 기술된 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의) 유전자 및 단백질 변이체를 포함한다. 변이체는 참조 서열 예컨대, 천연 발생 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는펩티드와 상이할 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드의 이러한 변이체는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형되었거나 변형될 수 있어 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드가 변형된 또는 추가의 특성을 지니게 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
뉴클레오티드 서열 수준에서, 천연 및 비-천연 발생 변이체 유전자는 전형적으로 참조 유전자와 적어도 약 50% 동일하거나, 더욱 전형적으로 약 70% 동일하거나, 더욱 더 전형적으로 약 80% 동일할 것이다. 따라서, 예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX 유전자는 야생형 FIX 유전자에 대해 80% 또는 그 초과의 동일성, 또는 야생형 FIX 유전자에 대해 80-85%, 85-90%, 90-95% 또는 그 초과의 동일성, 예를 들어, 야생형 FIX 유전자에 대해 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 초과의 동일성을 가질 수 있다.
아미노산 서열 수준에서, 천연 및 비-천연 발생 변이체 단백질은 전형적으로는 참조 단백질과 적어도 약 70% 동일하고, 더욱 전형적으로는 약 80% 동일하고, 더욱 더 전형적으로는 약 90% 또는 그 초과로 동일하지만, 실질적인 비-동일 영역이 보존되지 않은 영역에서 허용된다 (예를 들어, 70% 미만의 동일성 예컨대, 60%, 50% 또는 심지어 40% 미만의 동일성). 기타 구체예에서, 서열은 참조 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 75% 또는 그 초과의 동일성 (예를 들어, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성)을 갖는다.
용어 "동일성," "상동성" 및 이들의 문법적 변형은, 2개 또는 그 초과의 언급된 실체가 "정렬된" 서열일 때, 이들이 동일함을 의미한다. 이에 따라, 예로서, 2개의 폴리펩티드 서열이 동일할 때, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 경우에, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 규정된 구역(영역 또는 도메인)에 걸쳐 존재할 수 있다. 동일성의 "부위" 또는 "영역"은 동일한 2개 또는 그 초과의 언급된 실체물의 일부를 지칭한다. 이에 따라, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 부위 또는 영역에 걸쳐 동일한 경우에, 이들은 그러한 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 참조 서열과 비교하여 종종 결손 또는 추가적인 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 교정(correction)을 함유한 다수의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 (아미노산) 서열을 지칭한다.
동일성은 서열의 전체 길이 또는 일부에 걸쳐 연장될 수 있다. 특정 양태에서, 동일성 퍼센트를 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 등의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 추가적인 특정 양태에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 21개 또는 그 초과의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산, 예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개, 등의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 추가의 특정 양태에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 41개 또는 그 초과의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산, 예를 들어, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50개 등의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 또한 추가의 특정 양태에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 50개 또는 그 초과의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산, 예를 들어, 50 내지 55, 55 내지 60, 60 내지 65, 65 내지 70, 70 내지 75, 75 내지 80, 80 내지 85, 85 내지 90, 90 내지 95, 95 내지 100, 100 내지 110개, 등의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이다.
용어 "상동" 또는 "상동성"은 2개 또는 그 초과의 언급된 실체물이 제공된 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 일부 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 상동성 또는 동일성의 "부위, 영역 또는 도메인"은 둘 또는 그 초과의 언급된 실체물의 일부가 상동성을 공유하거나 동일한 것을 의미한다. 이에 따라, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우에, 이러한 것들은 이러한 영역에서 동일성을 공유한다. "실질적인 상동성"은 참조 분자, 또는 상동성을 공유하는 참조 분자의 관련/상응하는 영역 또는 부분의 구조 또는 기능(예를 들어, 생물학적 기능 또는 활성) 중 하나 이상의 적어도 일부 구조 또는 기능을 갖거나 갖는 것으로 예측되도록, 분자가 구조적으로 또는 기능적으로 보존됨을 의미한다.
두 서열 간의 동일성(상동성)의 정도는 컴퓨터 프로그램 및/또는 수학적 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 서열 동일성(상동성) 퍼센트를 계산하는 이러한 알고리즘은 일반적으로 비교 영역 또는 부위에 걸친 서열 갭 및 불일치를 설명한다. 예를 들어, BLAST (예를 들어, BLAST 2.0) 검색 알고리즘 (NCBI를 통해 공개적으로 입수 가능한 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)] 참조)은 하기와 같은 예시적 검색 파라미터를 갖는다: 불일치 - 2; 갭 오픈 5; 갭 연장 2. 폴리펩티드 서열 비교에 있어서, BLASTP 알고리즘은 전형적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어 매트릭스와 함께 이용된다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램이 또한 동일성의 정도를 정량화하는데 이용된다 (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); and Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Delaunay-기반 토폴로지 매핑을 사용하여 단백질 구조 유사성을 정량화하는 프로그램도 개발되었다 (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
폴리뉴클레오티드는 부가 및 삽입 예를 들어, 하나 이상의 이종성 도메인을 포함한다. 부가 (예를 들어, 이종성 도메인)은 임의의 유형의 분자의 조성물로의 공유 또는 비-공유 부착일 수 있다. 전형적으로, 부가 및 삽입(예를 들어, 이종성 도메인)은 상보적 또는 별개의 기능 또는 활성을 부여한다.
부가 및 삽입은 서열에 공유 결합된 참조 천연 (야생형) 서열에 정상적으로 존재하지 않는 하나 이상의 분자를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 서열인 키메라 및 융합 서열을 포함한다. 용어 "융합" 또는 "키메라" 및 이의 문법적 변형은 분자와 관련하여 사용되는 경우, 분자의 일부 또는 부분이 분자와 구별되는 (이종성의) 상이한 실체를 함유함을 의미한다 - 왜냐하면 전형적으로 이들은 자연적으로 함께 존재하지 않기 때문이다. 즉, 예를 들어, 융합 또는 키메라의 한 부분은 자연계에서 함께 존재하지 않으며 구조적으로 구별되는 부분을 포함하거나 이러한 부분으로 구성된다.
용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV 벡터), 또는 그 밖의 비히클을 나타낸다. 이러한 벡터는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입/전달하고, 세포에서 삽입된 폴리뉴클레오티드를 전사 또는 번역하기 위한 유전자 조작 (즉, "클로닝 벡터")에 사용될 수 있다. 벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서의 증식을 위한 복제 기점, 및 임의로 추가의 요소, 예컨대, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, ITR(들), 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리-아데닌(또한, 폴리-아데닐화로 언급됨) 서열을 함유한다.
바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나 이를 기반으로 한다. 특정 바이러스 벡터는 렌티-바이러스 및 파르보-바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 바이러스 벡터의 수식어, 예컨대, 재조합 렌티- 또는 파르보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터, 뿐만 아니라, 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서, 용어 "재조합"은 조성물(예를 들어, AAV 또는 서열)이 일반적으로 자연에서 일어나지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. AAV 벡터와 같은 재조합 벡터의 특정 예는 야생형 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈에 일반적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 게놈 내에 삽입되는 경우일 것이다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드의 예는, 단백질을 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 유전자)가 보통은 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈 내에서 유전자가 결합되어 있는 5', 3' 및/또는 인트론 영역이 있거나 없는 벡터에 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 본원에서 벡터 예컨대, 바이러스 및 AAV 벡터뿐만 아니라 서열 예컨대, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 관련하여 항상 사용되는 것은 아니지만, 재조합 형태의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 바이러스, AAV 및 서열은 임의의 이러한 생략에도 불구하고 분명하게 포함된다.
재조합 바이러스 "벡터" 또는 "AAV 벡터"는 예컨대, 바이러스(예를 들어, AAV)로부터 야생형 게놈을 제거하기 위한 분자 방법을 이용하고, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인간 FIX를 인코딩하는 변형된 핵산 서열)과 같은 비-천연 핵산으로 대체함으로써, AAV와 같은 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 전형적으로, AAV에 있어서, AAV 게놈의 역방위 말단 반복부(ITR) 서열들 중 하나 또는 둘 모두는 AAV 벡터에 보유된다. "재조합" 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)는, 바이러스 게놈 전부 또는 일부가 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인간 FIX를 인코딩하는 변형된 핵산 서열)과 같은 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈 핵산에 대해 비-천연 서열로 대체되었기 때문에, 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈과는 구별된다. 따라서, 비-천연 서열(예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인간 FIX를 인코딩하는 변형된 핵산 서열)의 혼입은 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 "재조합" 벡터로서 규정하며, AAV의 경우에, "rAAV 벡터"로서 지칭될 수 있다.
재조합 벡터(예를 들어, 렌티- 파르보-, AAV) 서열은 패키징될 수 있으며, 이는 본원에서 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자에 캡시드화(encapsidate)되거나 패키징되는 경우에, 입자는 또한, "rAAV"로서 지칭될 수 있다. 이러한 입자는 벡터 게놈을 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는 바이러스 외피 단백질, 및 AAV의 경우에, 캡시드 단백질을 포함한다.
재조합 플라스미드에 있어서, 벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 형성시키기 위해 최종적으로 패키징되거나 캡시드화되는 재조합 플라스미드 서열의 일부를 지칭한다. 재조합 벡터를 작제하거나 제작하기 위해 재조합 플라스미드가 사용되는 경우에, 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 일부를 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비-벡터 게놈 부분은 "플라스미드 백본"으로서 지칭되는데, 이는 증식 및 재조합 바이러스 생산을 위해 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭을 위해서는 중요하지만, 바이러스(예를 들어, AAV) 입자로 캡시드화되거나 그 자체로 패키징되지 않는다.
이에 따라, 벡터 "게놈"은 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하며, 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡시드화되는 벡터 플라스미드의 일부를 지칭한다. 재조합 플라스미드의 비 벡터 게놈 부분은 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요한 "플라스미드 백본"이며, 예를 들어, 선택 마커 예컨대, 카나마이신을 가지며, 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해서 그 자체로 패키징되거나 캡시드화되지 않는다.
벡터 게놈을 캡시드화/패키징하는 rAAV의 양은 예를 들어, 정량적 PCR에 의해 결정될 수 있다. 이러한 검정은 실시간 정량적 폴리머라제 사슬 반응에 의해 패키징된 벡터 게놈의 물리적 수를 측정하고, 예를 들어, 벌크 AAV 벡터 및 최종 생성물에 대한 제작/정제 공정의 다양한 단계에서 수행될 수 있다.
재조합 벡터 서열은 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 혼입에 의해 조작된다. 본원에 기재된 바와 같이, 벡터 플라스미드는 일반적으로, 적어도 세포의 증식을 위한 복제 기점 및 하나 이상의 발현 조절 요소를 함유한다.
AAV 벡터를 포함하는 벡터 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 조절 요소는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 주는 핵산 서열(들)이다. 벡터 내에 존재하는 프로모터 및 인핸서와 같은 본원에 제시된 발현 조절 요소를 포함하는 조절 요소는 적절한 이종성 폴리뉴클레오티드 전사 및 적합한 경우에, 번역(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 인-프레임 번역을 적용하기 위한 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지, 및 정지 코돈, 등)을 촉진시키기 위해 포함된다. 이러한 요소는 전형적으로, "시스 작용" 요소로서 지칭되는 시스로 작용하지만, 또한 트랜스로 작용할 수 있다.
발현 조절은 전사, 번역, 스플라이싱, 메세지 안정성 등의 수준에서 영향을 받을 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 (예를 들어, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산의) 전사된 폴리뉴클레오티드의 5' 말단(즉, "업스트림") 부근에 나란히 놓인다. 발현 조절 요소는 또한, 전사된 서열의 3' 말단(즉, "다운스트림")에 또는 전사물 내에(예를 들어, 인트론에) 위치할 수 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열에 인접하거나 간격을 두고 떨어져서 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터의 1 내지 10, 10 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 500개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드), 또는 심지어 상당한 거리를 두고 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 벡터, 예를 들어, AAV 벡터의 폴리뉴클레오티드 길이 제한으로 인하여, 이러한 발현 조절 요소는 전형적으로, 전사된 폴리뉴클레오티드로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오티드 내에 존재할 것이다.
기능적으로, 작동가능하게 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현은, 요소가 폴리뉴클레오티드의 전사, 및 적절한 경우에, 전사물의 번역을 조절하도록, 요소(예를 들어, 프로모터)에 의해 적어도 일부 조절가능하다. 발현 조절 요소의 특정 예는 일반적으로 전사된 서열의 5'에 위치한 프로모터이다. 발현 조절 요소의 또 다른 예는 전사된 서열의 5', 3' 또는 전사된 서열 내에 위치할 수 있는 인핸서이다.
본원에 사용된 바와 같은 "프로모터"는 재조합 생성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 인접하여 위치하는 핵산(예를 들어, DNA) 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 전형적으로 인접한 서열 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산)에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 전형적으로, 프로모터가 존재하지 않을 때 발현되는 양과 비교하여 이종성 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 양을 증가시킨다.
본원에서 사용된 바와 같은 "인핸서"는 이종성 폴리뉴클레오티드에 인접하여 위치한 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 업스트림에 위치하고 또한 기능하며, DNA 서열(예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드)의 다운스트림 또는 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 이종성 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림 100개 염기쌍, 200개 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 프로모터 요소에 의해 제공된 증가된 발현보다 높게 증가시킨다.
발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 특별한 조직 또는 세포 유형에서 활성인 것을 포함하는데, 이는 본원에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로서 지칭된다. 조직-특이적 발현 조절 요소는 전형적으로, 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 간, 뇌, 중추신경계, 척수, 눈, 망막, 뼈, 근육, 폐, 췌장, 심장, 신장 세포, 등)에서 활성이다. 발현 조절 요소는 전형적으로, 이들이 특정 세포, 조직 또는 장기 타입에 대해 독특한, 전사 활성제 단백질, 또는 전사의 다른 조절제에 의해 인식되기 때문에, 이들 세포, 조직 또는 장기에서 활성이다.
골격근에서 활성인 프로모터의 예는 골격 α-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 인코딩하는 유전자로부터의 프로모터 뿐만 아니라 천연 발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Li, et al., Nat. Biotech. 17:241-245 (1999)] 참조). 간에 대한 조직-특이적인 프로모터의 예는 특히, 인간 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터; 알부민[Miyatake, et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터[Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)]; 알파-태아단백질(AFP) [Arbuthnot, et al., Hum.Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)]; 뼈(오스테로칼신, [Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96(1997)]); 뼈 시알로 단백질[Chen, et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996)]), 림프구(CD2, [Hansal, et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)]; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 사슬), 뉴런(뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터[Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]; 뉴로필라멘트 경쇄 유전자[Piccioli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]; 뉴론-특이적 vgf 유전자[Piccioli, et al., Neuron, 15:373-84 (1995)])가 있다. 간에서 활성인 인핸서의 예는 아포지질단백질 E(apoE) HCR-1 및 HCR-2이다[Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)].
발현 조절 요소는 또한, 다수의 상이한 세포 유형에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 아주 흔하거나 불규칙한 프로모터/인핸서를 포함한다. 이러한 요소는 사이토메갈로바이러스(CMV) 급초기 프로모터/인핸서 서열, Rous 육종 바이러스(RSV) 프로모터/인핸서 서열, 및 다양한 포유동물 세포 유형 중에서 활성인 다른 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 활성 요소(예를 들어, 문헌 [Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
발현 조절 요소는 또한, 조절가능한 방식으로 발현을 제공할 수 있으며, 즉, 신호 또는 자극은 작동적으로 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시킨다. 신호 또는 자극에 반응하여 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절가능한 요소는 또한, "유도성 요소(inducible element)"(즉, 신호에 의해 유도됨)로서 지칭된다. 특정 예는, 호르몬(예를 들어, 스테로이드) 유도성 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 신호 또는 자극에 대해 반응하여 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 조절가능한 요소는 "억제 요소"로서 불린다(즉, 신호가 제거되거나 부재하는 경우 발현이 증가되도록 신호는 발현을 감소시킨다). 전형적으로, 이러한 요소에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호 또는 자극의 양에 비례하며; 신호 또는 자극의 양이 클수록, 발현이 더욱 크게 감소하거나 증가한다. 특정한 비제한적인 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 스테로이드 호르몬-유도성 마우스 포유동물 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제계[Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]; 테트라사이클린-유도성 시스템[Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995)]; 또한, 문헌[Harvey, et al., Curr.Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)] 참조; RU486-유도성 시스템[Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) 및 Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도성 시스템[Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997)]; [Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)]을 포함한다. 본 상황에서 유용할 수 있는 다른 조절가능한 조절 요소는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기(acute phase), 발달에 의해 조절되는 것들이다.
발현 조절 요소는 또한, 이종성 폴리뉴클레오티드를 위한 천연 요소(들)를 포함한다. 천연 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는, 이종성 폴리뉴클레오티드의 현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 요망될 때 사용될 수 있다. 천연 요소는, 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 일시적으로 또는 점진적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특이적 전사 자극에 반응하여 조절하고자 할 때 사용될 수 있다. 다른 천연 발현 조절 요소, 예를 들어, 인트론, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 콘센서스 서열이 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된"은 구성요소가 이들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하도록 기술된 바와 같은 구성요소의 물리적 또는 기능적 병치를 지칭한다. 핵산과 작동가능하게 연결된 상태의 발현 조절 요소의 예에서, 조절 요소는 핵산의 발현을 조절하게 하는 관계에 놓인다. 더욱 상세하게, 예를 들어, 작동적으로 연결된 2개의 DNA 서열은, DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 대한 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 2개의 DNA가 배열(시스 또는 트랜스)되는 것을 의미한다.
따라서, 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 변형된 핵산 서열, 및 바이러스 벡터 예컨대, AAV 벡터를 포함하는 렌티- 및 파르보바이러스 벡터를 포함하는 벡터 및 플라스미드, 뿐만 아니라 이들의 조성물은 추가의 핵산 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는 비제한적으로, AAV ITR 서열의 하나 이상의 복사체, 발현 조절(예를 들어, 프로모터/인핸서) 요소, 전사 종결 신호 또는 중지 코돈, 폴리뉴클레오티드 서열에 측면인접한 5' 또는 3' 비번역된 영역(예를 들어, 폴리아데닐화(폴리 A) 서열), 또는 인트론 예컨대, 게놈 인간 인자 IX(SEQ ID NO:13)의 인트론 I의 전체 또는 일부를 포함한다.
핵산 요소는 예를 들어, 패키징을 개선시키고 오염 핵산의 존재를 감소시키기 위해, 예를 들어, 플라스미드 백본의 패키징을 감소시키기 위해 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은, AAV 벡터는 일반적으로 약 4kb 내지 약 5.2kb, 또는 약간 더 큰 규정된 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 전형적으로 수용한다. 따라서, 더 짧은 서열에 있어서, 삽입 단편에서 스터퍼 또는 필러의 포함은 바이러스 입자로의 AAV 벡터 패키징을 위해 허용가능한 바이러스 게놈 서열의 정상적인 크기 또는 이에 가까운 크기로 길이를 조정하기 위한 것이다. 다양한 구체예에서, 필러/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역된(비-단백질 인코딩) 세그먼트이다. AAV 벡터의 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 4.7 Kb 미만의 길이를 가지며, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 이종성 폴리뉴클레오티드 서열과 결합될 때(예를 들어, 벡터에 삽입될 때) 전체 길이가 약 3.0 내지 5.5Kb, 또는 약 4.0 내지 5.0Kb, 또는 약 4.3 내지 4.8Kb가 되는 길이를 갖는다.
인트론은 또한, 바이러스 입자로의 AAV 벡터 패키징을 위한 길이를 달성하기 위해 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서 기능할 수 있다. 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서 기능하는 인트론 및 인트론 단편(예를 들어, FIX의 인트론 I의 부분)은 또한 발현을 향상시킬 수 있다. 인트론 요소의 포함은 인트론 요소의 부재하의 발현과 비교하여 발현을 향상시킬 수 있다 (상기 Kurachiet et al.., 1995).
인트론의 사용은 인자 IX 인트론 I 서열의 포함에 제한되지 않고, 다른 인트론을 또한, 포함하며, 이러한 인트론은 동일한 유전자와 회합될 수 있거나 (예를 들어, 핵산이 인자 IX를 인코딩하는 경우, 인트론은 인자 IX 게놈 서열에 존재하는 인트론으로부터 유래함) 완전히 다른 유전자 또는 다른 DNA 서열과 회합될 수 있다. 따라서, 핵산의 다른 비번역된 (비-단백질 인코딩) 영역 예컨대, 동족 (관련) 유전자 (이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열에 의해 인코딩된 동일한 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩함) 및 비-동족 (비관련) 유전자(이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열에 의해 인코딩된 단백질과 구별되는 단백질을 인코딩함)로부터의 게놈 서열에서 발견된 인트론은 또한 본 발명에 따른 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서 기능할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "인트론 I의 일부"는 약 0.1kb 내지 약 1.7kb의 뉴클레오티드 길이를 갖는 인트론 I의 영역으로 여겨지며, 이러한 영역은 인트론 I 부분의 부재하의 FIX의 발현과 비교할 경우 플라스미드 또는 바이러스 벡터 주형에 대해 전형적으로 약 1.5배 또는 그 초과 만큼 인자 IX의 발현을 향상시킨다. 보다 특정한 부분은 인트론 I의 1.3kb 부분이다. 인자 IX 인트론 I 서열의 비제한적 예는 인트론 A로서, SEQ ID NO:13에 제시된 바와 같은 FIX 제1 인트론의 5' 부부 및 3' 부분으로 구성된 키메라이다.
발현 조절 요소, ITR, 폴리 A 서열, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 발현 조절 요소, ITR, 폴리A, 또는 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 약 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 또는 2,000-2,500개 뉴클레오티드 길이의 서열이다.
한 비제한적 구체예에 따르면, AAV 벡터는 4-1 캡시드 변이체 VP1 단백질(SEQ ID NO:4)을 포함하는 AAV 캡시드 및 형질도입된 포유동물 세포에서 이종성 유전자를 발현하기 위한 게놈을 포함한다.
본 벡터의 캡시드는 4-1 캡시드 변이체로부터의 VP2 및 VP3 단백질(각각 SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:3)을 추가로 포함할 수 있다. 특정 비제한적 구체예에 따르면, VP1 단백질 및 VP2 단백질은 대략 1:1 (또는 일부 다른 비율)의 화학량론적 비율로 존재하며, VP3 단백질은 약 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 또는 일부 다른 비율의 대략적 비율로 VP1 또는 VP2, 또는 VP1과 VP2 둘 모두에 대한 비율로 존재한다.
일부 구체예에서, 비제한적으로, 4-1 캡시드 변이체 단백질(VP1, VP2, VP3)을 포함하는 캡시드를 갖는 것을 포함하는 AAV 벡터의 게놈은 인간 인자 IX(FIX) 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FIX 단백질은 야생형이며, 다른 구체예에서, FIX 단백질은 치환 돌연변이 또는 단백질의 활성을 변형시키는 기타 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 FIX 촉매 활성 및/또는 응혈원으로서의 단백질의 활성을 증가시킨다. 일부 구체예에서, FIX 단백질은 FIX 단백질의 338번 위치에 상응하는 아미노산에서 Arg의 Ala로의 치환을 갖는 Padua FIX 단백질이다. 일부 구체예에 따르면, 인간 FIX(FIX Padua 포함)를 인코딩하는 유전자는 예를 들어, CpG 디뉴클레오티드를 감소시키거나 심지어 제거함으로써 코돈 최적화된다. 다른 유형의 코돈 최적화 또한 가능하다.
일부 구체예에서, AAV 벡터의 게놈은 게놈의 왼쪽 및 오른쪽 말단 (즉, 각각 5' 및 3' 말단)에 위치하는 AAV2로부터의 역방위 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 왼쪽 ITR은 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 1-141(SEQ ID NO:13으로서 본원에 기재됨)를 포함하거나 이로 구성되며, 오른쪽 ITR은 SEQ ID NO:12로부터 뉴클레오티드 4097-4204(SEQ ID NO:20으로서 본원에 기재됨)를 포함하거나 이로 구성된다. 각 ITR은 가변 길이의 핵산 서열에 의해 벡터 게놈에서 다른 요소로부터 분리될 수 있다.
기타 구체예에서, AAV 벡터의 게놈은 프로모터, 및 선택적으로 인핸서를 포함하는 발현 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, AAV 벡터 게놈은 프로모터 및 인핸서 둘 모두를 포함하며, 이는 항시성, 유도성 또는 조직 특이적일 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터, 또는 인핸서, 또는 이 둘 모두는 조직 특이적이다. 예시적인 구체예에 따르면, 인핸서 및 프로모터 둘 모두는 다른 특정 세포 유형과 비교하여 간세포에서 우선적으로 활성이다. 한 구체예에 따르면, 인핸서는 인간 ApoE HCR-1 인핸서의 전체 또는 일부이며, 프로모터는 인간 알파-1 안티트립신(AAT) 프로모터의 전체 또는 일부이다. 일부 구체예에서, AAV 벡터 게놈은 SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 152-472 (SEQ ID NO:14로서 본원에 기재됨)을 포함하거나 이들로 구성된 인간 ApoE HCR-1 인핸서를 포함하며, SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 482-878 (SEQ ID NO:15로서 본원에 기재됨)을 포함하거나 이들로 구성된 인간 AAT 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, ApoE HCR-1 인핸서는 AAT 프로모터의 5'에 위치하고, 서열은 연속적이거나 또 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에 따르면, 인핸서 및 프로모터는 인자 IX를 코딩하는 핵산 서열의 5'에 위치하며, 인자 IX 유전자의 제1 엑손에 연속하여 결합될 수 있거나, 인간 인자 IX 유전자로부터의 5' 비번역된 서열(UTR) 또는 스페이서로서 작용하는 일부 기타 서열에 의해 이들로부터 분리될 수 있다. 예시적인 비제한적 구체예에서, 5' UTR 서열은 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 879-907을 포함하거나 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 천연 발생 FIX Padua를 포함하는 FIX를 인코딩하는 유전자는 인간 인자 IX 게놈 서열에 존재하는 하나 이상의 인트론을 포함한다. 기타 구체예에서, 모든 인트론은 배제될 수 있으며, 이의 예는 SEQ ID NO:10의 핵산 서열로서 기재되며, "FIX39"에 대한 코딩 서열로서 본원에 언급된다. 존재하는 경우, 인트론은 본원에 기술된 바와 같은 스터퍼 또는 필러 서열로서 작용할 수 있다. 전체 유전자는 CpG 디뉴클레오티드를 고갈시키거나 제거하기 위해 코돈-최적화될 수 있다.
특정 비제한적 구체예에서, AAV 벡터에 사용된 인간 인자 IX를 인코딩하는 유전자는 SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 908-3731을 포함하거나 이들로 구성되며, 이는 FIX Padua를 인코딩하며 CpG 디뉴클레오티드를 제거하도록 코돈-최적화된다. 이러한 서열은 엑손 1(SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 908-995), 제1 인트론(종종 인트론 I로서 공지됨; SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 996-2433), 및 엑손 2-8(SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 2434-3731)을 포함한다.
특정 구체예에서, 인자 IX를 인코딩하는 유전자 뒤의 이의 3' 말단에 인간 인자 IX 유전자로부터의 3' UTR 서열 (예컨대, 비제한적으로, SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 3732-3779 및/또는 인자 IX 유전자 또는 또 다른 유전자로부터의 폴리아데닐화(폴리A) 서열이 올 수 있다. 하나의 비제한적 예에서, 폴리A 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 유전자로부터 비롯될 수 있으며, SEQ ID NO:12로부터의 뉴클레오티드 3820-4047을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 3' UTR은 뉴클레오티드의 개재 서열에 의해 폴리A 서열로부터 가변적으로 이격될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 기재된 요소는 하나의 AAV 벡터 게놈으로 조합될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에 따르면, AAV 벡터는 5'에서 3'로의 순서로 좌측 AAV ITR, ApoE HCR-1 인핸서(또는 이의 일부), hAAT 프로모터(또는 이의 일부), 인간 인자 IX 5' UTR의 일부, 인간 인자 IX Padua를 인코딩하는 핵산 (선택적으로 하나 이상의 인트론 예컨대, 인트론 I 포함), 인간 인자 IX 3' UTR의 일부, bGH로부터의 폴리A 서열( 또는 이의 일부), 및 우측 AAV2 ITR을 포함하는 게놈을 가질 수 있다. 이러한 구체예 중 일부에서, 좌측 AAV2 ITR은 SEQ ID NO:13의 핵산 서열을 가지며; ApoE HCR-1 인핸서는 SEQ ID NO:14의 핵산 서열을 가지며; hAAT 프로모터는 SEQ ID NO:15의 핵산 서열을 가지며; 5' UTR은 SEQ ID NO:16의 핵산 서열을 가지며; FIX Padua를 인코딩하는 유전자(인트론 I 포함)는 SEQ ID NO:10의 핵산 서열에 의해 인코딩된 FIX 단백질을 인코딩하며; 3' UTR은 SEQ ID NO:18의 핵산 서열을 가지며; 폴리A 영역은 SEQ ID NO:19의 핵산 서열을 가지며; 우측 AAV2 ITR은 SEQ ID NO:20의 핵산 서열을 갖는다.
특정 구체예에 따르면, AAV 벡터의 게놈은 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 1-4204 또는 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 이들 구체예 중 일부에서, 캡시드는 4-1 VP1 캡시드 단백질 변이체(SEQ ID NO:4) 및 상응하는 VP2 및 VP2 캡시드 단백질을 포함한다. "AAV-FIX39-Padua"로서 본원에 언급된 AAV 벡터의 특정 비제한적인 구체예에서, 벡터는 4-1 캡시드 변이체 단백질(VP1, VP2, VP3)로부터 형성된 캡시드 및 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 1-4204로부터의 상응하는 핵산 서열을 포함하는 단일-가닥 게놈을 포함한다.
본원에 사용되는 AAV "빈 캡시드"는 AAV 벡터 게놈을 함유하는 "게놈 함유 캡시드"와 대조적으로 벡터 게놈을 함유하지 않는다(따라서, 용어 "빈"). 빈 캡시드는 이들의 온전한(AAV 벡터 함유 게놈) 바이러스와 반응하는 하나 이상의 항체와 반응한다는 점에서 바이러스-유사 입자이다.
빈 캡시드는 AAV 벡터 제조물에 포함될 수 있다. 요망되는 경우, AAV 빈 캡시드는 AAV 벡터 제조물에 첨가될 수 있거나, 본원의 방법에 따라 대상체에 별도로 투여될 수 있다.
이론에 구속되기를 희망하지 않으면서, AAV 빈 캡시드는 AAV 벡터에 대한 항체에 결합하거나 이와 반응하여, AAV 벡터의 불활성화를 감소시키기 위한 디코이로서 기능하는 것으로 여겨진다. 이러한 디코이는 AAV 벡터에 대해 유도된 항체를 흡수하여 세포의 AAV 벡터 전이유전자 형질도입(전이유전자의 도입)을 증가시키거나 개선하고, 차례로 전사물 및/또는 인코딩된 단백질의 세포내 발현을 증가시키는 작용을 한다.
빈 캡시드는 결정된 품질 및 이들의 정량으로 생성 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 빈 캡시드 역가는 280nm 파장에서의 광밀도에 의한 분광광도계에 의해 측정될 수 있다 (문헌 [Sommer et al., Mol. Ther. 2003 Jan;7(1):122-8]을 기반으로 함).
빈-AAV 또는 빈 캡시드는 종종 AAV 벡터 제조물에서 자연적으로 발견된다. 이러한 천연 혼합물이 본 발명에 따라 사용될 수 있거나, 요망되는 경우, 빈 캡시드 및/또는 벡터의 양을 증가시키거나 감소시키도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 빈 캡시드의 양은 대상체에서 벡터-매개된 유전자 형질도입에 사용하고자 하는 AAV 벡터와 반응하는 항체의 억제 효과를 저하시킬 것으로 예상되는 양으로 임의로 조절될 수 있다. 빈 캡시드의 사용은 미국 공개 2014/0336245에 기술되어 있다.
다양한 구체예에서, AAV 빈 캡시드는 AAV 벡터와 제형화되고/거나 대상체에 투여된다. 특정 양태에서, AAV 빈 캡시드는 적거나 동일한 양의 벡터 (예를 들어, 약 1.5 내지 100배 AAV 벡터 대 AAV 빈 캡시드, 또는 약 1:1 비율의 AAV 벡터 대 AAV 빈 캡시드)와 제형화된다. 기타 특정 양태에서, AAV 벡터는 과량의 AAV 빈 캡시드와 제형화된다 (예를 들어, AAV 벡터 대비 1배 초과의 AAV 빈 캡시드 예를 들어, AAV 벡터 대비 1.5 내지 100배 초과의 AAV 빈 캡시드). 선택적으로, 저 내지 음성 역가의 AAV NAb를 갖는 대상체는 더 적은 양의 빈 캡시드를 투여받을 수 있다 (AAV 벡터 대비 1 내지 10배 AAV 빈 캡시드, AAV 벡터 대비 2-6배의 AAV 빈 캡시드, 또는 AAV 벡터 대비 약 4-5배의 AAV 빈 캡시드).
특정 구체예에 따르면, AAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 4-1 캡시드 변이체 단백질(VP1, VP2 및 VP3)을 포함하는 것들을 포함하며, 조성물에서 AAV 벡터(즉, 벡터 게놈을 함유하는 것들)의 농도보다 높은 과량의 빈 캡시드를 포함한다. 빈 캡시드 대 AAV 벡터의 비율은 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10 대1, 또는 일부 기타 비율일 수 있다.
일부 구체예에서, 빈 캡시드는 AAV 벡터에 존재하는 동일한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 빈 캡시드는 AAV 벡터에서 발견된 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 포함한다. 전형적으로, 필수적이지는 않지만, 빈 캡시드의 캡시드 단백질과 AAV 벡터의 캡시드가 서열이 동일하지 않은 경우, 이들은 동일한 혈청형일 것이다.
일부 구체예에 따르면, 조성물은 AAV-FIX39-Padua로서 본원에 기술된 AAV 벡터 (또는 동일 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 것) 및 임의로 동일한 캡시드 단백질을 포함하는 과량의 빈 캡시드를 포함하며, 여기에서 빈 캡시드 대 AAV 벡터의 비율은 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10 대 1, 또는 일부 다른 비율이다. 일부 구체예에서, AAV-FIX39-Padua 대 빈 캡시드의 조성물 중의 비는 약 1:5이다. 기타 구체예에서, AAV-FIX39-Padua 및 빈 캡시드를 포함하는 조성물은 중증, 중등증 또는 경증 혈우병 B를 포함하는 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에게 투여된다.
"선택 마커 유전자"는 발현되는 경우, 형질도입된 세포에서 항생제 내성(예를 들어, 카나마이신)과 같은 선택 가능한 표현형을 부여하는 유전자를 지칭한다. "리포터" 유전자는 검출가능한 신호를 제공하는 유전자이다. 리포터 유전자의 비제한적 예는 루시퍼라제 유전자이다.
변형된 형태를 포함하는 핵산, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터(예를 들어, 벡터 게놈), 플라스미드는 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술을 이용하여, 세포 발현 또는 시험관내 번역을 통해 그리고 화학 합성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동 및 기타 등등을 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하이브리디제이션 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 그러한 기술은 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 프로브와 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리디제이션; (2) 예를 들어, 발현 라이브러리를 사용하는, 공유 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 항체 스크리닝; (3) 관심 핵산 서열에 어닐링될 수 있는 프라이머를 사용하는 게놈 DNA 또는 cDNA상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열에 대한 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 감산된 핵산 라이브러리의 차별적 스크리닝.
용어 "분리된"은 조성물의 수식어로서 사용될 때, 조성물이 사람의 손에 의해 제조되거나, 자연적으로 발생하는 생체내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리되는 것을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물에는 실질적으로, 대개 실제로는 관련되는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막이 존재하지 않는다. 용어 "분리된"은 사람의 손에 의해 생성된 조합물, 예를 들어, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 또는 벡터 게놈을 패키징하거나 캡시드화시키는 바이러스 입자, 및 약학적 조성물을 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한, 조성물의 대안적인 물리적 형태 예컨대, 하이브리드/키메라, 멀티머/올리고머, 변형(예를 들어, 포스포릴화, 글리코실화, 리피드화) 또는 유도체화된 형태, 또는 사람의 손에 의해 생성된 숙주 세포에서 발현된 형태를 배제하지 않는다.
본 발명의 방법 및 용도는 분열 및/또는 비-분열 세포를 포함하는, 숙주 세포 내로의 이종성 폴리뉴클레오티드(전이유전자) 전달(형질도입)을 위한 수단을 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 벡터 게놈, 재조합 바이러스 입자, 방법, 용도 및 약학적 제형은 치료 방법으로서 핵산 또는 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달, 투여 또는 제공하는 방법에 추가적으로 유용하다. 이러한 방식으로, 핵산이 전사되고, 단백질은 대상체 생체내에서 생산될 수 있다. 대상체는 핵산 또는 단백질의 결핍증을 가지고 있기 때문에, 또는 대상체의 핵산 또는 단백질 생산이 치료 방법 또는 다른 방법으로서 일부 치료 효과를 부여할 수 있기 때문에, 대상체는 핵산 또는 단백질이 유익할 수 있거나 이를 필요로 할 수 있다.
일반적으로, 재조합 렌티- 또는 파르보-바이러스 벡터(예를 들어, AAV) 서열, 벡터 게놈, 재조합 바이러스 입자, 방법 및 용도는 불충분한 또는 바람직하지 않은 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 연관이 있는 하나 이상의 증상을 치료하거나 완화시키기 위해 생물학적 효과를 갖는 임의의 이종성 폴리뉴클레오티드(전이유전자)를 전달하는데 이용될 수 있다. 재조합 렌티- 또는 파르보-바이러스 벡터(예를 들어, AAV) 서열, 플라스미드, 벡터 게놈, 재조합 바이러스 입자, 방법 및 용도는 다양한 질환 상태에 대한 치료법을 제공하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 벡터 게놈, 및 재조합 바이러스 입자, 방법 및 용도는 유전자 질환의 치료를 허용한다. 일반적으로, 질환 상태는 하기 두 부류에 속한다: 일반적으로 효소의 결핍 상태로서, 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 결핍 상태, 및 불균형 상태로서, 적어도 종종 우성 방식으로 유전되는 조절 또는 구조 단백질을 포함하는 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, 유전자 전달은 대체 요법을 위해 감염된 조직에 정상 유전자를 이동시킬 뿐만 아니라 안티센스 돌연변이를 이용하여 질병에 대한 동물 모델을 만드는데 이용될 수 있다. 불균형의 질병 상태의 경우, 유전자 전달은 모델 시스템에서 질병 상태를 발생시키는데 이용될 수 있으며, 이는 이어서 질병 상태에 대항하기 위한 노력으로 이용될 수 있다. 결함을 교정하기 위해 핵산 서열의 부위-특이적 혼입의 사용이 또한 가능하다.
질환 상태의 예시적인 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 혈액 응고 장애 예컨대, 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해빈혈 및 빈혈.
본 발명에 따르면, 본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 벡터 게놈, 및 재조합 바이러스 입자를 포함하는 치료 방법 및 용도가 제공된다. 본 발명의 방법 및 용도는 유전자 발현 또는 기능, 예를 들어, 유전자 추가 또는 대체를 제공하거나 증가시키거나 자극하는 것에 광범위하게 적용 가능하다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법 또는 용도는 (a) 예컨대, 벡터 또는 벡터 게놈에서 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX 예컨대, FIX를 인코딩하는 변형된 핵산을 제공하는 단계로서, 변형된 핵산 서열이 상기 서열의 전사를 부여하는 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 단계; 및 (b) 소정량의 변형된 핵산을 인자 IX가 포유동물에서 발현되도록 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 또는 용도는, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산 (및 임의로 ITR, 인트론, 폴리A, 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자 또는 복수의 바이러스(예를 들어, AAV) 입자(예를 들어, 예컨대, 캡시드 변이체(예를 들어, 4-1))를 포유동물 또는 포유동물의 세포에 투여하여 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산을 포유동물 또는 포유동물의 세포에 전달 또는 이동시킴으로써, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX 서열을 인코딩하는 변형된 핵산을 포유동물 또는 포유동물의 세포에 전달하거나 이동시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 방법 및 용도의 특정 양태에서, 핵산의 발현은 포유동물(예를 들어, 인간)에 치료학적 이점을 제공한다. 더욱 특정한 양태에서, 인자 IX의 발현은 포유동물(예를 들어, 인간) 예컨대, 혈우병 B를 갖는 포유동물에 치료학적 이점을 제공한다. 다양한 추가의 특정 양태에서, 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 FIX와 같은 인자 IX를 인코딩하는 변형된 핵산과 합쳐진 길이가 약 3.0kb-5.5kb, 또는 약 4.0kb-5.0kb, 또는 약 4.3kb-4.8kb의 전체 길이를 갖도록 벡터 서열에 포함된다.
본 발명의 방법 및 용도는 임의의 치료학적 또는 유익한 효과를 유도하는 치료 방법을 포함한다. 다양한 본 발명의 방법 및 용도에서, 질환에 의해 초래된 또는 질환과 관련된 하나 이상의 유해한 (예를 들어, 신체) 증상, 장애, 질병, 질환 또는 합병증을 억제하거나, 감소시키거나 저하시키는 것을 추가로 포함한다. 혈우병과 같은 출혈 장애에 있어서, 치료 효과 또는 유익한 효과는 비제한적으로, 멍듬 감소, 감소된 혈액 응고 시간, 감소된 출혈 에피소드(기간, 중증도, 빈도)를 포함한다. 예를 들어, 관절 또는 대뇌(뇌) 출혈 에피소드의 감소된 기간, 중증도 또는 빈도. 출혈 장애 예컨대, 혈우병에 있어서, 치료 효과 또는 유익한 효과는 또한, 비제한적으로, 보충 응고 인자 단백질(예를 들어, 인자 IX 단백질)의 감소된 투여량 또는 보충 응고 인자 단백질(예를 들어, 인자 IX 단백질)의 투여 감소를 포함한다.
따라서, 치료의 치료 효과 또는 유익한 효과는 특정 대상체에 제공된 임의의 객관적 또는 주관적인 측정가능한 또는 검출가능한 개선 또는 이점이다. 치료 효과 또는 유익한 효과는 질환의 모든 또는 임의의 특정 해로운 증상, 장애, 질병 또는 합병증의 완전한 제거일 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 따라서, 단기간 또는 장기간(시간, 일, 주, 개월, 등)에 걸쳐, 질환에 의해 초래되거나 이와 관련된 유해한 증상, 장애, 질병 또는 합병증에서의 점진적인 개선 또는 부분적 감소가 있거나, 질환에 의해 초래되거나 이와 관련된 하나 이상의 유해한 증상, 장애, 질병, 또는 합병증의 악화 또는 진행의 억제, 감소, 저하, 저지, 예방, 제한 또는 제어가 있는 경우 만족스러운 임상적 종료점이 달성된다.
조성물 예컨대, 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 벡터 게놈, 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 및 본 발명의 방법 및 용도가 이를 필요로 하는 대상체에 충분하거나 유효한 양으로 가해질 수 있다. "유효량" 또는 "충분한 양"은 단일 용량 또는 다수 용량으로 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(치료제, 예를 들어, 약물), 치료, 프로토콜, 또는 치료 요법제와 함께 임의의 기간(장기 또는 단기)의 검출 가능한 반응, 임의의 기간(예를 들어, 수분, 수시간, 수일, 수개월, 수년 동안, 또는 치유까지) 동안 또는 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도로 대상체에서의 예상되거나 요망되는 결과 또는 상기 대상체에 대한 이점을 제공하는 양을 나타낸다.
당업자는 단일 rAAV/벡터 용량의 투여가 충분한지의 여부 또는 다중 용량의 rAAV/벡터를 투여할지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, FIX 수준이 소정 수준 미만 (예를 들어, 치료 이점을 제공하는 최소 수준 미만)으로 감소되는 경우, 당업자는 적절한 경우 추가 용량의 rAAV/벡터를 투여할지를 결정할 수 있다.
치료 효과를 달성하기 위한 용량, 예를 들어, 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/kg)의 용량은 비제한적으로 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 필요한 이종성 폴리뉴클레오티드 발현 수준, 치료되는 특정 질병, 바이러스 벡터에 대한 임으의 숙주 면역 반응, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 발현 생성물(단백질)에 대한 숙주 면역 반응, 및 발현된 단백질의 안정성을 포함하는 여러 인자를 기초로 하여 다양할 것이다. 당업자는 상기 언급된 인자 뿐만 아니라 다른 인자를 기초로 하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 rAAV/벡터 게놈 용량 범위를 결정할 수 있다. 일반적으로, 용량은 치료 효과를 달성하기 위해 대상체의 체중 킬로그램 당 적어도 1X108 또는 그 초과, 예를 들어, 1X109, 1X1010, 1X1011, 1X1012, 1X1013 또는 1X1014 또는 그 초과의 벡터 게놈(vg/kg)의 범위일 것이다.
일부 구체예에서, 예를 들어, AAV-FIX39-Padua, 또는 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열 및 동일한 캡시드를 갖는 것을 포함하는 AAV 벡터의 치료학적 유효량은 혈우병 B 또는 인자 IX 활성의 기타 결핍을 갖는 대상체 예를 들어, 인간에 투여될 때 중증 혈우병 B를 중등증 또는 경증 혈우병 B로 전환시키거나 심지어 명백하게 질환-자유 상태로 유도하기에 충분한 양이다. 기타 구체예에서, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 혈우병 B를 갖는 인간 대상체가 인자 IX 대체 요법을 완전히 앞서가거나 적절한 지혈을 유지하기 위해 대체 FIX가 투여되는 빈도를 감소시키기에 충분한 양이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 인자 대체 요법은 혈우병 B에 대한 현재의 치료 표준이지만, 충분한 수준의 기능적 응고 인자를 생산하는데 있어서의 환자의 무능력을 고려한 경우, 재조합에 의해 생성된 인간 인자 IX의 빈번한 주입을 필요로 한다.
중증 혈우병 B는 종종 자발적으로(선행되는 외상없이) 대상체의 근육 또는 관절 내로의 빈번한 출혈(예를 들어, 주당 적어도 1회 또는 2회)을 특징으로 하는 것으로 일반적으로 받아들여진다. 건강한 인간에서 발견된 1% 미만의 FIX 활성은 중증 혈우병 B와 관련된다. 중등증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체는 중증 혈우병 B를 갖는 대상체보다 덜 빈번하게 예를 들어, 한 달에 약 1회로 출혈하지만, 수술, 외상 또는 치과 작업 후 정상보다 더 긴 시간 동안 출혈할 것으로 일반적으로 받아들여진다. 중등증의 질환을 갖는 인간 대상체는 종종 자발적으로 출혈하지 않는 것으로 일반적으로 받아들여진다. 정상의 1%-5% FIX 활성은 중등증 혈우병 B와 관련된다. 일반적으로, 경증 혈우병 B를 가진 인간 대상체는 출혈을 한다 하더라도 단지 수술이나 중증 외상으로 인해서만 과도하게 출혈한다. 일반적으로, 경증 혈우병은 정상 FIX 활성의 6%-40%와 관련이 있다. 일반적으로, 혈우병 B의 증상이 없는 건강한 것으로 여겨지는 개체는 정상 FIX 활성의 약 50% 내지 150%의 범위를 갖는다. 추가적인 정보는 문헌 [Fijnvandraat, et al., Diagnosis and management of hemophilia, Br. Med. J., 344:36-40 (2012)]에서 찾아볼 수 있다.
인자 IX 활성은 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나의 예시적인 비제한적 검정은 대상체로부터 수득된 혈장 샘플에서 FIX 응고 활성을 결정하기 위한 일-단계 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 검정이다. FIX 활성은 국제 단위(IU)로 빈번하게 표현되는데, 여기에서 1IU는 정상 도너로부터의 1ml의 풀링된 혈장 중에 존재하는 FIX 응고 활성으로서 정의된다. 이러한 관례를 이용하여, 중증의 혈우병 B는 0.01 미만 IU/ml FIX 수준과 관련이 있으며, 중등증 질환은 0.02-0.05 IU/ml FIX 수준과 관련이 있으며, 경증 질환은 0.06-0.40 IU/ml FIX 수준과 관련이 있으며, 질환이 없는 것은 0.50-1.50 IU/ml FIX 수준과 관련이 있다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 인자 IX 변이체 예컨대, 야생형 인간 FIX와 비교하여 더 높은 촉매 활성을 갖는 천연 발생 FIX Padua 변이체는 "비-Padua" FIX와 비교하여 더 낮은 농도의 활성 단백질에서 주어진 수준의 FIX 활성(예를 들어, 1IU/ml)을 생성할 수 있다.
특정 구체예에서, 예를 들어, AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 것을 포함하는 AAV 벡터의 치료학적 유효량은 중증, 중등증 또는 경증 혈우병 B를 갖는 대상체 예를 들어, 인간에 투여될 경우, 정상 FIX 활성의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 또는 50%, 또는 그 초과인 혈장 FIX 활성을 달성하기에 충분한 양이다. 기타 구체예에서, 치료학적 유효량은 FIX 활성이 결여된 대상체에서 1% 또는 그 초과의 FIX 활성 예를 들어, 대상체에서 1.5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30% 또는 그 초과의 FIX 활성을 달성하는 양이다.
혈우병 B를 갖는 대상체를 치료하는 것과 관련하여, 예를 들어, AAV-FIX39-Padua 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 것을 포함하는 AAV 벡터의 치료학적 유효량은 요망되는 치료학적 효과를 달성하기 위한, 대상체 체중 킬로그램 당 적어도 1x1010 벡터 게놈 (vg) (vg/kg), 또는 약 1x1010 내지 1x1011 vg/kg 대상체 체중, 또는 약 1x1011 내지 1x1012 vg/kg 대상체 체중 (예를 들어, 약 1x1011 내지 2x1011 vg/kg 또는 약 2x1011 내지 3x1011 vg/kg 또는 약 3x1011 내지 4x1011 vg/kg 또는 약 4x1011 내지 5x1011 vg/kg 또는 약 5x1011 내지 6x1011 vg/kg 또는 약 6x1011 내지 7x1011 vg/kg 또는 약 7x1011 내지 8x1011 vg/kg 또는 약 8x1011 내지 9x1011 vg/kg 또는 약 9x1011 내지 1x1012 vg/kg), 또는 약 1x1012 내지 1x1013 vg/kg 대상체 체중일 수 있다. 추가적인 용량은 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 대상체의 체중 킬로그램 당 약 5x1010 내지 1x1010 벡터 게놈 (vg) (vg/kg)의 범위, 또는 약 1x1010 내지 5x1011 vg/kg 대상체 체중의 범위, 또는 약 5x1011 내지 1x1012 vg/kg 대상체 체중의 범위, 또는 약 1x1012 내지 5x1013 vg/kg 대상체 체중의 범위일 수 있다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 약 2.0x1011 vg/kg, 2.1x1011 vg/kg, 2.2x1011 vg/kg, 2.3x1011 vg/kg, 2.4x1011 vg/kg, 2.5x1011 vg/kg, 2.6x1011 vg/kg, 2.7x1011 vg/kg, 2.8x1011 vg/kg, 2.9x1011 vg/kg, 3.0x1011 vg/kg, 3.1x1011 vg/kg, 3.2x1011 vg/kg, 3.3x1011 vg/kg, 3.4x1011 vg/kg, 3.5x1011 vg/kg, 3.6x1011 vg/kg, 3.7x1011 vg/kg, 3.8x1011 vg/kg, 3.9x1011 vg/kg, 4.0x1011 vg/kg, 4.1x1011 vg/kg, 4.2x1011 vg/kg, 4.3x1011 vg/kg, 4.4x1011 vg/kg, 4.5 x1011 vg/kg, 4.6 x1011 vg/kg, 4.7 x1011 vg/kg, 4.8 x1011 vg/kg, 4.9x1011 vg/kg, 5.0x1011 vg/kg, 5.1x1011 vg/kg, 5.2x1011 vg/kg, 5.3x1011 vg/kg, 5.4x1011 vg/kg, 5.5x1011 vg/kg, 5.6x1011 vg/kg, 5.7x1011 vg/kg, 5.8x1011 vg/kg, 5.9x1011 vg/kg, 6.0x1011 vg/kg, 6.1x1011 vg/kg, 6.2x1011 vg/kg, 6.3x1011 vg/kg, 6.4x1011 vg/kg, 6.5x1011 vg/kg, 6.6x1011 vg/kg, 6.7x1011 vg/kg, 6.8x1011 vg/kg, 6.9x1011 vg/kg, 7.0x1011 vg/kg, 7.1x1011 vg/kg, 7.2x1011 vg/kg, 7.3x1011 vg/kg, 7.4x1011 vg/kg, 7.5x1011 vg/kg, 7.6x1011 vg/kg, 7.7x1011 vg/kg, 7.8x1011 vg/kg, 7.9x1011 vg/kg, 또는 8.0x1011 vg/kg, 또는 일부 기타 용량이다. 임의의 이들 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
치료(예를 들어, 개선시키거나 치료 이점 또는 개선을 제공함)를 위한 "유효량" 또는 "충분한 양"의 용량은 전형적으로, 질병의 하나, 다수 또는 전부의 유해한 증상, 결과 또는 합병증, 예를 들어, 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 하나 이상의 유해한 증상, 장애, 질환, 병리, 또는 합병증에 대한 반응을 측정 가능한 정도로 제공하기에 효과적이며, 질병의 진행 또는 악화를 감소시키거나, 축소시키거나, 저해하거나, 억제하거나, 제한하거나, 조절하는 것도 만족스러운 결과이다.
유효량 또는 충분한 양은 단일 투여로 제공될 필요는 없으며, 다중 투여를 필요로 할 수 있고, 단독으로 또는 또 다른 조성물(예를 들어, 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 조합하여 투여될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 양은 대상체의 필요, 치료되는 질병의 유형, 상태 및 중증도 또는 치료의 부작용(존재시)에 의해 표시되는 것과 비례하여 증가될 수 있다. 또한, 유효량 또는 충분한 양은 제2 조성물(예를 들어, 또 다른 약물 또는 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없는데, 왜냐하면 해당 대상체에서 효과적이거나 충분한 것으로 여겨지기 위해 추가 용량, 상기 용량을 초과하거나 상기 용량 너머의 양 또는 기간, 또는 추가의 조성물(예를 들어, 약물 또는 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 포함될 수 있기 때문이다. 효과적인 것으로 여겨지는 양은 또한 응고 장애(예를 들어, 혈우병 A 또는 B)의 치료를 위한 또 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜, 예를 들어, 재조합 응고 인자 단백질의 투여의 이용 감소를 발생시키는 양을 또한, 포함한다.
유효량 또는 충분한 양은 치료되는 각각의 대상체 및 모든 대상체, 또는 해당 그룹 또는 집단 내의 치료 대상체 대부분에서 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분한 양은 그룹 또는 전체 집단이 아니라 특정 대상체에서의 유효성 또는 충분성을 의미한다. 상기 방법에 대해 통상적인 바와 같이, 일부 대상체는 해당 치료 방법 또는 용도에 대한 더 큰 반응, 또는 해당 치료 방법 또는 용도에 대한 덜한 반응 또는 반응 없음을 나타낼 것이다.
용어 "개선시키다"는 대상체의 질병 또는 이의 증상, 또는 기초 세포 반응에서의 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선은 질병, 또는 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행, 또는 기간에서의 주관적 또는 객관적 감소, 축소, 저해, 억제, 제한 또는 제어, 또는 질병의 증상 또는 기초 원인 또는 결과에서의 개선, 또는 질병의 역전을 포함한다.
따라서, 성공적인 치료 결과는 대상체에서 질환의 하나 이상의 해로운 증상 또는 기초 원인 또는 결과, 또는 질환의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간의 감소, 축소, 억제, 저지, 제한, 제어 또는 예방의 "치료학적 효과" 또는 "이익"을 유도할 수 있다. 따라서, 질환 또는 해로운 증상의 하나 이상의 근본 원인에 영향을 미치는 치료 방법 및 용도는 유익한 것으로 간주된다. 질병 또는 이의 해로운 증상을 안정화시키는 것과 같은 악화의 감소 또는 저하는 또한 성공적인 치료 결과이다.
따라서, 치료 유익 또는 개선은 질환, 또는 질환과 관련된 임의의 하나의, 대부분의 또는 전체 해로운 증상, 합병증, 결과 또는 근본적인 원인의 완전한 제거일 필요는 없다. 따라서, 단기간 또는 장기간(시간, 일, 주, 개월, 등)에 걸쳐 대상체 질환의 점진적 개선, 또는 질환의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간에서 부분적 감소, 저하, 억제, 저지, 제한, 제어 또는 예방, 또는 질환의 억제 또는 역전(예를 들어, 하나 이상의 증상 또는 합병증 안정화)이 있는 경우 만족스러운 종료점이 달성된다. 질환의 잠재적 치료학적 유익 또는 개선을 제공하는 치료와 같은 방법 또는 용도의 효과는 다양한 방법 예컨대, 피덩이 형성 시간 등에 의해 확인될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에 투여될 경우, 지속된 기간 동안 FIX 활성을 특정 수준을 초과하여 발생시키기에 충분한 양이다. 이들 구체예 중 일부에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 1.5년, 2년, 2.5년 3년, 3.5년, 4년, 4.5년, 5년, 5.5년, 6년, 6.5년, 7년, 7.5년, 8년, 8.5년, 9년, 9.5년, 10년 또는 그 초과의 지속 기간 동안 혈우병 B를 가진 인간 대상체에서 적어도 1% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 5% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 10% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 15% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 20% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 25% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 30% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 35% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 40% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 다른 구체예에서, AAV 벡터의 유효량은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개월 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10년 또는 그 초과의 지속된 기간 동안 적어도 45% 정상 FIX 활성을 발생시킨다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
기타 구체예에 따르면, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 인단 대상체에 투여될 경우 적어도 6개월의 지속된 기간 동안 정상의 적어도 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 또는 45%인 FIX 활성을 유도하기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터의 유효량은 약 5.0 x1011 vg/kg이며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율로 동일 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 투여될 수 있다.
예를 들어, AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터를 포함하는 치료학적 유효량의 AAV 벡터를 투여한 일부 인간 대상체에서, 벡터에 기인하는 FIX 활성이 연장된 기간 (예를 들어, 수개월 또는 수년)에 걸쳐 더 이상 충분한 것으로 간주되지 않는 수준으로 감소됨을 알 수 있다 (예를 들어, 대상체가 중등증 또는 중증 혈우병 B의 증상 및/또는 FIX 활성 특징을 나타내는 경우). 이러한 환경에서, 대상체에 초기 치료에서와 동일한 유형의 AAV 벡터가 다시 투약될 수 있다. 기타 구체예에서, 특히 대상체가 초기 벡터에 대한 면역 반응을 발달시킨 경우, 환자에 표적 세포에서 FIX를 발현하나 제1 AAV 벡터와 비교하여 덜 면역반응성인 상이한 또는 변이체 혈청형의 캡시드를 갖도록 설계된 AAV 벡터가 투여될 수 있다.
특정 구체예에 따르면, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에 투여되는 경우, 재조합 인간 인자 IX 대체 요법에 대한 대상체의 요구를 저하시키거나 심지어 제거하여 적절한 지혈을 유지하기에 충분한 양이다. 따라서, 일부 구체예에서, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 적절한 지혈을 유지하기 위해 중등증 또는 중증 혈우병 B를 갖는 평균 인간 대상체가 FIX 대체 요법을 필요로 하는 빈도를 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 만큼 감소시킬 수 있다. 관련 구체예에서, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 적절한 지혈을 유지하기 위해 중등증 또는 중증 혈우병 B를 갖는 평균 인간 대상체가 필요로 하는 재조합 인간 인자 IX의 용량을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 만큼 감소시킬 수 있다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
기타 구체예에서, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에 투여하는 경우 관절 내로의 자발적 출혈을 감소시키거나 심지어 제거하기에 충분한 양이다. 따라서, 일부 구체예에서, 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 중증 혈우병 B를 갖는 평균의 비처리된 인간 대상체와 비교하여, 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체 관절 내로의 자발적 출혈의 빈도를 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 만큼 감소시킬 수 있다. 관절 내로의 출혈은 관절의 자기 공명 영상 또는 초음파 검사, 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
혈우병 치료를 위한 AAV 벡터를 개발하기 위한 이전의 노력은 적어도 부분적으로 그러한 것으로 여겨지긴 하지만 종래 임상 시험에서 AAV 캡시드에 대한 강력한 면역 반응 때문에 성공적이지 못하였다. (예를 들어, 문헌 [Nathwani, et al., NEJM 2011;365(25):2357-2365; and Manno, et al., Nat Med 2006;12(3):342-347] 참조.) 진행중인 임상 시험은 본원의 AAV 벡터의 특정 구체예가 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에서 높은 수준의 FIX 활성을 생성할 수 있는 반면, AAV 벡터를 투여한지 6개월 후만큼 오래 면역 반응을 최소화시키거나 없앨 수 있음이 입증되었다 (실시예 5). 따라서, 특정 구체예에 따르면, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 대상체에 투여할 경우, 지혈을 유지하기에 적절한 FIX 활성을 발생시키는 반면, 상당한 기간에 걸쳐 최소의 면역 반응을 일으키거나 일으키지 않는 양이다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 선천적 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 세포성 면역 반응, 또는 심지의 세 가지 모든 유형의 면역 반응일 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 형질도입된 세포로부터 생성된 캡시드, 벡터 게놈, 및/또는 인자 IX 단백질에 대한 것일 수 있다.
특정 구체예에 따르면, 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 혈우병 B를 갖는 대상체에서 지혈을 유지하는데 적절한 FIX 활성을 유도하는 반면, 형질도입된 세포로부터 생성된 캡시드, 게놈 및/또는 인자 IX 단백질에 대한 최소의 체액성(즉, 항체) 면역 반응을 유도하거나 전혀 유도하지 않는다. 바이러스, 또는 바이러스-유사 입자 예컨대, AAV 벡터에 대한 항체 반응은 면역학 분야의 당업자에게 익숙한 기술을 사용하여 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항체 역가를 측정함으로써 결정될 수 있다. AAV 벡터의 임의의 구성요소 예컨대, 캡시드 단백질, 또는 벡터 게놈에 의해 인코딩되고 형질도입된 세포에서 생성된 유전자 생성물 예컨대, 인자 IX Padua (또는 기타 FIX 변이체)에 대한 항체 역가는 이러한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 항체 역가는 항체의 존재를 검출하는데 이용되는 특정 검정에서 항체 신호가 더 이상 검출가능하지 않기 전의 희석을 나타내는 비율로서 전형적으로 표현된다. 다양한 희석 배수 예를 들어, 2배, 5배, 10배, 또는 기타 다른 희석 배수가 이용될 수 있다. 항체의 존재에 대한 임의의 적합한 검정 예를 들어, 비제한적으로, WO 2015/006743에 기술된 바와 같은 ELISA, FACS, 또는 리포터 유전자 검정이 이용될 수 있다. 당업자의 지식에 따라 기타 검정을 사용하는 것이 또한 가능하다. 항체 역가는 AAV 벡터의 초기 투여 후 다양한 시점에서 측정될 수 있다.
특정 구체예에서, 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 혈우병 B를 갖는 대상체에 AAV 벡터를 투여한 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 그 초과의 기간에 측정할 경우, 형질도입된 세포로부터 생성된 캡시드, 게놈 및/또는 인자 IX 단백질 (예컨대, FIX Padua)에 대한 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 또는 그 초과보다 높지 않은 항체 역가를 유도하는 반면, 혈우병 B를 갖는 대상체에서 적어도 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 그 초과의 FIX 활성을 유도한다. 하나의 예시적인 비제한적 구체예에 따르면, AAV 벡터는 중증 혈우병 B를 갖는 대상체에서 적어도 20% FIX 활성을 발생하는 반면, 1:2, 1:3, 또는 1:4 이하인 형질도입된 세포에 의해 생성된 캡시드 및/또는 인자 IX에 대한 항체 역가를 유도하는데, 이 둘 모두는 AAV 벡터가 투여된 후 6개월 후에 일어난다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 혈우병 B에 대한 AAV-매개된 유전자 요법을 이용한 이전의 시도는 면역억제를 초래하는 고용량의 스테로이드를 필요로 하지 않으면서 상기 요법이 상당한 기간 동안 효과적이지 못하게 하는 자체-제한 면역 반응을 촉발시켰다. 중요한 인자는 연구중인 AAV 벡터로 형질도입된 간 세포를 제거하는 세포성 면역 반응인 것으로 보인다. 이러한 효과는 대상체에서 간 손상을 암시하는 간 효소의 증가 및 캡시드-특이적 T 세포의 존재 둘 모두로부터 검출가능하였다.
특정 구체예에서, 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 혈우병 B를 갖는 대상체에서 지혈을 유지하는데 적절한 FIX 활성을 발생시키는 반면, 형질도입된 세포로부터 생성된 캡시드 및/또는 인자 IX 단백질에 대한 최소의 세포성 면역 반응을 유도하거나 전혀 유도하지 않는다. 세포성 면역 반응은 적어도 2가지 방식으로 결정될 수 있다: 캡시드 단백질 또는 인자 IX에 대해 특이적인 T 세포 활성을 검정, 및 간세포에 대한 손상을 나타내는 증가된 간 효소 수준의 존재에 대한 평가.
일부 구체예에서, 세포성 면역 반응은 형질도입된 간 세포에 의해 생성된 캡시드 단백질 및/또는 인자 IX 단백질에 특이적인 T 세포 활성을 검정함으로써 결정된다. T 세포 반응에 대한 다양한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 하나의 예시적인 비제한적 구체예에서, T 세포 반응은 혈우병 B를 치료하기 위한 AAV 벡터로 이전에 처리된 대상체로부터의 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 수집함으로써 결정된다. 그 후, 세포는 벡터에 사용된 VP1 캡시드 단백질 및/또는 형질도입된 간 세포에 의해 생성된 인자 IX 단백질 예컨대, FIX Padua로부터 유래된 펩티드와 인큐베이션된다. 캡시드 단백질 또는 인자 IX 단백질을 특이적으로 인식하는 T 세포는 자극되어 사이토카인 예컨대, 인터페론 감마 또는 또 다른 사이토카인을 방출할 것이며, 이어서 이는 ELISPOT 검정, 또는 당업자에게 익숙한 또 다른 검정을 이용하여 검출되고 정량화될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Manno, et al., Nat Med 2006;12(3):342-347] 참조). T 세포 반응은 대상체에 혈우병 B를 치료하기 위한 용량의 AAV 벡터를 예를 들어, 매주, 매달, 또는 일부 다른 간격을 두고 투여하기 전 및 투여한 후의 다양한 시간에 모니터링될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에 따라, 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 혈우병 B를 갖는 대상체에서 지혈을 유지하기에 적절한 FIX 활성 (예를 들어, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 그 초과의 FIX 활성)을 발생시키는 반면, AAV 벡터가 투여된 후 매주, 매달, 또는 일부 다른 간격을 두고 측정될 경우, 또는 AAV 벡터가 투여된 후 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 또는 일부 상이한 시간에서 측정될 경우, 검정된 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 또는 그 초과를 넘지 않는 1백만 PBMC 당 스팟-형성 유닛인, ELISPOT를 사용하여 측정된 T 세포 반응을 초래한다. 일부 이들 구체예에서, ELISPOT 검정은 형질도입된 간 세포에 의해 생성된 인자 IX 단백질(FIX Padua, 또는 상이한 변이체 포함) 또는 AAV 벡터 캡시드 단백질로부터의 펩티드에 의해 자극된 인터페론 감마 (또는 일부 다른 사이토카인)를 검출하도록 설계된다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
형질도입된 간세포에 대한 세포성 면역 반응의 대용물로서, 정상보다 초과하는 간 효소의 존재는 표준 방법을 이용하여 검정될 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 종래 임상 시험에서 사용된 것과 같은 특정 AAV 벡터에 특이적인 T 세포는 간 효소를 순환계로 일시적으로 방출하는 형질도입된 간세포를 공격하여 사멸시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 예시적인 간 효소는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 및 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 포함하나, 간 손상을 나타내는 다른 효소가 또한 모니터링될 수 있다. 순환계에서 이들 효소의 정상 수준은 전형적으로 상위 수준을 갖는 범위로서 전형적으로 규정되는데, 효소 수준이 상기 상위 수준 위로 상승되어 간 손상의 나타내는 것으로 간주된다. 정상 범위는 검정을 수행하는 임상 실험실에 의해 사용되는 표준에 부분적으로 의존적이다. 특정 구체예에서, 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 혈우병 B를 갖는 대상체에서 지혈을 유지하기에 적절한 FIX 활성 (예를 들어, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 그 초과의 FIX 활성)을 발생시키는 반면, AAV 벡터의 투여 후 다양한 시간 (예를 들어, 매주 또는 매달 간격으로)에서의 처리하에 동일한 대상체로부터 추출된 다중 샘플에서 측정된 가장 높은 수준에서 또는 평균에서, 이들의 각 범위의 정상상한치(ULN) 값의 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, 2000%를 초과하지 않는 ALT, AST 또는 LDH의 수준과 같은 증가된 순환 간 효소 수준을 초래한다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
혈우병 B를 치료하기 위한 AAV 벡터를 사용하는 이전의 임상 시험에서, 연구자들은, 치료제가 투여된 대상체가 인자 IX 단백질을 생성하는 형질도입된 세포를 제거하는 면역 반응을 증가시키는 것을 예방하기 위해 스테로이드와 같은 면역억제 약물을 공동-투여할 필요가 있었다. 그러나, 특정 AAV 벡터로 실험적으로 처리되는 대상체에서 관찰된 약화된 면역 반응으로 인해, 면역억제 약물의 공동-투여는 필요하지 않을 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, AAV 벡터의 치료학적 유효량은 면역억제제 약물 (예컨대, 스테로이드 또는 기타 면역억제제)의 공동-투여(전, 동시, 또는 후)를 필요로 하지 않으면서, 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 대상체에서 적절한 지혈을 유지하기에 충분한 양이다. 그러나, 모든 대상체에서 면역 반응이 예측가능한 것은 아니기 때문에, 본원의 혈우병 B 치료 방법은 면역억제제 약물과 공동-투여되는 AAV 벡터를 포함한다. 면역억제제 약물의 공동-투여는 AAV 벡터를 혈우병 B를 갖는 대상체에 투여하기 전에, 투여와 동시에 또는 그 후에 발생할 수 있다. 일부 구체예에서, 혈우병 B를 치료하기 위한 AAV 벡터를 투여한 후 수 일, 수 주, 또는 수 개월의 기간 동안 면역억제제 약물이 대상체에 투여된다. 예시적인 면역억제 약물은 스테로이드(예를 들어, 비제한적으로, 프레드니손 또는 프레드니솔론) 및 비-스테로이드 면역억제제 예컨대, 사이클로스포린, 라파마이신 및 기타 등등을 포함한다. 충분한 면역억제를 달성하기 위해 약물 용량 및 처리 시간 경과에 필요한 것은 처리되는 각 대상체에 대한 고유한 인자에 의존적일 것이나, 투여량 및 처리 시간 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 일부 구체예에서, 면역억제제는 1회 초과로 투여될 필요가 있을 수 있다.
특정 구체예에 따르면, 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체 집단에 투여되는 경우 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 FIX 활성의 일관된 상승을 발생시킨다. 일관성은 평균 및 표준 편차(SD)와 같은 통계적 방법 또는 당업자에게 익숙한 또 다른 통계적 기술을 사용하여 인간 대상체 집단에서 반응의 가변성을 계산함으로써 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체 집단에 투여될 경우 치료학적 유효량의 AAV 벡터는 투여 후 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월, 18개월, 21개월, 또는 21개월째에 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 1-5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 2.5-7.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 5-10%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 7.5-12.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 10-15%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 12.5-17.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 15-20%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 17.5-22.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 20-25%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 22.5-27.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 25-30%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 27.5-32.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 30-35%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 32.5-37.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 35-40%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 37.5-42.5%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 40-45%의 평균 FIX 활성; 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 42.5-47.5%의 평균 FIX 활성; 또는 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 SD를 갖는 45-50%의 평균 FIX 활성을 발생시킨다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 요망되는 치료적, 유익한, 가산적, 상승작용적 또는 상보적 활성 또는 효과를 갖는 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료제 또는 기타 치료 요법 또는 프로토콜과 조합될 수 있다. 예시적인 조합 조성물 및 치료제는 제 2의 활성제, 예컨대, 생물제제 (단백질), 제제 및 약물을 포함한다. 그러한 생물제제 (단백질), 제제, 약물, 치료제 및 요법은 본 발명의 임의의 다른 방법 또는 용도, 예를 들어, 혈액 응고 질환에 대해 대상체를 치료하는 치료 방법 전에, 실질적으로 이와 동시에 또는 그 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
화합물, 제제, 약물, 치료제 또는 기타 치료 요법 또는 프로토콜이 조합 조성물로서 투여될 수 있거나, 핵산, 벡터, 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV), 벡터 게놈 또는 재조합 바이러스 입자의 전달 또는 투여와 별도로, 예컨대, 동시에 또는 연속적으로 또는 순차적으로 (전 또는 후에) 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도가 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물과 병행되는 조합을 제공한다. 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물은 본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV), 벡터 게놈 또는 재조합 바이러스 입자의 대상체로의 투여 전, 실질적으로 이와 동시에 또는 그 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 조합 조성물은 하나 이상의 면역억제제를 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 하나 이상의 면역억제제를 포유동물에 투여하거나 전달하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 조합 조성물은 AAV-FIX 입자 및 하나 이상의 면역억제제를 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 AAV-FIX 입자를 포유동물에 투여하거나 전달하고 면역억제제를 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 당업자는 하나 이상의 면역억제제와 이러한 조합 조성물 및 면역억제제의 포유동물로의 투여의 적절한 필요성 또는 시기를 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법 및 사용은 특히 또 다른 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정 또는 치료제의 감소된 필요 또는 사용을 유도하는 방법 및 사용을 포함한다. 예를 들어, 혈액 응고 질병에 대해, 본 발명의 방법 또는 용도는 대상체에서 결핍되거나 결함이 있는(비정상 또는 돌연변이체) 내인성 응고 인자를 보충하기 위한 재조합 응고 인자 단백질의 투여의 덜한 빈도 또는 감소된 용량 또는 제거가 제공된 대상체에서 존재한 경우에 치료 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따르면, 또 다른 치료 또는 요법의 필요 또는 사용을 감소시키는 방법 및 용도가 제공된다.
본 발명은 인간을 포함하는 포유동물 및 수의학 적용에서 유용하다. 따라서, 적합한 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간은 물론 비-인간 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로, 포유동물, 예컨대, 인간, 비-인간 영장류 (유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크 (macaque)), 애완 동물 (개 및 고양이), 가축 (가금류, 예컨대, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험용 동물 (마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그)를 지칭한다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 대상체는 동물 질환 모델, 예를 들어, 혈액 응고 질환의 마우스 및 기타 동물 모델 및 당업자에게 공지된 기타 질환을 포함한다.
치료에 적합한 대상체는 기능성 유전자 생성물(단백질)이 결핍되거나 이들을 불충분한 양으로 생성하거나 그럴 위험성이 있는 대상체, 또는 질환으로 이어질 수 있는 비정상적인 부분 기능성 또는 비-기능성 유전자 생성물(단백질)을 생성하는 대상체를 포함한다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 또한 질환으로 이어지는 비정상 또는 결손 (돌연변이체) 유전자 생성물 (단백질)을 갖거나 이를 생성할 위험성이 있어서 비정상 또는 결손 (돌연변이체) 유전자 생성물 (단백질)의 양, 발현 또는 기능의 감소가 질환 치료를 유도하거나 하나 이상의 증상을 감소시키거나 질환을 완화시키는 대상체를 포함한다. 따라서, 표적 대상체는 혈우병(예를 들어, 혈우병 B)과 같은 혈액 응고 인자 생성이 비정상적이거나, 불충분하거나, 결여된 대상체를 포함한다.
본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 보충 단백질(예를 들어, 혈우병을 치료하기 위한 재조합 혈액 응고 인자 예컨대, FIX)로 이전에 또는 현재 치료된 대상체를 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 또한, FIX 단백질에 대해 실질적인 또는 검출가능한 면역 반응, 또는 FIX 기반 유전자 요법을 방해하거나 차단하는 FIX 단백질에 대한 억제 항체의 양에 영향을 주지 않는 대상체를 포함한다.
기타 구체예에서, 혈우병 B(예를 들어, 유전형)를 가지나 혈우병 B의 증상 어느 것도 아직 나타내지 않는 인간 소아 대상체는 AAV 벡터로 예방적으로 치료되어, 임의의 이러한 증상이 제1 장소에서 발생하거나 기타 구체예에서, 이들이 다른 치료가 없을 때처럼 심각해지는 것을 예방할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 방식으로 예방적으로 치료된 인간 대상체는, 이들에 AAV 벡터를 투여하여 지혈을 유지하는데 적합한 FIX 활성을 생성하고 유지시켜, 혈우병 B의 하나 이상의 증상의 중증도를 예방하거나 감소시킬 때, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월령 또는 그 초과이다. 이들 구체예 중 임의의 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-FIX39-Padua, 또는 동일한 캡시드 및 이와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 게놈 서열을 갖는 AAV 벡터일 수 있으며, 이는 단독으로 또는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 일부 다른 비율의 빈 캡시드 대 벡터 비율의 동일한 캡시드 유형의 빈 캡시드와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
대상체로의 투여 또는 생체내 전달은 질환에 의해 초래되거나 질환과 관련된 해로운 증상, 병태, 합병증 등의 발달 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 스크린 (예를 들어, 유전학용)은 본 발명의 조성물, 방법 및 용도를 위한 후보로서 이러한 대상체를 확인하는데 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 대상체는 기능성 유전자 생성물(단백질)에서 불충분한 양 또는 결핍에 대해 양성으로 스크리닝된 대상체, 또는 비정상적인 부분적 기능성 또는 비기능성 유전자 생성물(단백질)을 생성시키는 대상체를 포함한다.
본 발명의 방법 및 용도는 전신적, 영역적 또는 국소적, 또는 임의의 경로에 의한, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 이러한 전달 및 투여는 비경구, 예를 들어, 혈관내, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 피하 또는 점막경유를 포함한다. 예시적인 투여 및 전달 경로는 정맥내 (i.v.), 복강내 (i.p.), 동맥내, 피하, 흉막내, 삽관내, 폐내, 공동내, 이온삼투압, 기관내, 흉강내를 포함한다.
대안적으로 또는 부가적으로, AAV 벡터는 간문맥을 통해 간에 전달될 수 있다. 또 다른 대안에서, 대퇴동맥내로 도입되는 카테터는 간동맥을 통해 간으로 AAV 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 내시경역행담췌관조영 (ERCP)과 같이 비외과적 수단이 또한, AAV 벡터를 간으로 직접 전달함으로써 혈류 및 AAV 중화 항체를 우회하는데 사용될 수 있다. 기타 관 시스템, 예컨대, 턱밑샘의 관이 또한 이미 존재하는 항-AVV 항체를 갖거나 이를 발달시키는 대상체로 AAV 벡터를 전달하기 위한 문으로서 사용될 수 있다.
용량은 다양할 수 있고, 치료가 유도되는 질병의 유형, 발생, 진행, 중증도, 빈도, 기간, 또는 가능성, 요망되는 임상 종점, 이전 또는 동시 치료, 대상체의 전반적 건강, 연령, 성별, 인종 또는 면역학적 능력 및 당업자에 의해 인지될 다른 인자에 좌우된다. 치료 또는 요법의 임의의 유해한 부작용, 합병증 또는 다른 위험 인자 및 대상체의 상태에 의해 나타내는 바에 따라 용량, 수, 빈도 또는 기간이 비례적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 당업자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양을 제공하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있는 인자를 인지할 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법 및 용도는 대상체가 치료에 표적화된 질환을 갖는 것으로 확인되거나, 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 심지어 대상체가 질환의 하나 이상의 증상을 갖지 않더라도 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝되고 양성으로서 확인된 후 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 또는 24-72 시간내에 실시될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법 및 용도는 치료에 표적화된 질환을 갖는 것으로 확인되거나, 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 본원에서 기재된 바와 같이 스크리닝되고 양성으로서 확인된 후 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 또는 그 초과의 일, 개월 또는 년째에 실시될 수 있다.
본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 벡터 게놈 및 재조합 바이러스 입자 및 기타 조성물, 제제, 약물, 생물제제(단백질)이 약학적 조성물 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 내로 혼입될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 특히, 생체내 또는 생체외에서 대상체로의 투여 및 전달에 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 투여, 생체 내 전달 또는 접촉 중 하나 이상의 경로에 적합한 생물학적으로 허용되는 제형, 기체, 액체 또는 고체, 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "약학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은 생물학적으로 또는 다르게 바람직한 물질이며, 예를 들어, 상기 물질은 실질적인 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기시키지 않고 대상체에 투여될 수 있다. 따라서, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 대상체로 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 투여하는데 사용될 수 있다.
이러한 조성물은 약학적 투여 또는 생체 내 접촉 또는 전달과 양립되는 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭서, 분산액 및 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연 작용제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 정제(코팅되거나 코팅되지 않음), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보조 활성 화합물(예를 들어, 보존제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제)이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
약학적 조성물은 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 투여 또는 전달의 특정 경로와 양립되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 활성 화합물의 수성 및 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하며, 여기서 제조물은 전형적으로 멸균 제조물이며, 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 될 수 있다. 비제한적인 예시적인 예는 물, 염수, 덱스트로스, 프룩토스, 에탄올, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다.
공용매 및 애쥬번트가 제형에 첨가될 수 있다. 공용매의 비제한적인 예는 하이드록실기 또는 다른 극성 기, 예를 들어, 알코올, 예컨대, 이소프로필 알코올; 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알코올 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 함유한다. 애쥬번트는, 예를 들어, 계면활성제, 예컨대, 콩 레시틴 및 올레산; 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트; 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 적합한 약학적 조성물 및 전달 시스템은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, [Remington : The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack PublishingCo., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack PublishingCo., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic PublishingCo., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano,ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315 참조).
본원에 사용된 바와 같은 "단위 투여량 형태"는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적당한 물리적으로 구분된 단위를 지칭하고; 각각의 단위는, 임의로, 하나 이상의 용량으로 투여되는 경우에 요망되는 효과 (예를 들어, 예방 또는 치료 효과)를 생성시키도록 계산된 약학적 담체 (부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 함께 소정량을 함유한다. 단위 투여량 형태는, 예를 들어, 냉동-건조된 또는 동결건조된 상태의 조성물 또는 액체 조성물을 포함할 수 있는 앰플 및 바이알내에 있을 수 있으며; 예를 들어, 멸균 액체 담체는 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여량 형태는 다중-용량 키트 또는 컨테이너내에 포함될 수 있다. 따라서, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 벡터 게놈, 재조합 바이러스 입자, 및 이의 약학적 조성물은 투약의 용이성 및 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여량 형태로 패키징될 수 있다.
본 발명은 패키징 물질 및 내포된 하나 이상의 성분들을 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로, 성분들의 설명 또는 내포된 성분들의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 그러한 성분들, 예를 들어, 핵산, 재조합 벡터, 바이러스 (예를 들어, AAV) 벡터, 벡터 게놈 또는 바이러스 입자 및 임의로 제2 활성제, 예컨대, 또 다른 화합물, 제제, 약물 또는 조성물의 수집물을 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 성분들을 수용한 물리적 구조물을 지칭한다. 패키징 물질은 성분들을 멸균으로 유지시킬 수 있으며, 이러한 목적을 위해 흔히 사용되는 재료 (예를 들어, 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 내포된 하나 이상의 성분들의 식별 정보, 용량, 작용 메카니즘을 포함하는 활성 구성성분(들)의 임상적 약리학, 약동학 및 약역학을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 장소 및 날짜 즉, 유통 기한을 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 질환에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 성분들중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위해 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 본원에 기술된 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 요법중 임의의 것을 실행하기 위한 설명, 투여량, 빈도 또는 기간을 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 예방 또는 치료 이점과 같이 성분이 제공할 수 있는 임의의 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 잠재적인 해로운 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보, 예컨대, 특정 조성물을 사용하는데 적합하지 않을 상황에 관한 대상체 또는 임상의에 대한 경고를 포함할 수 있다. 해로운 부작용 또는 합병증은 또한, 대상체가 본 조성물과 양립가능하지 않을 수 있는 하나 이상의 다른 약제를 섭취했거나, 섭취할 예정이거나, 현재 섭취 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 양립가능하지 않을 또 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 예정이거나, 현재 받는 중인 경우에 발생할 수 있으며, 따라서, 설명서는 이러한 부적합에 대한 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은, 성분, 키트 또는 패키징 물질 (예를 들어, 박스)에 부착되거나 분리되거나, 키트 성분을 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄된 물질" 예를 들어, 종이 또는 판지를 포함한다. 라벨 또는 삽입물은 추가적으로 컴퓨터 판독가능한 매체, 예컨대, 바-코드 인쇄된 라벨, 디스크, 광학 디스크 예컨대, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자석 테이프, 또는 전기 저장 매체, 예컨대, RAM 및 ROM, 또는 이들의 혼성체, 예컨대, 자석/광 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 타입 카드를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법들 및 재료들이 본원에 기술되어 있다.
본원에 인용된 모든 출원, 공개, 특허, 및 기타 참조문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 이들의 전체가 참조로 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 기준이 될 것이다.
본원에 개시된 특징들 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적으로 작용하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 이와 같이, 달리 명확히 명시되지 않는 한, 개시된 특징들 (예를 들어, 변형된 핵산, 벡터, 플라스미드, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 벡터 게놈, 또는 재조합 바이러스 입자)은 동등하거나 유사한 부류의 특징들의 예이다.
본원에 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 그러한 핵산들을 포함하며, "벡터"에 대한 언급은 복수의 그러한 벡터들을 포함하며, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 그러한 비리온들/입자들을 포함한다.
본원에 사용되는 모든 수치 값 또는 수치 범위는 달리 문맥에서 분명하게 지시되지 않는 한 그러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 소수를 포함한다. 따라서, 예시하자면, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등뿐만 아니라 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등, 및 기타 등등을 포함한다.
초과 (이상) 또는 미만을 갖는 정수에 대한 언급은 각각 언급된 수보다 큰 또는 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만에 대한 언급은 99, 98, 97 등, 숫자 일 (1)까지 낮은 모든 수를 포함하며; 10 미만은 9, 8, 7 등등, 숫자 일 (1)까지 낮은 모든 수를 포함한다.
본원에 사용되는 모든 수치 값 또는 범위는 달리 문맥에서 분명하게 지시되지 않는 한 그러한 범위 내의 값 및 정수의 소수 및 그러한 범위 내의 정수의 소수를 포함한다. 따라서, 예시하자면, 수치 범위에 대한 언급, 예컨대, 1-10은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10뿐만 아니라, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 및 기타 등등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 및 50을 포함하는 50 이하 뿐만 아니라, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등, 및 기타 등등을 포함한다.
일련 범위에 대한 언급은 일련 내의 상이한 범위의 경계값을 합한 범위를 포함한다. 따라서, 예시하자면, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500-3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 4,500-5,000, 5,500-6,000, 6,000-7,000, 7,000-8,000, 또는 8,000-9,000의 일련의 범위에 대한 언급은 10-50, 50-100, 100-1,000, 1,000-3,000, 2,000-4,000 등의 범위를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 다수의 구체예 및 양태를 기술하기 위해 긍정의 언어를 사용하여 본원에서 개시되었다. 또한, 본 발명은 특히 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같이 특정 주제가 전부 또는 일부 배제된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 본 발명에는 본 발명이 무엇을 포함하지 않는지에 대해 본원에 일반적으로 나타나지 않지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명에 명확하게 배제되지 않은 양태들은 본원에서 개시된다.
본 발명의 다수 구체예가 기술되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자는 다양한 용도 및 조건에 맞춰 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다.
따라서, 하기 실시예는 예시하고자 의도된 것이며, 어떠한 방식으로 청구된 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. 벡터 설계/제조
338L Padua 변이체(Simioni P, et al., N Engl J Med 2009, 361:1671)를 갖는 높은 특이적 활성 인간 인자 IX 단백질을 인코딩하는 신규한 인자 IX 핵산을 설계하였다("FIX 39-Padua"; SEQ ID NO:10; 도 10). FIX39-Padua는 FIX 코딩 및 인트론 서열에서 CpG 디뉴클레오티드가 완전히 제거된 것이다. 비교 시험을 위해, FIX19 (Mingozzi et al. Sci. Transl Med. 2013)를 제조하고 FIX Padua를 포함하고 FIX Padua로부터 발생하는 임의의 잠재적인 혼재 효과를 배제하도록 변형시켰다("FIX19-Padua; SEQ ID NO:11; 도 11).
플라스미드( "pAAV-ApoE_hAAT-FIX39"; 11125 bp; SEQ ID NO: 12;도 12a)를 합성하고, 표 2에 기재된 요소 및 FIX39-Padua 발현 카세트를 포함시켰다. PAAV-ApoE_hAAT-FIX39의 맵은 도 13에 도시되어 있다.
표 2. pAAV - ApoE _ hAAT - FIX39
Figure 112018017790524-pct00002
FIX39-Padua 코딩 서열 및 인트론 A의 서열은 SEQ ID NO:25 (도 15)에 제시되어 있다. FIX19-Padua CDS 및 동일한 조절 요소, 동일한 아데노-관련 역방위 말단 반복부(ITR) 및 pAAV-ApoE_hAAT-FIX39와 동일한 간-특이적 ApoE/hAAT 프로모터를 포함하는 플라스미드를 또한 합성하였다.
AAV-FIX39-Padua("AAV-FIX39-Padua") 및 FIX19-Padua("AAV-FIX19-Padua") 전이유전자에 있어서, 삼중 형질감염 과정에 이어서 이중 세슘 클로라이드 구배 원심분리(Ayuso E, Met al., Gene Ther 2010, 17:503)를 이용하여 4-1 캡시드 변이체(SEQ ID NO:4)를 갖는 AAV 벡터를 제조하였다. 표준으로서 선형화된 플라스미드를 사용하여 정량적 PCR에 의해 벡터를 적정하였다. 실시예 3에 기술된 연구에 있어서, 벡터를 꼬리 정맥 주사를 위해 마우스 당 200㎕의 최종 부피로 PBS, 5% 소르비톨, 0.001% F68로 희석하였다.
실시예 2. 시험관내 AAV 변이체 4-1 형질도입
시노몰구스 원숭이 및 인간 기원으로부터의 일차 간세포를 루시퍼라제를 발현하는 4-1 변이체 캡시드(SEQ ID NO:4)로 세포 당 500 내지 62,500개 벡터 게놈 범위의 4가지의 상이한 감염 다중도(MOI)로 형질도입하였다. 형질도입 후 72시간째에, 루시퍼라제 발현을 분석하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 비-인간 영장류 간세포에 비해 형질도입된 인간 간세포의 비율은 사용된 MOI에 따라 0.8 내지 1.5의 범위였다. 시험관내에서 생성된 이러한 데이터는 시노몰구스 원숭이 및 인간 대상체에서 응고 인자 IX의 발현과 비교할 경우 생체내에서의 이전 관찰과 일관되는 것으로 보인다.
실시예 3. 효능 연구
마우스에서 AAV-FIX39-Padua 대 AAV-FIX19-Padua의 효능을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 1x1011 또는 1x1012 vg/kg의 AAV-FIX39-Padua 및 AAV-FIX19-Padua를 8-10주령의 5마리 마우스 군에 주입하였다. 벡터 투여 후, 헤파린 처리된 모세관을 사용하여 눈뒤 출혈에 의해 혈액을 수집하였다; 혈장을 4℃에서 10분간 9000 rpm으로 원심분리에 의해 분리하고 분석할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
수집된 혈장을 사용하여 hFIX 전이유전자 발현을 평가하였다. 혈장 중 인간 FIX 수준은 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다(Affinity Biologicals, Ancaster, ON, Canada).
인간 FIX의 활성 수준을 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정에 의해 측정하였다. 샘플 혈장을 인간 FIX-결핍 혈장(George King Biomedical, Inc) 및 aPTT 시약(Trinity Biotech)과 1:1:1 부피-비율로 혼합하고, 이어서 37℃에서 180s 인큐베이션 기간을 통해 aPTT 검정을 수행하였다. 25mM 칼슘 클로라이드를 첨가하여 응고를 시작하였다. 응고 형성 시간은 STart4 응고 도구(Diagnostica Stago)를 사용하여 측정하였다. TBS pH 7.4 (48 ㎕ + 192 ㎕) 중의 1:5 희석에서 시작하여 이어서 1:2 연속 희석 (120 ㎕ +120 ㎕)하여 George King으로부터의 풀링된 정상 혈장으로 표준 곡선을 생성하였다. 인간 표준 곡선을 사용하여 벡터 투여 후 17주에 각 샘플의 활성을 계산하였다; 2개의 미처리된 마우스 중의 활성을 또한 측정하였다. 미처리된 마우스의 FIX 활성을 평균화한 다음, 처리된 샘플로부터 감산하여 FIX Padua 단백질로 인한 여분의(즉, 인간) 활성을 계산하였다.
도 17에 도시된 바와 같이, AAV-FIX39-Padua 및 AAV-FIX19-Padua는 실질적으로 동등한 수준의 FIX를 발현하는 것으로 보인다.
벡터 투여 후 17주째에, 인간 FIX 활성을 1x1012 vg/kg의 벡터 용량으로 처리된 마우스에서 측정하였다. FIX19-Padua 및FIX39-Padua 군 둘 모두에 있어서 활성-대-항원 비율은 5.2 내지 7.5의 범위이며, 평균 값은 6.4이다(표 3).
표 3. 인간 FIX 활성 값
Figure 112018017790524-pct00003
이러한 결과는 두 발현 카세트 모두의 효능이 실질적으로 유사함을 암시하지만, 두 작제물을 또한 플라스미드 유체역학적 꼬리 정맥 주입의 설정하에 분석하였다. 네이키드 DNA의 생체내 투여에서 유도된 FIX 수준을 평가하기 위한 이론적 근거는 AAV 역가화, 벡터 제작, 등의 차이의 잠재적 간섭 없이 두 발현 카세트 모두를 비교하는 것이었다.
도 18에 도시된 바와 같이, 두 네이키드 발현 카세트 모두는 FIX 발현을 유도하는데 있어서 동등한 효능이 있으며, 이는 AAV 설정에서 수득된 데이터를 확인시켜준다. 이러한 결과는 FIX19-Padua 및 FIX39-Padua 발현 카세트가 유사한 효능을 가짐을 나타낸다.
실시예 4. AAV - FIX39 - Padua 유전자 요법
AAV-FIX39-Padua의 단일 IV 주입의 안전성과 동역학을 결정하기 위해 임상 연구를 수행하고 있다. 사용된 AAV 4-1 캡시드 변이체는 양호한 안전성 및 효능, 벡터 주입 3개월 후 1x1012 vg/kg으로 ~35%의 NHP 중의 지속적인 FIX 활성 수준을 달성하는 능력을 갖는 것으로 전임상 연구에서 입증되었으며; AAV 4-1 캡시드 변이체에 대한 중화 항체(Ab)를 교차 반응시키는 것은 AAV8보다 약 10% 덜 흔하다. 연구 설계는 표 4에 제공되어 있다.
표 4. AAV - FIX39 - Padua 임상 연구 설계
Figure 112018017790524-pct00004
Figure 112018017790524-pct00005
실시예 5. 임상 결과
혈우병 B를 갖는 4명의 대상체에 AAV-FIX39-Padua 벡터를 단일 IV 주입 투여하였다. 각각 23세 및 18세의 첫 번째 두 대상체는 간 질환에 대한 병력이 없으며, 47세의 세 번째 대상체는 HCV 감염 병력은 있으나 자발적으로 치료되었다. 모두 4명의 대상체를 신규한 AAV 캡시드에 대한 중화 항체에 대해 스크리닝하였으며 음성인 것으로 밝혀졌다.
대상체 정맥내로 ~1시간의 기간에 걸쳐 5x1011 vg/kg의 AAV-FIX39-Padua 벡터를 주입하였다. 각 대상체에 투여된 총 AAV-FIX39-Padua 벡터는 도 20-23에 도시되어 있으며, 이는 지시된 양의 AAV 빈 캡시드와 조합되었다.
도 19-23은 0일에 투여된 AAV-FIX39-Padua 벡터로의 연구 결과를 보여준다. 결과는 연구 평가 기간 전반에 걸쳐 증가된 FIX 활성에 의해 반영되는 바와 같이, 모두 4명의 대상체에서 증가된 인자 IX 생산을 보여준다.
0일부터 약 3일까지의 FIX 활성의 초기 증가는 100 IU/Kg AlprolixTM 또는 BeneFIXTM의 투여로 인한 것이며, 이들은 약 82시간의 대략적 반감기를 갖는 재조합 FIX-Fc 융합 단백질이다. AAV-FIX39 Padua 벡터에 기인하는 인자 IX 활성은 AAV 벡터 주입 후 약 6-8일에 시작된다.
도 19에 요약되고, 도 20, 21a, 22a 및 23a에 각 개별 대상체에 대해 도시된 바와 같이, 인자 IX 활성은 대상체 4명 모두에 대한 183, 102, 69 및 50일 평가 전반에 걸쳐 점차적으로 증가하고 안정적인 것으로 나타났다. 이들 데이터는 5x1011 vg/kg의 AAV-FIX39-Padua 벡터 단일 주입이 현저하고 지속된 인자 IX 생산 및 활성을 발생시켜 혈우병 B 환자에게 지혈을 제공하는 의미 있고 유익한 혈액 응고 활성을 제공함을 나타낸다.
도 19, 20a, 21a, 22a 및 23a에 도시된 바와 같이, 인자 IX 활성 수준은 주입 후 183, 102, 69 및 50일에서 대상체 1-4에 있어서 각각 정상의 28%, 41%, 26% 및 33%이었다. 대상체 #3은 벡터 주입 후 2일째에 의심되는 발목 출혈에 대해 연장된 반감기 생성물로 스스로 처리하고; 이를 제외하고는 평가 기간 동안 인자를 주입하지 않았으며 출혈도 없었다.
면역억제제(스테로이드)는 어떠한 대상체에도 투여하지 않았다. 또한, 일반적으로, 정상의 상한치를 초과하는 트랜스아미나제의 지속적인 상승은 없었으며, 이는 치료의 부작용이 없음을 나타낸다 (도 20b, 21b, 22b 및 23).
ELISPOT를 사용하여 4명 모두의 대상체에서 AAV 및 FIX에 대한 T 세포 반응을 모니터링하였으며, 반응을 전혀 보이지 않거나 매우 낮은 반응을 보였다. 주목할 것은, 인자 IX 수준이 플래토 수준으로 증가하는 시간 경과는 현재까지 상당히 일관되었다 (도 19). 항원 수준에서의 완만한 변동은, 인자 IX Padua 변이체의 특이적 활성에서의 8배 증가를 고려할 때 활성 수준에서의 더 큰 이동으로 이어진다.
공개된 데이터(Nathwani et al., N Engl J Med. 371(21):1994-2004 (2014))는 야생형 인자 IX를 발현하는 AAV8 벡터가 주입된 혈우병 B를 갖는 남성에서 인자 IX의 장기간 발현을 보여주었다. 그러나, 발현 수준은 가장 낮은 용량(2x1011 벡터 게놈 [vg]/kg 체중)에서 정상의 1.4%-2.2% 내지 가장 높은 용량(2x1012 vg/kg)에서 2.9-7.2%의 낮은 범위였다. 또한, 가장 높은 용량으로 주입된 4/6명의 대상체는 가장 높은 용량과 관련된 트랜스아미나제 증가를 감소시키기 위해 면역억제제(프레드니솔론) 과정을 필요로 한다 (그러나, 2x1011 또는 6x1011 vg/kg의 더 낮은 용량에서는 관찰되지 않음). 혈우병 환자의 자연 병력 연구로부터의 데이터는 ~12% FIX의 순환 수준이 연간 자발적 관절 출혈 수를 0으로 감소시키는데 필요함을 시사한다 (den Uijl et al., Haemophilia 17(1):41-4 (2011)).
이들은 높은 특이적 활성 인자 IX 전이유전자를 발현하는 신규한 생물공학처리된 AAV 캡시드를 사용한 첫 번째 임상 결과이다. 대상체 1-4에서 관찰된 정상의 28%, 41%, 26% 및 33%의 인자 IX 활성 수준은 공개된 데이터를 기반으로 하여 종래 연구에서 관찰된 것보다 순환 인자 IX 수준이 실질적으로 더 크며, 연간 자발적 관절 출혈 수를 0으로 감소시키는데 필요한 순환 인자 IX 수준을 초과한다.
게다가, 본 연구에서 관찰된 실질적인 인자 IX 활성 수준은 벡터 주입부터 재조합 인자 IX 사용 없이 그리고, 면역억제제(스테로이드) 사용 없이 달성되었다. 이들 결과는 낮은 용량의 AAV 벡터 투여에서 높은 수준의 응고 인자 발현을 유도할 수 있어 면역억제제를 필요로 하지 않는 AAV-FIX의 발달을 보여준다 - 간-유도 유전자 요법에 대한 중요한 목적. 이러한 연구에서 관찰된 인자 IX 활성 수준은 연구 기간에 걸쳐 유지되었다.
실시예 6. AAV - FIX39 - Padua 벡터의 감소된 면역원성
현재 Phase I/II 연구에서, 5e11 vg/kg의 AAV-FIX39-Padua를 투여한 4명의 대상체를 입증된 인터페론 감마(IFN-g) 효소 결합 면역스팟(Enzyme Linked Immunospot:ELISPOT) 검정을 이용하여 AAV 벡터에 대한 잠재적 면역 반응에 대해 모니터링하였다. 매주 혈액 추출로부터 분리된 정제된 PBMC를 인터페론 감마 ELISPOT 검정을 통해 평가하였다. 24-25개 펩티드를 각각 함유하는 6개의 AAV 캡시드 펩티드 풀을 삼중으로 2e5 세포와 인큐베이션하였다. IFN-g에 대한 바이오티닐화된 항체 이어서 비색 현상을 이용하여 T 세포 반응을 검출하고 백만 세포 당 스팟-형성 유닛(SFU)으로서 보고하였다. 각 시점에서 가장 높은 반응 풀은 SFU/백만 세포로 표시하였다. 확실성을 위해 역사적으로 사용된 컷오프는 >50 SFU 및 3배 배지 조정(청색선)이다. 대상체 840-003-001, 840-001-002, 840-001-004, 및 840-001-005(흑색으로 표시)는 각각 26, 14, 11 및 8주만큼 멀리 떨어져있다. 1e12 vg/kg의 AAV8-FIX19 벡터를 투여받은 2명의 대상체 CP-16 및 PT17, 및 2e12 vg/kg의 AAV8-FIX19를 투여받은 1명의 대상체에서 이전 실험으로부터의 ELISPOT 결과는 적색으로 표시하였다.
양성 T 세포 반응에 대한 기준으로서 역사적으로 허용되는 >50 SFU 값 및 3배 배경(배지) 조정을 사용한 경우, 주입 후 26주까지 멀리 떨어져 있는 3명의 대상체에서는 반응이 전혀 없거나 거의 없었다(도 24a). 이는 FIX 전이유전자 카세트를 3명의 대상체에 전달하는데 코돈 최적화된 AAV8 벡터를 사용한 본 발명자들의 군에 의한 이전에 공개되지 않은 연구와 완전히 대조적이며, 여기에서 강력한 IFN-g T 세포 반응이 2주 시점만큼이나 빨리 관찰되었다(도 24b). AAV-2(Manno et al., 2006 Nat Med) 및 AAV-8 자가-상보적 벡터(Nathwani et al., 2011 NEJM)를 사용한 기타 이전에 공개된 연구는 또한 AAV 캡시드에 대한 조기 T 세포 반응의 증거를 마찬가지로 보여주었다. 중요하게는, 본 시험에서 전이유전자 생성물에 대한 반응은 관찰되지 않았다.
AAV 캡시드 T 세포 에피토프를 제시하는 형질도입된 간세포에 대한 T-세포 매개된 면역 반응의 활성화는 전이유전자 발현의 단명하는 최종 손실을 나타내는 대상체에서 역할을 할 수 있는 것으로 가정된다. 따라서, AAV-FIX39-Padua 벡터의 감소된 면역원성 프로파일은 전체 효능에 대한 유망한 개선을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> THE CHILDREN'S HOSPITAL OF PHILADELPHIA HIGH, Katherine A. ANGUELA, Xavier <120> Modified Factor IX, and Compositions, Methods and Uses for Gene Transfer to Cells, Organs and Tissues <130> 074659-0447746 <140> To Be Assigned <141> 2016-06-23 <150> 62/183,599 <151> 2015-06-23 <150> 62/315,453 <151> 2016-03-30 <150> 62/338,315 <151> 2016-05-18 <150> 62/348,781 <151> 2016-06-10 <150> 62/349,572 <151> 2016-06-13 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-associated Virus <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe 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<213> Adeno-associated Virus <400> 19 ctactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccttg ccttccttga 60 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcacatt 120 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 180 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcagtggg ctctatgg 228 <210> 20 <211> 108 <212> DNA <213> Adeno-associated Virus <400> 20 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 108 <210> 21 <211> 3631 <212> DNA <213> Adeno-associated Virus <400> 21 agcttgaagg aaatactaag gcaaaggtac tgcaagtgct cgcaacattc gcttatgcgg 60 attattgccg tagtgccgcg acgccggggg caagatgcag agattgccat ggtacaggcc 120 gtgcggttga tattgccaaa acagagctgt gggggagagt tgtcgagaaa gagtgcggaa 180 gatgcaaagg cgtcggctat tcaaggatgc cagcaagcgc agcatatcgc gctgtgacga 240 tgctaatccc aaaccttacc caacccacct ggtcacgcac tgttaagccg ctgtatgacg 300 ctctggtggt gcaatgccac aaagaagagt caatcgcaga caacattttg aatgcggtca 360 cacgttagca 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ttaactccaa tgtaaccatt acctgccatt tcagtaaaac cattattctc 4560 cctacttacc cacccaagtt gtacaataaa gagtgtttgc tctcactcat atacaaagca 4620 aattcatttg tttgtgatgt acagcttgct atgcccacag atgtggtttg cctagtcctt 4680 tgctctaggt catttgactg ggaacagatg ggatgctcac tttggttttt aatggttaac 4740 tagtcattga aatgcatttc atcaaataat cttagaggat aattgtttaa atgtctgtcc 4800 agactagctt tgtagagcca ggtgccatta cacatgtcac cttcttattt ctcttaattg 4860 aatttttatc atctgagata ggaataatag agggcttttt caagtgaaga tattactata 4920 gtctaaagac cttagtgtaa catcctggcc cctaaggaaa aacaagttct ggttcataca 4980 tataataact ttgcatgtta tctgccactg agatgtgtcc taatccaaca gaaaggattg 5040 aatctctgta gctaggtgta cagggcaaga gctgtacagg gaacctttaa agatagcttc 5100 aggccaaagc tgaggaaagt ggatggagac tggggaaaat gctaagacat tttaaagatt 5160 ttctttaggt caaaaataga ataagaaata gaccatttcc ctggacattt tctgtaggtt 5220 aatactgtta actattggta aatgcatatg ctacaactta atatgtctgc tttgtgagtt 5280 tagcattgtc tccttgtcat tccagaaatg aaatggcaaa tacatttaaa tcagaactaa 5340 aaaggggaac agggtataaa ggctcaattt agtcacatca tttccctttc tcacccaccc 5400 cctttaaacc agatgtttgc caatgcatta acaatgcaga tgtttcctga aagaaagttt 5460 agtaactcaa gcagacacct tattttcttt tcaagcagaa aagactatga gatggtggtt 5520 gtggttgttc tgggagggag aagatataaa tgatacacat tatttcaaat catttcatga 5580 cctcactgca cacttatagt tattgtacct gttgtctttt tgctgtcaag cctagctaag 5640 atcatttgga atgttcaaga tcactcatac atgcatgtgc acacatacac atgcacatat 5700 gttcactccc tatttcatcc acatgaacta agattactga tgtgtacaga ttcaaagcac 5760 ttttattctt ttccaaaggc aagaagctga gctactttcc agaatagttg tgaaagaccc 5820 tgtcatactt ctgcattgtt tcctccacac cacctccatc cagttcctta tgaatggtta 5880 ctggttttca aaaatatgag ataaattgag tgtataaaag tcatttttag acaaaatgaa 5940 acaggaaatg aaagaaacca gaatctctcc tcatttgtgg atgggccagc tccaccatgt 6000 catggttaat ctgcagggag gaaatactag atttgattgc agatcagact gcagcaaacc 6060 tgctgtgact aaggcatcaa gagaaagcaa gcaacagctg gggcttcagt ggtgaaaaca 6120 ttatatatct agctttgaaa tatgaaatac tgtttagcag tgtcacctag aaaagagtgt 6180 ttcaaaatgc tgatgcttca taagaacctt tctcttcaga gttgtttctt ttatctttca 6240 aattagccag ggtgggaaat aaagtgatca cttggtgaag aaatctcaca aagaagaaca 6300 tagagagttc actttcatct ggagtaatga acagattgaa caaactagaa atggttagtc 6360 tgttaaagaa aaggtgtagg tgagctgttt gcaagagcca caagggaaag gggaagacaa 6420 cttctttgtg gacttaaggg tgaaagttgc aagcaggcaa gaccattctg acctccatta 6480 agaaagccct ttccaaccaa caaccactgg gttggttact caggttgggc agcattggga 6540 gcaaatgttg attgaacaaa tgtttgtcag aattgttgac ttaaagagct gttctgtcac 6600 tggggacagc agcagctaga tagccccatt cagggagagg gcatttgttc acctggccag 6660 agatcagagc aggctaaggg actgctggga tcctgtccag ctttgagacc ctacagagcc 6720 atgttcacct agcaggtatc ccttctgagg tcactctcat ttcttacctt attccagggc 6780 tttcacctca gcttgccagg ctggagccaa gggccaaggc agcctcacct tgttggctat 6840 ggtagcttcc caggagcccc ctatggttca ggaacagctc tgcctgcccc atcctgtttg 6900 ctacctccta aagccaaagg cactggtggg ccaggccagc ttctaaagtc acacaaggtt 6960 agaaggttcc tgacaggaag ggcttgaggc caatggaagg aggtacttca gtttccctcc 7020 agatgcccag tgatgggctc agagctcctt gagaacttgg gaaaggaagc agggtctctg 7080 aagaaatact tcaggagtag aaagaggaag ctagagggtt aaatgcacta cacaggaaca 7140 gaaatgagtt tttcttagag ttagtatatg tctagaggtg tagtaaacta aaacaagtct 7200 tgaattgcat acagccactt agggaagaaa tgaaaacctt tgaatattag tgaaaaaagg 7260 gaaactgcaa cccctgtatt actagatagc tttcatcaac agctcaaaac agacagattt 7320 ttataggttt actgtgtgca ctttaataca agggcagtgg ttcagaacta gtcaggtcct 7380 gaaaaggatt taccaaatgt tgagtgtgcc ctctagtgtt cacacttccc agctttcttc 7440 ctataaaggt ggatcaaggc acttgcttac aactggaact gaaatcctcc aagtggaact 7500 agacattgag atggagaaaa tattcattgt ccactgtaat tatgcaagga atatccagtt 7560 gagataatgg acttgcctct tatctaataa tacccaggct caatgggtca ctgctttgtc 7620 cactttgccc aaaattcaag cacagctaag ttgatatttt aggacaaagg cagcttacta 7680 tccagccaga ggggagtaga atatggttaa gagagagtgg aaagaatgaa tgagccctgc 7740 tattcctcac tgcctggatg gctataagca cagcccttat ggaggcctta ggtcttgctt 7800 cataatattc cagtttgaaa agggtttgaa aagacctcct agaaaaatca gtagtttttc 7860 tcttttgagt aacatgtagc aaaaaaaatt tcatcatgta ggtacaggga acaccctaat 7920 aactattaat ctcaaggagt caagccagtg tgtttcctaa tgtatctgct gtatccccat 7980 gaagcaaatt ttgccatcag agaaactgac tcatggggaa aaaatccaag gacctcaaat 8040 caccaaaaga agccattcct cagatttgcc taagcttaag cttccctgtc tctcattgtg 8100 tgttgctttc aatgcagtta cataaatggc ttttttgttt atgcaccaaa aacactaatt 8160 catctgcaaa gctataggtc aaagcaacca tagtatgcac cctgctagct ggcgcattaa 8220 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccttagcgc 8280 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 8340 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 8400 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 8460 gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 8520 cactcaactc tatctcgggc tattcttttg atttagacct gcaggcatgc aagcttggca 8580 ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 8640 cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 8700 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgcgatt tattcaacaa agccgccgtc 8760 ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa 8820 aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata 8880 tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat 8940 ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa 9000 tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc 9060 cggtgagaat ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt 9120 acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg 9180 agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa 9240 ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc 9300 taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg 9360 agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct 9420 gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc 9480 tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc 9540 gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcttcga 9600 gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc 9660 agacagtttt attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt 9720 ttgagacaca acgtggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat 9780 cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa 9840 ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga 9900 tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctctcga 9960 cggagttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 10020 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 10080 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 10140 agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 10200 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 10260 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 10320 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 10380 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 10440 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 10500 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 10560 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 10620 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 10659 <210> 27 <211> 601 <212> PRT <213> Adeno-associated Virus <400> 27 Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser 1 5 10 15 Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys 20 25 30 Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp 35 40 45 Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro 50 55 60 Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu 65 70 75 80 Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser 85 90 95 Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala 100 105 110 Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro 130 135 140 Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg 145 150 155 160 Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg 165 170 175 Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn 180 185 190 Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val 195 200 205 Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His 210 215 220 Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln 225 230 235 240 Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser 245 250 255 Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly 260 265 270 Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser 275 280 285 Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile 290 295 300 Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr 305 310 315 320 Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met 325 330 335 Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln 340 345 350 Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp 355 360 365 Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn 370 375 380 Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe 385 390 395 400 Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp 405 410 415 Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys 420 425 430 Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn 435 440 445 Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln 450 455 460 Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro 485 490 495 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 500 505 510 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn 515 520 525 Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 530 535 540 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 545 550 555 560 Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val 565 570 575 Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 580 585 590 Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 595 600

Claims (129)

  1. 캡시드 및 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터로서, 상기 캡시드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 VP1 단백질을 포함하며, 상기 게놈은 SEQ ID NO:10에 의해 인코딩되는 인간 인자 IX(FIX) 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 야생형 서열에 대비하여 감소된 수의 CpG 디-뉴클레오티드를 갖는, rAAV 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 게놈은 인트론을 추가로 포함하는 rAAV 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 인트론이 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내부에 있는, rAAV 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:10으로 이루어진, rAAV 벡터.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈은 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈은 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조직-특이적 발현 조절 요소를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 발현 조절 요소가 간에서의 발현을 부여하는, rAAV 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 게놈은 인간 FIX를 인코딩하는 서열의 3'에 위치한 폴리-아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 제1 AAV ITR이 간 조직-특이적 발현 조절 요소에 관하여 5'에 위치하고, 제2 AAV ITR이 폴리-아데닐화 신호 서열에 관하여 3'에 위치하는, rAAV 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 폴리-아데닐화 신호 서열이 bGH 유전자로부터 비롯되는, rAAV 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 폴리-아데닐화 신호 서열이 SEQ ID NO:19에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, rAAV 벡터.
  12. 제9항에 있어서, 인트론이 SEQ ID NO:17에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, rAAV 벡터.
  13. 제9항에 있어서, 필러 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 필러 뉴클레오티드 서열이 제2 AAV ITR의 3'에 위치하는, rAAV 벡터.
  15. 제13항에 있어서, 필러 뉴클레오티드 서열이 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 서열의 3'에 위치하는, rAAV 벡터.
  16. 제9항에 있어서, 간 조직-특이적 발현 조절 요소가 인간 α1-항-트립신(hAAT) 유전자로부터 비롯되는 프로모터, 또는 아포지질단백질 E(ApoE) HCR-1 또는 HCR-2로부터 비롯되는 인핸서를 포함하는, rAAV 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 간 조직-특이적 발현 조절 요소가 SEQ ID NO:14에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 인핸서를 포함하는, rAAV 벡터.
  18. 제16항에 있어서, 간 조직-특이적 발현 조절 요소가 SEQ ID NO:15에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 프로모터를 포함하는, rAAV 벡터.
  19. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 상기 ITR은 AAV2로부터 비롯되는, rAAV 벡터.
  20. 제19항의 rAAV 벡터의 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.
  21. 제20항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 숙주 세포가 AAV rep 단백질, AAV 캡시드 단백질 및 아데노바이러스 헬퍼 단백질(들)을 발현하는 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 숙주 세포.
  24. rAAV 벡터를 생성하는 방법으로서, 게놈 뉴클레오티드 서열을 AAV 캡시드 내로 패키징하는 것을 허용하는 조건하에서 제22항의 숙주 세포를 배양하여 rAAV 벡터를 생성하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제24항의 방법에 의해 생성된 rAAV 벡터.
  26. 제24항에 있어서, 생성된 rAAV 벡터를 정제하거나 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항의 방법에 의해 생성된 분리되거나 정제된 rAAV 벡터.
  28. 제19항의 rAAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물로서, 치료학적 유효량의 상기 rAAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에서 혈우병 B를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 약학적 조성물이 정맥내 투여되는, 약학적 조성물.
  30. 제28항에 있어서, rAAV 벡터가 킬로그램 당 1x1011-1x1012 벡터 게놈(vg/kg) 범위의 투여량으로 투여되는, 약학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 치료가 적어도 6개월의 지속 기간 동안 적어도 20%의 혈장 FIX 활성을 달성하는데 효과적인, 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, rAAV 벡터가 5x1011 vg/kg의 투여량으로 투여되는, 약학적 조성물.
  33. 제30항에 있어서, 치료가 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체에서 자연적 관절 출혈 또는 뇌 출혈의 평균 빈도를 적어도 90%까지 감소시키는데 효과적인, 약학적 조성물.
  34. 제30항에 있어서, 치료가 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체가 적절한 지혈을 유지하기 위해 FIX 단백질 대체 요법을 필요로 하는 평균 빈도를 적어도 90%까지 감소시키는데 효과적인, 약학적 조성물.
  35. 캡시드 및 DNA 게놈을 포함하는, 혈우병 B를 치료하기 위한 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터로서, 상기 캡시드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 VP1 단백질을 포함하며, 상기 게놈은 제1 AAV ITR; 간 조직-특이적 발현조절 요소; SEQ ID NO:10에 의해 인코딩되는 인간 인자 IX(FIX) 단백질을 인코딩하는 비-천연 발생 뉴클레오티드 서열; 폴리-아데닐화 신호 서열; 및 제2 AAV ITR을 포함하는, rAAV 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 인트론에 의해 방해되는, rAAV 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 각 AAV ITR은 AAV2로부터 비롯되고, 상기 발현 조절 요소는 아포지질단백질 E(ApoE) HCR-1로부터 비롯되는 인핸서 및 인간 α1-항-트립신(hAAT) 유전자로부터 비롯되는 프로모터를 포함하며, 상기 인트론은 인간 FIX 유전자로부터 비롯된 인트론 A의 일부이고, 상기 폴리-아데닐화 신호 서열은 bGH 유전자로부터 비롯되는, rAAV 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 인핸서는 SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:15의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 상기 인트론은 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, rAAV 벡터.
  39. 제38항에 있어서,
    (a) 제1 AAV2 ITR의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:26의 뉴클레오티드 12-141로 이루어지고,
    (b) 상기 ApoE HCR-1 인핸서의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 152-472로 이루어지며,
    (c) 상기 hAAT 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 482-878로 이루어지고,
    (d) 상기 인간 FIX 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 908-3731로 이루어지며,
    (e) 상기 폴리-아데닐화 신호 서열의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 3820-4047로 이루어지고,
    (f) 상기 제2 AAV2 ITR의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:26의 뉴클레오티드 3557-3686으로 이루어지는, rAAV 벡터.
  40. 제38항에 있어서, 게놈이 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 142-4096에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  41. 제37항의 rAAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물로서, 치료학적 유효량의 상기 rAAV 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 중증 또는 중등증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 대상체가 중증 혈우병 B를 가지며, 상기 치료가 혈우병 증상을 중증으로부터 중등증 또는 경증 혈우병 B의 증상으로 저하시키는데 효과적인, 약학적 조성물.
  43. 제41항에 있어서, rAAV 벡터가 킬로그램 당 1x1011-1x1012 벡터 게놈(vg/kg) 범위의 투여량으로 투여되는, 약학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 치료가 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체가 적절한 지혈을 유지하기 위해 FIX 단백질 대체 요법을 필요로 하는 평균 빈도를 적어도 90% 까지 감소시키는데 효과적인, 약학적 조성물.
  45. 제43항에 있어서, 치료가 중증 혈우병 B를 갖는 인간 대상체의 관절 내로의 자연 출혈의 평균 빈도를 적어도 90% 까지 감소시키는데 효과적인, 약학적 조성물.
  46. 제43항에 있어서, 치료가 적어도 6개월의 지속 기간 동안 적어도 20%의 혈장 FIX 활성을 달성하는데 효과적인, 약학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, rAAV 벡터가 5x1011 vg/kg의 투여량으로 투여되는, 약학적 조성물.
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