CN111647625A - 一种提高人凝血因子ix表达水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高人凝血因子IX表达水平的方法，包括优化人凝血因子IX基因；替换Kozak序列；利用优化后的人FIX基因和Kozak序列构建腺相关病毒(AAV)表达质粒并包装重组AAV；本发明使用优化后的基因编码序列和Kozak序列，显著地提高了人凝血因子FIX基因的表达水平。该优化的人FIX基因和Kozak序列可用于高效生产治疗B型血友病的FIX蛋白，降低FIX蛋白的生产成本；也可用于AAV介导的基因替代疗法治疗B型血友病，提高FIX基因在人体内的表达水平，从而减少给药剂量，提高治疗效果。

Description

一种提高人凝血因子IX表达水平的方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种通过优化编码基因的 Kozak序列和密码子提高重组人凝血因子FIX表达水平的方法
技术背景
B型血友病是一种X染色体连锁的遗传性血液疾病。患者X染色体上编码凝血因子IX的FIX基因发生突变，而导致不能正常合成凝血因子IX。在临床上表现为凝血时间延长，严重时自发出血，有致畸致残的风险，甚至危及生命。目前主要依靠补充有活性的凝血因子IX 进行替代治疗，需要终身给药，尚无治愈方法。
人凝血因子IX的编码基因位于X染色体上，全长33.5kb，包含 8个外显子和7个内含子；mRNA全长2802bp；凝血因子IX由461 个氨基酸组成，其中包括N端一段28个氨基酸的信号肽，介导FIX 蛋白分泌到血液；FIX蛋白在人体血液中的半衰期约为24h。
正常人血浆中FIX蛋白的浓度约为5mg/L。当人血浆中FIX蛋白的浓度为正常浓度的5-40％时，表现出轻度血友病症状，在大手术时可能会导致严重出血；当人血浆中FIX蛋白的浓度为正常浓度的1-5％时，表现出中度血友病症状，在小手术或遭遇外伤时可能会导致严重出血；当人血浆中FIX蛋白的浓度低于正常浓度的1％时，表现出重度血友病症状，会出现自发出血。长期的自发出血可能导致关节畸变或者残疾，颅内出血甚至会危及生命。
B型血友病在男性中的患病率约为1/25000，尚无治愈方法，目前治疗该病的方法主要有两种：1)输血补充患者血浆中的FIX。该方法给输血者带来了血液传染病的风险，并且长期输血会导致铁元素在体内的积累。2)注射重组人源FIX蛋白，该方法的给药周期为1-3 次/周，治疗成本较高，给患者带来了较大的经济负担。
为弥补现有技术的不足，本发明的目的在于开发一种提高重组人源FIX蛋白体外表达水平的方法，利用体外重组人源蛋白治疗B型血友病，既可避免长期输血带来的血液传染病风险，又可降低重组人源 FIX蛋白的生产成本，也可用于B型血友病的基因治疗，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：对人FIX基因进行密码子优化，将人FIX基因原有的Kozak序列替换成一段更加高效的 Kozak序列，并利用以上AAV表达载体包装重组AAV。
进一步，所述优化后的Kozak序列为GCCGCCACCATGC，其中加粗的ATG为FIX基因的起始密码子。
进一步，所述人FIX基因去除了除第一个内含子Intron I以外的其它内含子，保留了所有8个外显子。
进一步，所述优化后的FIX基因序列如下Seq1所示。
Seq1：FIX基因序列
ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCCGAGAGCCCCGGCCTGATCACCAT CTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGAGCGCCGAGTGCACCGGTTTGTTTCCTTTTTT ATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTT CACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTT TTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTG TTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTT TAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAA ATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTGGGAAACAA AAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGAC AATTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAAGGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATAT ATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCT GTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCT CAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTA GGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATT GCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGA GGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCAC AGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTG ACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGG CCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGA CCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAAC CATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCA ATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAAC TTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACT GGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTA TACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTG GCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTT CATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTGTTC CTGGACCACGAGAACGCCAACAAGATCCTGAACCGCCCCAAGCGCTACAACAG CGGCAAGCTGGAGGAGTTCGTGCAGGGCAACCTGGAGCGCGAGTGCATGGAGGAGAAGTGCAGCTTCGAGGAGGCCCGCGAGGTGTTCGAGAACACCGAGCG CACCACCGAGTTCTGGAAGCAGTACGTGGACGGCGACCAGTGCGAGAGCAAC CCCTGCCTGAACGGCGGCAGCTGCAAGGACGACATCAACAGCTACGAGTGCT GGTGCCCCTTCGGCTTCGAGGGCAAGAACTGCGAGCTGGACGTGACCTGCAA CATCAAGAACGGCCGCTGCGAGCAGTTCTGCAAGAACAGCGCCGACAACAAG GTGGTGTGCAGCTGCACCGAGGGCTACCGCCTGGCCGAGAACCAGAAGAGCT GCGAGCCCGCCGTGCCCTTCCCCTGCGGCCGCGTGAGCGTGAGCCAGACCAG CAAGCTGACCCGCGCCGAGGCCGTGTTCCCCGACGTGGACTACGTGAACAGCA CCGAGGCCGAGACCATCCTGGACAACATCACCCAGAGCACCCAGAGCTTCAAC GACTTCACCCGCGTGGTGGGCGGCGAGGACGCCAAGCCCGGCCAGTTCCCCT GGCAGGTGGTGCTGAACGGCAAGGTGGACGCCTTCTGCGGCGGCAGCATCGT GAACGAGAAGTGGATCGTGACCGCCGCCCACTGCGTGGAGACCGGCGTGAAG ATCACCGTGGTGGCCGGCGAGCACAACATCGAGGAGACCGAGCACACCGAGC AGAAGCGCAACGTGATCCGCATCATCCCCCACCACAACTACAACGCCGCCATCA ACAAGTACAACCACGACATCGCCCTGCTGGAGCTGGACGAGCCCCTGGTGCTG AACAGCTACGTGACCCCCATCTGCATCGCCGACAAGGAGTACACCAACATCTTC CTGAAGTTCGGCAGCGGCTACGTGAGCGGCTGGGGCCGCGTGTTCCACAAGG GCCGCAGCGCCCTGGTGCTGCAGTACCTGCGCGTGCCCCTGGTGGACCGCGCC ACCTGCCTGCTGAGCACCAAGTTCACCATCTACAACAACATGTTCTGCGCCGGC TTCCACGAGGGCGGCCGCGACAGCTGCCAGGGCGACAGCGGCGGCCCCCAC GTGACCGAGGTGGAGGGCACCAGCTTCCTGACCGGCATCATCAGCTGGGGCG AGGAGTGCGCCATGAAGGGCAAGTACGGCATCTACACCAAGGTGAGCCGCTA CGTGAACTGGATCAAGGAGAAGACCAAGCTGACCTAA
本发明的创新性及产生的技术效果：
本发明使用优化后的Kozak序列和基因编码序列，显著地提高了人凝血因子FIX基因的表达水平。该Kozak序列和优化的人FIX基因可用于高效生产治疗B型血友病的FIX蛋白，降低FIX蛋白的生产成本；也可用于腺相关病毒(AAV)介导的基因治疗的方法治疗B型血友病，提高FIX基因在人体内的表达水平，从而减少给药剂量，提高治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1的质粒示意图；
图2为本发明实施例1的FIX浓度；
图3为本发明实施例1的目标质粒示意图；
图4为本发明实施例1的ELISA方法检测FIX蛋白浓度示意图；
图5为本发明实施例1的ELISA方法检测培养基中FIX蛋白浓度示意图。
具体实施方式：
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1：
替换Kozak序列提高FIX的表达
1)合成FIX基因
DNA合成委托第三方公司进行，合成的序列包括：启动子、5’端非翻译区UTR、上述优化后的FIX基因、3’端非翻译区UTR、polyA 加尾信号序列，序列两端添加NotI酶切识别位点gcggccgc。经测序，序列完全正确。
2)FIX表达序列和AAV表达载体线性化
反应体系为：
DNA 1μg
10×Buffer 5μL
NotI限制性内切酶 1μL
ddH2O补充至 50μL
反应条件为：
37℃，1-16h
3)片段回收：
将酶切后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1％。电泳参数为：电压120V，时间30min。在紫外光下切下目标片段。利用胶回收试剂盒回收。利用微型分光光度计检测所回收DNA浓度。
4)连接
连接反应体系为：
线性化AAV载体100ng
线性化FIX表达序列适量(线性化AAV载体mol量的3-10倍)
10×T4 DNA ligase Buffer 1.5μL
T4 DNA ligase 1μL
ddH2O补充至 15μL
反应条件为：
16℃，4-16h
5)转化E.coli Stbl4化转感受态细胞
取一管冻存于-80℃的E.coli Stbl4化转感受态细胞(100μL)，放置于冰上融化，加入上述连接反应液10μL。轻弹管壁使其混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL LB培养基。200rpm 复苏30-60min，取适量菌液涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LB 平板上。37℃培养约16h。
6)质粒鉴定
挑取LB平板上的菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养中，利用PCR的方法进行初步鉴定，鉴定引物序列如下。
上游引物(seqF)：CCCAGCCAGTGGACTTAG
下游引物(seqR)：AGTGGGAGTGGCACCTTC
PCR反应体系为：
EasyTaq 2×Mix 10μL
seqF(10μM) 1μL
seqR(10μM) 1μL
菌液 1μL
ddH2O 7μL
总体积 20μL
PCR反应程序为：
95℃ 10min
94℃ 30s
58℃ 30s
72℃ 60s
第2步至第4步反应35个循环
72℃ 2min
PCR反应结束后，利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。电泳的电压为120V，时间为30min。电泳结束后，利用紫外凝胶成像仪观察电泳结果。
选取符合预期的菌落，进一步进行测序验证，最终获得目标质粒。
质粒示意图见图1；
7)Kozak序列替换
将新的Kozak序列包埋在引物中，引物序列如下：
10F：CAATCTGCTAGCCGCCACCATGGAGAGGGTGAACATGATCATGGCT
10R：CCCTCTCCATGGTGGCGGCTAGCAGATTGTGAAAGTGGTATTCA
11F：CAATCTGCTAGCCGCCACCATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCT
11R：CCCTCTGCATGGTGGCGGCTAGCAGATTGTGAAAGTGGTATTCA
以10F和10R为引物，以pAAV-F9为模板进行PCR，以11F和11R 为引物，以pAAV-F9为模板进行PCR。
PCR反应体系如下：
dd H2O，31μL
5×Takara PrimeSTAR Bufer，10μL
2.5mM dNTP，4μL
DMSO,1.5μL
上游引物，1μL
下游引物，1μL
质粒，1μL
PrimeSTAR DNA polymerase，0.5μL
总体积，50μL
PCR反应程序如下：
98℃，10s
55℃，5s
72℃，7min
第一步至第三步反应30个循环
DNA片段回收与上述方法相同。所得片段采用Monad连接试剂盒进行无缝连接。质粒鉴定及转化方法与上述方法相同。所得质粒分别命名为pAAV-KZ10和pAAV-KZ11，与pAAV-F9相比，pAAV-KZ10和 pAAV-KZ1仅Kozak序列不同，其余序列均相同。
各质粒的Kozak序列如下：
编号 序列
F9 AAGGTTATGC
KZ10 GCCGCCACCATGG
KZ11 GCCGCCACCATGC
8)细胞转染
将HepG2细胞接种于24孔板，细胞密度为105个/孔，12-16h后，利用Lipo3000转染试剂进行转染。转染后4-6h更换新的培养基。转染后48h，收集培养液，1000g离心5min，所得上清液用于FIX蛋白的检测。
9)FIX浓度检测
采用ELISA试剂盒检测FIX的浓度。具体方法为：向包被有FIX 抗体的酶标板中加入100μL样品或标准品，加入50μL稀释后的标记有辣根过氧化物酶的二抗。37℃孵育1h。弃去液体，用洗液清洗5遍。加入100μL的反应底物，37℃避光反应15min，加入100 μL终止液。15min内利用酶标仪检测450nm波长下的吸光值，根据标准曲线计算样品中的FIX浓度。结果见图2。
实施例2：
质粒介导hFIX在HEK293细胞中高效表达
1)构建pCMV-F9-P2A-GFP质粒
将绿色荧光蛋白GFP克隆到上述AAV表达质粒pAAV-F9上的FIX 基因之后，同时去掉FIX基因的终止密码子TAG，在FIX基因和GFP 基因之间添加P2A序列 ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct。将上述AAV表达质粒的启动子替换成CMV启动子。所获得的质粒命名为pCMV-F9-P2A-GFP。质粒示意图见图3；
2)转染
将HEK293T细胞接种于24孔板，细胞密度为105个/孔，12-16h 后，利用Lipo3000转染试剂进行转染。转染后4-6h更换新的培养基。转染后48h，细胞在荧光显微镜下可观察到荧光。收集培养液，1000 g离心5min，所得上清液用于FIX蛋白的检测。
3)ELISA方法检测FIX蛋白
检测方法如上所述，结果见图4。
实施例3：
重组腺相关病毒(AAV)介导FIX基因在HepG2中高效表达人凝血因子FIX
1)重组AAV病毒包装及纯化
采用三质粒包装系统，包括上述AAV表达质粒pAAV-F9、辅助质粒pHelper和包装质粒pRC2/8。
将HEK293T细胞接种于5个15cm的培养皿中，12-18h后，细胞汇合度达到85-90％，且细胞状态良好。转染前1-2h将培养基换成无血清DMEM培养基。
配制DNA-PEI复合物：将124μg pHelper质粒、76μg pRC2/8 质粒和65.1μg pAAV-F9质粒依次加入5mL DMEM培养基中，涡旋混匀；另将1ml浓度为1mg/mL的PEI加入到5mLDMEM培养基中，涡旋混匀；将PEI溶液加入质粒溶液中，涡旋混匀，室温静置20 min。将上述质粒-PEI混合物均匀滴入HEK293T细胞中，轻轻混匀。 4-6h后，将无FBS培养基换成含FBS的完全培养基。
转染后96h，分别收集培养基上清和细胞，细胞冻融后超声破碎。采用碘克沙醇密度梯度离心的方法纯化病毒，并利用100KD的超滤管浓缩。经qPCR测定滴度后，储存于-80℃。
2)AAV感染
将HepG2细胞接种于24孔板，细胞数量为4×104个/孔，培养基体积为500μL/孔。接种后12-18h，将50μL含有上述AAV病毒的培养基加入培养孔，使感染复数(MOI)分别为为105、106、0.5×107。 4-6h后补加500μL培养基。感染后72h，收集培养基，1000g离心 5min后取上清。
3)ELISA方法检测培养基中FIX蛋白浓度
检测方法如上所述，结果见图5。

Claims (5)

1.一种提高人凝血因子IX表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，对IX基因进行密码子优化。
步骤2，替换Kozak序列，所述替换后的Kozak序列为GCCGCCACCATGC，其中的ATG为IX基因的起始密码子；使用所述Kozak序列表达优化后的IX基因。
步骤3，制备重组腺相关病毒rAAV，质粒转染或者rAAV感染HEK293T或HepG2细胞。
2.根据权利要求1所述的一种提高人凝血因子IX表达水平的方法，所述制备重组腺相关病毒rAAV，质粒转染或者rAAV感染HEK293T或HepG2细胞
1)酶切反应体系为：
DNA 1μg
10×Buffer 5μL
Notl限制性内切酶1μL
ddH2O补充至50μL
反应条件为：
37℃，1-16h
2)片段回收：将酶切后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1％。电泳参数为：电压120V，时间30min。在紫外光下切下目标片段；利用胶回收试剂盒回收目标DNA；利用微型分光光度计检测所回收DNA浓度；
3)连接
连接反应体系为：
线性化AAV载体100ng
线性化FIX表达序列适量，为线性化AAV载体mol量的3-10倍10×T4 DNA ligaseBuffer 1.5μL
T4 DNA ligase 1μL
ddH2O补充至15μL
反应条件为：16℃，4-16h
4)转化E.coli Stbl4化转感受态细胞
取一管冻存于-80℃的E.coli Stbl4化转感受态细胞(100μL)，放入冰中融化，加入上述连接反应液10μL；轻弹管壁使其混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL LB培养基；200rpm复苏30-60min，取适量菌液涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养约16h；
5)质粒鉴定
挑取LB平板上的菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养中，利用PCR的方法进行初步鉴定，鉴定引物序列如下：
上游引物(seqF)：TAGTCCTGTCGGGTTTCG
下游引物(seqR)：TACAGGGCGCGTACTATG
PCR反应体系为：
EasyTaq 2×Mix 10μL
seqF(10μM)1μL
seqR(10μM)1μL
菌液1μL
ddH2O 7μL
总体积20μL
PCR反应程序为：
95℃10min
94℃30s
58℃30s
72℃60s
第2步至第4步反应35个循环
72℃2min
PCR反应结束后，利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；电泳的电压为120V，时间为30min；电泳结束后，利用紫外凝胶成像仪观察电泳结果；选取PCR条带大小为4419bp的菌落，进一步进行测序验证，最终获得目标质粒。
3.根据权利要求1所述的一种提高人凝血因子IX表达水平的方法，所述替换Kozak序列的制备：将替换Kozak序列包埋在引物中，引物序列如下：
10F：CAATCTGCTAGCCGCCACCATGGAGAGGGTGAACATGATCATGGCT
10R：CCCTCTCCATGGTGGCGGCTAGCAGATTGTGAAAGTGGTATTCA
11F：CAATCTGCTAGCCGCCACCATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCT
11R：CCCTCTGCATGGTGGCGGCTAGCAGATTGTGAAAGTGGTATTCA
以10F和10R为引物，以pAAV-F9为模板进行PCR，以11F和11R为引物，以pAAV-F9为模板进行PCR；
PCR反应体系如下：
dd H2O，31μL
5×Takara PrimeSTAR Bufer，10μL
dNTP(2.5mM)，4μL
DMSO(100％)，1.5μL
上游引物(10μM)，1μL
下游引物(10μM)，1μL
质粒(1-10ng/μL)，1μL
PrimeSTAR DNA polymerase，0.5μL
总体积，50μL
PCR反应程序如下：
98℃，10s
55℃，5s
72℃，7min
第一步至第三步反应30个循环。
将以上PCR产物切胶回收，利用无缝连接试剂盒连接成环状质粒。转化E.coli stbl4感受态细胞，鉴定正确的转化子。
4.根据权利要求1所述的一种提高人凝血因子IX表达水平的方法，所述制备重组腺相关病毒，包括以下步骤：
1)重组AAV病毒包装及纯化
采用三质粒包装系统，包括上述AAV表达质粒、辅助质粒pHelper和包装质粒pRC2/8；
将HEK293T细胞接种于5个15cm的培养皿中，12-18h后，细胞汇合度达到85-90％，且细胞状态良好；转染前1-2h将培养基换成无血清DMEM培养基；
配制DNA-PEI复合物：将124μg pHelper质粒、76μg pRC2/8质粒和65.1μg pAAV-F9质粒依次加入5mL DMEM培养基中，涡旋混匀；另将1ml浓度为1mg/mL的PEI加入到5mL DMEM培养基中，涡旋混匀；将PEI溶液加入质粒溶液中，涡旋混匀，室温静置20min。将上述DNA-PEI混合物均匀滴入HEK293T细胞中，轻轻混匀。4-6h后，将无FBS培养基换成含FBS的完全培养基；
转染后96h，分别收集培养基上清和细胞，细胞冻融后超声破碎。采用碘克沙醇密度梯度离心的方法纯化病毒，并利用100KD的超滤管浓缩。经qPCR测定滴度后，储存于-80℃；
2)AAV感染
将HepG2细胞接种于24孔板，细胞数量为4×104个/孔，培养基体积为500μL/孔。接种后12-18h，将50μL含有上述rAAV病毒的培养基加入培养孔，并混合均匀，使感染复数(MOI)分别为为105、106、0.5×107。4-6h后补加500μL培养基。感染后72h，收集培养基，1000g离心5min后取上清。
5.根据权利要求1所述的一种提高人凝血因子IX表达水平的方法，所述优化后的IX基因除了除第一个内含子Intronl以外的其它内含子，保留了所有8个外显子。
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