CN111218446A - 一种肝脏特异性启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一组肝脏特异性启动子及其应用。本发明公开了一组调控基因在肝脏系统特异性高表达的小尺寸的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比，驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力明显增强，适用于重组腺病毒伴随病毒(rAAV)介导的基因治疗。

Description

一种肝脏特异性启动子及其应用
技术领域
本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种肝脏特异性启动子及其应用。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，最终实现治疗目的。从1989年人类首个基因治疗方案进入临床试验算起，已有着超30年的发展历史。虽然过程颇为坎坷，但是随着载体病毒、递送机制的优化，近年来，基因治疗得以迅猛发展，在癌症、罕见病治疗上展现出很好的前景。仅2017年，基因治疗就取得了多项里程碑突破，美国FDA先后批准两款CAR-T疗法(Kymriah 和Yescarta)和首款“靶向遗传学眼疾突变”的基因疗法(Luxturna)，可以称得上是基因疗法“厚积薄发”的一年。
腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点，近年来，用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点。早在2012年，欧洲药监局就批准了第一个基因治疗药物——基于rAAV载体的脂蛋白酯酶基因治疗药物Glybera；2017年12月19日，美国FDA批准了第一个罕见病基因治疗药物Luxturna，用以治疗先天性黑曚症(RPE65基因突变引起)，该药物也是以rAAV作为基因治疗载体；2019 年5月24日，美国FDA又批准了诺华旗下的治疗I型重症肌萎缩症(SMA I)的罕见病基因治疗药物Zolgensma。截止2019年11月份，在ClinicalTrials.gov上注册以rAAV为载体的基因治疗临床试验方案多达200 多项(ClinicalTrials.gov)。
重组AAV作为基因治疗载体也存在明显缺点，其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如A型血友病致病基因凝血因子Ⅷ，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FⅧ前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。
血友病(hemophilia)是凝血因子缺乏导致的一类遗传性凝血功能障碍疾病，常见类型包括血友病A(HA)和血友病B(HB)。以血友病的发病率为5～10/10万估算，预计目前我国的血友病患者人数达10万左右，全球大约100万人。
HA由位于X染色体上的FⅧ(F8)基因突变造成凝血因子八缺乏或功能缺陷导致，约占全部血友病的80％。HB表现为凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺乏，约占全部血友病患者的20％，由位于Ⅹ染色体上的FⅨ(F9)基因突变引起。
目前治疗血友病的主要方法是替代治疗。替代治疗是通过输注外源性重组凝血因子以缓解其出血并发症，防止功能丧失。但由于凝血因子Ⅷ半衰期较短(8-12h)，每周需注射2-3次，频繁的治疗严重影响了患者的生活质量。而基因治疗为血友病以及其他一些单基因遗传病的治疗提供了一条新的路径。血友病基因治疗是将外源正常编码凝血因子的基因导入患者体内，并在细胞内表达和分泌治疗水平的凝血因子，从而实现彻底治愈血友病的目的。凝血因子Ⅷ并不需要补充到正常水平发挥功能，只需要恢复到正常水平的5％即能达到预防出血的效果，使得血友病A成为一种很好的基因治疗适应症。
针对凝血因子Ⅷ基因较大和AAV载体装载基因受容量限制等特点，Lind P.,et al通过用14个氨基酸的衔接肽(SQ序列)替换凝血因子Ⅷ的B 结构域(760-1667aa)，将该基因的大小降低40％至4.4kb(Lind P et al.,Eur.J.Biochem.232:19-27,1995)，该B domaindeleted FⅧ(BDD-FⅧ)是目前FⅧ蛋白表达较常采用的版本；Jenny McIntosh.,et al通过在SQ序列中间插入包含6个糖基化位点的17aa短肽V3(V3-FⅧ)来增强该蛋白在体内表达(Jenny McIntosh et al.,BLOOD.121(17)，2013)。但无论是BDD-FⅧ还是V3-FⅧ，其尺寸已经接近rAAV的装载上限，留给调控目的基因表达的调控元件(启动子、Poly A)只有大约300bp的空间。
FⅧ的主要合成场所是肝细胞和肝窦内皮细胞，目前使用rAAV基因治疗血友病A的策略是在缩小目的基因FⅧ的同时，采用小尺寸的肝脏特异性启动子，将启动子、BDD-FⅧ或V3-FⅧ、polyA组装到同一AAV载体有限的空间上，如BIOMARIN公司的BMN270的表达簇为HLP-BDD FⅧ-sPA (ClinicalTrials.gov number,NCT02576795)，SPARK公司的SPK-8011的表达簇为TTRm-BDD FⅧ-Rabbit beta globin poly A(ClinicalTrials.gov number,NCT03003533)，两者均采用的是小尺寸的肝脏特异性启动子驱动目的基因的表达，Ⅰ/Ⅱ期临床试验已经取得了一定的效果(Rangarajan S et al.,The New England journal ofmedicine.2017；Lindsey A.G et al.,Blood.130:604, 2017)，其中BIOMARIN的血友病A基因治疗药物BMN270已向EMA提交上市申请。但由于启动子尺寸制约，其启动强度与一些较大尺寸启动子之间还是存在着不小的差距。
一个高效的启动子能够持续高强度的启动目的基因的表达，降低达到治疗效果所需剂量，降低给药次数，从而大大降低了治疗成本和机体的免疫反应。但由于rAAV装载容量限制，装载诸如凝血因子Ⅷ等较大基因时，势必要缩减启动子的长度，与之相对应的是，删除序列中所包含的关键表达调控元件也随之丢失，目的基因的表达强度和特异性也会随之下降。如何在最大程度缩减启动子尺寸的情况下，仍然维持启动子启动目的基因的强度和特异性，是采用rAAV作为载体递送较大基因时需要解决的重要问题。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种肝脏特异性启动子及其应用，其目的在于构建小尺寸强启动子并将其应用于驱动较大的外源基因表达(如FVIII凝血因子基因)，由此解决现有基因治疗所用 rAAV载体存在装载容量有限的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种核酸分子，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；和
(b)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第二多核苷酸，或该第二多核苷酸的功能片段；
其中(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
优选地，所述的核酸分子，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第一多核苷酸；和
(b)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二多核苷酸；
其中(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
优选地，所述核酸分子还包括：
(c)与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第三多核苷酸，或该第三多核苷酸的功能片段；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
优选地，所述的核酸分子，其包括：
(a)具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第一多核苷酸；和
(b)具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二多核苷酸；和
(c)具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第三多核苷酸；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的核酸分子的应用，用作肝脏特异性启动子。
优选地，所述启动子用于启动FVIII凝血因子基因在肝脏的表达。
按照本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其特征在于，包括所述的核酸分子。
优选地，所述表达载体为质粒或病毒载体。
优选地，所述表达载体为rAAV。
按照本发明的另一个方面，提供了一种哺乳动物宿主细胞，其包括所述的表达载体。
按照本发明的另一个方面，提供了一种哺乳动物，其基因组包括所述的核酸分子或如所述的表达载体。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明旨在构件小尺寸的强启动子并将其运用于rAAV基因治疗血友病A。本发明提供了一种调控基因在肝脏系统特异性高表达的小尺寸的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比，驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力明显增强，适用于重组腺病毒伴随病毒(rAAV)介导的基因治疗。
附图说明
图1为PFD-rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA载体结构示意图。
图2为PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIIIopt(WJ)-spolyA载体结构示意图。
图3为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果比较。
图4为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果比较。
图5为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果灰度扫描图。
图6为不同rAAV病毒SDS-PAGE蛋白胶银染图。
图7为RT-PCR方法测定不同AAV病毒滴度。
图8为C57小鼠上不同启动子表达FVIII效果比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供了一种核酸分子，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；和
(b)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第二多核苷酸，或该第二多核苷酸的功能片段；
其中(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的高效转录。
一些实施例中，所述的核酸分子，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第一多核苷酸；和
(b)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二多核苷酸。
其中(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的高效转录。
一些实施例中，所述的核酸分子还包括：
(c)与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第三多核苷酸，或该第三多核苷酸的功能片段；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的高效转录。
另一些实施例中，所述的核酸分子，其包括：
(a)具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第一多核苷酸；和
(b)具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二多核苷酸；和
(c)具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第三多核苷酸；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的高效转录。
本发明还提供了所述的核酸分子的应用，将所述的核酸分子用作肝脏特异性启动子。
一些实施例中，所述启动子可用于而不仅限于启动FVIII凝血因子基因在肝脏的表达。
本发明还提供了包括本发明的核酸分子的表达载体，其中核酸分子与异源多核苷酸可操作地连接。
优选实施例中，表达载体是质粒或病毒载体。哺乳动物表达载体的实例包括腺病毒载体、pSV和pCMV系列的质粒载体、牛痘载体和逆转录病毒载体、以及杆状病毒。在一些实施方式中，表达载体是腺相关病毒载体 rAAV。
表达载体还可以包括以下一种或多种元件：复制起点、选择性标记和多克隆位点。
本发明还提供了包括本发明的表达载体的哺乳动物宿主细胞。可以通过任何合适的方法将表达载体转染到宿主细胞中。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如人细胞)，例如上面提到的那些。这些宿主细胞可以是分离细胞。
核酸分子能够促进哺乳动物细胞中可操作连接的异源多核苷酸的转录。优选的哺乳动物细胞包括小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、猴细胞和人细胞。此类细胞的实例包括HEK细胞和衍生物(例如HEK293、HEK293T、 HEK293A)、PerC6细胞、911细胞、CHO细胞、HCT116细胞、HeLa细胞、 COS细胞和VERO细胞；癌细胞例如HepG2、A549和MCF7；从人或动物活检分离的原代细胞；和干细胞(包括多能细胞，例如胚胎干细胞和诱导性多能干(iPS)细胞；以及多能干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞等)。
本发明还提供了一种哺乳动物，其基因组包括本发明的核酸分子或本发明的表达载体。优选地，本发明的核酸分子或本发明的表达载体插入哺乳动物的基因组中，使得与本发明的所述核酸分子可操作地连接或可操作地插入本发明的所述表达载体中的异源多核苷酸在哺乳动物的一个或多个细胞中表达。优选地，哺乳动物是小鼠或大鼠。在一些实施方式中，哺乳动物是非人哺乳动物。
本领域的技术人员容易理解，本发明提供的启动子不仅可用于启动启动FVIII凝血因子基因在肝脏的表达，而且还可以启动非编码RNA的表达，如用启动siRNA表达。
以下为实施例：
实施例1
重组启动子片段
产生由表1认定的序列组成的重组启动子片段。
表1：重组启动子片段的序列
启动子名称 第三多核苷酸 第二多核苷酸 第一多核苷酸
ATh1 promoter 无 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.2
ATh2 promoter 无 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.1
ATh3 promoter SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.2
ATh4 promoter SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.1
ATh5 promoter SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.2
第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸(当存在时)在上述启动子片段中连续地连接。
实施例2
构建包括不同启动子的rAAV表达载体
人抗胰蛋白酶α1(Humanα1-antitrypsin,hAAT),是由SERPINA1基因编码合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其主要由肝脏合成并分泌到血液中， hAAT启动子作为肝脏特异性启动子，具有较强的启动能力，其表达调控元件分散在1.3Kb(-1200bp-+46bp)的范围内(Perlino et al,1987；Rong-Fong Shen et al.,1989；)，较大的尺寸限制了其在AAV载体上的应用。文献研究表明，hAAT核心启动子区域位于转录起始位点(TSS)-142/+44bp区域，其间分布着HNF1、HNF4、CEBP等转录因子结合位点。转录起始位点(TSS) 上游-261/-181bp的远距离增强子区域(Distal regin,DRI),也存在转录因子 CEBP和HNF3的结合位点，调控着hAAT在肝脏组织中的高水平表达。
本发明选取hAAT启动子-142/+44bp区域(186bp,NCBI Reference Sequence:NG_008290.1:6948nt-7133nt)，命名为mini-hAAT promoter；选取hAAT启动子-261/+44bp区域(305bp,NCBI Reference Sequence: NG_008290.1:6829nt-7133nt)，命名为hAATpromoter；选取hAAT启动子 -142/-62bp区域(81bp，NCBI Reference Sequence:NG_008290.1: 6948nt-7029nt,SEQ ID NO.3)，命名为truncated-hAAT hAAT promoter；选取hAAT启动子-261/-208bp区域(54bp,NCBI Reference Sequence: NG_008290.1:6829nt-6882nt,SEQ ID NO.4),命名为hAAT enhancer/hAATe。
甲状腺素转载蛋白(Transthyretin,TTR)是一种甲状腺激素转载蛋白，主要在肝脏组织合成后分泌到血液中，和脉络丛表皮细胞合成后分泌到脑脊液中。小鼠TTR的表达受两个肝脏特异性的区域调控——-200/+1的近端调控区域(启动子区)和-1.86/-1.96kbp的远端调控区域(增强子区)。 TTR启动子由于其较小尺寸和较强启动效果作为肝脏特异性启动子也广泛用于基因治疗。小鼠TTR增强子和启动子区域分布着AP1、CEBP、HNF4、 HNF1、HNF3等多个转录因子结合位点，调控着TTR蛋白的高效特异性性表达。
本发明通过嵌合hAAT启动子和小鼠TTR启动子的重要调控区域，获得多条嵌合的启动子，将其中后续试验筛选出来的五条启动效果较强的启动子分别命名为ATh1promoter、ATh2promoter、ATh3promoter、ATh4 promoter和ATh5promoter。
为比较不同启动子启动强度，本发明将上述嵌合启动子与已报道的上述较强肝脏特异性启动子一起构建到AAV载体PFD-rAAV- CMV-mCHERRY-bGHpA上，如图1所示。通过其启动mCHERRY荧光蛋白表达情况，比较不同启动子的启动水平。图1中ITR(inverted terminalrepeat)，长度为145bp的反向末端重复序列；CMV enhancer/promoter，人巨细胞病毒早期启动子；mCHERRY，红色荧光素酶基因读码框；BGH polyA, 牛生长激素的多聚腺苷酸加微信号；Amp，氨苄青霉素抗性基因读码框； GmR，潮霉素抗性基因读码框；Tn7F/R,Tn7转座子；ori：复制起始位点； XhoI、AgeI、SacI，限制性内切酶位点。具体构建策略为：
1)将PFD-rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA使用限制性内切酶XhoI和 AgeI进行双酶切，进行线性化处理；
2)设计引物以合成模板扩增所需启动子片段，设计引物时预留限制性内切酶位点和18bp左右的同源重组臂用于和线性化后载体进行重组；
3)根据所需重组片段数目选择ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，C112)和ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(诺唯赞，C113)将目的片段和载体骨架进行同源重组；
4)将同源重组产物转化STBL3感受态，涂LB平板37℃过夜培养挑单克隆鉴定，将鉴定正确克隆摇菌提取质粒。
具体序列信息如下：
hAAT promoter(-261/+44bp)：(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1:6829nt-7133nt)
mini-hAAT promoter(-142/+44bp)：(NCBI Reference Sequence: NG_008290.1:6948nt-7133nt)
mTTR promoter(NCBI Reference Sequence:NC_000084.6,1961nt- 2164nt,-203/+1bp),SEQ ID NO.1
mini-mTTR promoter(NCBI Reference Sequence:NC_000084.6,2014nt-2164nt,-150/+1bp),SEQ ID NO.2
truncated-hAAT hAAT promoter(-142/-62bp)：(NCBI Reference Sequence:NG_008290.1:6948nt-7029nt),SEQ ID NO.3
AAT enhancer(NCBI Reference Sequence:NG_008290.1:6829nt-6882nt), SEQID NO.4
mTTR enhancer(NCBI Reference Sequence:NC_000084.6,286nt-405nt, -1878/-1758bp),SEQ ID NO.5
ATh1Promoter,SEQ ID NO.6
ATh2Promoter,SEQ ID NO.7
ATh3Promoter，SEQ ID NO.8
ATh4Promoter，SEQ ID NO.9
ATh5Promoter，SEQ ID NO.10
Biomarin-HLP promoter,BIOMARIN公司BMN270项目中启动子，ClinicalTrials.gov number,NCT02576795
SPARK-TTRm(NCBI Reference Sequence:NC_000084.6,1961nt- 2183nt,-203bp/+20bp),其中-136bp/-133bp TGTG突变为GACTApoE enhancer(GenBank:U32510.1,78nt-231nt)
HS-CRM8enhancer(NCBI Reference Sequence:NM_000295.4,163nt- 93nt)
MVM intron(GenBank:NC_001510.1,2312nt-2403nt)
实施例3
不同启动子启动mCHERRY荧光基因效果比较
将实施例2中构建启动子、荧光蛋白mCHERRY和bGHpolyA AAV表达载体通过293三质粒系统将上述质粒包装为AAV2/8血清型病毒，将病毒用PEG8000沉淀后碘克沙醇密度梯度超速离心纯化AAV病毒。病毒滴度通过RT-PCR和银染进行定量。
将不同AAV病毒以相同剂量3E+13vg/kg通过尾静脉注射方式注射到 C57小鼠体内(n＝3)，注射病毒5周后，用生理盐水及4％多聚甲醛进行心脏灌流，取心、肝、脾、肺、肾、脑等4％多聚甲醛浸泡过夜，后浸泡在 30％蔗糖溶液中72小时。取肝脏组织进行低温冷冻切片，荧光显微镜下观察荧光。
将本发明重组后的启动子ATh1Promoter(SEQ ID NO.6)和ATh2 Promoter(SEQ IDNO.7)与mini-hAAT启动子、mTTR启动子(SEQ ID NO. 1,小鼠TTR启动子区域)、TBG启动子(TBG promoter)、hAAT启动子、 TTRm启动子(SPARK公司spark-8011项目中突变后TTR启动子， ClinicalTrials.gov number,NCT03003533)、HLP启动子(BIOMARIN公司 BMN270项目中启动子，ClinicalTrials.gov number,NCT02576795)、TTRe/TTRp启动子(小鼠TTR增强子区域和启动子区域)、 TTRe/TTRp/MVM(小鼠TTR增强子区域和启动子区域后添加MVM内含子)和CRM8//TTRp/MVM(小鼠TTR启动子区域后添加MVM内含子，启动子区域前添加CRM8增强序列，sangoma公司SB525项目中启动子， ClinicalTrials.gov number,NCT03061201)进行mCHERRY荧光的比较，比较其在肝脏组织中的启动水平，结果如图3和图4所示。
图3为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果比较。不同启动的AAV病毒以相同剂量3E+13vg/kg通过尾静脉注射方式注射到 C57小鼠(n＝3)，注射病毒后5周后，肝脏组织mCHERRY荧光强度比较。曝光时间10ms左20右500。
图4为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果比较。不同启动子的AAV病毒以相同剂量3E+13vg/kg通过尾静脉注射方式注射到C57小鼠(n＝3)，注射病毒5周后，肝脏组织mCHERRY荧光强度比较。曝光时间10ms左20右4000。
图5为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果灰度扫描图。使用graphpad软件对图4中不同启动子在小鼠肝脏组织中表达 mCHERRY荧光进行灰度扫描，扫描灰度值相对于HLP启动子的相对强度。
本发明通过比较mCHERRY荧光发现，在肝脏组织中，重组后启动子ATh1Promoter(SEQ ID NO.1)和ATh2Promoter(SEQ ID NO.2)启动水平显著优于重组前mini-hAAT启动子和mTTR启动子，也优于TBG启动子、 hAAT启动子、TTRm启动子、HLP启动子、TTRe/TTRp启动子、 TTRe/TTRp/MVM和CRM8//TTRp/MVM。
实施例4
不同启动子启动BDD-FVIII载体构建
为进一步论述ATh1，ATh2启动子较强的肝脏特异性启动水平是否受下游所连接基因的影响，以及在ATh1，ATh2前添加表达调控增强元件(ATh3，ATh4)是否能够进一步增加目的基因的表达；同时研究ATh1-4 启动较大外源基因的表达，AAV是否能够正常包装，本实施例按照上述实施例2中分子克隆方法构建不同启动子、BDD-FVIII(B domain deletedFVIII)和sPolyA表达框，构建到AAV载体 PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIII-spolyA(图2)上，其中PFD-rAAV-HLP- BDD-FVIII-spolyA载体使用限制性内切酶XhoI和AscI进行双酶切，进行线性化处理。
图2为PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIIIopt(WJ)-spolyA载体结构示意图。其中ITR，inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列；HLP promoter,Biomarin公司治疗A型血友病项目BMN270采用的启动子(SEQ ID NO.8)，BDD-FVIIIopt(WJ)，密码子优化过的BDD-FVIII(SEQ ID NO.17)；polyA,多聚腺苷酸加尾信号；Amp，氨苄青霉素抗性基因读码框； GmR，潮霉素抗性基因读码框；Tn7F/R,Tn7转座子；ori：复制起始位点； XhoI、AscI，限制性内切酶位点。
图6为不同AAV病毒SDS-PAGE蛋白胶银染图。将装载不同启动及 FVIII基因表达框的AAV病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染，用以判断病毒纯度和滴度。图7为采用RT-PCR方法测定不同AAV病毒滴度。使用ITR上引物对不同启动子表达FVIII的AAV病毒进行绝对定量PCR，测定病毒滴度。从银染结果和RT-PCR定量结果来看，上述载体均能够正常进行包装。
实施例5
不同启动子表达FVIII水平比较
通过sf9One-bac系统将上述实施例4中构建的质粒包装为AAV2/8血清型病毒。将不同AAV病毒以相同剂量5E+12vg/kg尾静脉注射到C57小鼠(n＝6)体内，注射病毒后2，5，8，10周后，眼眶静脉丛取血ELISA 检测FVIII表达水平。所用ELISA抗体对为F8C-EIA(enzymeresearch laboratories)，使用绿十字的人凝血因子Ⅷ绘制标准曲线，凝血因子Ⅷ使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(产品编号:P0010S)进行浓度测定。
图8为C57小鼠上不同启动子表达FVIII效果比较。不同启动子的AAV 病毒以相同剂量5E+12vg/kg通过尾静脉注射方式注射到C57小鼠(n＝6)，注射病毒2周,5周，8周，10周，分别采集小鼠血浆，通过ELISA方式测定血浆中FVIII含量。
从检测结果整体趋势来看，由于AAV表达的时效性，从第二到第五周，各启动子表达FVIII水平均有所增加，第五周时表达水平达到最高，在随后的两个时间点表达量均有不同程度下降。
整体而言，各个时间点ATh1，ATh2，ATh3，ATh4启动FVIII能力显著优于Spark公司的TTRm和Biomarin公司的HLP启动子，两周时这四个启动子表达FVIII水平是TTRm的2-3倍，是HLP的10倍以上，五周时这四个启动子表达FVIII水平是TTRm的1.5-2倍，是HLP的3-4倍，八周时这四个启动子表达FVIII水平是TTRm的1.3-1.9倍，是HLP的1.9-2.6倍，十周时这四个启动子表达FVIII水平是TTRm的1.2-2.1倍，是HLP的1.7-3 倍，这四个启动子相较于ApoE/TTRp/MVM和CRM8/TTRp/MVM启动子，各时间点表达FVIII水平也有1-2倍的提升，虽然提升效果没相较于mTTR 和HLP明显，但ATh1，ATh2从尺寸上缩短了83-211bp，对于存在包装容量有限的AAV装载诸如FVIII等大分子时具有重要的意义。ATh3，ATh4 与ATh1，ATh2相比，通过增加一些表达增强元件，虽然在前期效果表达无明显增强，但第十周时，表达水平有1.4-1.8倍的提升，从表达持续性上更具优势。
然而，采用相同的构件策略构件的重组启动子ATh5，其表达FVIII效果则显著弱于本发明提出的另外四条重组启动子，表明不同表达调控元件之间嵌合不一定存在协同促进作用，还可能存在相互竞争转录因子的情况，分析可能一方面在较小的空间范围内，会存在位阻效应，一种转录因子的结合阻止了其他转录因子进入临近位点，另一方面不同转录调控因子之间存在着一定相互作用，而不仅仅是一种顺次排列关系，额外结合的调控因子可能会破坏原有的相互作用。
本发明将构建的重组启动子与其他用于对比的表达调控元件的碱基数目列入表2。
表2：不同表达调控元件碱基数目表
Figure RE-GDA0002439652250000161
根据上表可知，本发明提供的重组启动子ATh1promoter和ATh2 promote以同HLP和TTRm相近的尺寸(ATh1,232bp；ATh2,284bp；HLP, 252bp；TTRm,223bp)达到FVIII表达量提升1.2-10效果，与 ApoE/TTRp/MVM和CRM8/TTRp/MVM启动子相比，表达FVIII水平也有 1-2倍的提升，而尺寸上缩短了83-211bp。ATh3，ATh4(ATh3,286bp；ATh4, 338bp)与ATh1，ATh2相比，长度虽然略有增加，但高效表达FVIII持续时间更长。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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tgtctgtctg cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc taggcaaggt 60
tcatatttgt gtaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc 120
aggtttggag tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag 180
ccccttcacc aggagaagcc gtca 204
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ggcaaggttc atatttgtgt aggttactta ttctcctttt gttgactaag tcaataatca 60
gaatcagcag gtttggagtc agcttggcag ggatcagcag cctgggttgg aaggaggggg 120
tataaaagcc ccttcaccag gagaagccgt ca 152
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gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60
gaccttggtt aatattcacc a 81
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ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatg 54
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<213> Human
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tacctgctga tcgcccggcc cctgttcaaa catgtcctaa tactctgtct ctgcaagggt 60
catcagtagt tttccatctt actcaacatc ctcccagtg 99
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gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60
gaccttggtt aatattcacc aggcaaggtt catatttgtg taggttactt attctccttt 120
tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca ggtttggagt cagcttggca gggatcagca 180
gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc cccttcacca ggagaagccg tc 232
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gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60
gaccttggtt aatattcacc atgtctgtct gcacatttcg tagagcgagt gttccgatac 120
tctaatctcc ctaggcaagg ttcatatttg tgtaggttac ttattctcct tttgttgact 180
aagtcaataa tcagaatcag caggtttgga gtcagcttgg cagggatcag cagcctgggt 240
tggaaggagg gggtataaaa gccccttcac caggagaagc cgtc 284
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ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatggggcga 60
ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt 120
ggttaatatt caccaggcaa ggttcatatt tgtgtaggtt acttattctc cttttgttga 180
ctaagtcaat aatcagaatc agcaggtttg gagtcagctt ggcagggatc agcagcctgg 240
gttggaagga gggggtataa aagccccttc accaggagaa gccgtca 287
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ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatggggcga 60
ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt 120
ggttaatatt caccatgtct gtctgcacat ttcgtagagc gagtgttccg atactctaat 180
ctccctaggc aaggttcata tttgtgtagg ttacttattc tccttttgtt gactaagtca 240
ataatcagaa tcagcaggtt tggagtcagc ttggcaggga tcagcagcct gggttggaag 300
gagggggtat aaaagcccct tcaccaggag aagccgtc 338
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tacctgctga tcgcccggcc cctgttcaaa catgtcctaa tactctgtct ctgcaagggt 60
catcagtagt tttccatctt actcaacatc ctcccagtgg ggcgactcag atcccagcca 120
gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca 180
ggcaaggttc atatttgtgt aggttactta ttctcctttt gttgactaag tcaataatca 240
gaatcagcag gtttggagtc agcttggcag ggatcagcag cctgggttgg aaggaggggg 300
tataaaagcc ccttcaccag gagaagccgt c 331

Claims (10)

1.一种核酸分子，其特征在于，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；和
(b)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第二多核苷酸，或该第二多核苷酸的功能片段；
其中(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第一多核苷酸；和
(b)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二多核苷酸；
其中(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括：
(c)与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性的第三多核苷酸，或该第三多核苷酸的功能片段；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其包括：
(a)具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第一多核苷酸；和
(b)具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二多核苷酸；和
(c)具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第三多核苷酸；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’连接，并且所述核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
5.如权利要求1至4任一项所述的核酸分子的应用，其特征在于，用作肝脏特异性启动子启动基因或核酸片段在肝脏中表达。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述启动子用于启动FVIII凝血因子基因在肝脏的表达。
7.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求1至6任一项所述的核酸分子。
8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒或病毒载体。
9.一种哺乳动物宿主细胞，其包括如权利要求7或8所述的表达载体。
10.一种哺乳动物，其基因组包括如权利要求1至4任一项所述的核酸分子或如权利要求7或8所述的表达载体。
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