WO2023008925A1 - 융합 프로모터, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 간암 치료용 조성물 - Google Patents

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    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present application relates to a recombinant vector using a fusion promoter specifically expressed in tumor tissue and an RNA interference-inducing nucleic acid, and a composition for treating liver cancer using the same.
  • This application is a technology developed through the 2020 Startup Support Facility Resident Technology Commercialization Support Project (TC200013) "Establishment of foundation for commercialization of cancer tissue-specific RNA interference gene therapy technology” by the Seoul Business Agency, Seoul Metropolitan Government.
  • TC200013 Startup Support Facility Resident Technology Commercialization Support Project
  • Gene therapy is a method of treating a disease by transferring a therapeutic gene to a desired organ in the body so that a new gene is expressed in cells.
  • Gene therapy can have excellent selectivity compared to treatment with general drugs, and can be applied for a long period of time by specifically improving the expression of only the causative gene of a disease that is difficult to control with other treatments. Since DNA as a therapeutic gene is vulnerable to hydrolysis by enzymes in vivo and has low efficiency in entering cells, it is configured in the form of a vector expressing a therapeutic gene for effective gene therapy.
  • a gene expression DNA vector is mainly used in the form of a plasmid, and then modified into a form having various kinds of sequences necessary for use as a viral vector.
  • a foreign gene mainly expressed in mammalian cells
  • it is inserted after the promoter sequence and operably linked, and then the gene is expressed in the cell.
  • Promoter sequences derived from these are often used.
  • promoters derived from various genes can be used to control the expression level of the corresponding gene or to express it only in specific cells or tissues.
  • Genes used in tumor-suppressing gene therapy basically use cancer-suppressing regulators that have the function of suppressing cell division while inducing death of cancer cells. Genes shared together are mainly used. Tumor suppressor genes are mainly expressed as proteins, and those related to DNA damage and other gene regulation can be used, but otherwise, noncoding RNA genes can be used as regulators in which the transcribed RNA itself regulates other gene expression. .
  • the problem to be solved by the present application is to prevent side effects and toxicity caused by gene expression in normal cells in tumor suppression gene therapy, and to express the gene only in cancer cells of a specific organ tissue to target tumor to obtain a cancer-specific therapeutic effect.
  • Another problem to be solved by the present application is to induce RNA interference including the sequence between the 2nd and 7th positions from the 5' end, which is the main site that binds to the target mRNA in the tumor suppressive microRNA whose expression level is low in cancer cells. to provide nucleic acids.
  • Another problem to be solved by the present application is to provide a recombinant vector including the promoter and a gene encoding an RNA interference-inducing nucleic acid.
  • Another problem to be solved by the present application is to provide a composition for preventing or treating liver cancer and a composition for diagnosing liver cancer containing the recombinant vector.
  • Another problem to be solved by the present application is to provide a method for providing information for diagnosing liver cancer using the recombinant vector.
  • One embodiment of the present application is an enhancer sequence of a gene that is specifically expressed only in cells of a specific tissue, including cancer cells; a core promoter sequence of the gene; and a binding site sequence of at least one oncogenic transcription factor located between the enhancer sequence and the promoter sequence; This operably linked fusion promoter is provided.
  • the genes are albumin, ⁇ -1-antitrypsin, pyruvate kinase, phosphoenol pyruvate carboxykinase, transferrin, transthyretin, ⁇ -fetoprotein specifically expressed in liver cancer cells. It may be a gene encoding a protein selected from the group consisting of proteins, ⁇ -fibrinogen and ⁇ -fibrinogen.
  • the transcription factor binding site may be selected from the group consisting of Myc, Myb, STAT, Jun, ETS (Erythroblast transformation specific), ERG, etc., known as oncogenic transcription factors, and in more detail may be a sequence (5'-TTCC-3') or (5'-CTCCC-3'), which is a binding site of an ETS (Erythroblast transformation specific) transcription factor.
  • it may further include a nucleic acid sequence encoding an RNA interference-inducing nucleic acid or a DNA fragment identical thereto.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid may have the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence of miR-122b from the 2nd to the 7th from the 5' end.
  • the fusion promoter includes a gene encoding a reporter protein; may further include.
  • the reporter protein may be at least one selected from the group consisting of a fluorescent protein, luciferase, and a protein used in nuclear medicine or MRI imaging.
  • the fluorescent protein is Green Fluorescent Protein (GFP), Modified Green Fluorescent Protein (MGFP), Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) , Red Fluorescent Protein (RFP), Enhanced Red Fluorescent Protein (ERFP), Blue Fluorescent Protein (BFP), Enhanced Blue Fluorescent Protein (EBFP) , Yellow Fluorescent Protein (YFP) and Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP).
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • MGFP Modified Green Fluorescent Protein
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • ERFP Enhanced Red Fluorescent Protein
  • BFP Blue Fluorescent Protein
  • EBFP Enhanced Blue Fluorescent Protein
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein
  • the protein used for nuclear medicine or MRI imaging is Herpes simplex virus thymidine kinase, dopamine receptor, somatostatin receptor, It may be at least one selected from the group consisting of a sodium-iodide transporter, an iron receptor, a transferrin receptor, ferritin, and an iron transporter (magA).
  • nucleotide sequence between at least the 2nd to the 7th from the 5' end of at least one single strand of the double strand of a nucleic acid that induces RNA interference is the same as the nucleotide sequence of miR-122b, RNA interference inducing nucleic acids are provided.
  • One embodiment of the present application provides a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding the RNA interference-inducing nucleic acid or a DNA fragment identical thereto.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid may have the same nucleotide sequence as that of miR-122b from the 2nd to the 7th nucleotide sequence from the 5' end.
  • One embodiment of the present application provides a recombinant vector including the fusion promoter.
  • One embodiment of the present application provides a recombinant vector including the fusion promoter and a nucleic acid sequence encoding the RNA interference-inducing nucleic acid or a DNA fragment identical thereto.
  • One embodiment of the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising, as an active ingredient, a recombinant vector containing a nucleic acid sequence encoding the RNA interference-inducing nucleic acid or a DNA fragment identical thereto.
  • One embodiment of the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising, as an active ingredient, a recombinant vector comprising the fusion promoter and a nucleic acid sequence encoding the RNA interference-inducing nucleic acid or a DNA fragment identical thereto.
  • One embodiment of the present application provides a method for treating liver cancer comprising administering the recombinant vector to a subject having liver cancer.
  • One embodiment of the present application provides the use of a recombinant vector for preparing a drug for liver cancer treatment.
  • One embodiment of the present application provides a composition for diagnosis of liver cancer comprising the recombinant vector as an active ingredient.
  • One embodiment of the present application provides a method for providing information for diagnosing liver cancer, comprising the step of treating the recombinant host cell in a biological sample isolated from a subject of interest.
  • One embodiment of the present application provides a method for providing information for diagnosing liver cancer, further comprising diagnosing cancer when the reporter protein is expressed from the recombinant host cell.
  • the present application provides a promoter technology in which a therapeutic gene is expressed only in target tumor cells while preventing side effects caused by inducing gene expression in normal cells in a tumor gene therapy product.
  • a liver cancer cell-specific expression promoter that can be used for liver cancer and a modified RNA interference gene based on miR-122b that effectively inhibits liver cancer are utilized together to provide effective and specific liver cancer suppression gene therapy effects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of enhancers, transcription factor binding sites, and core promoters required to construct a cancer tissue-specific expression promoter in a cancer suppressor gene therapy vector, and features that induce expression only in cancer cells, not normal cells.
  • FIGS. 2 to 4 show the composition of the liver cancer tissue-specific expression promoter, along with the albumin enhancer and the core promoter sequence, and the synthetic sequence of the binding site of ETS, an oncogenic transcription factor inserted therebetween, and the specific expression function of the promoter. It is shown schematically about the construction of a luciferase reporter vector for the purpose.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the function of the hepatocarcinoma cell-specific expression promoter prepared in FIG. 2 by measuring the expression level in various hepatocellular carcinoma cells through a luciferase reporter.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the function of the hepatocarcinoma cell-specific expression promoter prepared in FIG. 2 by measuring the expression level in other cells through a luciferase reporter.
  • Figure 9 shows the target inhibition effect through the expression of the corresponding RNA interference gene together with the results confirmed by the luciferase reporter.
  • Figure 10 shows that si-122b and si-122-2,3U, which are RNA interference inducing substances designed in the same form as the terminal sequence of miR-122b, show inhibitory effects on the terminal target mRNA in liver cancer cells (HepG2). Luciferase It shows the results confirmed by the reporter.
  • FIG. 11 shows the results of the cell division inhibitory effect in HepG2, a liver cancer cell line, of siRNAs designed based on miR-122b and terminal sequences.
  • FIG. 12 shows the results of the siRNA designed based on miR-122b and terminal sequences on the increase in apoptosis of liver cancer cells by the drug Sorafenib in HepG2, a liver cancer cell line.
  • Figure 13 shows the results of the target inhibitory effect of siRNA designed based on miR-122b and terminal sequences on the inhibition of liver cancer cell migration in HepG2, a liver cancer cell line.
  • Embodiments according to the concept of the present application may be applied with various changes and may have various forms, so specific embodiments are intended to be described in detail herein. However, this is not intended to limit the embodiments according to the concept of the present application to a specific disclosure form, and should be understood to include all changes, equivalents, and substitutes included in the spirit and technical scope of the present application.
  • the present applicant has developed a tumor tissue-specific expression promoter that activates gene expression only in cancer cells of a specific tissue by inserting a binding site for an oncogenic transcription factor between a tissue-specific enhancer and a core promoter sequence.
  • the albumin enhancer, a gene expressed only in the liver, and the albumin core promoter were combined with a functional sequence, and the binding site of ETS, a well-known oncogenic transcription factor, was inserted between the enhancer and the core promoter.
  • ETS a well-known oncogenic transcription factor
  • miR-122b was found to be expressed in the miR-122 gene region known to suppress liver cancer, and the end sequence of miR-122b was found to have a liver cancer suppression function. Therefore, this application was completed by finally developing a novel recombinant liver cancer treatment gene expression vector capable of specifically inhibiting liver cancer cells by combining it with a liver cancer tissue expression promoter.
  • the term "gene therapy” refers to the treatment of genetic diseases and acquired diseases by delivering new genetic materials into the cells of patients to compensate or suppress the functions of genes that cause diseases due to mutations, etc., and/or to treat genetic diseases. It is an approach to treating disease. Therefore, this application can be used in biotechnology and medicine for the manufacture of gene therapy products. That is, the produced gene therapy DNA vector containing the target gene can be delivered to cells of humans and animals suffering from reduced or insufficient expression of the gene, thereby ensuring a desired therapeutic effect.
  • the term "plasmid” is a self-replicating extrachromosomal circular DNA found in bacteria, and may contain a resistance gene for a gene. It can be easily recombinated, modified, and amplified by utilizing this, and is used as a vector to express various genes. Even when introduced into mammalian target cells such as humans, the plasmid is not integrated into the genome and exists as an episome, while its production is very inexpensive and there is no immune response or side effects due to the administration of the plasmid, so the delivery of therapeutic genes is widely used in gene therapy.
  • promoter is a specific nucleotide sequence on DNA that initiates transcription using DNA as a template, and generally has a common sequence. Promoters sometimes contain sequences up to 10 kb in front of the gene to be transcribed, and consist of an enhancer and a core promoter, and according to the sequence, a general promoter that can promote the expression of a foreign gene in all cells or tissues, Specific or selective promoters such as organ-specific promoters, tumor-specific promoters, and developmental or differentiation-specific promoters may also be used.
  • An enhancer is a transcription control sequence present in a sequence up to 10 kb in front of a gene to be transcribed, and initiates the transcription of the gene in specific tissues and cells, and the amount of messenger RNA (mRNA) produced by transcription is reduced depending on the presence or absence of the enhancer. As a result, it increases, but is not limited thereto, and refers to a sequence having a function of regulating transcription.
  • core promoter refers to a DNA region that is minimally required for RNA polymerase to bind and initiate transcription of a gene.
  • a promoter can induce transcription even if there is only a core promoter portion consisting of a minimal sequence having promoter activity.
  • eukaryotes usually have a TATA box at the -20 base pair site.
  • enhancer is a base sequence having the effect of regulating the action of a promoter.
  • An enhancer is a site that is regulated in order to be specifically expressed in a specific type of cell of a specific organ tissue. Enhancers can regulate transcription regardless of sequence orientation. Although one type of enhancer may be used in the present application, a plurality of two or more identical enhancers may be used, or a plurality of different enhancers may be used in combination. In the case of using a plurality of other enhancers, the order is not limited.
  • Enhancers are usually located far from the transcription start site. Therefore, gene expression can be controlled cell type-specifically, stage-specifically, or tissue-specifically by having different enhancer sequences in promoters. That is, if cell type specific expression of a foreign gene is desired, the foreign gene can be a sequence on a mammalian active cell type specific promoter, such as liver cells, brain cells (eg neuronal cells), glial cells, Schwan cells, lung cells, kidneys. It can be made operative by the inclusion of different enhancers specific for cells, spleen cells, muscle cells or skin cells.
  • a mammalian active cell type specific promoter such as liver cells, brain cells (eg neuronal cells), glial cells, Schwan cells, lung cells, kidneys. It can be made operative by the inclusion of different enhancers specific for cells, spleen cells, muscle cells or skin cells.
  • liver cell specific promoters include albumin, ⁇ -1-antitrypsin, pyruvate kinase, phosphoenol pyruvate carboxykinase, transferrin, transthyretin, ⁇ -fetoprotein, ⁇ -fibrinogen or ⁇ -fibrinogen This is the case of using the promoter enhancer of the gene encoding .
  • these promoter and enhancer regions can induce gene expression only in specific cells. Some of these transcription factor binding sites may change as mutations occur in the original promoter sequence. In other words, in the case of a specific disease gene, it is often observed that gene expression changes due to mutations in the promoter sequence. In this case, the mutation occurs at the binding site of a transcription factor, and the mutation is mainly often occurs in disease. In particular, as the tumor progresses, mutations frequently occur repeatedly in the promoter region of cancer-causing genes in normal cells at specific locations, and this exposure induces the binding of specific transcription factors and enhances the gene expression level of the promoter to cause cancer.
  • telomeres in liver cancer, a mutation in the promoter of the TERT (Telomerase reverse transcriptase) gene creates a binding site for an ETS (Erythroblast transformation specific) transcription factor, which increases the expression of TERT in cancer cells, leading to the formation of telomeres in the genome.
  • ETS transcription factors are usually overexpressed frequently in cancer tissues by chromosome amplification and translocation, and are oncogenes that cause erythroblastic and myeloblastic leukemia.
  • ETS transcription factors are usually overexpressed frequently in cancer tissues by chromosome amplification and translocation, and are oncogenes that cause erythroblastic and myeloblastic leukemia.
  • ETS transcription factors there are 27 types of ETS transcription factors in humans. of ETS family genes are reported carcinogens. Therefore, by using a mutant sequence that occurs directly at the promoter site in tumors, it is possible to construct a promoter with characteristics that induce overexpression in tumor cells and almost no expression in
  • a gene expression DNA vector composed of a promoter and a gene sequence is introduced into a target cell for gene therapy through a gene carrier.
  • a gene delivery vehicle should be non-toxic to cells and capable of selectively and effectively delivering a DNA vector to a desired cell.
  • These gene carriers can be largely divided into viral and non-viral.
  • the most efficient viral vectors include retroviruses, lentiviruses, adeno-associated viruses (AAV), herpesviruses, poxviruses or adenoviruses .
  • Non-viral delivery of genetic material usually involves plasmids themselves carrying the therapeutic gene and associated with various carriers such as lipids, cationic polymers, dendrimers, polypeptides or nanoparticles.
  • MicroRNAs are about 20 small non-coding RNAs that regulate various biological functions by inhibiting the mRNA expression of other target genes.
  • some microRNAs are highly expressed in normal cells, but their expression levels are significantly reduced in cancer cells, and some of them are known to suppress cancer.
  • MicroRNAs that suppress cancer are called tumor suppressor miRNAs, and treatments using cancer suppression functions are being actively studied.
  • Physiological functions of microRNAs appear by inhibiting their expression by recognizing target genes mainly through base pairing in the seed region (seed region; from 2nd to 7th of the 5' end). If the RNA sequence that induces RNA interference has the same terminal sequence as the tumor suppressor microRNA, it can exhibit the same tumor suppressor function.
  • Nucleic acids that induce such RNA interference are transcribed from genes in the form of shRNA (short hairpin RNA), which is made into a hairpin structure, and then processed in the body to finally form about 20 RNA duplexes, or about 20 RNA duplexes.
  • shRNA short hairpin RNA
  • siRNA small intertering RNA
  • operably linked generally means that a nucleotide expression control sequence and a nucleotide sequence encoding a protein of interest are operably linked to perform a function, thereby affecting the expression of the encoding nucleotide sequence.
  • Operable linkage with the recombinant vector can be prepared using gene recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cutting and linking can be prepared using cutting and linking enzymes known in the art.
  • RNA interference is a phenomenon that inhibits gene expression in the pre- and post-phase, and is widely used as a technology that inhibits a desired target gene by artificially inducing gene suppression by introducing an RNA material that causes it into a cell.
  • This RNA interference phenomenon is actually caused by small RNAs composed of ⁇ 21 bases called microRNAs (miRNAs) in cells, and microRNAs are particularly Through the array, hundreds of target genes are recognized in mRNA and their expression is suppressed to exhibit biological functions.
  • microRNA which is a naturally occurring RNA interference-inducing nucleic acid, forms a complex with an agonist protein and then binds to a target through a complementary nucleotide sequence.
  • the microRNA terminal region When a sequence of at least 6 consecutive bases between the 1st and 8th bases of the 5' end, called a seed region, and most importantly, between the 2nd and 7th bases of the 5' end, is combined with the target mRNA, that Inhibits the expression of target mRNA.
  • nucleotide sequence of the above type occurs most often, these targets are defined as canonical targets of microRNA, and this type of complementary nucleotide sequence is very important for the canonical biological function of microRNA.
  • Ago HITS-CLIP which can experimentally sequence microRNA targets, it has been found that there are many noncanonical targets that deviate from these rules and are not recognized as canonical targets such as terminal regions.
  • microRNAs recognize target mRNAs and inhibit the expression of their genes, they exhibit biological functions. Therefore, nucleotide sequences complementary to microRNA end regions are attached to microRNAs while competing with target mRNAs. It can be applied as a mechanism to inhibit biological functions induced by In particular, when microRNAs exhibit disease-causing functions, they can be used as therapeutic agents by specifically inhibiting them.
  • These microRNA inhibitors are generally used in the form of suppressing its function by specifically arranging the bases of a microRNA, including a sequence that is almost perfectly complementary to the entire sequence of the microRNA.
  • RNA interference-inducing nucleic acid since the biological function of a microRNA is mainly expressed by suppressing the expression of target mRNAs only with the sequence of the terminal region, as long as the terminal sequence of the RNA interference-inducing nucleic acid is the same as that of the corresponding microRNA, it can sufficiently exhibit the same biological function.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid is a double strand consisting of a guide strand of 18 to 23 nucleotides and a passenger strand complementary to the guide strand, most preferably 21 It may consist of nucleotides, but is not limited thereto.
  • the double-stranded nucleic acid having a stem-loop hairpin structure is modified into a double-stranded form by processing the stem part by Dicer protein, that is, shRNA is processed. It may be in the form of siRNA, but it may vary depending on the form of nucleic acid, so it is not limited thereto.
  • the nucleic acid generally has a two nucleotide overhang at the 3' end.
  • a nucleic acid that induces RNA interference is siRNA (small interfering RNA) in which a guide strand composed of sense oligonucleotides and a carrier strand, which is a complementary antisense oligonucleotide, are complementary to each other. It is preferably any one selected from the group consisting of shRNA (short hairpin RNA), which is a single RNA strand of a connected stem-loop structure, but is not limited thereto.
  • shRNA short hairpin RNA
  • the siRNA can be easily prepared by requesting a siRNA manufacturer or an RNA synthesis company, and since it is a short oligomer of about 21 nt, transduction into general cell lines is easy.
  • RNA interference-inducing nucleic acids can easily suppress the expression of target genes, they are provided as efficient gene knockdown methods or gene therapy methods.
  • guide strand is a single-stranded portion of the double strands whose sequence is determined for the purpose of inhibiting the target. It is a polynucleotide having a nucleic acid sequence that is substantially or 100% complementary to the target gene mRNA of interest and thus is also called an antisense strand, for example, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, It may be fully or partially complementary to a nucleic acid sequence such as lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA or asiRNA.
  • the term “passenger strand (sense strand)” forms a double-stranded structure with the guide strand among the double-strands, and acts as a carrier to help the guide strand bind to the agonist protein, and the target nucleic acid
  • a polynucleotide having a nucleic acid sequence substantially or 100% identical to, and thus also called a sense strand for example, a nucleic acid such as siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA or asiRNA It refers to a polynucleotide identical in whole or in part to a sequence.
  • the present application provides an RNA interference-inducing nucleic acid comprising a portion binding to the 2nd to 7th positions from the 5' end of a tumor suppressor microRNA whose expression level is low in cancer cells among microRNAs.
  • the 5' end sequence of the RNA interference-inducing nucleic acid may be a part of miR-122b, which acts as a microRNA to inhibit cancer growth and induce cell death, It may have the ability to inhibit cancer invasion.
  • the inventor of the present application invented miR-122b, a liver cancer inhibitory microRNA, in the miR-122 gene region, whose expression is specifically inhibited in liver cancer cells, and found that the terminal sequence effectively inhibits liver cancer cells when expressed in the form of RNA interference. confirmed the fact.
  • One example of the present application is to develop a liver cancer tissue-specific expression promoter, and select and express genes capable of effectively suppressing liver cancer cells through this. Therefore, finally, a novel recombinant gene therapy expression vector capable of specifically treating liver cancer is provided.
  • the fusion promoter according to the present application includes an enhancer sequence of a gene specifically expressed only in specific cancer cells; a core promoter sequence of the gene; and at least one oncogenic transcript binding site sequence located between the enhancer sequence and the promoter sequence; may be an operably linked promoter.
  • genes are albumin, ⁇ -1-antitrypsin, pyruvate kinase, phosphoenol pyruvate carboxykinase, transferrin, transthyretin, ⁇ -fetoprotein, ⁇ -fibrinogen and ⁇ - It may be a gene encoding a protein selected from the group consisting of fibrinogen.
  • the enhancer sequence may be chr5:90,597,504-90,598,315 (SEQ ID NO: 1) of mm39 or chr 4:73,398,294-73,399,116 (SEQ ID NO: 2) of hg38, and the core promoter sequence may be chr5:90,608,588- of mm39. 90,608,782 (SEQ ID NO: 3) or chr4 of hg38: 73,404,115-73,404,316 (SEQ ID NO: 4).
  • the transcription factor binding site may be a sequence (5'-TTCC-3') or (5'-CTTCC-3'), which is a binding site of an ETS (Erythroblast transformation specific) transcription factor.
  • ETS transcription factor binding site The sequence containing the ETS transcription factor binding site is SEQ ID NO: 5 (ETS transcription factor binding site (CC)), SEQ ID NO: 6 (ETS transcription factor binding site (TC)), SEQ ID NO: 7 (ETS transcription factor binding site) binding site (CT)) and SEQ ID NO: 8 (binding site (TT) of ETS transcription factor).
  • it may further include a nucleic acid sequence encoding an RNA interference-inducing nucleic acid or a DNA fragment identical thereto.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid may have the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence of miR-122b (SEQ ID NO: 9) from the 2nd to the 7th from the 5' end.
  • Substitution, insertion and deletion variants of one or more nucleotides constituting the promoter and combinations thereof are included.
  • Substitutional variants of nucleotides are those in which at least one base is removed from a nucleotide sequence and another base is inserted in its place.
  • An insertional variant of a nucleotide is a variant in which one or more nucleotides are introduced at a predetermined site in the sequence.
  • Deletion variants of nucleotides are characterized in that one or more nucleotides are removed from a base. Any combination of substitutions, deletions or insertions is such that the function of the component remains intact.
  • the DNA fragment of the fusion promoter according to the present application is a DNA fragment having at least 60% homology to the DNA fragment consisting of the above sequence.
  • DNA fragments of the present application include DNA fragments whose DNA sequences are at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homologous to the sequences of the DNA fragments reported herein.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotides or two polypeptide moieties. Correspondence between sequences from one moiety to another can be determined by known art techniques. For example, homology can be determined by aligning the sequence information and directly aligning the sequence information between two polypeptide molecules using readily available computer programs. In addition, homology can be determined by hybridizing polynucleotides under conditions of forming stable duplexes between homologous regions, followed by digestion with a single-strand-specific nuclease to determine the size of the digested fragments.
  • homologous include proteins derived from superfamily (eg, immunoglobulin superfamily) and homologous proteins from other species (eg, myoprotein chain, etc.) refers to the relationship between proteins having "evolutionary origins". Such proteins (and their coding genes) have sequence homology, which is reflected by a high degree of sequence similarity.
  • homologous when modified by an adjective such as "very high” refers to sequence similarity and not to a common evolutionary origin.
  • sequence similarity refers to the degree of identity or correspondence between nucleotide sequences or amino acid sequences of proteins that may or may not share a common evolutionary origin.
  • the two DNA sequences have at least 21% (preferably at least about 50%, most preferably about 75%, 90%, 95%, 96%, 97%) nucleotide match over a given length of DNA sequence. %, 98%, or 99%), "substantially homologous” or “substantially similar”.
  • Substantially homologous sequences can be identified by comparing sequences using standard software used in sequence data banks or, for example, by Southern hybridization experiments under stringent conditions defined for a particular system.
  • the present application relates to a recombinant vector comprising the fusion promoter prepared above.
  • the term “vector” refers to any medium for cloning and/or transfer of a base into a host cell.
  • a vector may be a replica that allows other DNA fragments to bind to result in replication of the linked fragments.
  • "Replication unit” refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, that is, is capable of replicating under its own control.
  • the term “vector” includes viral and non-viral vehicles for introducing bases into host cells in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the term “vector” may also include mini globular DNA.
  • the vector may be a plasmid without bacterial DNA sequences. Removal of abundant bacterial DNA sequences in the CpG region is being done to reduce transgene expression silencing and result in more sustained expression from plasmid DNA vectors.
  • the vector of the present application includes the fusion promoter.
  • the recombinant vector further comprises at least one antibiotic resistance gene selected from the group consisting of an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene and a chloramphenicol acetyl transferase gene. It may be a recombinant vector.
  • antibiotic resistance gene is a gene having resistance to antibiotics, and cells having this gene survive even in the environment treated with the antibiotic, so it is usefully used as a selection marker in the process of obtaining plasmids in large quantities from E. coli. .
  • the antibiotic resistance gene is not a factor that greatly affects the expression efficiency according to the optimal combination of vectors, which is a key technology of the present application, and therefore, antibiotic resistance genes commonly used as selection markers can be used without limitation.
  • resistance genes to ampicillin, tetracyclin, kanamycin, chloroamphenicol, streptomycin, or neomycin can be used, preferably It may be an ampicillin resistance gene.
  • the "reporter protein” of the present application is a protein that performs a function of visually diagnosing cancer, and includes, for example, a fluorescent protein, luciferase, and a protein used in nuclear medicine or MRI imaging. It may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the "fluorescent protein” of the present application is a protein that fluoresces itself so that cancer can be visually diagnosed, for example, Green Fluorescent Protein (GFP), Modified Green Fluorescent Protein (Modified Green Fluorescent Protein) Protein; MGFP), Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), Red Fluorescent Protein (RFP), Enhanced Red Fluorescent Protein (ERFP), Blue Fluorescent Protein Protein; BFP), Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), yellow fluorescent protein (YFP), and enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), but may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • Modified Green Fluorescent Protein Modified Green Fluorescent Protein
  • MGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • ERFP Enhanced Red Fluorescent Protein
  • BFP Enhanced Blue Fluorescent Protein
  • EBFP yellow fluorescent protein
  • EYFP enhanced yellow fluorescent protein
  • Proteins used in the nuclear medicine or MRI imaging of the present application are, for example, Herpes simplex virus thymidine kinase, dopamine receptor, somatostatin receptor, sodium -It may be at least one selected from the group consisting of a sodium-iodide transporter, an iron receptor, a transferrin receptor, ferritin, and an iron transporter (magA), but is not limited thereto no.
  • the method of applying modification to the gene of the present application may be performed by a method of deleting or disrupting various genes known in the art, and for example, the deletion and disruption methods include homologous recombination, chemical mutagenesis, and irradiation It can be performed by methods such as mutagenesis or transposon mutagenesis.
  • Another embodiment of the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present application includes the recombinant vector of the present application as an active ingredient.
  • the fusion promoter according to the present application when the fusion promoter according to the present application is transformed, targeting cancer in the subject, and then a substance that inhibits the regulatory protein is administered, a reporter protein capable of real-time imaging and anti-cancer in this strain Since the proteins are simultaneously expressed in a balanced manner, cancer can be prevented or treated very effectively, and at the same time, cancer can be diagnosed in real time.
  • the "prevention" of the present application may include all without limitation, as long as it is an act of blocking, suppressing or delaying the symptoms caused by cancer using the active ingredient of the present application.
  • treatment refers to all activities in which symptoms caused by cancer are improved by using the active ingredient of the present application, or an object is benefited, and useful or desirable results including clinical results are obtained. means an attempt to obtain A useful or desirable clinical outcome, whether detectable or not, is alleviation or amelioration of one or more symptoms or conditions, reduction of disease extent, stabilization of disease state, inhibition of disease occurrence, inhibition of disease spread, delay or slowing of disease progression. , delay or slowing of disease onset, improvement or alleviation of disease state, and reduction (partial or total), but are not necessarily limited thereto. Also, “treatment” can mean prolonging the survival of a patient beyond what would be predicted in the absence of treatment.
  • Treatment can also mean inhibiting disease progression, temporarily slowing disease progression, and more preferably relates to permanently arresting disease progression.
  • an outcome may be unfavorable or undesirable if the treatment results in the opposite outcome in the treated patient, i. .
  • the pharmaceutical composition of the present application may be in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be intended for humans.
  • compositions of the present application are not limited to these, but are formulated in the form of oral formulations such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • the pharmaceutical composition of the present application may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavors, etc. for oral administration.
  • a topical agent, a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer, and the like may be mixed and used, and in the case of topical administration, a base, an excipient, a lubricant, a preservative, and the like may be used.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present application may be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc.
  • it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
  • it may be formulated into solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained-release preparations, and the like.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate. , cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, and the like may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present application is, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, This includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral in the present application includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrabursal, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present application may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present application depends on various factors including the activity of the specific compound used, age, body weight, general health, sex, diet, administration time, route of administration, excretion rate, drug combination and severity of the specific disease to be prevented or treated. It can vary widely, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, body weight, degree of disease, drug type, administration route and period, but can be appropriately selected by those skilled in the art, and is 0.0001 to 50 mg/kg per day. Alternatively, it may be administered at 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present application in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present application may be formulated into a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • Another embodiment of the present application provides a composition for diagnosing cancer comprising the recombinant vector.
  • the "diagnosis" of the present application includes monitoring the presence of cancer in real time by a reporter protein expressed from a fusion promoter introduced into the vector when the vector of the present application is positioned to target cancer. It means any act of identifying cancer tissue in vivo.
  • the fusion promoter, anticancer protein, reporter protein, recombinant vector, Salmonella strain, transformation, cancer, etc. are the same as those described in the fusion promoter, recombinant vector, strain, and pharmaceutical composition. Therefore, it is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • Another embodiment of the present application provides a method for providing information for diagnosing cancer.
  • the method of the present application includes the step of treating a strain into which the recombinant vector according to the present application is introduced in a biological sample isolated from a subject of interest.
  • the method for providing information for diagnosis of cancer of the present application may further include diagnosing cancer when a reporter protein is expressed from the vector.
  • biological sample means any material, tissue, or cell obtained from or derived from an object, including, for example, tissue, cell, or cell extract. It can be done, but is not limited thereto.
  • the contents of the fusion promoter, enhancer, RNA interference nucleic acid, reporter protein, recombinant vector, strain, transformation, cancer, diagnosis, etc. are the same as described above, and the present specification are omitted to avoid excessive complexity.
  • the present applicants found that the promoter region can be divided into an enhancer showing tissue-specific expression and a core promoter, which is a minimum sequence required for gene transcription, and that cancer cells, unlike normal cells, can develop carcinogenesis Transcription factors are activated, and accordingly, when the promoter has a binding site for the transcription factor, gene expression is activated only in cancer cells.
  • a tumor tissue-specific expression promoter was constructed as follows. In more detail, the enhancer part that induces tissue-specific expression is brought from the promoter region of the genome sequence of a gene previously expressed in a specific tissue, and then the core promoter that can cause the least gene transcription in the gene are taken from the vicinity of the transcription start site and combined with each other to produce a synthetic promoter.
  • tissue-specific expression promoter can be constructed by combining the corresponding sequences of a gene expressed only in hepatocytes, a gene expressed only in nerve cells, and a gene expressed only in skin cells. .
  • a binding site of an oncogenic transcription factor is inserted between the enhancer and the core promoter. At this time, oncogenic transcription factors are not expressed or inactivated in normal cells, but when cancer cells are transformed, their expression is increased or activated. Examples include Myc, ETS, Myb, STAT, Jun, ERG, etc. .
  • a tumor tissue-specific expression promoter When such a tumor tissue-specific expression promoter is used in gene therapy, it can be used in combination with a cancer suppressor gene, and even if the cancer treatment gene vector constructed in this way is introduced into normal cells, the promoter is not activated, so gene expression does not occur (FIG. 1B ). Therefore, when a therapeutic gene induces cell death, if it is expressed in normal cells, it can cause side effects and toxicity by killing normal cells as well. It can show a specific therapeutic effect that is killed. Therefore, as in the promoter configuration presented in this application, at least one oncogenic transcription factor binding site is constructed behind the tissue-specific enhancer, and then a core promoter is placed in the following sequence to produce a cancer cell-specific synthetic promoter in various tissues and cells. can be produced.
  • binding sites of oncogenic transcription factors to be inserted here can be inserted by combining binding sites of several types of other transcription factors, but at least one site is present to distinguish normal cells from tumor cells and form tissue-specific In general, it can be overactivated only in cancer cells and have the characteristic of inducing gene expression.
  • Example 2 Construction of a liver cancer tissue-specific synthetic promoter and construction of a luciferase reporter vector for confirming the promoter
  • a promoter combining a tissue-specific enhancer, an oncogenic transcription factor binding site, and a core promoter sequence can induce cancer tissue-specific expression.
  • FIG. 2A left).
  • the sequence of the tissue-specific enhancer part (812 bp) of albumin, a gene expressed only in liver cancer cells was amplified and obtained from mouse genome (chr5:90,597,504 -90,598,315; mm39) DNA through PCR.
  • a 195 bp promoter was also obtained through PCR from a portion of the mouse genome (chr5:90,608,588-90,608,782; mm39) sequence.
  • the promoter sequence was changed to the luciferase reporter pGL4. It was inserted into the promoter region of the 10[luc2] vector (Promega) using Nhe1 and BglII restriction sites (Fig. 3). Through this, the firefly-derived luciferase gene, which has no promoter at all, is arranged next to the liver cancer tissue-specific synthetic promoter produced and regulated, so that the expression level in the cells introduced with the activity of the corresponding luciferase can be measured. It became.
  • liver cancer tissue-specific synthetic promoter prepared in this application, when there is no ETS binding site (pAlb-CC), when one ETS binding site occurs (pAlb-TC or pAlb-CT), In the case where two ETS binding sites occurred (pAlb-TT), the activity was measured by introducing into several cell lines (FIG. 5).
  • the cell lines used at this time were liver cancer cell lines (HepG2, Huh7), primary cultured mouse hepatocytes, cervical cancer cells (HeLa), and muscle cell lines (C2c12).
  • the same amount of the luciferase vector and the pRL-TK vector containing the renilla luciferase gene were transferred to each cell according to the manufacturer's protocol using Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen) (co -transfection) to investigate the effect.
  • all cell lines were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml steptomycin, and were transfected in antibiotic-free complete medium. tion was performed.
  • siRNA was investigated by measuring the activity of luciferase according to the manufacturer's protocol using Promega's Dual-luciferase reporter assay system.
  • the activity of firefly luciferase was calculated using a standardized value by repeating the experiment at least 4 times using the company's Glomax Luminometer.
  • luciferase was expressed in liver-derived cells Huh7, HepG2, and primary cultured mouse hepatocytes in all luciferase vectors, except for the case with two ETS binding sites (pAlb-TT), but other It was confirmed that almost no expression was observed in tissue-derived cells (HeLa, C2c12).
  • expression was at least twice as high in liver cancer cells except for cases without ETS binding sites (pAlb-CC).
  • liver cancer cells HepG2, Huh7
  • normal hepatocytes primary cultured mouse hepatocytes
  • cancer cells but derived from cervical tissue, HeLa, and non-cancer cells but indefinitely dividing like cancer cells.
  • C2C12 a muscle cell line with the ability (FIG. 6).
  • the ETS binding site was inserted between the albumin enhancer and the core promoter sequence, it was observed through luciferase reporter experiments that gene expression could be actively induced only in liver tissue-derived cancer cells.
  • the tumor tissue-specific expression promoter inserts the binding site of an oncogenic transcription factor between the tissue-specific enhancer and the core promoter sequence, the corresponding synthetic promoter sequence construct not only tissue-specific gene expression but also gene expression only in tumorized cells. It was found that the characteristics of activation appeared. Therefore, it was confirmed that the liver cancer tissue-specific expression promoter prepared in this way can be specifically used as a liver cancer suppressor gene therapy by combining with a liver cancer suppressor gene.
  • Example 4 Construction of a vector combining a gene modified with the terminal sequence of miR-122b expressed in the miR-122 gene region and a promoter specific to liver cancer tissue, and activity confirmed.
  • liver cancer tissue-specific promoter After producing a liver cancer tissue-specific promoter, it is necessary to combine it with a gene that can effectively suppress liver cancer in order to utilize it as a gene therapy for liver cancer suppression. Accordingly, in the TCGA data analysis (Cell. 2017 Jun 15; 169(7): 1327-1341), which was subjected to large-scale sequencing of liver cancer patients, all gene regions where miR-122 was expressed were hypermethylated in liver cancer patients. It was noted that expression was suppressed as progressed.
  • miR-122 is a liver cancer suppressor gene (J Clin Invest. 2012 Aug;122(8):2884-97, J Clin Invest. 2012 Aug;122( 8):2871-83).
  • the expression of the miR-122 gene which was expressed specifically in liver tissue in normal hepatocytes, is suppressed as liver cancer progresses, and the applicants of the present application can apply it as a gene therapy that suppresses cancer by expressing the miR-122 gene.
  • the miR-122-expressing gene location (chr18:65,381,821-65,382,125; mm39) through the miRBase database, it was found that similar miR-122b was expressed in addition to the previously known miR-122 (FIG. 7).
  • the sequence of miR-122b is almost similar to that of miR-122, but the terminal sequence that recognizes the target mRNA and shows its function in microRNA is different.
  • miR-122b the sequence from the 2nd to the 7th position of the 5' end is UUAGUG, but miR-122 is GGAGUG. Therefore, it was previously thought that the expression of miR-122 suppresses cancer, but in fact, miR-122b located at the locus of the miR-122 gene can play such a role. Therefore, the present applicants first obtained the gene sequence (chr18:65,381,821-65,382,125; mm39) of the mouse genome sequence in which miR-122 exists through PCR, and then made the sequence of the terminal region of miR-122 the same as miR-122b. After changing all microRNAs produced in the corresponding region to have the same function as miR-122b (Fig.
  • liver cancer tissue-specific expression promoters 8
  • miR-122* 8
  • normal hepatocytes in liver cancer cells In combination with pAlb-CT and pAlb-TT, which significantly increased expression compared to , a retroviral liver cancer treatment vector was completed.
  • luciferase reporter experiments were performed in liver cancer cell lines It was run on HepG2 (FIG. 9A). First, the effect was examined by co-transfection into HeLa cells using Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen) together with a psi-check2 vector expressing Renilla luciferase according to the manufacturer's protocol.
  • the psi-check2 vector contains seed sites, a sequence completely complementary to the terminal part of miR-122b (from 2 to 7 at the 5' end) of the 3' untranslated region (3'UTR) of the Renilla luciferase gene. ; Seed) was used by synthesizing and inserting DNA to repeat 5 times. 24 hours after transfection, the effect of siRNA was investigated by measuring the activity of luciferase according to the manufacturer's protocol using Promega's Dual-luciferase reporter assay system. It was calculated by standardizing the activity of firefly luciferase by repeating the experiment at least three times using the company's Glomax Luminometer.
  • miR-122 As described above, in the genomic sequence expressing miR-122, known as a liver cancer suppressor gene, paying attention to miR-122b, a similar microRNA, in addition to miR-122, the sequence of the miR-122 genomic region based on the terminal sequence of miR-122b After modifying all of them to have the terminal sequence of miR-122b, when a liver cancer inhibitory gene therapy vector was constructed by combining the gene with the liver cancer tissue-specific expression promoter developed above, the vector was expressed in liver cancer cells, resulting in miR-122b It was confirmed that the target of can be well suppressed through the terminal sequence.
  • miR-122b is designed in the form of siRNA, as it binds to the target mRNA mainly through the terminal sequence (from the 2nd to the 7th position based on the 5' end) and suppresses the expression of the corresponding gene.
  • RNA interference inducing duplex was synthesized with si-122b), and also in the case of miR-122, a sequence in which the second and third positions of the 5' end were substituted with U was designed as siRNA to have the same terminal sequence as miR-122b (si-122-2,3U) to synthesize a duplex (Fig. 9A).
  • RNA containing the seed region of miR-122b is synthesized on the guide strand, and the passenger strand is synthesized in an unmodified form, so that the existing structure It was prepared to generate a duplex having 2 dT (Deoxy Thymine Nucleotide) protrusions at the 3' end along with a perfect reverse complement of 19 phosphorus.
  • FITC was attached to the 5' end of the carrier strand, so that the delivery of the siRNA duplex into the cell could be easily confirmed.
  • This RNA was chemically synthesized by ST Pharma, Trilink Technologies, or Bioneer, separated by HPLC, and prepared as a duplex of guide strand and carrier strand according to the method provided by the company, as shown in FIG.
  • si-122b and si-122-2,3U which inhibit the terminal target of miR-122b in the same way as miR-122b, have the ability to inhibit liver cancer
  • 75 nM siRNA corresponding to HepG2 a liver cancer cell, was applied.
  • RNAiMAX reagent Invitrogen
  • cells were removed from the culture dish by treatment with trypsin after 48 hours, and changes were observed. Cell division and proliferation were analyzed by performing flow cytometry (FIG. 11).
  • the experiment was conducted by using the Muse Ki67 Proliferation Kit (millipore) to treat the cells according to the test method provided by the manufacturer, and then analyzing the cell division with the Muse Cell Analyzer (Milipore).
  • This method is a method of quantitatively analyzing the number of cells with increased cell division and proliferation by measuring the number of cells stained with Ki67.
  • si-122b was expressed in HepG2 hepatoma cells, the number of cells with reduced Ki67 staining intensity increased compared to the control NT. Based on this fact, it was found that the expression of genes such as miR-122b can suppress the growth of liver cancer cells.
  • liver cancer cells how cell migration ability, which is important for cancer metastasis, changes was examined by performing a wound healing assay (FIG. 13).
  • a wound healing assay for the wound healing assay in hepG2, a liver cancer cell line, si-122b and si-122-2,3U were introduced into hepG2 cells in the same way as in the above example, and after culturing for 24 hours, using a 1000ul tip, the cell culture layer A scratch was made on the cell layer, and the cells were cultured for up to 48 hours, and the migration of the cells of each experimental group was compared with that of the control group NT-6pi.
  • the gene suppressing liver cancer is based on miR-122b, a microRNA expressed in normal hepatocytes, and the terminal sequence (5'). It was found that miR-122b suppressed the growth and migration of liver cancer cells and induced apoptosis. Therefore, a novel recombinant liver cancer treatment gene expression vector capable of specifically inhibiting liver cancer cells by modifying the miR-122 gene region to show only the terminal sequence of miR-122b and then combining the gene with a liver cancer tissue expression promoter. It was confirmed that it was possible to create

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Abstract

본 출원은 특정 암세포에서만 특이적으로 발현하는 유전자의 인핸서 서열; 상기 유전자의 코어 프로모터 서열; 및 상기 인핸서 서열과 프로모터 서열 사이에 위치하는 적어도 하나 이상의 발암성 전사인자의 결합부위 서열; 이 작동 가능하게 연결된 융합 프로모터와, 신규한 RNA 간섭 유도 핵산과, 이를 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용한 간암 진단용 조성물과 간암 예방/치료용 조성물에 관한 것이다. 본 출원의 융합 프로모터를 이용하면 특정 암을 특이적으로 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

융합 프로모터, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 간암 치료용 조성물
본 출원은 2021년 7월 29일에 한국 특허청에 제출된 한국 특허 출원 제 10-2021-0099778호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용 전부는 본 명세서에 포함된다.
본 출원은 종양 조직에 특이적으로 발현하는 융합 프로모터와 RNA 간섭 유도 핵산을 이용한 재조합 벡터와 이를 이용한 간암 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 서울특별시 서울산업진흥원 2020년도 창업지원시설 입주기업 기술사업화 지원사업(TC200013) "암조직 특이적 RNA 간섭 유전자 치료기술의 상용화 기반 구축"을 통해 개발된 기술이다.
유전자 치료(gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 유전자가 발현되도록 하여 질병을 치료하는 방식의 치료법이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 원인 유전자만을 대상으로 하여 특이적으로 그 발현을 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 치료 유전자로서 DNA는 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 발현시키는 벡터 형태로 구성된다.
유전자 발현 DNA 벡터는 주로 플라스미드(plasmid) 형태로 이용되며, 이후 바이러스 벡터로 이용되기 위해 필요한 여러 종류의 서열을 가진 형태로 변형되어 사용된다. 주로 포유류 세포에서 발현되는 외래 유전자의 전사를 유도하기 위해서 프로모터(promotor) 서열 뒤에 이를 삽입하여 작동 가능하게 결합한 후, 해당 유전자가 세포 내에서 발현되도록 하며, 이때 일반적으로 강력한 유전자 전사를 유도하기 위해서 바이러스 유래의 프로모터 서열이 많이 사용된다. 또한 해당 유전자의 발현양을 조절하거나 특정 세포나 조직에서만 발현시키기 위해서 다양한 유전자에서 유래한 프로모터를 사용할 수도 있다.
이와 같이 프로모터 서열 중 암세포 특이적으로 반응할 수 있는 것들을 활용하여, 암세포에서만 특정 유전자가 발현하도록 하는 시도가 있었으며, hTERT, KDR, Bmi-1, Survivin, HER-2, uPAR, A33, COX-2, FGF, Rad51 등의 유전자의 프로모터 서열이 활용되었다 (Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Jun 1; 11: 508-514). 이러한 예로 췌장암 세포에서 특이적으로 활성도가 높은 CCKAR(cholecytokinin type A receptor) 유전자의 프로모터를 변형하고 이를 활용하여 암세포에서 세포사멸 유도 유전자를 발현하는 방법을 통해 효과를 본 경우가 있으며, 또한 폐암 세포에서 높게 발현되는 유전자인 TTF-1(Thyroid Transcription Factor-1) 프로모터를 활용하여 암 억제 능력을 보이는 마이크로RNA인 miR-7을 암세포 특이적으로 과발현함으로써 항암효과를 나타내는 연구가 수행된 적이 있다.
종양 억제 유전자 치료에 사용되는 유전자는 기본적으로 암세포의 사멸을 유도하면서 세포 분열을 억제하는 기능을 가진 암억제 조절인자를 사용하며, 특히 암환자의 생존률에 큰 영향을 미치는 암전이능을 억제하는 기능을 함께 가지고 있는 유전자를 주로 사용한다. 종양 억제 유전자는 주로 단백질로 발현되어 DNA 손상과 다른 유전자 조절에 관련된 것을 사용할 수 있지만, 그렇지 않고 전사된 RNA 자체가 다른 유전자 발현을 조절하는 조절인자로서의 논코딩RNA(noncoding RNA) 유전자가 사용될 수도 있다.
종양 세포를 억제하기 위해서 사용하는 유전자 치료에서, 암억제 치료 유전자를 발현시킬 때 사용하는 프로모터가 일반적으로 모든 세포에 적용됨으로 인한 부작용이 나타나는 문제점을 해결할 필요가 있었다.
본 출원이 해결하고자 하는 과제는 종양 억제 유전자 치료에서 정상세포에서의 유전자 발현에 의한 부작용과 독성을 막고, 표적으로 하는 특정 장기 조직의 암세포에서만 해당 유전자를 발현시켜 암 특이적 치료 효과를 얻기 위한 종양 조직 특이적 발현 합성 프로모터를 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 암세포에서 그 발현량이 낮아지는 종양 억제성 마이크로RNA에서 표적 mRNA와 결합하는 주요 부위인 5‘말단으로부터 2번째에서 7번째 사이의 서열을 포함하는 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 프로모터와 RNA 간섭 유도 핵산을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 재조합 벡터를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물과 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 재조합 벡터를 이용하여 간암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 일 실시예는 암세포를 포함한 특정 조직의 세포에서만 특이적으로 발현하는 유전자의 인핸서 서열; 상기 유전자의 코어 프로모터 서열; 및 상기 인핸서 서열과 프로모터 서열 사이에 위치하는 적어도 하나 이상의 발암성 전사인자의 결합부위 서열; 이 작동 가능하게 연결된 융합 프로모터를 제공한다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 유전자는 간암세포에서 특이적으로 발현하는 알부민, α-1-안티트립신, 피루베이트 키나아제, 포스포엔올 피루베이트 카르복시키나아제, 트랜스페린, 트랜스티레틴, α-페토단백질, α-피브리노겐 및 β-피브리노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질을 암호하는 유전자일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 전사인자 결합부위는 발암성 전사인사로 알려진, Myc, Myb, STAT, Jun, ETS (Erythroblast transformation specific), ERG 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 더 상세하게는 ETS(Erythroblast transformation specific) 전사인자의 결합부위인 서열 (5'-TTCC-3') 또는 (5'-CTTCC-3')일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은, 5‘말단으로부터 2번째에서 7번째 사이의 염기 서열이 miR-122b의 염기 서열과 동일한 것일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 융합 프로모터는 리포터 단백질을 암호화하는 유전자; 를 더 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 리포터 단백질은 형광 단백질, 루시퍼라아제(Luciferase) 및 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 형광 단백질은 녹색 리포터 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 변형된 녹색 리포터 단백질 (Modified Green Fluorescent Protein; MGFP), 증강된 녹색 리포터 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein; EGFP), 적색 리포터 단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 증강된 적색 리포터 단백질(Enhanced Red Fluorescent Protein; ERFP), 청색 리포터 단백질(Blue Fluorescent Protein; BFP), 증강된 청색 리포터 단백질(Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), 황색 리포터 단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 및 증강된 황색 리포터 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein; EYFP)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질은 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(Herpes simplex virus thymidine kinase), 도파민수용체(Dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(Somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(Sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트랜스 페린 수용체(Transferrin receptor), 페리틴(Ferritin) 및 철 수송체(magA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 출원의 일 실시예는 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에서 적어도 5'말단으로부터 2번째에서 7번째 사이의 염기 서열이 miR-122b의 염기 서열과 동일한, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 출원의 일 실시예에서 상기 RNA 간섭 유도 핵산은, 5‘말단으로부터 2번째에서 7번째 사이의 염기 서열이 miR-122b의 염기 서열과 동일한 것일 수 있다.
본 출원의 일 실시예는 상기 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 융합 프로모터와 상기 RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 융합 프로모터와 상기 RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 재조합 벡터를 간암이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 간암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 간암 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 재조합 벡터의 용도를 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 간암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 상기 재조합 숙주세포를 처리하는 단계를 포함하는, 간암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 출원의 일 실시예는 상기 재조합 숙주세포로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 간암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 출원은 종양 유전자 치료제에 있어서 정상 세포에서의 유전자 발현 유도에 의한 부작용을 막고, 표적 종양 세포에서만 치료 유전자가 발현되는 프로모터 기술을 제공한다. 본 출원의 일 실시예에 따르면 간암에 활용할 수 있는 간암세포 특이적 발현 프로모터와 간암을 효과적으로 억제하는 miR-122b에 기반한 변형 RNA 간섭 유전자를 함께 활용하여 효과적이고 특이적인 간암 억제 유전자 치료 효과를 제공하는 장점이 있다.
도 1은 암 억제 유전자 치료제 벡터에 있어서 암 조직 특이적 발현 프로모터를 구성하기 위해 필요한 인핸서, 전사인자 결합부위, 코어 프로모터와 정상세포가 아닌 암세포에서의 발현만을 유도하는 특징을 도식화해서 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 4는 간암 조직 특이적 발현 프로모터의 조성을 나타낸 것으로 알부민 인핸서와 코어 프로모터 서열과 함께 그 사이에 삽입한 발암 전사인자인 ETS의 결합부위의 합성 서열과 해당 프로모터의 특이적 발현 기능을 확인하기 위한 루시퍼라제 리포터 벡터 제작에 관한 것을 도식화해서 나타낸 것이다.
도 5는 도 2에서 제작한 간암세포 특이적 발현 프로모터의 기능을 루시퍼라제 리포터를 통해 여러 간암세포에서의 발현 정도를 측정하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 도 2에서 제작한 간암세포 특이적 발현 프로모터의 기능을 루시퍼라제 리포터를 통해 다른 세포에서의 발현 정도를 측정하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 암을 억제하는 것으로 알려진 마이크로RNA miR-122가 발현되는 지역에서 추가적으로 발현되는 miR-122b의 서열을 비교한 것이다.
도 8은 miR-122b의 말단 서열과 동일한 마이크로RNA만 발현시키고자 miR-122의 서열을 변형시킨 후, 간암세포 특이적인 프로모터와 결합한 벡터를 제작한 것이다.
도 9는 해당 RNA 간섭 유전자 발현을 통한 표적 억제 효과를 루시퍼라제 리포터로 확인한 결과와 함께 나타낸 것이다.
도 10은 miR-122b의 말단 서열과 동일한 형태로 디자인한 RNA 간섭 유도 물질인 si-122b와 si-122-2,3U가 간암세포(HepG2)에서 말단 표적 mRNA에 대한 저해 효과를 나타내는 것을 루시퍼라제 리포터로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 miR-122b 및 말단 서열에 기반하여 디자인한 siRNA의 간암세포주인 HepG2에서의 세포분열 억제 효과에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 miR-122b 및 말단 서열에 기반하여 디자인한 siRNA의, 간암세포주인 HepG2에서의 소라페닙 약물에 의한 간암세포 사멸 증대에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 miR-122b 및 말단서열에 기반하여 디자인한 siRNA의 표적억제 효과를, 간암세포주인 HepG2에서의 간암세포 이동 억제에 대한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.
이하의 특정한 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 출원자는 조직 특이적 인핸서와 코어 프로모터 서열 사이에 발암 전사인자의 결합부위를 삽입하여, 해당 합성 프로모터 서열 구성이 특정 조직의 암세포에서만 유전자 발현을 활성화시키는 종양조직 특이적 발현 프로모터를 개발하였다. 이러한 기술을 우선적으로 간암에 적용하기 위해서, 간에서만 발현되는 유전자인 알부민 인핸서와 알부민 코어 프로모터를 기능을 나타내는 서열을 조합하고, 발암 전사인자로 잘 알려진 ETS의 결합부위를 인핸서와 코어 프로모터 사이에 삽입하여, 간암세포에서만 특이적으로 유전자를 발현시키는 합성 프로모터를 발명하게 되었다. 또한, 해당 기술을 간암 억제 유전자 치료제로 발전시키고자, 간암을 억제하는 것으로 알려진 마이크로RNA miR-122 유전자 지역에서 miR-122b가 발현되는 것을 발견하였고, miR-122b의 말단서열이 간암 억제 기능이 있다는 것을 확인하게 되었으며, 따라서 이를 간암조직 발현 프로모터와 결합시켰고, 이를 통해 간암세포를 특이적으로 저해할 수 있는 신규 재조합 간암 치료 유전자 발현 벡터를 최종적으로 개발함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원에서 용어 "유전자 치료"는 돌연변이 등으로 인하여 질병을 유발하게 된 유전자의 기능을 보상 또는 억제하기 위해 및/또는 유전 질환을 치료하기 위해 새로운 유전 물질을 환자의 세포 내로 전달함으로써, 유전병과 후천성 질병을 치료하는 접근법이다. 따라서, 본 출원은 유전자 치료 제품의 제조를 위한 생명공학, 의학에 사용될 수 있다. 즉, 표적 유전자를 함유하는 생산된 유전자 치료 DNA 벡터(vector)는 해당 유전자의 감소된 또는 불충분한 발현을 겪는 인간 및 동물의 세포로 전달되어, 원하는 치료 효과를 보장할 수 있다.
본 출원에서 용어 "플라스미드"는 박테리아에서 발견된 자가 복제되는 염색체외 환형 DNA(extrachromosomal circular DNA)이며, 유전자에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다. 이를 활용하여 손쉽게 재조합, 변형 및 증폭이 가능하여, 여러 유전자를 발현시키는 벡터로 사용된다. 인간과 같은 포유류의 표적 세포에 도입되더라도 플라스미드는 유전체에 통합되지 않고 에피솜(episome)으로 존재하는 반면, 그 생산은 매우 저렴하고, 플라스미드의 투여로 인한 면역 반응이나 부작용이 없으므로, 치료 유전자의 전달을 통한 유전자 치료에 널리 사용되고 있다.
본 출원에서 용어 "프로모터"는 DNA를 주형으로 전사를 시작하는 DNA 상의 특정한 염기 서열이며, 일반적으로 공통의 서열을 갖는다. 프로모터는 전사되는 유전자의 앞부분 최대 10kb까지의 서열까지 포함하는 경우도 존재하며, 인핸서와 코어 프로모터로 구성되며 해당 서열에 따라 모든 세포나 조직에서 외래 유전자를 발현을 촉진시킬 수 있는 일반 프로모터, 조직 혹은 기관 특이적 프로모터, 종양 특이적 프로모터, 발생 혹은 분화 특이적 프로모터 등의 특이적 혹은 선택적 프로모터도 이용할 수 있다. 인핸서는, 전사되는 유전자의 앞부분 최대 10kb까지의 서열에 존재하는 전사 조절 서열로서 특정 조직과 세포에서 해당 유전자의 전사를 개시시키며, 그 유무에 따라 전사에 의해 생성되는 메신저 RNA(mRNA)의 양을 결과적으로 증가시키는 것이지만 이에 한정되지 않고 전사를 조절하는 기능을 가진 서열을 이야기한다.
본 출원에서 용어 "코어 프로모터(core promoter)"란 RNA중합효소가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 데 최소로 필요로 하는 DNA 영역을 말한다. 프로모터는 프로모터 활성을 갖는 최소 서열로 이루어지는 코어 프로모터 부분만 있더라도 전사 유도가 가능하다. 또한, 진핵생물에서는, 통상 -20 염기쌍 부위에 TATA 박스를 갖는다.
본 출원에서 용어 "인핸서"는 프로모터의 작용을 조절하는 효과를 갖는 염기 서열이다. 인핸서는 특정 장기 조직의 특정 종류의 세포에서 특이적으로 발현시키기 위해서 조절을 받는 부위이다. 인핸서는 서열의 방향에 관계없이 전사를 조절할 수 있다. 본 출원에서 이용되는 인핸서는 1종류라도 좋지만, 2개 이상의 동일한 인핸서를 복수 이용하거나, 또는 다른 복수의 인핸서를 조합시켜 이용하더라도 좋다. 또한, 다른 복수의 인핸서를 이용하는 경우, 그 순번은 한정되지 않는다.
인핸서는 주로 전사 시작 위치에서 멀리 존재한다. 따라서 인핸서 서열을 프로모터가 다르게 가짐으로 인하여 세포 유형 특이적, 단계 특이적 또는 조직 특이적으로 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 즉, 외래 유전자의 세포 유형 특이적 발현이 필요한 경우, 외래 유전자는 포유류 활성 세포 유형 특이적 프로모터 상의 서열, 예컨대 간 세포, 뇌 세포(예, 뉴런 세포), 신경교 세포, 쉬반 세포, 폐 세포, 신장 세포, 비장 세포, 근육 세포 또는 피부 세포에 특이적인 서로 다른 인핸서를 포함시켜 작동 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 간 세포 특이적 프로모터는 알부민, α-1-안티트립신, 피루베이트 키나아제, 포스포엔올 피루베이트 카르복시키나아제, 트랜스페린, 트랜스티레틴, α-페토단백질, α-피브리노겐 또는 β-피브리노겐을 암호하는 유전자의 프로모터 인핸서를 이용하는 경우이다.
이러한 프로모터와 인핸서 지역이 특이적인 세포에서만 유전자 발현을 유도할 수 있는 것은 다양한 세포에서 다르게 발현되는 전사인자(transcription factor)에 반응할 수 있는 결합부위를 다르게 가지고 있기 때문이다. 이러한 전사인자 결합부위의 일부는 원래의 프로모터 서열에서 돌연변이가 발생됨에 따라 달라질 수도 있다. 즉, 특정 질병유전자의 경우 프로모터 서열에 변이가 발생함에 따라 유전자 발현이 달라지는 경우가 자주 관찰되고 있으며, 이러한 경우에는 해당 변이가 전사인자의 결합 위치에 발생하여 야기되며, 해당 돌연변이들은 주로 종양과 같은 질병에서 자주 발생된다. 특히, 종양이 진행되면서 정상 세포에서 암 유발 유전자의 프로모터 지역에 자주 돌연변이가 특정 위치에서 반복적으로 일어나고, 이러한 노출은 특정 전사인자의 결합을 유도하여 프로모터의 유전자 발현 정도를 강화시켜 암을 유발하는 경우가 있다. 이러한 예로 간암에서 TERT(Telomerase reverse transcriptase) 유전자의 프로모터에 발생되는 변이에 의해서 ETS (Erythroblast transformation specific) 전사인자의 결합부위가 생성되고, 이로 인하여 암세포에서 TERT의 발현이 증가하여 유전체의 텔로미어(telomere)가 짧아지지 않고 암이 계속적으로 분열할 수 있도록 해주는 현상이 나타난다(Oncogene. 2019 Aug;38(34):6172-6183). ETS 전사인자는 보통은 암조직에서 염색체의 증폭(chromosome amplification)과 전위(translocation)에 의해서 이상 과발현이 자주 유도되며, 적혈모구 및 골수모구성 백혈병을 유발하는 종양유전자로서, 현재까지 인간에서는 27 종류의 ETS family 유전자가 보고된 발암 인자이다. 따라서, 이렇게 종양에서 프로모터 위치에서 직접적으로 일어나는 돌연변이 서열을 활용하면, 종양 세포에서는 과발현을 유도하고 정상 세포에서는 거의 발현을 일으키지 않는 특징의 프로모터를 구성할 수 있다.
프로모터와 유전자 서열로 구성된 유전자 발현 DNA 벡터는 유전자 치료를 위한 표적 세포로 유전자 전달체(gene carrier)를 통해 도입된다. 유전자 전달체는 세포에 대한 독성이 없고, DNA 벡터를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 가장 효율적인 바이러스성 벡터에는 레트로바이러스(retroviruses), 렌티바이러스(lentiviruses), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated viruses, AAV), 헤르페스바이러스(herpesviruses), 폭스바이러스(poxviruses) 또는 아데노바이러스(adenoviruses)가 포함된다. 유전자 물질의 비바이러스성 전달은 치료 유전자를 가지며, 지질, 양이온성 중합체, 덴드리머(dendrimers), 폴리펩티드(polypeptides) 또는 나노입자와 같은 다양한 운반체와 결합된 플라스미드(plasmids) 자체를 주로 포함한다.
마이크로RNA는 20개 정도의 작은 논코딩RNA으로 다른 타겟 유전자의 mRNA의 발현을 저해하여 여러 가지 생물학적 기능을 조절한다. 특히 몇몇의 마이크로RNA는 정상 세포에는 많이 발현하다가, 암세포에서는 그 발현양이 현저하게 줄어드는 현상을 보이는데, 그 중 일부는 암을 억제하는 기능이 알려져 있다. 이렇게 암을 억제하는 마이크로RNA를 종양 억제 마이크로RNA(Tumor suppressor miRNA)라 부르며, 암 억제 기능을 활용한 치료가 활발히 연구되고 있다. 마이크로RNA의 생리학적 기능은 마이크로RNA가 말단 위치(seed region; 5'말단의 2번째부터 7번째까지)의 염기 배열(base pairing)을 통하여 주로 타겟 유전자를 인식하여 그 발현을 저해하여 나타나며, 따라서 RNA 간섭을 유도하는 RNA 서열이 종양 억제 마이크로RNA와 동일한 말단 서열을 가지게 되면 같은 종양 억제 기능을 나타낼 수 있다. 이러한 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 헤어핀 구조로 만드는 shRNA(short hairpin RNA) 형태의 유전자에서 전사 발현된 후, 체내에서 프로세싱되어 최종적으로는 20개 정도의 RNA 이중체로 만들어지거나, 아니면 20개 정도의 RNA 이중체로 구성된 siRNA(small intertering RNA)를 합성해 세포에 도입하여 기능적으로 발현시킬 수 있다.
본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 용어 "RNA 간섭(RNA interference)"은 전 사후 단계에서 유전자의 발현을 억제하는 현상으로 이를 일으키는 RNA 소재를 세포 안으로 도입함으로써 인위적으로 유전자 억제를 유도하여 원하는 타겟 유전자를 저해하는 기술로 널리 사용하고 있다. 이러한 RNA 간섭 현상은 실제로 세포 안에서는 마이크로RNA(miRNA)라 불리우는 ~21개의 염기로 구성된 작은 RNA에 의해서 일어나며, 마이크로RNA는 특히 5' 말단에 위치하는 말단 지역 (seed region, positions 1-8)의 염기 배열을 통해 수백개의 타겟 유전자를 mRNA에서 인식하고 그 발현을 억제하여 생물학적인 기능을 나타낸다.
구체적으로, 자연적으로 존재하는 RNA 간섭 유도 핵산인 마이크로RNA는 아고너트 단백질과 복합체를 이룬 후 상보적인 염기배열을 통해 표적과 결합하는데, 이 때 동물에서 발견되는 마이크로RNA의 경우, 마이크로RNA의 말단 지역(seed region)이라고 불리우는 5’말단 기준 1번째부터 8번째 사이, 가장 중요하게는 5'말단 기준 2번째에서 7번째 사이에서 최소한 6개 이상의 연속적인 염기배열을 표적 mRNA와 결합을 이루게 되면, 그 표적 mRNA의 발현을 억제한다. 상기와 같은 형태의 염기배열이 가장 많이 일어나기에 이러한 표적들은 마이크로RNA의 정규표적(canonical target)이라 정의하며, 이러한 형태의 상보적 염기 배열은 마이크로RNA의 정규적인 생물학적 기능에 있어 매우 중요하다. 하지만 최근에는 마이크로RNA 표적을 실험적으로 시퀀싱할 수 있는 Ago HITS-CLIP과 같은 기술로 인하여, 말단 지역과 같은 정규 표적 인식이 아닌 이러한 규칙에 벗어나는 비정규표적(noncanonical target)도 많이 있음을 알게 되었다.
마이크로RNA는 표적 mRNA를 인식하여 그 유전자의 발현을 저해함으 로써 생물학적 기능을 나타내므로, 마이크로RNA 말단 지역과 상보적으로 배열할 수 있는 염기서열은 마이크로RNA에 표적 mRNA와 경쟁하면서 붙게 되어 마이크로RNA에 의해 유도되는 생물학적 기능을 저해하는 기작으로 응용될 수 있다. 특히 마이크로RNA 중 질병을 유발시키는 기능을 나타내는 경우에는 이를 특이적으로 억제함으로써 치료제로 활용될 수 있다. 이러한 마이크로RNA의 저해제는 일반적으로 마이크로RNA의 전체 서열에 거의 완벽하게 상보적인 서열을 포함하여 마이크로RNA에 특이적으로 염기배열하여 그 기능을 억제하는 형태로 많이 사용하고 있다. 하지만 실제로 마이크로RNA의 생물학적인 기능은 주로 말단 지역의 서열만으로 표적 mRNA들의 발현을 억제하면서 나타나기 때문에 RNA 간섭을 유도하는 핵산의 말단 서열이 해당 마이크로RNA와 같기만 하면 충분히 동일한 생물학적 기능을 나타낼 수 있다.
상기에서 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 18 내지 23개로 구성되는 뉴클레오티드의 가이드 가닥(guide strand) 및 상기 가이드 가닥에 상보적인 운반자 가닥(passenger strand)으로 이루어진 이중가닥인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 이중가닥은 줄기-루프(stem-loop)의 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 핵산이 다이서(Dicer) 단백질에 의해 줄기 부분이 가공되어 이중가닥 형태로 변형되는 것, 즉, shRNA가 가공되어 siRNA 형태를 이루는 것일 수 있으나, 이는 핵산 형태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 핵산은 일반적으로 3'말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 갖는다.
RNA 간섭을 유도하는 핵산은 센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 가이드 가닥 및 이에 상보적인 안티 센스 올리고뉴클레오티드인 운반자 가닥이 상보적으로 혼상화된 siRNA(small interfering RNA), 가이드 가닥 서열과 운반자 가닥 서열이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥인 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 siRNA는 siRNA 제조회사나 RNA 합성 회사에 의뢰하여 손쉽게 제작할 수 있고, 21nt 내외의 짧은 올리고머이기 때문에 일반적인 세포주에 형질도입이 수월하다. 또한 유전자로서는 최소 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥인 shRNA 또는 마이크로 RNA에서는 동일한 형태의 pre-miRNA로 전사되어 만들어지게 하면, 기존의 프로모터 서열과 결합시켜 손쉽게 세포 내에 발현시킬 수 있다. 따라서 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 표적 유전자의 발현을 손쉽게 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
본 출원에서 용어 "가이드 가닥(guide strand; antisense strand)"이란 상기 이중가닥 중 표적을 저해할 용도로 서열이 정해진 단일가닥 부분으로, 실질적으로 아고너트 단백질에 주로 결합하여, 아고너트 복합체가 표적 유전자를 인식하도록 가이드를 해주는 역할을 하며, 관심 있는 타겟 유전자 mRNA에 실질적으로 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로, 이에 따라 안티센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 상보적일 수 있다.
본 출원에서 용어 "운반자 가닥(passenger strand; sense strand)"이란 상기 의 이중가닥 중 가이드 가닥과 이중가닥 구조를 이루어서, 가이드 가닥이 아고너트 단백질과 결합할 수 있도록 도와주는 운반자 역할을 하며, 표적 핵산과 실질적으로 또는 100% 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 이에 따라 센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본 출원은 마이크로RNA 중, 암세포에서 그 발현양이 낮아지는 종양 억제성 마이크로RNA의 5‘말단으로부터 2번째에서 7번째 사이와 결합 하는 부분을 포함하는 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 제공한다.
본 출원의 일실시예에 있어서, 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산의 5‘말단 서열은 miR-122b 부분일 수 있으며, 이에 따라 마이크로RNA로 작용하여 암의 성장을 억제하고, 세포 사멸을 유도하며, 암의 침윤을 억제하는 능력을 가지는 것일 수 있다.
본 출원의 발명자는 간암세포에서 특이적으로 발현이 저해되는 miR-122 유전자 지역에서 간암 억제 마이크로RNA인 miR-122b를 발명하였고, 해당 말단 서열이 RNA 간섭 형태로 발현되었을 때 효과적으로 간암세포를 억제한다는 사실을 확인하였다.
본 출원의 하나의 예는 간암 조직 특이적 발현 프로모터를 개발하고, 이를 통해 효과적으로 간암세포를 억제할 수 있는 유전자를 선별하여 발현시키는 것이다. 따라서, 최종적으로 간암을 특이적으로 치료할 수 있는 신규 재조합 유전자 치료 발현 벡터를 제공한다.
본 출원에 따른 융합 프로모터는 특정 암세포에서만 특이적으로 발현하는 유전자의 인핸서 서열; 상기 유전자의 코어 프로모터 서열; 및 상기 인핸서 서열과 프로모터 서열 사이에 위치하는 적어도 하나 이상의 발암성 전사인사의 결합부위 서열; 이 작동 가능하게 연결된 프로모터일 수 있다.
상기 유전자는 간암세포에서 특이적으로 발현하는 알부민, α-1-안티트립신, 피루베이트 키나아제, 포스포엔올 피루베이트 카르복시키나아제, 트랜스페린, 트랜스티레틴, α-페토단백질, α-피브리노겐 및 β-피브리노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질을 암호하는 유전자일 수 있다.
상기 유전자가 알부민 유전자인 경우 인핸서 서열은 mm39의 chr5:90,597,504-90,598,315(서열번호 1) 또는 hg38의 chr 4:73,398,294- 73,399,116(서열번호 2)일 수 있고, 코어 프로모터 서열은 mm39의 chr5:90,608,588-90,608,782(서열번호 3) 또는 hg38의 chr4:73,404,115-73,404,316(서열번호 4)일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 전사인자 결합부위는 ETS(Erythroblast transformation specific) 전사인자의 결합부위인 서열(5'-TTCC-3') 또는 (5'-CTTCC-3')일 수 있다.
상기 ETS 전사인자의 결합부위를 포함하는 서열은 서열번호 5(ETS 전사인자의 결합부위(CC)), 서열번호 6(ETS 전사인자의 결합부위(TC)), 서열번호 7(ETS 전사인자의 결합부위(CT)), 서열번호 8(ETS 전사인자의 결합부위(TT))로 표시된다.
본 출원의 일 실시예에서, RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은, 5‘말단으로부터 2번 째에서 7번째 사이의 염기 서열이 miR-122b(서열번호 9)의 염기 서열과 동일한 것일 수 있다
상기 프로모터를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 결실 변이체 및 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드의 치환 변이체는 뉴클레오티드 서열에서 적어도 하나의 염기가 제거되고 다른 염기가 그 자리에 삽입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 삽입 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열 내 미리 결정된 부위에 도입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 결실 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 염기로부터 제거된 것에 특징이 있다. 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합은 구성요소의 기능이 온전히 동일하게 남아있도록 유도하도록 한다. 본 출원에 따른 융합 프로모터의 DNA 단편은 상기 서열로 이루어진 DNA 단편에 적어도 60% 상동성을 가지는 DNA 단편이다. 본 출원의 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드나 두 개의 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해(digestion)시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상동"의 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질(예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질(예, 미오신경쇄, 등)을 포함하여, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 출원에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용사에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 DNA 서열이 DNA 서열의 소정의 길이에 대해 뉴클레오티드 매치가 적어도 21%(바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 서열 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면, 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건 하에서 써던혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.
다른 하나의 양태로, 본 출원은 상기 제조된 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 에 관한 것이다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이 를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니 구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이 유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다.
본 출원의 벡터는 상기 융합 프로모터를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.
본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자" 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신(streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 암피실린 저항 유전자일 수 있다.
본 출원의 상기 "리포터 단백질"이란, 시각적으로 암이 진단될 수 있도록 하는 기능을 수행하는 단백질로서, 예를 들면, 형광 단백질, 루시퍼라아제(Luciferase) 및 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 상기 "형광 단백질은"은, 암이 시각적으로 진단될 수 있도록 자체적으로 형광을 띄는 단백질로서, 예를 들면 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(Modified Green Fluorescent Protein; MGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein; EGFP), 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질(Enhanced Red Fluorescent Protein; ERFP), 청색 형광 단백질(Blue Fluorescent Protein; BFP), 증강된 청색 형광 단백질 Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 및 증강된 황색 형광 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein; EYFP)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 상기 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질은 예를 들면, 단순포진바이러스의 티미딘인산 효소(Herpes simplex virus thymidine kinase), 도파민 수용체(Dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(Somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(Sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체 (Transferrin receptor), 페리틴(Ferritin) 및 철 수송체(magA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 상기 유전자에 변형을 가하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 유전자의 결실 또는 파괴하는 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들면, 상기 결실 및 파괴 방법은 상동성 재조합, 화학적 변이유발, 조사 변이유발 또는 트랜스포존 변이유발 등과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 출원의 또 다른 구현예에서는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 출원의 상기 약학 조성물은 본 출원의 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함한다.
본 출원의 상기 균주는 본 출원에 따른 상기 융합 프로모터가 형질전환되어, 개체 내에서 암을 표적한 뒤에, 조절 단백질을 억제하는 물질이 투여되는 경우 이와 같은 균주 내에 실시간으로 이미징이 가능한 리포터 단백질과 항암 단백질이 동시에 균형적으로 발현되기 때문에, 암을 매우 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 이와 동시에 실시간으로 암을 진단할 수 있다.
본 출원의 상기 "예방"이란, 본 출원의 상기 유효성분을 이용하여 암으로 인해 발생된 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 행위라면 제한 없이 모두 포함될 수 있다.
본 출원의 상기 "치료"란, 본 출원의 상기 유효성분을 이용하여 암으로 인해 발생된 증상이 호전되거나, 개체가 이롭게 되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, "치료"는 치료의 부재에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, "치료" 는 질병 진행의 억제, 일시적으로 질병 진행의 늦춤을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 질병의 진행을 영원히 정지시키는 것과 관련이 있다. 당업자에 의해 이해된 바와 같이, 특정 질병 상태를 향상시키는 동안 치료가 치료된 환자에서 반대의 결과, 즉 치료에 의해 영향을 받는 모든 이점보다 큰 결과를 초래한다면 결과는 유익하지 않거나 바람직하지 않을 수도 있다.
본 출원의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 출원의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 출원의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 출원의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담 체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 출원의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭 내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개 골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 출원의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 출원의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 출원의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 출원에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 출원의 또 다른 구현예에서는 상기 재조합 벡터를 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 출원의 상기 "진단"이란, 본 출원의 상기 벡터가 암을 표적하여 위치될 때, 상기 벡터에 도입된 융합 프로모터로부터 발현된 리포터 단백질에 의해 실시간으로 암의 존재 여부를 모니터링할 수 있는 것을 포함하는 생체 내 암 조직을 확인하는 모든 행위를 의미한다.
본 출원의 상기 진단용 조성물에서, 상기 융합 프로모터, 항암 단백질, 리포터 단백질, 재조합 벡터, 살모넬라 속 균주, 형질전환, 암 등에 대한 내용은, 상기 융합 프로모터, 재조합 벡터, 균주 및 약학 조성물에 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 출원의 또 다른 구현 예에서는 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 출원의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 본 출원에 따른 상기 재조합 벡터가 도입된 균주를 처리하는 단계를 포함한다.
본 출원의 상기 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 벡터로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 "생물학적 시료"란, 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 조직, 세포(cell), 또는 세포 추출물(cell extract)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 상기 진단을 위한 정보 제공 방법에서 상기 융합 프로모터, 인핸서, RNA 간섭 핵산, 리포터 단백질, 재조합 벡터, 균주, 형질전환, 암, 진단 등에 대한 내용은, 상기에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
이하, 본 출원을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐, 본 출원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 종양조직 특이적 발현 프로모터 및 해당 합성 프로모터를 통한 암세포 특이적 발현 유전자 치료제 개발
본 출원자들은 도 1A에 나타낸 도식화된 예와 같이, 프로모터 지역이 조직 특이적 발현을 나타내는 인핸서와 최소한의 유전자 전사에 필요한 서열인 코어 프로모터로 구분될 수 있다는 사실과, 암세포에서는 일반 세포와는 다르게 발암 전사인자들이 활성화되어 있고, 이에 따라 해당 전사인자의 결합부위를 프로모터에 가지고 있으면, 암세포에서만 유전자 발현이 활성화된다는 사실에 착안하여 다음과 같이 종양 조직 특이적 발현 프로모터를 구성하였다. 좀더 자세하게는, 조직 특이적 발현을 유도하는 인핸서 부분을 기존에 특정 조직에서 발현되는 유전자의 유전체 서열 중 프로모터 지역에서 가져오고, 이후 해당 유전자에서 가장 최소한의 유전자 전사를 일으킬 수 있는 코어 프로모터를 해당 유전자의 전사 시작 위치 주변에서 가져와 서로 결합하여 합성 프로모터를 제작한다. 이렇게 제작된 합성 프로모터는 조직 특이적인 발현을 나타내는데, 이에 따라서 간세포에서만 발현되는 유전자, 신경 세포에서만 발현되는 유전자, 피부세포에서만 발현되는 유전자의 해당 서열을 조합하면 조직 특이적인 발현 프로모터를 구성할 수 있다. 이에 추가하여 정상 세포 와 암세포를 구별하기 위해서 발암 전사인자의 결합부위를 인핸서와 코어 프로모터 사이에 삽입한다. 이때 발암 전사인자는 정상 세포에서는 발현이 안되거나 활성화가 되어 있지 않지만, 암세포 형질이 전환되었을 때는 발현이 증가하거나 활성화되는 특징을 나타내며, 예로는 Myc, ETS, Myb, STAT, Jun, ERG 등이 있다.
이러한 종양 조직 특이적 발현 프로모터는 유전자 치료에 사용될 경우 암억제 유전자와 같이 결합하여 사용될 수 있으며, 이렇게 제작된 암치료 유전자 벡터는 정상 세포에 도입되더라도 프로모터가 활성화되지 않으므로 유전자 발현이 일어나지 않는다 (도 1B). 따라서 치료 유전자가 세포 사멸을 유도시키는 경우, 정상 세포에서 발현된다면 정상 세포도 사멸시키는 부작용과 독성을 나타낼 수 있지만, 해당 치료 유전자가 종양 조직 특이적 발현 프로모터에 의해서 조절된다면, 암세포에서만 발현되어 암세포만 사멸되는 특이적인 치료 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 출원에서 제시한 프로모터 구성과 같이 조직 특이적 인핸서 뒤에 발암성 전사인자의 결합부위를 최소 1개 이상 구성하고, 그 다음 서열로 코어 프로모터를 놓게 되면 다양한 조직과 세포에서 암세포 특이적인 합성 프로모터를 제작할 수 있게 된다. 또한 여기에 들어가게 되는 발암성 전사인자의 결합부위는 여러 종류의 다른 전사인자의 결합부위가 조합을 이루게 해서 삽입할 수도 있으나, 최소한 1개 이상의 싸이트가 존재함으로써 일반 세포와 종양 세포를 구분하여 조직 특이적으로 암세포에서만 과활성화되어 유전자 발현을 유도할 수 있는 특징을 지닐 수 있다.
[실시예 2] 간암 조직 특이적 합성 프로모터 구성 및 이를 확인하기 위한 루시퍼라제 리포터 벡터 제작
상기 실시예 1에서 발명한 바와 같이, 조직 특이적 인핸서, 발암 전사인자 결합부위, 코어 프로모터 서열을 조합한 프로모터가 암 조직 특이적인 발현을 유도할 수 있으므로, 이를 기반으로 간암 특이적 프로모터를 제작하고자 하였다(도 2A, 왼쪽). 우선은 간암세포에서만 발현되는 유전자인 알부민의 조직 특이적 인핸서 부분(812bp)의 서열을 생쥐 유전체(chr5:90,597,504 -90,598,315; mm39) DNA로부터 PCR을 통해 증폭해서 얻어내었고, 이와 함께 알부민 프로모터의 코어 프로모터 195bp도 동시에 생쥐 유전체(chr5:90,608,588-90,608,782; mm39) 서열 부분에서 PCR을 통해 얻어내었다. 이렇게 얻어진 알부민 인핸서와 코어 프로모터를 pBlueScript 플라스미드에 넣은 후, 이 두 사이의 서열에 발암 전사인자인 ETS의 결합서열(TTCC)을 넣고자 해당 싸이트가 종양에서 돌연변이에 의해서 발생되는 서열을 찾고자 하였다. 간암 환자를 대상으로 대규모 시퀀싱을 진행한 TCGA 데이터 분석(Cell. 2017 Jun 15; 169(7): 1327-1341)에서 다양한 원인으로 생성된 간암임에도 불구하고 44%의 환자가 TERT 프로모터 지역에 2개의 돌연변이(C228T, C250T)가 발생하는 것으로 보고되었다. 이에 따라 해당 서열은 돌연변이에 의해서 TTCC의 ETS 결합부위가 생성되는 것으로 확인이 되었다(도 2B). 따라서, 간암에서 자주 발생하는 TERT의 프로모터 서열의 두 군데의 돌연변이 지역(C228T, C250T)의 서열(도 2B)과 동일한 부분에서, 모든 돌연변이의 조합으로 돌연변이가 일어나지 않아 ETS 결합부위가 없는 서열번호 5의 경우(CC), 한쪽만 돌연변이가 발생하여 ETS 결합부위가 1개 발생한 서열번호 6 및 서열번호 7의 경우(TC or CT), 또는 양쪽 다 돌연변이가 발생해 2개의 ETS 결합부위가 발생한 서열번호 8의 경우(TT)로 모두 DNA를 합성한 후 Gibson Assembly(NEB)를 통해 해당 서열을 알부민 인핸서와 코어 프로모터 사이에 삽입하여 간암 조직 특이적 합성 프로모터를 완성하였다.
이렇게 제작한 간암 조직 특이적 합성 프로모터가 실제로 간암세포에만 특이적으로 유전자 발현을 유도할 수 있는지를 확인하기 위해서, 해당 프로모터 서열을 루시퍼라제 리포터인 pGL4. 10[luc2] 벡터(Promega)의 프로모터 지역에 Nhe1, BglII 제한효소 싸이트를 이용해 삽입하였다(도 3). 이를 통해 프로모터가 전혀 없는 반딧불(firefly) 유래 루시퍼라제 유전자가 제작한 간암 조직 특이적 합성 프로모터 다음에 배열되어 조절을 받게 됨으로써, 해당 루시퍼라제의 활성도로 도입된 세포에서의 발현량을 측정할 수 있게 되었다.
[실시예 3] 간암 조직 특이적 합성 프로모터가 들어간 루시퍼라제 리포터를 통한 간암세포 특이적 발현 확인
본 출원에서 제작한 간암 조직 특이적 합성 프로모터가 들어간 루시퍼라제 리포터를 이용하여, ETS 결합부위가 없는 경우(pAlb-CC), ETS 결합부위가 1개 발생한 경우(pAlb-TC or pAlb-CT), ETS 결합부위가 2개 발생한 경우(pAlb-TT)에 대해서 여러 세포주에 도입하여 그 활성도를 측정하였다 (도 5). 이때 사용한 세포 주는 간암세포주(HepG2, Huh7), 일차 배양 생쥐 간세포(Mouse hepatocyte), 자궁경부암 세포(HeLa), 근육 세포주(C2c12)였다. 이 실험은 해당 루시퍼라제 벡터와 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase) 유전자가 들어 있는 pRL-TK 벡터와 동일 양으로 함께 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 각각의 세포에 전달(co-transfection)시켜서 그 효과를 조사하였다. 또한, 모든 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 (Invitrogen)에서 배양하였으 며, 항생제 없는 완전배지에서 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 48시간 후, Promega 社의 Dual-luciferase reporter asssay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하여 siRNA의 효과를 조사하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 promega 社의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 4번 이상의 반복 실험으로 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 대해서 표준화 값으로 이용하여 계산하였다.
그 결과(도 5), ETS의 결합부위를 2개 가지고 있는 경우(pAlb-TT)를 제외하고는 모든 루시퍼라제 벡터에서 간유래 세포인 Huh7, HepG2, 일차 배양 생쥐 간세포에서는 루시퍼라제가 발현되지만 다른 조직 유래의 세포(HeLa, C2c12)에서는 거의 발현이 되지 않는 것을 확인하였다. 또한 간암세포인 Huh7, HepG2와 정상 간세포인 일차 배양 생쥐 간세포에서의 발현을 비교하였을 때는, ETS의 결합부위가 없는 경우(pAlb-CC)를 제외하고는 모두 최소 2배 이상 간암세포에서 더 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 추가적으로 각각의 루시퍼라제 리포터의 유전자 발현 정도를 간암세포(HepG2, Huh7), 정상 간세포(일차 배양 생쥐 간세포), 암세포이지 만 자궁경부 조직 유래인 HeLa, 그리고 암세포 유래는 아니지만 암세포와 같이 무한으로 분열하는 능력을 가진 근육 세포주인 C2C12에서 비교해보았다 (도 6). 그 결과, 간암세포(HepG2, Huh7)에서만 ETS가 1개 이상 존재하는 경우에는 전혀 없는 경우(CC)보다 최소 2배 이상으로 발현이 활성화되는 것을 관찰할 수 있었다.
상기와 같이, 알부민 인핸서와 코어 프로모터로 이루어진 서열 사이에 ETS 결합부위를 삽입했을 경우에는 간조직 유래의 암세포에서만 활발하게 유전자 발현을 유도할 수 있다는 것을 루시퍼라제 리포터 실험을 통해 관찰하였다. 이를 통해 종양조직 특이적 발현 프로모터는 조직 특이적 인핸서와 코어 프로모터 서열 사이에 발암 전사인자의 결합부위를 삽입하면, 해당 합성 프로모터 서열 구성이 조직 특이적인 유전자 발현뿐만 아니라 종양화가 된 세포에서만 유전자 발현을 활성화시키는 특징이 나타난다는 것을 알 수 있었다. 따라서 이렇게 제작한 간암 조직 특이적 발현 프로모터는 간암 억제 유전자와 결합하여 간암 억제 유전자 치료제로 특이적으로 활용될 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] miR-122 유전자 지역에서 발현되는 miR-122b의 말단 서열로 변형시킨 유전자와 간암 조직 특이적 프로모터를 결합한 벡터 제작 및 활성 확인.
간암 조직 특이적 프로모터를 제작한 후 이를 활용하여 간암 억제용 유전자 치료제로 활용하기 위해서는 간암을 효과적으로 억제할 수 있는 유전자와 함께 결합하는 것이 필요하다. 이에 간암 환자를 대상으로 대규모 시퀀싱을 진행한 TCGA 데이터 분석(Cell. 2017 Jun 15; 169(7): 1327-1341)에서 간암 환자의 경우 miR-122가 발현되는 유전자 지역이 모두 과메틸화(hypermethylation)가 진행되어 발현이 억제되어 있음을 주목하였다. 이미, miR-122는 해당 유전자를 생쥐에서 없앴을 때 간암을 발생시키는 것으로 잘 알려진 간암 억제 유전자(J Clin Invest. 2012 Aug;122(8):2884-97, J Clin Invest. 2012 Aug;122(8):2871-83)이다. 정상 간세포에서는 간 조직 특이적으로 발현되었던 miR-122 유전자가 간암이 진행되면서 그 발현이 억제되는 것으로 이해할 수 있으며, 이에 본 출원자들은 miR-122 유전자를 발현시키면 암을 억제하는 유전자 치료제로 응용할 수 있을 것으로 생각했다. 하지만 miR-122가 발현되는 유전자 위치(chr18:65,381,821-65,382,125; mm39)를 miRBase 데이터베이스를 통해 살펴보면 기존에 알려진 miR-122 이외에도 이와 유사한 miR-122b가 발현된다는 사실을 발견할 수 있었다(도 7). miR-122b의 서열은 miR-122와 거의 유사하지만 마이크로RNA에서 표적 mRNA을 인식하고 기능을 나타내는 말단 서열이 다르다. 즉, miR-122b는 5‘말단 기준 2번째에서부터 7번째 사이의 서열이 UUAGUG인데 miR-122는 GGAGUG이다. 따라서 기존에는 miR-122의 발현이 암을 억제한다고 생각했지만, 사실은 miR-122 유전자 위치에 있는 miR-122b가 이러한 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 출원자들은 우선은 생쥐 유전체 서열 중 miR-122가 존재하는 유전자 서열(chr18:65,381,821-65,382,125; mm39)을 PCR을 통해 얻어낸 후에, miR-122이 말단 지역의 서열을 miR-122b와 동일하게 바꾸어 해당 지역에서 만들어지는 모든 마이크로RNA는 miR-122b와 같은 말단 서열로 동일한 기능을 하도록 바꾼 후에(도 8, miR-122*), 이전에 개발한 간암 조직 특이적 발현 프로모터 중 간암세포에서 정상 간세포에 비해 월등하게 발현을 증대시켰던 pAlb-CT, pAlb-TT와 결합하여 레트로바이러스 간암 치료 벡터를 완성하였다.
우선적으로 제작된 벡터에서 miR-122b 및 mir-122b 말단 서열로 치환한 마이크로RNA가 발현되어 해당 말단 서열에 따라 표적 mRNA를 인식하여 기능을 나타낼 수 있는지를 확인하기 위해서 루시퍼라제 리포터 실험을 간암세포주인 HepG2에서 실행하였다(도 9A). 우선적으로 레닐라 루시퍼라제를 발현시키는 psi-check2 벡터와 함께 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 HeLa 세포에 전달(co-transfection)시켜서 그 효과를 조사하였다. psi-check2 벡터는 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'UTR(3'untranslated region) 부분에 miR-122b의 말단 부분(5'말단 2번부터 7번까지)과 완전 상보적인 서열인 말단 사이트(seed sites; Seed)를 5번 반복되도록 DNA를 합성해서 삽입하여 만들어 사용하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 24시간 후, Promega 社의 Dual-luciferase reporter asssay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하여 siRNA의 효과를 조사하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 promega 社의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 3번 이상의 반복 실험으로 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다. 그 결과, pAlb-CT, pAlb-TT 프로모터와 결합한 miR-122 변형 유전자(mir-122*)를 가지고 있는 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 루시퍼라제 리포터 벡터와 함께 HepG2에 전달하였을 때, miR-122b 말단 표적을 강력히 저해하는 것을 관찰할 수 있었다.
상기와 같이, 간암 억제 유전자로 알려진 miR-122를 발현하는 유전체 서열에서 miR-122이외에 유사 마이크로RNA인 miR-122b에 주목하여, miR-122b의 말단 서열을 기반으로 miR-122 유전체 지역의 서열이 모두 miR-122b의 말단 서열을 가지도록 변형시킨 후, 해당 유전자를 위에서 개발한 간암 조직 특이적 발현 프로모터와 결합시킨 간암 억제 유전자 치료제 벡터를 제작하였을 때, 해당 벡터가 간암세포에서 발현되어 miR-122b의 표적을 말단 서열을 통해 잘 억제하는 효과를 나타낼 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] miR-122b의 말단 서열에 의한 간암세포 억제 효과 확인
miR-122 유전자 지역에서 발현되는 miR-122b가 실제로 간암을 억제할 수 있는지를 확인해보고자 하였다. 특히 마이크로RNA의 경우 주로 말단 서열(5’말단 기준 2번째에서부터 7번째까지)을 통해 표적 mRNA에 결합하고 해당 유전자 발현을 억제함으로써 생물학적 기능을 나타냄으로, miR-122b를 siRNA형태로 디자인한 형태(si-122b)로 RNA 간섭 유도 이중체를 합성하였고, 또한 miR-122의 경우에도 miR-122b와 동일한 말단 서열을 가지도록 5’말단 기준 2번째와 3번째를 U로 치환시킨 서열을 siRNA로 디자인(si-122-2,3U)해서 이중체를 합성하였다(도 9A). 이때의 제작은 가이드 가닥(guide strand) 상에 miR-122b의 말단 위치(seed region)를 포함하는 RNA를 합성하고, 운반 가닥(passenger strand)은 변형이 가해지지 않은 형태로 합성하여, 기존의 구조인 19개의 완전 상보배열(perfect reverse complement)과 함께 3'말단에 2개의 dT(Deoxy Thymine Nucleotide)의 돌출부를 가지는 이중가닥을 생성할 수 있도록 제조하였다. 또한 운반 가닥의 5’말단 끝에는 FITC를 붙여서, 해당 siRNA 이중가닥이 세포안으로 전달되는 것을 수월하게 확인할 수 있도록 하였다. 이러한 RNA는 ST Pharma 社, Trilink Technologies 社 또는 Bioneer 社를 통해 화학적으로 합성하고, HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 도 10A와 같이 제조되었다. 이때, 대조군(NT; non-targeting)으로는 예쁜 꼬마 선충(C.elegans)에만 발현하는 마이크로RNA(miRNA)인 cel-miR-67의 서열을 siRNA 형태로 합성한 것을 사용하였다. 이렇게 제작된 이중체의 siRNA는 도 9에 수행한 방법과 동일하게 루시퍼라제 리포터 실험을 수행하였다(도 10B). 이때 siRNA 이중체와 루시퍼라제 벡터는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 HepG2 세포에 전달(co-transfection)시킨 후 24시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정하여 진행하였다. 그 결과, si-122b와 si-122-2,3U 둘 다 모두 miR-122b의 원래 기능인 말단 표적에 대한 억제를 매우 잘 보이는 것을 확인하였다.
이렇게 miR-122b와 동일하게 miR-122b의 말단 표적을 억제하는 si-122b와 si-122-2,3U가 간암을 억제하는 능력을 가지고 있는지를 확인하기 위해서, 간암세포인 HepG2에 해당 75nM siRNA를 도입하고 RNAiMAX 시약(Invitrogen 사)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스팩션(transfection)한 후, 48시간 후에 트립신을 처리하여 세포를 배양 접시로부터 떼어내고, 그 변화를 관찰하였다. 세포 분열 증식 현상에 대해서는 유세포 분석을 실시하여 분석하였다(도 11). 이 때의 실험은 Muse Ki67 Proliferation Kit(millipore　社)을 이용하여 제조사가 제공한 실험 방법에 따라 세포를 처리한 후, Muse Cell Analyzer(Milipore)로 세포 분열을 분석하여 진행하였다. 이 방법은 Ki67이 염색된 세포의 수를 측정함으로 세포 분열 증식이 증가된 세포의 수를 정량적으로 분석하는 방법이다. 그 결과 간암세포인 HepG2에 si-122b를 발현시키면 대조군인 NT에 비해서 Ki67의 염색의 세기가 줄어든 세포가 늘어난다는 사실을 관찰하였다. 이러한 사실로 miR-122b와 같은 유전자를 발현시키면 간암세포의 성장을 억제할 수 있다는 것을 알게 되었다.
추가적으로 miR-122b에 의해서 간암세포의 사멸에도 영향을 미칠 수 있는지 확인해보았다(도 12). 이때의 유세포 분석은 BD Pharmingen　社의 Annexin V: FITC Apoptosis Detection Kit II를 제조사가 제공한 방법에 따라 세포를 처리하여 Attune NxT flow cytometer(Thermo Fisher Scientific)로 Annexin V로는 apoptosis를 PI(Propidium Iodide)로는 necrosis를 측정하여 수행하였다. 이 때 대조군으로는 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-67의 서열과 동일하게 합성(NT)하여 사용하였다. 또한 기존의 간암치료제로 널리 사용하는 Sorafenib(Sigma사)를 10uM 처리한 후 간암세포인 HepG2의 세포 사멸 정도도 함께 조사하였다. 그 결과, 초기 및 후기 apoptosis 모두 si-122b에 의해서 유의하게 증가됨을 관찰할 수 있었다. 또한 sorafenib을 처리한 경우에도 si-122b를 발현시키면 간암의 세포사멸이 상당히 늘어나는 것을 알 수 있었다.
상기에 실시한 예와 더불어, 이번에는 간암세포의 성질 중 암 전이에 중요한 세포 이동 능력이 어떻게 달라지는지를 상처 치유 분석(wound healing assay)을 수행하여 살펴보았다(도 13). 간암세포주인 hepG2에서의 상처 치유 분석은 si-122b, si-122-2,3U를 상기 실시예에서 실행한 동일한 방법으로 hepG2 세포안에 도입하고, 24시간 배양 후, 1000ul팁을 이용하여 세포 배양층(cell layer) 에 흠(scratch) 을 만들고, 세포를 48시간까지 배양하며 각 실험군의 세포가 이동하는 것을 대조군인 NT-6pi를 도입한 것과 비교 관찰하며 진행하였다. 그 결과, 대조군인 NT의 경우는, 48시간 세포 배양 시, 만들어진 흠이 거의 채워지는 세포 이동을 관찰할 수 있었다. 하지만 si-122b, si-122-2,3U가 전달된 실험군에서는 이러한 세 포 이동이 저해되는 것을 보였다(도 13). 이를 정량적으로 측정해본 결과, miR-122-G2U, miR-122-G2,3U siRNA의 경우 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 (t-test, P<0.01) 세포 이동이 저해되었음을 확인하였다(도 13). 해당, 정량 분석은 miR-122의 세포 이동을 세포 형태상으로 관찰한 다음, 이 관찰 결과를 이미지 프로그램(NIH)을 이용하여 분석하여 측정하였다.
상기의 실시예를 통해, 간암을 억제하는 유전자로는 정상 간세포에서 발현되는 마이크로RNA인 miR-122b를 기반으로, 일반적으로 마이크로RNA가 다른 유전자를 조절하는 데 있어서 핵심적인 것으로 알려진 말단 서열(5‘말단 기준 2번째에서부터 7번째까지)이 miR-122b에서 간암세포의 성장 및 이동을 억제하고 사멸을 유도한다는 사실을 알 수 있었다. 따라서, miR-122b의 말단 서열만을 나타내도록 miR-122 유전자 지역을 변형한 후 해당 유전자와 간암 조직 발현 프로모터와 결합시키면, 이를 통해 간암세포를 특이적으로 저해할 수 있는 신규 재조합 간암 치료 유전자 발현 벡터를 조성할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
전술한 본 출원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 또한, 청구범위에서 정의하고 있는 본 출원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태도 본 출원의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (19)

  1. 특정 조직세포 또는 암세포에서만 특이적으로 발현하는 유전자의 인핸서 서열;
    상기 유전자를 포함하여 전사 개시에 최소한으로 필요한 코어 프로모터 서열; 및
    상기 인핸서 서열과 프로모터 서열 사이에 위치하는 적어도 하나 이상의 발암성 전사인자의 결합부위 서열; 이 작동 가능하게 연결된 융합 프로모터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 인핸서 및 코어 프로모터는 간암 세포에서 특이적으로 발현하는 알부민 유전자에서 유래한 융합 프로모터.
  3. 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전사인자 결합부위는,
    ETS(Erythroblast transformation specific) 전사인자의 결합부위인 서열(5'-TTCC-3')인 융합 프로모터.
  4. 청구항 3에 있어서,
    RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 융합 프로모터.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 간섭 유도 핵산을 전사하는 유전자; 를 더 포함하는 융합 프로모터.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 단백질을 암호화하는 유전자; 를 더 포함하는 융합 프로모터.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 리포터 단백질은 형광 단백질, 루시퍼라아제(Luciferase) 및 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 융합 프로모터.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 형광 단백질은 녹색 리포터 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 변형된 녹색 리포터 단백질(Modified Green Fluorescent Protein; MGFP), 증강된 녹색 리포터 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein; EGFP), 적색 리포터 단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 증강된 적색 리포터 단백질(Enhanced Red Fluorescent Protein; ERFP), 청색 리포터 단백질(Blue Fluorescent Protein; BFP), 증강된 청색 리포터 단백질(Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), 황색 리포터 단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 및 증강된 황색 리포터 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein; EYFP)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 융합 프로모터.
  9. 청구항 7 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질은 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(Herpes simplex virus thymidine kinase), 도파민수용체(Dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(Somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(Sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체(Transferrin receptor), 페리틴(Ferritin) 및 철 수송체(magA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 융합 프로모터.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
  11. RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에서 적어도 5'말단으로부터 2번째에서 7번째 사이의 염기 서열이 miR-122b의 염기 서열과 동일한, RNA 간섭 유도 핵산.
  12. 청구항 11의 RNA 간섭 유도 핵산 또는 그와 동일한 DNA 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  13. 청구항 11 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은,
    5‘말단으로부터 2번째에서 7번째 사이의 염기 서열이 miR-122b의 염기 서열과 동일한 재조합 벡터.
  14. 청구항 10 또는 청구항 13의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 청구항 10 또는 청구항 13의 재조합 벡터를 간암이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 간암을 치료하는 방법.
  16. 간암 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 청구항 10 또는 청구항 13의 재조합 벡터의 용도.
  17. 청구항 10 또는 청구항 13의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 간암의 진단용 조성물.
  18. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 청구항 10 또는 청구항 13의 재조합 벡터를 처리하는 단계를 포함하는, 간암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 재조합 벡터로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 간암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
PCT/KR2022/011121 2021-07-29 2022-07-28 융합 프로모터, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하는 간암 치료용 조성물 WO2023008925A1 (ko)

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