CN107531774A - 优化的人类凝血因子viii基因表达盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在受试者的肝脏中生产多肽和功能性核酸的合成肝特异性启动子和表达构建体。本发明还涉及在因子VIII蛋白的氨基酸序列中含有修饰的因子VIII蛋白，以及编码所述因子VIII蛋白的核酸构建体和使用这些组合物治疗出血性病症的方法。

Description

优化的人类凝血因子VIII基因表达盒及其用途
优先权声明
本申请要求于2015年2月6日提交的美国临时申请序列号62/112,901的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于在受试者的肝脏中生产多肽和功能性核酸的合成肝特异性启动子和表达构建体。本发明还涉及在因子VIII蛋白的氨基酸序列中含有修饰的因子VIII蛋白，以及编码因子VIII蛋白的核酸构建体和使用这些组合物治疗出血性病症的方法。
背景技术
因子VIII(Factor VIII)(FVIII)通过加速因子X转化为因子Xa而在凝结级联(coagulation cascade)中起关键作用。FVIII活性缺乏是出血性病症血友病A的起因。目前对血友病A的治疗是静脉输注血浆源的或重组的FVIII蛋白。尽管这种治疗能有效控制出血发作，但由于FVIII的半衰期短(8-12小时)，频繁输注的要求使其固有地成本高昂。基因治疗已经成为最终治愈这种疾病的有吸引力的策略。然而，使用最有希望的病毒载体之一的腺相关病毒(AAV)递送FVIII基因的进展，已经落后于递送凝结因子IX的进展，因为FVIII编码序列的大尺寸接近AAV的包装能力。
本发明通过提供适合于在AAV载体中使用的短合成肝特异性启动子和表达构建体而克服了本领域的缺点。本发明进一步提供FVIII蛋白及其用于治疗出血性病症的方法，所述FVIII蛋白包含具有氨基酸序列修饰的附加糖基化位点。
发明内容
本发明部分基于长仅约200个碱基对的合成肝特异性启动子的开发。所述启动子可以被用于以肝特异性方式生产多肽和功能性核酸，尤其是使用AAV载体，所述AAV载体具有严格的长度限制并可受益于短但强的启动子的可用性。
本发明还部分基于在重链中包含附加糖基化位点的修饰的FVIII蛋白的开发。相对于没有本文所述修饰的FVIII蛋白，所述经修饰的蛋白提供长期和高水平的活性。
在一方面，本发明涉及包含合成肝特异性启动子的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的序列。
在另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体、细胞和/或转基因动物。
在又一方面，本发明涉及在受试者的肝脏中生产多肽或功能性核酸的方法，包含将本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞递送给受试者，由此在受试者的肝脏中生产多肽或功能性核酸。
在附加的方面，本发明涉及一种在受试者中治疗血友病A的方法，包含向受试者递送治疗有效量的本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞，从而治疗所述受试者中的血友病A。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中增加因子VIII多肽的生物利用度的方法，包含向受试者递送有效量的本发明的多核苷酸、载体和/或转化的细胞，从而增加所述受试者中的因子VIII多肽的生物利用度。
在又一方面，本发明涉及一种修饰的人类因子VIII多肽，其中，重链中的氨基酸残基被修饰以产生一个或多个糖基化位点。
在附加的方面，本发明涉及一种编码本发明的修饰的人类因子VIII多肽的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体、细胞和/或转基因动物。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者的肝脏中生产因子VIII的方法，包含向受试者递送编码本发明的修饰的人类因子VIII多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体和/或转化细胞，从而在受试者的肝脏中生产因子VIII。
在另一方面，本发明涉及一种在受试者中治疗血友病A的方法，包含向受试者递送治疗有效量的本发明的修饰的人类因子VIII多肽、多核苷酸、载体和/或转化细胞，从而治疗受试者中的血友病A。
在附加的方面，本发明涉及一种在受试者中增加因子VIII多肽的生物利用度的方法，包含向受试者递送有效量的编码本发明的修饰的人类因子VIII多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体和/或转化细胞，从而增加受试者中的因子VIII多肽的生物利用度。
在下面本发明的描述中更详细地阐述了本发明的这些和其它方面。
附图说明
图1显示了LXP3.3启动子的序列(SEQ ID NO：1)。通过下划线突出显示了推定的肝脏和管家(house-keeping)转录因子结合位点。
图2A显示了将AAV9-TBG-LacZ或AAV9-Lxp3.3-LacZ静脉内注射入小鼠后，肝脏和心脏中LacZ表达的比较。显示的是肝脏和心脏薄切片的X-gal和H&E双重染色。
图2B显示了在使用1x1011个AAV9-LacZ载体的载体基因组(v.g.)处理的小鼠的各种组织中，LacZ酶活性的定量比较，所述AAV9-LacZ载体分别含有非特异性CMV启动子、肝特异性TBG启动子或LXP3.3启动子(如图1所示)。
图2C显示了在使用如图2B所示的AAV9-LacZ载体但以更低的剂量(2x1010个载体基因组(v.g.))处理的小鼠的肝脏中，LacZ酶活性的定量比较。
图3显示了用不同AAV载体质粒转染的Huh7细胞的上清液中的因子VIII活性，所述AAV载体质粒含有驱动没有内含子或含有VH4内含子或嵌合CIN内含子的人类BDD因子VIII基因的NBP启动子(177bp)。
图4显示了AAV-Lxp3.3i-BDD-F8构建体和Lxp3.3i启动子-内含子的序列(SEQ IDNO：2)。ITR代表AAV的145bp反向末端重复序列。
图5显示了在人类肝癌Huh7细胞和小鼠Hepa1-6细胞中，含有非特异性CMV启动子或肝特异性LXP3.3启动子的两个构建体的FVIII表达。
图6显示了分别用不同BDD因子VIII(合成的opti-F8或野生型wtF8)质粒转染的Huh7细胞中的FVIII活性，所述不同BDD因子VIII(合成的opti-F8或野生型wtF8)质粒分别含有启动子LXP3.3或弱启动子TkPro。
图7A显示了在IV注射高剂量(2x1011个v.g./小鼠)或低剂量(4x1010个v.g./小鼠)之后，FVIII敲除小鼠中AAV9-Lxp3.3-F8介导的长期人类FVIII基因表达和FVIII活性。分别在注射后的2、6、10和18周测量因子VIII活性(作为正常人类水平的百分比)。
图7B显示了在IV注射高剂量(2x1011个v.g./小鼠)或低剂量(4x1010个v.g./小鼠)之后，FVIII敲除小鼠中AAV9-Lxp3.3-F8介导的长期人类FVIII基因表达和人类FVIII蛋白浓度。分别在注射后的2、6、10和18周，通过ELISA测量因子VIII蛋白(作为正常人类水平的百分比)。
图8显示了修饰的BDD FVIII蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：31-34)。SQ表示BDD因子VIII的重链和轻链连接处的丝氨酸743(Ser 743)和谷氨酰胺(Gln 1638)(基于SEQ IDNO：5编号)。带下划线的字母突出了重链中突变的氨基酸。
图9A显示了用含有BDD因子VIII或突变体F8X1和F8X2的表达质粒转染的Huh7细胞中的人类FVIII活性(详见图8)。
图9B显示了FVIII敲除小鼠中突变体人类BDD FVIII基因的AAV8载体介导的长期表达。人类因子VIII活性(作为正常人类水平的百分比)是在静脉注射5x1010个AAV8-LXP3.3i-F8X1或AAV8-LXP3.3i-F8X2的载体基因组后的不同时间点进行测量的。
具体实施方式
现在将参考附图更详细地描述本发明，在附图中示出了本发明的优选实施方案。然而，本发明可以以不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方式。更确切地，提供这些实施方式以便本公开将是彻底的和完整的，并且将充分地向本领域的技术人员传达本发明的范围。
除非上下文另有指示，否则特别意图是可以任何组合使用本文所述的本发明的各种特征。此外，本发明还预期，在本发明的一些实施方式中，可以排除或忽略本文所阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书规定复合物包含组分A、B和C，具体意图是可以单独或以任何组合来省略和放弃A、B或C任何一个或其组合。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本文中本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明。
除非另有明确指出，否则核苷酸序列在本文中仅以单链在5′至3′方向上从左至右呈现。核苷酸和氨基酸在本文中以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的方式或(对于氨基酸)由单字母代码或三字母代码表示，两者均符合37C.F.R.§1.822和确立的用法。
除非另有说明，本领域技术人员已知的标准方法可用于克隆基因、扩增和检测核酸等。这些技术是本领域技术人员已知的。参见例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor，NY，1989)；Ausubel etal.Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，New York)。
定义
如在本发明的描述和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”旨在还包括复数形式，除非上下文另有明确指出。
此外，如本文所使用的，“和/或”是指并包括一个或多个相关列出项目的任何的和所有的可能的组合，以及当以择一(alternative)(“或”)解释时缺少组合。
当涉及可测量的值例如多肽的量、剂量、时间、温度、酶活性或其他生物活性等时，如本文所使用的术语“约”意在涵盖指定数量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
过渡性短语“基本上由…组成”是指权利要求的范围应被解释为包括权利要求中所述的指定材料或步骤，“和不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。参见In re Herz，537F.2d 549，551-52，190USPQ 461，463(CCPA 1976)(重点是原始的)；还参见MPEP§2111.03。
应用于本发明的多核苷酸或多肽序列的术语“基本上由…组成”(和语法变体)是指由所述序列(例如SEQ ID NO)和在所述序列的5′和/或3′或N-末端和/或C-末端上的总计为十个或更少(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)附加核苷酸或氨基酸组成的多核苷酸或多肽，以便所述多核苷酸或多肽的功能不会实质上改变。总计十个或更少的附加核苷酸或氨基酸包括两端添加的附加核苷酸或氨基酸的总数。应用于本发明的多核苷酸的术语“实质上改变”，是指与由所述序列组成的多核苷酸的表达水平相比，表达编码的多肽的能力增加或降低至少约50％或更多。应用于本发明的多肽的术语“实质上改变”，是指与由所述序列组成的多肽的活性相比，凝结刺激活性的增加或降低至少约50％或更多。
本文所用的术语“增强”或“增加”或其语法变化，是指指定参数的增加至少为约1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或甚至15倍。
本文所用的术语“抑制”或“减少”或其语法变化是指指定水平或活性的降低或减少至少约15％、25％、35％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％或更多。在具体实施方案中，抑制或减少导致很少或基本上不可检测的活性(至多不显著的量，例如小于约10％或甚至5％)。
本文使用的“有效”量是提供期望效果的量。
本文使用的“治疗有效”量是为受试者提供一些改善或益处的量。可替代地说，“治疗有效”量是将在受试者中的至少一种临床症状中提供一些缓解、减轻或减少的量。本领域技术人员将理解，只要向受试者提供一些益处，治疗效果不需要是完全的或治愈的。
本文使用的“预防有效”量是在患者中足以预防(如本文所定义的)疾病、病症和/或临床症状的量。本领域技术人员将理解，只要向受试者提供一些益处，预防水平不需要是完全的。
如本领域技术人员众所周知的，可以通过检测受试者的症状和/或临床参数的变化所指示的临床改善来确定，通过本发明的方法治疗出血性病症的功效。
术语“治疗(treat)”、“治疗了(treating)”或“治疗的(treatment)”意图是减轻或至少部分改善或改变受试者病况的严重程度，并且实现至少一种临床症状的一些缓解、减轻或减少。
术语“预防(prevent)”、“预防了(preventing)”和“预防的(prevention)”(及其语法变体)是指相对于在疾病、病症和/或临床症状发作之前不进行本发明的方法将发生的情况，发病后疾病、病症和/或临床症状的程度或严重程度的减少或延迟。在血友病A方面，“预防”是指与在不存在预防性治疗时发生的出血发作的次数和/或严重程度相比，出现出血发作的次数和/或严重程度的降低。
如本文所使用的，“核酸”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用并且涵盖RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成(例如化学合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合体。术语多核苷酸、核苷酸序列或核酸是指不考虑链长度的核苷酸的链。核酸可以是双链或单链的。当单链时，核酸可以是有义链或反义链。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成核酸。这样的寡核苷酸可以用于例如制备具有改变的碱基配对能力或增加的核酸酶抗性的核酸。本发明还提供了一种核酸，其为本发明的核酸、核苷酸序列或多核苷酸的互补体(complement)(其可以是完全互补体(full complement)或部分互补体(partial complement))。
“分离的多核苷酸”是一种核苷酸序列(例如DNA或RNA)，其不直接与在其衍生的生物体的天然发生的基因组中其直接邻接(一个在5′末端，一个在3′末端)的核苷酸序列邻接。因此，在一个实施方案中，分离的核酸包括紧邻编码序列的5′非编码(例如启动子)序列的一些或全部。因此，该术语包括例如并入载体中、并入自主复制的质粒或病毒中、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为单独分子(例如cDNA或通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段)存在的重组DNA，其与其它序列无关。它还包括作为编码附加多肽或肽序列的杂交核酸的一部分的重组DNA。包括基因的分离的多核苷酸，不是包括此种基因的染色体的片段，而是包括与该基因相关的编码区和调节区，但是没有该染色体上天然存在的额外基因。
应用于多核苷酸的术语“片段”将被理解为是指相对于参考核酸或核苷酸序列，长度减小的核苷酸序列，并且包含与所述参考核酸或核苷酸序列一致或几乎一致(例如90％、92％、95％、98％、99％一致)的连续核苷酸的核苷酸序列、基本上其组成、和/或由其组成。根据本发明所述的这种核酸片段在适当的情况下可以被包括在其作为组成的更大的多核苷酸中。在一些实施方案中，此种片段可以包含具有根据本发明所述的核酸或核苷酸序列的至少约8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或更多连续核苷酸长度的寡核苷酸，基本由其组成，和/或由其组成。
术语“分离的”可以指基本上不含细胞材料、病毒材料、和/或培养基(当通过重组DNA技术产生时)、或化学前体或其它化学物质(当化学合成时)的核酸、核苷酸序列或多肽。此外，“分离的片段”是核酸、核苷酸序列或多肽的片段，其不是天然存在的片段，并且在天然状态下不会被发现。“分离的”并不意味着制备在技术上是纯的(均匀的)，但是其足够纯以提供可用于预期目的形式的多肽或核酸。
应用于多肽的术语“片段”将被理解为是指相对于参考多肽或氨基酸序列，长度减少的氨基酸序列，并且包含与所述参考多肽或氨基酸序列一致或几乎一致(例如90％、92％、95％、98％、99％一致)的连续氨基酸的氨基酸序列、基本上由其组成、和/或由其组成。根据本发明所述的这种多肽片段在适当的情况下可以被包含在其作为组成的较大多肽中。在一些实施方案中，此种片段可以包含具有根据本发明所述的多肽或氨基酸序列的至少约4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或更多连续氨基酸长度的肽，基本上由其组成，和/或由其组成。
“载体”是用于将核酸克隆和/或转移到细胞中的任何核酸分子。载体可以是可以附接另一个核苷酸序列以允许所附接的核苷酸序列复制的复制子。“复制子”可以是在体内作为核酸复制的自主单元(即能够在其自身控制下复制)的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒基因组)。术语“载体”包括在体外、离体和/或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒(例如质粒)核酸分子。可以使用本领域已知的大量载体来操纵核酸、将响应元件和启动子合并到基因中等。例如，将对应于响应元件和启动子的核酸片段插入合适的载体中，可以通过将合适的核酸片段连接到具有互补结合末端的选定载体中来实现。可替代地，核酸分子的末端可以被酶促修饰，或者可以通过将核苷酸序列(接头)连接到核酸末端来产生任何位点。可以将这样的载体工程化成含有编码选择性标记的序列，这便于含有所述载体的细胞和/或已将所述载体的核酸合并到细胞基因组中的细胞的选择。这样的标记允许鉴定和/或选择合并且表达由所述标记编码的蛋白质的宿主细胞。“重组”载体是指包含一个或多个异源核苷酸序列(即转基因)的病毒或非病毒载体，例如包含两个、三个、四个、五个或更多个异源核苷酸序列。
病毒载体已经用于在细胞中以及活的动物受试者中的各种基因递送应用中。可以使用的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、痘病毒、甲病毒、杆状病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和腺病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电荷的脂质(细胞转染剂(cytofectin))、核酸-蛋白复合物和生物聚合物。除感兴趣的核酸之外，载体还可以包含一个或多个调节区和/或可用于选择、测量和监测核酸转移结果(递送到特定组织、表达持续时间等)的可选择标记。
可以通过本领域已知的方法将载体引入到所需的细胞中，例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、使用基因枪或核酸载体转运蛋白(参见例如Wu et al.、J.Biol.Chem.267：963(1992)；Wu et al.、J.Biol.Chem.263：14621(1988)；和Hartmut et al.1990年3月15日提交的加拿大专利申请号2,012,311)。在各种实施方案中，可用其他分子来促进核酸在体内的递送，诸如阳离子寡肽(例如WO95/21931)、衍生自核酸结合蛋白的肽(例如WO96/25508)和/或阳离子聚合物(例如WO95/21931)。也可以在体内引入作为裸核酸的载体(参见美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。还可以使用受体介导的核酸递送方法(Curiel et al.，Hum.GeneTher.3：147(1992)；Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
如本文使用的术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用并且包括肽和蛋白质，除非另有说明。
“融合蛋白”是当自然界中未发现融合在一起的编码两种(或更多种)不同多肽的两个异源核苷酸序列或其片段，在正确的翻译阅读框中被融合在一起时，产生的多肽。说明性的融合多肽包括本发明的多肽(或其片段)与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白或报告蛋白(例如绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等)、血凝素、c-myc、FLAG表位等的全部或部分的融合物。
如本文所使用的，“功能性”多肽或“功能性片段”是基本上保留至少一种通常与该多肽相关的生物活性(例如血管生成活性、蛋白结合、配体或受体结合)的物质。在具体实施方案中，“功能性”多肽或“功能性片段”基本上保留由未修饰的肽所具有的所有活性。“基本保留”生物活性，是指多肽保留天然多肽的至少约20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、99％或更多的生物活性(并且甚至可以具有比天然多肽更高的活性水平)。“非功能性”多肽是表现出很少或基本上没有通常与多肽相关的可检测的生物活性的多肽(例如，至多只有不明显的量，例如小于约10％或甚至5％)。生物活性如蛋白质结合和血管生成活性可以使用本领域熟知的和如本文所述的测定法来测量。
术语“表达(express)”或“表达了(expression)”多核苷酸编码序列，其意思是将该序列转录并可选地翻译。通常，根据本发明，本发明的编码序列的表达将导致本发明的多肽的产生。整体表达的多肽或片段也可以在完整的细胞中起作用而不需要纯化。
在本发明的上下文中，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于此AAV1型、AAV 2型、AAV 3型(包括类型3A和3B)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV10型、AAV 11型、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV以及现在已知或以后发现的任何其他AAV。参见例如BERNARD N.FIELDS et al.、VIROLOGY、第2卷、第69章(第4版、Lippincott-Raven Publishers)。已经鉴定了一些额外的AAV血清型和进化枝(clade)(参见例如Gao etal.，(2004)J.Virol.78：6381-6388和表1)，其也被术语“AAV”所涵盖。
各种AAV和自主细小病毒的基因组序列，以及ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这些序列可以在文献或公共数据库中找到，诸如数据库。参见例如登录号NC 002077、NC 001401、NC 001729、NC 001863、NC 001829、NC 001862、NC 000883、NC 001701、NC 001510、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC 001358、NC001540、AF513851、AF513852、AY530579、AY631965、AY631966；其公开内容全部并入本文。还参见例如Srivistava et al.，(1983)J.Virol.45：555；Chiorini et al.，(1998)J.Virol.71：6823；Chiorini et al.，(1999)J.Virol.73：1309；Bantel-Schaal et al.，(1999)J.Virol.73：939；Xiao et al.，(1999)J.Virol.73：3994；Muramatsu et al.，(1996)Virology 221：208；Shade et al.，(1986)J.Virol.58：921；Gao et al.，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：11854；国际专利公布WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；美国专利号6,156,303；它们的公开内容全部并入本文。还参见表1。Xiao，X.，(1996)、“Characterization of Adeno-associated virus(AAV)DNA replication andintegration，”Ph.D.Dissertation，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA(其整体并入本文)提供了AAV1、AAV2和AAV3末端重复序列的早期描述。
表1
“重组AAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含至少一个反向末端重复(例如一个、两个或三个反向末端重复序列)和一个或多个异源核苷酸序列的AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体通常以顺式(cis)保留145个碱基末端重复(TR)以产生病毒；然而，修饰的AAV TR和非AAV TR(包括部分或完全合成序列)也可以用于该目的。所有其他病毒序列是不必要的，可以以反式(trans)提供(Muzyczka，(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158：97)。rAAV载体可选地包含两个TR(例如AAV TR)，其通常将处于异源核苷酸序列的5’和3’端，但不必与其相邻近。TR可以彼此相同或彼此不同。载体基因组还可以在其3’或5’端含有单个ITR。
术语“末端重复”或“TR”包括形成发夹结构并用作反向末端重复(即介导所需功能例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒营救等等)的任何病毒末端重复或合成序列。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列，例如其他细小病毒(例如犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的那些序列或作为SV40复制起点的SV40发夹的序列，可以被用作TR，它们可以进一步通过截短、取代、缺失、插入和/或添加来修饰。此外，TR可以是部分或完全合成的，诸如Samulski et al的美国专利号5,478,745中所描述的“双D序列”。
“AAV末端重复”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或现在已知或以后发现的任何其他AAV(参见例如表1)。AAV末端重复不需要具有天然末端重复序列(例如天然AAV TR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变)，只要所述末端重复介导所需的功能例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等即可。
术语“rAAV颗粒”和“rAAV病毒颗粒”在这里可互换使用。“rAAV颗粒”或“rAAV病毒颗粒”包含包装在AAV衣壳内的rAAV载体基因组。
BERNARD N.FIELDS et al.，VIROLOGY，第2卷，第69&70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)中更详细地描述了AAV衣壳结构。
术语“药代动力学性质”具有通常和惯用的含义，并且是指FVIII蛋白的吸收、分布、代谢和排泄。
“生物利用度”的通常和惯用含义是达到体循环的生物活性药物的给药剂量的分数或量。在本发明的实施方案的上下文中，术语“生物利用度”包括通常和惯用含义，但还被认为具有更广泛的含义，以包括FVIII蛋白质生物活性的程度。在FVIII的情况下，例如，“生物利用度”的一个量度是在输注后循环中获得的FVIII蛋白的促凝血活性。
“翻译后修饰”具有通常和惯用的含义，并且包括但不限于除去前导序列、谷氨酸残基的γ-羧化、天冬氨酸残基的β-羟化、天冬酰胺残基的N-连接糖基化、丝氨酸和/或苏氨酸残基的O-连接糖基化、酪氨酸残基的硫酸化、丝氨酸残基的磷酸化和它们的任何组合。
如本文所用的，“生物活性”是参照例如来自人类血浆的标准物来确定的。对于FVIII，该标准物可以是(CSL Behring)。该标准物的生物活性取为100％。
本文所用的术语“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”包括野生型FVIII蛋白以及天然存在的或人造的蛋白(例如B结构域缺失的蛋白)。本发明的FVIII蛋白可以进一步包括文献中已知的突变形式的FVIII。本发明的FVIII蛋白，还包括现在已知的或稍后鉴定的任何其它天然存在的人类FVIII蛋白或人造的人类FVIII蛋白，以及本领域已知的它们的衍生物和活性片段/活性结构域。
来自多种哺乳动物物种的FVIII的氨基酸序列，可从诸如GenBank的序列数据库获得。FVIII序列的例子如下表所示。
物种 GenBank登录号
人类(Homo sapiens) AAA52484.1
小家鼠(Mus musculus) NP_032003.2
野猪(Sus scrofa) AAB06705.1
黄牛(Bos Taurus) NP_001138980.1
家犬(Canis lupus familiaris) NP-001003212.1
褐家鼠(Rattus norvegicus) ADU79112.1
本发明的FVIII蛋白还包括FVIII的药理活性形式，其是已除去了信号肽的分子，并且已通过蛋白酶的作用切除了B结构域(或通过在核酸水平上除去其而将其从蛋白质中工程化(engineer)出来)，产生折叠为功能性FVIII凝血因子的FVIII的两个不连续的多肽链(轻链和重链)。已知多个B结构域缺失形式的人类FVIII，包括经常使用的SQ版本，其中S743和Q1638之间的残基被缺失。具体地说，具有增加糖基化程度的修饰的FVIII蛋白在广义上被具体地包括在内。
人类FVIII蛋白的氨基酸序列是本领域熟知的，并且可以在GenBank登录号AAA52484中找到。人类FVIII蛋白的长度为2351个氨基酸，并且由信号肽(残基1-19)、重链(残基20-759)、B结构域(残基760-1332)和轻链(残基1668-2351)组成。以下公开了不具有信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
术语“半衰期(half life)”是一个广义术语，其包括通常和惯用的含义以及在FVIII科学文献中发现的通常和惯用意义。该定义中具体包括与FVIII相关的参数的测量，其定义了从输注时测量的初始值减少到初始值的一半所用的输注后的时间。在一些实施方案中，可以在各种免疫测定中使用FVIII的抗体在血液和/或血液成分中测量FVIII的半衰期，如本领域熟知的和本文所述的。可替代地，可以使用包括标准凝血测定在内的功能测定法，以FVIII活性的降低来测量半衰期，如本领域公知的和如本文所述的。
如本文所用的术语“恢复(recovery)”，包括在其输注、注射、递送或以其它方式给药之后，为了测量FVIII的水平，在取出生物样品(例如血液或血液制品样品)的最早实践时间在受体动物或人受试者中(例如在循环中)通过任何可接受的方法测量的FVIII的量，包括但不限于检测的FVIII抗原水平或FVIII蛋白酶或凝血活性水平。使用现有的方法，用于测量FVIII恢复的最早的生物采样时间通常在FVIII的输注、注射或其它方式递送/给药之后的前15分钟内，但随着科学和/或临床技术的改进，期望更快的采样时间是合理的。本质上，FVIII的恢复值在此表示，在向受体动物或患者输注、注射或其它方式递送之后的最早可能时间点，可以在受体中(例如，在循环中)测量的输注、注射或以其他方式递送/给药的FVIII的最大分数。
术语“糖基化位点”是具有其通常和惯用意义的广义术语。在本中请的上下文中，该术语适用于潜在地可以接受碳水化合物部分的两个位点以及蛋白质内的位点，特别是FVIII，其实际上已附接了碳水化合物部分并且包括可以用作寡糖和/或碳水化合物的受体的任何氨基酸序列。
如本文所用的，“转化的”细胞是已经用编码本发明的FVIII蛋白的核酸分子转化、转导和/或转染的细胞，包括但不限于使用重组DNA技术构建的FVIII蛋白载体。
如本文所用的，术语“出血性病症”反映了出血表现出的细胞、生理或分子起源的任何缺陷、先天性、获得性或诱导性。例子是凝血因子缺陷(例如，血友病A和B或凝血因子XI、VII、VIII或IX的缺陷)、凝血因子抑制剂、血小板功能不全、血小板减少症、血管性血友病(冯·威利布兰德疾病，von Willebrand′s disease)、或由外科手术或外伤引起的出血。
过度出血也发生在具有正常功能的血液凝血级联(无凝血因子缺乏症或针对任何凝血因子的抑制剂)的受试者中，并且可能由血小板功能不全、血小板减少症、或血管性血友病引起。在这种情况下，出血可能与血友病引起的出血相似，因为止血系统(如在血友病中)缺少或具有异常的必要凝血“化合物”(如血小板或血管性血友病因子蛋白)，导致重大出血。在经历与手术或创伤相关的广泛组织损伤的受试者中，正常的止血机制可能会由于立即止血的需求而不堪重负，因此尽管有正常的止血机制也仍可能出现出血。在诸如脑、内耳区域和眼睛等器官中出血时，外科止血的可能性有限，实现令人满意的止血也是一个问题。在各种器官(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)以及腹腔镜手术中进行活组织检查的过程中也可能出现同样的问题。所有这些情况的共同之处在于，通过手术技术(缝线、夹子等)难以提供止血，在出血为扩散性时(出血性胃炎和大量子宫出血)也是如此。急性和大量出血也可能发生在抗凝治疗的受试者中，在所述受试者中通过给予的治疗诱发了有缺陷的止血。在必须迅速抵消抗凝作用的情况下，这些受试者可能需要手术干预。根治性耻骨前列腺切除术(radical retropubic prostatectomy)是针对具有局限性前列腺癌的受试者的常规手术。手术经常因显著且有时大量失血而复杂化。前列腺切除术过程中相当大的失血主要与复杂的解剖情况有关，其具有不容易获得手术止血的各种密集血管化的部位，并且可能导致大面积的弥漫性出血。此外，大脑内出血是中风中最不可治疗的形式，并且与脑内出血后头几个小时的高死亡率和血肿生长有关。在止血不良的情况下可能引起问题的另一种情形是，当具有正常止血机制的受试者进行抗凝治疗以预防血栓栓塞性疾病时的情形。这样的治疗可以包括肝素、其他形式的蛋白聚糖、杀鼠灵或其他形式的维生素K拮抗剂以及阿司匹林和其他血小板聚集抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，出血与血友病有关。在另一个实施方案中，出血与获得性抑制剂的血友病有关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少症有关。在另一个实施方案中，出血与血管性血友病(von Willebrand’s disease)有关。在另一个实施方案中，出血与严重的组织损伤有关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤有关。在另一个实施方案中，出血与手术有关。在另一个实施方案中，出血与腹腔镜手术有关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎有关。在另一个实施方案中，出血是大量的子宫出血。在另一个实施方案中，出血发生在机械止血可能性有限的器官中。在另一个实施方案中，出血发生在脑、内耳区域或眼睛中。在另一个实施方案中，出血与采取活组织检查的过程有关。在另一个实施方案中，出血与抗凝治疗有关。
本发明的“受试者”包括患有或易感出血性病症或出血病况的任何动物，其需要和/或期望控制出血，其可以通过向受试者给药FVIII来治疗、改善或预防(例如血友病A和获得性FVIII缺乏症(例如，由于针对FVIII或血液恶性肿瘤的自身抗体引起的))。这样的受试者通常是哺乳动物受试者(例如，实验室动物如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、灵长类动物等)、农场或商业动物(例如母牛、马、山羊、驴、绵羊等)或家畜(例如猫、狗、白鼬等)。在具体实施方案中，受试者是灵长类受试者、非人灵长类受试者(例如黑猩猩、狒狒、猴、大猩猩等)或人类。本发明的受试者可以是已知或相信具有需要和/或期望控制的出血性病症或出血病况风险的受试者。可替代地，根据本发明所述的受试者，还可以包括先前未知或怀疑具有需要或期望控制的出血性病症或出血病况风险的受试者。作为另一个选择，受试者可以是实验室动物和/或疾病的动物模型。
受试者包括任何年龄的男性和/或女性，包括新生儿、幼年、成年和老年受试者。关于人类受试者，在代表性的实施方案中，受试者可以是婴儿(例如小于约12个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月或更小的年龄)、幼儿(例如至少约12、18或24个月和/或小于约36、30或24个月)或儿童(例如至少约1、2、3、4或5岁和/或小于约14岁、12、10、8、7、6、5或4岁)。在本发明的实施方案中，受试者是约0至3、4、5、6、9、12、15、18、24、30、36、48或60个月龄的人类受试者，约3至6、9、12、15、18、24、30、36、48或60个月龄的人类受试者，约6至9、12、15、18、24、30、36、48或60个月龄的人类受试者，约9至12、15、18、24、30、36、48或60个月龄的人类受试者，约12至18、24、36、48或60个月龄的人类受试者，约18至24、30、36、48或60个月龄的人类受试者，或约24至30、36、48或60个月龄的人类受试者。
启动子和表达盒(表达框)
本发明的一个方面涉及包含合成肝特异性启动子的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少约90％一致性的序列，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。所述启动子是短(约200个碱基对)且强的肝特异性启动子，其对于感兴趣的多核苷酸的肝特异性表达是理想的，并且由于其短的长度和AAV载体的有限能力而特别适合用于AAV载体中。所述启动子被设计为含有保守的基础启动子元件和转录起始位点。基础启动子在其5’端与许多肝特异性转录因子结合位点连接以用于肝特异性表达(图1)。经在人肝癌细胞系Huh7中使用荧光素酶报告基因和转染实验体外初步鉴定，以及然后在小鼠体内证实，所述启动子表现出高活性。
在一些实施方案中，所述启动子是表达盒的一部分，其中它可操作地连接到内含子，例如在启动子的3’末端上。这可以进行以增加与启动子连接的感兴趣的多核苷酸的表达水平。可以使用任何合适的内含子，例如嵌合内含子CIN(Promega)。在一些实施方案中，内含子来自VH4。在一些实施方案中，内含子可以进一步包含短的非天然外显子接合序列。在一个实施方案中，所述启动子和内含子在一起包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性(例如与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)的序列，或基本上由其组成，或由其组成。
所述启动子可以可操作地连接到感兴趣的多核苷酸。在一些实施方案中，所述感兴趣的多核苷酸编码多肽或功能性核酸。在某些实施方案中，所述感兴趣的多核苷酸编码凝血因子，例如FVIII，例如B结构域缺失的FVIII。所述B结构域缺失的FVIII可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性(例如与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性)的序列，或基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方案中，包含启动子、内含子和编码B结构域缺失的FVIII的感兴趣的多核苷酸的表达盒包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性(例如与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性)的序列，或基本上由其组成，或由其组成。
本发明的另一方面是包含本发明的多核苷酸的载体，例如表达载体。载体可以是本领域已知的任何类型的载体，包括但不限于质粒载体和病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒或慢病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是来自任何已知AAV血清型的AAV载体，包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV以及现在已知或稍后发现的任何其他AAV。在一些实施方案中，AAV载体是AAV8或AAV9。
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸和/或载体的细胞(例如，分离的细胞、转化细胞、重组细胞等)。因此，本发明的各种实施方案涉及含有载体(例如表达盒)的重组宿主细胞。这样的细胞可以是分离的和/或存在于转基因动物中。下文进一步描述细胞的转化。
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞的转基因动物。下文进一步描述转基因动物。
本发明的多核苷酸、载体和/或细胞可以被包括在药物组合物中。一些实施方案涉及试剂盒，其包含本发明的多核苷酸、载体和/或细胞、和/或使用该试剂盒的试剂和/或说明书，例如以便实施本发明的方法。
修饰的因子VIII蛋白
本发明的一个方面涉及修饰的哺乳动物因子VIII多肽(例如人类FVIII多肽)，其中，重链中的氨基酸残基被修饰以产生一个或多个附加糖基化位点。在某些实施方案中，所述一个或多个附加糖基化位点位于重链的C末端中，例如重链的最后100个氨基酸残基，例如最后的50、40、30、20、10、9、8、7、6或5个残基。在一些实施方案中，所述多肽被修饰以产生至少2个糖基化位点，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多个糖基化位点。修饰可以包括氨基酸取代、添加、缺失或其任何组合。这些修饰被引入到FVIII蛋白的氨基酸序列中，以产生在体内表达后具有增加活性的FVIII蛋白。
“附加”糖基化位点是指所述FVIII蛋白中的糖基化位点的数目大于通常存在于未修饰(例如野生型)FVIII蛋白(例如SEQ ID NO：5)中的糖基化位点的数目。
本发明还涉及含有一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等)附加糖侧链的FVIII蛋白。这种附加糖侧链可以存在于本发明的FVIII蛋白中的一个或多个糖基化位点上。可替代地，如本领域技术人员众所周知的，作为将此种糖链引入FVIII分子中的化学和/或酶促方法的结果，所述附加糖侧链可以存在于FVIII蛋白上的位点。“附加的(additional)”或“新的”糖链是指所述FVIII蛋白中的糖链数大于通常存在于“野生型”形式FVIII中的糖链数。在各个实施方案中，可以添加约1至约50个附加糖侧链(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个)。
糖基化位点可以是N-连接的糖基化位点、O连接的糖基化位点以及N-连接的糖基化位点和O-连接的糖基化位点的组合。在一些实施方案中，所添加的糖基化位点包括N-连接的糖基化位点，并且共有序列是NXT/S，条件是X不是脯氨酸。在其它实施方案中，糖基化位点包含含有共有序列的O-连接的糖基化位点，所述共有序列选自于由CXXGGT/S-C(SEQID NO：24)、NSTE/DA(SEQ ID NO：25)、NITQS(SEQ ID NO：26)、QSTQS(SEQ ID NO：27)、D/E-FT-R/K-V(SEQ ID NO：28)、C-E/D-SN(SEQ ID NO：29)、GGSC-K/R(SEQ ID NO：30)和它们的任何组合所组成的组。
在一些实施方案中，可将约1至约15个糖基化位点加入到本发明的FVIII蛋白的氨基酸序列中。在各个实施方案中，可以添加约1至约50个糖基化位点(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个)。
如本文所用，“糖基化附接位点”或“糖基化位点”可以表示糖附着共有序列(即充当将糖(单糖、寡糖或多糖)附接到氨基酸序列的共有序列的一系列氨基酸)或者其可以是指糖部分共价连接的实际氨基酸残基。糖部分可以是单糖(简单糖分子(simple sugarmolecule))、寡糖或多糖。
在具体实施方案中，可以在组成重链的任何氨基酸残基之间插入另外的氨基酸和/或替代成这样的氨基酸残基。此外，可以在FVIII蛋白的氨基酸序列的相同和/或不同位置处，多次引入本发明的相同插入物。此外，可以在FVIII蛋白的整个氨基酸序列的氨基酸残基之间的相同和/或不同位置处，一次或多次引入不同的插入物和/或相同的插入物。
一些蛋白质可以支持大量的糖侧链，并且N-连接的糖基化位点之间的距离可以少至三个、四个、五个或六个氨基酸(参见例如Lundin et al.，FEBS Lett.581：5601(2007)；Apweiler et al.，Biochim.Biophys.Acta 1473：4(1991)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，野生型人类序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸残基736和737被替换为氨基酸残基XX，其中X是S或T。因此，残基736和737可以是SS、ST、TS或TT。
在一些实施方案中，野生型人序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸残基736-742被替换为氨基酸残基XXYVNRXL(SEQ ID NO：6)，其中X是S或T。因此，残基736-742可以如下。
残基736-742 SEQ ID NO
TTYVNRSL 7
TTYVNRTL 8
TSYVNRSL 9
TSYVNRTL 10
STYVNRSL 11
STYVNRTL 12
SSYVNRSL 13
SSYVNRTL 14
在一些实施方案中，野生型人类序列(SEQ ID NO：5)中的氨基酸残基736-742被替换为氨基酸残基XXNNX(SEQ ID NO：15)，其中X是S或T。因此，残基736-740可以如下。
在一些实施方案中，修饰的人类因子VIII多肽是其中缺失了B结构域的多肽，例如从S743到Gln1638的SQ缺失(如SEQ ID NO：5中的编号)。
具有附加糖基化位点的本发明的FVIII蛋白可以通过重组方法如使用PCR的定点诱变来产生。可替代地，本发明的FVIII蛋白可以化学合成，以制备具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等)附加糖基化位点的FVIII蛋白。
根据本领域熟知的方法和如本文所教导的方法修饰成熟FVIII氨基酸序列中的任何氨基酸残基或多个残基，以及根据众所周知的方法和如本文所述的方法测试任何得到的FVIII蛋白的活性、稳定性、恢复(recovery)、半衰期等，在本领域技术人员的技术范围内和在本发明的范围内(参见例如Elliott et al..J.Biol.Chem.279：16854(2004)，其全部内容通过引用并入本文)。
本发明的实施方案涉及重组FVIII蛋白(例如X0、X1、X2)，其中已经加入糖基化位点以改善FVIII的活性和/或恢复和/或半衰期和/或稳定性。本发明的FVIII蛋白包含修饰，其允许提高FVIII蛋白对已给药本发明的FVIII蛋白的受试者的生物利用度。在一些实施方案中，提高的生物利用度是指血液学中的标准当前思维，血浆中FVIII的浓度是相关浓度。在本发明的一些实施方案中，提高的生物利用度是指FVIII蛋白在受试者的循环中停留更长时间的能力。因此，在本发明的一些实施方案中，本文所述的FVIII蛋白质被修饰以产生在体内表达后具有增加活性的FVIII蛋白，并且在一些实施方案中，本发明提供了增加受试者中FVIII蛋白的止血有效性的方法，包含向所述受试者给药有效量的本发明的FVIII蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的细胞，其中，在任何这些实施方案中向所述受试者给药的FVIII蛋白是具有增加活性的本发明的FVIII蛋白。
根据本发明所述的FVIII蛋白是通过本领域公知的和本文所述的方法产生和表征的。如本领域众所周知的，这些方法包括测定凝血时间(部分凝血致活酶(thromboplastin)时间(PPT)测定))和向测试动物给药FVIII蛋白以通过适当的免疫测定和/或活性测定来确定恢复、半衰期和生物利用度。
本发明的另一方面提供了编码本发明的FVIII蛋白的分离的多核苷酸以及用于产生FVIII蛋白的表达盒。
本发明的另一方面是包含本发明的多核苷酸的载体，例如表达载体。载体可以是本领域已知的任何类型的载体，包括但不限于质粒载体和病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是来自任何已知AAV血清型的AAV载体，包括但不限于此AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV以及现在已知或稍后发现的任何其他AAV。在一些实施方案中，AAV载体是AAV8或AAV9。
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸和/或载体的细胞(例如分离的细胞、转化细胞，重组细胞等)。因此，本发明的各个实施方案涉及含有所述载体(例如表达盒)的重组宿主细胞。这样的细胞可以是分离的和/或存在于转基因动物中。下文进一步描述了细胞的转化。
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞的转基因动物。下文进一步描述了转基因动物。
本发明的FVIII蛋白、多核苷酸、载体和/或细胞可以包括在药物组合物中。一些实施方案涉及试剂盒，其包含本发明的FVIII蛋白、多核苷酸、载体和/或细胞、和/或用于使用所述试剂盒的试剂和/或说明书，例如以便实施本发明的方法。
本发明的方法
本发明的另一方面涉及本发明的启动子和表达盒用于例如以肝特异性方式产生多肽或功能性核酸的用途。因此，一个方面涉及在受试者的肝脏中产生多肽或功能性核酸的方法，包含向受试者递送本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞，从而在受试者的肝脏中产生多肽或功能性核酸酸。在发生感兴趣的多核苷酸表达的条件下递送所述多核苷酸、载体和/或转化细胞，以产生多肽或功能性核酸。这些条件在本领域中是众所周知的并在下文进一步描述。
本发明的另一方面涉及使用本发明的启动子和表达盒治疗受试者中的血友病A或获得性因子VIII缺乏症的方法，包括向所述受试者递送治疗有效量的本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞，由此治疗所述受试者中的血友病A。在一些实施方案中，感兴趣的多核苷酸编码如上所述的FVIII多肽。
本发明的另一方面涉及使用本发明的启动子和表达盒增加受试者中FVIII多肽的生物利用度的方法，包含向所述受试者递送有效量的本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞，由此增加所述受试者中的FVIII多肽的生物利用度。在这一方面，所述感兴趣的多核苷酸编码如上所述的FVIII多肽。
本发明的修饰的FVIII蛋白可以在治疗出血性病症的方法中使用，通过向有此需求的受试者(例如人类患者)给药有效量的FVIII蛋白。因此，本发明还提供了治疗出血性病症的方法，包含向有此需求的受试者给药有效量的本发明的FVIII蛋白、多核苷酸、载体和/或细胞。
本发明的一个方面涉及在受试者的肝脏中产生因子VIII的方法，包含向所述受试者递送本发明的编码修饰的人类因子VIII多肽的多核苷酸、载体和/或转化细胞，从而在所述受试者的肝脏中产生因子VIII。
本发明的另一方面涉及治疗受试者中的血友病A或获得性因子VIII缺乏症的方法，包含向所述受试者递送治疗有效量本发明的修饰的人类因子VIII多肽、多核苷酸、载体和/或转化细胞，由此治疗所述受试者中的血友病A或获得性因子VIII缺乏症。
本发明的另一方面涉及增加受试者中因子VIII多肽的生物利用度的方法，包含向所述受试者递送有效量本发明的编码修饰的人类因子VIII多肽的多核苷酸、载体和/或转化细胞，从而增加该受试者中因子VIII多肽的生物利用度。
根据本发明的方法可以治疗的出血性病症包括可用FVIII治疗的任何病症，诸如血友病A和获得性FVIII缺乏症。用于向受试者(例如有此需要的受试者)给药或递送本发明的FVIII蛋白和/或本发明的编码FVIII蛋白的多核苷酸的此种治疗协议和给药方案是本领域熟知的。
在本发明的实施方案中，编码本发明的FVIII蛋白的载体(例如，病毒载体或其他核酸载体)的剂量，可以是使达到FVIII蛋白的治疗血浆浓度的量。FVIII蛋白的治疗浓度被认为是高于1％的健康个体的正常水平，其是在平均100％上测量的，因此为1mL正常人类血浆中一个国际单位(IU)的FVIII。本领域技术人员将能够确定给定受试者和给定病况的最佳剂量。
对于与故意干预有关的治疗，本发明的FVIII蛋白通常在进行干预之前的约24小时内给药，此后持续多达7天或更长时间。作为凝血剂的给药可以通过如本文所述的多种途径进行。
药物组合物主要用于预防和/或治疗性治疗的肠胃外给药。优选地，药物组合物是肠胃外给药的，即静脉内、皮下或肌内给药，或通过连续或脉冲输注给药。可替代地，药物组合物可以配制为用于各种方式给药，包括但不限于口服、皮下、静脉内、脑内、鼻内、经皮、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠、眼内或任何其他可接受的方式。
用于肠胃外给药的组合物包含本发明的FVIII蛋白联合(例如溶解于)药学上可接受的载体，优选水性载体。可以使用各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。也可以使用延长稳定性和储存的组合物(如甲硫氨酸和蔗糖)来配制本发明的FVIII蛋白。本发明的FVIII蛋白也可以配制成用于递送或靶向损伤部位的脂质体制剂。美国专利号4,837,028、4,501,728和4,975,282中大体描述了脂质体制剂。组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术来灭菌。所得的水溶液可以包装以供使用，或在无菌条件下过滤并冻干，给药前将冻干制剂与无菌水溶液组合。所述组合物可以含有为近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。所述组合物还可以含有防腐剂、等渗剂、非离子表面活性剂或洗涤剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
这些制剂中FVIII蛋白的浓度可以广泛变化，即从小于约0.5重量％(通常为或至少约1重量％)至多达约15重量％或20重量％，并将主要根据所选择的特定给药模式通过流体体积、粘度等来选择。因此，作为一个非限制性例子，用于静脉输注的典型药物组合物可以制成以含有250ml无菌林格氏溶液和10mg FVIII蛋白质。用于制备可胃肠外给药的组合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并且在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第21版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(2005)中有更详细的描述。
包含本发明的FVIII蛋白和/或编码本发明的FVIII蛋白的核酸分子的组合物，可以给药用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足以治愈、减轻或部分阻止如上所述的疾病及其并发症的量，将组合物给药于已经患有所述疾病的受试者。足以实现这一目标的量被定义为“治疗有效量”。如本领域技术人员所理解的，有效于此目的的量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
在预防性应用中，将含有本发明的FVIII多肽的组合物给药于易患或以其它方式具有疾病状态或损伤风险的受试者，以增强该受试者自身的凝血能力。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在预防性应用中，精确量再次取决于受试者的健康状况和体重。
组合物的单次或多次给药可以由治疗医师选择的剂量水平和模式进行。对于需要日常维持水平的流动受试者(ambulatory subiect)，FVIII蛋白可以通过使用例如便携式泵系统的连续输注来给药。
本发明的FVIII蛋白也可以配制成持续或延长释放制剂。配制持续或延长释放组合物的方法是本领域已知的，并且包括但不限于含有所述多肽的固体疏水性颗粒的半透性基质。
本发明的FVIII蛋白的局部递送，例如局部施用，可以例如通过喷雾、灌注、双球囊导管、支架、结合入血管移植物或支架、用于涂覆球囊导管的水凝胶或其他成熟的方法来进行。在任何情况下，药物组合物应提供足以有效治疗受试者的量的FVIII蛋白。
在一些实施方案中，使用AAV载体向受试者递送感兴趣的多核苷酸(例如FVIII蛋白)。因此，本发明还提供了包含感兴趣的多核苷酸的AAV病毒颗粒(即病毒体)，其中病毒颗粒包装(即包裹(encapsidate))载体基因组、可选地AAV载体基因组。
在具体实施方案中，病毒体(virion)是包含感兴趣的异源多核苷酸(例如用于递送至细胞)的重组载体。因此，本发明可用于在体外、离体和体内将多核苷酸递送至细胞。在代表性的实施方案中，本发明的重组载体可有利地用于将多核苷酸递送或转移至动物(例如哺乳动物)细胞中。
任何异源核苷酸序列均可以由本发明的病毒载体递送。感兴趣的多核苷酸包括编码多肽、可选地治疗性(例如，用于医学或兽医用途)和/或免疫原性(例如疫苗)多肽的多核苷酸。
治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养不良蛋白(包括肌营养不良蛋白迷你基因(mini-gene)或微基因(micro-gene)的蛋白质产物，参见例如Vincent et al.，(1993)Nature Genetics 5：130；美国专利申请号2003017131；Wang etal.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：13714-9[迷你肌营养不良蛋白(min-dystrophin)]；Harper et al.，(2002)Nature Med.8：253-61[微肌营养不良蛋白(micro-dystrophin)])；迷你集聚蛋白(min-agrin)，层粘连蛋白-α2，肌钙蛋白(sarcoglycan)(α、β、γ或δ)，Fukutin相关蛋白，肌生成抑制素前肽，卵泡抑素，显性负性肌生成抑制素(dominant negative myostatin)，血管生成因子(例如VEGF、血管生成素-1或2)，抗凋亡因子(例如血红素加氧酶-1，TGF-β，促凋亡信号(pro-apoptotic signal)的抑制剂诸如胱天蛋白酶(caspase)、蛋白酶、激酶、死亡受体[例如CD-095]、细胞色素C释放调节剂、线粒体孔开放和肿胀的抑制剂)；激活素II型可溶性受体，抗炎多肽诸如Ikappa B显性突变体、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)、迷你抗肌萎缩蛋白相关蛋白(mini-utrophin)、针对肌生成抑制素或肌生成抑制素前肽的抗体或抗体片段，细胞周期调节剂，Rho激酶调节剂如Cethrin，其是修饰的细菌C3胞外酶[可从BioAxone Therapeutics，Inc.，Saint-Lauren，Quebec，加拿大获得]，BCL-xL，BCL2，XIAP，FLICEc-s，显性阴性半胱天冬酶(caspase)-8，显性阴性半胱天冬酶-9，SPI-6(参见例如美国专利申请号20070026076)，转录因子PGC-o1，Pinch基因，ILK基因和胸腺素4基因)，凝血因子(例如因子VIII、因子IX、因子X等)，促红细胞生成素，血管抑素，内皮抑制素，过氧化氢酶，酪氨酸羟化酶，细胞内和/或细胞外超氧化物歧化酶，瘦蛋白，LDL受体，脑啡肽酶(neprilysin)，脂蛋白脂肪酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，β-球蛋白，α-球蛋白，血影蛋白，α1-抗胰蛋白酶，甲基胞嘧啶结合蛋白2，腺苷脱氨酶，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，β-葡糖脑苷脂酶，鞘磷脂酶，溶酶体氨基己糖苷酶A，支链酮酸脱氢酶，RP65蛋白，细胞因子(例如α-干扰素，β-干扰素，干扰素-γ，白介素-1至-14，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，淋巴毒素等)，肽生长因子，神经营养因子和激素(例如生长激素(somatotropin)，胰岛素，包括IGF-1和IGF-2的胰岛素样生长因子，GLP-1，血小板源性生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，神经营养因子-3和-4，脑源性神经营养因子，胶质衍生生长因子，转化生长因子-α和-β等)，骨形态发生蛋白(包括RANKL和VEGF)，溶酶体蛋白，谷氨酸受体，淋巴因子，可溶性CD4，Fc受体，T细胞受体，ApoE，ApoC，蛋白磷酸酶抑制剂1的抑制剂1(I-1)，受磷酸蛋白(phospholamban)，serca2a，溶酶体酸α-葡萄糖苷酶，α-半乳糖苷酶A，Barkct，β2-肾上腺素能受体，β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)，磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)，calsarcin，受体(例如，肿瘤坏死生长因子-α可溶性受体)，抗炎因子如IRAP、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、ECF-SOD、激肽释放酶、胸腺素-β4、缺氧诱导型转录因子[HIF]，血管生成因子，S 100A1，小白蛋白(parvalbumin)，6型腺苷基环化酶，影响G蛋白偶联受体激酶2型敲除的分子(如截短的组成型活性bARKct)；受磷蛋白抑制或显性阴性分子如受磷蛋白S16E，单克隆抗体(包括单链单克隆抗体)或自杀基因产物(例如胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子如TNF-α)，和在有需要的受试者中具有治疗效果的任何其它多肽。
编码多肽的异源核苷酸序列包括编码报道多肽(例如酶)的那些。报道多肽是本领域已知的，包括但不限于荧光蛋白(例如EGFP、GFP、RFP、BFP、YFP或dsRED2)，产生可检测产物的酶，诸如荧光素酶(例如来自Gaussia、Renilla或Photinus)，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶，碱性磷酸酶，和氯霉素乙酰转移酶基因，或可直接检测的蛋白质。几乎任何蛋白质都可以通过使用例如该蛋白质的特异性抗体来直接检测。Sambrook and Russell(2001)，Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.以及Ausubel et al.(1992)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(包括定期更新)中公开了适用于真核细胞的阳性或阴性选择的其他标记(和相关抗生素)。
可替代地，异源核酸可以编码功能性RNA，例如反义寡核苷酸、核酶(例如美国专利号5,877,022中所述)、影响剪接体介导的转拼(trans-splicing)的RNA(参见Puttaraju etal.，(1999)Nature Biotech.17：246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702)、干扰RNA(RNAi)，包括介导基因沉默的小干扰RNA(siRNA)(参见Sharp et al.，(2000)Science287：2431)、微RNA或其他非翻译的“功能性”RNA，诸如“向导”RNA(Gorman et al.，(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：4929；Yuan et al.的美国专利号5,869,248)等等。示例性的非翻译RNA包括针对多重耐药性(MDR)基因产物的RNAi或反义RNA(例如用于治疗肿瘤和/或向心脏给药以防止化学疗法带来的损害)，针对肌生长抑制素的RNAi或反义RNA(Duchenne或Becker肌营养不良症)，针对VEGF或肿瘤免疫原(包括但不限于本文具体描述的那些肿瘤免疫原)的RNAi或反义RNA(用于治疗肿瘤)，针对突变的肌营养不良蛋白的RNAi或反义寡核苷酸(Duchenne或Becker肌营养不良症)，针对乙型肝炎表面抗原基因的RNAi或反义RNA(以预防和/或治疗乙型肝炎感染)，针对HIV tat和/或rev基因的RNAi或反义RNA(以预防和/或治疗HIV)，和/或针对来自病原体(以保护受试者免受病原体)或缺陷型基因产物(以预防或治疗疾病)的任何其他免疫原的RNAi或反义RNA。针对上述靶或任何其它靶的RNAi或反义RNA也可用作研究试剂。
如本领域已知的，可以使用反义核酸(例如DNA或RNA)和抑制性RNA(例如微RNA和RNAi诸如siRNA或shRNA)序列，以在患有起因于肌营养不良蛋白基因缺陷的肌营养不良的患者中诱导“外显子跳过”。因此，异源核酸可以编码诱导合适外显子跳过的反义核酸或抑制性RNA。本领域技术人员将理解，外显子跳过的具体方法取决于肌营养不良蛋白基因的潜在缺陷的性质，并且许多这样的策略在本领域中是已知的。示例性反义核酸和抑制性RNA序列靶向一种或多种肌营养不良蛋白外显子(例如外显子19或23)的上游分支点和/或下游供体剪接位点和/或内部剪接增强子序列。例如，在特定实施方案中，异源核酸编码针对肌营养不良蛋白基因的外显子19或23的上游分支点和下游剪接供体位点的反义核酸或抑制性RNA。这样的序列可以并入到递送修饰的U7snRNA和反义核酸或抑制性RNA的AAV载体中(参见例如Goyenvalle et al.，(2004)Science 306：1796-1799)。作为另一个策略，修饰的U1snRNA可以与互补于肌营养不良蛋白外显子(例如外显子19或23)的上游和下游剪接位点的siRNA、微RNA或反义RNA一起并入到AAV载体中(参见例如Denti et al.，(2006)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103：3758-3763)。此外，反义核酸和抑制性RNA可以靶向外显子19、43、45或53内的剪接增强子序列(参见例如美国专利号6,653,467；美国专利号6,727,355；和美国专利号6,653,466)。
核酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA-蛋白复合物。核酶具有特异性催化结构域，该特异性催化结构域具有内切核酸酶活性(Kim et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8788；Gerlach et al.，(1987)Nature 328：802；Forsterand Symons，(1987)Cell 49：211)。例如，大量的核酶以高度的特异性加速磷酯转移反应，通常仅切割寡核苷酸底物中多种磷酯中的一种(Michel and Westhof，(1990)J.Mol.Biol.216：585；Reinhold-Hurek and Shub，(1992)Nature 357：173)。这种特异性已被归因于如下需要：在化学反应之前，底物通过特异性碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合。
核酶催化主要作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的一部分而被观察到(Joyce，(1989)Nature 338：217)。例如，美国专利号5,354,855报道，某些核酶可以充当核酸内切酶，其序列特异性大于已知核糖核酶的序列特异性，并且接近DNA限制酶的序列特异性。因此，序列特异性核酶介导的核酸表达的抑制可能特别适用于治疗性应用(Scanlon etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10591；Sarver et al.，(1990)Science 247：1222；Sioud et al.，(1992)J.Mol.Biol.223：831)。
微RNA(mir)是可以通过控制mRNA的稳定性而调节多种基因表达的天然细胞RNA分子。特定的微RNA的过度表达或减少，可用于治疗功能障碍，并且已经显示在许多疾病状态和疾病的动物模型中是有效的(参见例如Couzin，(2008)Science 319：1782-4)。嵌合AAV可用于将微RNA递送到细胞、组织和受试者中，以用于治疗遗传和获得性疾病，或用于增强某些组织的功能性和促进生长。例如，mir-1、mir-133、mir-206和/或mir-208可用于治疗心脏和骨骼肌疾病(参见例如Chen et al.，(2006)Genet.38：228-33；van Rooij et al.，(2008)Trends Genet.24：159-66)。微RNA也可用于在基因递送后调节免疫系统(Brown etal.，(2007)Blood 110：4144-52)。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”(包括“反义RNA”)是指与指定的DNA或RNA序列互补且特异性杂交的核酸。可以根据常规技术制备反义寡核苷酸和编码该反义寡核苷酸的核酸。参见例如Tullis的美国专利号5,023,243；Pederson et al的美国专利号5,149,797。
本领域技术人员将理解，只要序列相似性程度足以使反义核苷酸序列与其靶标(如上所定义)特异性杂交并且减少蛋白质产物的产生(例如减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)，该反义寡核苷酸不必与靶序列完全互补。
为了确定杂交的特异性，这种寡核苷酸与靶序列的杂交可以在降低的严格性、中等严格性或甚至严格条件下进行。用于实现降低的、中等和严格杂交条件的合适条件如本文所述。
可替代地说，在具体实施方案中，本发明的反义寡核苷酸与靶序列的互补序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更高的序列一致性，并且减少蛋白质产物(如上所定义)的生产。在一些实施方案中，与靶序列相比，反义序列含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。
本文其他地方更详细地描述确定核酸序列一致性百分比的方法。
反义寡核苷酸的长度不是关键的，只要它与预定的靶特异性杂交并减少蛋白质产物(如上所定义)的产生并且可以根据常规程序来确定。通常，反义寡核苷酸的长度为至少约8个、10个或12个或15个核苷酸和/或小于约20、30、40、50、60、70、80、100或150个核苷酸。
RNA干扰(RNAi)是减少蛋白质产物产生的另一种有用的方法(例如shRNA或siRNA)。RNAi是转录后基因沉默的机制，其中对应于感兴趣的靶序列的双链RNA(dsRNA)被引入到细胞或生物体中，导致相应mRNA的降解。Sharp et al.，(2001)Genes Dev 15：485-490；和Hammond et al.，(2001)Nature Rev.Gen.2：110-119)中综述了RNAi实现基因沉默的机制。在重新获得基因表达之前，RNAi效应持续多个细胞分裂。因此，RNAi是在RNA水平上进行靶向敲除或“敲低(knockdown)”的有力方法。已证明，RNAi在人类细胞包括人类胚胎肾和HeLa细胞中是成功的(参见例如Elbashir et al.，Nature(2001)411：494-8)。
在哺乳动物细胞中使用RNAi的初步尝试，产生了涉及对dsRNA分子响应的PKR的抗病毒防御机制(参见例如Gil et al.，(2000)Apoptosis 5：107)。已经证明，被称为“短干扰RNA”(siRNA)的约21个核苷酸的短合成dsRNA，在哺乳动物细胞中可以介导沉默而不引发抗病毒反应(参见例如Elbashir et al.，Nature(2001)411：494-8；Caplen et al.，(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98：9742)。
RNAi分子(包括siRNA分子)可以是短的发夹RNA(shRNA；参见Paddison et al.，(2002)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：1443-1448)，其被认为是通过RNase III样酶Dicer的作用在细胞中加工成20-25链节的siRNA分子。shRNA通常具有茎环结构，其中两个反向重复序列通过环出(loop out)的短间隔物序列分开。已经报道了具有长度为3至23个核苷酸的环的shRNA。环序列通常并不重要。示例性环序列包括以下基序：AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。
RNAi可以进一步包含含有有义和反义区的环状分子，其两侧之一有两个环区，以便在所述有义和反义区之间形成dsRNA时形成“哑铃”形结构。该分子可以在体外或体内处理，以释放dsRNA部分，例如siRNA。
国际专利公开WO 01/77350描述了一种载体，其用于双向转录以在真核细胞中产生异源序列的有义和反义转录本。该技术可用于产生根据本发明使用的RNAi。
Shinagawa et al.，(2003)Genes Dev.17：1340报道了从CMV启动子(pol II启动子)表达长dsRNA的方法，该方法也适用于组织特异性pol II启动子。同样地，Xia et al.，(2002)Nature Biotech.20：1006的方法避免了poly(A)拖尾(tailing)并且可与组织特异性启动子结合使用。
生产RNAi的方法包括化学合成、体外转录、通过Dicer消化长dsRNA(体外或体内)、由递送载体体内表达、和由PCR衍生的RNAi表达盒体内表达(参见例如TechNotes 10(3)“Five Ways to Produce siRNAs，”来自Ambion，Inc.，Austin TX；可在www.ambion.com上获得)。
设计siRNA分子的指南是现有的(参见例如来自Ambion，Inc.，Austin TX的文献；可在www.ambion.com上获得)。在具体实施方案中，siRNA序列具有约30-50％的G/C含量。此外，如果使用RNA聚合酶III来转录RNA，通常可避免大于四个T或A残基的长延伸。在线siRNA靶标探测器(target finder)可例如从Ambion，Inc.(www.ambion.com)获得、通过怀特黑德生物医学研究所(www.jura.wi.mit.edu)获得或从Dharmacon Research，Inc.(www.dharmacon.com)获得。
RNAi分子的反义区域可以与靶序列完全互补，但只要其与靶序列(如上定义的)特异性杂交并减少蛋白质产物的产生(例如减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)，就不需要完全互补。在一些实施方案中，这样的寡核苷酸与靶序列的杂交可以在如上所定义的降低的严格性、中等严格性或甚至严格条件下进行。
在其它实施方案中，RNAi的反义区域与靶序列的互补序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更高的序列一致性，并降低蛋白质产物的产生(例如降低至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)。在一些实施方案中，与靶序列相比，反义区含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。通常在dsRNA的末端比在中心部分更好地耐受错配。
在具体实施方案中，RNAi通过两个单独的有义和反义分子之间的分子间络合形成。RNAi包含由两个分开的链之间的分子间碱基对形成的ds区。在其它实施方案中，RNAi包含通过在包含有义和反义区的单个核酸分子内的分子内碱基配对形成的ds区域，通常为反向重复(例如shRNA或其他茎环结构，或环状RNAi分子)。RNAi还可以包含有义区和反义区之间的间隔区。
通常RNAi分子是高选择性的。如果需要，本领域技术人员通过例如使用BLAST(可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上获得)，搜索相关数据库来识别与其它已知序列不具有实质序列同源性的RNAi序列，能够容易地排除可能干扰除靶标以外的核酸表达的候选RNAi。
用于生产RNAi的试剂盒可从例如New England Biolabs，Inc.和Ambion，Inc商购。
重组病毒载体还可以包含异源核苷酸序列，其与宿主染色体上的位点共享同源性并与其重组。该方法可用于校正宿主细胞中的遗传缺陷。
本发明还提供表达免疫原性多肽的重组病毒载体，所述免疫原性多肽例如用于疫苗接种。异源核酸可以编码本领域已知的任何感兴趣的免疫原，包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。可替代地，免疫原可以存在于病毒衣壳(例如并入其中)中或与病毒衣壳连接(例如通过共价修饰)。
细小病毒作为疫苗的用途是本领域已知的(参见例如Miyamura et al.，(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：8507；Young et al.的美国专利号5,916,563，Mazzara etal.的美国专利号5,905,040，美国专利号5,882,652，Samulski et al.的美国专利号5,863,541；它们的公开内容通过引用整体并入本文)。抗原可以存在于病毒衣壳中。可替代地，抗原可以由引入到重组载体基因组中的异源核酸表达。
免疫原性多肽或免疫原可以是适于保护受试者免受疾病的任何多肽，所述疾病包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和病毒性疾病。例如，免疫原可以是正粘病毒免疫原(例如流感病毒免疫原，如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因、或马流感病毒免疫原)，或慢病毒免疫原(例如马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，诸如HIV或SIV包膜GP160蛋白、HIV或SIV基质/衣壳蛋白、以及和HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原也可以是沙粒病毒免疫原(例如拉沙热病毒免疫原，如拉萨热病毒核衣壳蛋白基因和拉萨热病包膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如牛痘，如牛痘L1或L8基因)、黄病毒免疫原(例如黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，如NP和GP基因)、布尼亚病毒免疫原(例如RVFV、CCHF和SFS病毒)、或冠状病毒免疫原(例如感染性人类冠状病毒免疫原，如人类冠状病毒包膜糖蛋白基因、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽传染性支气管炎病毒免疫原、或严重急性呼吸综合征(SARS)免疫原如S[S1或S2]、M、E或N蛋白或其免疫原性片段)。免疫原可进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)免疫原、或本领域已知的任何其它疫苗免疫原。
可替代地，免疫原可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。可选地，肿瘤或癌抗原被表达在癌细胞的表面上。示例性的癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A.Rosenberg，(1999)Immunity10：281)中。说明性的癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、半胱天冬酶(caspase)-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑色素瘤肿瘤抗原(Kawakami et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3515；Kawakami et al.，(1994)J.Exp.Med.，180：347；Kawakami et al.，(1994)Cancer Res.54：3124)包括MART-1(Coulie et al.，(1991)J.Exp.Med.180：35)、gp100(Wick et al.，(1988)J.Cutan.Pathol.4：201)和MAGE抗原(MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3)(Van der Bruggen et al.，(1991)Science，254：1643)、CEA、TRP-1；TRP-2；P-15和酪氨酸酶(Brichard et al.，(1993)J.Exp.Med.178：489)；HER-2/neu基因产物(美国专利号4,968,603)；CA 125；HE4；LK26；FB5(内皮唾液酸蛋白)；TAG 72；AFP；CA19-9；NSE；DU-PAN-2；CA50；Span-1；CA72-4；HCG；STN(唾液酸基Tn抗原)；c-erbB-2蛋白；PSA；L-CanAg；雌激素受体；乳脂球蛋白；p53肿瘤抑制蛋白(Levine，(1993)Ann.Rev.Biochem.62：623)；粘蛋白抗原(国际专利公开WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头瘤病毒抗原；和与下列癌症相关的抗原：黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌、食管癌、头颈癌等(参见例如Rosenberg，(1996)Annu.Rev.Med.47：481-91)。
可替代地，异源核苷酸序列可以编码期望在体外、离体或体内在细胞中生产的任何多肽。例如，可以将病毒载体引入到培养的细胞中以及从中分离出的表达的蛋白质产物中。
本领域技术人员将理解，感兴趣的异源多核苷酸可以与适当的控制序列可操作地相关联。例如，异源核酸可以与表达控制元件(诸如转录/翻译控制信号、复制起点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等)可操作地相关联。
本领域技术人员将进一步理解，根据所需的水平和组织特异性表达，可以使用各种启动子/增强子元件。取决于所需的表达模式，启动子/增强子可以是组成型或诱导型的。启动子/增强子可以是天然的或外源的，并且可以是天然的或合成的序列。“外源的(forforeign)”是指在被引入转录起始区的野生型宿主中没有发现所述转录起始区。
启动子/增强子元件对靶细胞或待治疗的受试者可以是天然的，和/或对于异源核酸序列是天然的。通常选择启动子/增强子元件，使其在感兴趣的靶细胞中起作用。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强元件可以是组成型或诱导型的。
诱导表达控制元件通常用于需要提供对异源核酸序列表达的调节的那些应用中。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或组织优选性启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选性(包括心脏、骨骼和/或平滑肌)、神经组织特异性或优选性(包括脑特异性)、眼睛(包括视网膜特异性和角膜特异性)、肝特异性或优选性、骨髓特异性或优选性、胰腺特异性或优选性、脾特异性或优选性、以及肺特异性或优选性启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中将异源核酸序列转录并在靶细胞中翻译的实施方案中，通常将特异性起始信号用于插入的蛋白质编码序列的有效翻译。可以包括ATG起始密码子和相邻序列的这些外源翻译控制序列可以是多种来源的(天然的和合成的)。
本发明还提供了生产本发明的病毒载体的方法。在代表性的实施方案中，本发明提供了一种生产重组病毒载体的方法，该方法包含在体外向细胞提供(a)模板，该模板包含(i)感兴趣的多核苷酸和(ii)足以将AAV模板封装入病毒颗粒的包装信号序列(例如一个或多个(例如两个)末端重复序列，例如AAV末端重复序列)，和(b)足以使模板复制和将模板装入到病毒颗粒中的AAV序列(例如AAV rep和AAV cap序列)。在使得在细胞中生产包含包装在衣壳内的模板的重组病毒颗粒的条件下，提供所述模板和AAV复制和衣壳序列。该方法还可以包括从所述细胞收集病毒颗粒的步骤。可以从培养基和/或通过裂解细胞来收集病毒颗粒。
在一个说明性的实施方案中，本发明提供了一种生产包含AAV衣壳的rAAV颗粒的方法，该方法包含：在体外向细胞提供编码AAV衣壳的核酸、AAV rep编码序列、包含感兴趣的多核苷酸的AAV载体基因组和用于产生生产性AAV感染的辅助子(helper)功能；和允许组装包含AAV衣壳并且包裹AAV载体基因组的AAV颗粒。
细胞通常是允许AAV病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适的细胞，例如哺乳动物细胞。同样合适的是，提供从复制缺陷型辅助病毒缺失的功能的反式互补包装细胞系(trans-complementing packaging cell line)，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞(trans-complementing cell)。
可以通过本领域已知的任何方法提供AAV复制和衣壳序列。目前的协议通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。不需要一起提供AAV复制和包装序列，尽管这样做可能很方便。AAV rep和/或cap序列可以由任何病毒载体或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂交腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如插入到缺失的腺病毒载体的E1a或E3区中)。也可以使用EBV载体来表达AAV cap和rep基因。该方法的一个优点是，EBV载体是附加型的(episomal)，但是在整个连续的细胞分裂中将保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定地整合到细胞中，指定为基于EBV的核附加体(episome))。
作为另一替代方案，细胞内可稳定地携带rep/cap序列(附加型或整合的)。
通常，AAV rep/cap序列不会被AAV包装序列侧接(例如，AAV ITR)，以防止这些序列的拯救(rescue)和/或包装。
可以使用本领域已知的任何方法将模板(例如rAAV载体基因组)提供给细胞。例如，模板可以由非病毒(例如质粒)或病毒载体提供。在具体实施方案中，模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如插入到缺失的腺病毒的E1a或E3区域中)。作为另一说明，Palombo etal.，(1998)J.Virol.72：5025描述了携带侧翼为AAV ITR的报告基因的杆状病毒载体。也可以使用EBV载体递送模板，如上文关于rep/cap基因所述。
在另一代表性实施方案中，模板由复制rAAV病毒提供。在又其他实施方案中，AAV原病毒稳定地整合到细胞的染色体中。
为了获得最大的病毒滴度，通常向细胞提供对生产性AAV感染重要的辅助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。可替代地，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如作为携带有效AAV生产所需的所有辅助基因的非感染性腺病毒迷你质粒(miniplasmid)，如Ferrari et al.，(1997)Nature Med.3：1295以及美国专利号6,040,183和6,093,570所述。
此外，辅助病毒功能(helper virus function)可以由包装细胞提供，该包装细胞具有整合在染色体中的或维持为稳定的染色体外元件的辅助基因(helper gene)。在代表性的实施方案中，辅助病毒序列不能包装在AAV病毒体中，例如不是侧接有AAV ITR。
本领域技术人员将理解，在单个辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如腺病毒序列)可能是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体，但可选地是包含AAV rep/cap基因的杂交腺病毒或杂交疱疹病毒。
在一个具体实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该载体还含有rAAV模板。可以将AAV rep/cap序列和/或rAAV模板插入到腺病毒的缺失区域(例如E1a或E3区域)中。
在另一个实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。rAAV模板作为质粒模板提供。
在另一个说明性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板被整合到细胞中作为原病毒。可替代地，rAAV模板由作为染色体外元件保持在细胞内的EBV载体提供(例如作为“基于EBV的核附加体”，参见Margolski，(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158：67)。
在另一个示例性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助子(single adenovirus helper)提供。rAAV模板作为单独的复制病毒载体提供。例如，rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据上述方法，杂交腺病毒载体通常包含足以用于腺病毒复制和包装的腺病毒5’和3’顺式序列(即腺病毒末端重复和PAC序列)。AAV rep/cap序列和(如果存在的话)rAAV模板被嵌入在腺病毒骨架中，并且被所述5’和3’顺式序列侧接，使得这些序列可以被包装到腺病毒衣壳中。如上所述，在代表性的实施方案中，腺病毒辅助序列(helper sequence)和AAV rep/cap序列不被AAV包装序列侧接(例如AAV ITR)，使得这些序列未被包装到AAV病毒体中。
疱疹病毒也可以用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码AAV rep蛋白的杂交疱疹病毒可有利地促进更可扩展的AAV载体的生产方案。已经描述了表达AAV-2rep和cap基因的杂交单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体(Conway et al.，(1999)Gene Therapy 6：986和WO 00/17377，它们的公开内容全部并入本文)。
作为另一种替代方案，可以使用杆状病毒载体在昆虫细胞中生产本发明的病毒载体，以递送rep/cap基因和rAAV模板，如Urabe et al.，(2002)Human Gene Therapy 13：1935-43所述。
生产AAV的其他方法使用稳定转化的包装细胞(参见例如美国专利号5,658,785)。
可以通过本领域已知的任何方法获得没有污染辅助病毒的AAV载体储料(stock)。例如，可以根据大小容易地区分AAV和辅助病毒。也可以基于对肝素底物的亲和力从辅助病毒中分离出AAV(Zolotukhin et al.，(1999)Gene Therapy 6：973)。在代表性的实施方案中，使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染辅助病毒不具有复制能力。作为另外的替代方案，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助子，因为只需要腺病毒早期基因表达来介导AAV病毒的包装。晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如ts100K和ts149腺病毒突变体)。
本发明的包装方法可用于产生高滴度的病毒颗粒储料。在具体的实施方案中，所述病毒储料(stock)具有的滴度为至少约105个转导单位(tu)/ml，至少约106tu/ml，至少约107tu/ml，至少约108tu/ml，至少约109tu/ml或至少约1010tu/ml。
在具体实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含本发明的病毒载体和可选的其它医疗剂、药剂、稳定剂、缓冲液、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，载体通常是液体。对于其它给药方式，载体可以是固体或液体。对于吸入给药，载体将是可呼吸的，并且将优选为固体或液体颗粒形式。
术语“药学上可接受的”是指不具有毒性或不因其它原因而不期望的物质，即可将物质给药于受试者而不引起任何不期望的生物学效应。
本发明的一个方面是一种在体外将感兴趣的多核苷酸转移至细胞的方法。根据适用于特定靶细胞的标准转导方法，可以以适当的感染多重性将病毒载体引入到细胞中。用于给药的病毒载体或衣壳的滴度可以根据靶细胞类型和数量以及特定的病毒载体或衣壳而变化，并且本领域技术人员无需过多的实验即可确定。在具体实施方案中，向细胞中引入至少约103个传染性单位，更优选地至少约105个传染性单位。
可以引入病毒载体的细胞可以是任何类型的，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是，脑细胞如神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞)，肺细胞，眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)，上皮细胞(例如肠和呼吸上皮细胞)，骨骼肌细胞(包括成肌细胞、肌管和肌纤维)，隔膜肌细胞，树突状细胞，胰腺细胞(包括胰岛细胞)，肝细胞，胃肠道细胞(包括平滑肌细胞、上皮细胞)，心脏细胞(包括心肌细胞)，骨细胞(例如骨髓干细胞)，造血干细胞，脾细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，内皮细胞，前列腺细胞，关节细胞(包括例如软骨、半月板、滑膜和骨髓)，生殖细胞等。可替代地，细胞可以是任何祖细胞。作为另外的选择，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为另一种替代方案，细胞可以是癌症或肿瘤细胞(如上所述的癌症和肿瘤)。此外，如上所述，细胞可以来自任何来源的物种。
病毒载体可以在体外被引入细胞中，目的是将修饰的细胞给药于受试者。在具体实施方案中，已从受试者中移出细胞，将病毒载体导入其中，然后将细胞置换回受试者中。从受试者中取出细胞进行体外治疗并且然后引入回受试者的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346)。可替代地，将重组病毒载体引入到来自另一受试者的细胞中，引入到培养的细胞，或引入到来自任何其它适合来源的细胞中，并将所述细胞给药于有需要的受试者。
用于离体基因治疗的合适的细胞如上所述。施用于受试者的细胞的剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞类型、细胞表达的核酸、给药方式等而变化。典型地，将处于药学上可接受的载体中每剂量至少约102至约108或约103至约106个细胞给药。在具体实施方案中，用病毒载体转导的细胞以有效量与药物载体组合施用于受试者。
在一些实施方案中，可以给药已经用病毒载体转导的细胞以引发针对递送的多肽的免疫原性应答(例如表达为转基因或在衣壳中)。通常，给药一定量的表达有效量的多肽的细胞与药学上可接受载体的组合。可选地，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上所定义)。只要给药免疫原性多肽的益处超过其任何缺点，所赋予的保护程度就不需要是完整的或永久的。
本发明的另一方面是一种将本发明的病毒载体向受试者给药的方法。在具体的实施方案中，所述方法包含一种向动物受试者递送感兴趣的多核苷酸的方法，该方法包含：向动物受试者给药有效量的根据本发明的病毒载体。可以通过本领域已知的任何方法向有此需要的人类受试者或动物给药本发明的病毒载体。可选地，以有效剂量递送处于药学上可接受的载体(carrier)中的病毒载体(vector)。
本发明的病毒载体可以进一步给药于受试者以引发免疫原性应答(例如作为疫苗)。通常，本发明的疫苗包含与药学上可接受的载体组合的有效量的病毒。可选地，剂量足以产生保护性免疫应答(如上所定义)。只要给药免疫原性多肽的益处超过其任何缺点，所赋予的保护程度就不需要是完全的或永久的。受试者和免疫原如上所述。
要给药于受试者的病毒载体的剂量将取决于给药方式、待治疗的疾病或病症、个体受试者的状况、特定病毒载体和待递送的核酸，并且可以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014、1015个转导单位或更高的病毒滴度，优选约107或108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单位，还更优选约1012个转导单位。
在具体实施方案中，可以使用多于一次给药(例如两次、三次、四次或更多次给药)以在各个间隔的时间段内(例如每天、每周、每月、每年等)实现期望水平的基因表达。
示例性给药方式包括口服、直肠、经粘膜、局部、鼻内、吸入(例如通过气雾剂)、颊内(例如舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、肌肉内[包括向骨骼、隔膜和/或心肌给药]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如皮肤和粘膜表面，包括气道表面和透皮给药)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如肝、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。也可以向肿瘤给药(例如在肿瘤或淋巴结中或附近)。任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗的病症的性质和严重程度以及正在使用的特定载体的性质。
通过递送包含病毒载体的贮库(depot)也可以实现向这些组织中任一种的递送，所述贮库可以被植入组织中或所述组织可以与包含病毒载体的膜或其它基质接触。这种可植入基质或底物的例子描述于美国专利号7,201,898中。
本发明可用于治疗组织或器官的病症。可替代地，可以实施本发明以将核酸递送至组织或器官，所述组织或器官被用作用于生产通常在血液中循环或全身递送至其他组织以治疗病症(例如代谢紊乱，诸如糖尿病(例如胰岛素)、血友病(例如因子IX或因子VIII)、或溶酶体储存障碍(如高雪氏病[葡糖脑苷脂酶]、庞培病[溶酶体酸α-葡萄糖苷酶]或法布里病[α-半乳糖苷酶A])或糖原贮积病(诸如庞培病[溶酶体酸α葡萄糖苷酶])的蛋白质产物(例如酶)或非翻译RNA(例如RNAi、微RNA、反义RNA)的平台。用于治疗代谢紊乱的其它合适的蛋白质如上所述。
可注射剂可以以常规形式制剂，作为液体溶液或悬浮液，适于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或作为乳液。可替代地，可以以局部而非全身方式给药病毒载体，例如以贮库或缓释制剂的形式。此外，可以将病毒载体递送干燥至手术可植入性基质中，例如骨移植物替代物、缝合线，支架等(例如如美国专利7,201,898中所述)。
适于口服给药的药物组合物可以以离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂、锭剂或片剂，它们各自含有预定量的本发明组合物；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为油包水或油包水乳液。口服递送可以通过使本发明的病毒载体与能够耐受动物肠道中消化酶的降解的载体复合来进行。这种载体(carrier)的例子包括本领域已知的塑料胶囊或片剂。通过任何合适的药学方法制备这些制剂，包括使组合物和合适的载体(carrier)结合的步骤(载体可含有一种或多种如上所述的辅助成分)。通常，通过将组合物与液体或细分的固体载体或两者均匀紧密地混合，然后如有必要使所得混合物成型，从而制备根据本发明实施方案的药物组合物。例如，可以通过压缩或模制含有所述组合物和可选地一种或多种辅助成分的粉末或颗粒来制备片剂。通过在适合的机器中压缩自由流动形式的组合物(诸如可选地混合有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂的粉末或颗粒)以制备压缩片剂。模制片剂是通过在合适的机器中模制用惰性液体粘合剂润湿的粉末化合物来制备的。
适合于口腔(舌下)给药的药物组合物包括在调味基料(base)中包含本发明组合物的锭剂，所述调味基料通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；以及在惰性基料如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含所述组合物的软锭剂(pastilles)。
适用于肠胃外给药的药物组合物可包含本发明组合物的无菌水性和非水性注射液，该制剂可选地与预期接受者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使得组合物与预期接受者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳液可以包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外运载体(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或固定油(fixed oil)。静脉内运载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
组合物可以存在于单位/剂量或多剂量容器中，例如在密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体(carrier)，例如盐水或注射用水。
可以由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。例如，可以提供在密封容器中的单位剂型的本发明的可注射的稳定的无菌组合物。可以以冻干物的形式提供组合物，该冻干物可以与合适的药学上可接受的载体重构以形成适合于注射到受试者中的液体组合物。单位剂型可以为约1μg至约10g本发明的组合物。当组合物基本上不溶于水时，可以将足量的生理学可接受的乳化剂以足够的量包含在水性载体中以乳化所述组合物。一种这样的有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适用于直肠给药的药物组合物可以作为单位剂量栓剂提供。这些可以通过将组合物与一种或多种常规固体载体(例如可可油)混合然后使所得混合物成型来制备。
适用于局部施用于皮肤的本发明的药物组合物，可以采取软膏、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可以使用的载体(carrier)包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增强剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，可以通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂性试剂(例如DMSO)混合来进行局部递送。
适用于透皮给药的药物组合物可以是分散贴片的形式，其适于与受试者的表皮保持长时间的紧密接触。适合透皮给药的组合物也可以通过离子电渗法递送(参见例如Pharm.Res.3：318(1986))并且通常采用可选缓冲的本发明组合物的水溶液的形式。合适的制剂可以包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(pH6)或乙醇/水，并且可以含有0.1至0.2M的活性成分。
本文公开的病毒载体可以通过任何合适的方式给药至受试者的肺，例如通过给药由病毒载体组成的可呼吸颗粒的气溶胶悬浮液，受试者吸入所述气溶胶悬浮液。可吸入颗粒可以是液体或固体。如本领域技术人员已知的，包含病毒载体的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的装置产生，例如用压力驱动的喷雾器或超声雾化器产生。参见例如美国专利号4,501,729。包含病毒载体的固体颗粒的气溶胶，同样可以通过制药领域已知的技术用任何固体颗粒状药物气溶胶发生器来产生。
本发明的因子VIII蛋白的生产
许多表达载体可用于创建基因工程化细胞。一些表达载体被设计成在有利于选择的高表达细胞的各种条件下，在转染细胞扩增后，表达大量的重组蛋白。一些表达载体被设计用于表达大量的重组蛋白，而不需要在选择压力下进行扩增。本发明包括根据本领域标准方法生产基因工程化细胞，并且不依赖于任何特异性表达载体或表达系统的使用。
为了产生基因工程化细胞以产生大量的FVIII蛋白，用含有编码所述蛋白的多核苷酸(例如cDNA)的表达载体转染细胞。在一些实施方案中，用选择的共转染的酶表达FVIII蛋白，该酶导致FVIII蛋白在给定细胞系统中发生适当的翻译后修饰。
细胞可以来自多种来源，但在其它方面，可以是用含有编码FVIII蛋白的核酸分子(例如cDNA)的表达载体转染的细胞。
除非另有说明，本发明的实践采用本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。在文献中充分说明了这些技术。参见例如Sambrook，et al.，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.NGlover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)，特别为第154和155卷(分别由Wu and Grossman以及Wu编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos编辑，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology，Mayerand Walker编辑(Academic Press，London，1987)；Scopes，Protein Purification： Principles and Practice，第2版，1987(Springer-Verlag，N.Y.)；和Handbook of Experimental Immunology第I-IV卷(D.M.Weir and C.C.Blackwell编辑，1986)。本说明书中引用的所有专利、专利申请和出版物的全部内容通过引用并入本文。
基因工程技术
通过基因工程生产克隆基因、重组DNA、载体、转化细胞、蛋白质和蛋白质片段是众所周知的。参见例如Bell et al.的美国专利号4,761,371第6栏第3行至第9栏第65行；Clark et al.的美国专利号4,877,729第4栏第38行至第7第6行；Schilling的美国专利号4,912,038第3栏第26行至第14栏第12行；和Wallner的美国专利号4,879,224第6栏第8行至第8栏第59行。
载体(vector)是可复制的DNA构建体。载体在本文中用于扩增编码FVIII蛋白的核酸和/或表达编码FVIII蛋白的核酸。表达载体是可复制的核酸构建体，其中编码FVIII蛋白的核苷酸序列可操作地连接到合适的控制序列，该控制序列能够在合适的宿主细胞中实现核苷酸序列的表达以产生FVIII蛋白。对这种控制序列的需要将根据所选择的宿主细胞和所选择的转化方法而变化。通常，控制序列包括转录启动子、用于控制转录的可选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。
载体包含质粒、病毒(例如AAV、腺病毒、巨细胞病毒)、噬菌体和可整合的DNA片段(即可通过重组整合到宿主细胞基因组中的片段)。载体可以独立于宿主细胞基因组复制并起作用(例如通过瞬时表达)，或可以整合入宿主细胞基因组本身(例如，稳定整合)。表达载体可以含有启动子和RNA结合位点，所述启动子和RNA结合位点可操作地连接到要表达的核酸分子并且可在宿主细胞和/或生物体中操作。
当DNA区域或核苷酸序列在功能上彼此相关时，它们被可操作地连接或可操作地相关联。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则启动子可操作地连接到该编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以允许编码序列翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接到该编码序列。
合适的宿主细胞包括原核生物、酵母或更高等级的真核细胞如哺乳动物细胞和昆虫细胞。衍生自多细胞生物体的细胞是重组FVIII蛋白合成的特别合适的宿主，并且特别优选哺乳动物细胞。这种细胞在细胞培养中的增殖已经成为常规程序(Tissue Culture，Academic Press，Kruse and Patterson，编辑(1973))。有用的宿主细胞系的例子是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和WI138、HEK 293、BHK、COS-7、CV和MDCK细胞系。这种细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制起点、位于编码要表达的FVIII蛋白的核苷酸序列上游并与之可操作地相关联的启动子、以及核糖体结合位点、RNA剪接位点(如果使用含内含子基因组DNA)、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。在一个实施方案中，可以使用美国专利号5,888,809的表达系统在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达，该专利通过引用以其全部内容并入本文。
在转化脊椎动物细胞中使用的表达载体中的转录和翻译控制序列通常由病毒源提供。非限制性例子包括衍生自多瘤病毒、腺病毒2和猿猴病毒40(SV40)的启动子。参见例如美国专利号4,599,308。
可以通过载体构建以包括外源性来提供复制起点，诸如可以来源于SV 40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)源，或可以由宿主细胞染色体复制机制提供复制起点。如果载体被整合到宿主细胞染色体中，该宿主细胞染色体通常就足够了。
除了使用含有病毒复制起点的载体，还可以通过使用选择性标记和编码FVIII蛋白的核酸分子共转化的方法来转化哺乳动物细胞。合适的选择性标记的非限制性例子是二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸苷激酶。美国专利号4,399,216中进一步描述了这种方法，其通过引用以全部内容并入本文。
适用于改编以在重组脊椎动物细胞培养中合成FVIII蛋白的其他方法包括Gething et al.Nature 293：620(1981)；Mantei et al.Nature 281：40；和Levinson etal.，EPO申请号117,060A和117,058A中描述的那些方法，它们每一个的全部内容均通过引用并入本文。
宿主细胞诸如昆虫细胞(例如培养的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞)和表达载体诸如杆状病毒表达载体(例如来源于苜蓿尺蠖(Autographa californica)MNPV，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)MNPV，夏梢小卷蛾(Rachiplusia ou)MNPV或Galleria ouMNPV的载体)可以被用来实施本发明，如Smith et al的美国专利号4,745,051和4,879,236所述的。一般来说，杆状病毒表达载体包含含有要表达的核苷酸序列的杆状病毒基因组，所述核苷酸序列被插入到多角体蛋白基因中，在多角体转录起始信号到ATG起始位点范围内的位置处并且在杆状病毒多角体启动子的转录控制下。
原核生物宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如分别为大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)或杆状菌。高级真核细胞包括如本文所述的哺乳动物来源的已建立的细胞系。示例性细菌宿主细胞是大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌294(ATCC 31，446)。可以使用各种各样的合适的原核和微生物载体。通常使用pBR322转化大肠杆菌。在重组微生物表达载体中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang et al.Nature 275：615(1978)；和Goeddel et al.Nature 281：544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel etal.Nucleic Acids Res.8：4057(1980)和EPO申请公开号36,776)、以及tac启动子(De Boeret al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21(1983))。启动子和Shine-Dalgarno序列(用于原核宿主表达)可操作地连接到编码FVIII蛋白的核酸，即它们被定位以促进FVIII信使RNA从DNA的转录。
真核微生物如酵母培养物也可以用蛋白质编码载体转化(参见例如美国专利号4,745,057)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是低等真核宿主微生物中最常用的，尽管许多其他菌株通常也可用。酵母载体可以含有来自2微米酵母质粒的复制起点或自主复制的序列(ARS)、启动子、编码FVIII蛋白的核酸、多聚腺苷酸化和转录终止的序列、以及选择基因。示例性质粒是YRp7(Stinchcomb et al.Nature 282：39(1979)；Kingsman etal.Gene 7：141(1979)；Tschemper et al.Gene 10：157(1980))。酵母载体中合适的启动序列包括金属硫蛋白的启动子、3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman etal.J.Biol.Chem.255：2073(1980)或其他糖酵解酶的启动子(Hess et al.J.Adv.EnzymeReg.7：149(1968)；和Holland et al.Biochemistry 17：4900(1978))。R.Hitzeman etal.，EPO公开号73,657中进一步描述了适用于酵母表达的载体和启动子。
本发明的克隆编码序列可以编码任何物种来源的FVIII，包括小鼠、大鼠、狗、负鼠、兔、猫、猪、马、绵羊、母牛、豚鼠、负鼠、鸭嘴兽和人类，但优选编码人源性FVIII蛋白。可与本文公开的编码蛋白质的核酸杂交的编码FVIII的核酸也包括在内。可以在标准原位杂交测定中，在降低的严格性条件或甚至在严格条件下(例如由处于60℃或甚至70℃的0.3MNaCl、0.03M柠檬酸钠、0.1％SDS的洗涤严格度代表的严格条件)，进行此种序列与本文公开的编码FVIII蛋白的核酸的杂交。参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2版1989)Cold Spring Harbor Laboratory)。
根据本发明产生的FVIII蛋白可以通过已知方法在转基因动物中表达。参见例如美国专利号6,344,596，其全部内容通过引用并入本文。简而言之，转基因动物可以包括但不限于农场动物(例如猪、山羊、绵羊、母牛、马、兔等)、啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)和家养宠物(例如猫和狗)。在一些实施方案中，家畜如猪、绵羊、山羊和奶牛是特别优选的。
本发明的转基因动物是通过向单细胞胚胎中引入编码本发明的人类FVIII蛋白的合适的多核苷酸来产生的，其方式是使所述多核苷酸稳定地整合到成熟动物的种系细胞的DNA中并且以正常的孟德尔方式继承。本发明的转基因动物将具有在体液和/或组织中产生FVIII蛋白的表型。可以从这些流体和/或组织中取出FVIII蛋白并加工，例如用于治疗用途。(参见例如Clark et al.“Expression of human anti-hemophilic factor IX in themilk of transgenic sheep”Bio/Technology 7：487-492(1989)；Van Cott et al.“Haemophilic factors produced by transgenic livestock：abundance can enablealternative therapies worldwide”Haemophilia 10(4)：70-77(2004)，它们的全部内容通过引用并入本文)。
可以通过多种方式将DNA分子引入胚胎中，所述方式包括但不限于显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合或全能或多能干细胞的逆转录病毒感染。然后将转化的细胞引入胚胎并且并入其中以形成转基因动物。例如，L.M.Houdebine的Transgenic Animal Generation and Use，Harwood Academic Press，1997中描述了制作转基因动物的方法。使用胚胎或成年细胞系的核转移或克隆的方法也可以产生转基因动物，如例如Campbell etal.，Nature 380：64-66(1996)和Wilmut et al.，Nature 385：810-813(1997)中所描述的。另外，如美国专利号5,523,222中所描述的，可以使用利用细胞质注射DNA的技术。
可以通过引入包含FVIII编码序列的嵌合构建体来获得产生FVIII的转基因动物。获得转基因动物的方法是众所周知的。参见例如Hogan et al.，MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO，(Cold Spring Harbor Press 1986)；Krimpenfort et al.，Bio/Technology 9：88(1991)；Palmiter et al.，Cell 41：343(1985)，Kraemer et al.，GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO，(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985)；Hammer et al.，Nature 315：680(1985)；Wagner et al.，美国专利号5,175,385；Krimpenfort et al.，美国专利号5,175,384，Janne et al.，Ann.Med.24：273(1992)，Bremet al.，Chim.Oggi.11：21(1993)，Clark et al.，美国专利号5,476,995，它们的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可以使用在乳腺组织中具有“活性”的顺式作用调节区，因为在合成乳的生理条件下，启动子在乳腺组织中比在其它组织中更有活性。这些启动子包括但不限于短和长的乳清酸性蛋白质(WAP)，短和长α、β和κ酪蛋白，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(“BLG”)启动子。也可以根据本发明使用信号序列，其将表达的蛋白质直接分泌到其它体液中，特别是血液和尿液。这些序列的例子包括分泌的凝血因子的信号肽，包括FVIII、蛋白C和组织型纤溶酶原激活物的信号肽。
除了上面讨论的启动子之外，调节转录的有用序列是增强子、剪接信号、转录终止信号、聚腺苷酸化位点、缓冲序列、RNA加工序列和调节转基因表达的其他序列。
优选地，表达系统或构建体包含编码所需重组蛋白的核苷酸序列下游的3’非翻译区。该区域可增加转基因的表达。在这一方面，有用的3’非翻译区是提供poly A信号的序列。
合适的异源3’-非翻译序列可以衍生自例如SV40小t抗原、酪蛋白3’非翻译区或本领域熟知的其他3’非翻译序列。核糖体结合位点对于增加FVIII的表达效率也是重要的。同样地，调节FVIII的翻译后修饰的序列在本发明中是有用的。
已经描述了本发明，在下面的实施例中将更详细地解释本发明，这些实施例被包含在本发明中仅用于说明目的而不旨在限制本发明。
实施例1
合成肝特异性启动子
我们设计并完全合成了许多含有保守的基础启动子元件和转录起始位点的人工启动子。基础启动子(basal promoter)在其5’末端与许多肝特异性转录因子结合位点连接，以用于肝特异性表达。选择名为LXP3.3(图1)(SEQ ID NO：1)的启动子，原因在于其尺寸小(200bp)并且在人肝癌细胞系Huh7中，使用荧光素酶报道基因和转染实验在体外初步筛选具有高活性。
然后用包装在AAV9载体中的LacZ报告基因进一步测试LXP3.3启动子，所述AAV9载体在肝脏、心脏和肌肉等中具有广泛的组织向性(tissue tropism)。进行并行体内实验以将启动子活性和肝特异性与强的和肝特异性启动子甲状腺素结合球蛋白(TBG)进行比较，该启动子甲状腺素结合球蛋白(TBG)以前被报道为小型和大型动物模型中最强的肝特异性启动子之一。以两种不同剂量，将含有LXP3.3-LacZ或TBG-LacZ表达盒的AAV9载体通过尾静脉注射到C56/B6小鼠中。如图2A所示，肝脏和心脏的X-gal染色显示了两个启动子的强健肝脏表达并且缺乏心脏表达。组织匀浆的定量分析显示，尽管LXP3.3启动子大小仅为200bp，而TBG的大小为681bp，但这两种启动子实现了几乎相同的LacZ表达水平和对肝脏的组织特异性(图2B)。具体来说，定量LacZ酶活性分析显示，对于LXP3.3和TBG启动子，在肝脏中的基因表达比在心脏中的基因表达高出大于300倍。此外，在肝脏中，通过肝脏特异性启动子获得的LacZ酶活性，比通过普遍存在的CMV启动子获得的活性高出500倍(图2C)。另一方面，在心脏中，CMV启动子实现的LacZ表达接近高达肝特异性启动子的13倍(图2B)。结果表明，合成启动子LXP3.3在肝脏中具有高活性和特异性。
实施例2
合成启动子内含子盒
完全合成的启动子LXP3.3在其3’端连接到具有短的非天然外显子接合序列的VH4的小内含子。最初通过使用驱动BDD人类FVIII基因的弱启动子的体外转染实验来测试该内含子。VH4内含子的添加提供比不具有内含子的启动子更高的基因表达，并且还提供比通常使用的嵌合内含子CIN(Promega)更高的表达(图3)。因此，我们将LXP3.3启动子和VH4内含子与人工外显子接合序列相结合，并命名为LXP3.3I(SEQ ID NO：2)。为了测试其驱动FVIII表达的活性，我们将完全合成的人类BDD缺失的FVIII基因上游的启动子LXP3.3I插入(SEQID NO：3)，其随后是小聚腺苷酸化位点。随后，将整个基因表达盒(SEQ ID NO：4)克隆到具有用于载体DNA复制和载体基因组包装的两个AAV反向末端重复序列的AAV载体质粒骨架中(图4)。
为了在体外比较启动子活性，使用与SV40内含子连接的普遍存在的CMV启动子(通常使用的强力组合)来替代FVIII表达盒中的LXP3.3I。将质粒转染入人类肝癌细胞系Huh7后，用显色试剂盒测定FVIII活性。如图5中的转染实验所示，在细胞培养基中，LXP3.3I产生比CMV启动子更高的FVIII活性。此外，我们还在转染实验中，将完全合成的人类BDD缺失的FVIII基因与天然人类DNA序列的BDD FVIII基因进行了比较。当由相同的LXP3.3I驱动时，在人类细胞中，编码相同FVIII氨基酸序列但使用不同密码子选择的两个基因未显示出FVIII活性的显著差异(图6)。然而，当使用不同的肝特异性启动子时，与由LXP3.3I驱动的BDD FVIII基因相比，具有天然密码子的BDD FVIII基因显示出较低的表达，表明主要是由于LXP3.3I启动子导致更高的基因表达。
我们接下来在常用的FVIII基因敲除血友病A小鼠模型中测试了体内基因表达活性。将LXP3.3I-hF8基因表达盒包装到AAV9衣壳中并注入FVIII KO小鼠的尾静脉。使用了两种不同剂量的载体(每只小鼠为2x 1011和4x 1010个载体基因组)以检查体内表达。如图7A所示，在这两个剂量下，在载体给药后长于1年的时间内达到了高水平和长期的基因表达。除了用于FVIII活性的显色测定之外，还使用ELISA测定来检查分泌在血浆中的FVIII蛋白的量(图7B)。结果表明，与全长野生型人类FVIII蛋白质的参考标准相比，BDD FVIII蛋白浓度比通过FVIII活性的显色测定相对相同全长人类FVIII获得的读数低约50％。这种差异(比FVIII活性读数更低的ELISA读数)可能是由于BDD FVIII中缺少长B结构域导致的，其几乎包含野生型FVIII长度的一半。由于ELISA试剂盒使用针对包括B结构域的野生型全长FVIII的多克隆抗体，因此预期缺乏B结构域的BDD FVIII具有较少的抗体结合位点并因此具有较低的ELISA读数。这些结果表明，血友病A小鼠中，显色测定和ELISA测定均能产生FVIII表达的一致测量。还在几个时间点进行了部分凝血活酶时间(PTT)测定。结果与其他两种测定法的结果基本一致。
实施例3
因子VIII重链突变
先前的文献显示，FVIII的重链是限制因素。重链比轻链的加工效率要低得多和/或更不稳定，其中精确的机制仍然模糊不清。例如，当从两个单独载体分别表达重链和轻链基因时，需要比轻链基因高得多的重链基因拷贝数，以获得类似的凝结活性的蛋白质浓度。因此，我们着手通过在其C-末端区引入突变来提高FVIII重链翻译后的加工效率，特别是通过引入新的糖基化位点，因为糖基化因其在细胞膜相关的和分泌的蛋白的翻译后加工以及稳定性中的作用而众所周知。我们选择在重链C末端引入糖基化。基本原理是，因为如BDDFVIII蛋白的X射线晶体结构分析所示，该末端区域是无定形的，因此是没有定义结构的柔性区。因此，该区域的突变可能不会扰乱FVIII蛋白功能结构。基于这个基本原理，我们利用了在734和735位置的两个天然天门冬酰胺，并将其相邻的氨基酸736和737突变为苏氨酸(NNAI至NNTT)。突变使氨基酸序列的改变最小化并使糖基化程度最大化，产生了命名为X0的突变体FVIII中的两个从头开始的糖基化位点(NNT和NTT)(图8)。
除了突变体X0中的两个新的糖基化位点之外，我们通过在重链中的N-末端的氨基酸738-742处替代肽(EPRSF)，在NNTT位点旁边添加了另一个糖基化位点(具有从氨基酸237至242分离出的天然糖基化序列(YVNRSL))。选择这种天然糖基化位点(NRS)，因为它是重链中最有效的糖基化位点之一(Medzihradszky et al.，Anal.Chem.69：3986(1997))，产生名为X1的突变体FVIII(图8)。
可替代地，我们已经在突变体X0中用NNT替代位置738-740处的氨基酸EPR，产生突变体X2中的两个另外糖基化位点(图8)。
实施例4
因子VIII重链C末端处的突变增强了FVIII的体外活性
接下来，我们将突变体构建体的FVIII活性与其野生型BDD FVIII对应物进行了并行比较。在人类肝癌细胞系Huh7中进行了质粒转染，人类肝癌细胞系Huh7没有内源性FVIII表达，但适用于肝特异性启动子控制的基因表达。如图9A所示，与亲本基因相比，突变X1和X2在体外使FVIII活性增加了一倍以上。
实施例5
突变体FVIII在血友病A小鼠模型中体内的长期和高水平基因表达
由于FVIII突变体X1和X2在体外转染实验中显示出显著更高的FVIII活性，所以我们接下来在FVIII KO小鼠体内检查了它们的基因表达和FVIII活性。X1和X2基因处于相同LXP3.3I启动子的转录控制下，并且被包装在AAV8载体颗粒中。基于早期实验，选择标准载体剂量5X 1010v.g./小鼠并且通过尾静脉静脉注射到龄期为2至3个月的血友病A小鼠中。通过眶后出血技术收集血浆样品，眶后出血技术是一种常用的方法。如图9B所示，突变体X1和X2实现的表达均高于其野生型亲本BDD FVIII基因(与图7A相比，低剂量)。为了监测长期基因表达，我们保留了用X1或X2突变体处理的血友病A小鼠，以观察24周。与用亲本wt BDDFVIII载体处理的血友病A小鼠相似(图7A)，用突变FVIII载体处理的小鼠也显示出长期稳定的基因表达，而没有显著降低血浆中人类FVIII的活性。在不同时间点的抑制剂测试显示没有抑制剂形成。
本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行许多和各种修改。因此，应当清楚地理解，本发明的形式仅是说明性的，并不意图限制本发明的范围。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、专利公开、数据库登录号标识的序列以及其它参考文献，因与呈现该参考文献的句子和/或段落相关的教导而通过引用以其全部内容并入。
前述内容是对本发明的说明，而不应被解释为对本发明的限制。本发明由所附权利要求限定，其中包括所述权利要求的等同物。
序列：
SEQ ID NO：1LXP3.3启动子-200bp
SEQ ID NO：2(含有LXP3.3启动子和VH4内含子的LXP3.3I-288bp
SEQ ID NO：3合成人类B结构域缺失的因子FVIII编码序列-4374bp
SEQ ID NO：4在AAV载体中的人类因子FVIII基因表达盒，从左反向重复到右反向末端重复-5045bp
SEQ ID NO：5无信号肽的人类因子FVIII野生型蛋白序列-2333aa。

Claims (40)

1.一种包含合成肝特异性启动子的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述启动子可操作地连接到内含子。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述内含子来自VH4。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述启动子和所述内含子一起包含SEQ IDNO：2的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子可操作地连接到感兴趣的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述感兴趣的多核苷酸编码多肽或功能性核酸。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述感兴趣的多核苷酸编码凝血因子。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述感兴趣的多核苷酸编码因子VIII。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述感兴趣的多核苷酸编码B结构域缺失的因子VIII。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述感兴趣的多核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的序列。
11.根据权利要求9所述的多核苷酸，包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，进一步包含在感兴趣的多核苷酸下游的聚腺苷酸化位点。
13.一种包含权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸的载体。
14.根据权利要求13所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
16.根据权利要求15所述的载体，其中所述AAV载体是AAV8载体或AAV9载体。
17.一种包含权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸和/或权利要求13-16中任一项所述的载体的转化细胞。
18.一种包含权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸、权利要求13-16中任一项所述的载体、和/或权利要求17所述的转化细胞的转基因动物。
19.一种在受试者的肝脏中生产多肽或功能性核酸的方法，包括向所述受试者递送权利要求6-12中任一项所述的多核苷酸、权利要求13-16中任一项所述的载体、和/或权利要求17所述的转化细胞，从而在所述受试者的肝脏中生产所述多肽或功能性核酸。
20.一种治疗受试者的血友病A或获得性因子VIII缺乏症的方法，包括向所述受试者递送治疗有效量的权利要求8-12中任一项所述的多核苷酸、权利要求13-16中任一项所述的载体、和/或权利要求17所述的转化细胞，从而治疗受试者的血友病A。
21.一种增加受试者的因子VIII多肽的生物利用度的方法，包括向所述受试者递送有效量的权利要求8-12中任一项所述的多核苷酸、权利要求13-16中任一项所述的载体、和/或权利要求17所述的转化细胞，从而增加因子VIII多肽在所述受试者中的生物利用度。
22.一种修饰的哺乳动物因子VIII多肽，其中重链中的氨基酸残基被修饰以产生一个或多个糖基化位点。
23.根据权利要求22所述的修饰的因子VIII多肽，其中所述一个或多个糖基化位点在所述重链的C末端。
24.根据权利要求22或23所述的修饰的因子VIII多肽，其是人类因子VIII多肽。
25.根据权利要求24所述的修饰的因子VIII多肽，其中野生型人类序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸残基736和737被氨基酸残基XX取代，其中X是S或T。
26.根据权利要求24所述的修饰的因子VIII多肽，其中野生型人类序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸残基736-742被氨基酸残基XXYVNRXL取代，其中X是S或T。
27.根据权利要求24所述的修饰的因子VIII多肽，其中野生型人类序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸残基736-740被氨基酸残基XXNNX取代，其中X是S或T。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的修饰的因子VIII多肽，进一步包含B结构域缺失。
29.一种编码权利要求22-28中任一项所述的修饰的因子VIII多肽的多核苷酸。
30.根据权利要求29所述的多核苷酸，可操作地连接到启动子。
31.根据权利要求30所述的多核苷酸，其中所述启动子包含权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸。
32.一种包含权利要求29-31中任一项所述的多核苷酸的载体。
33.根据权利要求32所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
34.根据权利要求33所述的载体，其中所述载体是AAV载体。
35.根据权利要求34所述的载体，其中所述AAV载体是AAV8载体或AAV9载体。
36.一种包含权利要求29-31中任一项所述的多核苷酸和/或权利要求32-35中任一项所述的载体的转化细胞。
37.一种包含权利要求29-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-35中任一项所述的载体、和/或权利要求36所述的转化细胞的转基因动物。
38.一种在受试者的肝脏中生产因子VIII的方法，包括向所述受试者递送权利要求29-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-35中任一项所述的载体、和/或权利要求36所述的转化细胞，从而在所述受试者的肝脏中生产因子VIII。
39.一种治疗受试者的血友病A或获得性因子VIII缺乏症的方法，包括向所述受试者递送治疗有效量的权利要求22-28中任一项所述的修饰的人类因子VIII多肽、权利要求29-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-35中任一项所述的载体、和/或权利要求36所述的转化细胞，从而治疗所述受试者的血友病A。
40.一种增加受试者的因子VIII多肽的生物利用度的方法，包括向所述受试者递送有效量的权利要求29-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-35中任一项所述的载体、和/或权利要求36所述的转化细胞，从而增加因子VIII多肽在所述受试者中的生物利用度。
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