JP7437035B2 - 最適化されたヒト凝固第ｖｉｉｉ因子遺伝子発現カセットおよびその使用 - Google Patents

最適化されたヒト凝固第ｖｉｉｉ因子遺伝子発現カセットおよびその使用 Download PDF

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Description

優先権の陳述
本出願は、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２０
１５年２月６日に出願された米国仮出願第６２／１１２，９０１号の利益を主張する。
本発明は、対象の肝臓でポリペプチドおよび機能性核酸を産生するための肝臓特異的合
成プロモーターおよび発現構築物に関する。本発明はさらに、第ＶＩＩＩ因子タンパク質
のアミノ酸配列に改変を含有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質、ならびに該第ＶＩＩＩ因子
タンパク質をコードする核酸構築物およびこれらの組成物を使用して出血障害を処置する
方法に関する。
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換を加速させること
により凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす。ＦＶＩＩＩ活性の欠乏は出血障害血
友病Ａの原因である。血友病Ａの現在の処置は、血漿由来または組換えＦＶＩＩＩタンパ
ク質の静脈内注入である。この処置は出血エピソードの制御に有効であるにもかかわらず
、ＦＶＩＩＩの短い半減期（８～１２時間）により頻回注入が必要なことが、この処置を
本質的に高価にしている。遺伝子治療は、この疾患の最終的な治癒に対する魅力的な戦略
として現れた。しかしながら、最も有望なウイルスベクターの１つ、アデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）を使用するＦＶＩＩＩ遺伝子の送達の進歩は、ＡＡＶパッケージング能力に近
いコード配列ＦＶＩＩＩの大きなサイズのため、凝固因子ＩＸの送達の進歩よりも遅れて
いる。
本発明は、ＡＡＶベクターでの使用に適した短い、合成の肝臓特異的プロモーターおよ
び発現構築物を提供することにより、当技術分野の短所を克服する。本発明は、アミノ酸
配列改変を有する追加の糖鎖付加部位を含むＦＶＩＩＩタンパク質、および出血障害の処
置におけるその使用方法をさらに提供する。
本発明は、わずか約２００塩基対の長さの肝臓特異的合成プロモーターの開発に部分的
に基づく。該プロモーターは、特にＡＡＶベクターを使用して肝臓特異的にポリペプチド
および機能性核酸を産生するのに使用することができる。ＡＡＶベクターには厳しい長さ
の制約があり、短いが強力なプロモーターの利用が有効である。
本発明はさらに、重鎖に追加の糖鎖付加部位を含む改変ＦＶＩＩＩタンパク質の開発に
部分的に基づく。該改変タンパク質は、本明細書に記載した改変がないＦＶＩＩＩタンパ
ク質と比べて長期の高レベルの活性をもたらす。
一態様では、本発明は、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドに関し、
該プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の
配列を含む。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、細胞、および／
または遺伝子導入動物に関する。
さらなる態様では、本発明は、対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生する
方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象
に送達し、これにより対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む
方法に関する。
追加の態様では、本発明は、対象における血友病Ａを処置する方法であって、治療有効
量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し
、これにより対象における血友病Ａを処置することを含む方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラ
ビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターお
よび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第ＶＩＩＩ因子ポリ
ペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、重鎖のアミノ酸残基が１つまたは複数の糖鎖付加部位を
作製するために改変された、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに関する。
追加の態様では、本発明は、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞、および／また
は遺伝子導入動物に関する。
別の態様では、本発明は、対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法であって、本発
明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリ
ヌクレオチドを含むベクターおよび／もしくは形質転換細胞を対象に送達し、これにより
対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、対象における血友病Ａを処置する方法であって、治療有
効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターお
よび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における血友病Ａを処置する
ことを含む方法に関する。
追加の態様では、本発明は、対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイ
ラビリティ増加させる方法であって、有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび
／もしくは形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペ
プチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
本発明のこれらの態様およびその他の態様を、以下の本発明の説明においてより詳細に
述べる。
ＬＸＰ３．３プロモーターの配列（配列番号１）を示す図である。推定肝臓転写因子およびハウスキーピング転写因子結合部位が下線によって強調されている。 ＡＡＶ９－ＴＢＧ－ＬａｃＺまたはＡＡＶ９－Ｌｘｐ３．３－ＬａｃＺをマウスに静脈内注射後の肝臓および心臓におけるＬａｃＺ発現の比較を示す図である。肝臓および心臓薄片のＸ－ｇａｌおよびＨ＆Ｅ二重染色が示されている。 １×１０１１個のベクターゲノム（ｖ．ｇ．）のＡＡＶ９－ＬａｃＺベクターで処置したマウスの様々な組織におけるＬａｃＺ酵素活性の定量的比較を示す図である。ＡＡＶ９－ＬａｃＺベクターは、それぞれ非特異的ＣＭＶプロモーター、肝臓特異的ＴＢＧプロモーター、またはＬＸＰ３．３プロモーターを含有した（図１に例示）。 図２Ｂに示す、ただしより低量（２×１０１０ベクターゲノム（ｖ．ｇ．）のＡＡＶ９－ＬａｃＺベクターで処置したマウスの肝臓におけるＬａｃＺ酵素活性の定量的比較を示す図である。 異なるＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞の上清中の第ＶＩＩＩ因子活性を示す図である。該プラスミドは、イントロンなしでまたはＶＨ４イントロンもしくはキメラＣＩＮイントロンと共に、ヒトＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子遺伝子を駆動するＮＢＰプロモーター（１７７ｂｐ）を含有した。 ＡＡＶ－Ｌｘｐ３．３ｉ－ＢＤＤ－Ｆ８構築物およびＬｘｐ３．３ｉプロモーター－イントロンの配列（配列番号２）を示す図である。ＩＴＲはＡＡＶの１４５ｂｐ逆方向末端反復を表す。 ヒト肝臓癌Ｈｕｈ７細胞およびマウスＨｅｐａ１－６細胞にける非特異的ＣＭＶプロモーターまたは肝臓特異的ＬＸＰ３．３プロモーターを含有する２つの構築物からのＦＶＩＩＩ発現を示す図である。 それぞれプロモーターＬＸＰ３．３または弱いプロモーターＴｋＰｒｏを含有する異なるＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（合成ｏｐｔｉ－Ｆ８または野生型ｗｔＦ８）プラスミドをそれぞれトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞におけるＦＶＩＩＩ活性を示す図である。 高用量（２×１０１１ｖ．ｇ．／マウス）または低用量（４×１０１０ｖ．ｇ．／マウス）のＩＶ注射後の、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９－Ｌｘｐ３．３－Ｆ８媒介長期ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子発現およびＦＶＩＩＩ活性を示す図である。第ＶＩＩＩ因子活性（正常ヒトレベルのパーセンテージとしての）は、それぞれ注射後２、６、１０および１８週目に測定された。 高用量（２×１０１１ｖ．ｇ．／マウス）または低用量（４×１０１０ｖ．ｇ．／マウス）のＩＶ注射後の、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９－Ｌｘｐ３．３－Ｆ８媒介長期ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子発現およびヒトＦＶＩＩＩタンパク質濃度を示す図である。第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、それぞれ注射後２、６、１０および１８週目にＥＬＩＳＡにより（正常ヒトレベルのパーセンテージとして）測定された。 改変ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号３１～３４）のアミノ酸配列を示す図である。ＳＱはＢＤＤ 第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖の接合部のセリン７４３（Ｓｅｒ ７４３）およびグルタミン（Ｇｌｎ １６３８）を表す（配列番号５に基づくナンバリング）。下線を付した文字は重鎖の変異アミノ酸を強調している。 ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子または変異体Ｆ８Ｘ１およびＦ８Ｘ２を含有する発現プラスミドをトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞におけるヒトＦＶＩＩＩ活性を示す図である（詳細は図８を参照）。 ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおける変異体ヒトＢＤＤ ＦＶＩＩＩ遺伝子のＡＡＶ８ベクター媒介長期発現を示す図である。ヒト第ＶＩＩＩ因子活性（正常ヒトレベルのパーセンテージとしての）は、５×１０１０ベクターゲノムのＡＡＶ８－ＬＸＰ３．３ｉ－Ｆ８Ｘ１またはＡＡＶ８－ＬＸＰ３．３ｉ－Ｆ８Ｘ２を静脈内注射後の様々な時点で測定された。
本発明を、これより、本発明の好ましい実施形態が示されている添付図面を参照してよ
り詳細に記載する。しかしながら、本発明は異なる形態で実施することができ、本明細書
で述べられている実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形
態は、本開示が十分かつ完全となり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供さ
れる。
文脈が別段のことを指示しない限り、本明細書に記載する本発明の様々な特徴を任意の
組み合わせで使用することができることが明確に意図される。さらに、本発明はまた、本
発明のいくつかの実施形態において、本明細書で述べる任意の特徴または特徴の組み合わ
せを除外することができるまたは省略することができることも意図するものである。例示
すると、ある複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むことが本明細書で述べられている場
合、Ａ、ＢもしくはＣのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせを単独でまたは任意の
組み合わせで省略して特許請求の範囲から除外する（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｄ）ことができ
ることが明確に意図される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明
が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において
本発明の説明で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本
発明を限定することを意図するものではない。
別段の具体的な指示がない限り、本明細書では、ヌクレオチド配列を左から右へ５’か
ら３’方向に一本鎖のみで示す。本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸の両方を、
特許法施行規則第１．８２２条および確立された用法に従って、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨さ
れた様式でまたは（アミノ酸に関しては）１文字表記もしくは３文字表記のいずれかによ
り表す。
別段に指示されている場合を除き、当業者に既知である標準的な方法を、遺伝子のクロ
ーニング、核酸の増幅および検出等に使用することができる。そのような技法は当業者に
既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
ＮＹ、１９８９）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）を参照。
Ｉ．定義
本発明の説明および添付した特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」
および「ｔｈｅ」は、文脈が別段のことを明確に指示しない限り複数形も含むことを意図
するものである。
本明細書で使用する場合にも、「および／または」は、列挙した関連事項のうちの１つ
または複数の任意の組み合わせおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに選択肢（「また
は」）として解釈した場合には組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
用語「約」は本明細書で使用する場合、例えばポリペプチドの量、用量、時間、温度、
酵素活性またはその他の生物学的活性等等の測定可能な値を指す場合に、特定の量の±２
０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または±０．１％のばらつきを包含するこ
とを意味する。
移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）
」は、請求項の範囲が該請求項に列挙した特定の材料または工程、および請求された本発
明の「基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈する
ことを意味する。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１
９０ ＵＳＰＱ ４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（原文の強調）を参照。ＭＰＥ
Ｐ § ２１１１．０３も参照。
用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（およ
び文法的変形）は、本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用する場
合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないように、列挙し
た配列（例えば配列番号）ならびに、列挙した配列の５’末端および／もしくは３’末端
またはＮ末端および／もしくはＣ末端の合計１０個以下（例えば１個、２個、３個、４個
、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸の
両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計１０個以下の追加の
ヌクレオチドまたはアミノ酸は、両方の末端に一緒に追加された追加のヌクレオチドまた
はアミノ酸の総数を含む。用語「実質的に変更された」は本発明のポリヌクレオチドに適
用する場合、列挙した配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、少なくと
も約５０％以上のコードされたポリペプチドを発現する能力の増減を指す。用語「実質的
に変更された」は本発明のポリペプチドに適用する場合、列挙した配列からなるポリペプ
チドの活性と比較して、少なくとも約５０％以上の凝固刺激活性の増減を指す。
用語「高める（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または
これらの文法的変形は本明細書で使用する場合、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２
倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍または１５倍の特定のパラメータの
増加を指す。
用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」またはこれ
らの文法的変形は本明細書で使用する場合、少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０
％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはより多くの特定のレベルま
たは活性の低下または減少を指す。特定の実施形態では阻害または低減は、ほとんど検出
できない活性または本質的に検出不能の活性（多くてもわずかな量、例えば約１０％未満
または５％未満）をもたらす。
「有効」量とは本明細書で使用する場合、所望の効果をもたらす量のことである。
「治療上有効」量とは本明細書で使用する場合、対象にある程度の改善または利益をも
たらす量のことである。換言すると、「治療有効」量とは、対象における少なくとも１種
の臨床症状のある程度の軽減、緩和または低減をもたらすことができる量のことである。
ある程度の利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完璧であるまたは治癒的である必
要はないことを当業者は認識する。
「予防有効」量とは本明細書で使用する場合、対象における疾患、障害および／または
臨床症状を予防する（本明細書で定義したように）のに十分な量のことである。ある程度
の利益が対象にもたらされる限り、予防レベルが完璧である必要はないことを当業者は認
識する。
本発明の方法により出血障害を処置する有効性は、当業者に公知であるように対象の症
状および／または臨床パラメータの変化により示された臨床的改善を検出することにより
決定することができる。
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象の状態の重症度が低減されるまたは少なくとも部分的に
改善されるもしくは改変されること、および少なくとも１種の臨床症状のある程度の軽減
、緩和または低減が達成されることを意図するものである。
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」ま
たは「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびこれらの文法的変形）は、疾患、障害お
よび／または臨床症状の発症前に本発明の方法を実施しない場合に起こることと比べた、
発症後の疾患、障害および／または臨床症状の程度または重症度の低下または遅延を指す
。血友病Ａに関して、「予防すること」は、予防的処置がない場合に起こる出血エピソー
ドの回数および／または重症度より低い出血エピソードの回数および／または重症度の発
生を指す。
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド
」を互換的に使用し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成
された）ＤＮＡまたはＲＮＡならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含む、ＲＮＡおよび
ＤＮＡの両方を包含する。用語ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列または核酸は、鎖の
長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本
鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。核酸は、オリゴヌクレオチ
ド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使
用して合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能
力が変更されたまたはヌクレアーゼ耐性が向上した核酸を調製するのに使用することがで
きる。本発明は、本発明の核酸、ヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチドの相補体（
完全相補体または部分的相補体のどちらかであり得る）である核酸をさらに提供する。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、これが由来する生物の天然に存在するゲノムに
おいて、これが直接隣接する（一方は５’末端および一方は３’末端に）ヌクレオチド配
列とは直接隣接しないヌクレオチド配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）のことである。そ
のため、一実施形態では単離された核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例
えばプロモーター）配列の一部または全てを含む。したがって、該用語は、例えば、ベク
ター、自律複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノム
ＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、あるいはその他の配列から独立して別個の分子（例
えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処置により産生されたゲノ
ムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。該用語はまた、追加のポリ
ペプチドまたはペプチドコード配列ハイブリッド核酸の一部である組換えＤＮＡも含む。
遺伝子を含む単離されたポリヌクレオチドは、そのような遺伝子を含む染色体のフラグメ
ントではなく、むしろ該遺伝子に関連したコード領域および調節領域を含むが、該染色体
で天然に見出される追加の遺伝子を含まない。
用語「フラグメント」はポリヌクレオチドに適用する場合、参照核酸または参照ヌクレ
オチド配列と比べて長さが縮小し、ならびに参照核酸または参照ヌクレオチド配列と同一
またはほとんど同一（例えば９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）の隣接する
ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、該ヌクレオチド配列から本質的になる、および
／または該ヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明
に係るそのような核酸フラグメントは、これが構成要素となるより大きいポリヌクレオチ
ドに必要に応じて含めることができる。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメン
トは、本発明に係る核酸またはヌクレオチド配列の少なくとも約８個、１０個、１２個、
１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個
、１５０個、２００個もしくはより多くの連続ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレ
オチドを含むことができる、該オリゴヌクレオチドから本質的になっていてもよい、およ
び／または該オリゴヌクレオチドからなっていてもよい。
用語「単離された」は、細胞性物質、ウイルス性物質、および／または培養培地（組換
えＤＮＡ法により産生する場合）、または化学前駆体もしくはその他の化学物質（化学的
に合成する場合）が実質的にない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドを指し得る
。さらに、「単離されたフラグメント」とは、フラグメントとして天然に存在せず、天然
の状態では見出されない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドのフラグメントのこ
とである。「単離された」は、調製物が技術的に純粋（均質）であることを意味しないが
、意図した目的に使用され得る形態でポリペプチドまたは核酸を提供するには十分に純粋
である。
用語「フラグメント」はポリペプチドに適用する場合、参照ポリペプチドまたは参照ア
ミノ酸配列と比べて長さが縮小し、ならびに参照ポリペプチドまたは参照アミノ酸配列と
同一またはほとんど同一（例えば９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）の隣接
するアミノ酸のアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列から本質的になる、および／または
該アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を意味すると理解される。本発明に係るそのような
ポリペプチドフラグメントは、これが構成要素となるより大きいポリペプチドに必要に応
じて含めることができる。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメントは、本発明
に係るポリペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約４個、６個、８個、１０個、１２
個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１０
０個、１５０個、２００個もしくはより多くの連続アミノ酸の長さを有するペプチドを含
むことができる、該ペプチドから本質的になっていてもよい、および／または該ペプチド
からなっていてもよい。
「ベクター」とは、核酸を細胞にクローニングおよび／または移入するための任意の核
酸分子のことである。ベクターはレプリコンであってもよい。レプリコンはこれに別のヌ
クレオチド配列を結合して、結合したヌクレオチド配列の複製を可能にすることができる
。「レプリコン」は、インビボでの核酸複製の自律的単位として機能する、すなわち、そ
れ自身の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、
ファージ、コスミド、染色体、ウイルスゲノム）であり得る。用語「ベクター」は、イン
ビトロ、エクスビボ、および／またはインビボで細胞に核酸を導入するためのウイルスお
よび非ウイルス（例えばプラスミド）核酸分子の両方を含む。当分野で既知の多くのベク
ターを使用して核酸を操作すること、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み
込むこと等ができる。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応する核酸フラグ
メントの適切なベクターへの挿入は、適切な核酸フラグメントを相補的な付着末端を有す
る選択されたベクターにライゲートすることにより達成することができる。また、核酸分
子の末端を酵素的に修飾することができ、またはヌクレオチド配列（リンカー）を核酸末
端にライゲートすることにより任意の部位を産生することができる。そのようなベクター
は、ベクターを含有する細胞および／またはベクターの核酸を細胞ゲノムに取り込んだ細
胞の選択をもたらす選択マーカーをコードする配列を含有するように改変することができ
る。そのようなマーカーは、マーカーによりコードされたタンパク質を取り込み、発現す
る宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。「組換え」ベクターは、１つまたは
複数の異種ヌクレオチド配列（すなわち導入遺伝子）、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ
またはより多くの異種ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたは非ウイルスベクタ
ーを指す。
ウイルスベクターは、細胞および生きている動物対象における幅広い遺伝子送達用途に
使用されている。使用することができるウイルスベクターとして、レトロウイルスベクタ
ー、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター
、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター
、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、およびアデノウイル
スベクターが挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターとして、プラスミ
ド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、核酸－タンパク質複合体、およびバイ
オポリマーが挙げられる。目的の核酸に加えて、ベクターは１つもしくは複数の調節領域
、ならびに／または核酸移入結果（特定の組織への送達、発現期間等）の選択、測定およ
びモニタリングに有用な選択マーカーも含むことができる。
ベクターは当分野で既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸
カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、または核酸ベ
クタートランスポーターにより、所望の細胞に導入することができる（例えば、Ｗｕ他、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２）；Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；およびＨａｒｔｍｕｔ他、カナダ特許出願第２，
０１２，３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照）。様々な実施形態では、カチオン
性オリゴペプチド（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、核酸結合タンパク質に
由来するペプチド（例えば国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、および／またはカチオ
ン性ポリマー（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）等のその他の分子を、インビ
ボでの核酸の送達を促進するのに使用することができる。裸の核酸としてインビボでベク
ターを導入することもできる（米国特許第５，６９３，６２２号、米国特許第５，５８９
，４６６号および米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。受容体媒介核酸送達アプロ
ーチも使用することができる（Ｃｕｒｉｅｌ他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４
７（１９９２）；Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９（１９８７））。
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、別段の指示
がない限り互換的に使用され、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「融合タンパク質」とは、天然には融合した状態で見出されない２つ（以上）の異なる
ポリペプチドをコードする２つの異種ヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントが、
正しい翻訳リーディングフレームにおいて融合される場合に産生されるポリペプチドのこ
とである。例示的な融合ポリペプチドとして、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、
マルトース結合タンパク質、またはレポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質
、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等）、赤血球凝集素、
ｃ－ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープ等の全てまたは一部への、本発明のポリペプチド（また
はそのフラグメント）の融合が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「機能性」ポリペプチドまたは「機能性フラグメント」とは
、そのポリペプチドと通常は関連がある少なくとも１種類の生物学的活性（例えば、血管
新生活性、タンパク質結合、リガンドまたは受容体結合）を実質的に保持するものである
。特定の実施形態では、「機能性」ポリペプチドまたは「機能性フラグメント」は、非改
変ペプチドにより保有される活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に
保持する」とは、ポリペプチドが、天然のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約２
０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９
８％、９９％またはより多くを保持する（および天然のポリペプチドより高いレベルの活
性を有することさえできる）ことを意味する。「非機能性」ポリペプチドとは、ポリペプ
チドと通常は関連がある、ほとんど検出できない生物学的活性または本質的に検出不能の
生物学的活性（例えば、多くてもほんのわずかな量、例えば約１０％未満または５％未満
）を示すものである。タンパク質結合および血管新生活性等の生物学的活性は、当分野で
公知であり本明細書に記載されたアッセイを使用して測定することができる。
ポリヌクレオチドコード配列の「発現（ｅｘｐｒｅｓｓ）」または「発現（ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ）」という用語は、該配列が転写され、および任意選択的に翻訳されることを
意味する。典型的には、本発明によれば、本発明のコード配列の発現は本発明のポリペプ
チドの産生をもたらす。発現したポリペプチドまたはフラグメント全体は、精製すること
なくインタクトな細胞で機能することもできる。
本発明に関連する用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２
型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、
ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシ
ＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶならびにヒツジＡＡＶ、ならびに未知のまたは後に発見
される任意の他のＡＡＶが含まれるがこれらに限定されない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ
Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ他、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏ
ｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くのさらなるＡＡＶの血清型およ
びクレードも同定されており（例えばＧａｏ他、（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６
３８１～６３８８および表１を参照）、これらも用語「ＡＡＶ」に包含される。
様々なＡＡＶおよび自律性パルボウイルスのゲノム配列ならびにＩＴＲ、Ｒｅｐタンパ
ク質およびカプシドサブユニットの配列は当分野で既知である。そのような配列を、文献
にまたはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース等の公共データベースに見出すことが
できる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４
０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８６３、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００１８６２、Ｎ
Ｃ０００８８３、ＮＣ００１７０１、ＮＣ００１５１０、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９
０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９
０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８
２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ００１３５８、ＮＣ００１５４０、ＡＦ５１３８５１、
ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９、ＡＹ６３１９６５、ＡＹ６３１９６６を参照し、
これらの開示はその全体が本明細書に援用される。また、例えばＳｒｉｖｉｓｔａｖａ他
、（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ他、（１９９８）Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ他、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３
：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ他、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３
９；Ｘｉａｏ他、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ他
、（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ他、（１９８６）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ他、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９９：１１８５４；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０
１、ＷＯ９８／１１２４４；米国特許第６，１５６，３０３号も参照し、これらの開示は
その全体が本明細書に援用される。また、表１も参照。Ｘｉａｏ，Ｘ．（１９９６）、「
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒ
ｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」、
博士論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルベニア州（その全体が本明細書に
援用される）には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３の末端反復配列の初期の説明が記
載されている。
Figure 0007437035000001
「組換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」とは、少なくとも１つの逆
方向末端反復（例えば、１つの、２つのまたは３つの逆方向末端反復）と、１つまたは複
数の異種ヌクレオチド配列とを含むＡＡＶゲノム（すなわちｖＤＮＡ）のことである。ｒ
ＡＡＶベクターは、ウイルスを生成するために１４５塩基の末端反復（ＴＲ）をシスで一
般に保持するが、部分的にまたは完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲおよび非ＡＡ
Ｖ ＴＲも、この目的に役立つことができる。全てのその他のウイルス配列が必ずしも必
要ではなく、トランスで供給されてもよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、（１９９２）Ｃｕｒｒ．
Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクタ
ーは２つのＴＲ（例えばＡＡＶ ＴＲ）を任意選択的に含み、これらのＴＲは一般に異種
ヌクレオチド配列の５’末端および３’末端にあることができるが、それらに隣接してい
る必要はない。これらのＴＲは互いに同じであり得る、または互いに異なることができる
。ベクターゲノムはまた、その３’末端または５’末端に単一のＩＴＲを含有することも
できる。
用語「末端反復」または「ＴＲ」には、任意のウイルス末端反復、またはヘアピン構造
を形成し逆方向末端反復として機能する（すなわち、例えば複製、ウイルスパッケージン
グ、組み込みおよび／もしくはプロウイルス救済等の所望の機能を媒介する）合成配列が
含まれる。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであり得る。例えば、その他のパ
ルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ
）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）の非ＡＡＶ ＴＲ配列等の非ＡＡＶ ＴＲ配列または
ＳＶ４０複製の開始点としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピンをＴＲとして使用すること
ができ、非ＡＡＶ ＴＲ配列またはＳＶ４０ヘアピンを短縮化、置換、欠失、挿入および
／または追加によりさらに改変することができる。さらに、ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他
に対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている「二重Ｄ配列」等の部分的な
または完全な合成であり得る。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０もしくは１１または未知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶ（例え
ば表１を参照）が挙げられるがそれらに限定されない任意のＡＡＶ由来であり得る。ＡＡ
Ｖ末端反復が所望の機能、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／また
はプロウイルス救済等を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復は、天然の末端反復配列を有する
必要はない（例えば、天然のＡＡＶ ＴＲ配列を挿入、欠失、短縮化および／またはミス
センス変異により変更することができる）。
本明細書では用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」を互換的に使用する。
「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングさ
れているｒＡＡＶベクターゲノムを含む。
ＡＡＶカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ他、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第
２巻、第６９章および第７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ）により詳細に説明されている。
用語「薬物動態特性」は、その通常の慣習的意味を有し、ＦＶＩＩＩタンパク質の吸収
、分布、代謝および排出を指す。
「バイオアベイラビリティ」の通常の慣習的意味は、生物学的に活性な薬物の投与量の
うちの体循環に到達する画分または量である。本発明の実施形態の文脈では、用語「バイ
オアベイラビリティ」は通常の慣習的意味を含むが、さらに、ＦＶＩＩＩタンパク質が生
物活性である程度を含むようにより広義の意味を有すると理解される。ＦＶＩＩＩの場合
には、例えば、「バイオアベイラビリティ」の１つの測定値は、注入後に循環で得られる
ＦＶＩＩＩタンパク質のプロコアグラント活性である。
「翻訳後改変」は、その通常の慣習的意味を有し、リーダー配列の除去、グルタミン酸
残基のγ－カルボキシル化、アスパラギン酸残基のβ－ヒドロキシル化、アスパラギン残
基のＮ結合型糖鎖付加、セリンおよび／またはトレオニン残基のＯ結合型糖鎖付加、チロ
シン残基の硫酸化、セリン残基のリン酸化ならびにこれらの任意の組み合わせを含むがこ
れらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「生物学的活性」は、例えばヒト血漿に由来する標準物質を
参照して決定される。ＦＶＩＩＩに関して、標準物質はＭｏｎｏＣＬＡＴＥ－Ｐ（登録商
標）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）であってもよい。標準物質の生物学的活性は１００％と
理解される。
用語「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」または「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、本明細書で使
用する場合、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質および天然に存在するまたは人工のタンパク質
（例えばＢドメイン欠失タンパク質）を含む。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、文献で
知られているようなＦＶＩＩＩの変異形態をさらに含むことができる。本発明のＦＶＩＩ
Ｉタンパク質は、当分野で知られているような、現在既知のまたは後に同定される任意の
その他の天然に存在するヒトＦＶＩＩＩタンパク質または人工のヒトＦＶＩＩＩタンパク
質、ならびにそれらの誘導体および活性フラグメント／活性ドメインをさらに含む。
多様な哺乳動物種由来のＦＶＩＩＩのアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データ
ベースから入手可能である。ＦＶＩＩＩ配列の例は以下の表に見出される。
Figure 0007437035000002
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの薬理学的に活性な形態をさらに含む。
該形態は、シグナルペプチドが除去され、およびプロテアーゼの作用により（または核酸
レベルでＢドメインを除去してタンパク質からＢドメインを改変することにより）Ｂドメ
インが切断されており、機能性ＦＶＩＩＩ凝固因子として折り畳まれたＦＶＩＩＩの２つ
の非隣接ポリペプチド鎖（軽鎖および重鎖）をもたらす分子形態である。Ｓ７４３とＱ１
６３８の間の残基が欠失された頻用ＳＱバージョンを含む、ヒトＦＶＩＩＩのいくつかの
Ｂドメイン欠失形態が知られている。具体的には、糖鎖付加の程度を高める改変を有する
ＦＶＩＩＩタンパク質が、該広義語に具体的には含まれる。
ヒトＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列は当分野で公知であり、例えばＧｅｎＢａｎ
ｋ受託番号ＡＡＡ５２４８４に見出すことができる。ヒトＦＶＩＩＩタンパク質は２３５
１アミノ酸長であり、シグナルペプチド（残基１～１９）、重鎖（残基２０～７５９）、
Ｂドメイン（残基７６０～１３３２）、および軽鎖（残基１６６８～２３５１）から構成
される。シグナルペプチドがないアミノ酸配列を以下に開示する（配列番号５）。
用語「半減期」とは、通常の慣習的意味のほか、ＦＶＩＩＩに関する科学文献に見出さ
れる通常の慣習的意味を含む広義語のことである。具体的には、注入時に測定される初期
値から初期値の半分までの低下にかかる注入後の時間を定義する、ＦＶＩＩＩに関連する
パラメータの測定値がこの定義に含まれる。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減
期は、当分野で公知であるように、および本明細書に記載したように、様々な免疫アッセ
イにおいてＦＶＩＩＩに対する抗体を使用して血液および／または血液成分で測定するこ
とができる。また、半減期は、当分野で公知であるように、および本明細書に記載したよ
うに、標準的な凝固アッセイを含む機能的アッセイを使用してＦＶＩＩＩ活性の低下とし
て測定されてもよい。
用語「回復」は本明細書で使用する場合、ＦＶＩＩＩの注入、注射、送達またはさもな
ければ投与後にＦＶＩＩＩのレベルを測定する目的で、生体試料（例えば、血液または血
液産物試料）を除去する最も早い実用的な時間に受容動物またはヒト対象（例えば循環）
において検出される、任意の許容される方法により測定されるＦＶＩＩＩの量（ＦＶＩＩ
Ｉ抗原レベルまたはＦＶＩＩＩプロテアーゼもしくは凝固活性レベルを含むがこれらに限
定されない）を含む。現在の方法論では、ＦＶＩＩＩ回復を測定するための最も早い生体
採取時間は典型的には、ＦＶＩＩＩの注入、注射、またはさもなければ送達／投与後、最
初の１５分以内であるが、科学技術および／または臨床技術が向上するにつれてより速い
採取時間を期待することは当然である。要するに、ＦＶＩＩＩの回復値は、受容動物また
は患者への注入、注射、またはその他の送達後できるだけ早い時点で受容者（例えば循環
）において測定することができる、注入、注射またはさもなければ送達／投与されたＦＶ
ＩＩＩの最大画分となることを本明細書では意味する。
用語「糖鎖付加部位」は、その通常の慣習的意味を有する広義語である。本出願の文脈
では該用語は、潜在的に糖鎖を受容し得る部位、および糖鎖が実際に結合されているタン
パク質内、具体的にはＦＶＩＩＩ内の部位の両方に適用され、オリゴ糖および／または炭
水化物のアクセプターとして作用し得る任意のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用する場合、「形質転換」細胞とは、組換えＤＮＡ法を使用して構築され
たＦＶＩＩＩタンパク質ベクターを含むがこれに限定されない本発明のＦＶＩＩＩタンパ
ク質をコードする核酸分子で形質転換され、形質導入されおよび／またはトランスフェク
トされた細胞のことである。
本明細書で使用する場合、用語「出血障害」は、出血のかたちで現れる細胞起源、生理
学的起源または分子起源の先天性、後天性または誘導された任意の欠損を表す。例は、凝
固因子欠乏症（例えば、血友病ＡおよびＢ、または凝固因子ＸＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩもし
くはＩＸの欠乏）、凝固因子インヒビター、血小板機能不全、血小板減少症、フォンヴィ
ルブランド病、または手術もしくは外傷により誘発される出血である。
出血過多は、血液凝固カスケードが正常に機能する（凝固因子欠乏症がない、または凝
固因子のいずれかに対するインヒビターがない）対象においても生じ、血小板機能不全、
血小板減少症またはフォンヴィルブランド病により引き起こされることがある。そのよう
な場合、止血系は血友病の場合と同様に欠如し、または異常な必須凝固「化合物」（血小
板またはフォンヴィレブランド因子タンパク質など）を有し、大量出血を引き起こすこと
から、その出血は血友病により引き起こされる出血になぞらえることができる。手術また
は外傷と関連して広範な組織損傷を経験する対象では、正常な止血機構は差し迫った止血
の必要性に圧倒される可能性があり、正常な止血機構にもかかわらず出血を起こす場合が
ある。十分な止血の達成は、脳、内耳領域および眼等の外科的止血の可能性が限られる器
官で出血が生じる場合にも問題となる。同じ問題は、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、
胃腸管）から生検を採取する過程および腹腔鏡手術において発生し得る。全てのこれらの
状況に共通しているのは、外科的手法（縫合、クリップ等）により止血を行う難しさであ
る。これはまた出血が拡散しているケースでもある（出血性胃炎および大量子宮出血）。
急性および大量出血は、行われた療法により止血不全が誘発された、抗凝固療法中の対象
においても生じ得る。そのような対象は、抗凝固作用が迅速に中和されなければならない
場合、外科的介入を必要とすることがある。根治的恥骨後式前立腺摘除術は、前立腺癌が
限局している対象に対して一般に行われ術式である。手術は、著しいおよび時折の大量失
血をしばしば伴う。前立腺摘除中の少なからぬ失血は、主に複雑な解剖学的位置と関係し
ており、血管が密集した様々な部位は外科的止血が容易に利用できず、広い範囲からの広
汎出血をもたらす可能性がある。また、脳内出血は脳卒中の最も治療困難な形態であり、
脳内出血後最初の数時間での高い死亡率および血腫増大と関連している。不十分な止血の
場合に問題を引き起こし得る別の状況は、正常な止血機構を有する対象が、血栓塞栓症を
予防するための抗凝固療法を受ける場合である。そのような療法として、ヘパリン、プロ
テオグリカンのその他の形態、ワルファリンまたはビタミンＫ拮抗薬のその他の形態、な
らびにアスピリンおよびその他の血小板凝集阻害剤を挙げることができる。
本発明の一実施形態では、出血は血友病と関連している。別の実施形態では、出血は後
天性インヒビターを有する血友病と関連している。別の実施形態では、出血は血小板減少
症と関連している。別の実施形態では、出血はフォンヴィルブランド病と関連している。
別の実施形態では、出血は重度の組織損傷と関連している。別の実施形態では、出血は重
度の外傷と関連している。別の実施形態では、出血は手術と関連している。別の実施形態
では、出血は腹腔鏡手術と関連している。別の実施形態では、出血は出血性胃炎と関連し
ている。別の実施形態では、出血は多量の子宮出血と関連している。別の実施形態では、
出血は機械的止血の可能性が限られる器官で生じている。別の実施形態では、出血は脳、
内耳領域または眼で生じている。別の実施形態では、出血は生検を受ける過程と関連して
いる。別の実施形態では、出血は抗凝固療法と関連している。
本発明の「対象」は、出血の制御が必要とされるおよび／もしくは望まれる出血障害も
しくは出血状態を有する、または該出血障害もしくは出血状態になりやすい任意の動物を
含む。該出血障害または出血状態（血友病Ａおよび後天性ＦＶＩＩＩ欠乏症（例えば、Ｆ
ＶＩＩＩに対する自己抗体または血液悪性腫瘍による）等の）は、対象へのＦＶＩＩＩの
投与により処置する、改善するまたは予防することができる。そのような対象は一般に、
哺乳動物対象（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、霊長類等等の実験動物）
、家畜もしくは商業用動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ、ヒツジ等）、または飼育
動物（例えばネコ、イヌ、フェレット等）である。特定の実施形態では、対象は霊長類対
象、ヒト以外の霊長類対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、サル、ゴリラ等）またはヒト
である。本発明の対象は、制御が必要とされるおよび／または望まれる出血障害または出
血状態のリスクがあるとわかっているまたは考えられる対象であり得る。また、本発明に
係る対象は、制御が必要とされるまたは望まれる出血障害または出血状態のリスクがある
と以前にわかっていないまたは疑われていない対象も含み得る。さらなる選択肢として、
対象は実験動物および／または疾患の動物モデルであってもよい。
対象は、新生児、若年、熟年および老年対象を含む任意の齢のオスおよび／またはメス
を含む。ヒト対象に関して、代表的な実施形態では、対象は乳児（例えば、約１２カ月未
満、１０カ月未満、９カ月未満、８カ月未満、７カ月未満、６カ月未満またはより若い）
、幼児（例えば、少なくとも約１２、１８もしくは２４カ月および／または約３６、３０
もしくは２４カ月未満）、または子供（例えば、少なくとも約１、２、３、４もしくは５
歳および／または約１４、１２、１０、８、７、６、５もしくは４歳未満）であってもよ
い。本発明の実施形態では、対象は、約０カ月齢から３、４、５、６、９、１２、１５、
１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約３カ月齢から６、９、１２、１５
、１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約６カ月齢から９、１２、１５、
１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約９カ月齢から１２、１５、１８、
２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約１２カ月齢から１８、２４、３６、４８
もしくは６０カ月齢、約１８カ月齢から２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、ま
たは約２４カ月齢から３０、３６、４８もしくは６０カ月齢のヒト対象である。
プロモーターおよび発現カセット
本発明の一態様は、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドに関し、該プ
ロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも約９０％同一の配
列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。いくつかの実施形態では、ヌ
クレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。該プロ
モーターは、短い（約２００塩基対）強力な肝臓特異的プロモーターであり、目的のポリ
ヌクレオチドの肝臓特異的発現に理想的であり、その短い長さおよびＡＡＶベクターの限
られた能力のためにＡＡＶベクターで使用するのに特に適している。該プロモーターは、
保存された基本プロモーターエレメントおよび転写開始部位を含有するように設計された
。基本プロモーターは、肝臓特異的発現のためのいくつかの肝臓特異的転写因子結合部位
を有する５’末端で連結される（図１）。プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺
伝子およびヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７でのトランスフェクション実験を用いてインビトロ
で最初に同定され、次いでマウスにおいてインビボで確認されたように、高い活性を示す
。
いくつかの実施形態ではプロモーターは、これがイントロン（例えばプロモーターの３
’末端で）に作動可能に連結している発現カセットの一部である。これは、プロモーター
に連結された目的のポリヌクレオチドの発現レベルを高めるために行われてもよい。任意
の適切なイントロン、例えば、キメライントロンＣＩＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するこ
とができる。いくつかの実施形態では、イントロンはＶＨ４由来である。いくつかの実施
形態では、イントロンは短い非天然エクソンジャンクション配列をさらに含み得る。一実
施形態では、プロモーターおよびイントロンは一緒に、配列番号２のヌクレオチド配列、
または該配列と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列と少なく
とも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もし
くは９９％同一の配列を構成する、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。
プロモーターは、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結させることができる。いく
つかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドはポリペプチドまたは機能性核酸をコード
する。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ、
例えばＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩをコードする。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、配列番号
３のヌクレオチド配列、または配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一、
例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％もしくは９９％同一の配列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列から
なるポリヌクレオチドによりコードされてもよい。一実施形態では、プロモーター、イン
トロン、およびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩをコードする目的のポリヌクレオチドを含む発
現カセットは、配列番号４のヌクレオチド配列、または配列番号４のヌクレオチド配列と
少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を含む、該配列から本質的
になるまたは該配列からなる。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクター
である。ベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定
されない当分野で既知の任意の種類のベクターであってもよい。いくつかの実施形態では
、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの
実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型およ
び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、Ａ
ＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡ
ＡＶおよびヒツジＡＡＶならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むが
これらに限定されない、任意の既知のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである。いくつ
かの実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８またはＡＡＶ９である。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細
胞に関する（例えば、単離細胞、形質転換細胞、組換え細胞等）。そのため、本発明の様
々な実施形態は、ベクター（例えば発現カセット）を含有する組換え宿主細胞に関する。
そのような細胞は、遺伝子導入動物において単離するおよび／また存在することができる
。細胞の形質転換を以下でさらに記載する。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細
胞を含む遺伝子導入動物に関する。遺伝子導入動物を以下でさらに記載する。
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞は、医薬組成物に含まれ得る
。いくつかの実施形態は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／もしくは細胞、
ならびに／または例えば本発明の方法を実行するための試薬および／もしくはキットを使
用するための説明書を含むキットに関する。
改変第ＶＩＩＩ因子タンパク質
本発明の一態様は、１つまたは複数の追加の糖鎖付加部位を作製するために重鎖のアミ
ノ酸残基が改変されている、改変哺乳動物第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（例えばヒトＦＶ
ＩＩＩポリペプチド）に関する。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の糖鎖付加
部位は、重鎖のＣ末端、例えば重鎖の最後の１００アミノ酸残基、例えば最後の５０、４
０、３０、２０、１０、９、８、７、６または５残基にある。いくつかの実施形態では、
ポリペプチドは、少なくとも２つの糖鎖付加部位、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４もしくまたは１５のまたはより多く
の糖鎖付加部位を作製するために改変される。改変には、アミノ酸置換、付加、欠失、ま
たはこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。これらの改変は、インビボで発現したとき
に活性が増加するＦＶＩＩＩタンパク質を産生するように、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミ
ノ酸配列に導入される。
「追加の」糖鎖付加部位とは、ＦＶＩＩＩタンパク質中の糖鎖付加部位の数が、非改変
（例えば野生型）ＦＶＩＩＩタンパク質（例えば配列番号５）に通常存在する糖鎖付加部
位の数より大きいことを意味する。
本発明は、１つまたは複数の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５等）追加の糖側鎖を含有するＦＶＩＩＩタンパク質にさらに関す
る。そのような追加の糖側鎖は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の１つまたは複数の糖鎖
付加部位に存在することができる。また、追加の糖側鎖は、当分野で公知であるような、
そのような糖鎖をＦＶＩＩＩ分子に導入する化学的および／または酵素的方法の結果とし
て、ＦＶＩＩＩタンパク質上の部位に存在することができる。「追加の」または「新たな
」糖鎖とは、ＦＶＩＩＩタンパク質中の糖鎖の数が、ＦＶＩＩＩの「野生型」形態に通常
存在する糖鎖の数より大きいことを意味する。様々な実施形態では、約１から約５０の追
加の糖側鎖（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７
、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、
４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０）を追加することが
できる。
糖鎖付加部位は、Ｎ結合型糖鎖付加部位、Ｏ結合型糖鎖付加部位、ならびにＮ結合型糖
鎖付加部位およびＯ結合型糖鎖付加部位の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形
態では、追加される糖鎖付加部位にはＮ結合型糖鎖付加部位が含まれ、コンセンサス配列
はＮＸＴ／Ｓである（ただし、Ｘがプロリンでないことを条件とする）。他の実施形態で
は、糖鎖付加部位は、ＣＸＸＧＧＴ／Ｓ－Ｃ（配列番号２４）、ＮＳＴＥ／ＤＡ（配列番
号２５）、ＮＩＴＱＳ（配列番号２６）、ＱＳＴＱＳ（配列番号２７）、Ｄ／Ｅ－ＦＴ－
Ｒ／Ｋ－Ｖ（配列番号２８）、Ｃ－Ｅ／Ｄ－ＳＮ（配列番号２９）、ＧＧＳＣ－Ｋ／Ｒ（
配列番号３０）およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるコンセンサス
配列を含むＯ結合型糖鎖付加部位を含む。
いくつかの実施形態では約１から約１５糖鎖付加部位を、本発明のＦＶＩＩＩタンパク
質のアミノ酸配列に追加することができる。様々な実施形態では、約１から約５０糖鎖付
加部位（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、
２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４
１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０）を追加することがで
きる。
本明細書で使用する場合、「糖鎖付加部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｔｔａｃ
ｈｍｅｎｔ ｓｉｔｅ）」または「糖鎖付加部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔ
ｅ）」は、糖付加コンセンサス配列（すなわち、糖（単糖、オリゴ糖または多糖）をアミ
ノ酸配列に付加するためのコンセンサス配列として作用する一連のアミノ酸を意味し得、
または糖部分が共有結合している実際のアミノ酸残基を意味し得る。糖部分は、単糖（単
純な糖分子）、オリゴ糖または多糖であってもよい。
特定の実施形態では、追加のアミノ酸は重鎖を構成するアミノ酸残基のいずれかの間に
挿入することができ、および／または該アミノ酸残基のいずれかに代入することができる
。さらに、本発明の同じインサートを、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列の同じおよ
び／または異なる位置で複数回導入することができる。また、異なるインサートおよび／
または同じインサートを、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列全体にわたってアミノ酸
残基間の同じおよび／または異なる位置に１回または複数回導入することができる。
いくつかのタンパク質は多くの糖側鎖を支持することができ、Ｎ結合型糖鎖付加部位間
の距離はわずか３、４、５または６アミノ酸であってもよい（例えば、Ｌｕｎｄｉｎ他、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８１：５６０１（２００７）；Ａｐｗｅｉｌｅｒ他、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３：４（１９９１）を参照。それらの内容全体
が参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態では、野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６および
７３７は、アミノ酸残基ＸＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換される。そのため、残
基７３６および７３７はＳＳ、ＳＴ、ＴＳまたはＴＴとなり得る。
いくつかの実施形態では、野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６～７４
２は、アミノ酸残基ＸＸＹＶＮＲＸＬ（配列番号６）（ＸはＳまたはＴ）により置換され
る。そのため、残基７３６～７４２は以下となり得る。
Figure 0007437035000003
いくつかの実施形態では、野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６～７４
２は、アミノ酸残基ＸＸＮＮＸ（配列番号１５）（ＸはＳまたはＴ）により置換される。
そのため、残基７３６～７４０は以下となり得る。
Figure 0007437035000004
いくつかの実施形態では、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはＢドメインが欠失さ
れたもの、例えば、Ｓ７４３からＧｌｎ１６３８のＳＱ欠失（配列番号５にナンバリング
されている）である。
追加の糖鎖付加部位を有する本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＰＣＲを使用する部位
特異的変異誘発等の組換え方法により産生することができる。また、本発明のＦＶＩＩＩ
タンパク質は、化学的に合成されて１つまたは複数（例えば１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５等）の追加の糖鎖付加部位を有するＦＶ
ＩＩＩタンパク質を調製することができる。
当分野で公知の方法に従っておよび本明細書で教示したように、成熟ＦＶＩＩＩアミノ
酸配列の任意のアミノ酸残基を改変すること、ならびに公知の方法に従っておよび本明細
書に記載したように、任意の得られたＦＶＩＩＩタンパク質を活性、安定性、回復、半減
期等について試験することは、本発明および当業者の技能の範囲内である（例えば、その
内容全体が参照により本明細書に援用されるＥｌｌｉｏｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７９：１６８５４（２００４）を参照）。
本発明の実施形態は、ＦＶＩＩＩの活性および／または回復および／または半減期およ
び／または安定性を改善するために糖鎖付加部位が追加された組換えＦＶＩＩＩタンパク
質（例えば、Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２）に関する。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、本発明の
ＦＶＩＩＩタンパク質が投与された対象に対するＦＶＩＩＩタンパク質のバイオアベイラ
ビリティの増加を可能にする改変を含む。いくつかの実施形態ではバイオアベイラビリテ
ィの増加は、血漿中のＦＶＩＩＩの濃度が関連濃度となる血液学における標準的な現在の
考えを指す。本発明のいくつかの実施形態では、バイオアベイラビリティの増加は、より
長期間対象の循環にとどまるＦＶＩＩＩタンパク質の能力を指す。したがって、本発明の
いくつかの実施形態では、本明細書に記載したＦＶＩＩＩタンパク質は、インビボでの発
現後に活性を増加させたＦＶＩＩＩタンパク質をもたらすように改変され、いくつかの実
施形態では、本発明は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本
発明のベクターおよび／または本発明の細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象
におけるＦＶＩＩＩタンパク質の止血有効性を増加させる方法を提供する。これらの実施
形態のいずれかで対象に投与されるＦＶＩＩＩタンパク質は、活性を増加させた本発明の
ＦＶＩＩＩタンパク質である。
本発明に係るＦＶＩＩＩタンパク質は、当分野で公知のおよび本明細書に記載した方法
により産生され、ならびに該方法を特徴とする。これらの方法には、凝固時間の決定（部
分トロンボプラスチン時間（ＰＰＴ）アッセイ）、ならびに回復、半減期、およびバイオ
アベイラビリティを、当分野で公知であるような適切な免疫アッセイおよび／または活性
アッセイにより決定するための試験動物へのＦＶＩＩＩタンパク質の投与が含まれる。
本発明の追加の態様は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離されたポリヌ
クレオチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質を産生するための発現カセットを提供する。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクター
である。ベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定
されない、当分野で既知の任意の種類のベクターであり得る。いくつかの実施形態では、
ウイルスベクターは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む
）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡ
Ｖ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶおよびヒツ
ジＡＡＶならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むがこれらに限定さ
れない、任意の既知のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態で
は、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８またはＡＡＶ９である。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細
胞に関する（例えば、単離細胞、形質転換細胞、組換え細胞等）。そのため、本発明の様
々な実施形態は、ベクター（例えば発現カセット）を含有する組換え宿主細胞に関する。
そのような細胞は、遺伝子導入動物において単離するおよび／または存在することができ
る。細胞の形質転換を以下でさらに記載する。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細
胞を含む遺伝子導入動物に関する。遺伝子導入動物を以下でさらに記載する。
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞は、
医薬組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、ポリ
ヌクレオチド、ベクターおよび／もしくは細胞、ならびに／または例えば本発明の方法を
実行するための試薬および／もしくはキットを使用するための説明書を含むキットに関す
る。
本発明の方法
本発明のさらなる態様は、ポリペプチドまたは機能性核酸を例えば肝臓特異的に産生す
るための、本発明のプロモーターおよび発現カセットの使用に関する。そのため、一態様
は、対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、本発明のポリ
ヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象の
肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法に関する。ポリヌクレオ
チド、ベクターおよび／または形質転換細胞は、ポリペプチドまたは機能性核酸を産生す
るように目的のポリヌクレオチドの発現が生じる条件下で送達される。そのような条件は
当分野で公知であり、以下でさらに記載される。
本発明の別の態様は、本発明のプロモーターおよび発現カセットを使用して対象におけ
る血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これ
により対象における血友病Ａを処置することを含む方法に関する。いくつかの実施形態で
は、目的のポリヌクレオチドは、上記したＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。
本発明のさらなる態様は、本発明のプロモーターおよび発現カセットを使用して対象に
おけるＦＶＩＩＩポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有
効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達
し、これにより対象におけるＦＶＩＩＩポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加さ
せることを含む方法に関する。この態様では、目的のポリヌクレオチドは、上記したＦＶ
ＩＩＩポリペプチドをコードする。
本発明の改変ＦＶＩＩＩタンパク質は、それを必要とする対象（例えばヒト患者）に有
効量のＦＶＩＩＩタンパク質を投与することにより出血障害を処置する方法において使用
することができる。そのため、本発明はまた、それを必要とする対象に、有効量の、本発
明のＦＶＩＩＩタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞を投与する
ことを含む、出血障害を処置する方法も提供する。
本発明の一態様は、対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法本発明の改変ヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転
換細胞を対象に送達し、これにより対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む方
法に関する。
本発明の別の態様は、対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置
する方法であって、治療有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象に
おける血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置することを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラ
ビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送
達し、これにより対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを
増加させることを含む方法に関する。
本発明の方法に従って処置することができる出血障害として、血友病Ａおよび後天性Ｆ
ＶＩＩＩ欠乏症等の、ＦＶＩＩＩで処置することができるいずれかの障害が挙げられる。
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質および／または本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドを、対象（例えば、それを必要とする対象）に投与するまたは送達す
るためのそのような処置プロトコルおよび投与レジメンは、当分野で公知である。
本発明の実施形態では、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードするベクター（例えば
、ウイルスベクターまたはその他の核酸ベクター）の投与量は、ＦＶＩＩＩタンパク質の
治療血漿濃度が達成されるような量であり得る。ＦＶＩＩＩタンパク質の治療濃度は、平
均１００％で測定される健康な個体の正常レベルの１％超、故に、正常なヒト血漿１ｍＬ
中のＦＶＩＩＩの１国際単位（ＩＵ）超であるとみなされる。当業者は、特定の対象およ
び特定の状態に対する最適用量を決定することができる。
計画的介入と関連した処置について、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、典型的には介
入を行う前の約２４時間以内、およびその後７日以上にもわたって投与される。凝固剤と
しての投与は、本明細書に記載した様々な経路によることができる。
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のための非経口投与を主に対象として
いる。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、すなわち静脈内、皮下もしくは筋肉内に投
与される、または持続もしくはパルス注入により投与されてもよい。また、医薬組成物は
、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内に、肺内、膣内、直腸、眼
内を含むがこれらに限定されない様々な方法で、または任意のその他の許容される方法で
投与するために処方することができる。
非経口投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体と共に（
例えば、該担体に溶解された）本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を含む。水、緩衝水、０．
４％生理食塩水、０．３％グリシン等等の様々な水性担体を使用することができる。本発
明のＦＶＩＩＩタンパク質はまた、安定性および貯蔵を延長する、メチオニンおよびスク
ロース等の組成物と処方することもできる。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質はまた、傷害
の部位に送達するまたは該部位を標的とするためにリポソーム調製物中に処方することも
できる。リポソーム調製物は、例えば、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４
，５０１，７２８号および米国特許第４，９７５，２８２号に一般に記載されている。組
成物は、従来の公知の滅菌法により滅菌することができる。得られた水溶液は使用のため
にパッケージングする、または無菌条件下で濾過し凍結乾燥することができ、凍結乾燥調
製物は投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度
調節剤等等の、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム等の、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物
質を含有してもよい。組成物はまた、防腐剤、等張化剤、非イオン界面活性剤もしくは洗
浄剤、抗酸化剤および／またはその他の種々の添加剤も含有することができる。
これらの製剤におけるＦＶＩＩＩタンパク質の濃度は大きく異なり得（すなわち、通常
は約１重量％または少なくとも約１重量％のところ、約０．５重量％未満から約１５また
は２０重量％まで）、選択された特定の投与様式に従って主に流量、粘度等により選択さ
れる。そのため、１つの非限定例として、静脈内注入用の典型的な医薬組成物は、滅菌リ
ンゲル溶液２５０ｍｌおよびＦＶＩＩＩタンパク質１０ｍｇを含有するように構成され得
る。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に既知または明らかであり
、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシル
ベニア州（２００５）により詳細に記載されている。
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質および／または本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコード
する核酸分子を含む組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することが
できる。治療的適用では、組成物は、疾患およびその合併症を治癒する、軽減するまたは
部分的に停止させるのに十分な量で、上記した疾患に既に罹患している対象に投与される
。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」として定義される。当業者に理解され
るように、この目的に有効な量は、疾患または傷害の重症度ならびに対象の体重および全
般的状態に依存する。
予防的適用では、本発明のＦＶＩＩＩポリペプチドを含有する組成物は、疾患状態もし
くは傷害になりやすいまたはさもなければ疾患状態もしくは傷害のリスクがある対象に投
与されて、対象自身の凝固能力を高める。そのような量は「予防有効量」であると定義さ
れる。予防的適用では、正確な量はこの場合も対象の健康状態および体重に依存する。
組成物の単回または複数回投与は、担当医師により選択されている服用レベルおよびパ
ターンで実行され得る。毎日維持レベルを必要とする外来対象には、ＦＶＩＩＩタンパク
質は、例えば携帯ポンプシステムを使用して持続注入により投与することができる。
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、徐放または持続放出製剤に処方することもできる。
徐放または持続放出組成物を処方する方法は当分野で既知であり、該方法として、該ポリ
ペプチドを含有する固体疎水性粒子の半透性マトリックスが挙げられるがこれに限定され
ない。
例えば局所適用等の、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の局所送達は、例えば、スプレー
、灌流、ダブルバルーンカテーテル、人工血管もしくは血管ステントに組み込まれるステ
ント、バルーンカテーテルを被覆するのに使用されるハイドロゲル、またはその他の十分
に確立された方法によって実行することができる。いずれにしても、医薬組成物は、対象
を効果的に処置するのに十分なＦＶＩＩＩタンパク質の量を提供するべきである。
いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド（例えばＦＶＩＩＩタンパク質）は
ＡＡＶベクターを使用して対象に送達される。そのため、本発明はまた、目的のポリヌク
レオチドを含むＡＡＶウイルス粒子（すなわちビリオン）も提供し、ウイルス粒子はベク
ターゲノムをパッケージングし（すなわちカプシド形成し）、任意選択的にＡＡＶベクタ
ーゲノムをパッケージングする。
特定の実施形態では、ビリオンは、目的の異種ポリヌクレオチド、例えば細胞に送達す
るための異種ポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。そのため、本発明は、イン
ビトロでの、エクスビボでのおよびインビボでのポリヌクレオチドの細胞への送達に有用
である。代表的な実施形態では、本発明の組換えベクターを有利に用いて、ポリヌクレオ
チドを動物（例えば哺乳動物）細胞へ送達または移入させることができる。
本発明のウイルスベクターにより、任意の異種ヌクレオチド配列を送達することができ
る。目的のポリヌクレオチドとして、ポリペプチドをコードし、任意選択的に治療用（例
えば医学的用途のまたは獣医学的用途の）ポリペプチドおよび／または免疫原性（例えば
ワクチン用の）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
治療用ポリペプチドとして、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジスト
ロフィン（ジストロフィンのミニ遺伝子またはマイクロ遺伝子のタンパク質産物等、例え
ば、Ｖｉｎｃｅｎｔ他、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０、米
国特許公開第２００３０１７１３１号、Ｗａｎｇ他、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４～９［ミニジストロフィン］、Ｈａｒｐｅ
ｒ他、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：２５３～６１［マイクロジストロフィン
］を参照）；ミニアグリン、ラミニン－α２、サルコグリカン（α、β、γまたはδ）、
フクチン関連タンパク質、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、ドミナントネガ
ティブミオスタチン、血管新生因子（例えばＶＥＧＦ、アンジオポエチン－１またはアン
ジオポエチン－２）、抗アポトーシス因子（例えばヘムオキシゲナーゼ－１、ＴＧＦ－β
、プロアポトーシスシグナルの阻害因子、例えばカスパーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、
細胞死受容体［例えばＣＤ－０９５］、チトクロムＣ放出の調節因子、ミトコンドリアの
開孔および膨張の阻害因子）；アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、
例えばＩカッパＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、ミ
オスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント、細胞
周期調節因子、Ｒｈｏキナーゼ調節因子、例えば改変された細菌Ｃ３外酵素であるＣｅｔ
ｈｒｉｎ［ＢｉｏＡｘｏｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、サンローラン、ケ
ベック州、カナダから入手可能］、ＢＣＬ－ｘＬ、ＢＣＬ２、ＸＩＡＰ、ＦＬＩＣＥｃ－
ｓ、ドミナントネガティブカスパーゼ－８、ドミナントネガティブカスパーゼ－９、ＳＰ
Ｉ－６（例えば米国特許出願第２００７００２６０７６号を参照）、転写因子ＰＧＣ－α
１、Ｐｉｎｃｈ遺伝子、ＩＬＫ遺伝子およびチモシンβ４遺伝子）、凝固因子（例えば、
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エ
ンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、細胞内のおよび／または細胞外
のスーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、ネプリライシン、リポタン
パク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、ス
ペクトリン、α１－抗トリプシン、メチルシトシン結合タンパク質２、アデノシンデアミ
ナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブ
ロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸
デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えばα－インターフェロン、
β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン１～１４、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子、リンフォトキシン等）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子
およびホルモン（例えばソマトトロピン、インスリン、ＩＧＦ－１およびＩＧＦ－２等の
インスリン様増殖因子、ＧＬＰ－１、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、線維芽細胞増
殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子－３および神経栄養因子－４、脳由来神経栄養因子
、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子－αおよび形質転換増殖因子－β等）、骨形態
形成タンパク質（ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む）、リソソームタンパク質、グルタミ
ン酸受容体、リンフォカイン、可溶性ＣＤ４、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体、ＡｐｏＥ、Ａ
ｐｏＣ、タンパク質ホスファターゼ阻害因子１の阻害因子１（Ｉ－１）、ホスホランバン
、ｓｅｒｃａ２ａ、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、Ｂａｒ
ｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、
ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、カルサルシン、受容体（例えば腫瘍
壊死増殖因子－α可溶性受容体）、抗炎症性因子、例えばＩＲＡＰ、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ
－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣＦ－ＳＯＤ、カリクレイン、チモシン－β４、低
酸素誘導転写因子［ＨＩＦ］、血管新生因子、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニ
リルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子
、例えば短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ；ホスホランバン阻害分子またはドミナン
トネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、モノクローナル抗体（単鎖モノクロ
ーナル抗体を含む）または自殺遺伝子産物（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナ
ーゼ、ジフテリア毒素および腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ－α）、ならびにそれを必要と
する対象で治療効果を有する任意の他のポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されな
い。
ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列として、レポーターポリペプチドをコ
ードするもの（例えば酵素）が挙げられる。レポーターポリペプチドは当分野で既知であ
り、該レポーターポリペプチドとして、蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、Ｒ
ＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｄｓＲＥＤ２）、ルシフェラーゼ（例えば、ガウシア、ウミ
シイタケまたはホタル由来）等の検出可能な産物を産生する酵素、β－ガラクトシダーゼ
、β－グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子、または直接検出することができるタンパク質が挙げられる
がこれらに限定されない。事実上いずれのタンパク質も、例えばタンパク質に対する特異
抗体を使用することにより直接検出することができる。真核細胞の正の選択または負の選
択のいずれかに適した追加のマーカー（および関連抗生物質）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよ
びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプ
リング・ハーバー、ニューヨーク州、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ他（１９９２）、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（定期的更新を含む）に開示されている。
また、異種核酸は、機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイ
ム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されている）、スプライソソーム媒
介トランス－スプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ他、（１９９９）Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特
許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する低分子干渉ＲＮＡ
（ｓｉＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ他、（２０００）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２８７：２４３１を参照）、マイクロＲＮＡまたは「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａ
ｎ他、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９、Ｙ
ｕａｎ他に対する米国特許第５，８６９，２４８号）等のその他の非翻訳「機能性」ＲＮ
Ａ等をコードすることができる。例示的な非翻訳ＲＮＡとして、（例えば、腫瘍を治療す
るためのおよび／もしくは化学療法による損傷を予防するための心臓への投与のための）
多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ、ミオスタチ
ン（デュシェンヌ型のもしくはベッカー型の筋ジストロフィー）に対するＲＮＡｉまたは
アンチセンスＲＮＡ、ＶＥＧＦまたは（腫瘍を処置するための）本明細書に具体的に記載
した腫瘍免疫原が挙げられるがこれに限定されない腫瘍免疫原に対するＲＮＡｉまたはア
ンチセンスＲＮＡ、変異ジストロフィン（デュシェンヌ型のもしくはベッカー型の筋ジス
トロフィー）を標的とするＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、（Ｂ型肝炎
感染を防止および／もしくは処置するための）Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子に対するＲＮＡｉ
またはアンチセンスＲＮＡ、（ＨＩＶを予防および／もしくは処置するための）ＨＩＶｔ
ａｔ遺伝子および／またはＨＩＶｒｅｖ遺伝子に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮ
Ａ、ならびに／または（病原体から対象を保護するための）病原体由来の任意の他の免疫
原または（疾患を予防するまたは処置するための）欠陥遺伝子産物に対するＲＮＡｉまた
はアンチセンスＲＮＡが挙げられる。上記した標的または任意の他の標的に対するＲＮＡ
ｉまたはアンチセンスＲＮＡを研究試薬として用いることもできる。
当分野で知られているように、アンチセンス核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列お
よび阻害性ＲＮＡ（例えばマイクロＲＡＮおよびＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈ
ＲＮＡ）配列を使用して、ジストロフィン遺伝子の欠如から生じる筋ジストロフィーを有
する患者で「エクソンスキッピング」を誘発することができる。そのため、異種核酸は、
適切なエクソンスキッピングを誘発するアンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡをコードす
ることができる。エクソンスキッピングのための特定のアプローチはジストロフィン遺伝
子の根本的な欠如の性質に依存し、多くのそのような戦略が当分野で既知であることを当
業者は認識する。例示的なアンチセンス核酸配列および阻害性ＲＮＡ配列は、１つまたは
複数のジストロフィンエクソン（例えばエクソン１９または２３）の上流の分岐点および
／または下流のドナースプライス部位および／または内部スプライシングエンハンサー配
列を標的とする。例えば、特定の実施形態では、異種核酸は、ジストロフィン遺伝子のエ
クソン１９または２３の上流の分岐点および下流のスプライスドナー部位に対するアンチ
センス核酸または阻害性ＲＮＡをコードする。そのような配列を、改変Ｕ７ｓｎＲＮＡと
アンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡとを送達するＡＡＶベクターに組み込むことができ
る（例えばＧｏｙｅｎｖａｌｌｅ他、（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：１７９６～
１７９９を参照）。別の戦略として、改変Ｕ１ｓｎＲＮＡを、ジストロフィンエクソン（
例えばエクソン１９または２３）の上流のおよび下流のスプライス部位に相補的なｓｉＲ
ＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡと共にＡＡＶベクターに組み込むことが
できる（例えばＤｅｎｔｉ他、（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ １０３：３７５８～３７６３を参照）。さらに、アンチセンス核酸および阻害性ＲＮ
Ａは、エクソン１９、４３、４５または５３中のスプライシングエンハンサー配列を標的
とすることができる（例えば米国特許第６，６５３，４６７号、米国特許第６，７２７，
３５５号および米国特許第６，６５３，４６６号を参照）。
リボザイムとは、部位特異的な方法で核酸を切断するＲＮＡ－タンパク質複合体のこと
である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保持する特定の触媒ドメインを有する
（Ｋｉｍ他、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８７
８８、Ｇｅｒｌａｃｈ他、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：８０２、Ｆｏｒｓｔｅｒ
およびＳｙｍｏｎｓ、（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：２１１）。例えば、多くのリボザイ
ムは、高度に特異的なリン酸エステル転移反応を促進し、オリゴヌクレオチド基質のいく
つかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断することが多い（ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅ
ｓｔｈｏｆ、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：５８５、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ－
ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：１７３）。この特異性
は、化学反応前に基質が特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配
列（「ＩＧＳ」）に結合するという要求に起因している。
リボザイム触媒反応は、核酸に関わる配列特異的切断／連結反応の一部として主に観察
されている（Ｊｏｙｃｅ、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２１７）。例えば、米国
特許第５，３５４，８５５号では、ある種のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌク
レアーゼの配列特異性よりも高くてＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近いエンドヌクレアー
ゼとして作用することができることが報告されている。そのため、核酸発現の配列特異性
リボザイム媒介阻害は治療用途に特に適し得る（Ｓｃａｎｌｏｎ他、（１９９１）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５９１、Ｓａｒｖｅｒ他（１９９
０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２、Ｓｉｏｕｄ他、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２２３：８３１）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉｒ）とは、ｍＲＮＡの安定性を制御することにより多重遺伝子の
発現を調節することができる天然の細胞ＲＮＡ分子のことである。特定のマイクロＲＮＡ
の過剰発現または減少を使用して機能不全を処置することができ、多くの病状および疾患
の動物モデルで有効であることが分かっている（例えばＣｏｕｚｉｎ、（２００８）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ３１９：１７８２～４を参照）。遺伝的疾患および後天性疾患を処置するた
めに、またはある種の組織の機能性を高め増殖を促進するために、キメラＡＡＶを使用し
てマイクロＲＮＡを細胞、組織および対象中に送達することができる。例えば、ｍｉｒ－
１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６および／またはｍｉｒ－２０８を使用して心疾患お
よび骨格筋疾患を処置することができる（例えばＣｈｅｎ他、（２００６）Ｇｅｎｅｔ．
３８：２２８～３３、ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ他、（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．
２４：１５９～６６を参照）。マイクロＲＮＡを使用して、遺伝子送達後に免疫系を調節
することもできる（Ｂｒｏｗｎ他、（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０：４１４４～５２）
。
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（「アンチセンスＲＮＡ」を含む）は本明細
書で使用する場合、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に相補的であり特異的にハイブリ
ダイズする核酸を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれをコードする核酸を
、従来の技法に従って産生することができる。例えば、Ｔｕｌｌｉｓに対する米国特許第
５，０２３，２４３号、Ｐｅｄｅｒｓｏｎに対する米国特許第５，１４９，７９７号を参
照。
配列相同性の程度が、アンチセンスヌクレオチド配列のその標的（上記で定義した）へ
の特異的ハイブリダイズおよびタンパク質産物の産生の（例えば少なくとも約３０％、４
０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはより多くの）低減に十分
である限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に完全に相補的であることは必
要ではないことを当業者は認識する。
ハイブリダイゼーションの特異性を決定するために、低ストリンジェンシー条件下で、
中間ストリンジェンシー条件下で、さらにはストリンジェントな条件下で、そのようなオ
リゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを実行することができる。低ス
トリンジェンシーの、中間ストリンジェンシーのおよびストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件を実現するための適切な条件は本明細書に記載した通りである。
換言すると、特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的
配列の相補体と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％
のまたはより高い配列同一性を有し、タンパク質産物（上記で定義した）の産生を低減す
る。いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、標的配列と比較して１個、２個、３
個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のミスマッチを含有する。
核酸配列のパーセント同一性を決定する方法を、本明細書の他の箇所により詳細に記載
する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが目的の標的に特異的にハイブリダイズし、タンパク
質産物（上記で定義した）の産生を低減する限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長
さは重要ではなく、常法に従って決定することができる。一般に、アンチセンスヌクレオ
チドは、少なくとも約８、１０もしくは１２もしくは１５のヌクレオチド長であり、かつ
／または約２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７０未満、８０未満、
１００未満もしくは１５０未満のヌクレオチド長である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、タンパク質産物（例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）の
産生の低減に有用な別のアプローチである。ＲＮＡｉとは、目的の標的配列に対応する二
本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞または生物に取り込まれ、対応するｍＲＮＡが分解する
転写後遺伝子サイレンシング機構のことである。ＲＮＡｉにより遺伝子サイレンシングが
実現される機構は、Ｓｈａｒｐ他、（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：４８５～４
９０およびＨａｍｍｏｎｄ他、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０
～１１９）に概説されている。ＲＮＡｉの効果が複数回の細胞分裂にわたって持続した後
に遺伝子発現が回復する。したがって、ＲＮＡｉは、ＲＮＡレベルで、標的化したノック
アウトまたは「ノックダウン」を行う強力な方法である。ＲＮＡｉは、ヒト胚腎細胞およ
びＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞での成功が証明されている（例えばＥｌｂａｓｈｉｒ他、
Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４～８を参照）。
哺乳動物細胞でＲＮＡｉを使用する初期の試みにより、ｄｓＲＮＡ分子に応じたＰＫＲ
を含む抗ウイルス防御機構が得られた（例えばＧｉｌ他、（２０００）Ａｐｏｐｔｏｓｉ
ｓ ５：１０７を参照）。その後、「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）として既知である約
２１個のヌクレオチドの短い合成ｄｓＲＮＡが、抗ウイルス応答を誘発することなく哺乳
動物細胞でサイレンシングを媒介することができることが証明されている（例えばＥｌｂ
ａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４～８、Ｃａｐｌｅｎ他、（２０
０１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２を参照）。
ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ分子を含む）は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；Ｐａｄｄ
ｉｓｏｎ他、（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４
４３～１４４８を参照）であり得、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒの作用によ
り細胞内で２０～２５ｍｅｒのｓｉＲＮＡ分子にプロセシングされると考えられる。ｓｈ
ＲＮＡは一般に、ループアウトする短スペーサー配列により２つの逆方向反復配列が分離
されているステム－ループ構造を有する。３～２３のヌクレオオチド長の範囲のループを
有するｓｈＲＮＡが報告されている。ループ配列は一般に重要ではない。例示的なループ
構造として以下のモチーフが挙げられる：ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴ
ＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡ。
ＲＮＡｉは、センス領域とアンチセンス領域との間でのｄｓＲＮＡ形成時に「ダンベル
」型の構造を形成するために、両側に２つのループ領域を有するセンス領域およびアンチ
センス領域を含む環状分子をさらに含むことができる。この分子をインビトロまたはイン
ビボでプロセシングして、ｄｓＲＮＡ部分、例えばｓｉＲＮＡを遊離させることができる
。
国際特許公開ＷＯ０１／７７３５０には、真核細胞中で異種配列のセンス転写産物およ
びアンチセンス転写産物の両方を生成するための双方向性転写用のベクターが記載されて
いる。この技法を用いて、本発明に係る使用のためのＲＮＡｉを産生することができる。
Ｓｈｉｎａｇａｗａ他、（２００３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：１３４０には、ＣＭ
Ｖプロモーター（ｐｏｌ ＩＩプロモーター）由来の長ｄｓＲＮＡを発現させる方法が報
告されており、この方法を組織特異的ｐｏｌ ＩＩプロモーターに適用することもできる
。同様に、Ｘｉａ他、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６のア
プローチはポリ（Ａ）尾部付加を回避し、組織特異的プロモーターに関連して使用され得
る。
ＲＮＡｉを生成する方法として、化学合成、インビトロ転写、（インビトロまたはイン
ビボでの）Ｄｉｃｅｒによる長ｄｓＲＮＡの消化、送達ベクターからのインビボでの発現
、およびＰＣＲ由来ＲＮＡｉ発現カセットからのインビボでの発現が挙げられる（例えば
Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，オースティン テキサス州からのＴｅｃｈＮｏｔｅｓ １０（
３）“Ｆｉｖｅ Ｗａｙｓ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｉＲＮＡｓ”を参照；ｗｗｗ．ａ
ｍｂｉｏｎ．ｃｏｍで入手可能）。
ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのガイドラインが入手可能である（例えばＡｍｂｉｏｎ
，Ｉｎｃ．，オースティン テキサス州からの文献を参照；ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏ
ｍで入手可能）。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列は約３０～５０％のＧ／Ｃ含有量
を有する。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩをＲＮＡの転写に使用する場合、４個のＴ
残基またはＡ残基よりも大きい長ストレッチを一般に避ける。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａ
ｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｗｗｗ．ｊ
ｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を介してＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏ
ｎ．ｃｏｍ）から、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．
ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ）から、オンラインｓｉＲＮＡターゲットファインダー（Ｏ
ｎｌｉｎｅ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｆｉｎｄｅｒ）が入手可能である。
ＲＮＡｉ分子のアンチセンス領域は標的配列に完全に相補的であり得るが、該アンチセ
ンス領域が標的配列（上記に定義した）に特異的にハイブリダイズしてタンパク質産物の
産生を（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％
、９５％またはより多く）低減する限り、標的配列に完全に相補的である必要はない。い
くつかの実施形態では、上記で定義したように、そのようなオリゴヌクレオチドの標的配
列へのハイブリダイゼーションを低ストリンジェンシー条件下で、中間ストリンジェンシ
ー条件下で、さらにはストリンジェントな条件下で実行することができる。
その他の実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス領域は、標的配列の相補体と少なくと
も約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％のまたはより高い配列同
一性を有し、タンパク質産物の産生を（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６
０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはより多く）低減する。いくつかの実施形態
では、アンチセンス領域は、標的配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、
７個、８個、９個または１０個のミスマッチを含有する。ミスマッチは、ｄｓＲＮＡの中
心部分よりも端部で一般に許容される。
特定の実施形態では、ＲＮＡｉは、２つの別々のセンス分子とアンチセン分子との間の
分子間複合体化により形成される。ＲＮＡｉは、２つの別々の鎖の間の分子間塩基対合に
より形成される二本鎖領域を含む。その他の実施形態では、ＲＮＡｉは、典型的には逆方
向反復として、センス領域およびアンチセンス領域の両方を含む単一の核酸分子内の分子
間塩基対合により形成されたｄｓ領域を含む（例えばｓｈＲＮＡもしくはその他のステム
ループ構造、または環状ＲＮＡｉ分子）。ＲＮＡｉは、センス領域とアンチセンス領域と
の間にスペーサー領域をさらに含むことができる。
一般に、ＲＮＡｉ分子は高選択的である。必要に応じて、当業者は、例えばＢＬＡＳＴ
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）を使用して、そ
の他の既知の配列との実質的な配列相同性を有しないＲＮＡｉ配列を同定すべく関連する
データベースを検索することにより、標的以外の核酸の発現を妨げる可能性がある候補Ｒ
ＮＡｉを容易に除くことができる。
ＲＮＡｉの産生用キットは市販されており、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ，Ｉｎｃ．およびＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から市販されている。
組換えウイルスベクターはまた、宿主染色体の遺伝子座と相同性を共有し該遺伝子座と
組み換わる異種ヌクレオチド配列を含むこともできる。このアプローチを用いて、宿主細
胞での遺伝子欠損を修正することができる。
本発明はまた、例えばワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現する組換え
ウイルスベクターも提供する。異種核酸は、当分野で既知の目的の任意の免疫原をコード
することができ、該免疫原して、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａ
ｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原等からの免疫原が挙げられ
るがこれらに限定されない。また、免疫原は、ウイルスカプシド中に存在する（例えばウ
イルスカプシド中に組み込まれる）ことができる、または（例えば共有結合改変により）
ウイルスカプシドに繋がれ得る。
パルボウイルスのワクチンとしての使用は当分野で既知である（例えばＭｉｙａｍｕｒ
ａ他、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８５０７、Ｙ
ｏｕｎｇ他に対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａ他に対する米国特
許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他に対
する米国特許第５，８６３，５４１号、これらの開示はその全体が参照により本明細書に
援用される）。抗原がウイルスカプシド中に存在することができる。また、組換えベクタ
ーゲノムに導入した異種核酸から抗原を発現させることができる。
免疫原性ポリペプチドまたは免疫原は、疾患に対して対象を防御するのに適した任意の
ポリペプチドであり得、該疾患として、微生物による疾患、細菌による疾患、原虫による
疾患、寄生虫による疾患、真菌による疾患およびウイルスによる疾患が挙げられるがこれ
らに限定されない。例えば、免疫原は、オルソミクソウイルス免疫原（例えばインフルエ
ンザウイルス免疫原、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）表面タンパク
質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質遺伝子、またはウマインフルエンザウイ
ルス免疫原）、またはレンチウイルス免疫原（例えばウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サ
ル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例
えばＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶ
のマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ遺伝子産
物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｅｎｖ遺伝子産物）であり得る。免疫原はまた、アレナウイ
ルス免疫原（例えばラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルスのヌクレオカプシ
ドタンパク質遺伝子およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子）、ポックスウイル
ス免疫原（例えばワクシニア、例えばワクシニアのＬ１遺伝子またはＬ８遺伝子）、フラ
ビウイルス免疫原（例えば黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィ
ロウイルス免疫原（例えばエボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原、例
えばＮＰ遺伝子およびＧＰ遺伝子）、ブニヤウイルス免疫原（例えばＲＶＦＶウイルス、
ＣＣＨＦウイルスおよびＳＦＳウイルス）、またはコロナウイルス免疫原（例えば感染性
ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスのエンベロープ糖タンパク質遺伝
子またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原また
は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）免疫原、例えばＳ［Ｓ１もしくはＳ２］タンパク質
、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質またはＮタンパク質またはそれらの免疫原性フラグメント
）であることもできる。免疫原はさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えばＣＭＶ
免疫原、ＥＢＶ免疫原、ＨＳＶ免疫原）、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫
原、ジフテリア毒素もしくはその他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えばＡ型
肝炎、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎）免疫原または当分野で既知の任意の他のワクチン免疫
原であり得る。
また、免疫原は、任意の腫瘍細胞抗原または癌細胞抗原であり得る。任意選択的に、腫
瘍抗原または癌抗抗原を癌細胞の表面上で発現させる。例示的な癌細胞抗原および腫瘍細
胞抗原がＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１）
に記載されている。例示的な癌抗原および腫瘍抗原として、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲ
ＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ
、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡ
Ａ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、ＭＡＲＴ－１（Ｃｏｕｌｉ
ｅ他、（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５）を含むメラノーマ腫瘍抗原（Ｋ
ａｗａｋａｍｉ他、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１
：３５１５、Ｋａｗａｋａｍｉ他、（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０：３４７
、Ｋａｗａｋａｍｉ他、（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ｇｐ１
００（Ｗｉｃｋ他、（１９８８）Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４：２０１）ならびに
ＭＡＧＥ抗原（ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２およびＭＡＧＥ－３）（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂ
ｒｕｇｇｅｎ他、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１６４３）、ＣＥＡ、ＴＲＰ－
１；ＴＲＰ－２；Ｐ－１５およびチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ他、（１９９３）Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９
６８，６０３号）；ＣＡ１２５；ＨＥ４；ＬＫ２６；ＦＢ５（エンドシアリン）；ＴＡＧ
７２；ＡＦＰ；ＣＡ１９－９；ＮＳＥ；ＤＵ－ＰＡＮ－２；ＣＡ５０；Ｓｐａｎ－１；Ｃ
Ａ７２－４；ＨＣＧ；ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）；ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質；ＰＳ
Ａ；Ｌ－ＣａｎＡｇ；エストロゲン受容体；乳脂肪グロブリン；ｐ５３腫瘍サプレッサー
タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２
３）；ムチン抗原（国際特許公開ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリック
スタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；ならびに以下の癌
に関連する抗原：メラノーマ、腺がん、胸腺腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、非ホジキ
ンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚部癌
、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、頭頚部癌およびその他（例え
ばＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１～９１を参
照）が挙げられるがこれらに限定されない。
また、異種ヌクレオチド配列は、望ましくはインビトロ、エクスビボでまたはインビボ
で細胞中において産生される任意のポリペプチドをコードすることができる。例えば、ウ
イルスベクターを培養細胞に導入し、発現したタンパク質産物を培養細胞から単離するこ
とができる。
目的の異種ポリヌクレオチドを適切な制御配列と作動可能に結合させることができるこ
とを当業者は理解する。例えば、異種核酸を、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制
御シグナル、複製開始点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ
）、プロモーター、エンハンサー等と作動可能に結合させることができる。
所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて様々なプロモーター／エンハンサーエレメ
ントを使用することができることを当業者はさらに認識する。所望の発現パターンに応じ
て、プロモーター／エンハンサーは構成的であり得る、または誘導性であり得る。プロモ
ーター／エンハンサーは生来または外来性であり得、天然配列または合成配列であり得る
。外来性とは、転写開始領域が、該転写開始領域が導入されている野生型宿主において見
出されないことを意図するものである。
プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞もしくは処置する対象に対して生
来であり得、および／または異種核酸配列に対して生来であり得る。プロモーター／エン
ハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞中で機能することができるように選択され
る。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは哺乳動物のプロモ
ーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅ
）エレメントは構成的または誘導性であり得る。
誘導性発現制御エレメントは一般に、異種核酸配列の発現に対する調節をもたらすこと
が望ましい用途で使用される。遺伝子送達用の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメ
ントは、組織特異的なまたは組織優先的なプロモーター／エンハンサーエレメントであり
得、該エレメントには、（心臓、骨格および／または平滑筋を含む）筋肉に特異的なまた
は優先的な、（脳特異的を含む）神経組織に特異的なまたは優先的な、（網膜特異的およ
び角膜特異的を含む）眼、肝臓に特異的なまたは優先的な、骨髄に特異的なまたは優先的
な、膵臓に特異的なまたは優先的な、脾臓に特異的なまたは優先的な、および肺に特異的
なまたは優先的なプロモーター／エンハンサーエレメントが含まれる。その他の誘導性プ
ロモーター／エンハンサーエレメントとして、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導
性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとし
て、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６－誘導性プロモーター、エクジソン誘導性
プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが
挙げられるがこれらに限定されない。
標的細胞において異種核酸配列が転写され、次いで翻訳される実施形態では、挿入され
たタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルを一般に用いる
。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含むことができるこれらの外因性翻訳制御配列は様
々な起源であり得、すなわち天然および合成のどちらでもあることができる。
本発明は、本発明のウイルスベクターを産生する方法をさらに提供する。代表的な実施
形態では、本発明は、組換えウイルスベクターを産生する方法であって、細胞にインビト
ロで、（ａ）（ｉ）目的のポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）ＡＡＶテンプレートのウイル
ス粒子へのカプシド形成に十分なパッケージングシグナル配列（例えば、ＡＡＶ末端反復
等の１つまたは複数の（例えば２つの）末端反復）を含むテンプレートと、（ｂ）テンプ
レートの複製およびウイルス粒子へのカプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ
ｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列）とを提供することを含む方法を提供する。カプシド
内にパッケージングされたテンプレートを含む組換えウイルス粒子が細胞中で産生される
ような条件下で、テンプレート配列およびＡＡＶ複製配列およびカプシド配列が提供され
る。本方法は、細胞からウイルス粒子を回収する工程をさらに含むことができる。培地か
らかつ／または細胞を溶解させることにより、ウイルス粒子を回収することができる。
一つの例示的な実施形態では、本発明は、ＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を産生す
る方法であって、細胞にインビトロで、ＡＡＶカプシドをコードする核酸、ＡＡＶｒｅｐ
コード配列、目的のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターゲノムおよび増殖性ＡＡＶ感
染を生じさせるヘルパー機能を提供すること、ならびにＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子
の組み立てを可能にし、ＡＡＶベクターゲノムをカプシド形成することを含む方法を提供
する。
細胞は典型的には、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞である。哺乳動物細胞等の当分
野で既知の任意の適切な細胞を用いることができる。複製欠陥性ヘルパーウイルス、例え
ば２９３細胞またはその他のＥ１ａトランス相補性細胞から欠失した機能を提供するトラ
ンス相補性パッケージング細胞株も適している。
当分野で既知の任意の方法により、ＡＡＶ複製配列およびカプシド配列を供給すること
ができる。最新のプロトコルにより、単一のプラスミド上でＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子
が典型的には発現される。ＡＡＶ複製配列およびパッケージング配列を共に供給する必要
はないが、そのようにすることが便利な場合がある。ＡＡＶｒｅｐ配列および／またはＡ
ＡＶｃａｐ配列を、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにより供給するこ
とができる。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を、ハイブリッドアデノウイルスベクターまた
はハイブリッドヘルペスウイルスベクターにより供給することができる（例えば、欠失ア
デノウイルスベクターのＥａ１領域またはＥ３領域に挿入することができる）。ＥＢＶベ
クターを用いてＡＡＶｃａｐ遺伝子およびＡＡＶｒｅｐ遺伝子を発現させることもできる
。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続的な細胞分裂を
通して高コピー数を維持することができる（すなわち、ＥＢＶベースの核エピソームと命
名した染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる）ことである。
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は細胞内で安定的に保有され得る（エピソー
ムであり得る、または組み込まれ得る）。
典型的には、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列がＡＡＶパッケージング配列（例えばＡＡＶ
ＩＴＲ）に隣接せず、これらの配列の救済および／またはパッケージングを防止すること
ができる。
当分野で既知の任意の方法を使用して、テンプレート（例えばｒＡＡＶベクターゲノム
）を細胞に供給することができる。例えば、非ウイルス（例えばプラスミド）ベクターま
たはウイルスベクターにより、テンプレートを供給することができる。特定の実施形態で
は、テンプレートは、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターにより供
給される（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａ領域またはＥ３領域に挿入される）。別
の例示として、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルス
ベクターがＰａｌｏｍｂｏ他、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５０２５に記載され
ている。ＥＢＶベクターを用いて、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記に記載したように
テンプレートを送達することもできる。
別の代表的な実施形態では、ｒＡＡＶウイルスを複製することによりテンプレートが供
給される。さらに他の実施形態では、ＡＡＶプロウイルスが細胞の染色体に安定的に組み
込まれる。
最大のウイルス力価を得るために、増殖性ＡＡＶ感染に必須のヘルパーウイルス機能（
例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に概して供給される。ＡＡＶ複製
に必要なヘルパーウイルス配列は当分野で既知である。典型的には、これらの配列は、ヘ
ルパーアデノウイルスベクターまたはヘルパーヘルペスウイルスベクターにより供給され
る。また、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターにより、例えばＦｅｒｒａｒ
ｉ他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５ならびに米国特許第６，０４０
，１８３号および米国特許第６，０９３，５７０号に記載されているように効率的なＡＡ
Ｖ産生に必要である全てのヘルパー遺伝子を保有する非感染性のアデノウイルスミニプラ
スミドとして、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列を供給することができる
。
さらに、染色体に組み込まれた、または安定的な染色体外エレメントとして維持された
ヘルパー遺伝子を有するパッケージング細胞により、ヘルパーウイルス機能を提供するこ
とができる。代表的な実施形態では、ヘルパーウイルス配列をＡＡＶビリオン中にパッケ
ージングすることはできず、例えばＡＡＶ ＩＴＲに隣接していない。
ＡＡＶ複製配列およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えばアデノウイ
ルス配列）を単一のヘルパー構築物上に供給することが有利であり得ることを当業者は認
識する。このヘルパー構築物は非ウイルス構築物またはウイルス構築物であり得るが、任
意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイ
ブリッドヘルペスウイルスであり得る。
一つの特定の実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによりＡＡＶｒｅ
ｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。このベクターはｒＡＡ
Ｖテンプレートをさらに含有する。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶテ
ンプレートを、アデノウイルスの欠失領域（例えばＥ１ａ領域またはＥ３領域）に挿入す
ることができる。
さらなる実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによりＡＡＶｒｅｐ／
ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。ｒＡＡＶテンプレートはプ
ラスミドテンプレートとして供給される。
別の例示的な実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによりＡＡＶｒｅ
ｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給され、ｒＡＡＶテンプレートは
プロウイルスとして細胞に組み込まれる。また、染色体外エレメントとして（例えば「Ｅ
ＢＶベースの核エピソーム」として、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ、（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）細胞内に維持されるＥＢＶ
ベクターによりｒＡＡＶテンプレートが供給される。
さらに例示的な実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーによりＡＡＶｒｅｐ／ｃ
ａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。ｒＡＡＶテンプレートは別々
の複製ウイルスベクターとして供給される。例えば、ｒＡＡＶ粒子によりまたは別の組換
えアデノウイルス粒子によりｒＡＡＶテンプレートを供給することができる。
上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの複製
およびパッケージングに十分なアデノウイルスの５’シス配列および３’シス配列（すな
わち、アデノウイルスの末端反復およびＰＡＣ配列）を典型的には含む。ＡＡＶｒｅｐ／
ｃａｐ配列および存在する場合にはｒＡＡＶテンプレートはアデノウイルスバックボーン
に埋め込まれており、５’シス配列および３’シス配列に隣接しており、そのため、これ
らの配列をアデノウイルスカプシド中にパッケージングすることができる。上記に記載し
たように、代表的な実施形態では、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶｒｅｐ／ｃ
ａｐ配列はＡＡＶパッケージング配列（例えばＡＡＶ ＩＴＲ）に隣接しておらず、その
ため、これらの配列はＡＡＶビリオン中にパッケージングされない。
ＡＡＶパッケージング法において、ヘルペスウイルスをヘルパーウイルスとして使用す
ることもできる。ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは
、よりスケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを有利に促進することができる。ＡＡ
Ｖ－２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ－２ｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペス
ウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）が記載されている（Ｃｏｎｗａｙ他、（１９９９）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６およびＷＯ００／１７３７７、これらの開示はその全体が
本明細書に援用される）。
さらなる代替として、Ｕｒａｂｅ他、（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ １３：１９３５～４３に記載されているようにｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡ
Ｖテンプレートの送達にバキュロウイルスベクターを使用して、本発明のウイルスベクタ
ーを昆虫細胞中で産生することができる。
ＡＡＶを産生するその他の方法は、安定的に形質転換されたパッケージング細胞を使用
する（例えば米国特許第５，６５８，７８５号を参照）。
当分野で既知の任意の方法により、ヘルパーウイルスの夾雑がないＡＡＶベクタースト
ックを得ることができる。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスをサイズに基づいて容
易に区別することができる。ＡＡＶをヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウ
イルスから分離することもできる（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ他、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。代表的な実施形態では、いかなる夾雑ヘルパーウイルスも
複製能を有しないように、欠失した複製欠損ヘルパーウイルスを使用する。さらなる代替
として、アデノウイルスの初期遺伝子発現のみがＡＡＶウイルスのパッケージングの媒介
に必要であることから、後期遺伝子発現を欠いているアデノウイルスヘルパーを用いるこ
とができる。後期遺伝子発現が不完全なアデノウイルス変異体は当分野で既知である（例
えばｔｓ１００Ｋアデノウイルス変異体およびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
本発明のパッケージング法を用いて、ウイルス粒子の高力価ストックを産生することが
できる。特定の実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも約１０５形質導入単位（
ｔｕ）／ｍｌ、少なくとも約１０６ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０７ｔｕ／ｍｌ、少なく
とも約１０８ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０９ｔｕ／ｍｌまたは少なくとも約１０１０ｔ
ｕ／ｍｌの力価を有する。
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中の本発明のウイルスベクタ
ーと、任意選択的にその他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希
釈剤等とを含む医薬組成物を提供する。注射では、担体は典型的には液体となる。その他
の投与の方法では、担体は固体でもよいし液体でもよい。吸入投与では、担体は呼吸に適
し、好ましくは固体または液体粒子形態となる。
「薬学的に許容される」とは、毒性ではないまたはそれ以外の望ましくはないものでは
ない材料を意味し、すなわち、任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく材
料を対象に投与することができる。
本発明の一態様は、目的のポリヌクレオチドをインビトロで細胞へ移入する方法である
。特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法により、感染の適切な多重度でウイルスベ
クターを細胞に導入することができる。投与するウイルスベクターまたはカプシドの力価
は、標的細胞の型および数、ならびに具体的なウイルスベクターまたはカプシドに応じて
異なることができ、過度の実験を行うことなく当業者により決定され得る。特定の実施形
態では、少なくとも約１０３感染単位を、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位を
細胞に導入する。
ウイルスベクターを導入することができる細胞は、神経細胞（末梢神経系、中枢神経系
、特に脳細胞、例えば神経細胞、希突起神経膠細胞、グリア細胞、星状膠細胞を含む）、
肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば
腸上皮細胞および呼吸上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管および筋繊維を含む）、
横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細
胞、上皮細胞を含む）、心臓細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば骨髄幹細胞）、造
血幹細胞、脾臓細胞、角化細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば
軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む）、生殖細胞等が挙げられるがこれらに限定されな
い任意の種類であり得る。また、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらにまた、細胞は
幹細胞（例えば神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。さらにまた、細胞は癌細胞または腫
瘍細胞（上記に記載している癌および腫瘍）であり得る。さらに、上記に示したように、
細胞は任意の種類の起源由来であり得る。
改変細胞を対象に投与する目的で、ウイルスベクターをインビトロで細胞に導入するこ
とができる。特定の実施形態では、対象から細胞を取り出し、細胞にウイルスベクターを
導入し、次いで細胞を対象内に戻す。エクスビボでの処置のために対象から細胞を取り出
し、続いて対象内に戻す方法は当分野で既知である（例えば米国特許第５，３９９，３４
６号を参照）。または、組換えウイルスベクターを、別の対象由来の細胞に、培養細胞に
、または任意のその他の適切な供給源由来の細胞に導入し、それを必要とする対象に該細
胞を投与する。
エクスビボでの遺伝子治療に適した細胞は上記に記載した通りである。対象に投与する
細胞の投与量は、対象の年齢、状態および種、細胞型、細胞により発現される核酸、投与
の様式等に応じて異なることができる。典型的には、薬学的に許容される担体中、投与１
回当たり少なくとも約１０２～約１０８個のまたは約１０３～１０６個の細胞を投与する
ことができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターにより形質導入された細胞を有効
量で、薬学的に許容される担体と共に対象に投与する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターにより形質導入されている細胞を投与して
、送達されたポリペプチド（例えば導入遺伝子として発現される、またはカプシド中で発
現される）に対する免疫応答を誘発することができる。典型的には、有効量のポリペプチ
ドを発現する量の細胞を、薬学的に許容される担体と共に投与する。任意選択的に、投与
量は防御免疫応答（上記で定義した）を引き起こすのに十分である。免疫原性ポリペプチ
ドを投与する利点が該投与の任意の不利益を上回る限り、付与される防御の程度が完全で
ある必要はない、または持続性である必要はない。
本発明のさらなる態様は、本発明のウイルスベクターを対象に投与する方法である。特
定の実施形態では、本方法は、目的のポリヌクレオチドを動物対象に送達する方法を含み
、該方法は、有効量の、本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与することを含む
。当分野で既知の任意の手段により、それを必要とするヒト対象または動物に本発明のウ
イルスベクターを投与することができる。任意選択的に、薬学的に許容される担体中のウ
イルスベクターを有効な用量で送達する。
さらに、本発明のウイルスベクターを（例えばワクチンとして）対象に投与して、免疫
原性応答を誘発することができる。典型的には、本発明のワクチンは、有効量のウイルス
を薬学的に許容される担体と共に含む。任意選択的に、投与量は防御免疫応答（上記で定
義した）を引き起こすのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与する利点が該投与の
任意の不利益を上回る限り、付与される防御の程度が完全である必要はない、または持続
性である必要はない。対象および免疫原は上記に記載した通りである。
対象に投与するウイルスベクターの投与量を、投与の様式、処置する疾患または状態、
個々の対象の状態、具体的なウイルスベクターおよび送達する核酸によって決めることが
でき、定常的な方法で決定することができる。治療効果を達成する例示的な用量は、少な
くとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１
０３、１０１４、１０１５形質導入単位またはより多くであり、好ましくは約１０７また
は１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４形質導入単
位であり、さらにより好ましくは約１０１２形質導入単位である。
特定の実施形態では、複数回の投与（例えば２回、３回、４回またはより多くの投与）
を用いて、様々な間隔の期間にわたり、例えば日毎に、週毎に、月毎に、年毎に等で所望
のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
投与の例示的な様式として、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、（例えばエアロゾル
を介する）吸入、口腔（例えば舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）
、非経口（例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋へ
の投与等］、皮内、胸腔内、脳内および関節内）、局所（例えば皮膚表面と気道表面を含
む粘膜表面との両方、および経皮投与）、リンパ管内等、ならびに組織または器官への（
例えば肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）直接注入が挙げられる。腫瘍（例え
ば腫瘍またはリンパ節の内部または近傍）に投与することもできる。いずれの場合であっ
ても、最も適切な経路を、処置する状態の性質および重症度、ならびに使用する具体的な
ベクターの性質によって決めることができる。
ウイルスベクターを含むデポー剤を送達することにより、これらの組織のいずれかへの
送達を達成することもでき、デポー剤は、組織に埋め込むことができ、または該組織を、
ウイルスベクターを含むフィルムまたはその他のマトリックスと接触させることができる
。そのような埋め込み可能なマトリックスまたは基質の例が米国特許第７，２０１，８９
８号）に記載されている。
本発明を使用して、組織または器官の障害を処置することができる。また、本発明を実
行して、核酸を組織または器官に送達することができ、本発明は、通常は血液中を循環す
るタンパク質産物（例えば酵素）もしくは非翻訳ＲＮＡ（例えばＲＮＡｉ、マイクロＲＮ
Ａ、アンチセンスＲＮＡ）の産生用の、または疾患（例えば代謝障害、例えば糖尿病（例
えばインスリン）、血友病（例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子）またはリソソー
ム蓄積障害（例えばゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸性
α－グルコシダーゼ］またはファブリー病［α－ガラクトシダーゼＡ］またはグリコーゲ
ン蓄積障害（例えばポンペ病［リソソーム酸性αグルコシダーゼ］）を処置するためのそ
の他の組織への全身的送達用のプラットフォームとして使用される。代謝障害の処置に適
したその他のタンパク質は上記に記載されている。
注射剤を、溶液または懸濁液、注射前に溶液または懸濁液に適した固形状として、また
はエマルションとしてのいずれかの従来の形態で調製することができる。また、ウイルス
ベクターを例えばデポー剤または徐放性製剤で全身的な様式ではなくて局所に投与するこ
とができる。さらに、（例えば米国特許第７，２０１，８９８号に記載されているように
）ウイルスベクターを、例えば骨移植代替物、縫合糸、ステント等の外科的に埋め込み可
能なマトリックスに乾燥して送達することができる。
経口投与に適した医薬組成物を、それぞれ所定の量の本発明の組成物を含有するカプセ
ル、カシェ剤、ロゼンジ剤もしくはタブレット等の個別の単位で；粉末または顆粒として
；水性のもしくは非水性の液体の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型のもしくは
油中水型のエマルションとして提供することができる。本発明のウイルスベクターと動物
の腸内において消化酵素による分解に耐えることが可能な担体との複合体化により、経口
送達を行うことができる。そのような担体の例として、当分野で既知であるようにプラス
チックカプセルまたはタブレットが挙げられる。そのような製剤を薬学の任意の適切な方
法により調製し、該方法は、組成物と、（上記で述べた１種または複数の副成分を含有す
ることができる）好適な担体とを結合させる工程を含む。一般に、組成物と液体の担体も
しくは微粉化した固体の担体またはその両方とを均一にかつ密接に混合し、次いで、必要
な場合には得られた混合物を成形することにより、本発明の実施形態に係る医薬組成物を
調製する。例えば、組成物と任意選択的に１種または複数の副成分とを含有する粉末また
は顆粒を圧縮するまたは成型することにより、タブレットを調製することができる。結合
剤、潤滑剤、不活性希釈剤および／または界面活性剤／分散剤と任意選択的に混合した、
粉末または顆粒等の易流動形態の組成物を適切な機械中で圧縮することにより、圧縮タブ
レットを調製する。不活性な液体結合剤で湿らせた粉末状化合物を適切な機械中で成型す
ることにより、成型タブレットを作製する。
頬側（舌下）投与に適した医薬組成物として、通常はスクロースおよびアラビアゴムま
たはトラガントである風味付け基剤中に本発明の組成物を含むロゼンジ剤；ならびにゼラ
チンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアゴム等の不活性基剤中に組成物を
含むパステル剤が挙げられる。
非経口投与に適した医薬組成物は、本発明の組成物の無菌の水性注射液および非水性注
射液を構成することができ、これらの調製液は、対象の受容者の血液と任意選択的に等張
である。これらの調製液は、組成物と対象の受容者の血液とを等張にする抗酸化剤、緩衝
剤、静菌薬および溶液を含有することができる。水性のおよび非水性の無菌の懸濁液、溶
液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エ
チル等の注射可能な有機エステルである。水性担体として、水、アルコール性／水性の溶
液、食塩水および緩衝媒体を含むエマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体と
して、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｄｅｘｔｒｏ
ｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル（ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒ
ｉｎｇｅｒ’ｓ）または不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体として、流体および栄養補
充液、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースをベースとするもの）等が挙げられ
る。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス等の、防腐剤およびその他の
添加剤が存在することもできる。
組成物は、単位／用量のまたは複数回用量の容器中の状態で、例えば密封したアンプル
およびバイアル中の状態で存在することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば食塩
水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライした（凍結乾燥した）状態で貯
蔵され得る。
即時注射用の溶液および懸濁液を、上記した種類の無菌の粉末、顆粒およびタブレット
から調製することができる。例えば、密封した容器中における単位剤形の形態で、本発明
の注射可能な安定した無菌の組成物を提供することができる。組成物を凍結乾燥した形態
で提供することができ、該組成物を適切な薬学的に許容される担体と再構成して対象への
注射に適した液体組成物を形成することができる。単位剤形は、約１μｇ～約１０グラム
の本発明の組成物であり得る。組成物が実質的に水不溶性である場合、十分な量の生理的
に許容される乳化剤が、水性担体中で組成物を乳化させるのに十分な量で含有され得る。
そのような有用な乳化剤の一つはホスファチジルコリンである。
直腸投与に適した医薬組成物が単位用量の座薬として存在することができる。組成物と
例えばカカオ脂等の１種または複数の従来の固体担体とを混合し、次いで得られた混合物
を成形することにより、この座薬を調製することができる。
皮膚への局所投与に適した本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペー
スト、ゲル、スプレー、エアロゾルおよび／またはオイルの形態を取ることができる。使
用することができる担体として、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコ
ール、経皮エンハンサーおよびこれらの２種以上の組み合わせが挙げられるがこれらに限
定されない。いくつかの実施形態では、例えば本発明の医薬組成物と皮膚を通過可能な親
油性試薬（例えばＤＭＳＯ）とを混合することにより、局所送達を行うことができる。
経皮投与に適した医薬組成物は、長時間にわたり対象の表皮に密接させた状態で保つの
に適した個別パッチの形態であり得る。経皮投与に適した組成物をイオン導入（例えばＰ
ｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）により送達することもでき、該組成
物は任意選択的に緩衝した本発明の組成物の水溶液の形態を典型的にはとる。適切な製剤
は、クエン酸塩緩衝液もしくはビス／トリス緩衝剤（ｐＨ６）またはエタノール／水を含
むことができ、０．１～０．２Ｍの活性成分を含有することができる。
任意の適切な手段により、例えば、対象が吸入する、ウイルスベクターから構成される
呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより、本明細書中に開示したウイルスベ
クターを対象の肺に投与することができる。吸入用粒子は液体または固体であり得る。当
業者に既知であるように、任意の適切な手段により、例えば圧力駆動式のエアロゾル噴霧
器または超音波噴霧器により、ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルを産生する
ことができる。例えば米国特許第４，５０１，７２９号を参照。ウイルスベクターを含む
固体粒子のエアロゾルも同様に、製薬分野で既知の技法により、任意の固体粒子の薬剤エ
アロゾル発生器により産生することができる。
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の産生
多くの発現ベクターを使用して遺伝子改変細胞を作製することができる。いくつかの発
現ベクターは、選択された高発現細胞に好都合な様々な条件下で、トランスフェクトされ
た細胞の増幅後に大量の組換えタンパク質を発現するように設計される。いくつかの発現
ベクターは、淘汰圧下で増幅を必要とすることなく大量の組換えタンパク質を発現するよ
うに設計される。本発明は、当分野で標準的な方法に従った遺伝子改変細胞の産生を含み
、任意の特異的発現ベクターまたは発現系の使用に依存しない。
大量のＦＶＩＩＩタンパク質を産生する遺伝子改変細胞を作製するために、細胞は、該
タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を含有する発現ベクターを
トランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質の適切な翻訳後修飾を特定の細胞系で生じさせる選択されたコトランスフェ
クト酵素と共に発現される。
細胞は様々な供給源から選択することができるが、さもなければ、ＦＶＩＩＩタンパク
質をコードする核酸分子（例えばｃＤＮＡ）を含有する発現ベクターをトランスフェクト
することができる細胞である。
本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微
生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は文献で十
分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌ
ｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ
ｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅ
ｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８４）；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、特にＶｏｌ．１５４および１５５（それぞれ、Ｗ
ｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、ならびにＷｕ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ
．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、１９８
７（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ Ｉ～ＩＶ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅ
ｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）を参照。本明細書で引用する全て
の特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
遺伝子操作法
遺伝子操作によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換細胞、タンパ
ク質およびタンパク質フラグメントの産生は公知である。例えば、Ｂｅｌｌ他の米国特許
第４，７６１，３７１号、Ｃｏｌ．６、３行目～Ｃｏｌ．９、６５行目；Ｃｌａｒｋ他の
米国特許第４，８７７，７２９号、Ｃｏｌ．４、３８行目～Ｃｏｌ．７、６行目；Ｓｃｈ
ｉｌｌｉｎｇの米国特許第４，９１２，０３８号、Ｃｏｌ．３、２６行目～Ｃｏｌ．１４
、１２行目；およびＷａｌｌｎｅｒの米国特許第４，８７９，２２４号、Ｃｏｌ．６、８
行目～Ｃｏｌ．８、５９行目を参照。
ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターは、ＦＶＩＩＩタンパク質をコー
ドする核酸を増幅するおよび／またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸を発現する
ために本明細書で使用される。発現ベクターは、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌク
レオチド配列が適切な制御配列に作動可能に連結している複製可能な核酸構築物である。
制御配列は、該ヌクレオチド配列の発現をもたらして適切な宿主細胞でＦＶＩＩＩタンパ
ク質を産生することができる。そのような制御配列の必要性は、選択される宿主細胞およ
び選択される形質転換方法に応じて異なる。一般に、制御配列として、転写プロモーター
、転写を制御する任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコ
ードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。
ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、サイトメガロ
ウイルス）、ファージ、および組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、組換えに
より宿主細胞ゲノムに組み込み可能なフラグメント）を含む。ベクターは、宿主細胞ゲノ
ムとは独立に複製および機能することができ（例えば一過性発現により）、または宿主細
胞ゲノム自体に組み込むことができる（例えば安定的組み込み）。発現ベクターは、発現
される核酸分子に作動可能に連結し、宿主細胞および／または生物において作動可能なプ
ロモーターおよびＲＮＡ結合部位を含有することができる。
ＤＮＡ領域またはヌクレオチド配列は、これらが互いに機能的に関連している場合、作
動可能に連結され、または作動可能に結合される。例えば、プロモーターは、これがコー
ド配列の転写を制御するならば、コード配列に作動可能に連結しており、またはリボソー
ム結合部位は、これがコード配列の翻訳を可能にするように位置しているならば、コード
配列に作動可能に連結している。
適切な宿主細胞として、原核生物細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞および昆虫細胞
等の高等真核細胞が挙げられる。多細胞生物に由来する細胞は、組換えＦＶＩＩＩタンパ
ク質合成に特に適した宿主であり、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞培養におけるその
ような細胞の増殖は常法になっている（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３））。有用な宿主細
胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株
、ならびにＷＩ１３８、ＨＥＫ ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、ＣＶおよびＭＤＣＫ細胞
株である。そのような細胞に対する発現ベクターは、通常、（必要な場合には）複製起点
、発現されるＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列から上流に位置し、リ
ボソーム結合部位と共に該配列と作動可能に結合されるプロモーター、ＲＮＡスプライス
部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位および転写
終結配列を含む。一実施形態では、発現は、その全体が参照により本明細書に援用される
米国特許第５，８８８，８０９号の発現系を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞で実行することができる。
脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現ベクターにおける転写および翻訳制御配列は
、ウイルス供給源により提供されることが多い。非限定例として、ポリオーマ、アデノウ
イルス２およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターが挙げられる。例
えば、米国特許第４，５９９，３０８号を参照。
複製起点は、ＳＶ４０もしくはその他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノウイル
ス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）供給源に由来し得るような外因性起点を含むベクターの構築に
よりもたらされ得、または宿主細胞染色体複製機構によりもたらされ得る。ベクターが宿
主細胞染色体に組み込まれる場合、後者で十分であることが多い。
ウイルス複製起点を含有するベクターを使用するよりむしろ、選択マーカーとＦＶＩＩ
Ｉタンパク質をコードする核酸分子で同時形質転換する方法により哺乳動物細胞を形質転
換することができる。適切な選択マーカーの非限定例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ）またはチミジンキナーゼである。この方法は、その全体が参照により本明細書に援用
される米国特許第４，３９９，２１６号にさらに記載されている。
組換え脊椎動物細胞培養におけるＦＶＩＩＩタンパク質の合成への適合に適したその他
の方法として、Ｇｅｔｈｉｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０（１９８１）；Ｍａｎ
ｔｅｉ他、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：４０；ならびにＬｅｖｉｎｓｏｎ他、ＥＰＯ出願第１
１７，０６０Ａ号およびＥＰＯ出願第１１７，０５８Ａ号に記載されているものが挙げら
れ、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される。
昆虫細胞（例えば培養ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ）細胞）
等の宿主細胞およびバキュロウイルス発現ベクター（例えば、オートグラファ・カリフォ
ルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＭＮＰＶ、イラクサギンウワ
バ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）ＭＮＰＶ、ラキプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌ
ｕｓｉａ ｏｕ）ＭＮＰＶ、またはガレリア・オウ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｏｕ）ＭＮＰＶ
）に由来するベクター）等の発現ベクターが、Ｓｍｉｔｈ他の米国特許第４，７４５，０
５１号および米国特許第４，８７９，２３６号に記載されているように、本発明を実行す
るのに用いられてもよい。一般に、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリへドリン転写
開始シグナルからＡＴＧ開始部位わたる位置で、およびバキュロウイルスポリへドリンプ
ロモーターの転写制御下でポリへドリン遺伝子に挿入される、発現されるヌクレオチド配
列を含有するバキュロウイルスゲノムを含む。
原核生物宿主細胞として、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えばそれぞれ、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌が挙げられる。高等
真核細胞として、本明細書に記載した哺乳動物起源の確立された細胞株が挙げられる。例
示的な細菌宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、大腸菌Ｂ、大腸菌
Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であ
る。幅広い適切な原核生物および微生物ベクターが利用可能である。大腸菌は、典型的に
はｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。組換え微生物発現ベクターにおいて最も一般
的に使用されるプロモーターとして、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラク
トースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５（１９７８）；お
よびＧｏｅｄｄｅｌ他、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン
（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ他Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８
：４０５７（１９８０）およびＥＰＯ出願公開第３６，７７６号）ならびにｔａｃプロモ
ーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ他Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１
（１９８３））が挙げられる。プロモーターおよびシャイン－ダルガノ配列（原核生物宿
主発現のための）は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結される。
すなわち、これらは、ＤＮＡからのＦＶＩＩＩメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するよ
うに配置される。
酵母培養物等の真核微生物も、タンパク質コードベクターで形質転換することができる
（例えば米国特許第４，７４５，０５７号を参照）。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されるが
、多くのその他の株が一般的に利用可能である。酵母ベクターは、２ミクロン酵母プラス
ミド由来の複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、ＦＶＩＩＩタンパク
質をコードする核酸、ポリアデニル化および転写終結のための配列、ならびに選択遺伝子
を含有し得る。例示的なプラスミドはＹＲｐ７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ他、Ｎａｔ
ｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ他、Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９
７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ他、Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０））。酵母ベクター
における適切なプロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として、メ
タロチオネイン、３－ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーターが挙げられる（
Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０）またはそ
の他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ他、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９（１９６
８）；およびＨｏｌｌａｎｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００（１９７８
））。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、Ｒ． Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎ他、ＥＰＯ公開番号第７３，６５７号にさらに記載されている。
本発明のクローン化コード配列は、マウス、ラット、イヌ、オポッサム、ウサギ、ネコ
、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、モルモット、オポッサム、カモノハシおよびヒトを含む任
意の種の起源のＦＶＩＩＩをコードし得るが、好ましくはヒト起源のＦＶＩＩＩタンパク
質をコードする。本明細書に開示したタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズでき
るＦＶＩＩＩをコードする核酸も包含される。そのような配列のハイブリダイゼーション
は、標準的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、本明細書に開示し
たＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸に対して、低下したストリンジェンシー条件ま
たはストリンジェントな条件（例えば、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳ、６０℃または７０℃の洗浄ストリンジェンシーにより代表される
ストリンジェントな条件）下で実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版
、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。
本発明に従って産生されたＦＶＩＩＩタンパク質は、既知の方法により遺伝子導入動物
において発現することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米
国特許第６，３４４，５９６号を参照。手短かに言うと、遺伝子導入動物として、家畜（
例えば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等）、齧歯類（マウス、ラットおよび
モルモットなど）および飼育動物（例えばネコおよびイヌ）が挙げられ得るがこれらに限
定されない。ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシ等の家畜動物が、いくつかの実施形態では特
に好ましい。
本発明の遺伝子導入動物は、ポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系列細胞のＤＮＡに安
定的に組み込まれ、通常のメンデルの様式で遺伝されるような方法で、本発明のヒトＦＶ
ＩＩＩタンパク質をコードする適切なポリヌクレオチドを単一細胞胚に導入することによ
り産生される。本発明の遺伝子導入動物は、体液および／または組織でＦＶＩＩＩタンパ
ク質を産生する表現型を有する。ＦＶＩＩＩタンパク質は、これらの体液および／または
組織から取り除かれ、例えば治療用途のために処理される。（その内容全体が参照により
本明細書に援用される、例えば、Ｃｌａｒｋ他、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍ
ａｎ ａｎｔｉ-ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｌｋ
ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｈｅｅｐ”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４８
７-４９２（１９８９）；Ｖａｎ Ｃｏｔｔ他、“Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆａｃｔｏ
ｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ：ａｂｕｎ
ｄａｎｃｅ ｃａｎ ｅｎａｂｌｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｗ
ｏｒｌｄｗｉｄｅ”Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １０（４）：７０-７７（２００４）を参
照）。
ＤＮＡ分子は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融
合、または全能性もしくは多能性幹細胞のレトロウイルス感染を含むがこれらに限定され
ない様々な手段により、胚に導入することができる。形質転換細胞は、次いで胚導入され
、その中に組み込まれて遺伝子導入動物を形成することができる。遺伝子導入動物を作製
する方法は、例えば、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｕｓｅ ｂｙ Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。遺伝子導入動物はまた、例えばＣａｍｐｂｅ
ｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４－６６（１９９６）およびＷｉｌｍｕｔ他、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８５：８１０－８１３（１９９７）に記載されているように核移植または胚細
胞株もしくは成体細胞株を使用するクローニングの方法を使用して生成することもできる
。さらに、ＤＮＡの細胞質注射を利用する技法が米国特許第５，５２３，２２２号に記載
されているように使用されてもよい。
ＦＶＩＩＩ産生遺伝子導入動物は、ＦＶＩＩＩコード配列を含むキメラ構築物を導入す
ることにより得ることができる。遺伝子導入動物を得るための方法は公知である。例えば
、Ｈｏｇａｎ他、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８６）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ
他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８８（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ他、Ｃｅ
ｌｌ ４１：３４３（１９８５）、Ｋｒａｅｍｅｒ他、ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬ
ＡＴＩＯＮ ＯＦ ＴＨＥ ＥＡＲＬＹ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＥＭＢＲＹＯ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８５）；Ｈａ
ｍｍｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（１９８５）；Ｗａｇｎｅｒ他、米国特許第
５，１７５，３８５号；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ他、米国特許第５，１７５，３８４号、
Ｊａｎｎｅ他、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２４：２７３（１９９２）、Ｂｒｅｍ他、Ｃｈｉｍ．Ｏ
ｇｇｉ．１１：２１（１９９３）、Ｃｌａｒｋ他、米国特許第５，４７６，９９５を参照
。全てはその全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、ｃｉｓ作用調節領域が使用され得る。ｃｉｓ作用調節領域は
、乳汁が合成される生理学的条件下、プロモーターがその他の組織より乳腺組織で活性と
なる乳腺組織で「活性」となる。そのようなプロモーターとして、乳清酸性タンパク質（
ＷＡＰ）、短いおよび長いα、βおよびκカゼイン、α－ラクトアルブミンおよびβ－ラ
クトグロブリン（「ＢＬＧ」）プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。発現
されたタンパク質のその他の体液、特に血液および尿への分泌を指示するシグナル配列も
、本発明に従って使用することができる。そのような配列の例として、ＦＶＩＩＩ、タン
パク質Ｃおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子のシグナルペプチドを含む、分泌凝固
因子のシグナルペプチドが挙げられる。
上で論じたプロモーターに加えて、転写を調節する有用な配列は、エンハンサー、スプ
ライスシグナル、転写終結シグナル、ポリアデニル化部位、緩衝配列、ＲＮＡプロセシン
グ配列および導入遺伝子発現を調節するその他の配列である。
好ましくは、発現系または発現構築物は、所望の組換えタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列の下流の３’非翻訳領域を含む。この領域は、導入遺伝子の発現を増加させる
ことができる。この点で有用な３’非翻訳領域は、ポリＡシグナルをもたらす配列である
。
適切な異種３’非翻訳配列は、例えば、ＳＶ４０スモールＴ抗原、カゼイン３’非翻訳
領域、または当分野で公知のその他の３’非翻訳配列に由来し得る。リボソーム結合部位
もＦＶＩＩＩの発現の効率性を高めるのに重要である。同様に、ＦＶＩＩＩの翻訳後修飾
を調節する配列は、本発明において有用である。
本発明を説明してきたが、本発明を以下の実施例でより詳細に説明することができ、実
施例は例示目的のみで本明細書に記載されており、本発明を限定すること意図するもので
はない。
［実施例１］
肝臓特異的合成プロモーター
本発明者らは、保存された基本プロモーターエレメントおよび転写開始部位を含有する
いくつかの人工プロモーターを設計し、完全合成した。基本プロモーターは、その５’末
端で肝臓特異的発現のためのいくつかの肝臓特異的転写因子結合部位と連結される。ＬＸ
Ｐ３．３と名付けたプロモーター（図１）（配列番号１）を、ヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７
においてルシフェラーゼレポーター遺伝子およびトランスフェクション実験を用いてイン
ビトロで最初にスクリーニングされたその小さいサイズ（２００ｂｐ）および高い活性に
より選択する。
ＬＸＰ３．３プロモーターを、次いで、肝臓、心臓および筋肉等に広い組織向性を有す
るＡＡＶ９ベクターにパッケージングされたＬａｃＺレポーター遺伝子を用いてさらに試
験した。並行して、インビボ実験を行ってプロモーター活性および肝臓特異性を、小型お
よび大型動物モデルにおいて最も強力な肝臓特異的プロモーターのうちの１つとして以前
に報告された強力な肝臓特異的プロモーターチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）と比較
した。ＬＸＰ３．３－ＬａｃＺまたはＴＢＧ－ＬａｃＺ発現カセットを含有するＡＡＶ９
ベクターを、２種類の異なる用量でＣ５６／Ｂ６マウスに尾静脈を介して注射した。図２
Ａに示すように、肝臓および心臓のＸ－ｇａｌ染色は、両方のプロモーターについて強い
肝臓発現、および心臓発現の欠如を示した。組織ホモジネートの定量分析は、これらの２
種類のプロモーターが、肝臓（図２Ｂ）に対してほとんど同一のＬａｃＺ発現レベルおよ
び組織特異性を達成したが、ＬＸＰ３．３プロモーターはサイズがわずか２００ｂｐであ
り、一方ＴＢＧは６８１ｂｐであったことを示した。具体的には、定量的ＬａｃＺ酵素活
性分析は、肝臓における遺伝子発現が、ＬＸＰ３．３およびＴＢＧプロモーターに関して
心臓より３００倍超高いことを示した。さらに、肝臓特異的プロモーターにより得られる
ＬａｃＺ酵素活性は、ユビキタスＣＭＶプロモーターにより得られる活性より肝臓で５０
０倍高かった（図２Ｃ）。一方、ＣＭＶプロモーターは、肝臓特異的プロモーターのほぼ
１３倍高いＬａｃＺ発現を心臓で達成した（図２Ｂ）。結果は、合成プロモーターＬＸＰ
３．３が肝臓において高度に活性であり、特異的であることを示した。
［実施例２］
合成プロモーターイントロンカセット
完全合成プロモーターＬＸＰ３．３をその３’末端で、短い非天然エクソンジャンクシ
ョン配列を有するＶＨ４の小さいイントロンに連結させた。このイントロンは、ＢＤＤヒ
トＦＶＩＩＩ遺伝子を駆動する弱いプロモーターを使用したインビトロでのトランスフェ
クション実験により、最初に試験した。ＶＨ４イントロンの追加は、イントロンのないプ
ロモーターよりはるかに高い遺伝子発現を生じさせ、また、一般的に使用されるキメライ
ントロンＣＩＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ）より高い発現も生じさせた（図３）。結果的に、本発
明者らは、ＬＸＰ３．３プロモーターおよびＶＨ４イントロンを人工エクソンジャンクシ
ョン配列と組み合わせ、これをＬＸＰ３．３Ｉと名付けた（配列番号２）。ＦＶＩＩＩ発
現の駆動におけるその活性を試験するために、本発明者らはプロモーターＬＸＰ３．３Ｉ
を、完全合成ヒトＢＤＤ欠失ＦＶＩＩＩ遺伝子（配列番号３）とこれに続く小さいポリア
デニル化部位の上流に挿入した。遺伝子発現カセット（配列番号４）全体を、その後、ベ
クターＤＮＡ複製およびベクターゲノムパッケージングのために、２つのＡＡＶ逆方向末
端反復配列を有するＡＡＶベクタープラスミド骨格にクローニングした（図４）。
インビトロでのプロモーター活性を比較するために、一般的に使用される強力な組み合
わせであるＳＶ４０イントロンに連結したユビキタスＣＭＶプロモーターを使用して、Ｆ
ＶＩＩＩ発現カセット中のＬＸＰ３．３Ｉを置換した。プラスミドをヒト肝臓癌細胞株Ｈ
ｕｈ７にトランスフェクション後、ＦＶＩＩＩ活性を発色キットを用いて測定した。図５
のトランスフェクション実験に示すように、ＬＸＰ３．３ＩはＣＭＶプロモーターより高
いＦＶＩＩＩ活性を細胞培養培地で生じさせた。さらに、本発明者らはまた、トランスフ
ェクション実験において完全合成ヒトＢＤＤ欠失ＦＶＩＩＩ遺伝子を天然ヒトＤＮＡ配列
のＢＤＤ ＦＶＩＩＩ遺伝子と比較した。同じＬＸＰ３．３Ｉにより駆動される場合、同
じＦＶＩＩＩアミノ酸配列をコードするが異なる選択のコドンを使用した２つの遺伝子は
、ヒト細胞においてＦＶＩＩＩ活性の有意な差を示さなかった（図６）。しかしながら、
異なる肝臓特異的プロモーターを使用した場合、天然コドンを有するＢＤＤＦＶＩＩＩ遺
伝子は、ＬＸＰ３．３Ｉにより駆動される同じ遺伝子と比較するとより低い発現を示し、
これは主に、より高い遺伝子発現をもたらすＬＸＰ３．３Ｉプロモーターによるものであ
ることを示唆した。
本発明者らは次に、一般的に使用されるＦＶＩＩＩ遺伝子ノックアウト血友病Ａマウス
モデルにおいてインビボでの遺伝子発現活性を試験した。ＬＸＰ３．３Ｉ－ｈＦ８遺伝子
発現カセットをＡＡＶ９カプシドにパッケージングし、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスの尾静脈
に注射した。２種類の異なる用量のベクターを使用して（マウス１匹当たり２×１０１１
および４×１０１０ベクターゲノム）インビボでの発現を調べた。図７Ａに示すように、
高レベルおよび長期の遺伝子発現は、ベクター投与後、これらの２種類の用量で１年を超
えて達成された。ＦＶＩＩＩ活性に関する発色アッセイに加えて、ＥＬＩＳＡアッセイも
使用して血漿に分泌されるＦＶＩＩＩタンパク質の量を調べた（図７Ｂ）。結果は、完全
長野生型ヒトＦＶＩＩＩタンパク質の参照標準と比べて、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質
濃度は、同じ完全長ヒトＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ活性の発色アッセイにより得られ
た読み取りデータより約５０％低いことを示した。ＦＶＩＩＩ活性読み取りデータより低
いＥＬＩＳＡ読み取りデータというこの食い違いは、野生型ＦＶＩＩＩのほぼ半分の長さ
を含む、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩにおける長いＢドメインの欠如による可能性が高い。ＥＬＩ
ＳＡキットは、Ｂドメインを含む野生型完全長ＦＶＩＩＩに対してポリクローナル抗体を
使用したため、Ｂドメインを欠くＢＤＤ ＦＶＩＩＩは抗体結合部位がより少なく、した
がってＥＬＩＳＡ読み取りデータがより低かったことが予想される。これらの結果は、発
色アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイは両方とも、血友病ＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ発
現の一致した測定値を生成したことを示した。部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）ア
ッセイも数時点で行った。結果は、他の２つのアッセイの結果と概ね一致した。
［実施例３］
第ＶＩＩＩ因子重鎖変異
以前の文献は、ＦＶＩＩＩの重鎖が限定因子であることを示した。重鎖は、軽鎖よりプ
ロセシングの有効性がはるかに低くおよび／またははるかに不安定であり、その正確な機
構ははっきりしないままである。例えば、重鎖および軽鎖遺伝子を２つの別個のベクター
から別々に発現させた場合、凝固活性のために同様のタンパク質濃度を得るには、軽鎖遺
伝子より重鎖遺伝子のはるかに高いコピー数を必要とした。結果的に、本発明者らは、Ｃ
末端領域に変異を導入することにより、具体的には新たな糖鎖付加部位を導入することに
より、ＦＶＩＩＩ重鎖翻訳後プロセシング効率性を高めることにした。その理由は、糖鎖
付加は、翻訳後プロセシングにおける役割および細胞膜結合および分泌タンパク質の安定
性が公知であるためである。本発明者らは、糖鎖付加を重鎖のＣ末端に導入することを選
択した。その論理的根拠は、この末端領域が、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質のＸ線結晶
構造分析により示されたように不定形であることから、したがって明確な構造がない柔軟
な領域であることであった。そのため、その領域の変異はＦＶＩＩＩタンパク質の機能構
造を妨げない可能性が高い。その論理的根拠により、本発明者らは７３４位および７３５
位の２個の天然アスパラギンを利用し、隣接するアミノ酸７３６および７３７をトレオニ
ンに変異させた（ＮＮＡＩからＮＮＴＴ）。変異はアミノ酸配列の変化を最小化し、糖鎖
付加の程度を最大化し、Ｘ０と名付けた変異体ＦＶＩＩＩに２つの新規の糖鎖付加部位（
ＮＮＴおよびＮＴＴ）をもたらした（図８）。
変異体Ｘ０の２つの新たな糖鎖付加部位に加えて、本発明者らは、重鎖のＮ末端のアミ
ノ酸７３８～７４２のペプチド（ＥＰＲＳＦ）を、アミノ酸２３７から２４２から単離し
た天然糖鎖付加配列（ＹＶＮＲＳＬ）により置換することによって、ＮＮＴＴ部位のすぐ
隣りに別の糖鎖付加部位を追加した。この天然糖鎖付加部位（ＮＲＳ）は、重鎖において
最も効果的に糖鎖付加される部位のうちの１つであることから選択され（Ｍｅｄｚｉｈｒ
ａｄｓｚｋｙ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３９８６（１９９７））、Ｘ１と名付けた
変異体ＦＶＩＩＩが生成された（図８）。
また、本発明者らは、７３８～７４０位のアミノ酸ＥＰＲを変異体Ｘ０のＮＮＴと置換
し、変異体Ｘ２において２つ多い糖鎖付加部位をもたらした（図８）。
［実施例４］
第ＶＩＩＩ因子重鎖のＣ末端の変異はインビトロでのＦＶＩＩＩ活性を高めた
本発明者らは次に、変異体構築物のＦＶＩＩＩ活性をその野生型ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ対
応物と対照比較した。プラスミドのトランスフェクションは、内因性ＦＶＩＩＩ発現はな
いが肝臓特異的プロモーター対照遺伝子発現に適したヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７で実行し
た。図９Ａに示すように、変異Ｘ１およびＸ２は、その親遺伝子と比べてインビトロでの
ＦＶＩＩＩ活性を２倍超にした。
［実施例５］
血友病Ａマウスモデルにおけるインビボでの変異体ＦＶＩＩＩの長期および高レベルの遺
伝子発現
ＦＶＩＩＩ変異体Ｘ１およびＸ２が、インビトロでのトランスフェクション実験で有意
に高いＦＶＩＩＩ活性を示したことから、本発明者らは次に、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウスに
おいてインビボでの遺伝子発現およびＦＶＩＩＩ活性を調べた。Ｘ１およびＸ２遺伝子は
、同じＬＸＰ３．３Ｉプロモーターの転写制御下にあり、ＡＡＶ８ベクター粒子にパッケ
ージングされた。初期の実験に基づき、５×１０１０ｖ．ｇ．／マウスの標準的なベクタ
ー用量を選択し、２から３カ月齢の血友病Ａマウスの尾静脈を介して静脈内に注射した。
血漿試料を、一般的に使用される方法である後眼窩出血法により採取した。図９Ｂに示す
ように、変異体Ｘ１およびＸ２は両方とも、それらの野生型親ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ遺伝子
より高い発現を達成した（図７Ａ、低用量と比べて）。長期の遺伝子発現をモニターする
ために、本発明者らは、Ｘ１またはＸ２変異体のいずれかで処置した血友病Ａマウスを観
察用に２４週間維持した。親ｗｔ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩベクターで処置した血友病Ａマウ
ス（図７Ａ）と同様に、変異体ＦＶＩＩＩベクターで処置したマウスも、血漿中のヒトＦ
ＶＩＩＩ活性を著しく低下させることなく長期のおよび安定した遺伝子発現を示した。様
々な時点でのインヒビター試験は、インヒビター形成がないことを明らかにした。
本発明の趣旨から逸脱することなく、多くのおよび様々な改変を行うことができること
を当業者は理解する。したがって、本発明の形態は例示のみであり、本発明の範囲を限定
することを意図するものではないことが明確に理解すべきである
本明細書で引用する全ての刊行物、特許出願、特許、特許公報、ＧｅｎＢａｎｋ（登録
商標）データベース受託番号により同定された配列およびその他の参照は、参照が提示さ
れた文および／または段落に関する教示のために、その全体が参照により援用される。
前述は、本発明の例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本発明は、本明細書に含まれる特許請求の範囲の同等物と共に、以下の特許請求の範囲により規定される。
出願時の特許請求の範囲は、以下の通り。
［請求項１］
肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、ポリヌクレオチド。
［請求項２］
前記プロモーターがイントロンに作動可能に連結している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
［請求項３］
前記イントロンがＶＨ４由来である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
［請求項４］
前記プロモーターおよび前記イントロンが一緒に、配列番号２のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を構成する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
［請求項５］
前記プロモーターが目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結している、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［請求項６］
前記目的のポリヌクレオチドがポリペプチドまたは機能性核酸をコードする、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
［請求項７］
前記目的のポリヌクレオチドが凝固因子をコードする、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
［請求項８］
前記目的のポリヌクレオチドが第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
［請求項９］
前記目的のポリヌクレオチドがＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１０］
前記目的のポリヌクレオチドが、配列番号３のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１１］
配列番号４のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１２］
前記目的のポリヌクレオチドの下流にポリアデニル化部位をさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１３］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［請求項１４］
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
［請求項１５］
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
［請求項１６］
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
［請求項１７］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
［請求項１８］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項１７の形質転換細胞を含む遺伝子導入動物。
［請求項１９］
対象の肝臓で前記ポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、請求項６から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法。
［請求項２０］
対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、請求項８から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における血友病Ａを処置することを含む方法。
［請求項２１］
対象における前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、請求項８から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法。
［請求項２２］
重鎖のアミノ酸残基が１つまたは複数の糖鎖付加部位を作製するために改変された、改変哺乳動物第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２３］
前記１つまたは複数の糖鎖付加部位が重鎖のＣ末端にある、請求項２２に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２４］
ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、請求項２２または２３に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２５］
野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６および７３７がアミノ酸残基ＸＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項２４に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２６］
野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残７３６から７４２が、アミノ酸残基ＸＸＹＶＮＲＸＬ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項２４に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２７］
野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６から７４０が、アミノ酸残基ＸＸＮＮＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項２４に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２８］
Ｂドメイン欠失をさらに含む、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２９］
請求項２２から２８のいずれか１項に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［請求項３０］
プロモーターに作動可能に連結している、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
［請求項３１］
前記プロモーターが請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
［請求項３２］
請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［請求項３３］
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
［請求項３４］
前記ベクターがＡＡＶベクターである、請求項３３に記載のベクター。
［請求項３５］
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
［請求項３６］
請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
［請求項３７］
請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３６に記載の形質転換細胞を含む遺伝子導入動物。
［請求項３８］
対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法であって、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３６に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む方法。
［請求項３９］
対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、請求項２２から２８のいずれか１項に記載の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３６に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における血友病Ａを処置することを含む方法。
［請求項４０］
対象における前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項３６に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法。
配列：
配列番号１ ＬＸＰ３．３プロモーター－２００ｂｐ
配列番号２ （ＬＸＰ３．３プロモーターおよびＶＨ４イントロンを含有するＬＸＰ３．
３Ｉ－２８８ｂｐ
配列番号３ 合成ヒトＢドメイン欠失第ＦＶＩＩＩ因子コード配列－４３７４ｂｐ
配列番号４ ＡＡＶベクター中のヒト第ＦＶＩＩＩ因子遺伝子発現カセット、左逆方向反
復から右逆方向末端反復－５０４５ｂｐ
配列番号５ シグナルペプチドがないヒト第ＦＶＩＩＩ因子野生型タンパク質配列－２３
３３ａａ

Claims (16)

  1. 重鎖のアミノ酸残基が、当該重鎖のＣ末端の最後の５０アミノ酸残基内にある１つまたは複数の糖鎖付加部位を作製するために改変され、Ｂドメインが欠失した、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、改変哺乳動物第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
  2. 野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６および７３７がアミノ酸残基ＸＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項１に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
  3. 野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６から７４２が、アミノ酸残基ＸＸＹＶＮＲＸＬ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項１に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
  4. 野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６から７４０が、アミノ酸残基ＸＸＮＮＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項１に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
  5. 請求項１から４のいずれか１項に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  6. プロモーターに作動可能に連結している、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記プロモーターが、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 請求項５から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  9. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記ベクターがＡＡＶベクターである、請求項９に記載のベクター。
  11. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
  12. 請求項５から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項８から１１のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
  13. 請求項５から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８から１１のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１２に記載の形質転換細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物。
  14. 請求項５から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８から１１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１２に記載の形質転換細胞であって、当該ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞を対象に送達し、これにより前記対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む、対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法における使用のための、ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞。
  15. 請求項１から４のいずれか１項に記載の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、請求項５から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８から１１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１２に記載の形質転換細胞であって、当該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞を対象に送達し、これにより前記対象における血友病Ａを処置することを含む、対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法における使用のためのポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞。
  16. 請求項５から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８から１１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１２に記載の形質転換細胞であって、当該ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞を対象に送達し、これにより前記対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む、対象における前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法における使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
MX2017010117A (es) * 2015-02-06 2018-05-17 Univ North Carolina Chapel Hill Casetes optimizados de expresión del gen humano del factor viii de coagulación y su uso.
MY190067A (en) 2015-11-13 2022-03-24 Baxalta Inc Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
WO2017180857A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating hemophilia a
WO2017180861A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsulvania Gene therapy for treating hemophilia b
CN108977452B (zh) * 2017-05-31 2022-07-19 北卡罗来纳大学教堂山分校 优化的人凝血因子ix基因表达盒及其应用
EP3665289A1 (en) * 2017-08-09 2020-06-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
JP7244547B2 (ja) 2018-02-19 2023-03-22 ホモロジー・メディシンズ・インコーポレイテッド Ｆ８遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用の方法
WO2020028830A1 (en) * 2018-08-03 2020-02-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Improved clinical parameters by expression of factor viii
US20200069817A1 (en) * 2018-08-09 2020-03-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
TW202039546A (zh) 2019-01-16 2020-11-01 美商巴克斯歐塔公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
CN113088519B (zh) * 2019-12-23 2024-02-02 苏州华毅乐健生物科技有限公司 一种分离的核酸分子及其应用
CN111218446B (zh) * 2019-12-25 2023-03-28 劲帆生物医药科技（武汉）有限公司 一种肝脏特异性启动子及其应用
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
EP4225382A2 (en) * 2020-10-07 2023-08-16 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21
CN112608921B (zh) * 2020-12-23 2022-04-08 武汉枢密脑科学技术有限公司 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用
EP4384629A1 (en) * 2021-08-12 2024-06-19 The University of North Carolina at Chapel Hill Gene therapy products facilitating bystander effects and methods using the same
WO2023078220A1 (zh) * 2021-11-02 2023-05-11 苏州华毅乐健生物科技有限公司 分离的核酸分子及其应用
CN114457086B (zh) * 2022-03-02 2022-11-15 上海勉亦生物科技有限公司 白介素1受体拮抗蛋白的表达盒以及基于aav的基因递送系统
CN115948408A (zh) * 2022-09-23 2023-04-11 上海信致医药科技有限公司 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050009148A1 (en) 1998-11-06 2005-01-13 Lollar John S. Glycosylated, low antigenicity, low immunogenicity factor VIII
JP2008534559A (ja) 2005-04-01 2008-08-28 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 血液凝固ｆｖｉｉｉ類似体
JP2009542225A (ja) 2006-06-30 2009-12-03 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ミシガン 組換え法によりｆｖｉｉｉタンパク質を生産する方法
WO2012170289A1 (en) 2011-06-03 2012-12-13 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing factor viii proteins by recombinant methods

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4599308A (en) 1981-10-06 1986-07-08 Hamer Dean H Protein from SV40 recombinants
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4501729A (en) 1982-12-13 1985-02-26 Research Corporation Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4965199A (en) * 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4745057A (en) 1984-05-18 1988-05-17 Eli Lilly And Company Method, vectors and transformants for high expression of heterologous polypeptides in yeast
US4912038A (en) 1984-12-11 1990-03-27 California Biotechnology Inc. Recombinant DNA sequence encoding alveolar surfactant protein
US4879224A (en) 1985-01-10 1989-11-07 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides
US4761371A (en) 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
US4975282A (en) 1985-06-26 1990-12-04 The Liposome Company, Inc. Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies
US5366894A (en) 1986-06-30 1994-11-22 Pharmaceutical Proteins Limited Peptide production
US4877729A (en) 1986-07-14 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
EP0322417A1 (en) 1986-09-08 1989-07-05 Applied Biotechnology, Inc. Empty viral capsid vaccines
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
US5175385A (en) 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
EP0442926A1 (en) 1988-11-10 1991-08-28 Imperial Cancer Research Technology Limited Polypeptides
US5916563A (en) 1988-11-14 1999-06-29 United States Of America Parvovirus protein presenting capsids
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
ES2026826A6 (es) 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus canino y otros virus relacionados.
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
WO1994018834A1 (en) 1993-02-16 1994-09-01 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Polyelectrolyte dna conjugation and genetic transformation of an animal
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US5869248A (en) 1994-03-07 1999-02-09 Yale University Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5599706A (en) 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6040183A (en) 1995-06-07 2000-03-21 University Of North Carloina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
WO1997003195A1 (en) * 1995-07-11 1997-01-30 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered protease sites
ATE354957T1 (de) 1995-12-15 2006-03-15 Intronn Inc Durch trans-spaltung erhaltene therapeutische molekule
US6083702A (en) 1995-12-15 2000-07-04 Intronn Holdings Llc Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
AU4645697A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
DE69841459D1 (en) 1997-02-14 2010-03-11 American Nat Red Cross Expression des active human factor ix im brustdrüsengewebe transgener tiere
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
CA2745131C (en) 1998-05-28 2016-08-09 John A. Chiorini Aav5 vector and uses thereof
NZ511171A (en) 1998-09-22 2004-02-27 Univ Florida Methods for large-scale production of recombinant AAV vectors
AU768729B2 (en) 1998-11-05 2004-01-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
AU7879000A (en) * 1999-10-12 2001-04-23 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Adeno-associated virus vectors encoding factor viii and methods of using the same
AU2001253255A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
WO2001091803A2 (en) 2000-06-01 2001-12-06 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compounds for controlled release of recombinant parvovirus vectors
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US6623729B2 (en) 2001-07-09 2003-09-23 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Process for preparing sustained release micelle employing conjugate of anticancer drug and biodegradable polymer
WO2005047501A1 (en) 2003-02-24 2005-05-26 Johns Hopkins University Molecular vaccines employing nucleic acid encoding anti-apoptotic proteins
CN101212977A (zh) * 2005-06-01 2008-07-02 国际创新生物技术研究所有限公司 葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法
JP5008424B2 (ja) * 2006-03-14 2012-08-22 シチズンホールディングス株式会社 振動子の製造方法
EP2037892B1 (en) * 2006-06-19 2015-03-18 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Modified factor viii and factor ix genes and vectors for gene therapy
JP5739865B2 (ja) * 2009-03-24 2015-06-24 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 第ｖｉｉｉ因子変異体および使用の方法
CN101906437A (zh) * 2009-06-05 2010-12-08 苏州泽璟生物制药有限公司 一种重组人凝血因子ⅷ在动物细胞内的表达和生产方法
US9169492B2 (en) * 2010-02-05 2015-10-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compositions and methods for enhanced parvovirus transduction
JP6072810B2 (ja) * 2011-10-18 2017-02-01 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 第ｖｉｉｉ因子の生物学的利用能を改善するための硫酸化グリコサミノグリカンの使用
CA2888931C (en) * 2012-10-26 2023-09-05 Vrije Universiteit Brussel Vector for liver-directed gene therapy of hemophilia and methods and use thereof
RS61387B1 (sr) * 2013-02-15 2021-02-26 Bioverativ Therapeutics Inc Gen optimizovanog faktora viii
LT3013855T (lt) * 2013-06-24 2021-01-25 Xiao, Weidong Mutavusio viii faktoriaus kompozicijos ir metodai
MX2017010117A (es) * 2015-02-06 2018-05-17 Univ North Carolina Chapel Hill Casetes optimizados de expresión del gen humano del factor viii de coagulación y su uso.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050009148A1 (en) 1998-11-06 2005-01-13 Lollar John S. Glycosylated, low antigenicity, low immunogenicity factor VIII
JP2008534559A (ja) 2005-04-01 2008-08-28 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 血液凝固ｆｖｉｉｉ類似体
JP2009542225A (ja) 2006-06-30 2009-12-03 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ミシガン 組換え法によりｆｖｉｉｉタンパク質を生産する方法
WO2012170289A1 (en) 2011-06-03 2012-12-13 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing factor viii proteins by recombinant methods

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