JP7437035B2 - 最適化されたヒト凝固第viii因子遺伝子発現カセットおよびその使用 - Google Patents
最適化されたヒト凝固第viii因子遺伝子発現カセットおよびその使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、20
15年2月6日に出願された米国仮出願第62/112,901号の利益を主張する。
成プロモーターおよび発現構築物に関する。本発明はさらに、第VIII因子タンパク質
のアミノ酸配列に改変を含有する第VIII因子タンパク質、ならびに該第VIII因子
タンパク質をコードする核酸構築物およびこれらの組成物を使用して出血障害を処置する
方法に関する。
により凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす。FVIII活性の欠乏は出血障害血
友病Aの原因である。血友病Aの現在の処置は、血漿由来または組換えFVIIIタンパ
ク質の静脈内注入である。この処置は出血エピソードの制御に有効であるにもかかわらず
、FVIIIの短い半減期(8~12時間)により頻回注入が必要なことが、この処置を
本質的に高価にしている。遺伝子治療は、この疾患の最終的な治癒に対する魅力的な戦略
として現れた。しかしながら、最も有望なウイルスベクターの1つ、アデノ随伴ウイルス
(AAV)を使用するFVIII遺伝子の送達の進歩は、AAVパッケージング能力に近
いコード配列FVIIIの大きなサイズのため、凝固因子IXの送達の進歩よりも遅れて
いる。
び発現構築物を提供することにより、当技術分野の短所を克服する。本発明は、アミノ酸
配列改変を有する追加の糖鎖付加部位を含むFVIIIタンパク質、および出血障害の処
置におけるその使用方法をさらに提供する。
に基づく。該プロモーターは、特にAAVベクターを使用して肝臓特異的にポリペプチド
および機能性核酸を産生するのに使用することができる。AAVベクターには厳しい長さ
の制約があり、短いが強力なプロモーターの利用が有効である。
部分的に基づく。該改変タンパク質は、本明細書に記載した改変がないFVIIIタンパ
ク質と比べて長期の高レベルの活性をもたらす。
該プロモーターは、配列番号1のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも90%同一の
配列を含む。
または遺伝子導入動物に関する。
方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象
に送達し、これにより対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む
方法に関する。
量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象に送達し
、これにより対象における血友病Aを処置することを含む方法に関する。
ビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターお
よび/または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第VIII因子ポリ
ペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
作製するために改変された、改変ヒト第VIII因子ポリペプチドに関する。
るポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞、および/また
は遺伝子導入動物に関する。
明の改変ヒト第VIII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリ
ヌクレオチドを含むベクターおよび/もしくは形質転換細胞を対象に送達し、これにより
対象の肝臓で第VIII因子を産生することを含む方法に関する。
効量の、本発明の改変ヒト第VIII因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターお
よび/または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における血友病Aを処置する
ことを含む方法に関する。
ラビリティ増加させる方法であって、有効量の、本発明の改変ヒト第VIII因子ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび
/もしくは形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第VIII因子ポリペ
プチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
述べる。
り詳細に記載する。しかしながら、本発明は異なる形態で実施することができ、本明細書
で述べられている実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形
態は、本開示が十分かつ完全となり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供さ
れる。
組み合わせで使用することができることが明確に意図される。さらに、本発明はまた、本
発明のいくつかの実施形態において、本明細書で述べる任意の特徴または特徴の組み合わ
せを除外することができるまたは省略することができることも意図するものである。例示
すると、ある複合体が構成要素A、BおよびCを含むことが本明細書で述べられている場
合、A、BもしくはCのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせを単独でまたは任意の
組み合わせで省略して特許請求の範囲から除外する(disclaimed)ことができ
ることが明確に意図される。
が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において
本発明の説明で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本
発明を限定することを意図するものではない。
ら3’方向に一本鎖のみで示す。本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸の両方を、
特許法施行規則第1.822条および確立された用法に従って、IUPAC-IUB B
iochemical Nomenclature Commissionにより推奨さ
れた様式でまたは(アミノ酸に関しては)1文字表記もしくは3文字表記のいずれかによ
り表す。
ーニング、核酸の増幅および検出等に使用することができる。そのような技法は当業者に
既知である。例えば、Sambrook他、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor、
NY、1989)、F.M.Ausubel他、Current Protocols
in Molecular Biology(Green Publishing As
sociates,Inc.およびJohn Wiley&Sons,Inc.、New
York)を参照。
本発明の説明および添付した特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」
および「the」は、文脈が別段のことを明確に指示しない限り複数形も含むことを意図
するものである。
または複数の任意の組み合わせおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに選択肢(「また
は」)として解釈した場合には組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
酵素活性またはその他の生物学的活性等等の測定可能な値を指す場合に、特定の量の±2
0%、±10%、±5%、±1%、±0.5%または±0.1%のばらつきを包含するこ
とを意味する。
」は、請求項の範囲が該請求項に列挙した特定の材料または工程、および請求された本発
明の「基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈する
ことを意味する。In re Herz,537 F.2d 549,551-52,1
90 USPQ 461,463(CCPA 1976)(原文の強調)を参照。MPE
P § 2111.03も参照。
び文法的変形)は、本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用する場
合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないように、列挙し
た配列(例えば配列番号)ならびに、列挙した配列の5’末端および/もしくは3’末端
またはN末端および/もしくはC末端の合計10個以下(例えば1個、2個、3個、4個
、5個、6個、7個、8個、9個または10個)の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸の
両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計10個以下の追加の
ヌクレオチドまたはアミノ酸は、両方の末端に一緒に追加された追加のヌクレオチドまた
はアミノ酸の総数を含む。用語「実質的に変更された」は本発明のポリヌクレオチドに適
用する場合、列挙した配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、少なくと
も約50%以上のコードされたポリペプチドを発現する能力の増減を指す。用語「実質的
に変更された」は本発明のポリペプチドに適用する場合、列挙した配列からなるポリペプ
チドの活性と比較して、少なくとも約50%以上の凝固刺激活性の増減を指す。
これらの文法的変形は本明細書で使用する場合、少なくとも約1.25倍、1.5倍、2
倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍または15倍の特定のパラメータの
増加を指す。
らの文法的変形は本明細書で使用する場合、少なくとも約15%、25%、35%、40
%、50%、60%、75%、80%、90%、95%またはより多くの特定のレベルま
たは活性の低下または減少を指す。特定の実施形態では阻害または低減は、ほとんど検出
できない活性または本質的に検出不能の活性(多くてもわずかな量、例えば約10%未満
または5%未満)をもたらす。
たらす量のことである。換言すると、「治療有効」量とは、対象における少なくとも1種
の臨床症状のある程度の軽減、緩和または低減をもたらすことができる量のことである。
ある程度の利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完璧であるまたは治癒的である必
要はないことを当業者は認識する。
臨床症状を予防する(本明細書で定義したように)のに十分な量のことである。ある程度
の利益が対象にもたらされる限り、予防レベルが完璧である必要はないことを当業者は認
識する。
状および/または臨床パラメータの変化により示された臨床的改善を検出することにより
決定することができる。
treatment)」は、対象の状態の重症度が低減されるまたは少なくとも部分的に
改善されるもしくは改変されること、および少なくとも1種の臨床症状のある程度の軽減
、緩和または低減が達成されることを意図するものである。
たは「予防(prevention)」(およびこれらの文法的変形)は、疾患、障害お
よび/または臨床症状の発症前に本発明の方法を実施しない場合に起こることと比べた、
発症後の疾患、障害および/または臨床症状の程度または重症度の低下または遅延を指す
。血友病Aに関して、「予防すること」は、予防的処置がない場合に起こる出血エピソー
ドの回数および/または重症度より低い出血エピソードの回数および/または重症度の発
生を指す。
」を互換的に使用し、cDNA、ゲノムDNA、mRNA、合成(例えば、化学的に合成
された)DNAまたはRNAならびにRNAおよびDNAのキメラを含む、RNAおよび
DNAの両方を包含する。用語ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列または核酸は、鎖の
長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本
鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。核酸は、オリゴヌクレオチ
ド類似体または誘導体(例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド)を使
用して合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能
力が変更されたまたはヌクレアーゼ耐性が向上した核酸を調製するのに使用することがで
きる。本発明は、本発明の核酸、ヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチドの相補体(
完全相補体または部分的相補体のどちらかであり得る)である核酸をさらに提供する。
おいて、これが直接隣接する(一方は5’末端および一方は3’末端に)ヌクレオチド配
列とは直接隣接しないヌクレオチド配列(例えばDNAまたはRNA)のことである。そ
のため、一実施形態では単離された核酸は、コード配列に直接隣接する5’非コード(例
えばプロモーター)配列の一部または全てを含む。したがって、該用語は、例えば、ベク
ター、自律複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノム
DNAに組み込まれる組換えDNA、あるいはその他の配列から独立して別個の分子(例
えば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処置により産生されたゲノ
ムDNAフラグメント)として存在する組換えDNAを含む。該用語はまた、追加のポリ
ペプチドまたはペプチドコード配列ハイブリッド核酸の一部である組換えDNAも含む。
遺伝子を含む単離されたポリヌクレオチドは、そのような遺伝子を含む染色体のフラグメ
ントではなく、むしろ該遺伝子に関連したコード領域および調節領域を含むが、該染色体
で天然に見出される追加の遺伝子を含まない。
オチド配列と比べて長さが縮小し、ならびに参照核酸または参照ヌクレオチド配列と同一
またはほとんど同一(例えば90%、92%、95%、98%、99%同一)の隣接する
ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、該ヌクレオチド配列から本質的になる、および
/または該ヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明
に係るそのような核酸フラグメントは、これが構成要素となるより大きいポリヌクレオチ
ドに必要に応じて含めることができる。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメン
トは、本発明に係る核酸またはヌクレオチド配列の少なくとも約8個、10個、12個、
15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、75個、100個
、150個、200個もしくはより多くの連続ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレ
オチドを含むことができる、該オリゴヌクレオチドから本質的になっていてもよい、およ
び/または該オリゴヌクレオチドからなっていてもよい。
えDNA法により産生する場合)、または化学前駆体もしくはその他の化学物質(化学的
に合成する場合)が実質的にない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドを指し得る
。さらに、「単離されたフラグメント」とは、フラグメントとして天然に存在せず、天然
の状態では見出されない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドのフラグメントのこ
とである。「単離された」は、調製物が技術的に純粋(均質)であることを意味しないが
、意図した目的に使用され得る形態でポリペプチドまたは核酸を提供するには十分に純粋
である。
ミノ酸配列と比べて長さが縮小し、ならびに参照ポリペプチドまたは参照アミノ酸配列と
同一またはほとんど同一(例えば90%、92%、95%、98%、99%同一)の隣接
するアミノ酸のアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列から本質的になる、および/または
該アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を意味すると理解される。本発明に係るそのような
ポリペプチドフラグメントは、これが構成要素となるより大きいポリペプチドに必要に応
じて含めることができる。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメントは、本発明
に係るポリペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約4個、6個、8個、10個、12
個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、75個、10
0個、150個、200個もしくはより多くの連続アミノ酸の長さを有するペプチドを含
むことができる、該ペプチドから本質的になっていてもよい、および/または該ペプチド
からなっていてもよい。
酸分子のことである。ベクターはレプリコンであってもよい。レプリコンはこれに別のヌ
クレオチド配列を結合して、結合したヌクレオチド配列の複製を可能にすることができる
。「レプリコン」は、インビボでの核酸複製の自律的単位として機能する、すなわち、そ
れ自身の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント(例えば、プラスミド、
ファージ、コスミド、染色体、ウイルスゲノム)であり得る。用語「ベクター」は、イン
ビトロ、エクスビボ、および/またはインビボで細胞に核酸を導入するためのウイルスお
よび非ウイルス(例えばプラスミド)核酸分子の両方を含む。当分野で既知の多くのベク
ターを使用して核酸を操作すること、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み
込むこと等ができる。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応する核酸フラグ
メントの適切なベクターへの挿入は、適切な核酸フラグメントを相補的な付着末端を有す
る選択されたベクターにライゲートすることにより達成することができる。また、核酸分
子の末端を酵素的に修飾することができ、またはヌクレオチド配列(リンカー)を核酸末
端にライゲートすることにより任意の部位を産生することができる。そのようなベクター
は、ベクターを含有する細胞および/またはベクターの核酸を細胞ゲノムに取り込んだ細
胞の選択をもたらす選択マーカーをコードする配列を含有するように改変することができ
る。そのようなマーカーは、マーカーによりコードされたタンパク質を取り込み、発現す
る宿主細胞の同定および/または選択を可能にする。「組換え」ベクターは、1つまたは
複数の異種ヌクレオチド配列(すなわち導入遺伝子)、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ
またはより多くの異種ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたは非ウイルスベクタ
ーを指す。
使用されている。使用することができるウイルスベクターとして、レトロウイルスベクタ
ー、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター
、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター
、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、およびアデノウイル
スベクターが挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターとして、プラスミ
ド、リポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、核酸-タンパク質複合体、およびバイ
オポリマーが挙げられる。目的の核酸に加えて、ベクターは1つもしくは複数の調節領域
、ならびに/または核酸移入結果(特定の組織への送達、発現期間等)の選択、測定およ
びモニタリングに有用な選択マーカーも含むことができる。
ョン、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸
カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、または核酸ベ
クタートランスポーターにより、所望の細胞に導入することができる(例えば、Wu他、
J.Biol.Chem.267:963(1992);Wu他、J.Biol.Che
m.263:14621(1988);およびHartmut他、カナダ特許出願第2,
012,311号、1990年3月15日出願を参照)。様々な実施形態では、カチオン
性オリゴペプチド(例えば国際特許公開WO95/21931)、核酸結合タンパク質に
由来するペプチド(例えば国際特許公開WO96/25508)、および/またはカチオ
ン性ポリマー(例えば国際特許公開WO95/21931)等のその他の分子を、インビ
ボでの核酸の送達を促進するのに使用することができる。裸の核酸としてインビボでベク
ターを導入することもできる(米国特許第5,693,622号、米国特許第5,589
,466号および米国特許第5,580,859号を参照)。受容体媒介核酸送達アプロ
ーチも使用することができる(Curiel他、Hum.Gene Ther.3:14
7(1992);Wu他、J.Biol.Chem.262:4429(1987))。
がない限り互換的に使用され、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
ポリペプチドをコードする2つの異種ヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントが、
正しい翻訳リーディングフレームにおいて融合される場合に産生されるポリペプチドのこ
とである。例示的な融合ポリペプチドとして、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、
マルトース結合タンパク質、またはレポータータンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質
、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等)、赤血球凝集素、
c-myc、FLAGエピトープ等の全てまたは一部への、本発明のポリペプチド(また
はそのフラグメント)の融合が挙げられる。
、そのポリペプチドと通常は関連がある少なくとも1種類の生物学的活性(例えば、血管
新生活性、タンパク質結合、リガンドまたは受容体結合)を実質的に保持するものである
。特定の実施形態では、「機能性」ポリペプチドまたは「機能性フラグメント」は、非改
変ペプチドにより保有される活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に
保持する」とは、ポリペプチドが、天然のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約2
0%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、9
8%、99%またはより多くを保持する(および天然のポリペプチドより高いレベルの活
性を有することさえできる)ことを意味する。「非機能性」ポリペプチドとは、ポリペプ
チドと通常は関連がある、ほとんど検出できない生物学的活性または本質的に検出不能の
生物学的活性(例えば、多くてもほんのわずかな量、例えば約10%未満または5%未満
)を示すものである。タンパク質結合および血管新生活性等の生物学的活性は、当分野で
公知であり本明細書に記載されたアッセイを使用して測定することができる。
ssion)」という用語は、該配列が転写され、および任意選択的に翻訳されることを
意味する。典型的には、本発明によれば、本発明のコード配列の発現は本発明のポリペプ
チドの産生をもたらす。発現したポリペプチドまたはフラグメント全体は、精製すること
なくインタクトな細胞で機能することもできる。
型、AAV3型(3A型および3B型を含む)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、
AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、トリAAV、ウシ
AAV、イヌAAV、ウマAAVならびにヒツジAAV、ならびに未知のまたは後に発見
される任意の他のAAVが含まれるがこれらに限定されない。例えば、BERNARD
N.FIELDS他、VIROLOGY、第2巻、第69章(第4版、Lippinco
tt-Raven Publishers)を参照。多くのさらなるAAVの血清型およ
びクレードも同定されており(例えばGao他、(2004)J.Virol.78:6
381~6388および表1を参照)、これらも用語「AAV」に包含される。
ク質およびカプシドサブユニットの配列は当分野で既知である。そのような配列を、文献
にまたはGenBank(登録商標)データベース等の公共データベースに見出すことが
できる。例えば、GenBank(登録商標)受託番号NC002077、NC0014
01、NC001729、NC001863、NC001829、NC001862、N
C000883、NC001701、NC001510、AF063497、U8979
0、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J019
01、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028
226、AY028223、NC001358、NC001540、AF513851、
AF513852、AY530579、AY631965、AY631966を参照し、
これらの開示はその全体が本明細書に援用される。また、例えばSrivistava他
、(1983)J.Virol.45:555;Chiorini他、(1998)J.
Virol.71:6823;Chiorini他、(1999)J.Virol.73
:1309;Bantel-Schaal他、(1999)J.Virol.73:93
9;Xiao他、(1999)J.Virol.73:3994;Muramatsu他
、(1996)Virology 221:208;Shade他、(1986)J.V
irol.58:921;Gao他、(2002)Proc.Nat.Acad.Sci
.USA 99:11854;国際特許公開WO00/28061、WO99/6160
1、WO98/11244;米国特許第6,156,303号も参照し、これらの開示は
その全体が本明細書に援用される。また、表1も参照。Xiao,X.(1996)、「
Characterization of Adeno-associated vir
us(AAV)DNA replication and integration」、
博士論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルベニア州(その全体が本明細書に
援用される)には、AAV1、AAV2およびAAV3の末端反復配列の初期の説明が記
載されている。
方向末端反復(例えば、1つの、2つのまたは3つの逆方向末端反復)と、1つまたは複
数の異種ヌクレオチド配列とを含むAAVゲノム(すなわちvDNA)のことである。r
AAVベクターは、ウイルスを生成するために145塩基の末端反復(TR)をシスで一
般に保持するが、部分的にまたは完全に合成の配列を含む改変AAV TRおよび非AA
V TRも、この目的に役立つことができる。全てのその他のウイルス配列が必ずしも必
要ではなく、トランスで供給されてもよい(Muzyczka、(1992)Curr.
Topics Microbiol.Immunol.158:97)。rAAVベクタ
ーは2つのTR(例えばAAV TR)を任意選択的に含み、これらのTRは一般に異種
ヌクレオチド配列の5’末端および3’末端にあることができるが、それらに隣接してい
る必要はない。これらのTRは互いに同じであり得る、または互いに異なることができる
。ベクターゲノムはまた、その3’末端または5’末端に単一のITRを含有することも
できる。
を形成し逆方向末端反復として機能する(すなわち、例えば複製、ウイルスパッケージン
グ、組み込みおよび/もしくはプロウイルス救済等の所望の機能を媒介する)合成配列が
含まれる。TRは、AAV TRまたは非AAV TRであり得る。例えば、その他のパ
ルボウイルス(例えば、イヌパルボウイルス(CPV)、マウスパルボウイルス(MVM
)、ヒトパルボウイルスB-19)の非AAV TR配列等の非AAV TR配列または
SV40複製の開始点としての役割を果たすSV40ヘアピンをTRとして使用すること
ができ、非AAV TR配列またはSV40ヘアピンを短縮化、置換、欠失、挿入および
/または追加によりさらに改変することができる。さらに、TRは、Samulski他
に対する米国特許第5,478,745号に記載されている「二重D配列」等の部分的な
または完全な合成であり得る。
8、9、10もしくは11または未知のもしくは後に発見される任意の他のAAV(例え
ば表1を参照)が挙げられるがそれらに限定されない任意のAAV由来であり得る。AA
V末端反復が所望の機能、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび/また
はプロウイルス救済等を媒介する限り、AAV末端反復は、天然の末端反復配列を有する
必要はない(例えば、天然のAAV TR配列を挿入、欠失、短縮化および/またはミス
センス変異により変更することができる)。
「rAAV粒子」または「rAAVビリオン」は、AAVカプシド内にパッケージングさ
れているrAAVベクターゲノムを含む。
2巻、第69章および第70章(第4版、Lippincott-Raven Publ
ishers)により詳細に説明されている。
、分布、代謝および排出を指す。
うちの体循環に到達する画分または量である。本発明の実施形態の文脈では、用語「バイ
オアベイラビリティ」は通常の慣習的意味を含むが、さらに、FVIIIタンパク質が生
物活性である程度を含むようにより広義の意味を有すると理解される。FVIIIの場合
には、例えば、「バイオアベイラビリティ」の1つの測定値は、注入後に循環で得られる
FVIIIタンパク質のプロコアグラント活性である。
残基のγ-カルボキシル化、アスパラギン酸残基のβ-ヒドロキシル化、アスパラギン残
基のN結合型糖鎖付加、セリンおよび/またはトレオニン残基のO結合型糖鎖付加、チロ
シン残基の硫酸化、セリン残基のリン酸化ならびにこれらの任意の組み合わせを含むがこ
れらに限定されない。
参照して決定される。FVIIIに関して、標準物質はMonoCLATE-P(登録商
標)(CSL Behring)であってもよい。標準物質の生物学的活性は100%と
理解される。
用する場合、野生型FVIIIタンパク質および天然に存在するまたは人工のタンパク質
(例えばBドメイン欠失タンパク質)を含む。本発明のFVIIIタンパク質は、文献で
知られているようなFVIIIの変異形態をさらに含むことができる。本発明のFVII
Iタンパク質は、当分野で知られているような、現在既知のまたは後に同定される任意の
その他の天然に存在するヒトFVIIIタンパク質または人工のヒトFVIIIタンパク
質、ならびにそれらの誘導体および活性フラグメント/活性ドメインをさらに含む。
ベースから入手可能である。FVIII配列の例は以下の表に見出される。
該形態は、シグナルペプチドが除去され、およびプロテアーゼの作用により(または核酸
レベルでBドメインを除去してタンパク質からBドメインを改変することにより)Bドメ
インが切断されており、機能性FVIII凝固因子として折り畳まれたFVIIIの2つ
の非隣接ポリペプチド鎖(軽鎖および重鎖)をもたらす分子形態である。S743とQ1
638の間の残基が欠失された頻用SQバージョンを含む、ヒトFVIIIのいくつかの
Bドメイン欠失形態が知られている。具体的には、糖鎖付加の程度を高める改変を有する
FVIIIタンパク質が、該広義語に具体的には含まれる。
k受託番号AAA52484に見出すことができる。ヒトFVIIIタンパク質は235
1アミノ酸長であり、シグナルペプチド(残基1~19)、重鎖(残基20~759)、
Bドメイン(残基760~1332)、および軽鎖(残基1668~2351)から構成
される。シグナルペプチドがないアミノ酸配列を以下に開示する(配列番号5)。
れる通常の慣習的意味を含む広義語のことである。具体的には、注入時に測定される初期
値から初期値の半分までの低下にかかる注入後の時間を定義する、FVIIIに関連する
パラメータの測定値がこの定義に含まれる。いくつかの実施形態では、FVIIIの半減
期は、当分野で公知であるように、および本明細書に記載したように、様々な免疫アッセ
イにおいてFVIIIに対する抗体を使用して血液および/または血液成分で測定するこ
とができる。また、半減期は、当分野で公知であるように、および本明細書に記載したよ
うに、標準的な凝固アッセイを含む機能的アッセイを使用してFVIII活性の低下とし
て測定されてもよい。
ければ投与後にFVIIIのレベルを測定する目的で、生体試料(例えば、血液または血
液産物試料)を除去する最も早い実用的な時間に受容動物またはヒト対象(例えば循環)
において検出される、任意の許容される方法により測定されるFVIIIの量(FVII
I抗原レベルまたはFVIIIプロテアーゼもしくは凝固活性レベルを含むがこれらに限
定されない)を含む。現在の方法論では、FVIII回復を測定するための最も早い生体
採取時間は典型的には、FVIIIの注入、注射、またはさもなければ送達/投与後、最
初の15分以内であるが、科学技術および/または臨床技術が向上するにつれてより速い
採取時間を期待することは当然である。要するに、FVIIIの回復値は、受容動物また
は患者への注入、注射、またはその他の送達後できるだけ早い時点で受容者(例えば循環
)において測定することができる、注入、注射またはさもなければ送達/投与されたFV
IIIの最大画分となることを本明細書では意味する。
では該用語は、潜在的に糖鎖を受容し得る部位、および糖鎖が実際に結合されているタン
パク質内、具体的にはFVIII内の部位の両方に適用され、オリゴ糖および/または炭
水化物のアクセプターとして作用し得る任意のアミノ酸配列を含む。
たFVIIIタンパク質ベクターを含むがこれに限定されない本発明のFVIIIタンパ
ク質をコードする核酸分子で形質転換され、形質導入されおよび/またはトランスフェク
トされた細胞のことである。
学的起源または分子起源の先天性、後天性または誘導された任意の欠損を表す。例は、凝
固因子欠乏症(例えば、血友病AおよびB、または凝固因子XI、VII、VIIIもし
くはIXの欠乏)、凝固因子インヒビター、血小板機能不全、血小板減少症、フォンヴィ
ルブランド病、または手術もしくは外傷により誘発される出血である。
固因子のいずれかに対するインヒビターがない)対象においても生じ、血小板機能不全、
血小板減少症またはフォンヴィルブランド病により引き起こされることがある。そのよう
な場合、止血系は血友病の場合と同様に欠如し、または異常な必須凝固「化合物」(血小
板またはフォンヴィレブランド因子タンパク質など)を有し、大量出血を引き起こすこと
から、その出血は血友病により引き起こされる出血になぞらえることができる。手術また
は外傷と関連して広範な組織損傷を経験する対象では、正常な止血機構は差し迫った止血
の必要性に圧倒される可能性があり、正常な止血機構にもかかわらず出血を起こす場合が
ある。十分な止血の達成は、脳、内耳領域および眼等の外科的止血の可能性が限られる器
官で出血が生じる場合にも問題となる。同じ問題は、様々な器官(肝臓、肺、腫瘍組織、
胃腸管)から生検を採取する過程および腹腔鏡手術において発生し得る。全てのこれらの
状況に共通しているのは、外科的手法(縫合、クリップ等)により止血を行う難しさであ
る。これはまた出血が拡散しているケースでもある(出血性胃炎および大量子宮出血)。
急性および大量出血は、行われた療法により止血不全が誘発された、抗凝固療法中の対象
においても生じ得る。そのような対象は、抗凝固作用が迅速に中和されなければならない
場合、外科的介入を必要とすることがある。根治的恥骨後式前立腺摘除術は、前立腺癌が
限局している対象に対して一般に行われ術式である。手術は、著しいおよび時折の大量失
血をしばしば伴う。前立腺摘除中の少なからぬ失血は、主に複雑な解剖学的位置と関係し
ており、血管が密集した様々な部位は外科的止血が容易に利用できず、広い範囲からの広
汎出血をもたらす可能性がある。また、脳内出血は脳卒中の最も治療困難な形態であり、
脳内出血後最初の数時間での高い死亡率および血腫増大と関連している。不十分な止血の
場合に問題を引き起こし得る別の状況は、正常な止血機構を有する対象が、血栓塞栓症を
予防するための抗凝固療法を受ける場合である。そのような療法として、ヘパリン、プロ
テオグリカンのその他の形態、ワルファリンまたはビタミンK拮抗薬のその他の形態、な
らびにアスピリンおよびその他の血小板凝集阻害剤を挙げることができる。
天性インヒビターを有する血友病と関連している。別の実施形態では、出血は血小板減少
症と関連している。別の実施形態では、出血はフォンヴィルブランド病と関連している。
別の実施形態では、出血は重度の組織損傷と関連している。別の実施形態では、出血は重
度の外傷と関連している。別の実施形態では、出血は手術と関連している。別の実施形態
では、出血は腹腔鏡手術と関連している。別の実施形態では、出血は出血性胃炎と関連し
ている。別の実施形態では、出血は多量の子宮出血と関連している。別の実施形態では、
出血は機械的止血の可能性が限られる器官で生じている。別の実施形態では、出血は脳、
内耳領域または眼で生じている。別の実施形態では、出血は生検を受ける過程と関連して
いる。別の実施形態では、出血は抗凝固療法と関連している。
しくは出血状態を有する、または該出血障害もしくは出血状態になりやすい任意の動物を
含む。該出血障害または出血状態(血友病Aおよび後天性FVIII欠乏症(例えば、F
VIIIに対する自己抗体または血液悪性腫瘍による)等の)は、対象へのFVIIIの
投与により処置する、改善するまたは予防することができる。そのような対象は一般に、
哺乳動物対象(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、霊長類等等の実験動物)
、家畜もしくは商業用動物(例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ、ヒツジ等)、または飼育
動物(例えばネコ、イヌ、フェレット等)である。特定の実施形態では、対象は霊長類対
象、ヒト以外の霊長類対象(例えば、チンパンジー、ヒヒ、サル、ゴリラ等)またはヒト
である。本発明の対象は、制御が必要とされるおよび/または望まれる出血障害または出
血状態のリスクがあるとわかっているまたは考えられる対象であり得る。また、本発明に
係る対象は、制御が必要とされるまたは望まれる出血障害または出血状態のリスクがある
と以前にわかっていないまたは疑われていない対象も含み得る。さらなる選択肢として、
対象は実験動物および/または疾患の動物モデルであってもよい。
を含む。ヒト対象に関して、代表的な実施形態では、対象は乳児(例えば、約12カ月未
満、10カ月未満、9カ月未満、8カ月未満、7カ月未満、6カ月未満またはより若い)
、幼児(例えば、少なくとも約12、18もしくは24カ月および/または約36、30
もしくは24カ月未満)、または子供(例えば、少なくとも約1、2、3、4もしくは5
歳および/または約14、12、10、8、7、6、5もしくは4歳未満)であってもよ
い。本発明の実施形態では、対象は、約0カ月齢から3、4、5、6、9、12、15、
18、24、30、36、48もしくは60カ月齢、約3カ月齢から6、9、12、15
、18、24、30、36、48もしくは60カ月齢、約6カ月齢から9、12、15、
18、24、30、36、48もしくは60カ月齢、約9カ月齢から12、15、18、
24、30、36、48もしくは60カ月齢、約12カ月齢から18、24、36、48
もしくは60カ月齢、約18カ月齢から24、30、36、48もしくは60カ月齢、ま
たは約24カ月齢から30、36、48もしくは60カ月齢のヒト対象である。
本発明の一態様は、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドに関し、該プ
ロモーターは、配列番号1のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも約90%同一の配
列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。いくつかの実施形態では、ヌ
クレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも約90%、91%、92
%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である。該プロ
モーターは、短い(約200塩基対)強力な肝臓特異的プロモーターであり、目的のポリ
ヌクレオチドの肝臓特異的発現に理想的であり、その短い長さおよびAAVベクターの限
られた能力のためにAAVベクターで使用するのに特に適している。該プロモーターは、
保存された基本プロモーターエレメントおよび転写開始部位を含有するように設計された
。基本プロモーターは、肝臓特異的発現のためのいくつかの肝臓特異的転写因子結合部位
を有する5’末端で連結される(図1)。プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺
伝子およびヒト肝臓癌細胞株Huh7でのトランスフェクション実験を用いてインビトロ
で最初に同定され、次いでマウスにおいてインビボで確認されたように、高い活性を示す
。
’末端で)に作動可能に連結している発現カセットの一部である。これは、プロモーター
に連結された目的のポリヌクレオチドの発現レベルを高めるために行われてもよい。任意
の適切なイントロン、例えば、キメライントロンCIN(Promega)を使用するこ
とができる。いくつかの実施形態では、イントロンはVH4由来である。いくつかの実施
形態では、イントロンは短い非天然エクソンジャンクション配列をさらに含み得る。一実
施形態では、プロモーターおよびイントロンは一緒に、配列番号2のヌクレオチド配列、
または該配列と少なくとも90%同一、例えば、配列番号1のヌクレオチド配列と少なく
とも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もし
くは99%同一の配列を構成する、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。
つかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドはポリペプチドまたは機能性核酸をコード
する。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、凝固因子、例えばFVIII、
例えばBドメイン欠失FVIIIをコードする。Bドメイン欠失FVIIIは、配列番号
3のヌクレオチド配列、または配列番号3のヌクレオチド配列と少なくとも90%同一、
例えば、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97
%、98%もしくは99%同一の配列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列から
なるポリヌクレオチドによりコードされてもよい。一実施形態では、プロモーター、イン
トロン、およびBドメイン欠失FVIIIをコードする目的のポリヌクレオチドを含む発
現カセットは、配列番号4のヌクレオチド配列、または配列番号4のヌクレオチド配列と
少なくとも90%同一、例えば、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%
、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一の配列を含む、該配列から本質的
になるまたは該配列からなる。
である。ベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定
されない当分野で既知の任意の種類のベクターであってもよい。いくつかの実施形態では
、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの
実施形態では、ウイルスベクターは、AAV1型、AAV2型、AAV3型(3A型およ
び3B型を含む)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、A
AV9型、AAV10型、AAV11型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマA
AVおよびヒツジAAVならびに未知のまたは後に発見される任意の他のAAVを含むが
これらに限定されない、任意の既知のAAV血清型由来のAAVベクターである。いくつ
かの実施形態では、AAVベクターはAAV8またはAAV9である。
胞に関する(例えば、単離細胞、形質転換細胞、組換え細胞等)。そのため、本発明の様
々な実施形態は、ベクター(例えば発現カセット)を含有する組換え宿主細胞に関する。
そのような細胞は、遺伝子導入動物において単離するおよび/また存在することができる
。細胞の形質転換を以下でさらに記載する。
胞を含む遺伝子導入動物に関する。遺伝子導入動物を以下でさらに記載する。
。いくつかの実施形態は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび/もしくは細胞、
ならびに/または例えば本発明の方法を実行するための試薬および/もしくはキットを使
用するための説明書を含むキットに関する。
本発明の一態様は、1つまたは複数の追加の糖鎖付加部位を作製するために重鎖のアミ
ノ酸残基が改変されている、改変哺乳動物第VIII因子ポリペプチド(例えばヒトFV
IIIポリペプチド)に関する。特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の糖鎖付加
部位は、重鎖のC末端、例えば重鎖の最後の100アミノ酸残基、例えば最後の50、4
0、30、20、10、9、8、7、6または5残基にある。いくつかの実施形態では、
ポリペプチドは、少なくとも2つの糖鎖付加部位、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ
、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14もしくまたは15のまたはより多く
の糖鎖付加部位を作製するために改変される。改変には、アミノ酸置換、付加、欠失、ま
たはこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。これらの改変は、インビボで発現したとき
に活性が増加するFVIIIタンパク質を産生するように、FVIIIタンパク質のアミ
ノ酸配列に導入される。
(例えば野生型)FVIIIタンパク質(例えば配列番号5)に通常存在する糖鎖付加部
位の数より大きいことを意味する。
12、13、14、15等)追加の糖側鎖を含有するFVIIIタンパク質にさらに関す
る。そのような追加の糖側鎖は、本発明のFVIIIタンパク質の1つまたは複数の糖鎖
付加部位に存在することができる。また、追加の糖側鎖は、当分野で公知であるような、
そのような糖鎖をFVIII分子に導入する化学的および/または酵素的方法の結果とし
て、FVIIIタンパク質上の部位に存在することができる。「追加の」または「新たな
」糖鎖とは、FVIIIタンパク質中の糖鎖の数が、FVIIIの「野生型」形態に通常
存在する糖鎖の数より大きいことを意味する。様々な実施形態では、約1から約50の追
加の糖側鎖(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1
4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27
、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49または50)を追加することが
できる。
鎖付加部位およびO結合型糖鎖付加部位の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形
態では、追加される糖鎖付加部位にはN結合型糖鎖付加部位が含まれ、コンセンサス配列
はNXT/Sである(ただし、Xがプロリンでないことを条件とする)。他の実施形態で
は、糖鎖付加部位は、CXXGGT/S-C(配列番号24)、NSTE/DA(配列番
号25)、NITQS(配列番号26)、QSTQS(配列番号27)、D/E-FT-
R/K-V(配列番号28)、C-E/D-SN(配列番号29)、GGSC-K/R(
配列番号30)およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるコンセンサス
配列を含むO結合型糖鎖付加部位を含む。
質のアミノ酸配列に追加することができる。様々な実施形態では、約1から約50糖鎖付
加部位(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14
、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4
1、42、43、44、45、46、47、48、49または50)を追加することがで
きる。
hment site)」または「糖鎖付加部位(glycosylation sit
e)」は、糖付加コンセンサス配列(すなわち、糖(単糖、オリゴ糖または多糖)をアミ
ノ酸配列に付加するためのコンセンサス配列として作用する一連のアミノ酸を意味し得、
または糖部分が共有結合している実際のアミノ酸残基を意味し得る。糖部分は、単糖(単
純な糖分子)、オリゴ糖または多糖であってもよい。
挿入することができ、および/または該アミノ酸残基のいずれかに代入することができる
。さらに、本発明の同じインサートを、FVIIIタンパク質のアミノ酸配列の同じおよ
び/または異なる位置で複数回導入することができる。また、異なるインサートおよび/
または同じインサートを、FVIIIタンパク質のアミノ酸配列全体にわたってアミノ酸
残基間の同じおよび/または異なる位置に1回または複数回導入することができる。
の距離はわずか3、4、5または6アミノ酸であってもよい(例えば、Lundin他、
FEBS Lett.581:5601(2007);Apweiler他、Bioch
im.Biophys.Acta 1473:4(1991)を参照。それらの内容全体
が参照により本明細書に援用される)。
737は、アミノ酸残基XX(XはSまたはTである)により置換される。そのため、残
基736および737はSS、ST、TSまたはTTとなり得る。
2は、アミノ酸残基XXYVNRXL(配列番号6)(XはSまたはT)により置換され
る。そのため、残基736~742は以下となり得る。
2は、アミノ酸残基XXNNX(配列番号15)(XはSまたはT)により置換される。
そのため、残基736~740は以下となり得る。
れたもの、例えば、S743からGln1638のSQ欠失(配列番号5にナンバリング
されている)である。
特異的変異誘発等の組換え方法により産生することができる。また、本発明のFVIII
タンパク質は、化学的に合成されて1つまたは複数(例えば1、2、3、4、5、6、7
、8、9、10、11、12、13、14、15等)の追加の糖鎖付加部位を有するFV
IIIタンパク質を調製することができる。
酸配列の任意のアミノ酸残基を改変すること、ならびに公知の方法に従っておよび本明細
書に記載したように、任意の得られたFVIIIタンパク質を活性、安定性、回復、半減
期等について試験することは、本発明および当業者の技能の範囲内である(例えば、その
内容全体が参照により本明細書に援用されるElliott他、J.Biol.Chem
.279:16854(2004)を参照)。
び/または安定性を改善するために糖鎖付加部位が追加された組換えFVIIIタンパク
質(例えば、X0、X1、X2)に関する。本発明のFVIIIタンパク質は、本発明の
FVIIIタンパク質が投与された対象に対するFVIIIタンパク質のバイオアベイラ
ビリティの増加を可能にする改変を含む。いくつかの実施形態ではバイオアベイラビリテ
ィの増加は、血漿中のFVIIIの濃度が関連濃度となる血液学における標準的な現在の
考えを指す。本発明のいくつかの実施形態では、バイオアベイラビリティの増加は、より
長期間対象の循環にとどまるFVIIIタンパク質の能力を指す。したがって、本発明の
いくつかの実施形態では、本明細書に記載したFVIIIタンパク質は、インビボでの発
現後に活性を増加させたFVIIIタンパク質をもたらすように改変され、いくつかの実
施形態では、本発明は、本発明のFVIIIタンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本
発明のベクターおよび/または本発明の細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象
におけるFVIIIタンパク質の止血有効性を増加させる方法を提供する。これらの実施
形態のいずれかで対象に投与されるFVIIIタンパク質は、活性を増加させた本発明の
FVIIIタンパク質である。
により産生され、ならびに該方法を特徴とする。これらの方法には、凝固時間の決定(部
分トロンボプラスチン時間(PPT)アッセイ)、ならびに回復、半減期、およびバイオ
アベイラビリティを、当分野で公知であるような適切な免疫アッセイおよび/または活性
アッセイにより決定するための試験動物へのFVIIIタンパク質の投与が含まれる。
クレオチドおよびFVIIIタンパク質を産生するための発現カセットを提供する。
である。ベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定
されない、当分野で既知の任意の種類のベクターであり得る。いくつかの実施形態では、
ウイルスベクターは、AAV1型、AAV2型、AAV3型(3A型および3B型を含む
)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AA
V10型、AAV11型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAVおよびヒツ
ジAAVならびに未知のまたは後に発見される任意の他のAAVを含むがこれらに限定さ
れない、任意の既知のAAV血清型由来のAAVベクターである。いくつかの実施形態で
は、AAVベクターはAAV8またはAAV9である。
胞に関する(例えば、単離細胞、形質転換細胞、組換え細胞等)。そのため、本発明の様
々な実施形態は、ベクター(例えば発現カセット)を含有する組換え宿主細胞に関する。
そのような細胞は、遺伝子導入動物において単離するおよび/または存在することができ
る。細胞の形質転換を以下でさらに記載する。
胞を含む遺伝子導入動物に関する。遺伝子導入動物を以下でさらに記載する。
医薬組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態は、本発明のFVIIIタンパク質、ポリ
ヌクレオチド、ベクターおよび/もしくは細胞、ならびに/または例えば本発明の方法を
実行するための試薬および/もしくはキットを使用するための説明書を含むキットに関す
る。
本発明のさらなる態様は、ポリペプチドまたは機能性核酸を例えば肝臓特異的に産生す
るための、本発明のプロモーターおよび発現カセットの使用に関する。そのため、一態様
は、対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、本発明のポリ
ヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象の
肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法に関する。ポリヌクレオ
チド、ベクターおよび/または形質転換細胞は、ポリペプチドまたは機能性核酸を産生す
るように目的のポリヌクレオチドの発現が生じる条件下で送達される。そのような条件は
当分野で公知であり、以下でさらに記載される。
る血友病Aまたは後天性第VIII因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象に送達し、これ
により対象における血友病Aを処置することを含む方法に関する。いくつかの実施形態で
は、目的のポリヌクレオチドは、上記したFVIIIポリペプチドをコードする。
おけるFVIIIポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有
効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象に送達
し、これにより対象におけるFVIIIポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加さ
せることを含む方法に関する。この態様では、目的のポリヌクレオチドは、上記したFV
IIIポリペプチドをコードする。
効量のFVIIIタンパク質を投与することにより出血障害を処置する方法において使用
することができる。そのため、本発明はまた、それを必要とする対象に、有効量の、本発
明のFVIIIタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび/または細胞を投与する
ことを含む、出血障害を処置する方法も提供する。
III因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転
換細胞を対象に送達し、これにより対象の肝臓で第VIII因子を産生することを含む方
法に関する。
する方法であって、治療有効量の、本発明の改変ヒト第VIII因子ポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象に
おける血友病Aまたは後天性第VIII因子欠乏症を処置することを含む方法に関する。
ビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明の改変ヒト第VIII因子ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび/または形質転換細胞を対象に送
達し、これにより対象における第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを
増加させることを含む方法に関する。
VIII欠乏症等の、FVIIIで処置することができるいずれかの障害が挙げられる。
本発明のFVIIIタンパク質および/または本発明のFVIIIタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドを、対象(例えば、それを必要とする対象)に投与するまたは送達す
るためのそのような処置プロトコルおよび投与レジメンは、当分野で公知である。
、ウイルスベクターまたはその他の核酸ベクター)の投与量は、FVIIIタンパク質の
治療血漿濃度が達成されるような量であり得る。FVIIIタンパク質の治療濃度は、平
均100%で測定される健康な個体の正常レベルの1%超、故に、正常なヒト血漿1mL
中のFVIIIの1国際単位(IU)超であるとみなされる。当業者は、特定の対象およ
び特定の状態に対する最適用量を決定することができる。
入を行う前の約24時間以内、およびその後7日以上にもわたって投与される。凝固剤と
しての投与は、本明細書に記載した様々な経路によることができる。
いる。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、すなわち静脈内、皮下もしくは筋肉内に投
与される、または持続もしくはパルス注入により投与されてもよい。また、医薬組成物は
、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内に、肺内、膣内、直腸、眼
内を含むがこれらに限定されない様々な方法で、または任意のその他の許容される方法で
投与するために処方することができる。
例えば、該担体に溶解された)本発明のFVIIIタンパク質を含む。水、緩衝水、0.
4%生理食塩水、0.3%グリシン等等の様々な水性担体を使用することができる。本発
明のFVIIIタンパク質はまた、安定性および貯蔵を延長する、メチオニンおよびスク
ロース等の組成物と処方することもできる。本発明のFVIIIタンパク質はまた、傷害
の部位に送達するまたは該部位を標的とするためにリポソーム調製物中に処方することも
できる。リポソーム調製物は、例えば、米国特許第4,837,028号、米国特許第4
,501,728号および米国特許第4,975,282号に一般に記載されている。組
成物は、従来の公知の滅菌法により滅菌することができる。得られた水溶液は使用のため
にパッケージングする、または無菌条件下で濾過し凍結乾燥することができ、凍結乾燥調
製物は投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、張度
調節剤等等の、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム等の、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物
質を含有してもよい。組成物はまた、防腐剤、等張化剤、非イオン界面活性剤もしくは洗
浄剤、抗酸化剤および/またはその他の種々の添加剤も含有することができる。
は約1重量%または少なくとも約1重量%のところ、約0.5重量%未満から約15また
は20重量%まで)、選択された特定の投与様式に従って主に流量、粘度等により選択さ
れる。そのため、1つの非限定例として、静脈内注入用の典型的な医薬組成物は、滅菌リ
ンゲル溶液250mlおよびFVIIIタンパク質10mgを含有するように構成され得
る。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に既知または明らかであり
、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences
、第21版、Mack Publishing Company、イーストン、ペンシル
ベニア州(2005)により詳細に記載されている。
する核酸分子を含む組成物は、予防的および/または治療的処置のために投与することが
できる。治療的適用では、組成物は、疾患およびその合併症を治癒する、軽減するまたは
部分的に停止させるのに十分な量で、上記した疾患に既に罹患している対象に投与される
。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」として定義される。当業者に理解され
るように、この目的に有効な量は、疾患または傷害の重症度ならびに対象の体重および全
般的状態に依存する。
くは傷害になりやすいまたはさもなければ疾患状態もしくは傷害のリスクがある対象に投
与されて、対象自身の凝固能力を高める。そのような量は「予防有効量」であると定義さ
れる。予防的適用では、正確な量はこの場合も対象の健康状態および体重に依存する。
ターンで実行され得る。毎日維持レベルを必要とする外来対象には、FVIIIタンパク
質は、例えば携帯ポンプシステムを使用して持続注入により投与することができる。
徐放または持続放出組成物を処方する方法は当分野で既知であり、該方法として、該ポリ
ペプチドを含有する固体疎水性粒子の半透性マトリックスが挙げられるがこれに限定され
ない。
、灌流、ダブルバルーンカテーテル、人工血管もしくは血管ステントに組み込まれるステ
ント、バルーンカテーテルを被覆するのに使用されるハイドロゲル、またはその他の十分
に確立された方法によって実行することができる。いずれにしても、医薬組成物は、対象
を効果的に処置するのに十分なFVIIIタンパク質の量を提供するべきである。
AAVベクターを使用して対象に送達される。そのため、本発明はまた、目的のポリヌク
レオチドを含むAAVウイルス粒子(すなわちビリオン)も提供し、ウイルス粒子はベク
ターゲノムをパッケージングし(すなわちカプシド形成し)、任意選択的にAAVベクタ
ーゲノムをパッケージングする。
るための異種ポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。そのため、本発明は、イン
ビトロでの、エクスビボでのおよびインビボでのポリヌクレオチドの細胞への送達に有用
である。代表的な実施形態では、本発明の組換えベクターを有利に用いて、ポリヌクレオ
チドを動物(例えば哺乳動物)細胞へ送達または移入させることができる。
る。目的のポリヌクレオチドとして、ポリペプチドをコードし、任意選択的に治療用(例
えば医学的用途のまたは獣医学的用途の)ポリペプチドおよび/または免疫原性(例えば
ワクチン用の)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
ロフィン(ジストロフィンのミニ遺伝子またはマイクロ遺伝子のタンパク質産物等、例え
ば、Vincent他、(1993)Nature Genetics 5:130、米
国特許公開第2003017131号、Wang他、(2000)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 97:13714~9[ミニジストロフィン]、Harpe
r他、(2002)Nature Med.8:253~61[マイクロジストロフィン
]を参照);ミニアグリン、ラミニン-α2、サルコグリカン(α、β、γまたはδ)、
フクチン関連タンパク質、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、ドミナントネガ
ティブミオスタチン、血管新生因子(例えばVEGF、アンジオポエチン-1またはアン
ジオポエチン-2)、抗アポトーシス因子(例えばヘムオキシゲナーゼ-1、TGF-β
、プロアポトーシスシグナルの阻害因子、例えばカスパーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、
細胞死受容体[例えばCD-095]、チトクロムC放出の調節因子、ミトコンドリアの
開孔および膨張の阻害因子);アクチビンII型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、
例えばIカッパB優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、ミ
オスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント、細胞
周期調節因子、Rhoキナーゼ調節因子、例えば改変された細菌C3外酵素であるCet
hrin[BioAxone Therapeutics,Inc.、サンローラン、ケ
ベック州、カナダから入手可能]、BCL-xL、BCL2、XIAP、FLICEc-
s、ドミナントネガティブカスパーゼ-8、ドミナントネガティブカスパーゼ-9、SP
I-6(例えば米国特許出願第20070026076号を参照)、転写因子PGC-α
1、Pinch遺伝子、ILK遺伝子およびチモシンβ4遺伝子)、凝固因子(例えば、
第VIII因子、第IX因子、第X因子等)、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エ
ンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、細胞内のおよび/または細胞外
のスーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、LDL受容体、ネプリライシン、リポタン
パク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β-グロビン、α-グロビン、ス
ペクトリン、α1-抗トリプシン、メチルシトシン結合タンパク質2、アデノシンデアミ
ナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β-グルコセレブ
ロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼA、分枝鎖ケト酸
デヒドロゲナーゼ、RP65タンパク質、サイトカイン(例えばα-インターフェロン、
β-インターフェロン、インターフェロン-γ、インターロイキン1~14、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子、リンフォトキシン等)、ペプチド増殖因子、神経栄養因子
およびホルモン(例えばソマトトロピン、インスリン、IGF-1およびIGF-2等の
インスリン様増殖因子、GLP-1、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、線維芽細胞増
殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子-3および神経栄養因子-4、脳由来神経栄養因子
、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子-αおよび形質転換増殖因子-β等)、骨形態
形成タンパク質(RANKLおよびVEGFを含む)、リソソームタンパク質、グルタミ
ン酸受容体、リンフォカイン、可溶性CD4、Fc受容体、T細胞受容体、ApoE、A
poC、タンパク質ホスファターゼ阻害因子1の阻害因子1(I-1)、ホスホランバン
、serca2a、リソソーム酸α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、Bar
kct、β2-アドレナリン受容体、β2-アドレナリン受容体キナーゼ(BARK)、
ホスホイノシチド-3キナーゼ(PI3キナーゼ)、カルサルシン、受容体(例えば腫瘍
壊死増殖因子-α可溶性受容体)、抗炎症性因子、例えばIRAP、Pim-1、PGC
-1α、SOD-1、SOD-2、ECF-SOD、カリクレイン、チモシン-β4、低
酸素誘導転写因子[HIF]、血管新生因子、S100A1、パルブアルブミン、アデニ
リルシクラーゼ6型、Gタンパク質共役受容体キナーゼ2型ノックダウンをもたらす分子
、例えば短縮型の構成的に活性なbARKct;ホスホランバン阻害分子またはドミナン
トネガティブ分子、例えばホスホランバンS16E、モノクローナル抗体(単鎖モノクロ
ーナル抗体を含む)または自殺遺伝子産物(例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナ
ーゼ、ジフテリア毒素および腫瘍壊死因子、例えばTNF-α)、ならびにそれを必要と
する対象で治療効果を有する任意の他のポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されな
い。
ードするもの(例えば酵素)が挙げられる。レポーターポリペプチドは当分野で既知であ
り、該レポーターポリペプチドとして、蛍光タンパク質(例えば、EGFP、GFP、R
FP、BFP、YFPまたはdsRED2)、ルシフェラーゼ(例えば、ガウシア、ウミ
シイタケまたはホタル由来)等の検出可能な産物を産生する酵素、β-ガラクトシダーゼ
、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子、または直接検出することができるタンパク質が挙げられる
がこれらに限定されない。事実上いずれのタンパク質も、例えばタンパク質に対する特異
抗体を使用することにより直接検出することができる。真核細胞の正の選択または負の選
択のいずれかに適した追加のマーカー(および関連抗生物質)は、Sambrookおよ
びRussell(2001)、Molecular Cloning、第3版、Col
d Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプ
リング・ハーバー、ニューヨーク州、ならびにAusubel他(1992)、Curr
ent Protocols in Molecular Biology、John
Wiley&Sons(定期的更新を含む)に開示されている。
ム(例えば、米国特許第5,877,022号に記載されている)、スプライソソーム媒
介トランス-スプライシングをもたらすRNA(Puttaraju他、(1999)N
ature Biotech.17:246、米国特許第6,013,487号、米国特
許第6,083,702号を参照)、遺伝子サイレンシングを媒介する低分子干渉RNA
(siRNA)を含む干渉RNA(RNAi)(Sharp他、(2000)Scien
ce 287:2431を参照)、マイクロRNAまたは「ガイド」RNA(Gorma
n他、(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:4929、Y
uan他に対する米国特許第5,869,248号)等のその他の非翻訳「機能性」RN
A等をコードすることができる。例示的な非翻訳RNAとして、(例えば、腫瘍を治療す
るためのおよび/もしくは化学療法による損傷を予防するための心臓への投与のための)
多剤耐性(MDR)遺伝子産物に対するRNAiまたはアンチセンスRNA、ミオスタチ
ン(デュシェンヌ型のもしくはベッカー型の筋ジストロフィー)に対するRNAiまたは
アンチセンスRNA、VEGFまたは(腫瘍を処置するための)本明細書に具体的に記載
した腫瘍免疫原が挙げられるがこれに限定されない腫瘍免疫原に対するRNAiまたはア
ンチセンスRNA、変異ジストロフィン(デュシェンヌ型のもしくはベッカー型の筋ジス
トロフィー)を標的とするRNAiまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、(B型肝炎
感染を防止および/もしくは処置するための)B型肝炎表面抗原遺伝子に対するRNAi
またはアンチセンスRNA、(HIVを予防および/もしくは処置するための)HIVt
at遺伝子および/またはHIVrev遺伝子に対するRNAiまたはアンチセンスRN
A、ならびに/または(病原体から対象を保護するための)病原体由来の任意の他の免疫
原または(疾患を予防するまたは処置するための)欠陥遺伝子産物に対するRNAiまた
はアンチセンスRNAが挙げられる。上記した標的または任意の他の標的に対するRNA
iまたはアンチセンスRNAを研究試薬として用いることもできる。
よび阻害性RNA(例えばマイクロRANおよびRNAi、例えばsiRNAまたはsh
RNA)配列を使用して、ジストロフィン遺伝子の欠如から生じる筋ジストロフィーを有
する患者で「エクソンスキッピング」を誘発することができる。そのため、異種核酸は、
適切なエクソンスキッピングを誘発するアンチセンス核酸または阻害性RNAをコードす
ることができる。エクソンスキッピングのための特定のアプローチはジストロフィン遺伝
子の根本的な欠如の性質に依存し、多くのそのような戦略が当分野で既知であることを当
業者は認識する。例示的なアンチセンス核酸配列および阻害性RNA配列は、1つまたは
複数のジストロフィンエクソン(例えばエクソン19または23)の上流の分岐点および
/または下流のドナースプライス部位および/または内部スプライシングエンハンサー配
列を標的とする。例えば、特定の実施形態では、異種核酸は、ジストロフィン遺伝子のエ
クソン19または23の上流の分岐点および下流のスプライスドナー部位に対するアンチ
センス核酸または阻害性RNAをコードする。そのような配列を、改変U7snRNAと
アンチセンス核酸または阻害性RNAとを送達するAAVベクターに組み込むことができ
る(例えばGoyenvalle他、(2004)Science 306:1796~
1799を参照)。別の戦略として、改変U1snRNAを、ジストロフィンエクソン(
例えばエクソン19または23)の上流のおよび下流のスプライス部位に相補的なsiR
NA、マイクロRNAまたはアンチセンスRNAと共にAAVベクターに組み込むことが
できる(例えばDenti他、(2006)Proc.Nat.Acad.Sci.US
A 103:3758~3763を参照)。さらに、アンチセンス核酸および阻害性RN
Aは、エクソン19、43、45または53中のスプライシングエンハンサー配列を標的
とすることができる(例えば米国特許第6,653,467号、米国特許第6,727,
355号および米国特許第6,653,466号を参照)。
である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保持する特定の触媒ドメインを有する
(Kim他、(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:87
88、Gerlach他、(1987)Nature 328:802、Forster
およびSymons、(1987)Cell 49:211)。例えば、多くのリボザイ
ムは、高度に特異的なリン酸エステル転移反応を促進し、オリゴヌクレオチド基質のいく
つかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断することが多い(MichelおよびWe
sthof、(1990)J.Mol.Biol.216:585、Reinhold-
HurekおよびShub、(1992)Nature 357:173)。この特異性
は、化学反応前に基質が特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配
列(「IGS」)に結合するという要求に起因している。
されている(Joyce、(1989)Nature 338:217)。例えば、米国
特許第5,354,855号では、ある種のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌク
レアーゼの配列特異性よりも高くてDNA制限酵素の配列特異性に近いエンドヌクレアー
ゼとして作用することができることが報告されている。そのため、核酸発現の配列特異性
リボザイム媒介阻害は治療用途に特に適し得る(Scanlon他、(1991)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 88:10591、Sarver他(199
0)Science 247:1222、Sioud他、(1992)J.Mol.Bi
ol.223:831)。
発現を調節することができる天然の細胞RNA分子のことである。特定のマイクロRNA
の過剰発現または減少を使用して機能不全を処置することができ、多くの病状および疾患
の動物モデルで有効であることが分かっている(例えばCouzin、(2008)Sc
ience 319:1782~4を参照)。遺伝的疾患および後天性疾患を処置するた
めに、またはある種の組織の機能性を高め増殖を促進するために、キメラAAVを使用し
てマイクロRNAを細胞、組織および対象中に送達することができる。例えば、mir-
1、mir-133、mir-206および/またはmir-208を使用して心疾患お
よび骨格筋疾患を処置することができる(例えばChen他、(2006)Genet.
38:228~33、van Rooij他、(2008)Trends Genet.
24:159~66を参照)。マイクロRNAを使用して、遺伝子送達後に免疫系を調節
することもできる(Brown他、(2007)Blood 110:4144~52)
。
書で使用する場合、特定のDNA配列またはRNA配列に相補的であり特異的にハイブリ
ダイズする核酸を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれをコードする核酸を
、従来の技法に従って産生することができる。例えば、Tullisに対する米国特許第
5,023,243号、Pedersonに対する米国特許第5,149,797号を参
照。
の特異的ハイブリダイズおよびタンパク質産物の産生の(例えば少なくとも約30%、4
0%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはより多くの)低減に十分
である限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に完全に相補的であることは必
要ではないことを当業者は認識する。
中間ストリンジェンシー条件下で、さらにはストリンジェントな条件下で、そのようなオ
リゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを実行することができる。低ス
トリンジェンシーの、中間ストリンジェンシーのおよびストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件を実現するための適切な条件は本明細書に記載した通りである。
配列の相補体と少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%
のまたはより高い配列同一性を有し、タンパク質産物(上記で定義した)の産生を低減す
る。いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、標的配列と比較して1個、2個、3
個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個のミスマッチを含有する。
する。
質産物(上記で定義した)の産生を低減する限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長
さは重要ではなく、常法に従って決定することができる。一般に、アンチセンスヌクレオ
チドは、少なくとも約8、10もしくは12もしくは15のヌクレオチド長であり、かつ
/または約20未満、30未満、40未満、50未満、60未満、70未満、80未満、
100未満もしくは150未満のヌクレオチド長である。
産生の低減に有用な別のアプローチである。RNAiとは、目的の標的配列に対応する二
本鎖RNA(dsRNA)が細胞または生物に取り込まれ、対応するmRNAが分解する
転写後遺伝子サイレンシング機構のことである。RNAiにより遺伝子サイレンシングが
実現される機構は、Sharp他、(2001)Genes Dev 15:485~4
90およびHammond他、(2001)Nature Rev.Gen.2:110
~119)に概説されている。RNAiの効果が複数回の細胞分裂にわたって持続した後
に遺伝子発現が回復する。したがって、RNAiは、RNAレベルで、標的化したノック
アウトまたは「ノックダウン」を行う強力な方法である。RNAiは、ヒト胚腎細胞およ
びHeLa細胞を含むヒト細胞での成功が証明されている(例えばElbashir他、
Nature(2001)411:494~8を参照)。
を含む抗ウイルス防御機構が得られた(例えばGil他、(2000)Apoptosi
s 5:107を参照)。その後、「短干渉RNA」(siRNA)として既知である約
21個のヌクレオチドの短い合成dsRNAが、抗ウイルス応答を誘発することなく哺乳
動物細胞でサイレンシングを媒介することができることが証明されている(例えばElb
ashir他、Nature(2001)411:494~8、Caplen他、(20
01)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98:9742を参照)。
ison他、(2002)、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:14
43~1448を参照)であり得、RNaseIII様酵素であるDicerの作用によ
り細胞内で20~25merのsiRNA分子にプロセシングされると考えられる。sh
RNAは一般に、ループアウトする短スペーサー配列により2つの逆方向反復配列が分離
されているステム-ループ構造を有する。3~23のヌクレオオチド長の範囲のループを
有するshRNAが報告されている。ループ配列は一般に重要ではない。例示的なループ
構造として以下のモチーフが挙げられる:AUG、CCC、UUCG、CCACC、CT
CGAG、AAGCUU、CCACACCおよびUUCAAGAGA。
」型の構造を形成するために、両側に2つのループ領域を有するセンス領域およびアンチ
センス領域を含む環状分子をさらに含むことができる。この分子をインビトロまたはイン
ビボでプロセシングして、dsRNA部分、例えばsiRNAを遊離させることができる
。
びアンチセンス転写産物の両方を生成するための双方向性転写用のベクターが記載されて
いる。この技法を用いて、本発明に係る使用のためのRNAiを産生することができる。
Vプロモーター(pol IIプロモーター)由来の長dsRNAを発現させる方法が報
告されており、この方法を組織特異的pol IIプロモーターに適用することもできる
。同様に、Xia他、(2002)Nature Biotech.20:1006のア
プローチはポリ(A)尾部付加を回避し、組織特異的プロモーターに関連して使用され得
る。
ビボでの)Dicerによる長dsRNAの消化、送達ベクターからのインビボでの発現
、およびPCR由来RNAi発現カセットからのインビボでの発現が挙げられる(例えば
Ambion,Inc.,オースティン テキサス州からのTechNotes 10(
3)“Five Ways to Produce siRNAs”を参照;www.a
mbion.comで入手可能)。
,Inc.,オースティン テキサス州からの文献を参照;www.ambion.co
mで入手可能)。特定の実施形態では、siRNA配列は約30~50%のG/C含有量
を有する。さらに、RNAポリメラーゼIIIをRNAの転写に使用する場合、4個のT
残基またはA残基よりも大きい長ストレッチを一般に避ける。例えば、Whitehea
d Institute of Biomedical Research(www.j
ura.wi.mit.edu)を介してAmbion,Inc.(www.ambio
n.com)から、またはDharmacon Research,Inc.(www.
dharmacon.com)から、オンラインsiRNAターゲットファインダー(O
nline siRNA target finder)が入手可能である。
ンス領域が標的配列(上記に定義した)に特異的にハイブリダイズしてタンパク質産物の
産生を(例えば少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%
、95%またはより多く)低減する限り、標的配列に完全に相補的である必要はない。い
くつかの実施形態では、上記で定義したように、そのようなオリゴヌクレオチドの標的配
列へのハイブリダイゼーションを低ストリンジェンシー条件下で、中間ストリンジェンシ
ー条件下で、さらにはストリンジェントな条件下で実行することができる。
も約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%のまたはより高い配列同
一性を有し、タンパク質産物の産生を(例えば少なくとも約30%、40%、50%、6
0%、70%、80%、90%、95%またはより多く)低減する。いくつかの実施形態
では、アンチセンス領域は、標的配列と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、
7個、8個、9個または10個のミスマッチを含有する。ミスマッチは、dsRNAの中
心部分よりも端部で一般に許容される。
分子間複合体化により形成される。RNAiは、2つの別々の鎖の間の分子間塩基対合に
より形成される二本鎖領域を含む。その他の実施形態では、RNAiは、典型的には逆方
向反復として、センス領域およびアンチセンス領域の両方を含む単一の核酸分子内の分子
間塩基対合により形成されたds領域を含む(例えばshRNAもしくはその他のステム
ループ構造、または環状RNAi分子)。RNAiは、センス領域とアンチセンス領域と
の間にスペーサー領域をさらに含むことができる。
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで入手可能)を使用して、そ
の他の既知の配列との実質的な配列相同性を有しないRNAi配列を同定すべく関連する
データベースを検索することにより、標的以外の核酸の発現を妨げる可能性がある候補R
NAiを容易に除くことができる。
abs,Inc.およびAmbion,Inc.から市販されている。
組み換わる異種ヌクレオチド配列を含むこともできる。このアプローチを用いて、宿主細
胞での遺伝子欠損を修正することができる。
ウイルスベクターも提供する。異種核酸は、当分野で既知の目的の任意の免疫原をコード
することができ、該免疫原して、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ga
gタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原等からの免疫原が挙げられ
るがこれらに限定されない。また、免疫原は、ウイルスカプシド中に存在する(例えばウ
イルスカプシド中に組み込まれる)ことができる、または(例えば共有結合改変により)
ウイルスカプシドに繋がれ得る。
a他、(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:8507、Y
oung他に対する米国特許第5,916,563号、Mazzara他に対する米国特
許第5,905,040号、米国特許第5,882,652号、Samulski他に対
する米国特許第5,863,541号、これらの開示はその全体が参照により本明細書に
援用される)。抗原がウイルスカプシド中に存在することができる。また、組換えベクタ
ーゲノムに導入した異種核酸から抗原を発現させることができる。
ポリペプチドであり得、該疾患として、微生物による疾患、細菌による疾患、原虫による
疾患、寄生虫による疾患、真菌による疾患およびウイルスによる疾患が挙げられるがこれ
らに限定されない。例えば、免疫原は、オルソミクソウイルス免疫原(例えばインフルエ
ンザウイルス免疫原、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素(HA)表面タンパク
質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質遺伝子、またはウマインフルエンザウイ
ルス免疫原)、またはレンチウイルス免疫原(例えばウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サ
ル免疫不全ウイルス(SIV)免疫原またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)免疫原、例
えばHIVもしくはSIVのエンベロープGP160タンパク質、HIVもしくはSIV
のマトリックス/カプシドタンパク質、ならびにHIVもしくはSIVのgag遺伝子産
物、pol遺伝子産物およびenv遺伝子産物)であり得る。免疫原はまた、アレナウイ
ルス免疫原(例えばラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルスのヌクレオカプシ
ドタンパク質遺伝子およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子)、ポックスウイル
ス免疫原(例えばワクシニア、例えばワクシニアのL1遺伝子またはL8遺伝子)、フラ
ビウイルス免疫原(例えば黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原)、フィ
ロウイルス免疫原(例えばエボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原、例
えばNP遺伝子およびGP遺伝子)、ブニヤウイルス免疫原(例えばRVFVウイルス、
CCHFウイルスおよびSFSウイルス)、またはコロナウイルス免疫原(例えば感染性
ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスのエンベロープ糖タンパク質遺伝
子またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原また
は重症急性呼吸器症候群(SARS)免疫原、例えばS[S1もしくはS2]タンパク質
、Mタンパク質、Eタンパク質またはNタンパク質またはそれらの免疫原性フラグメント
)であることもできる。免疫原はさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原(例えばCMV
免疫原、EBV免疫原、HSV免疫原)、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫
原、ジフテリア毒素もしくはその他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎(例えばA型
肝炎、B型肝炎もしくはC型肝炎)免疫原または当分野で既知の任意の他のワクチン免疫
原であり得る。
瘍抗原または癌抗抗原を癌細胞の表面上で発現させる。例示的な癌細胞抗原および腫瘍細
胞抗原がS.A.Rosenberg、(1999)Immunity 10:281)
に記載されている。例示的な癌抗原および腫瘍抗原として、BRCA1遺伝子産物、BR
CA2遺伝子産物、gp100、チロシナーゼ、GAGE-1/2、BAGE、RAGE
、NY-ESO-1、CDK-4、β-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIA
A0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、MART-1(Couli
e他、(1991)J.Exp.Med.180:35)を含むメラノーマ腫瘍抗原(K
awakami他、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91
:3515、Kawakami他、(1994)J.Exp.Med.、180:347
、Kawakami他、(1994)Cancer Res.54:3124)、gp1
00(Wick他、(1988)J.Cutan.Pathol.4:201)ならびに
MAGE抗原(MAGE-1、MAGE-2およびMAGE-3)(Van der B
ruggen他、(1991)Science、254:1643)、CEA、TRP-
1;TRP-2;P-15およびチロシナーゼ(Brichard他、(1993)J.
Exp.Med.178:489);HER-2/neu遺伝子産物(米国特許第4,9
68,603号);CA125;HE4;LK26;FB5(エンドシアリン);TAG
72;AFP;CA19-9;NSE;DU-PAN-2;CA50;Span-1;C
A72-4;HCG;STN(シアリルTn抗原);c-erbB-2タンパク質;PS
A;L-CanAg;エストロゲン受容体;乳脂肪グロブリン;p53腫瘍サプレッサー
タンパク質(Levine、(1993)Ann.Rev.Biochem.62:62
3);ムチン抗原(国際特許公開WO90/05142);テロメラーゼ;核マトリック
スタンパク質;前立腺酸性ホスファターゼ;パピローマウイルス抗原;ならびに以下の癌
に関連する抗原:メラノーマ、腺がん、胸腺腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、非ホジキ
ンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚部癌
、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、頭頚部癌およびその他(例え
ばRosenberg、(1996)Ann.Rev.Med.47:481~91を参
照)が挙げられるがこれらに限定されない。
で細胞中において産生される任意のポリペプチドをコードすることができる。例えば、ウ
イルスベクターを培養細胞に導入し、発現したタンパク質産物を培養細胞から単離するこ
とができる。
とを当業者は理解する。例えば、異種核酸を、発現制御エレメント、例えば転写/翻訳制
御シグナル、複製開始点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位(IRES
)、プロモーター、エンハンサー等と作動可能に結合させることができる。
ントを使用することができることを当業者はさらに認識する。所望の発現パターンに応じ
て、プロモーター/エンハンサーは構成的であり得る、または誘導性であり得る。プロモ
ーター/エンハンサーは生来または外来性であり得、天然配列または合成配列であり得る
。外来性とは、転写開始領域が、該転写開始領域が導入されている野生型宿主において見
出されないことを意図するものである。
来であり得、および/または異種核酸配列に対して生来であり得る。プロモーター/エン
ハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞中で機能することができるように選択され
る。代表的な実施形態では、プロモーター/エンハンサーエレメントは哺乳動物のプロモ
ーター/エンハンサーエレメントである。プロモーター/エンハンサー(enhance
)エレメントは構成的または誘導性であり得る。
が望ましい用途で使用される。遺伝子送達用の誘導性プロモーター/エンハンサーエレメ
ントは、組織特異的なまたは組織優先的なプロモーター/エンハンサーエレメントであり
得、該エレメントには、(心臓、骨格および/または平滑筋を含む)筋肉に特異的なまた
は優先的な、(脳特異的を含む)神経組織に特異的なまたは優先的な、(網膜特異的およ
び角膜特異的を含む)眼、肝臓に特異的なまたは優先的な、骨髄に特異的なまたは優先的
な、膵臓に特異的なまたは優先的な、脾臓に特異的なまたは優先的な、および肺に特異的
なまたは優先的なプロモーター/エンハンサーエレメントが含まれる。その他の誘導性プ
ロモーター/エンハンサーエレメントとして、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導
性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター/エンハンサーエレメントとし
て、Tetオン/オフエレメント、RU486-誘導性プロモーター、エクジソン誘導性
プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが
挙げられるがこれらに限定されない。
たタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルを一般に用いる
。ATG開始コドンおよび隣接配列を含むことができるこれらの外因性翻訳制御配列は様
々な起源であり得、すなわち天然および合成のどちらでもあることができる。
形態では、本発明は、組換えウイルスベクターを産生する方法であって、細胞にインビト
ロで、(a)(i)目的のポリヌクレオチドおよび(ii)AAVテンプレートのウイル
ス粒子へのカプシド形成に十分なパッケージングシグナル配列(例えば、AAV末端反復
等の1つまたは複数の(例えば2つの)末端反復)を含むテンプレートと、(b)テンプ
レートの複製およびウイルス粒子へのカプシド形成に十分なAAV配列(例えば、AAV
rep配列およびAAVcap配列)とを提供することを含む方法を提供する。カプシド
内にパッケージングされたテンプレートを含む組換えウイルス粒子が細胞中で産生される
ような条件下で、テンプレート配列およびAAV複製配列およびカプシド配列が提供され
る。本方法は、細胞からウイルス粒子を回収する工程をさらに含むことができる。培地か
らかつ/または細胞を溶解させることにより、ウイルス粒子を回収することができる。
る方法であって、細胞にインビトロで、AAVカプシドをコードする核酸、AAVrep
コード配列、目的のポリヌクレオチドを含むAAVベクターゲノムおよび増殖性AAV感
染を生じさせるヘルパー機能を提供すること、ならびにAAVカプシドを含むAAV粒子
の組み立てを可能にし、AAVベクターゲノムをカプシド形成することを含む方法を提供
する。
野で既知の任意の適切な細胞を用いることができる。複製欠陥性ヘルパーウイルス、例え
ば293細胞またはその他のE1aトランス相補性細胞から欠失した機能を提供するトラ
ンス相補性パッケージング細胞株も適している。
ができる。最新のプロトコルにより、単一のプラスミド上でAAVrep/cap遺伝子
が典型的には発現される。AAV複製配列およびパッケージング配列を共に供給する必要
はないが、そのようにすることが便利な場合がある。AAVrep配列および/またはA
AVcap配列を、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにより供給するこ
とができる。例えば、rep/cap配列を、ハイブリッドアデノウイルスベクターまた
はハイブリッドヘルペスウイルスベクターにより供給することができる(例えば、欠失ア
デノウイルスベクターのEa1領域またはE3領域に挿入することができる)。EBVベ
クターを用いてAAVcap遺伝子およびAAVrep遺伝子を発現させることもできる
。この方法の1つの利点は、EBVベクターがエピソームであるが、連続的な細胞分裂を
通して高コピー数を維持することができる(すなわち、EBVベースの核エピソームと命
名した染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる)ことである。
ムであり得る、または組み込まれ得る)。
ITR)に隣接せず、これらの配列の救済および/またはパッケージングを防止すること
ができる。
)を細胞に供給することができる。例えば、非ウイルス(例えばプラスミド)ベクターま
たはウイルスベクターにより、テンプレートを供給することができる。特定の実施形態で
は、テンプレートは、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターにより供
給される(例えば、欠失アデノウイルスのE1a領域またはE3領域に挿入される)。別
の例示として、AAV ITRに隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルス
ベクターがPalombo他、(1998)J.Virol.72:5025に記載され
ている。EBVベクターを用いて、rep/cap遺伝子に関して上記に記載したように
テンプレートを送達することもできる。
給される。さらに他の実施形態では、AAVプロウイルスが細胞の染色体に安定的に組み
込まれる。
例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス)が細胞に概して供給される。AAV複製
に必要なヘルパーウイルス配列は当分野で既知である。典型的には、これらの配列は、ヘ
ルパーアデノウイルスベクターまたはヘルパーヘルペスウイルスベクターにより供給され
る。また、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターにより、例えばFerrar
i他、(1997)Nature Med.3:1295ならびに米国特許第6,040
,183号および米国特許第6,093,570号に記載されているように効率的なAA
V産生に必要である全てのヘルパー遺伝子を保有する非感染性のアデノウイルスミニプラ
スミドとして、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列を供給することができる
。
ヘルパー遺伝子を有するパッケージング細胞により、ヘルパーウイルス機能を提供するこ
とができる。代表的な実施形態では、ヘルパーウイルス配列をAAVビリオン中にパッケ
ージングすることはできず、例えばAAV ITRに隣接していない。
ルス配列)を単一のヘルパー構築物上に供給することが有利であり得ることを当業者は認
識する。このヘルパー構築物は非ウイルス構築物またはウイルス構築物であり得るが、任
意選択的に、AAVrep/cap遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイ
ブリッドヘルペスウイルスであり得る。
p/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。このベクターはrAA
Vテンプレートをさらに含有する。AAVrep/cap配列および/またはrAAVテ
ンプレートを、アデノウイルスの欠失領域(例えばE1a領域またはE3領域)に挿入す
ることができる。
cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。rAAVテンプレートはプ
ラスミドテンプレートとして供給される。
p/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給され、rAAVテンプレートは
プロウイルスとして細胞に組み込まれる。また、染色体外エレメントとして(例えば「E
BVベースの核エピソーム」として、Margolski、(1992)Curr.To
p.Microbiol.Immun.158:67を参照)細胞内に維持されるEBV
ベクターによりrAAVテンプレートが供給される。
ap配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。rAAVテンプレートは別々
の複製ウイルスベクターとして供給される。例えば、rAAV粒子によりまたは別の組換
えアデノウイルス粒子によりrAAVテンプレートを供給することができる。
およびパッケージングに十分なアデノウイルスの5’シス配列および3’シス配列(すな
わち、アデノウイルスの末端反復およびPAC配列)を典型的には含む。AAVrep/
cap配列および存在する場合にはrAAVテンプレートはアデノウイルスバックボーン
に埋め込まれており、5’シス配列および3’シス配列に隣接しており、そのため、これ
らの配列をアデノウイルスカプシド中にパッケージングすることができる。上記に記載し
たように、代表的な実施形態では、アデノウイルスヘルパー配列およびAAVrep/c
ap配列はAAVパッケージング配列(例えばAAV ITR)に隣接しておらず、その
ため、これらの配列はAAVビリオン中にパッケージングされない。
ることもできる。AAVrepタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは
、よりスケーラブルなAAVベクター産生スキームを有利に促進することができる。AA
V-2rep遺伝子およびAAV-2cap遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペス
ウイルスI型(HSV-1)が記載されている(Conway他、(1999)Gene
Therapy 6:986およびWO00/17377、これらの開示はその全体が
本明細書に援用される)。
py 13:1935~43に記載されているようにrep/cap遺伝子およびrAA
Vテンプレートの送達にバキュロウイルスベクターを使用して、本発明のウイルスベクタ
ーを昆虫細胞中で産生することができる。
する(例えば米国特許第5,658,785号を参照)。
ックを得ることができる。例えば、AAVおよびヘルパーウイルスをサイズに基づいて容
易に区別することができる。AAVをヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウ
イルスから分離することもできる(Zolotukhin他、(1999)Gene T
herapy 6:973)。代表的な実施形態では、いかなる夾雑ヘルパーウイルスも
複製能を有しないように、欠失した複製欠損ヘルパーウイルスを使用する。さらなる代替
として、アデノウイルスの初期遺伝子発現のみがAAVウイルスのパッケージングの媒介
に必要であることから、後期遺伝子発現を欠いているアデノウイルスヘルパーを用いるこ
とができる。後期遺伝子発現が不完全なアデノウイルス変異体は当分野で既知である(例
えばts100Kアデノウイルス変異体およびts149アデノウイルス変異体)。
できる。特定の実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも約105形質導入単位(
tu)/ml、少なくとも約106tu/ml、少なくとも約107tu/ml、少なく
とも約108tu/ml、少なくとも約109tu/mlまたは少なくとも約1010t
u/mlの力価を有する。
ーと、任意選択的にその他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希
釈剤等とを含む医薬組成物を提供する。注射では、担体は典型的には液体となる。その他
の投与の方法では、担体は固体でもよいし液体でもよい。吸入投与では、担体は呼吸に適
し、好ましくは固体または液体粒子形態となる。
ない材料を意味し、すなわち、任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく材
料を対象に投与することができる。
。特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法により、感染の適切な多重度でウイルスベ
クターを細胞に導入することができる。投与するウイルスベクターまたはカプシドの力価
は、標的細胞の型および数、ならびに具体的なウイルスベクターまたはカプシドに応じて
異なることができ、過度の実験を行うことなく当業者により決定され得る。特定の実施形
態では、少なくとも約103感染単位を、より好ましくは少なくとも約105感染単位を
細胞に導入する。
、特に脳細胞、例えば神経細胞、希突起神経膠細胞、グリア細胞、星状膠細胞を含む)、
肺細胞、眼の細胞(網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞を含む)、上皮細胞(例えば
腸上皮細胞および呼吸上皮細胞)、骨格筋細胞(筋芽細胞、筋管および筋繊維を含む)、
横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞(島細胞を含む)、肝細胞、消化管の細胞(平滑筋細
胞、上皮細胞を含む)、心臓細胞(心筋細胞を含む)、骨細胞(例えば骨髄幹細胞)、造
血幹細胞、脾臓細胞、角化細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞(例えば
軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む)、生殖細胞等が挙げられるがこれらに限定されな
い任意の種類であり得る。また、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらにまた、細胞は
幹細胞(例えば神経幹細胞、肝幹細胞)であり得る。さらにまた、細胞は癌細胞または腫
瘍細胞(上記に記載している癌および腫瘍)であり得る。さらに、上記に示したように、
細胞は任意の種類の起源由来であり得る。
とができる。特定の実施形態では、対象から細胞を取り出し、細胞にウイルスベクターを
導入し、次いで細胞を対象内に戻す。エクスビボでの処置のために対象から細胞を取り出
し、続いて対象内に戻す方法は当分野で既知である(例えば米国特許第5,399,34
6号を参照)。または、組換えウイルスベクターを、別の対象由来の細胞に、培養細胞に
、または任意のその他の適切な供給源由来の細胞に導入し、それを必要とする対象に該細
胞を投与する。
細胞の投与量は、対象の年齢、状態および種、細胞型、細胞により発現される核酸、投与
の様式等に応じて異なることができる。典型的には、薬学的に許容される担体中、投与1
回当たり少なくとも約102~約108個のまたは約103~106個の細胞を投与する
ことができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターにより形質導入された細胞を有効
量で、薬学的に許容される担体と共に対象に投与する。
、送達されたポリペプチド(例えば導入遺伝子として発現される、またはカプシド中で発
現される)に対する免疫応答を誘発することができる。典型的には、有効量のポリペプチ
ドを発現する量の細胞を、薬学的に許容される担体と共に投与する。任意選択的に、投与
量は防御免疫応答(上記で定義した)を引き起こすのに十分である。免疫原性ポリペプチ
ドを投与する利点が該投与の任意の不利益を上回る限り、付与される防御の程度が完全で
ある必要はない、または持続性である必要はない。
定の実施形態では、本方法は、目的のポリヌクレオチドを動物対象に送達する方法を含み
、該方法は、有効量の、本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与することを含む
。当分野で既知の任意の手段により、それを必要とするヒト対象または動物に本発明のウ
イルスベクターを投与することができる。任意選択的に、薬学的に許容される担体中のウ
イルスベクターを有効な用量で送達する。
原性応答を誘発することができる。典型的には、本発明のワクチンは、有効量のウイルス
を薬学的に許容される担体と共に含む。任意選択的に、投与量は防御免疫応答(上記で定
義した)を引き起こすのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与する利点が該投与の
任意の不利益を上回る限り、付与される防御の程度が完全である必要はない、または持続
性である必要はない。対象および免疫原は上記に記載した通りである。
個々の対象の状態、具体的なウイルスベクターおよび送達する核酸によって決めることが
でき、定常的な方法で決定することができる。治療効果を達成する例示的な用量は、少な
くとも約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1
03、1014、1015形質導入単位またはより多くであり、好ましくは約107また
は108、109、1010、1011、1012、1013または1014形質導入単
位であり、さらにより好ましくは約1012形質導入単位である。
を用いて、様々な間隔の期間にわたり、例えば日毎に、週毎に、月毎に、年毎に等で所望
のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
を介する)吸入、口腔(例えば舌下)、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内(または卵内)
、非経口(例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内[骨格筋、横隔膜筋および/または心筋へ
の投与等]、皮内、胸腔内、脳内および関節内)、局所(例えば皮膚表面と気道表面を含
む粘膜表面との両方、および経皮投与)、リンパ管内等、ならびに組織または器官への(
例えば肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への)直接注入が挙げられる。腫瘍(例え
ば腫瘍またはリンパ節の内部または近傍)に投与することもできる。いずれの場合であっ
ても、最も適切な経路を、処置する状態の性質および重症度、ならびに使用する具体的な
ベクターの性質によって決めることができる。
送達を達成することもでき、デポー剤は、組織に埋め込むことができ、または該組織を、
ウイルスベクターを含むフィルムまたはその他のマトリックスと接触させることができる
。そのような埋め込み可能なマトリックスまたは基質の例が米国特許第7,201,89
8号)に記載されている。
行して、核酸を組織または器官に送達することができ、本発明は、通常は血液中を循環す
るタンパク質産物(例えば酵素)もしくは非翻訳RNA(例えばRNAi、マイクロRN
A、アンチセンスRNA)の産生用の、または疾患(例えば代謝障害、例えば糖尿病(例
えばインスリン)、血友病(例えば第IX因子もしくは第VIII因子)またはリソソー
ム蓄積障害(例えばゴーシェ病[グルコセレブロシダーゼ]、ポンペ病[リソソーム酸性
α-グルコシダーゼ]またはファブリー病[α-ガラクトシダーゼA]またはグリコーゲ
ン蓄積障害(例えばポンペ病[リソソーム酸性αグルコシダーゼ])を処置するためのそ
の他の組織への全身的送達用のプラットフォームとして使用される。代謝障害の処置に適
したその他のタンパク質は上記に記載されている。
はエマルションとしてのいずれかの従来の形態で調製することができる。また、ウイルス
ベクターを例えばデポー剤または徐放性製剤で全身的な様式ではなくて局所に投与するこ
とができる。さらに、(例えば米国特許第7,201,898号に記載されているように
)ウイルスベクターを、例えば骨移植代替物、縫合糸、ステント等の外科的に埋め込み可
能なマトリックスに乾燥して送達することができる。
ル、カシェ剤、ロゼンジ剤もしくはタブレット等の個別の単位で;粉末または顆粒として
;水性のもしくは非水性の液体の溶液もしくは懸濁液として;または水中油型のもしくは
油中水型のエマルションとして提供することができる。本発明のウイルスベクターと動物
の腸内において消化酵素による分解に耐えることが可能な担体との複合体化により、経口
送達を行うことができる。そのような担体の例として、当分野で既知であるようにプラス
チックカプセルまたはタブレットが挙げられる。そのような製剤を薬学の任意の適切な方
法により調製し、該方法は、組成物と、(上記で述べた1種または複数の副成分を含有す
ることができる)好適な担体とを結合させる工程を含む。一般に、組成物と液体の担体も
しくは微粉化した固体の担体またはその両方とを均一にかつ密接に混合し、次いで、必要
な場合には得られた混合物を成形することにより、本発明の実施形態に係る医薬組成物を
調製する。例えば、組成物と任意選択的に1種または複数の副成分とを含有する粉末また
は顆粒を圧縮するまたは成型することにより、タブレットを調製することができる。結合
剤、潤滑剤、不活性希釈剤および/または界面活性剤/分散剤と任意選択的に混合した、
粉末または顆粒等の易流動形態の組成物を適切な機械中で圧縮することにより、圧縮タブ
レットを調製する。不活性な液体結合剤で湿らせた粉末状化合物を適切な機械中で成型す
ることにより、成型タブレットを作製する。
たはトラガントである風味付け基剤中に本発明の組成物を含むロゼンジ剤;ならびにゼラ
チンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアゴム等の不活性基剤中に組成物を
含むパステル剤が挙げられる。
射液を構成することができ、これらの調製液は、対象の受容者の血液と任意選択的に等張
である。これらの調製液は、組成物と対象の受容者の血液とを等張にする抗酸化剤、緩衝
剤、静菌薬および溶液を含有することができる。水性のおよび非水性の無菌の懸濁液、溶
液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エ
チル等の注射可能な有機エステルである。水性担体として、水、アルコール性/水性の溶
液、食塩水および緩衝媒体を含むエマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体と
して、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース(Ringer’s dextro
se)、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル(lactated R
inger’s)または不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体として、流体および栄養補
充液、電解質補充液(例えばリンゲルデキストロースをベースとするもの)等が挙げられ
る。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス等の、防腐剤およびその他の
添加剤が存在することもできる。
およびバイアル中の状態で存在することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば食塩
水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライした(凍結乾燥した)状態で貯
蔵され得る。
から調製することができる。例えば、密封した容器中における単位剤形の形態で、本発明
の注射可能な安定した無菌の組成物を提供することができる。組成物を凍結乾燥した形態
で提供することができ、該組成物を適切な薬学的に許容される担体と再構成して対象への
注射に適した液体組成物を形成することができる。単位剤形は、約1μg~約10グラム
の本発明の組成物であり得る。組成物が実質的に水不溶性である場合、十分な量の生理的
に許容される乳化剤が、水性担体中で組成物を乳化させるのに十分な量で含有され得る。
そのような有用な乳化剤の一つはホスファチジルコリンである。
例えばカカオ脂等の1種または複数の従来の固体担体とを混合し、次いで得られた混合物
を成形することにより、この座薬を調製することができる。
スト、ゲル、スプレー、エアロゾルおよび/またはオイルの形態を取ることができる。使
用することができる担体として、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコ
ール、経皮エンハンサーおよびこれらの2種以上の組み合わせが挙げられるがこれらに限
定されない。いくつかの実施形態では、例えば本発明の医薬組成物と皮膚を通過可能な親
油性試薬(例えばDMSO)とを混合することにより、局所送達を行うことができる。
に適した個別パッチの形態であり得る。経皮投与に適した組成物をイオン導入(例えばP
harm.Res.3:318(1986)を参照)により送達することもでき、該組成
物は任意選択的に緩衝した本発明の組成物の水溶液の形態を典型的にはとる。適切な製剤
は、クエン酸塩緩衝液もしくはビス/トリス緩衝剤(pH6)またはエタノール/水を含
むことができ、0.1~0.2Mの活性成分を含有することができる。
呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより、本明細書中に開示したウイルスベ
クターを対象の肺に投与することができる。吸入用粒子は液体または固体であり得る。当
業者に既知であるように、任意の適切な手段により、例えば圧力駆動式のエアロゾル噴霧
器または超音波噴霧器により、ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルを産生する
ことができる。例えば米国特許第4,501,729号を参照。ウイルスベクターを含む
固体粒子のエアロゾルも同様に、製薬分野で既知の技法により、任意の固体粒子の薬剤エ
アロゾル発生器により産生することができる。
多くの発現ベクターを使用して遺伝子改変細胞を作製することができる。いくつかの発
現ベクターは、選択された高発現細胞に好都合な様々な条件下で、トランスフェクトされ
た細胞の増幅後に大量の組換えタンパク質を発現するように設計される。いくつかの発現
ベクターは、淘汰圧下で増幅を必要とすることなく大量の組換えタンパク質を発現するよ
うに設計される。本発明は、当分野で標準的な方法に従った遺伝子改変細胞の産生を含み
、任意の特異的発現ベクターまたは発現系の使用に依存しない。
タンパク質をコードするポリヌクレオチド(例えばcDNA)を含有する発現ベクターを
トランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、FVIIIタンパク質は、FVII
Iタンパク質の適切な翻訳後修飾を特定の細胞系で生じさせる選択されたコトランスフェ
クト酵素と共に発現される。
質をコードする核酸分子(例えばcDNA)を含有する発現ベクターをトランスフェクト
することができる細胞である。
生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は文献で十
分に説明されている。例えば、Sambrook他、Molecular Clonin
g;A Laboratory Manual、第2版(1989);DNA Clon
ing、Vol.IおよびII(D.N Glover編、1985);Oligonu
cleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucle
ic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higg
ins編、1984);Transcription and Translation
(B.D.Hames&S.J.Higgins編、1984);Animal Cel
l Culture(R.I.Freshney編、1986);Immobilize
d Cells and Enzymes(IRL Press、1986);B.Pe
rbal、A Practical Guide to Molecular Clon
ing(1984);シリーズ、Methods in Enzymology(Aca
demic Press,Inc.)、特にVol.154および155(それぞれ、W
uおよびGrossman、ならびにWu編);Gene Transfer Vect
ors for Mammalian Cells(J.H.MillerおよびM.P
.Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laborato
ry);Immunochemical Methods in Cell and M
olecular Biology、MayerおよびWalker編(Academi
c Press,London,1987);Scopes,Protein Puri
fication:Principles and Practice、第2版、198
7(Springer-Verlag,N.Y.);ならびにHandbook of
Experimental Immunology Vol I~IV (D.M.We
irおよびC.C.Blackwell編、1986)を参照。本明細書で引用する全て
の特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
遺伝子操作によるクローン化遺伝子、組換えDNA、ベクター、形質転換細胞、タンパ
ク質およびタンパク質フラグメントの産生は公知である。例えば、Bell他の米国特許
第4,761,371号、Col.6、3行目~Col.9、65行目;Clark他の
米国特許第4,877,729号、Col.4、38行目~Col.7、6行目;Sch
illingの米国特許第4,912,038号、Col.3、26行目~Col.14
、12行目;およびWallnerの米国特許第4,879,224号、Col.6、8
行目~Col.8、59行目を参照。
ドする核酸を増幅するおよび/またはFVIIIタンパク質をコードする核酸を発現する
ために本明細書で使用される。発現ベクターは、FVIIIタンパク質をコードするヌク
レオチド配列が適切な制御配列に作動可能に連結している複製可能な核酸構築物である。
制御配列は、該ヌクレオチド配列の発現をもたらして適切な宿主細胞でFVIIIタンパ
ク質を産生することができる。そのような制御配列の必要性は、選択される宿主細胞およ
び選択される形質転換方法に応じて異なる。一般に、制御配列として、転写プロモーター
、転写を制御する任意選択のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコ
ードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。
ウイルス)、ファージ、および組み込み可能なDNAフラグメント(すなわち、組換えに
より宿主細胞ゲノムに組み込み可能なフラグメント)を含む。ベクターは、宿主細胞ゲノ
ムとは独立に複製および機能することができ(例えば一過性発現により)、または宿主細
胞ゲノム自体に組み込むことができる(例えば安定的組み込み)。発現ベクターは、発現
される核酸分子に作動可能に連結し、宿主細胞および/または生物において作動可能なプ
ロモーターおよびRNA結合部位を含有することができる。
動可能に連結され、または作動可能に結合される。例えば、プロモーターは、これがコー
ド配列の転写を制御するならば、コード配列に作動可能に連結しており、またはリボソー
ム結合部位は、これがコード配列の翻訳を可能にするように位置しているならば、コード
配列に作動可能に連結している。
等の高等真核細胞が挙げられる。多細胞生物に由来する細胞は、組換えFVIIIタンパ
ク質合成に特に適した宿主であり、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞培養におけるその
ような細胞の増殖は常法になっている(Tissue Culture、Academi
c Press、KruseおよびPatterson編(1973))。有用な宿主細
胞株の例は、VEROおよびHeL細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株
、ならびにWI138、HEK 293、BHK、COS-7、CVおよびMDCK細胞
株である。そのような細胞に対する発現ベクターは、通常、(必要な場合には)複製起点
、発現されるFVIIIタンパク質をコードするヌクレオチド配列から上流に位置し、リ
ボソーム結合部位と共に該配列と作動可能に結合されるプロモーター、RNAスプライス
部位(イントロン含有ゲノムDNAが使用される場合)、ポリアデニル化部位および転写
終結配列を含む。一実施形態では、発現は、その全体が参照により本明細書に援用される
米国特許第5,888,809号の発現系を使用して、チャイニーズハムスター卵巣(C
HO)細胞で実行することができる。
、ウイルス供給源により提供されることが多い。非限定例として、ポリオーマ、アデノウ
イルス2およびサルウイルス40(SV40)に由来するプロモーターが挙げられる。例
えば、米国特許第4,599,308号を参照。
ス、VSVまたはBPV)供給源に由来し得るような外因性起点を含むベクターの構築に
よりもたらされ得、または宿主細胞染色体複製機構によりもたらされ得る。ベクターが宿
主細胞染色体に組み込まれる場合、後者で十分であることが多い。
Iタンパク質をコードする核酸分子で同時形質転換する方法により哺乳動物細胞を形質転
換することができる。適切な選択マーカーの非限定例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHF
R)またはチミジンキナーゼである。この方法は、その全体が参照により本明細書に援用
される米国特許第4,399,216号にさらに記載されている。
の方法として、Gething他、Nature 293:620(1981);Man
tei他、Nature 281:40;ならびにLevinson他、EPO出願第1
17,060A号およびEPO出願第117,058A号に記載されているものが挙げら
れ、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される。
等の宿主細胞およびバキュロウイルス発現ベクター(例えば、オートグラファ・カリフォ
ルニカ(Autographa californica)MNPV、イラクサギンウワ
バ(Trichoplusia ni)MNPV、ラキプルシア・オウ(Rachipl
usia ou)MNPV、またはガレリア・オウ(Galleria ou)MNPV
)に由来するベクター)等の発現ベクターが、Smith他の米国特許第4,745,0
51号および米国特許第4,879,236号に記載されているように、本発明を実行す
るのに用いられてもよい。一般に、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリへドリン転写
開始シグナルからATG開始部位わたる位置で、およびバキュロウイルスポリへドリンプ
ロモーターの転写制御下でポリへドリン遺伝子に挿入される、発現されるヌクレオチド配
列を含有するバキュロウイルスゲノムを含む。
(Escherichia coli)(E.coli)または桿菌が挙げられる。高等
真核細胞として、本明細書に記載した哺乳動物起源の確立された細胞株が挙げられる。例
示的な細菌宿主細胞は、大腸菌W3110(ATCC27,325)、大腸菌B、大腸菌
X1776(ATCC31,537)および大腸菌294(ATCC31,446)であ
る。幅広い適切な原核生物および微生物ベクターが利用可能である。大腸菌は、典型的に
はpBR322を使用して形質転換される。組換え微生物発現ベクターにおいて最も一般
的に使用されるプロモーターとして、ベータラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラク
トースプロモーター系(Chang他、Nature 275:615(1978);お
よびGoeddel他、Nature 281:544(1979))、トリプトファン
(trp)プロモーター系(Goeddel他Nucleic Acids Res.8
:4057(1980)およびEPO出願公開第36,776号)ならびにtacプロモ
ーター(De Boer他Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21
(1983))が挙げられる。プロモーターおよびシャイン-ダルガノ配列(原核生物宿
主発現のための)は、FVIIIタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結される。
すなわち、これらは、DNAからのFVIIIメッセンジャーRNAの転写を促進するよ
うに配置される。
(例えば米国特許第4,745,057号を参照)。出芽酵母(Saccharomyc
es cerevisiae)は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されるが
、多くのその他の株が一般的に利用可能である。酵母ベクターは、2ミクロン酵母プラス
ミド由来の複製起点または自己複製配列(ARS)、プロモーター、FVIIIタンパク
質をコードする核酸、ポリアデニル化および転写終結のための配列、ならびに選択遺伝子
を含有し得る。例示的なプラスミドはYRp7である(Stinchcomb他、Nat
ure 282:39(1979);Kingsman他、Gene 7:141(19
79);Tschemper他、Gene 10:157(1980))。酵母ベクター
における適切なプロモーター配列(promoting sequence)として、メ
タロチオネイン、3-ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーターが挙げられる(
Hitzeman他、J.Biol.Chem.255:2073(1980)またはそ
の他の解糖酵素(Hess他、J.Adv.Enzyme Reg.7:149(196
8);およびHolland他、Biochemistry 17:4900(1978
))。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、R. Hitzema
n他、EPO公開番号第73,657号にさらに記載されている。
、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、モルモット、オポッサム、カモノハシおよびヒトを含む任
意の種の起源のFVIIIをコードし得るが、好ましくはヒト起源のFVIIIタンパク
質をコードする。本明細書に開示したタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズでき
るFVIIIをコードする核酸も包含される。そのような配列のハイブリダイゼーション
は、標準的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、本明細書に開示し
たFVIIIタンパク質をコードする核酸に対して、低下したストリンジェンシー条件ま
たはストリンジェントな条件(例えば、0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリ
ウム、0.1%SDS、60℃または70℃の洗浄ストリンジェンシーにより代表される
ストリンジェントな条件)下で実行することができる。例えば、Sambrook他、M
olecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版
、1989)Cold Spring Harbor Laboratoryを参照)。
において発現することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米
国特許第6,344,596号を参照。手短かに言うと、遺伝子導入動物として、家畜(
例えば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等)、齧歯類(マウス、ラットおよび
モルモットなど)および飼育動物(例えばネコおよびイヌ)が挙げられ得るがこれらに限
定されない。ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシ等の家畜動物が、いくつかの実施形態では特
に好ましい。
定的に組み込まれ、通常のメンデルの様式で遺伝されるような方法で、本発明のヒトFV
IIIタンパク質をコードする適切なポリヌクレオチドを単一細胞胚に導入することによ
り産生される。本発明の遺伝子導入動物は、体液および/または組織でFVIIIタンパ
ク質を産生する表現型を有する。FVIIIタンパク質は、これらの体液および/または
組織から取り除かれ、例えば治療用途のために処理される。(その内容全体が参照により
本明細書に援用される、例えば、Clark他、“Expression of hum
an anti-hemophilic factor IX in the milk
of transgenic sheep”Bio/Technology 7:48
7-492(1989);Van Cott他、“Haemophilic facto
rs produced by transgenic livestock:abun
dance can enable alternative therapies w
orldwide”Haemophilia 10(4):70-77(2004)を参
照)。
合、または全能性もしくは多能性幹細胞のレトロウイルス感染を含むがこれらに限定され
ない様々な手段により、胚に導入することができる。形質転換細胞は、次いで胚導入され
、その中に組み込まれて遺伝子導入動物を形成することができる。遺伝子導入動物を作製
する方法は、例えば、Transgenic Animal Generation a
nd Use by L.M.Houdebine,Harwood Academic
Press,1997に記載されている。遺伝子導入動物はまた、例えばCampbe
ll他、Nature 380:64-66(1996)およびWilmut他、Nat
ure 385:810-813(1997)に記載されているように核移植または胚細
胞株もしくは成体細胞株を使用するクローニングの方法を使用して生成することもできる
。さらに、DNAの細胞質注射を利用する技法が米国特許第5,523,222号に記載
されているように使用されてもよい。
ることにより得ることができる。遺伝子導入動物を得るための方法は公知である。例えば
、Hogan他、MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO(Co
ld Spring Harbor Press 1986);Krimpenfort
他、Bio/Technology 9:88(1991);Palmiter他、Ce
ll 41:343(1985)、Kraemer他、GENETIC MANIPUL
ATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO(Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1985);Ha
mmer他、Nature 315:680(1985);Wagner他、米国特許第
5,175,385号;Krimpenfort他、米国特許第5,175,384号、
Janne他、Ann.Med.24:273(1992)、Brem他、Chim.O
ggi.11:21(1993)、Clark他、米国特許第5,476,995を参照
。全てはその全体が参照により本明細書に援用される。
、乳汁が合成される生理学的条件下、プロモーターがその他の組織より乳腺組織で活性と
なる乳腺組織で「活性」となる。そのようなプロモーターとして、乳清酸性タンパク質(
WAP)、短いおよび長いα、βおよびκカゼイン、α-ラクトアルブミンおよびβ-ラ
クトグロブリン(「BLG」)プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。発現
されたタンパク質のその他の体液、特に血液および尿への分泌を指示するシグナル配列も
、本発明に従って使用することができる。そのような配列の例として、FVIII、タン
パク質Cおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子のシグナルペプチドを含む、分泌凝固
因子のシグナルペプチドが挙げられる。
ライスシグナル、転写終結シグナル、ポリアデニル化部位、緩衝配列、RNAプロセシン
グ配列および導入遺伝子発現を調節するその他の配列である。
オチド配列の下流の3’非翻訳領域を含む。この領域は、導入遺伝子の発現を増加させる
ことができる。この点で有用な3’非翻訳領域は、ポリAシグナルをもたらす配列である
。
領域、または当分野で公知のその他の3’非翻訳配列に由来し得る。リボソーム結合部位
もFVIIIの発現の効率性を高めるのに重要である。同様に、FVIIIの翻訳後修飾
を調節する配列は、本発明において有用である。
施例は例示目的のみで本明細書に記載されており、本発明を限定すること意図するもので
はない。
肝臓特異的合成プロモーター
本発明者らは、保存された基本プロモーターエレメントおよび転写開始部位を含有する
いくつかの人工プロモーターを設計し、完全合成した。基本プロモーターは、その5’末
端で肝臓特異的発現のためのいくつかの肝臓特異的転写因子結合部位と連結される。LX
P3.3と名付けたプロモーター(図1)(配列番号1)を、ヒト肝臓癌細胞株Huh7
においてルシフェラーゼレポーター遺伝子およびトランスフェクション実験を用いてイン
ビトロで最初にスクリーニングされたその小さいサイズ(200bp)および高い活性に
より選択する。
るAAV9ベクターにパッケージングされたLacZレポーター遺伝子を用いてさらに試
験した。並行して、インビボ実験を行ってプロモーター活性および肝臓特異性を、小型お
よび大型動物モデルにおいて最も強力な肝臓特異的プロモーターのうちの1つとして以前
に報告された強力な肝臓特異的プロモーターチロキシン結合グロブリン(TBG)と比較
した。LXP3.3-LacZまたはTBG-LacZ発現カセットを含有するAAV9
ベクターを、2種類の異なる用量でC56/B6マウスに尾静脈を介して注射した。図2
Aに示すように、肝臓および心臓のX-gal染色は、両方のプロモーターについて強い
肝臓発現、および心臓発現の欠如を示した。組織ホモジネートの定量分析は、これらの2
種類のプロモーターが、肝臓(図2B)に対してほとんど同一のLacZ発現レベルおよ
び組織特異性を達成したが、LXP3.3プロモーターはサイズがわずか200bpであ
り、一方TBGは681bpであったことを示した。具体的には、定量的LacZ酵素活
性分析は、肝臓における遺伝子発現が、LXP3.3およびTBGプロモーターに関して
心臓より300倍超高いことを示した。さらに、肝臓特異的プロモーターにより得られる
LacZ酵素活性は、ユビキタスCMVプロモーターにより得られる活性より肝臓で50
0倍高かった(図2C)。一方、CMVプロモーターは、肝臓特異的プロモーターのほぼ
13倍高いLacZ発現を心臓で達成した(図2B)。結果は、合成プロモーターLXP
3.3が肝臓において高度に活性であり、特異的であることを示した。
合成プロモーターイントロンカセット
完全合成プロモーターLXP3.3をその3’末端で、短い非天然エクソンジャンクシ
ョン配列を有するVH4の小さいイントロンに連結させた。このイントロンは、BDDヒ
トFVIII遺伝子を駆動する弱いプロモーターを使用したインビトロでのトランスフェ
クション実験により、最初に試験した。VH4イントロンの追加は、イントロンのないプ
ロモーターよりはるかに高い遺伝子発現を生じさせ、また、一般的に使用されるキメライ
ントロンCIN(Promega)より高い発現も生じさせた(図3)。結果的に、本発
明者らは、LXP3.3プロモーターおよびVH4イントロンを人工エクソンジャンクシ
ョン配列と組み合わせ、これをLXP3.3Iと名付けた(配列番号2)。FVIII発
現の駆動におけるその活性を試験するために、本発明者らはプロモーターLXP3.3I
を、完全合成ヒトBDD欠失FVIII遺伝子(配列番号3)とこれに続く小さいポリア
デニル化部位の上流に挿入した。遺伝子発現カセット(配列番号4)全体を、その後、ベ
クターDNA複製およびベクターゲノムパッケージングのために、2つのAAV逆方向末
端反復配列を有するAAVベクタープラスミド骨格にクローニングした(図4)。
わせであるSV40イントロンに連結したユビキタスCMVプロモーターを使用して、F
VIII発現カセット中のLXP3.3Iを置換した。プラスミドをヒト肝臓癌細胞株H
uh7にトランスフェクション後、FVIII活性を発色キットを用いて測定した。図5
のトランスフェクション実験に示すように、LXP3.3IはCMVプロモーターより高
いFVIII活性を細胞培養培地で生じさせた。さらに、本発明者らはまた、トランスフ
ェクション実験において完全合成ヒトBDD欠失FVIII遺伝子を天然ヒトDNA配列
のBDD FVIII遺伝子と比較した。同じLXP3.3Iにより駆動される場合、同
じFVIIIアミノ酸配列をコードするが異なる選択のコドンを使用した2つの遺伝子は
、ヒト細胞においてFVIII活性の有意な差を示さなかった(図6)。しかしながら、
異なる肝臓特異的プロモーターを使用した場合、天然コドンを有するBDDFVIII遺
伝子は、LXP3.3Iにより駆動される同じ遺伝子と比較するとより低い発現を示し、
これは主に、より高い遺伝子発現をもたらすLXP3.3Iプロモーターによるものであ
ることを示唆した。
モデルにおいてインビボでの遺伝子発現活性を試験した。LXP3.3I-hF8遺伝子
発現カセットをAAV9カプシドにパッケージングし、FVIII KOマウスの尾静脈
に注射した。2種類の異なる用量のベクターを使用して(マウス1匹当たり2×1011
および4×1010ベクターゲノム)インビボでの発現を調べた。図7Aに示すように、
高レベルおよび長期の遺伝子発現は、ベクター投与後、これらの2種類の用量で1年を超
えて達成された。FVIII活性に関する発色アッセイに加えて、ELISAアッセイも
使用して血漿に分泌されるFVIIIタンパク質の量を調べた(図7B)。結果は、完全
長野生型ヒトFVIIIタンパク質の参照標準と比べて、BDD FVIIIタンパク質
濃度は、同じ完全長ヒトFVIIIに対するFVIII活性の発色アッセイにより得られ
た読み取りデータより約50%低いことを示した。FVIII活性読み取りデータより低
いELISA読み取りデータというこの食い違いは、野生型FVIIIのほぼ半分の長さ
を含む、BDD FVIIIにおける長いBドメインの欠如による可能性が高い。ELI
SAキットは、Bドメインを含む野生型完全長FVIIIに対してポリクローナル抗体を
使用したため、Bドメインを欠くBDD FVIIIは抗体結合部位がより少なく、した
がってELISA読み取りデータがより低かったことが予想される。これらの結果は、発
色アッセイおよびELISAアッセイは両方とも、血友病AマウスにおけるFVIII発
現の一致した測定値を生成したことを示した。部分トロンボプラスチン時間(PTT)ア
ッセイも数時点で行った。結果は、他の2つのアッセイの結果と概ね一致した。
第VIII因子重鎖変異
以前の文献は、FVIIIの重鎖が限定因子であることを示した。重鎖は、軽鎖よりプ
ロセシングの有効性がはるかに低くおよび/またははるかに不安定であり、その正確な機
構ははっきりしないままである。例えば、重鎖および軽鎖遺伝子を2つの別個のベクター
から別々に発現させた場合、凝固活性のために同様のタンパク質濃度を得るには、軽鎖遺
伝子より重鎖遺伝子のはるかに高いコピー数を必要とした。結果的に、本発明者らは、C
末端領域に変異を導入することにより、具体的には新たな糖鎖付加部位を導入することに
より、FVIII重鎖翻訳後プロセシング効率性を高めることにした。その理由は、糖鎖
付加は、翻訳後プロセシングにおける役割および細胞膜結合および分泌タンパク質の安定
性が公知であるためである。本発明者らは、糖鎖付加を重鎖のC末端に導入することを選
択した。その論理的根拠は、この末端領域が、BDD FVIIIタンパク質のX線結晶
構造分析により示されたように不定形であることから、したがって明確な構造がない柔軟
な領域であることであった。そのため、その領域の変異はFVIIIタンパク質の機能構
造を妨げない可能性が高い。その論理的根拠により、本発明者らは734位および735
位の2個の天然アスパラギンを利用し、隣接するアミノ酸736および737をトレオニ
ンに変異させた(NNAIからNNTT)。変異はアミノ酸配列の変化を最小化し、糖鎖
付加の程度を最大化し、X0と名付けた変異体FVIIIに2つの新規の糖鎖付加部位(
NNTおよびNTT)をもたらした(図8)。
ノ酸738~742のペプチド(EPRSF)を、アミノ酸237から242から単離し
た天然糖鎖付加配列(YVNRSL)により置換することによって、NNTT部位のすぐ
隣りに別の糖鎖付加部位を追加した。この天然糖鎖付加部位(NRS)は、重鎖において
最も効果的に糖鎖付加される部位のうちの1つであることから選択され(Medzihr
adszky他、Anal.Chem.69:3986(1997))、X1と名付けた
変異体FVIIIが生成された(図8)。
し、変異体X2において2つ多い糖鎖付加部位をもたらした(図8)。
第VIII因子重鎖のC末端の変異はインビトロでのFVIII活性を高めた
本発明者らは次に、変異体構築物のFVIII活性をその野生型BDD FVIII対
応物と対照比較した。プラスミドのトランスフェクションは、内因性FVIII発現はな
いが肝臓特異的プロモーター対照遺伝子発現に適したヒト肝臓癌細胞株Huh7で実行し
た。図9Aに示すように、変異X1およびX2は、その親遺伝子と比べてインビトロでの
FVIII活性を2倍超にした。
血友病Aマウスモデルにおけるインビボでの変異体FVIIIの長期および高レベルの遺
伝子発現
FVIII変異体X1およびX2が、インビトロでのトランスフェクション実験で有意
に高いFVIII活性を示したことから、本発明者らは次に、FVIII KOマウスに
おいてインビボでの遺伝子発現およびFVIII活性を調べた。X1およびX2遺伝子は
、同じLXP3.3Iプロモーターの転写制御下にあり、AAV8ベクター粒子にパッケ
ージングされた。初期の実験に基づき、5×1010v.g./マウスの標準的なベクタ
ー用量を選択し、2から3カ月齢の血友病Aマウスの尾静脈を介して静脈内に注射した。
血漿試料を、一般的に使用される方法である後眼窩出血法により採取した。図9Bに示す
ように、変異体X1およびX2は両方とも、それらの野生型親BDD FVIII遺伝子
より高い発現を達成した(図7A、低用量と比べて)。長期の遺伝子発現をモニターする
ために、本発明者らは、X1またはX2変異体のいずれかで処置した血友病Aマウスを観
察用に24週間維持した。親wt BDD FVIIIベクターで処置した血友病Aマウ
ス(図7A)と同様に、変異体FVIIIベクターで処置したマウスも、血漿中のヒトF
VIII活性を著しく低下させることなく長期のおよび安定した遺伝子発現を示した。様
々な時点でのインヒビター試験は、インヒビター形成がないことを明らかにした。
を当業者は理解する。したがって、本発明の形態は例示のみであり、本発明の範囲を限定
することを意図するものではないことが明確に理解すべきである
商標)データベース受託番号により同定された配列およびその他の参照は、参照が提示さ
れた文および/または段落に関する教示のために、その全体が参照により援用される。
出願時の特許請求の範囲は、以下の通り。
[請求項1]
肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが、配列番号1のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも90%同一の配列を含む、ポリヌクレオチド。
[請求項2]
前記プロモーターがイントロンに作動可能に連結している、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
[請求項3]
前記イントロンがVH4由来である、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
[請求項4]
前記プロモーターおよび前記イントロンが一緒に、配列番号2のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも90%同一の配列を構成する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
[請求項5]
前記プロモーターが目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結している、請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
[請求項6]
前記目的のポリヌクレオチドがポリペプチドまたは機能性核酸をコードする、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
[請求項7]
前記目的のポリヌクレオチドが凝固因子をコードする、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
[請求項8]
前記目的のポリヌクレオチドが第VIII因子をコードする、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
[請求項9]
前記目的のポリヌクレオチドがBドメイン欠失第VIII因子をコードする、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
[請求項10]
前記目的のポリヌクレオチドが、配列番号3のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも90%同一の配列を含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
[請求項11]
配列番号4のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも90%同一の配列を含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
[請求項12]
前記目的のポリヌクレオチドの下流にポリアデニル化部位をさらに含む、請求項1から11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
[請求項13]
請求項1から12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[請求項14]
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項13に記載のベクター。
[請求項15]
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項14に記載のベクター。
[請求項16]
前記AAVベクターがAAV8またはAAV9ベクターである、請求項15に記載のベクター。
[請求項17]
請求項1から12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項13から16のいずれか1項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
[請求項18]
請求項1から12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項13から16のいずれか1項に記載のベクターおよび/または請求項17の形質転換細胞を含む遺伝子導入動物。
[請求項19]
対象の肝臓で前記ポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、請求項6から12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項13から16のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項17の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法。
[請求項20]
対象における血友病Aまたは後天性第VIII因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、請求項8から12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項13から16のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項17の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における血友病Aを処置することを含む方法。
[請求項21]
対象における前記第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、請求項8から12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項13から16のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項17の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法。
[請求項22]
重鎖のアミノ酸残基が1つまたは複数の糖鎖付加部位を作製するために改変された、改変哺乳動物第VIII因子ポリペプチド。
[請求項23]
前記1つまたは複数の糖鎖付加部位が重鎖のC末端にある、請求項22に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
[請求項24]
ヒト第VIII因子ポリペプチドである、請求項22または23に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
[請求項25]
野生型ヒト配列(配列番号5)のアミノ酸残基736および737がアミノ酸残基XX(XはSまたはTである)により置換されている、請求項24に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
[請求項26]
野生型ヒト配列(配列番号5)のアミノ酸残736から742が、アミノ酸残基XXYVNRXL(XはSまたはTである)により置換されている、請求項24に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
[請求項27]
野生型ヒト配列(配列番号5)のアミノ酸残基736から740が、アミノ酸残基XXNNX(XはSまたはTである)により置換されている、請求項24に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
[請求項28]
Bドメイン欠失をさらに含む、請求項22から27のいずれか1項に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
[請求項29]
請求項22から28のいずれか1項に記載の改変第VIII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[請求項30]
プロモーターに作動可能に連結している、請求項29に記載のポリヌクレオチド。
[請求項31]
前記プロモーターが請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項30に記載のポリヌクレオチド。
[請求項32]
請求項29から31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[請求項33]
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項32に記載のベクター。
[請求項34]
前記ベクターがAAVベクターである、請求項33に記載のベクター。
[請求項35]
前記AAVベクターがAAV8またはAAV9ベクターである、請求項34に記載のベクター。
[請求項36]
請求項29から31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項32から35のいずれか1項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
[請求項37]
請求項29から31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項32から35のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項36に記載の形質転換細胞を含む遺伝子導入動物。
[請求項38]
対象の肝臓で第VIII因子を産生する方法であって、請求項29から31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項32から35のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項36に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象の肝臓で第VIII因子を産生することを含む方法。
[請求項39]
対象における血友病Aまたは後天性第VIII因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、請求項22から28のいずれか1項に記載の改変ヒト第VIII因子ポリペプチド、請求項29から31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項32から35のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項36に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における血友病Aを処置することを含む方法。
[請求項40]
対象における前記第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、請求項29から31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項32から35のいずれか1項に記載のベクターおよび/または請求項36に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法。
配列番号1 LXP3.3プロモーター-200bp
配列番号2 (LXP3.3プロモーターおよびVH4イントロンを含有するLXP3.
3I-288bp
配列番号3 合成ヒトBドメイン欠失第FVIII因子コード配列-4374bp
配列番号4 AAVベクター中のヒト第FVIII因子遺伝子発現カセット、左逆方向反
復から右逆方向末端反復-5045bp
配列番号5 シグナルペプチドがないヒト第FVIII因子野生型タンパク質配列-23
33aa
Claims (16)
- 重鎖のアミノ酸残基が、当該重鎖のC末端の最後の50アミノ酸残基内にある1つまたは複数の糖鎖付加部位を作製するために改変され、Bドメインが欠失した、ヒト第VIII因子ポリペプチドである、改変哺乳動物第VIII因子ポリペプチド。
- 野生型ヒト配列(配列番号5)のアミノ酸残基736および737がアミノ酸残基XX(XはSまたはTである)により置換されている、請求項1に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
- 野生型ヒト配列(配列番号5)のアミノ酸残基736から742が、アミノ酸残基XXYVNRXL(XはSまたはTである)により置換されている、請求項1に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
- 野生型ヒト配列(配列番号5)のアミノ酸残基736から740が、アミノ酸残基XXNNX(XはSまたはTである)により置換されている、請求項1に記載の改変第VIII因子ポリペプチド。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載の改変第VIII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- プロモーターに作動可能に連結している、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターが、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが、配列番号1のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも90%同一の配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項5から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項8に記載のベクター。
- 前記ベクターがAAVベクターである、請求項9に記載のベクター。
- 前記AAVベクターがAAV8またはAAV9ベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 請求項5から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項8から11のいずれか1項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
- 請求項5から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項8から11のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項12に記載の形質転換細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物。
- 請求項5から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項8から11のいずれか1項に記載のベクター、または請求項12に記載の形質転換細胞であって、当該ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞を対象に送達し、これにより前記対象の肝臓で第VIII因子を産生することを含む、対象の肝臓で第VIII因子を産生する方法における使用のための、ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載の改変ヒト第VIII因子ポリペプチド、請求項5から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項8から11のいずれか1項に記載のベクター、または請求項12に記載の形質転換細胞であって、当該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞を対象に送達し、これにより前記対象における血友病Aを処置することを含む、対象における血友病Aまたは後天性第VIII因子欠乏症を処置する方法における使用のためのポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞。
- 請求項5から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項8から11のいずれか1項に記載のベクター、または請求項12に記載の形質転換細胞であって、当該ポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞を対象に送達し、これにより前記対象における第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む、対象における前記第VIII因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法における使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または形質転換細胞。
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