JP2003511082A - 第ｖｉｉｉ因子をコードするアデノ随伴ウィルスベクターとその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、第VIII因子（factor VIII）をコードする異種ヌクレオチド配列を含有する組み換えアデノ随伴ウィルス(rAAV)ベクターを提供する。好ましくは、第VIII因子はＢドメイン欠失第VIII因子である。本発明のrAAV/第VIII因子ベクターの高力価ストックを作製する方法も提供される。本発明の別の態様は、好ましくは、被検者にその後に投与するために、第VIII因子をコードするヌクレオチド配列を細胞に送達する方法である。本発明は、例えば、血友病を治療するために、rAAV/factor VIIIを被検者に投与する方法をさらに提供する。rAAVベクターはいかなる経路でも投与することができるが、好ましくは、肝臓に投与される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［技術分野］ 本発明は、第VIII因子を提供する試薬および方法に関し、さらに詳細には、第
VIII因子を提供するウィルス試薬および方法に関する。

【０００２】 ［背景技術］ 血友病Aは、第VIII凝固因子（第VIII因子）の欠陥によって生ずる遺伝性の伴
性出血性疾患である。血友病Aは血友病患者の大半（80％）を占め、発現頻度は5
〜10,000例の男児出産例に対して1例の割合である(Antonarakis et al(1998) Ha
emophilia 4:1)。血友病患者は、大型の関節、軟組織での特発出血を生じ、頭蓋
内出血の危険がある。特に、重症の罹患患者では、関節出血の反復して起こる発
作は、重大な関節症に至る、この疾患の最もよく見られる兆候である。

【０００３】 遺伝子治療は、血友病A患者を治療する魅力的な方法の1つである。ヒト第VIII
因子の永続的な発現は、治療レベルより低いレベル（正常の5％にほぼ等しいか
またはそれ以上）であっても血友病A患者の治療に顕著な影響を与えると思われ
る。レトロウィルスベクターおよびアデノウィルスベクターは第VIII因子cDNAを
送達するために使用されている（Dwarki et al. (1995) Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 92: 1023; Connelly et al. (1998) Blood 91: 3273; Connelly et al. (1
996) Blood 87: 4671）。モロニーマウス白血病ウィルス（MoMLv）両種指向性(a
mphotropic)ベクターは、分裂後細胞の形質導入が不良である（Dwarki et al. (
1995)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 1023）。肝臓に向かうヒト第VIII因子cDN
Aを搬送するアデノウィルスは動物モデルにおいて高レベルの第VIII因子を発現
する。しかし、発現は、よく調べられている、そのベクターに対する細胞性免疫
応答により経時的に弱くなる（Connelly et al. (1996)Blood 87: 4671; Connel
ly et al. (1996)Blood 88: 3846）。このような免疫応答は患者に重篤な結果を
もたらすことがある。免疫応答により炎症、細胞死が生じ、患者が死亡すること
もある。

【０００４】 アデノ随伴ウィルスは、広範囲の分裂細胞または分裂終了細胞に感染すること
ができる非病原性欠陥パルボウィルスである(Rabinowitz et al.(1998) Current
Opinion in Biotechnology 9: 470)。rAAVは、第VIII因子およびFIXが合成され
る（Wion et al.(1985)Nature 317:726; Zelechowska et al. (1985) Nature 31
7: 729)大型の動物モデルにおいて機能的FIX遺伝子を永続的に発現することがで
きることが示されている（Snyder et al.(1999) Nature Medicine 6: 64)。

【０００５】 rAAVベクターの欠点はパッケージング能力が小さいことである（Dong et al.(
1996)Human Gene Therapy, 7: 2101)。野生型(wt)AAVは4.6 kbの鎖状1本鎖DNAウ
ィルスである。AAVベクターの総サイズが、AAVビリオンへのパッケージング効率
に影響を与える。Dongらは、ウィルス粒子のDNA含有量を定量し、AAVビリオンが
CAT遺伝子をHeLa細胞に導入する効率をアッセイすることによって、AAVベクター
のパッケージング効率を求めた。Dongらが求めた効率的なパッケージングには、
トランスジーンを含有し、発現する粒子が含まれる。その結果は、AAVのパッケ
ージング効率はゲノムの長さに影響されることを証明している。

【０００６】 ヒト第VIII因子遺伝子は、中心のＢドメインコアと、これに隣接するアミノA1
およびA2ドメインとカルボキシルA3、C1およびC2ドメインを含有する。Ｂドメイ
ンは、特定の前凝固活性にいかなる重要な影響も与えずに、欠損できる(Pittman
et al.(1993)Blood 81: 2925)。しかし、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子cDNA（
Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子）でも、その4.4 kbのサイズではrAAVベクターの
限られた領域内への効率的なパッケージングができないと考えられるので（Kay
and High(1999)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 9973)、rAAVでの試験に適する
とは考えられない（Pittman et al. (1993)Blood 81: 2925)。このように、高力
価AAV Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子ベクターの作製は非常に困難であると思わ
れる（Kay and Russell(1999)Blood 94:864)。

【０００７】 血友病Aを治療する体細胞遺伝子治療は、第VIII因子遺伝子の発現に付随する
困難さによってさらに複雑となっている。永続的なヒト第VIII因子発現は、ヒト
第VIII因子遺伝子の転写効率の不良（Connelly et al.(1996)Blood 91: 3846; R
abinowitz et al(1998)Current Opinion in Biotechnology 9:470）や、第VIII
因子タンパク質の分泌効率の悪さ（Snyder et al.(1999) Nature Medicine 5: 6
4; Wion et al. (1985)Nature 317: 726)および第VIII因子タンパク質の比較的
短い半減期（t_1/2〜12時間;Wion et al.(1985)Nature 317: 726; Zelechowska e
t al.(1985)Nature 317: 729)により妨害されることが証明されている。

【０００８】 従って、血友病Aを治療する試薬および方法の改良の必要性が当該技術上にお
いて存在する。

【０００９】 ［発明の概要］ 被検者において生物学的に活性な第VIII因子タンパク質（第VIII因子）を発現
する組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、被検者の凝固
疾患、特に血友病Aを治療する際に有用である。本発明の組成物は、少なくとも1
つのエンハンサーと少なくとも1つのプロモーターとが作動可能に結合したＢド
メイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列を含有する組み換えAAV（r
AAV）ベクターを含有する。ある実施態様では、AAV ITRは、ITRがＢドメイン欠
失第VIII因子トランスジーンを発現させるように、Ｂドメイン欠失第VIII因子を
コードするヌクレオチド配列に作動可能に結合する。ベクターはまた、転写因子
結合部位またはターミネーション領域あるいはそれらの両方を含有してもよい。
必要に応じて、スペーサーDNAはカセット内に含有されてもよい。本発明のrAAV
ベクターは、インビボにおいて、治療レベルの第VIII因子タンパク質を長期間発
現することができる生物学的に活性なＢドメイン欠失第VIII因子タンパク質をコ
ードする。従って、本発明はrAAVベクターの多数の利点を利用するとともに、AA
Vカプシドのパッケージング能力の低さによって生じる制約を克服している。

【００１０】 本発明の別の態様は、(a)図1の（配列番号１にも示す）ヌクレオチド約419〜4
835と、(b)高度にストリンジェントな条件下において(a)のヌクレオチド配列と
ハイブリダイゼーションし、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチ
ド配列およびと、(c)遺伝コードの縮重により上記(a)および(b)のヌクレオチド
配列と異なり、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列とから
なる群から選択されるＢドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド
配列を含有するrAAVベクターである。

【００１１】 本発明はまた、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列
をインビトロおよびインビボにおいて細胞に送達する方法を提供する。従って、
一実施態様において、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列
を細胞に送達する方法であって、肝臓選択的（liver-preferred)発現制御因子が
作動可能に結合した第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含有するrA
AVベクターを細胞に接触させるステップを含む方法が提供される。接触させるス
テップはインビトロおよびインビボにおいて実施されてもよい。

【００１２】 さらに別の実施態様は、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド
配列を細胞に送達する方法であって、本発明のrAAVベクターを細胞に接触させる
ステップを含む方法である。(a)図1の（配列番号１にも示す）ヌクレオチド約41
9〜4835と、(b)高度にストリンジェントな条件下において(a)のヌクレオチド配
列とハイブリダイゼーションし、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレ
オチド配列と(c)遺伝コードの縮重により上記(a)および(b)のヌクレオチド配列
と異なり、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列とからなる
群から選択されるＢドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列
を含有するrAAVベクター。

【００１３】 よりさらに別の態様では、本発明は、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする
異種ヌクレオチド配列を含む生物学的に有効な量のrAAVベクターを血友病被検者
に投与するステップを含む、血友病Aを治療する方法を提供する。好ましくは、
コードされているＢドメイン欠失第VIII因子は治療的に有効な量が発現される。

【００１４】 さらに別の実施態様において、本発明は、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコード
する異種ヌクレオチド配列を含有する生物学的に有効な量のrAAVを血友病被検者
の肝細胞に投与するステップを含む、血友病を治療する方法を提供する。好まし
くは、コードされているＢドメイン欠失第VIII因子は形質導入された肝細胞によ
って発現され、治療的に有効な量が血中に分泌される。

【００１５】 よりさらに別の実施態様として、本発明は、第VIII因子を発現する細胞を被検
者に投与するステップを含む、第VIII因子を被検者に投与する方法であって、本
発明の組み換えアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを細胞に接触させるステッ
プを含む方法によって細胞が生産されている方法を提供する。

【００１６】 本発明は、(a)第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含有するrAAV
ベクターをパッケージング細胞に感染するステップと、（ｂ）パッケージング細
胞によってrAAVゲノムを複製し、封入するステップと、(c)rAAV粒子を回収してr
AAVストックを形成するステップとを含む、高力価rAAVベクターストックを生産
する方法をさらに提供する。示すように、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードす
る異種ヌクレオチド配列には肝臓選択的（liver-preferred)発現制御因子が作動
可能に結合している。上述の方法によって作製される高力価ウィルスストックも
提供される。

【００１７】 本発明のrAAVベクターを感染することによって、安定な細胞株を生産する方法
も提供される。このような細胞株は、ベクターのトランスフェクション、分泌、
次に個々のコロニーのクローニングを実施することによって作製される。次いで
、ベクターの高レベル複製を示すクローンを感染性ベクターの生産について試験
する。この細胞株はＢドメイン欠失第VIII因子を発現することができる。

【００１８】 本発明の別の態様は、肝炎ウィルス発現制御因子が作動可能に結合した第VIII
因子をコードするヌクレオチド配列である。ある実施態様において、この発現制
御因子はB型肝炎由来であり、肝炎EnhIエンハンサーとEnhIIエンハンサーとから
選択されるエンハンサーの少なくとも1つを含有する。ヌクレオチド配列は、少
なくとも1つのプロモーターとポリアデニル化配列とをさらに含有してもよい。
ある実施態様において、少なくとも1つのプロモーターはAAV ITRである。本発明
はまた、肝炎ウィルス発現制御因子が作動可能に結合した第VIII因子をコードす
るヌクレオチド配列を含有するベクターと、このベクターを含有する宿主細胞と
を含む。

【００１９】 本発明のこれらの態様および他の態様は以下の発明の説明において、より詳細
に提供されている。

【００２０】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、第VIII因子欠損に関連する症状を軽減する組成物と方法とを提供す
る。組成物は、少なくとも1つのエンハンサーと少なくとも1つのプロモーターと
が作動可能に結合したＢドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列
を含有するrAAVベクターを含有する。ある実施態様において、本発明のベクター
は、肝臓選択的（liver-preferred)発現制御因子を含有する。スペーサーDNAお
よび3'側ターミネーション領域がカセット内に含有されてもよい。

【００２１】 本発明を任意の作用機序に結び付けるのではないが、好ましい実施態様におい
て、ITR領域またはAAV内の領域は第VIII因子ヌクレオチド配列を発現させるプロ
モーターとして働くと考えられている。すなわち、AAVゲノムの両端に見られる
逆方向反復塩基配列(ITRs)の少なくとも1つは、Ｂドメイン欠失第VIII因子配列
を発現させるために使用される。例えば、引用することにより本発明の一部をな
すものとする米国特許第5,866,696号参照。

【００２２】 以下の定義は、本明細書および添付の請求の範囲に記載する本発明を理解する
ために使用されるように提供されている。

【００２３】 「発現制御因子」は、その発現制御因子が機能させられる宿主細胞において、
作動可能に結合したポリヌクレオチドの転写を増加させるポリヌクレオチド配列
、好ましくは、DNA配列である。発現制御因子はエンハンサー、プロモーターお
よび/または転写因子結合部位を含有してもよい。肝臓選択的（liver-preferred
)転写調節因子は、肝臓以外の細胞と比較したとき、肝臓細胞において作動可能
に結合したポリヌクレオチド配列の転写を増加する発現制御因子である。

【００２４】 「第VIII因子関連疾患」は、不十分なレベルの第VIII因子に関連する、それに
よって生じるおよび/またはそれに応答して生ずるような疾患または疾病である
。このような疾患には、血友病Aが含まれるが、それに限定されない。

【００２５】 「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の
長さのアミノ酸のポリマーを言うために本明細書において使用され、交換可能で
ある。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化
または標識化合物との接合のように修飾されたアミノ酸ポリマーも含む。

【００２６】 本明細書において使用され、交換可能である「ポリヌクレオチド」、「ヌクレ
オチド配列」および「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくは
リボヌクレオチドまたはそれらの類似体を含む、任意の長さのポリマー形態のヌ
クレオチドを言う。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオ
チド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分が構造
の間に入ってもよい。ヌクレオチド構造の修飾が存在する場合には、ポリマー形
成の前または後に修飾が起きてもよい。本明細書において使用される「ポリヌク
レオチド」という用語は、2本鎖および1本鎖分子をいい、交換可能である。特に
明記しない限りまたは必要でない限り、ポリヌクレオチドと本明細書において記
載する本発明の任意の実施態様は、2本鎖形態および2本鎖形態を形成することが
既知または予測される2つの相補的な1本鎖形態の各々を含む。

【００２７】 「AAV」はアデノ随伴ウィルスの略語であり、そのウィルス自体またはその誘
導体を言うために使用することができる。この用語は、そうでないことが必要で
ある場合を除いて、全てのサブタイプ並びに天然型および組み換え型を含む。「
AAV」は野生型および組み換え型（rAAV）のアデノ随伴ウィルスを言い、突然変
異型のAAVを含む。AAVという用語にはさらに、AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型、AAV
4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAVおよ
びヒツジAAVが含まれるが、それらに限定されない（例えば、Fields et al., Vo
lume 2, Chapter 69(3d ed., Lippincott-Raven Publishers参照)。好ましい実
施態様において、現在の本発明で使われているＡＡＶはＡＡＶ２型である。

【００２８】 「アデノ随伴ウィルス逆方向反復塩基配列」または「AAV ITRs」は、AAVゲノ
ムの両端に見られるパリンドローム領域を意味する。ITRｓは、ウィルスのDNA複
製起点として、並びにパッケージングシグナルとしてcis型で一体として機能す
る。本発明で使用するには、隣接するAAV ITRsは、エンハンサーおよび、必要に
応じてスペーサーDNAまたはプロモーター因子が、作動可能に結合したＢドメイ
ン欠失第VIII因子コード配列を含むカセットの5'側および3'側に位置づけられる
。ある実施態様において、AAV ITRは、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする
ヌクレオチド配列を発現させるように、この配列に作動可能に結合する。

【００２９】 AAV ITR領域のヌクレオチド配列は既知である。AAV-2配列は、例えば、Kotin,
R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Bems, "Parvoviridae and The
ir Replication", in Fundamental Virology, 2nd ed.(ed. Fields and Knipe)
参照。本明細書において使用する「AAV ITR」は、示されている野生型ヌクレオ
チド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換
によって変更されてもよい。また、AAV ITRは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、A
AV-5、AAV-6、AAV-7等を含むが、これらに限定されない、いくつかのAAV血清型
のいずれかに由来してもよい。意図されるように機能する限り、すなわち、rep
遺伝子が（同じベクターまたは異なるベクターに）存在する場合またはRep発現
産物が標的細胞中に存在する場合に、関連する異種配列を標的細胞のゲノムに導
入することができる限り、第VIII因子コード配列を含有する選択した異種ヌクレ
オチド配列に隣接する5'側および3'側ITRsは、必ずしも同じである必要はなく、
また同じAAV血清型または単離体から誘導される必要はない。最近の証拠は、2つ
のITRsを含有する構成物に通常関連する機能を実施するのに1つのITRで十分であ
り（米国特許第5,478745号）、ITRを1つだけ含有するベクター構築物を本明細書
において記載するパッケージングおよび作製方法と合わせて使用することができ
ることを示唆している。

【００３０】 本発明のrAAVベクターの「生物学的に有効な」量は、標的組織または器官の少
なくとも1つの細胞による、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレ
オチド配列の形質導入および発現を生ずるのに十分である量である。

【００３１】 本明細書において使用する「rAAVベクター」、「rAAVウィルス」または「rAAV
ウィルス粒子」は、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質（好ましくは、野生
型AAVのカプシドタンパク質の全てによる）およびAAVそのものではないポリヌク
レオチド配列（すなわち、AAVと異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞
の遺伝的形質転換にとって興味深い配列を含有する封入化rAAVを含有する。異種
ポリヌクレオチドには、少なくとも1つ、好ましくは2つのAAV逆方向反復塩基配
列(ITRs)が隣接する。

【００３２】 「パッケージング」は、AAV粒子またはrAAV粒子の形成および封入を生ずる一
連の細胞内現象を言う。rAAV粒子の場合には、パッケージングは、トランスジー
ンを含む、rAAV粒子の形成および封入化を言う。

【００３３】 AAV「rep」および「cap」遺伝子は、アデノ随伴ウィルスの複製および封入化
タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をいう。それらは、検討した全て
のAAV血清型に見られ、以下および当技術上記載されている。AAV repおよびcap
は、本明細書において、AAV「パッケージング遺伝子」と言われる。

【００３４】 AAVの「ヘルパーウィルス」は、AAVの哺乳類細胞における複製およびパッケー
ジングを可能とするウィルスを言う。アデノウィルス、ヘルペスウィルスおよび
ワクシニアなどのポックスウィルスを含む、AAVの種々のヘルパーウィルスが当
技術上既知である。アデノウィルスは数多くの異なるサブグループを含むが、サ
ブグループCのアデノウィルス5型が最も普通に使用される。ヒト起源、ヒト以外
の哺乳類起源およびトリ起源の数多くのアデノウィルスが知られているが、ATCC
などの寄託機関を利用可能である。ヘルペスファミリーのウィルスには、例えば
、単純ヘルペスウィルス(HSV)およびエプスタインバーウィルス（EBV）並びにサ
イトメガロウィルス(CMV)および仮性狂犬病ウィルス(PRV)が含まれ、これらもAT
CCなどの寄託機関を利用可能である。

【００３５】 「感染性」ウィルスまたはウィルス粒子は、そのウィルス種が栄養性である細
胞内に送達することができるポリヌクレオチド成分を含有するものである。この
用語は、ウィルスの任意の複製能力を必ずしも意味しない。感染性ウィルス粒子
を計測するアッセイは当技術上記載されている。

【００３６】 「複製能力」ウィルス（例えば、複製能力AAV、「RCA」と略されるときもある
）は、感染性であり、感染した細胞内で（すなわち、ヘルパーウィルスまたはヘ
ルパーウィルス機能の存在下において）複製することもできる表現型が野生型の
ウィルスを言う。AAVの場合には、複製能力は、一般に、機能的なAAVパッケージ
ング遺伝子の存在を必要とする。本明細書において記載する好ましいrAAVベクタ
ーは、1つ以上のAAVパッケージング遺伝子の欠失のために、哺乳類細胞において
（特にヒト細胞において）複製能力がない。好ましくは、このようなrAAVベクタ
ーは、AAVパッケージング遺伝子とrAAVベクターとの間の組み換えによってRCAが
作製される可能性を最小にするために、いかなるAAVパッケージング遺伝子配列
も欠失している。

【００３７】 「遺伝子」は、転写および翻訳により、特定のタンパク質をコードすることが
できる少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオ
チドをいう。

【００３８】 本明細書において使用する「発現」は、遺伝子の転写および/または翻訳をい
う。

【００３９】 ポリヌクレオチドに適用される「組み換え」は、そのポリヌクレオチドが、天
然に見出されるポリヌクレオチドとは別個の構築物を生じるクローニング、切断
またはライゲーションステップの種々の組み合わせの産物であることを意味する
。組み換えウィルスは、組み換えポリヌクレオチドを含有するウィルス粒子であ
る。この用語は、もとのポリヌクレオチド構築物の複製物およびもとのウィルス
構築物の子孫をそれぞれ含む。

【００４０】 「作動可能に結合する(operatively linked)」または「作動可能に結合する(o
perably linked)」または「作動可能に関連する(operably associated)」は、遺
伝子要素が予測されたように機能できる関係にある遺伝子要素の並列を言う。例
えば、プロモーターが、コード配列の転写の開始を助ける場合には、プロモータ
ーはコード領域に作動可能に結合している。この機能的な関係が維持される限り
、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。

【００４１】 「異種(heterologous)」は、比較されているものとは遺伝子型が別個のもの由
来であることを意味する。例えば、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに
遺伝子工作技法によって組み込まれるポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチド
である。天然のコード配列から取り出され、天然には結合されていないコード配
列に作動可能に結合されるプロモーターは異種プロモーターである。

【００４２】 「遺伝的改変」は、遺伝的要素が細胞に導入される、有糸分裂または減数分裂
以外の過程を言う。要素は細胞にとって異種であっても、細胞にすでに存在する
要素の追加のコピーまたは改良型であってもよい。遺伝的改変は、例えば、エレ
クトロポレーション、リン酸カルシウム沈降またはポリヌクレオチド-リポソー
ム複合体を接触させるなどの当技術上既知の任意の方法によって組み換えプラス
ミドまたは他のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトすることによって実
施することができる。遺伝的改変はまた、例えば、DNAまたはRNAウィルスまたは
ウィルスベクターを形質導入または感染することによって実施することができる
。好ましくは、遺伝的要素は、細胞の染色体またはミニ染色体に組み入れられる
が、細胞およびその子孫の表現型および/または遺伝子型を変化させる任意の改
変もこの用語に含まれる。

【００４３】 インビトロにおける細胞の長期培養中、遺伝子配列がその機能を実施するのに
利用可能である場合には、細胞は遺伝子配列が「安定に」改変、形質導入または
形質転換されていると言われる。好ましい例において、改変細胞の子孫によって
受け継がれうる遺伝的改変が導入されているという点において、このような細胞
は「遺伝的」に改変されている。

【００４４】 ポリヌクレオチドの細胞への「安定な導入」は、ポリヌクレオチドが、細胞内
で安定に維持される傾向にあるレプリコンに組み込まれることを意味する。プラ
スミドなどのエピソームが何世代にわたって維持されうることもあるが、エピソ
ームに搬送される遺伝材料は、一般に、染色体に組み込まれる材料よりも欠失さ
れやすい。しかし、ポリヌクレオチドは、選択マーカーをポリヌクレオチド内ま
たはポリヌクレオチドに隣接して組み込み、次いでそのポリヌクレオチドを保有
する細胞を選択圧力下において培養することによって維持できることがしばしば
ある。ある場合では、配列は染色体内に組み込まれていないと安定に効果的に維
持されない。従って、選択マーカーを含有する配列の保持に関して選択すること
により、マーカーが染色体に安定に組み込まれている細胞を選択することができ
る。抗生物質抵抗性遺伝子は、当技術上周知であるように、このような選択マー
カーとして便利に使用することができる。典型的には、安定に組み込まれたポリ
ヌクレオチドは少なくとも約20世代、好ましくは少なくとも100世代維持される
ことが期待され、よりさらに好ましくは、それらは永久的に維持される。真核生
物の染色体のクロマチン構造が組み込まれたポリヌクレオチドの発現レベルに影
響を与えることもある。安定に維持される特定の遺伝子の多数のコピーを有する
ことが望ましい場合には、安定に維持されるエピソームに遺伝子を保有させるこ
とが特に有用となり得る。本発明に関連して特に望ましい特性を有する安定な細
胞株を選択することは以下に記載され、例示されている。

【００４５】 「単離された」プラスミド、ウィルスまたは他の物質は、その物質または同様
の物質が天然に存在するまたは最初に調製される場合に、同時に存在する可能性
のある他の成分の少なくとも一部を含有しない物質の調製物を言う。従って、例
えば、単離物質は、原料混合物から濃縮する精製技法を使用して調製することが
できる。濃縮は、溶液の容量あたりの重量などの絶対量で測定されてもよく、ま
たは原料混合物中に存在する妨害する可能性のある第二の物質に対して測定する
こともできる。本発明の実施態様では、濃縮が増すほどより好ましい。従って、
例えば、2倍の濃縮が好ましく、10倍の濃縮はさらに好ましく、100倍の濃縮はさ
らに好ましく、1000倍の濃縮はよりさらに好ましい。

【００４６】 rAAVの調製物は、感染性ヘルパーウィルス粒子に対する感染性rAAV粒子の割合
が少なくとも約10²:1、好ましくは少なくとも約10⁴:1、さらに好ましくは少なく
とも約10⁶:1、よりさらに好ましくは少なくとも約10⁸:1である場合にはヘルパー
ウィルスを「実質的に含有しない」と言われる。調製物はまた、好ましくは、等
量のヘルパーウィルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウィルス粒子不純
物が崩壊した形態で存在する場合、このようなレベルのヘルパーウィルスの結果
として存在するであろうタンパク質）を含有しない。ウィルスまたは細胞または
それらの両方のタンパク質の混入は、一般に、SDSゲルのクーマシー染色バンド
の存在として観察することができる（例えば、AAVカプシドタンパク質VP1、VP2
およびVP3に相当するもの以外のバンドの出現）。

【００４７】 「宿主細胞」は、ベクターのレシピエントまたはポリヌクレオチドまたはタン
パク質またはそれらの両方を組み込むためのレシピエントとなり得るまたはレシ
ピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は1つの宿主細
胞の子孫を含み、子孫は、自然、偶発的または意図的な突然変異により元の親細
胞と（形態および総DNA相補物のゲノムが）必ずしも全く同じでなくてもよい。
宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをインビボにおいてトランスフェクトし
た細胞を含む。

【００４８】 「肝細胞」は、実質細胞、非実質細胞、内皮細胞、上皮細胞等を含むが、これ
らに限定されない、肝臓組織に見られる任意の細胞種類を意図している。

【００４９】 「形質転換」または「トランスフェクション」は、例えば、リポフェクション
、形質導入、感染またはエレクトロポレーションのような挿入に使用する方法に
かかわらず、宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを挿入することをいう。外因性
ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドのような非組み込みベクターとして維
持されてもよく、または宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。

【００５０】 「個体」または「被検者（体）」は、脊椎動物、特に哺乳類種の動物を言い、
家畜、競技用動物、げっ歯類および人間を含む霊長類を含むが、これらに限定さ
れない。

【００５１】 本明細書において使用する「と併用して」は、別の治療方法以外に1つの治療
方法を行うこといい、被検者に（ポリペプチドの形態の）第VIII因子を送達し、
さらに同じ被検者に本明細書に記載するrAAVを投与することなどである。同様に
、「併用して」は、1つの治療方法を他の治療方法の前、最中または後に被検者
に行うことを言う。

【００５２】 本明細書において使用する「治療」は、有用なまたは望ましい臨床結果を得る
ための方法である。本発明の目的のためには、有用なまたは望ましい臨床結果に
は、検出可能または検出不能にかかわらず、少なくとも1つの症状の軽減、疾病
の程度の減少、疾病状態の安定（すなわち、悪化しない）、疾病の拡散の防止、
疾病進行の遅延または緩和、疾病状態の改善または軽減および寛解（部分的また
は全体的）が含まれるが、それらに限定されない。「治療」はまた、治療を行わ
ない場合に予測される生存と比較したとき、生存を延長することを意味すること
もある。

【００５３】 「生物試料」は、個体から入手される種々の試料の種類を含み、診断またはモ
ニタリングアッセイに使用することができる。この定義は、血液および生物起源
の他の液体試料、生検標本または組織培養物またはそれら由来の細胞およびそれ
らの子孫などの固体組織試料を含む。この定義はまた、調達後に、試薬による処
理、溶解化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮
などの任意の方法で操作された試料も含む。「生物試料」という用語は臨床試料
を含み、また培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液および組織
試料を含む。

【００５４】 疾患を「軽減すること」は、本発明のrAAVベクターを投与しない場合と比較し
たとき、疾病状態の程度および/または望ましくない臨床症状が減少すること、
および/または疾病進行の時間経過が緩和または遅延することを意味する。

【００５５】 示すように、スペーサーDNAが本発明の構築物に含有されてもよい。「スペー
サーDNA」は、タンパク質をコードせず、プロモーターまたはプロモーター因子
として働かないナンセンスDNAであると意図されている。すなわち、スペーサーD
NAは、第VIII因子の核酸分子を発現するために任意の空間的な必要性を提供する
ために使用されてもよい。スペーサーDNAのサイズまたは長さは数ヌクレオチド
から数百ヌクレオチドと異なってもよい。スペーサーDNAの長さは、rAAVベクタ
ーのサイズ限界を考慮すると、発現される第VIII因子のヌクレオチド配列のサイ
ズおよびエンハンサー因子によって制限される。

【００５６】 「力価」は、流体の容量あたりの感染性ウィルス単位の数と意図されている。

【００５７】 「高力価rAAVストック」は、人工的な操作を行わない生産系によって生産され
るウィルス粒子のストックと意図されている。「人工的な操作を行わない」は、
ウィルス粒子の数が、プール化、多数回の操作または他の濃縮手段によって操作
されていないことを意味する。本発明の目的のためには、約2×10⁷細胞を含有す
る1枚の細胞プレートにより約2〜3×10¹¹粒子が産生する。これらの数は適当に
スケールアップすることができる。産生されるウィルス粒子の数のうち、1％が
機能的ウィルスである。すなわち、100あたり1つが第VIII因子タンパク質を発現
する。従って、調製物中の約2×10⁹の感染性ウィルス粒子が機能的である。これ
らの約90〜100％がトランスジーンを発現する。

【００５８】 「感染単位」は、感受性のある宿主とともにおくとき検出可能な影響を生ずる
最小単位と意図されている。感染単位を求めるアッセイは既知である。例えば、
本発明において使用される一方法では、ウィルスをアデノウィルスおよび野生型
AAVの存在下においてレポーター細胞上で複製する。複製後、DNAを細胞から入手
し、第VIII因子コード配列をプロービングする。この方法では、細胞中のrAAVの
数を求めることができる。

【００５９】 粒子の総数を測定するためには、細胞をウィルスヌクレオチド配列でプロービ
ングすることができる。本発明の方法では、rAAV/第VIII因子は総粒子の約90〜9
9.9％、好ましくは約99〜約99.99％を含有する。野生型ウィルスは総粒子の0.01
％未満である。入手したこのような99.9％の粒子のうち、100あたり1つ、すなわ
ち、1％が機能的ウィルス、すなわち、Ｂドメイン欠失第VIII因子トランスジー
ンを発現するウィルスである。

【００６０】 本発明は、一部には、生物学的に活性なＢドメイン欠失第VIII因子をコードす
るヌクレオチド配列が組み換えAAV（rAAV）ベクター中で効率的に発現されると
いう予測されなかった所見に基づいている。肝臓選択的（liver-preferred）エ
ンハンサー因子のコントロール下においてＢドメイン欠失ヒト第VIII因子（BDD
ヒト第VIII因子）を搬送するrAAVベクターをマウスに投与することにより、肝臓
によってＢドメイン欠失ヒト第VIII因子が長期間（14ヶ月より長い）発現され、
治療後の動物の血漿中で治療レベルのＢドメイン欠失ヒト第VIII因子（正常の〜
27％）が発現される。従って、本発明は、遺伝子治療のためにrAAVベクターを使
用して、血友病を治療する新規試薬と方法を提供する。

【００６１】 rAAVベクターは、ゲノムに異種（すなわち、外因性）遺伝子を保有するAAVウ
ィルス粒子である。rAAVベクターは、ウィルスを形成する4679野生型塩基のうち
145塩基のcis型末端重複を少なくとも1つ必要とする。他の全てのウィルス配列
は重要ではなく、trans型で供給されてもよい（Muzyczka, (1992) Curr. Topics
Microbiol. Immunol. 158: 97)。典型的には、rAAVベクターは、ベクターによ
って効率的にパッケージングされ得るトランスジーンのサイズを最大にするのに
最小の末端重複配列だけを保持する。

【００６２】 本明細書において使用する、AAVによる細胞の「感染」または「形質導入」は
、AAVが細胞内に流入して潜伏的または活動的感染を確立することを意味する。
例えば、Fields et al., Virology, Volume 2, Chapter 69(3d ed., Lippincott
-Raven Publishers)参照。AAVを被検者に投与する本発明の実施態様では、AAVが
ゲノムに組み込んで、潜伏的感染を確立することが好ましい。しかし、ベクター
は形質導入した細胞中ではエピソームとして安定して存続することができるので
、このような組み込みはrAAVベクターによって搬送されるトランスジーンの発現
には必要ない。

【００６３】 特に示さない限り、本発明によるrAAVベクター、ヘルパーベクターおよび細胞
を構築するために、標準的な方法を使用することができる。このような技法は当
業者に既知である（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A La
boratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
NY); Aububel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Green
Publishing Assocoates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., NY)参照）。

【００６４】 ［A. Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするrAAVベクター］ 本発明は、rAAVベクターを使用して、効率的にパッケージングされ、送達され
、発現され得る生物学的に活性なＢドメイン欠失第VIII因子をコードする構築物
を提供する。ある実施態様では、rAAVベクターに含有されるAAV ITRは、プロモ
ーターを追加しなくても、Ｂドメイン欠失第VIII因子ヌクレオチド配列を発現さ
せられる。本発明のrAAVベクターは、発現を促進するために、少なくとも1つの
エンハンサーと少なくとも1つのプロモーターとを含有する。本発明によるrAAV/
第VIII因子ベクターは、（例えば、血液凝固を増強する、または血友病Aを治療
する獣医学的用途または医学的用途のために）コードされているＢドメイン欠失
第VIII因子タンパク質を産生するため、または治療的投与のために、細胞および
被検者への投与を可能にするのに十分な力価で作製することができる。

【００６５】 これらの結果は、AAVベクターの既知のパッケージング限界を考慮すると予測
されないものである。このような限界により、AAVカプシドによって効率的にパ
ッケージングできる異種ヌクレオチド配列および/または発現制御因子のサイズ
が制約される（例えば、Russell et al. (1999) Blood 94: 864; Chuah et al.
(1998) Critical Review in Oncology/Hematology 28: 153参照）。

【００６６】 全長の第VIII因子遺伝子は長さが186kbで、9029ヌクレオチドのmRNAをコード
する。全長の第VIII因子をコードするcDNAは、rAAVベクターのパッケージング能
力を大幅に超えると思われる。Ｂドメインは第VIII因子機能に必要ないことが見
出されている。Ｂドメインをコードする配列を欠失すると、約4.4〜4.6kbのcDNA
Ｂドメイン欠失第VIII因子が生じる。AAV中での高力価産生のためにサイズ制限
を越えることなく高レベル発現に十分な発現制御因子（例えば、プロモーター、
エンハンサー、ポリ(A)部位）を加えなければならないので、このようなより小
さい構築物でさえもrAAVベクターを使用して効率的にパッケージングおよび発現
させられないことを当技術分野は教示している（Russell et al((1999)Blood 94
: 864, 868ページのCol. 1, para. 2）。

【００６７】 従って、本発明が組み換えベクターの効率的なパッケージングを達成し、その
結果高力価rAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子ストックが得られたことは全く驚く
べきことであった。特に、rAAVベクターが、野生型の109％であるトランスジー
ン発現カセットを使用したことに関しては驚くべきことであった（5084bp)。さ
らに、このＢドメイン欠失第VIII因子ベクターはインビボにおいて肝実質細胞に
よって長期間、高レベルで発現され、治療後の動物の血漿中に治療レベルのＢド
メイン欠失第VIII因子タンパク質を産生する。

【００６８】 示すように、本発明は、生物学的に活性なＢドメイン欠失第VIII因子をコード
する異種ヌクレオチド配列を保有するrAAVベクターを提供する。Ｂドメイン欠失
第VIII因子をコードするヌクレオチド配列は、鳥類および哺乳類の種を含む、い
かなる種由来であってもよい。好ましくは、Ｂドメイン欠失第VIII因子は哺乳類
であり（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、
ヤギ、ウマ、サル、ヒト等）、さらに好ましくは、Ｂドメイン欠失第VIII因子は
ヒトＢドメイン欠失第VIII因子である。さらに別法として、Ｂドメイン欠失第VI
II因子は、以下に記載するように種間ハイブリッドであってもよい。ヌクレオチ
ド配列は合成配列であってもよい。Ｂドメイン欠失第VIII因子配列の変種および
断片も、第VIII因子の生物活性を保持する限り、含まれる

【００６９】 生物学的に活性なＢドメイン欠失第VIII因子コード配列は、AAVによってパッ
ケージングされ得るほど十分小さくなければならない。Ｂドメイン欠失第VIII因
子トランスジーン構築物のサイズは約4.8kb以下であることが好ましく、さらに
好ましくは約4.7kb以下であり、よりさらに好ましくは約4.6kb以下であり、より
さらに好ましくは約4.5kb以下であり、さらにより好ましくは約4.4kb以下である
。

【００７０】 または記述されているように、Ｂドメイン欠失第VIII因子トランスジーンカセ
ット（すなわち、ITRsおよび他の発現制御因子を含む）は約5.2 kb以下であるこ
とが好ましく、約5.1 kb以下であり、約5.0 kb以下であり、約4.9 kb以下であり
、4.8 kb以下であり、約4.7 kb以下であり、約4.5 kb以下でありまたは約4.4 kb
以下である。Ｂドメイン欠失第VIII因子トランスジーンカセットは、rAAVストッ
クを作製するのに効率的にパッケージングされ得るサイズである。

【００７１】 Ｂドメイン欠失第VIII因子トランスジーンは、上記のサイズにするために切断
および/または欠失されてもよい。発現されるＢドメイン欠失第VIII因子タンパ
ク質が十分な生物活性（例えば、凝固）を保持する限り、当技術上既知の任意の
切断および/または欠失を使用してもよい。「十分な生物活性」は、Ｂドメイン
欠失第VIII因子がインビトロおよび/またはインビボにおいて使用されるのに十
分な活性を有することを意図している。好ましくは、発現される切断および/ま
たは欠失Ｂドメイン欠失第VIII因子は、天然の第VIII因子タンパク質の生物活性
の少なくとも約25％、約50％、約75％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99
％以上を保持する。第VIII因子の生物活性を求めるアッセイは当技術上周知であ
り、本明細書に記載されているようなアッセイを含む。第VIII因子の特異的活性
を求めるためのワン-ステージ凝固アッセイ(one-stage clotting assay)の説明
は、Practor and Rapaport(1961)Blood 72: 335も参照。第VIII因子活性はまた
発色アッセイ(chromogenic assay)でも測定することができる（Kabi Coatest; K
abi Vitrurus, Stockholm, Sweden)。

【００７２】 好ましい実施態様において、本発明のＢドメイン欠失第VIII因子構築物は、Ｂ
ドメインをコードするヌクレオチド配列が欠失している。Ｂドメインの一部また
は全てをコードするヌクレオチド配列を欠失してトランスジーンサイズを最小に
してもよい。本発明の構築物は、使用したクローニング方法の結果として、Ｂド
メイン欠失領域由来の多少のヌクレオチド配列を保持してもよい。1つのヒトＢ
ドメイン欠失第VIII因子のアミノ酸配列を本明細書の図1および配列番号２に示
し、この図および配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド419〜4835
によってコードされる。Ｂドメイン欠失第VIII因子変異体は、残基760から1639
までを欠失している（第VIII因子760〜1639）（Pittman et al. (1993)Blood 11
: 2925。他のＢドメイン欠失第VIII因子は当技術上既知で、Gnatenko et al(199
9) Br. J. Haemotology 104: 27によって記載されている第VIII因子Δ756〜1679
および第VIII因子Δ761〜1639構築物、Ill et al. (1997) Blood Coagulation a
nd Fibrinolysis 8: 523によって記載されている第VIII因子746〜1639が含まれ
る。いくつかのＢドメイン欠失変異体が記載されている、米国特許第5,910,481
号も参照。本発明はさらに、図6および配列番号：4に示すアミノ酸配列を有する
イヌ由来の構築物を提供する。イヌＢドメイン欠失第VIII因子（Ｂドメイン欠失
イヌ第VIII因子）変異体タンパク質は図6（配列番号：3）に示すヌクレオチド配
列のヌクレオチド428〜4790によってコードされる。この構築物もＢドメインか
ら残基760〜1639が欠失している。Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子およびＢドメ
イン欠失イヌ第VIII因子の変種および断片も本発明に含まれる。

【００７３】 ある実施態様では、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする発現カセットおよ
び/またはヌクレオチド配列は、例えば、Ｂドメイン欠失第VIII因子トランスジ
ーンの転写および/または翻訳効率を増加するために修飾されている。このよう
な修飾は当技術上既知で、例えば、参照として本明細書に組み入れられている、
Ill et al. (1997) Blood Coagul. Fibrinolysis 8(suppl.2): S23-S30に記載さ
れている。

【００７４】 本発明の他の実施態様において、生物学的に活性なＢドメイン欠失第VIII因子
をコードするヌクレオチド配列は、図1（配列番号１）に示すヌクレオチド約419
〜4835として与えられる配列または図6（配列番号：3）に示すヌクレオチド約42
8〜4790として与えられる配列と実質的に同一であり、生物学的に活性または治
療的に有効なＢドメイン欠失第VIII因子をコードする。この定義は、第VIII因子
遺伝子に天然の対立遺伝子変異を含むことを意図している。この実施態様による
Ｂドメイン欠失第VIII因子は、上記の任意の種起源であっても、ハイブリッドで
あってもよい。本明細書において使用する、「実質的に同一である」ヌクレオチ
ド配列は少なくとも75％同一であり、さらに好ましくは少なくとも80％、85％、
90％、95％または99％以上同一であり、すなわち、それらは開示されている配列
と少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも80％、85％、90％、95％または
99％以上の同一性を共有する。配列の同一性は本明細書の別の箇所に記載されて
いる方法によって求めることができる。

【００７５】 実質的に同一なヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションさせる高度にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件は当技術上周知である。例えば、相
同なヌクレオチド配列を図1（配列番号１）に示すヌクレオチド約419〜4835とし
て与えられる配列または図6（配列番号：3）に示すヌクレオチド約428〜4790と
して与えられる配列にハイブリダイゼーションするには、25％のホルムアミド、
5×SSC、5×デンハルト溶液および100μg/mlの1本鎖DNAおよび5％の硫酸デキス
トラン、42℃、4、8または12時間、洗浄条件として、25％のホルムアミド、5×S
SC、0.1％のSDS、42℃、15分間で、約60％の相同性の配列のハイブリダイゼーシ
ョンが可能になる。さらにストリンジェントな条件は、0.3MのNaCl、0.03Mのク
エン酸ナトリウム、0.1％ SDS、60℃または70℃の洗浄のストリンジェントな条
件で、標準的なインサイチューハイブリダイゼーションを使用する。Sambrook e
t al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)参照。

【００７６】 当業者は、発現されるＢドメイン欠失第VIII因子が十分な生物活性（上記）を
保持する限り、Ｂドメイン欠失第VIII因子構築物は他の改変を含有してもよいこ
とを理解している。例えば、Ｂドメイン欠失第VIII因子タンパク質は、生物活性
を増強する、タンパク質の半減期を延長する、またはＢドメイン欠失第VIII因子
を投与するレシピエントの抗原性応答を低下するように改変することができる（
例えば、引用することによりその内容全体が本明細書の一部をなすものとする、
Kaufman et al. (1998)Haemophilia 4: 370参照）。さらに別法として、Ｂドメ
イン欠失第VIII因子は種間ハイブリッドであってもよい。例えば、第VIII因子の
ヒト/ブタハイブリッドは米国特許第5,583,209号（引用することによりその開示
内容全体が本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。同様に、第V
因子と第VIII因子のドメイン交換により、半減期が延長され、および/または生
物活性が増加したハイブリッドが作製される。

【００７７】 関心のある自然または天然型のタンパク質またはポリペプチドの生物学的に活
性で好適な変種は、そのポリペプチドの断片、類似体および誘導体であってもよ
い。「断片」は、無傷のポリペプチド配列および構造の一部だけからなるポリペ
プチドを意図しており、自然のポリペプチドのC末端欠失またはN末端欠失であっ
てもよい。「類似体」は、1つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する
自然のポリペプチド配列および構造を有する場合には、自然のポリペプチドまた
は自然のポリペプチドの断片の類似体を意図している。「誘導体」は、自然のタ
ンパク質またはポリペプチドの望ましい生物活性が保持される限り、関心のある
自然のタンパク質もしくはポリペプチド、自然のタンパク質もしくはポリペプチ
ドの断片またはそれぞれの類似体の、グリコシル化、リン酸化またはその他の外
因的部分の追加などの任意の好適な修飾を意図している。このような断片、類似
体および誘導体を作製する方法は一般に当技術上利用可能である。

【００７８】 例えば、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列変種は、関心のある自
然のタンパク質またはポリペプチドをコードするクローニングされたDNA配列の
突然変異によって作製することができる。突然変異およびヌクレオチド配列改変
の方法は当技術上周知である。例えば、引用することにより本明細書の一部をな
すものとする、Walker and Gaastra eds.(1983) Techniques in Molecular Biol
ogy (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985)Proc. Nat. Ac
ad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367
-382;Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold
Spring Harbor , NY);米国特許第4,873,192号;およびそこに引用されている参照
文献参照。関心のあるポリペプチドの生物活性に影響を与えない適当なアミノ酸
置換に関するガイダンスは、引用することにより本明細書の一部をなすものとす
る、Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., W
ashington, D. C.)においてDayhoff et al.(1978)のモデルに見出すことができ
る。1つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの同類置
換が好ましい。同類置換の例には、GlyとAlaの置換、ValとIleとLeuの間の置換
、AspとGluの置換、LysとArgの置換、AsnとGlnの置換およびPheとTrpとTyrの間
の置換が含まれるが、それらに限定されない。

【００７９】 関心のあるタンパク質またはポリペプチドの変種を構築する際には、変種が常
に望ましい活性を有するように改変をする。明らかに、変種のタンパク質または
ポリペプチドをコードするDNAに加えられる改変は、配列をリーディングフレー
ムの外側に置いてはだめで、好ましくは、二次的なmRNA構造を作製すると思われ
る相補的な領域を作製しない。欧州特許出願番号第75,444号参照。

【００８０】 関心のあるタンパク質またはポリペプチドの生物学的に活性な変種は、比較の
基準として働く基準ポリペプチド分子のアミノ酸配列と、一般に、少なくとも70
％、好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは約90％〜95％以上、最も好ま
しくは約98％以上アミノ酸配列が同一である。関心のある自然のポリペプチドの
生物学的に活性な変種は、自然のポリペプチドと1〜15アミノ酸程度、6〜10アミ
ノ酸のように1〜10アミノ酸程度、5アミノ酸程度、4、3、2または1アミノ酸残基
程度が異なってもよい。「配列の同一性」は、変種のアミノ酸配列の具体的な連
続セグメントを整列させて、基準分子のアミノ酸配列と比較するとき、変種のタ
ンパク質またはポリペプチドと基準として働くタンパク質またはポリペプチド分
子との間に同じアミノ酸残基が見出されることを意図している。2つのアミノ酸
配列間の配列の同一性の割合は、両方の配列に同じアミノ酸残基がある位置の数
を求めて一致する位置の数を出し、一致する位置の数を基準分子と比較している
セグメントの総位置数で割り、その結果に100をかけて配列の同一性の割合を出
すことによって算出する。

【００８１】 2つの配列を最適に並置するために、変種のアミノ酸配列の連続セグメントに
、基準分子のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸残基を追加またはアミノ酸残基
を欠失することができる。基準のアミノ酸配列との比較に使用する連続セグメン
トは少なくとも20連続するアミノ酸残基を含み、30、40、50、100以上の残基で
あってもよい。変種のアミノ酸配列にギャップを挿入することにより配列の同一
性を増加する補正はギャップペナルティをあてがうことによって行うことができ
る。配列を並置する方法は、アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列においても当技術上周知である。

【００８２】 このように、任意の2つの配列間の同一性の割合を求めることは、数学アルゴ
リズムを使用して実施できる。配列を比較するために使用される、1つの好まし
く、非限定的な数学アルゴリズムの例はMyers and Miller (1988) CABIOS 4: 11
-17である。このようなアルゴリズムは、GCG配列並置ソフトウェアーパッケージ
の一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0)で使用される。アミノ酸配列を
比較するとき、PAM120ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップ
ペナルティ4をALIGNプログラムに使用することができる。2つの配列を比較する
際に使用する、別の好ましく非限定的な数学アルゴリズムの例はKarlin and Alt
schul(1990)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 2264のアルゴリズムに、Karlin an
d Altschul(1993)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877のように改良を加
えたものである。このようなアルゴリズムを、Altshul et al (1990)J. Mol. Bi
ol. 215: 403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込む。BLASTヌクレオチド
検索は、NBLASTプログラム、スコアー＝100、ワード長＝12を使用して実施する
ことができ、関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と相同なヌ
クレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラ
ム、スコアー＝50、ワード長＝3を使用して実施することができ、関心のあるポ
リペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップアラ
インメントを得るためには、Altshul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3
389に記載されているように、Gapped BLASTを使用することができる。または、P
SI-Blastを使用して、分子間の遠い関係(distant relationship)を検出する反復
検索を実施することができる。Altshul et al. (1997)上記。BLAST、Gapped BLA
STおよびPSI-Blastプログラムを使用するとき、それぞれのプログラムのデフォ
ルトパラメーター（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を使用することができる。ht
tp://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。また、ALIGNプログラム（Atlas of Protein S
equence and Structure 5: Suppl. 3のDayhoff(1978) (National Biomedical Re
search Foundation, Washington, D. C.)およびWisconsin Sequence Analysis P
ackage, Version 8のプログラム（Genetics Computoer Group, Madison, Wiscon
sin製）、例えば、プログラムのデフォルトパラメーターを使用するGAPプログラ
ムも参照。

【００８３】 アミノ酸配列の同一性の割合を考慮するとき、いくつかのアミノ酸残基位置が
同類アミノ酸置換の結果として異なることがあるが、これはタンパク質機能の特
性に影響を与えない。これらの例では、配列の同一性の割合は、同類置換された
アミノ酸の類似性を説明する方向に調節することができる。このような調節は当
技術上周知である。例えば、Myers and Miller (1988) Computer Applic. Biol.
Sci. 4: 11-17参照。

【００８４】 当業者は、種々の発現制御因子（例えば、プロモーターおよび/または転写因
子結合部位および/またはエンハンサー）に、望ましいレベルおよび組織選択的(
tissue-preferred)発現に応じて、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種
ヌクレオチド配列が作動可能に結合することを理解している。上記のように、一
般に、発現制御因子は少なくとも1つのエンハンサー因子を含有する。しかし、
プロモーターまたはプロモーター因子もカセットに含有されてもよいことが認識
されている。

【００８５】 プロモーターまたはプロモーター因子の選択は一部にはサイズに基づいている
。AAVベクターによるパッケージサイズの制約のために、小型または微小なプロ
モーターが好ましい。

【００８６】 上記のサイズの制約が満たされるなら、種々のプロモーターを本発明のrAAVベ
クターに使用することができる。これらには、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼまたはチミジル酸シンターゼプロモーター(Merrill (1989)Proc. Nat. Ac
ad. Sci. USA 86: 4987, Deng et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 4079)、B型
肝炎ウィルスコアプロモーター（例えば、Kramvis and Kew (1999) J. Viral. H
epat. 6: 415-427）、ヒトU1 snRNA プロモーター（例えば、Asselbergs and Pr
onk (1993) Mol. Biol. Rep. 17: 101-114）、近接的要素を有するマウス最小ア
ルブミンプロモーター（例えば、Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1: 268-2
76参照）、PCT公報国際公開公報第09920773号（参照として本明細書に組み入れ
られている）に記載されているプロモーター、最小サイトメガロウィルス主要即
時型プロモーター、初期および後期SV40プロモーター、アデノウィルス主要後期
プロモーター、α-またはβ-インターフェロンプロモーター、現象または組織選
択的（tissue preferred)プロモーター等が含まれるが、それらに限定されない
。プロモーターは、適宜、強力に発現させるようにまたは比較的弱い発現を生ず
るように選択することができる。

【００８７】 一実施態様において、本発明のrAAVベクターは、現象特異的なプロモーターの
活性化時に、Ｂドメイン欠失第VIII因子核酸分子がコードする関心のある遺伝子
が発現されるように、肝臓選択的（liver-preferred）エンハンサー因子および
現象特異的プロモーターの転写コントロール下においてＢドメイン欠失第VIII因
子コード配列を含有する。本明細書において使用する「現象特異的なプロモータ
ー」は、ある種の細胞条件下において活性化されるプロモーターである。プロモ
ーターからの転写を活性化してＢドメイン欠失第VIII因子を主に発現して、血流
中に分泌することができる因子を含有し、迅速に増殖している（造血細胞などの
）細胞中で主に転写が活性であるチミジンキナーゼもしくはチミジル酸シンター
ゼプロモーターまたはトランスフェリン受容体プロモーターなどの細胞増殖によ
って活性化される（または、細胞周期依存的な）プロモーター、細胞がウィルス
に感染された場合に活性化される、αまたはβインターフェロンプロモーターな
どのプロモーター（Fan and Maniatis (1989) EMBO J 8: 101; Goodbourn et al
. (1986) Cell 45: 601）並びにホルモンの存在によって活性化される、エスト
ロゲン応答プロモーターのようなプロモーターを含むが、これらに限定されない
、数多くの現象特異的プロモーターを本発明に関連して使用することができる。
Toohey et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 4526参照。

【００８８】 別の実施態様において、本発明のrAAVは、肝臓選択的（liver-preferred)プロ
モーターの活性化時に、Ｂドメイン欠失第VIII因子が発現されるように、肝臓選
択的（liver-preferred)エンハンサーおよび肝臓選択的（liver-preferred)プロ
モーターの転写コントロール下においてＢドメイン欠失第VIII因子遺伝子を含有
する。このような肝臓選択的（liver-preferred)プロモーターの代表例には、ホ
スホ-エノール-ピルビン酸カルボキシ-キナーゼ（「PEPCK」）（Hatzoglou et a
l. (1988)J. Biol. Chem. 263: 17798; Benvenisty et al. (1989)Proc. Nat. A
cad. Sci. USA 86: 1118; Vaulont et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 6: 4409)
、アルコール脱水素酵素プロモーター(Felder(1989)Proc. Nat. Acad. Sci. USA
86: 5903）およびアルブミンプロモーターおよびアルファ胎児タンパク質（Feu
erman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 4204; Camper and Tilghman(1989)
Genes Develop. 3: 537)が含まれるが、それらに限定されない。

【００８９】 本発明はまた、特定の転写因子のための結合部位であるプロモーター因子をrA
AVベクターが含有する実施態様を含む。これらのプロモーター因子は本明細書で
は「転写因子結合部位」と言われる。これらの部位に結合する転写因子は遍在的
であっても、組織選択的(tissue-preferred)であってもよい。遍在的な転写因子
のための結合部位の非限定的な例には、TFIIDに結合するTATA box(TATAAAA)、CT
F/NFに結合するCAAT box(GGCCAATCT)、SP1に結合するGC box(GGGCGG)およびATF
に結合するATF box(GTGACGT)が挙げられる。組織選択的(tissue-preferred)転写
因子結合部位の非限定的な例には、C/EBPタンパク質のための肝臓選択的（liver
-preferred)CAAT box結合部位（最適なパリンドロームGATTGCGCAATC、配列番号
：5に記載）、HNF1、HNF3およびHNF4の結合部位（例えば、Costa and Grayson (
1991) Nucleic Acids Res. 19: 4139-4145)並びにTGT3の結合部位（例えば、Chi
ang et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1132: 337-339) が挙げられる。

【００９０】 本発明のある実施態様では、発現制御因子は、トランスジーンの肝臓選択的（
liver-preferred)発現のためのエンハンサーを含有する。本発明が含むこのよう
なエンハンサーの非限定的な例には、α1ミクログロブリン/ビクニンエンハンサ
ー（例えば、Rouet et al. (1992)J. Biol. Chem. 267: 20765029773)、B型肝炎
ウィルスEnhI（図1または配列番号１のヌクレオチド150〜278並びにGuo et al.
(1991)J. Virol. 65: 6686-6692）およびEnhII（Gustin et al. (1993) Virolog
y 193(2): 653-60) エンハンサー、ヒトアルブミンE_1.7エンハンサーおよびヒト
アルブミンE₆エンハンサー（Hayashi et al. (1992)J. Biol. Chem. 267: 14580
-14585)並びにヒトサイトメガロウィルス即時型遺伝子エンハンサー（Boshart e
t al. (1985) Cell 41: 521-530)が挙げられる。

【００９１】 当技術上既知のいかなる発現制御因子も使用することができるが、当業者は、
使用する発現制御因子は、好ましくは、AAVベクターについて記載したサイズの
制約を満たすことを理解している。

【００９２】 また、本発明のrAAVベクターは、標的細胞に送達される異種ヌクレオチド配列
が作動可能に結合しているポリアデニル化シグナルを含有してもよい。これらの
ポリアデニル化配列は、好ましくは、上記のサイズの制約に適合する。好ましい
ポリアデニル化は約100bp未満を含有する。一実施態様において、ポリアデニル
化シグナルは合成ポリアデニル化シグナルである（例えば、引用することにより
本明細書の一部をなすものとする、国際公開公報第09929773号参照）。

【００９３】 本発明の一実施態様において、Ｂドメイン欠失第VIII因子トランスジーンカセ
ットを図1（配列番号１）に示す。この構築物は、左側および右側AAV末端反復配
列と、5'側から3'側方向に、B型肝炎ウィルスEnhIエンハンサー（nt 150-278)、
スペーサー配列（nt 279-399)、Ｂドメイン欠失第VIII因子コード領域(nt 419-4
835)およびTKポリアデニル化配列(nt 4840-4914)を含有する。

【００９４】 ［B. rAAVストックを作製する方法］ 遺伝子治療に使用するrAAVウィルス調製物には少なくとも3つの望ましい特徴
がある。最初に、rAAVウィルスは、効果的な割合の細胞を標的組織に形質導入す
るのに十分に高い力価で作製されることが好ましい。インビボにおける遺伝子治
療には、典型的には、大多数のrAAV感染単位が必要である。例えば、約10⁸粒子
、約10⁹粒子、約10¹⁰粒子、約10¹¹粒子、約10¹²粒子、約10¹³粒子、約10¹⁴粒子
、約10¹⁵粒子の過剰量を必要とする治療もある。第二に、rAAVウィルス調製物は
、本質的に、複製能力AAV（すなわち、ヘルパーウィルスまたはヘルパーウィル
ス機能の存在下において複製できる表現型が野生型のAAV）を含有しないことが
好ましい。第三に、遺伝子導入に関連する免疫応答を生ずるいかなるリスクも最
小または排除するために、rAAVウィルス調製物は全体として、他のウィルス（AA
V作製に使用するヘルパーウィルスなど）並びにヘルパーウィルスおよび細胞タ
ンパク質並びに脂質および炭水化物などの他の成分を本質的に含有しないことが
好ましい。AAVは、AAV作製過程中に効果的に複製、パッケージングされるために
、ヘルパーウィルス（典型的には、アデノウィルス）または他のヘルパーウィル
ス機能を与えることによる同時感染を必要とする「ヘルパー依存的」ウィルスで
あり、さらに上記のように、アデノウィルスは遺伝子導入用途に関して宿主免疫
応答を形成することが観察されているので、この後者の点は、AAVに関しては本
質的に重要である（例えば、Le et al. (1997); Byrnes et al. (1995) Neurosc
ience 66: 1015; McCoy et al. (1995) Human Gene Therapy 6: 1553およびBarr
et al. (1995) Gene Therapy 2: 151参照）。

【００９５】 rAAVベクターを複製し、パッケージングするために、損失している機能は、種
々の損失しているrepおよび/またはcap遺伝子産物に必要な機能を一体としてコ
ードするパッケージング遺伝子または複数のパッケージング遺伝子が補う。パッ
ケージング遺伝子または遺伝子カセットには、好ましくは、AAV ITRsが隣接せず
、好ましくは、rAAVゲノムといかなる実質的な相同性も持たない。

【００９６】 rAAVベクター構築物および相補的なパッケージング遺伝子構築物は本発明にお
いて数多くの異なる形態で作成することができる。ウィルス粒子、プラスミド、
安定に形質転換された宿主細胞は全て、このような構築物をパッケージング細胞
に一時的または安定に導入するために使用することができる。

【００９７】 種々の異なる遺伝的に改変された細胞を本発明に関連して使用することができ
る。例として、哺乳類宿主細胞を、安定に組み込まれたrAAVベクターの少なくと
も無傷のコピーとともに使用することができる。複製機能を供給するために、プ
ロモーターに作動可能に結合したAAV rep遺伝子を少なくとも含有するAAVパッケ
ージングプラスミドを使用することができる（米国特許第5,658,776号に記載）
。または、複製機能を供給するために、AAV rep遺伝子がプロモーターに作動可
能に結合した安定な哺乳類細胞を使用することができる（例えば、Trempe et al
.,米国特許第5,837,484号;Burstein et al., 国際公開公報第98/27207号およびJ
ohnson et al., 米国特許第5,658,785号参照）。上記の封入化タンパク質を提供
する、AAV cap遺伝子をAAV rep遺伝子と共にまたは別個に提供することができる
（例えば、上記出願および特許並びにAllen et al.(国際公開公報第96/17947号
参照）。他の組み合わせも可能である。

【００９８】 当技術上記載され、上記の参照文献および以下の実施例において例示されてい
るように、このような細胞を形質転換または形質導入する種々の手段のいずれか
を使用して、遺伝材料を（rAAVを作製するための哺乳類「プロデューサー」細胞
などの）細胞に導入することができる。例として、このような技法には、細菌プ
ラスミドのトランスフェクション、ウィルスベクターの感染、エレクトロポレー
ション、リン酸カルシウム沈降および種々の脂質系組成物のいずれかを使用した
導入（「リポフェクションと言われることが多い方法）が含まれるが、それらに
限定されない。これらの技法を実施する方法および組成物は当技術上記載されて
おり、広範に使用されている。

【００９９】 好適に改変された細胞の選択は、当技術の任意の技法によって実施することが
できる。例えば、細胞を改変するために使用するポリヌクレオチド配列を、当技
術上既知の1つ以上の検出または選択マーカーと同時に組み込んでもよく、また
はそれに作動可能に結合してもよい。例として、薬物耐性遺伝子を選択マーカー
として使用することができる。次いで、薬物耐性細胞を採取し、増殖し、望まし
い配列の発現（すなわち、異種ポリヌクレオチドの作製）について試験すること
ができる。組み込んだポリヌクレオチドの獲得、局在化および/または維持につ
いての試験は、DNAハイブリダイゼーションに基づいた技法（当技術上既知のサ
ザンブロット手法および他の手法など）を使用して実施することができる。発現
の試験は、遺伝的に改変した細胞から抽出したRNAのノーザン分析によってまた
は対応する遺伝産物の間接的な免疫蛍光によって実施することができる。パッケ
ージング能力および効率の試験および確認は、AAVの残りの機能的成分およびヘ
ルパーウィルスを細胞に導入して、AAV粒子の産生について試験することによっ
て得ることができる。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変され
ている場合には、それらを別個に細胞に導入して、各段階を順次実証することが
一般により便利である（が、必須ではない）。このような技法を記載している参
照文献には本明細書に引用されているものが含まれる。

【０１００】 rAAVベクターをAAV粒子にパッケージングする方法では、rAAVベクター配列（
すなわち、AAV ITRsが隣接する配列）とtrans型で提供されるAAVパッケージング
遺伝子を別個の細菌プラスミド形態で宿主細胞に導入する。この方法の例はRats
chin et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072; Hermonat et al. (1984)Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 81: 6466; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5
:3251; McLaughlinet al. (988) J. Virol. 62: 1963; Lebkowski et al. (188)
Mol. Cell. Biol. 7: 349; Samulski et al. (989) J. Virol. 63: 3822-3828
およびFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349に記載
されている。

【０１０１】 第2の方法は、rAAVベクター配列またはAAVパッケージング遺伝子どちらかを
エピソームプラスミドの形態でAAV複製に使用する哺乳類細胞に提供することで
ある。例えば、米国特許第5,173,414号参照。

【０１０２】 第3の方法は、rAAVベクター配列またはAAVパッケージング遺伝子のどちらかま
たは両方を複製に使用する哺乳類細胞のゲノムに安定に組み込むことである。

【０１０３】 この第3の方法の1つの例示的な技法は国際特許出願国際公開公報第95/13365号
（Targeted Genetics Corporation and Johns Hopkins University）および対応
する米国特許第5,658,776号（Flotte et alによる）に概略が記載されている。
この例は、安定に組み込まれたrAAVベクターの少なくとも1つの無傷のコピーを
有し、ベクターは標的ポリヌクレオチドに作動可能に結合したAAV ITRおよび転
写プロモーターを含有するが、repの発現はこの細胞内では制限されている哺乳
類細胞を使用している。好ましい実施態様において、異種プロモーターに作動可
能に結合したrep遺伝子を含有するAAVパッケージングプラスミドを細胞に導入し
、粒子中でのrAAVベクター配列の複製およびパッケージングを可能にする条件下
においてその細胞を培養する。

【０１０４】 別の方法はTrempe et al.,米国特許第5,837,484号に概略が記載されている。
この例は、機能的Repタンパク質を発現することができるように、AAV rep遺伝子
が異種プロモーターに作動可能に結合した安定な哺乳類細胞株を使用している。
種々の好ましい実施態様において、AAV cap遺伝子は安定に提供されてもよく、
または一時的に（例えば、プラスミドに）導入されてもよい。rAAVベクターも安
定または一時的に導入することができる。

【０１０５】 別の方法は、特許出願国際公開公報第96/17947号（Targeted Genetics Corpor
ation)に概略が記載されている。この例は、ヘルパーウィルス誘導性異種プロモ
ーターに作動可能に結合され、安定に組み込まれたAAV cap遺伝子および安定に
組み込まれたAAV rep遺伝子を含有する哺乳類細胞を使用している。rAAVベクタ
ー配列を含有するプラスミドも細胞に（安定にまたは一時的に）導入される。次
いで、ヘルパーウィルスを導入することによって、rAAVベクターの粒子へのパッ
ケージングが開始される。

【０１０６】 混在するウィルスおよび/またはウィルスまたは細胞タンパク質を実質的に含
有しない高力価のrAAVウィルス調製物を得る方法はAtkinson et al.によって国
際公開公報第99/11764号に記載されている。そこに記載されている技法をrAAV粒
子調製物の大規模作製に使用することができる。

【０１０７】 これらの種々の例は、十分に高い力価のrAAVウィルス粒子を作製する問題、rA
AVベクターとパッケージング成分をコードする配列との組み換えを最小にする問
題、哺乳類の細胞株におけるAAV rep遺伝子の発現に関連して生ずる可能性のあ
る困難の軽減または回避の問題（Repタンパク質はそれら自身の発現を制限する
だけでなく、細胞の代謝にも影響を与えるので）、混在するウィルスおよび/ま
たはウィルスまたは細胞タンパク質を実質的に含有しないrAAVウィルス調製物を
作製する問題に対処している。

【０１０８】 AAVベクターのウィルス粒子へのパッケージングは、AAVの好適なヘルパーウィ
ルスが存在することまたはヘルパーウィルス機能が提供されることを利用してい
る。AAV複製を支持することができるヘルパーウィルスはアデノウィルスによっ
て例示されるが、（HSV1、サイトメガロウィルスおよびHHV-6を含むが、これら
に限定されない）ヘルペスウィルスおよびポックスウィルス（特にワクシニア）
などの他のウィルスを含む。このような任意のウィルスを使用することができる
。

【０１０９】 ヘルパーウィルスは、目的の宿主細胞に感染することができる型およびサブグ
ループのアデノウィルスであることが多い。サブグループCのヒトアデノウィル
ス、特に血清型1、2、3、4、5、6および7が通常使用される。血清型5は、一般に
、好ましい。

【０１１０】 アデノウィルスの特徴および増殖パターンは当技術上既知である。例えば、
"Fundamental Virology", Fields et al., eds.のHorowitz, "Adenoviridae and
their replication", pp771-816を参照。パッケージングされたアデノウィルス
ゲノムは鎖状のDNA分子で、アデノウィルスITRsを介して左側および右側末端の
末端タンパク質複合体を介して結合して、環を形成する。早期、中間および後期
成分のコントロールおよびコード領域はゲノム内で重複する。早期領域遺伝子は
アデノウィルスゲノムを複製する際に必要であり、それらの位置により、E1、E2
、E3およびE4領域に分類される。

【０１１１】 本質的ではないが、原則的に、ヘルパーウィルス株は、最終的に遺伝子治療を
受ける被検者において複製が欠失していることが望ましい。従って、rAAVウィル
ス調製物に存在するいかなる残存ヘルパーウィルスも複製無能である。E1Aまた
はE1AおよびE3領域が除去されているアデノウィルスはほとんどのヒト細胞に感
染しない。それらは、欠損している活性を補うことができる許容細胞株（例えば
、ヒト293細胞株）において複製できる。ヘルパー機能に関連すると思われるア
デノウィルス領域および関連すると思われない領域は当技術上同定されており、
記載されている（例えば、P. Colosi et al., 国際公開公報第97/17458号およ
びそこに引用されている参照文献参照）。

【０１１２】 例えば、Atkinson et al.(国際公開公報第99/11764号）に記載されているよう
に、ヘルパーウィルス活性を提供するために、「条件付き感受性」ヘルパーウィ
ルスも使用することができる。このようなヘルパーウィルス株は、効率的なゲノ
ム複製を受けない少なくとも1つの条件下において、宿主細胞のAAV複製を支持す
ることができる特性を最小限持っていなければならない。ヘルパーウィルス活性
が無傷のウィルス粒子として供給される場合には、第2の条件下においてウィル
スが宿主細胞において複製できることも一般に必要である。第1の条件は、必要
な補助因子（陽イオンなど）の有無、阻害剤の有無または温度などの環境条件の
変化などの容易にコントロール可能な特徴が第2の条件と異なる。最も便利なこ
とには、2つの条件の差は温度であり、このような条件付き感受性ウィルスは温
度感受性ヘルパーウィルスと言われる。

【０１１３】 ヘルパーウィルスは、ウィルスの複製が許容されるいかなる細胞においても作
製することができる。アデノウィルスでは、好ましい細胞には293細胞およびHeL
a細胞が含まれる。播種密度の増加を可能にする培養技法を使用することが好ま
しい。懸濁培養に適合されている293細胞およびHeLa細胞変種を利用することが
できる。HeLaは懸濁状態での細胞増殖、生存度および形態の理由のために好まし
い。これらの細胞は、複製速度の低い温度感受性アデノウィルス株を作製するの
に十分な密度（1mlあたり2×10⁶）で増殖することができる。確立されたら、細
胞にウィルスを感染し、許容温度において十分な期間、一般に3〜7日、典型的に
は、約5日間培養する。

【０１１４】 ヘルパーウィルスの作製、単離および濃縮に有用な方法の例はAtkinson et al
.(国際公開公報第99/11764号）見出すことができる。

【０１１５】 いくつかの基準は、本明細書に記載するrAAV粒子を生産する際に使用する細胞
の選択に影響を与える。最初の問題として、選択されるヘルパーウィルスを使用
する場合には、細胞はrAAVベクターの複製およびパッケージングを許容する必要
がある。しかし、ほとんどの哺乳類細胞はAAVが増殖的に感染し、多数の細胞は
アデノウィルスなどのヘルパーウィルスによっても感染されることがあるので、
多岐にわたる哺乳類細胞および細胞株がこれらの基準を実際に満足することは明
らかである。これらのうち、より好ましい細胞および細胞株は、rAAVウィルス複
製の大規模生産を容易にするほど容易に培養で増殖することができるものである
。しかしまた、多数のこのような細胞がこの基準を実際に満足する。大規模生産
が望ましい場合には、生産方法の選択も宿主細胞の選択に影響する。例えば、At
kinson et al.(国際公開公報第99/11764号)にさらに詳細に記載されているよう
に、いくつかの生産技法および培養容器またはチャンバーは付着または接着細胞
を増殖するために設計されているが、懸濁細胞培養に設計されているものもある
。後者の場合では、宿主細胞は、好ましくは、懸濁内容に適合されるかまたは適
合可能である。しかし、付着または固定依存的と考えられている細胞または細胞
株の場合でも、懸濁培養できる細胞を連続的に選択することによって、固定依存
的な親系統の懸濁適合性変種を誘導することができる。例えば、Atkinson et al
.（国際公開公報第99/11764号）参照。

【０１１６】 最後に、複製およびパッケージングに必要なヘルパーウィルス、rAAVベクター
配列および全てのAAV配列が同じ細胞に存在する必要がある。1つ以上のAAVパッ
ケージング遺伝子がベクターとは別個に提供される場合には、(i)各AAVパッケー
ジング遺伝子がAAV複製または封入化タンパク質をコードする1つ以上のAAVパッ
ケージング遺伝子と、(ii)少なくとも1つのAAV ITRが隣接した異種ポリヌクレオ
チドを含有し、AAVパッケージング遺伝子が欠失しているrAAVベクターを使用し
て、宿主細胞に導入される異種ポリヌクレオチドおよび(iii)ヘルパーウィルス
または必要なヘルパーウィルス機能をコードする配列を含有する宿主細胞が提供
される。しかし、これらの因子の1つ以上が1つのレプリコン上で組み合わされて
もよいことが注目されるべきである。

【０１１７】 ヘルパーウィルスは、好ましくは、培養細胞のほとんどに感染するのに十分な
レベルが細胞培養物に導入されるが、得られる調製物中に存在するヘルパーウィ
ルスの量を制限するために、最小にしておいてもよい。1-100の感染効率または
「MOI」を使用することができるが、5-10のMOIが典型的には十分である。

【０１１８】 同様に、rAAVベクターおよび/またはパッケージング遺伝子がパッケージング
細胞に一時的に導入される場合には（安定して導入される場合と異なり）、それ
らは、好ましくは、培養細胞のほとんどを遺伝的に改変するのに十分なレベルが
導入される。一般に必要な量は、細菌プラスミドとして供給される場合には、10 ⁶ 細胞あたり10μg程度であり、AAV粒子として供給される場合には、10⁵細胞あた
り10⁸粒子程度である。最適な量は、当業者の範囲内である通常の力価検定を実
行することによって決定される。

【０１１９】 これらの要素は、同時にまたは任意の順序で連続的に細胞に導入することがで
きる。細胞が要素のいずれかによって遺伝的に改変される場合には、次の要素を
導入する前に、細胞を選択して、増殖させることができる。

【０１２０】 好ましい例において、常在rAAVベクターを救済し、パッケージングするために
ヘルパーウィルスを最後に細胞に導入する。細胞は、一般に、必要な程度までAA
Vパッケージング遺伝子がすでに補われている。好ましくは、rAAVベクターまた
はパッケージング遺伝子、さらに好ましくは、両者が安定に細胞に導入されてい
る。他の組み合わせが可能であることが容易に理解される。このような組み合わ
せは本発明の範囲内に含まれる。

【０１２１】 宿主細胞に必要な要素が提供されたら、rAAVベクターの複製およびパッケージ
ングを可能にするために、AAVの複製が許容される条件下において細胞を培養す
る。培養時間は、好ましくは、ピーク作製レベルに相当するように調節され、典
型的には、3〜6日である。次いで、rAAV粒子を回収し、それらを作製するために
使用した細胞から単離する。

【０１２２】 必要に応じて、rAAV粒子を濃縮、ヘルパーウィルス粒子を欠失または被検者に
投与するのに好適にするようにrAAVウィルス調製物をさらに処理することができ
る。例示的な技法はAtkinson et al.を参照（国際公開公報第99/11764号）。精
製技法には、密度勾配遠心分離およびクロマトグラフィー技法が含まれてもよい
。感染性ヘルパーウィルス活性の低下には、当技術上既知の過熱処理またはpH処
理による不活性化を含んでもよい。他の処理には、濃縮、ろ過、ダイアフィルト
レーションまたは好適な緩衝液もしくは製薬学的担体との混合を含んでもよい。
抗原量および遺伝子量の均一性、並びに混在するヘルパーウィルスの相対的な割
合などの、バッチの本質的な特徴を保持する単位用量および多容量型分布量に調
製物を分割することができる。

【０１２３】 ウィルス調製物の感染力価を求める種々の方法は当業者に既知である。例えば
、力価を求める1つの方法は、Atkinson et al.（国際公開公報第99/11764号）に
提供されている高スループット力価アッセイである。この迅速で、定量的な方法
によって求められるウィルス力価は、さらに古典的な技法によって求められる力
価と密に対応している。しかしまた、この高スループット方法は多数のウィルス
複製反応を同時に処理し、分析することができるので、例えば、ウィルスの複製
および感染が許容される細胞株または許容されない細胞株のスクリーニングを含
む、多数の他の用途がある。

【０１２４】 感染性アデノウィルスによりヘルパー機能を提供するのに好ましい方法は、効
率的なAAV作製に必要なヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウィル
スミニプラスミドを使用する（Ferrari et al. (1997) Nature Med. 3: 1295; X
iao et al. (1998) J. Virology 72: 2224）。アデノウィルスミニプラスミドで
得られるrAAV力価は、野生型アデノウィルス感染の従来の方法で得られるものよ
り40倍高い(Xiao et al. (1998) J. Virology 72: 2224)。この方法は、アデノ
ウィルスとの同時トランスフェクションを実施する必要性を明らかにしている（
Holscher et al. (1994) J. Virology 68: 7169; Clark et al. (1995) Hum. Ge
ne Ther. 6: 1329; Trempe and Yang (1993), in, Fifth Parvovirus Workshop
(Crystal River, FL)。

【０１２５】 複製能力AAVの作製を妨害するために別個の発現カセット上でrepおよびcap遺
伝子を分割する方法（Allen et al. (1997) J. Virol. 71: 6816）およびパッケ
ージ細胞株を使用する方法（Gao et al. (1998)Human Gene Therapy 9: 2353; I
noue et al.(1998) J. Virol. 72: 7024）を含むが、これらに限定されない、rA
AVストックを作製する他の方法が記載されている。

【０１２６】 本発明は、本発明のＢドメイン欠失第VIII因子トランスジーンおよびＢドメイ
ン欠失第VIII因子発現カセットを保有する高力価rAAVベクターストックを作製す
る方法を提供する。rAAV/第VIII因子を作製する以前の試みは、インビボにおい
て投与するのに十分な力価のウィルスを作製できなかったので、これらの結果は
驚くべきである。

【０１２７】 高力価rAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子ストックを作製する本発明の方法は、
上記のように、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を
保有するrAAVベクターをパッケージング細胞に感染することを含む。rAAVベクタ
ーはパッケージング細胞によって複製、パッケージングされ、rAAV粒子を回収し
てAAVストックを形成する。このストックは、1ミリリッターあたり少なくとも約
10⁴、約10⁵、約10⁶、約10⁷、約10⁸、約10⁹、約10¹⁰、約10¹¹、約10¹²または約10 ¹³ 粒子の力価を有する。

【０１２８】 rAAVストックを作製するのに好ましいパッケージング細胞は当業者に既知であ
り、293細胞（例えば、Samulski et al. (1989) J. Virology 63: 3822; Ferrar
i et al. (1997) Nature Med. 3: 1295; Xiao et al. (1998) J. Virology 72:
2224参照）を含むが、これらに限定されない、アデノウィルスヘルパーウィルス
またはアデノウィルスミニプラスミドを含む方法によってrAAVを作製するパッケ
ージング細胞を含む。他のrAAVパッケージング細胞には、Gao et al. (1998)Hum
an Gene Therapy9: 2353およびInoue et al. (1998) J. Virol. 72: 7024によっ
て記載されているものを含む。

【０１２９】 ［C. 遺伝子導入技術］ 本発明の方法は、インビトロ（例えば、第VIII因子タンパク質を作製するまた
はエクスビボにおける遺伝子治療のため）およびインビボにおいて分裂細胞およ
び非分裂細胞を含む、広域的な宿主細胞に異種ヌクレオチド配列を送達する手段
を提供する。本発明のベクター、方法および製薬学的組成物は、必要としている
被検者にタンパク質もしくはペプチドを投与する方法または治療方法等に有用で
ある。この方法では、該タンパク質またはペプチドは被検者においてインビボで
作製される。被検者はこのタンパク質またはペプチドに欠陥があるので、または
被検者におけるこのタンパク質またはペプチドの産生は、治療方法等としておよ
び以下に詳細に説明するように、多少の治療効果を与えることができるので、被
検者は該タンパク質またはペプチドを必要としていてもよい。

【０１３０】 一般に、本発明は、上記のrAAVベクターによってパッケージングすることがで
きるＢドメイン欠失第VIII因子をコードする任意の異種核酸を送達するために使
用することができる。Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド
配列は、治療効果を得るために、被検者に投与することができる。例えば、Ｂド
メイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列は、血液凝固を増強（
例えば、改善、増大、増加）するために投与することができる。

【０１３１】 ［D. 被検者、製薬学的組成物、ワクチンおよび投与方法］ 本発明は、獣医学的用途および医学的用途における用途を見出している。好適
な被検者は鳥類および哺乳類を含み、哺乳類が好ましい。本明細書において使用
する「鳥類」という用語には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥お
よびキジが含まれるが、それらに限定されない。本明細書において使用する「哺
乳類」という用語には、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ
等が含まれるが、それらに限定されない。ヒト被検者が最も好ましい。ヒト被検
者には新生児、幼児、少年少女および成人が含まれる。

【０１３２】 特定の実施態様において、本発明は、製薬学的に許容されうる担体または他の
医薬品、薬剤、担体、補助剤、希釈剤等中に本発明のrAAV粒子を含有する医薬製
剤を提供する。注射用は、担体が典型的には、液体である。他の投与方法用には
、担体は、発熱物質不含滅菌水または発熱物質不含滅菌リン酸緩衝生理食塩液な
ど、固体であっても、液体であってもよい。吸入投与用には、担体は呼吸可能で
あり、好ましくは、固体または液体の粒子形態である。注射媒体として、安定剤
、塩または生理食塩液および/または緩衝液などの、注射溶液に慣例である添加
剤を含有する水を使用することが好ましい。

【０１３３】 「製薬学的に許容されうる」は、生物学的およびその他の望ましくないことの
ない材料を意図している。すなわち、材料はいかなる望ましくない生物作用を生
ずることなく、ウィルスベクターと共に被検者に投与することができる。従って
、このような製薬学的組成物は、例えば、半ビボで細胞をトランスフェクション
する際または被検者にウィルス粒子を直接投与する際に使用することができる。

【０１３４】 本発明は、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を細
胞に送達する方法をさらに提供する。インビトロでの方法では、ウィルスは、当
技術上周知の標準的なウィルス形質導入方法によって細胞に投与することができ
る。好ましくは、ウィルス粒子は、特定の標的細胞に適当な標準的な形質導入方
法により、適当な感染効率で細胞に加えられる。投与するウィルスの力価は、標
的細胞の種類および特定のウィルスベクターにより異なってもよく、不当な実験
を行うことなく、当業者が求めることができる。または、本発明のrAAVベクター
の投与は、当技術上既知のいかなる任意の他の手段によって実施することができ
る。

【０１３５】 本発明のウィルスベクターを投与する細胞は、神経細胞（抹消および中枢神経
系の細胞、特に脳細胞を含む）、網膜細胞、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器
）、筋肉細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば
、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾細胞、線維芽細胞、内皮細胞、生殖細胞等を含
むが、これらに限定されない、いかなる種類であってもよい。さらに、細胞は、
上記のように、いかなる種起源であってもよい。

【０１３６】 本発明の特定の態様において、細胞を被検者から取り出し、rAAVベクターを細
胞に導入し、次いで細胞を被検者に戻す。半ビボで治療するために被検者から細
胞を取り出し、次に被検者に戻す方法は当業者に既知である。または、Ｂドメイ
ン欠失第VIII因子を発現する別の被検者由来の細胞または培養細胞にrAAVベクタ
ーを導入し、第VIII因子治療を必要としている被検者に細胞を投与する。半ビボ
遺伝子治療に好適な細胞には、肝細胞、神経細胞（中枢および末梢神経系の細胞
、特に脳細胞を含む）、膵臓細胞、脾細胞、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細
胞）、ケラチン細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋原細胞、造血幹細胞および骨髄間
質細胞が含まれるが、それらに限定されない。

【０１３７】 本発明のさらに別の態様は、本発明のウィルス粒子でインビボにおいて被検者
を治療する方法である。必要としている被検者または動物への本発明のrAAV粒子
の投与は、ウィルスベクターを投与する当業者に既知の任意の手段によることが
できる。本明細書において使用する「治療的に有効な」量は、第VIII因子欠失に
関連する症状（例えば、血液凝固）の少なくとも1つを軽減（例えば、緩和、減
少、低下）するのに十分であるrAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子ベクターの量で
ある。Ｂドメイン欠失第VIII因子を投与する利点がその不利益を上回る限り、Ｂ
ドメイン欠失第VIII因子の投与が第VIII因子欠失症状をなくす必要はない。

【０１３８】 ヒト血漿中の第VIII因子の正常範囲は約100〜200ng/mlである。正常の5％程度
の血漿第VIII因子濃度で正常の血液凝固が見られる。正常血漿第VIII因子濃度の
1％でも治療効果を観察することができる（Nilsson et al. (1992) J. Int. Med
. 232: 25-32; Lpfgvist et al. (1997)J. Int. Med. 241: 395-400; Petrini e
t al. (1991) Am. J. Ped. Hem. Onc. 13: 280-287およびHematology-Principle
s and Practice, 3rd ed. (2000) Hoffman, R: ed., 1884-1885ページ）。本発
明のrAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子ベクターを被検者に投与することにより、
好ましくは、血漿第VIII因子濃度は正常な第VIII因子濃度の少なくとも約1％と
なり、さらに好ましくは正常の少なくとも約5％になり、よりさらに好ましくは
正常の少なくとも約10％になり、なおさらに好ましくは正常の少なくとも約20％
になり、なおよりさらに好ましくは正常の少なくとも約25％になる。

【０１３９】 本発明の特に好ましい実施態様において、関心のあるヌクレオチド配列は被検
者の肝臓に送達される。肝臓への投与は、静脈内投与、門脈内投与、胆嚢内投与
、動脈内投与および肝実質細胞への直接注射を含むが、これらに限定されない当
技術上既知の任意の方法によって実施できる。

【０１４０】 従って、本発明のさらに別の態様は、血友病Aを含む、第VIII因子欠陥患者を
治療する方法である。本明細書において使用する、第VIII因子欠陥は欠陥のある
タンパク質またはタンパク質の欠失による。好ましくは、被検者はヒト被検者で
ある。本発明の方法によると、被検者は、生物学的に有効な量の第VIII因子を産
生するのに十分な量のrAAV/第VIII因子ベクターを1つ以上の組織に投与される。
好ましくは、組織は脳、膵臓、脾臓、肝臓、細網内皮系(RES)、リンパ系または
筋肉または骨髄/間質細胞であり、最も好ましくは、肝臓である。

【０１４１】 好ましい実施態様において、rAAVベクターは肝臓に投与される。好ましくは、
細胞（例えば、肝細胞）はrAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子ベクターに感染され
、Ｂドメイン欠失第VIII因子タンパク質を発現し、上記に規定した治療的に有効
な量のタンパク質を循環系に分泌する。第VIII因子を投与する利点がその不利益
を上回る限り、第VIII因子欠失症状をなくす必要はない。

【０１４２】 例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口（例
えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内および関節内）投与等並びに組織または器官
への直接注射、または気管内（intratrahecal)、直接的な筋肉内、心室内、静脈
内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が挙げられる。注射剤は、溶液剤または懸濁
剤、注射時に溶液剤または懸濁剤に調製するのに好適な固形剤、または乳剤とし
て、従来の形態で製剤化することができる。または、例えば、デポ剤または徐放
性製剤の形態で、全身ではなく局所的にウィルスを投与することができる。

【０１４３】 好ましい実施態様において、本発明のrAAVは、静脈内投与によって投与され、
さらに好ましくは、静脈内投与によって肝臓に投与される（以下に記載）。

【０１４４】 用量は、投与様式、治療対象の疾病または状態の重症度、患者個人の状態、特
定のウィルスベクターおよび送達される遺伝子、および被検者の種、被検者のサ
イズおよび体重に依存し、通常の方法で設定できる。循環系において治療的に有
効な量を達成する例示的な用量は、産生されるトランスジーンのレベル、タンパ
ク質の活性等に応じて、約10⁸、約10⁹、約10¹⁰、約10¹¹、約10¹²、約10¹³、約10 ¹⁴ 、約10¹⁵感染単位である。

【０１４５】 本発明は、例示のみの目的で本明細書に含まれ、本発明を制限する意図のない
実施例を参照して本明細書において例示される。

【０１４６】 ［実施例１：ベクターの構築］ ヒトＢドメイン欠失第VIII因子または強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ)を
発現するrAAVプラスミドを構築した。簡単に説明すると、pmt2LA (Pittman et a
l. (1993) Blood 81:2925; Dr. D. Pittman, Genetics Institute, Cambridge,
MAにより提供されたものである) をPCRで増幅して、Ｂドメイン欠失第VIII因子
の全長の配列をコードする4435 bpの断片を作製した。4435 bpのＢドメイン欠失
第VIII因子を、B型肝炎ウィルスのスペーサー配列(pDLZ2) またはエンハンサーI
(EnhI)およびスペーサー配列 (pDLZ6) (Guo et al. (1991) J. Virology 65:668
6)を含有するカセットに挿入した。pDLZ6の配列は、Ｂドメイン欠失第VIII因子
タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２にも示す）と共に図1（配列番号１）に
示す。最初の19アミノ酸残基はシグナルペプチドであり、Ｂドメイン欠失ヒト第
VIII因子前駆体が小胞体内に転位する前に切断される。pDLZ6中のＢドメイン欠
失ヒト第VIII因子をpTR-EGFP (R.Haberman, UNC Gene Therapy Center, Chapel
Hill, NC) のEGFP cDNAと交換して、pDLZ8を構築した。構築物は全てTkポリアデ
ニル化シグナルを使用し、pAAV/cFIXの AAV ITRs を使用して隣接した。

【０１４７】 pDLZ6構築物は、図1（および配列番号１）のヌクレオチド(nt)位置約1〜146
および4916〜5084の2つのITRs、ヌクレオチド位置約150〜278のB型肝炎ウィルス
EnhIエンハンサー因子、ヌクレオチド位置約279〜399のスペーサー配列、ヌクレ
オチド位置約419〜4835のＢドメイン欠失ヒト第VIII因子cDNA並びにヌクレオチ
ド位置約4804〜4914のTkポリA配列を含有する。

【０１４８】 ［実施例２：細胞および培養］ 293、HeLaおよびHepG2細胞を、10％ウシ胎仔血清(FBS, Gibco/BRL, Gaithersb
urg, MD) を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM, Gibco/BRL, Gaithersbur
g, MD) 中で、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を加えた場合
または加えない場合でにおいて、37℃、5％のCO₂において、培養した。FBSは55
℃において30分間不活性化した。これらの条件下では、第VIII因子タンパク質お
よび活性はFBS中では検出されなかった。

【０１４９】 ［実施例３：rAAV作製および精製］ 3つのプラスミドトランスフェクションスキームを使用してrAAVを作製した。
簡単に説明すると、リン酸カルシウム沈降法を使用して、低密度分布状態の293
細胞にrAAVベクタープラスミド、AAVヘルパープラスミドpXX2 (Xiao et al. (19
98) J. Virology 72:2224)およびアデノウィルスヘルパープラスミドpXX6を同時
トランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、細胞を回収し、
凍結融解を3回反復して溶菌し、超音波処理して、rAAVビリオン粒子を遊離させ
た。硫酸アンモニウム沈降後、ウィルス粒子を精製し、セシウム密度勾配遠心分
離を2回実施して濃縮した。ドット-ブロットでウィルス粒子を力価検定し、rAAV
/ヒト第VIII因子ピーク濃度勾配分画を集めし、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で透
析して、-20℃で保存した。

【０１５０】 ［実施例４：Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子のインビトロにおける発現］ 2×10⁵の293またはHepG2細胞を6ウェルプレートの各プレートでプレート培養
した。24時間のプレート培養後、アデノウィルス(MOI＝1)が存在する場合または
存在しない場合において、rAAVウィルス粒子/細胞(MOI＝10)を加えて1時間おい
て細胞を形質導入した。細胞培養培地を分析するために回収し、感染後24時間ご
とに新鮮な培地と交換した。ヒト第VIII因子発現および機能をアッセイするため
に使用した全ての培地について、第VIII因子を含有しないかどうかをスクリーニ
ングした。

【０１５１】 ［実施例５：ヒト第VIII因子のタンパク質機能および阻害剤の活性］ rAAV由来ヒト第VIII因子タンパク質を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA、簡単
には、モノクローナルヒツジ抗-ヒト第VIII因子抗体）(Affinity Biological, I
nc., Canada)で検出して、捕獲抗体として使用した。ペルオキシダーゼ接合ヒツ
ジ抗-ヒト第VIII因子抗体(Affinity Biological, Inc., Canada)を二次抗体とし
て使用した。プールした正常なヒト血漿の連続希釈液から作成した標準曲線によ
り第VIII因子レベルを算出した(UCRP, Fisher Scientific)。ヒト第VIII因子のE
LISAによる再現性のある感度は0.3ng/mlであった。

【０１５２】 rAAV由来Ｂドメイン欠失第VIII因子の機能を活性化部分トロンボプラスチン時
間(APTT)およびCoaest(Chromgenix AB, Sweden).で試験した。FIX欠陥血漿(Paci
fic Hemostasis)ではなく第VIII因子欠陥血漿を使用したことを除いて、APTTを
実施した。Coatestは、製造業者の指示に従って実施した。プールした正常なヒ
ト血漿の連続希釈液を使用して、第VIII因子活性の標準曲線を作成した。

【０１５３】 Bethesda阻害剤アッセイ(BIA)を使用して、マウス血清中の抗-ヒト第VIII因子
阻害剤を検出した(Kasper et al. (1975) Thrombosis et Diathesis Haemorrhag
ica 34:612)。簡単に説明すると、マウス血漿を55℃において30分間インキュベ
ーションして、内因性マウス第VIII因子を不活性化した。次いで、処理したマウ
ス血漿の連続希釈液に等容量の正常なヒトプール血漿を混合し(UCRP, Fisher Sc
ientific)、37℃において2時間インキュベーションした。APTTを実施して、不活
性化したマウス血漿と共にインキュベーションしたUCRP中の残存第VIII因子活性
を求めた。抗-ヒト第VIII因子阻害剤の力価は、確立したBIA標準曲線により、各
試料の残存第VIII因子活性から算出した。

【０１５４】 ［実施例６：動物の世話および処理手法］ マウスは、UNC Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドライ
ンに準拠して、チャペルヒルのノースカリフォルニア大学の動物施設で飼育した
。各動物の体重を計測し、ウィルスを投与する前に、ケタミン(100mg/kg)とキシ
ラニン(5mg/kg)の混合物を使用して鎮静化した。切開用顕微鏡下において、1cm
の垂直正中線腹部切開を実施した。2×10¹⁰または2×10¹¹の粒子のrAAV/DLZ6ま
たはrAAV/DLZ8をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)に加えたものをHarvard Apparatus
ポンプ22を使用して、門脈を介して2〜5分かけて肝臓に注射した。眼窩後方静脈
叢を介して血液を採取し、血漿を-80℃で保存した。注射の30週後に処理した3匹
のマウスについて組織学およびDNA/RNA分析を実施するために組織/器官を採取し
た。採取した組織には、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、心臓、脳、脊髄、腸、筋肉、
リンパ節および骨髄が含まれる。組織は、処理する前に、-80℃で凍結する（DNA
およびRNAを単離するため）か、または10％の中性緩衝ホルマリンで終夜固定し
た。

【０１５５】 ［実施例７：DNAの単離および分析］ 高分子量ゲノムおよび低分子量DNA(Hirt)を単離し、サザンブロットおよびDNA
PCRに使用した。プラスミドpDLZ6の29.5pg、5.9pg、1.18pg、0.118pgおよび0.0
59pgを、対照マウス肝臓の20μgのゲノムDNAに添加し、マウス肝細胞あたり、そ
れぞれ、5、1、0.2、0.02および0.01コピーのrAAV/DLZ6に相当するコピー数標準
を作成した。各ITRの内側でプラスミドpDLZ6を切断して、4.6kbのDLZ6ゲノムを
遊離する制限酵素SphIでゲノムDNAを消化して、次いでアガロースゲルで分離し
た。ブロットに³²I-標識ヒト第VIII因子プローブをハイブリダイゼーションした
。

【０１５６】 センスプライマー（5'-AACCTTTACCCCGTTGCTCG-3'）およびアンチセンスプライ
マー（5'-GTCTTTTTGTACACGACTGAGG-3'）を使用して、450 bp のrAAV/DLZ6ベクタ
ーユニーク断片を増幅した。PCR条件は、95℃、5分、次に95℃、2分、50℃、1分
、72℃、1分を1サイクルとして30サイクルとした。

【０１５７】 ［実施例８：RNA抽出、ノーザンブロットおよび逆転写（RT）PCR］ 培養細胞または凍結したマウス組織から抽出した総細胞RNAを同様にノーザン
ブロットまたはRT-PCRに使用した。センスプライマー（5'-TTCTCCCCAATCCAGCTGG
-3')）およびアンチセンスプライマー（5'-GAGTTATTTCCCGTTGATGG-3')）を使用
して、534 bpのユニークヒト第VIII因子cDNA断片を増幅した。PCR条件は95℃、2
分、次に95℃、1分、55℃、1分、72℃、1分を1サイクルとして30サイクルとした
。βアクチンプライマーペアーを、記載した各試料のRT-PCRの内部対照として使
用した。

【０１５８】 ［実施例９：組織学的分析］ ホルマリン固定した組織をアルコール脱水して、パラフィン包埋した。組織を
各々6μmの厚さに切片化して、キシレン中で脱パラフィンし、特級(graded)エタ
ノールで再度水和し、さらにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。

【０１５９】 ［実施例１０：rAAV Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子のパッケージング］ Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子、pDLZ2およびpDLZ6（図2）を発現する2つのrA
AVベクターを構築して、B型肝炎ウィルスEnhIエンハンサー因子の利用性を試験
した。トリプルプラスミドトランスフェクションおよび塩化セシウム密度勾配遠
心分離を使用して、1ミリリッターあたり10¹²を超えるrAAV/ DLZ6 またはrAAV/D
LZ2粒子が産生された。rAAVビリオンの複製を確認するために、HeLaまたはHepG2
細胞にrAAV (MOI＝10)およびアデノウィルス5型(MOI＝1)を形質導入した後、低
分子量ウィルスDNAを単離した。図3に示すように、トランスジーンに特異的なプ
ローブを使用して、予測されるモノマーおよびダイマー複製型のrAAV/DLZ6およ
びrAAV/DLZ2を検出した。rAAV/DLZ6ビリオンDNAの単離は、予測されたモノマー
サイズがパッケージングされたことを確認するものである（図3）。形質導入後
、EnhI配列を含有するrAAV/DLZ6は、エンハンサー因子を欠失するrAAVと比較し
て、HeLaおよびHepG2のmRNA転写物が30倍増加した（データは示していない）。

【０１６０】 これらの結果に基づいて、本発明者らは、pDLZ6由来のベクターを使用して第V
III因子機能的アッセイを実施した。ヒト第VIII因子タンパク質の発現は、トラ
ンスフェクションおよび形質導入から24時間経過時に採取した細胞培養培地の第
VIII因子タンパク質をELISA測定することによって実施した。機能的ヒト第VIII
因子の評価は、APTTおよびCoatestアッセイを使用して実施した（表1）。従って
、組み換えウィルスは、野生型よりサイズが大きいにもかかわらず、効率的にパ
ッケージングされ、機能的Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子を産生した。これらの
結果に基づいて、rAAV/DLZ6をインビボ分析に使用した。

【０１６１】

【表１】 **1×10⁶の293細胞にMOI＝10のrAAV/DLZ6またはrAAV/DLZ8 (EGFP)を形質導入し
た。ヒト第VIII因子アッセイでは24時間経過時に培地を採取した。培地オーバー
レイ293/EGFPを対照として使用した。UCRPは標準として使用し、200ng/mlのヒト
第VIII因子抗原および1000 mu/mlのCoatest活性に相当する。APTTは正常な第VII
I因子活性に対する割合をいう。結果は3回の実験の平均として表し、各実験は3
本セットで実施した。

【０１６２】 ［実施例１１：マウスにおけるヒト第VIII因子の長期発現］ rAAV/DLZ6を4週齢の雄マウスまたは6週齢のNOD/scidマウスの門脈に注射した
。2週間ごとに眼窩後方静脈叢を介して血液試料を採取した。Ｂドメイン欠失ヒ
ト第VIII因子タンパク質は、AAVの注射から4週間後まで、2×10¹⁰のrAAV/DLZ6を
投与した2匹のマウスの血漿中には検出されなかった。ヒト第VIII因子レベルは
、一旦検出されると、正常なヒトレベルの第VIII因子レベル(200ng/ml)の2〜3％
が11ヶ月以上も維持された。一方、平均42ng/mlのＢドメイン欠失ヒト第VIII因
子、すなわち正常なヒト第VIII因子レベルの21％が注射の1週間後に2×10¹¹のrA
AV/DLZ6を投与した4匹のマウスの血漿中で検出された（図4、パネルA）。抗-ヒ
ト第VIII因子阻害剤力価は、注射から9〜12週間後に最大力価に増加した。阻害
剤の出現は、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子血漿タンパク質の低下と一致してい
た。予測されるように、EGFPトランスジーンを発現するrAAVを投与した対照マウ
スの血漿では、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子または抗-ヒト第VIII因子阻害剤
のどちらも検出されなかった（データは示していない）。

【０１６３】 Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子タンパク質の発現を十分に評価するために、免
疫無能NOD/scidマウスに1.5×10¹¹のウィルスを門脈注射により投与した。ELISA
によって測定したＢドメイン欠失ヒト第VIII因子の血漿レベルは、注射後10日目
に35ng/ml(正常レベルの17％)に達し、55ng/ml(正常レベルの27％）まで増加し
た（図4、パネルB)。予測されるように、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子は、非
感染（mock infected)scid マウスの血漿では検出されなかった（データは示し
ていない）。

【０１６４】 ［実施例１２：rAAVベクターの分布および組織学的分析］ rAAVベクターを投与したマウスを注射後30週めに処理した。全身投与後、抹消
血、肝臓、脾臓、リンパ節、腎臓、腸、精巣、皮膚、筋肉、心臓、肺、大動脈、
骨髄、脳および脊髄を分析して、ベクターの分布を測定した。ベクターDLZ6に特
異的なプライマーペアーを使用したDNA PCRは450bpの産物を増幅した。ベクター
ゲノムは、門脈注射後30週では肝臓試料からだけ検出された（図5、パネルA）。
RT-PCRは、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子cDNAの534bpの断片を増幅するプライ
マーペアーを使用した。肝臓から単離されたRNAだけが適当なPCR産物を作製し、
これはDNA PCRの結果を確認するものである（図5、パネルB)。250bpのβアクチ
ン断片の増幅をRT/PCRの内部対照として使用し、無傷で等しい量のRNAを示し、R
T-PCRにおいて各試料に使用した（データは示していない）。DNA PCRおよびサザ
ンブロット分析を使用することによって、1細胞あたり推定0.05コピーのrAAV/DL
Z6ゲノムが、2×10¹¹のrAAV粒子を投与した動物において形質導入後30週めに存
在した（図5、パネルA&C)。この結果は、以前の報告（(Snyder et al. (1999) N
ature Medicine 5:64; Xiao et al. (1998) J. Virology 72:10222）と一致して
いる。肝臓、脾臓、消化管、生殖腺、脳、心臓および肺に大きな異常は観察され
なかった（データは示していない）。

【０１６５】 ［実施例１３：肝細胞におけるrAAVの分子分析］ 30週めの処理時に、低分子量DNA（Hirt DNA）および高分子量ゲノムDNAをrAAV
/DLZ6を投与したマウスのいくつかの器官から単離した。各ITRの内側で切断する
制限酵素SphIおよびサザンブロット法を使用して、再配列されていないrAAV/DLZ
6ゲノムを高分子量分画においてのみ検出した（図5、パネルC)。約0.05ベクター
ゲノムコピー/細胞が高分子量DNA分画で検出された。DNA PCRは、rAAV/DLZ6ベク
ターゲノムシグナルはHirt DNA分画には検出されないことを確認している（デー
タは示していない）。PCRアッセイの感度は0.001コピー/細胞である。

【０１６６】 ［実施例１４：第VIII因子ノックアウトマウスにおける表現型の矯正］ 第VIII因子をコードする遺伝子が相同組み換えによって「ノックアウト」され
ており、従って血友病Aに対応する表現型を生じているマウスにrAAV/DLZ6を投与
した。先の実施例に記載するように、マウスに2×10²もしくは2×10¹¹粒子のrAA
V/DLZ6または対照ベクターを投与した。

【０１６７】 Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子の肝臓での発現を先の実施例に記載するように
測定した。また、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子の血漿レベルを、上記のように
、経時的にモニターした。第VIII因子活性の機能的アッセイ（例えば、Coatest)
も実施して、血漿中の機能的Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子タンパク質を測定し
た。rAAV/DLZ6処理したマウスを、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子の発現による
表現型の変化、すなわち、血友病に関連する表現型特徴の改善または矯正、（例
えば、凝固時間の改善）について経時的にモニターした。

【０１６８】 このように、rAAVベクターを使用したＢドメイン欠失ヒト第VIII因子の長期肝
臓発現（実施例11）は血友病動物における表現型の改善に関連している。

【０１６９】 ［実施例１５：血友病のイヌにおける表現型の矯正］ 血友病のイヌにＢドメイン欠失イヌ第VIII因子（イヌ第VIII因子）を保有する
rAAVベクターを投与する。Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子発現カセットは、本質
的に、ヒト第VIII因子発現カセットについての実施例1に記載されており、隣接
するAAV ITRs、EnhIエンハンサー、非コード領域およびTkポリ(A)配列を含有す
る。プラスミドpDLZ10はイヌ第VIII因子発現カセットをコードする。pDLZ10のヌ
クレオチド配列は、それがコードするＢドメイン欠失イヌ第VIII因子のアミノ酸
配列と共に図６に示す。この構築物は、図1（配列番号１）のヌクレオチド（nt
）位置約1〜144および4885〜5048の2つのITRs、nt位置約149〜278のB型肝炎ウィ
ルスEnhIエンハンサー、nt位置約279〜399のスペーサー配列、nt位置約428〜479
0のBBDイヌ第VIII因子cDNAおよびnt位置約4804〜4884のポリA配列を含有する。
イヌに10¹³もしくは10¹⁴粒子のrAAV/イヌ第VIII因子または対照ベクターを門脈
を介して注入した。同じ検討または別の検討において、同じ力価のrAAVベクター
を直接肝血管注射によって投与する。

【０１７０】 Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子の肝臓での発現を先の実施例に記載するように
測定する。また、Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子および第VIII因子阻害剤の血漿
レベルを上記のように経時的にモニターする。第VIII因子活性の機能的アッセイ
（例えば、Coatest)も実施して、血漿中の機能的Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子
タンパク質の発現を測定する。rAAV/Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子処理したイ
ヌを、Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子の発現による表現型の変化、すなわち、血
友病に関連する表現型特徴の改善または矯正、（例えば、凝固時間の改善）につ
いて経時的にモニターした。

【０１７１】 このように、rAAVベクターを使用した、Ｂドメイン欠失イヌ第VIII因子の血友
病イヌの肝臓への送達は血友病Aの治療のために評価される。

【０１７２】 ［実施例１６：rAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子の安定なプロデューサー細胞
株の作製］ 一般に、rAAVプロデューサー細胞株は、細胞にベクタープラスミドをトランス
フェクションし、次に抗生物質（典型的には、G418、ヒグロマイシンまたはヒス
チジノール）で選択し、個々のコロニーをクローニングすることによって作製さ
れる。最初に、コロニーをベクターの複製についてスクリーニングする。次いで
、アデノウィルス感染後にベクターの高レベル複製を示すクローンを感染性ベク
ターの作製について試験する。プラスミドＢドメイン欠失第VIII因子(30μg)をH
ela C12パッケージング細胞株にエレクトロポレーション（Potter et al., 1984
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7161-7165）によってトランスフェクション
した。C12細胞株は、アデノウィルスヘルパーの感染による誘導時まで転写が静
止状態にあるAAV2 repおよびcap遺伝子を含有する（Clark et al., 1995; Clark
et al., 1996, Gene Therapy 3:1124-1132）。トランスフェクションの24時間
後に、細胞をトリプシン処理し、プレートあたり5×10³〜5×10⁴の細胞の密度で
100mmのプレートで再度培養した。10％ウシ胎仔血清および300μg/mlのヒグロマ
イシンBを含有するDMEM中で細胞を選択した。Atkinson et al., 1998, Nucleic
Acid Res. 26:2821-2823に記載されているように、薬物耐性細胞クローンを単離
、増殖し、感染性AAV第VIII因子ベクターを産生する能力を試験し、比較した。
このようなプロデューサー細胞クローン（C12〜55）をさらにベクター作製にさ
らに使用した。作製、精製および滴定は、本質的に、本明細書およびAtkinson e
t al. (国際公開公報第 99/11764号)に記載されているように実施した。

【０１７３】 本明細書に記載されている全ての文献および特許出願は、本発明が属する当技
術の当業者のレベルを暗示している。全ての文献および特許出願は、個々の文献
または特許出願各々が参照として組み入れられていることを具体的および個別に
示しているのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられている。

【０１７４】 上記の発明は、理解を明らかにするために、例示および実施例により幾分詳細
に記載されているが、ある種の変更および改良が添付の請求の範囲内で実施でき
ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＢドメイン欠失第VIII因子をコードするプラスミドpDLZ6の配列を提供す
る。この配列は配列番号１にも記載されている。発現カセットは、左側および右
側AAV逆方向反復塩基配列(ITR;ヌクレオチド約1〜146と4916〜5084）、B型肝炎
ウィルスEnhIエンハンサー（ヌクレオチド約150〜278)、スペーサー配列（ヌク
レオチド約279〜399)、ヒトＢドメイン欠失第VIII因子（ヌクレオチド約419〜48
35）およびTKポリ(A)配列（ヌクレオチド約4840〜4914)を含有する。ヌクレオチ
ド419〜4835（配列番号２）によってコードされるヒトＢドメイン欠失第VIII因
子のアミノ酸配列も示す。

【図２】 rAAV/Ｂドメイン欠失第VIII因子構築物の略図である。Ｂドメイン欠失ヒト第V
III因子を発現する2つのrAAV構築物、pDLZ2（2つのITRsを含有する4965 bp、wt-
AAVの107％）およびpDLZ6(2つのITRsを含有する5089 bp、wt-AAVの109％）のマ
ップを示す。ITRはAAV逆方向反復塩基配列であり、EnhIはHBVのエンハンサーIで
あり、NCSはスペーサー配列であり、P(A)はTKポリアデニル化配列である。

【図３】 rAAV/Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子の複製およびパッケージングを示す。低
分子量DNA（Hirt DNA）をrAAV/DLZ2、DLZ6およびDLZ8(対照)形質導入HeLaおよび
HepG2細胞から単離し、アガロースゲルで分離し、Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因
子cDNAでプロービングした。左から右に、対照レーン：1-HepG2+rAAV/DLZ8、2-H
eLa+rAAV/DLZ8、DLZ2：1-HeLa+rAAV/DLZ2、2-HepG2+rAAV/DLZ2、DLZ6：1-HeLa+r
AAV/DLZ6、2-HepG2+rAAV/DLZ6および未被覆rAAV/DLZ6ビリオンDNA。

【図４】 マウスにおけるrAAV/Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因子のインビボにおける発現
を示すグラフである。精製rAAV/DLZ6ウィルスを門脈経由でマウスに投与した。E
LISAを利用して、血漿中のヒト第VIII因子レベルを測定し、BIAを利用して、抗-
ヒト第VIII因子阻害剤力価を測定した。パネルAは、2×10¹¹のrAAV/DLZ6を投与
したマウス（n＝4)の血漿中のＢドメイン欠失ヒト第VIII因子抗原レベルおよび
抗-ヒト第VIII因子阻害剤力価である。パネルBは、1.5×10¹¹のrAAV/DLZ6を投与
したNOD/scidマウス(n＝4)のＢドメイン欠失ヒト第VIII因子抗原測定値である。
実線は、ヒト第VIII因子抗原レベルで、破線は抗-Ｂドメイン欠失ヒト第VIII因
子阻害剤力価である。

【図５】 rAAV/DLZ6を注射したマウスの分子分析を示す。パネルAは、PCRのために設計
したプライマーの図である。パネルBは、門脈注射によるマウスのrAAVベクター
分布をしめすＤＮＡ ＰＣＲの結果である。rAAV/DLZ6特有の450bpの断片をDNA
PCRで増幅して、肝注射後のrAAV分布を試験した。ネガティブコントロールは、
対照マウスの肝臓DNAである。DNA試料は、高用量のrAAV/DLZ6を投与したマウス
の脳、脊髄、筋肉、骨髄、心臓、肺、精巣、リンパ節、腎臓、腸、脾臓である。
肝臓/LDは、低用量のrAAV/DLZ6を投与したマウスの肝臓DNAである。肝臓HDは、
高用量のrAAV/DLZ6を投与したマウスの肝臓DNAである。標準曲線、細胞あたり、
それぞれ、5、1、0.2、0.1、0.01および0ゲノムコピー当量のプラスミドpDLZ6を
有する対照マウス肝臓のゲノムDNA。パネルCは、RT/PCRのために設計したプライ
マーの図である。パネルDは、対照動物および実験動物から単離した総RNAのRT-P
CR分析である。534 bpのＢドメイン欠失ヒト第VIII因子特異的断片を増幅するた
めにプライマーを設計した。RT対照は、高用量のrAAV/DLZ6を投与したマウス肝
臓から単離したRNAを使用した。陰性対照は、対照動物から単離したRNAを使用し
た。筋肉、脳、リンパ節、精巣、腎臓および脾臓のRNA試料は、高用量のrAAV/DL
Z6を投与したマウス由来であった。LDは、低用量のAAV/DLZ6を投与したマウスか
ら単離した肝臓RNAであり、HDは、高用量のAAV/DLZ6を投与したマウスから単離
した肝臓RNAである。パネルEは、Sph Iを使用した制限切断の図である。パネルF
は、実験動物から単離した高分子量ゲノムDNAとHirt DNAのサザンブロット分析
である。標準曲線：細胞あたり、それぞれ、5、1、0.2および0.02ゲノムコピー
当量のプラスミドpDLZ6を有する対照マウス肝臓のゲノムDNAである。HMWゲノムD
NAおよび低分子量wt肝DNAは、高用量rAAV/DLZ6を投与した動物から単離した。

【図６】 イヌＢドメイン欠失第VIII因子をコードするプラスミドpDLZ10（配列番号：3
）の配列を提供する。発現カセットは、左側および右側AAV逆方向反復塩基配列(
ITR;ヌクレオチド約1〜144と4885〜5048）、B型肝炎ウィルスEnhIエンハンサー
（ヌクレオチド約149〜278)、スペーサー配列（ヌクレオチド約279〜399)、イヌ
Ｂドメイン欠失第VIII因子（ヌクレオチド約428〜4790）およびTKポリ(A)配列（
ヌクレオチド約4804〜4884)を含有する。ヌクレオチド428〜4790によってコード
されるイヌＢドメイン欠失第VIII因子もこの図および配列番号：4に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:93 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バースタイン，ヘイム アメリカ合衆国ワシントン州98052，レド モンド，ノース・イースト・シックスティ セカンド・ストリート 14104 (72)発明者 リンチ，カーメル・エム アメリカ合衆国ワシントン州98028，ケン モア，セヴンティエイス・アヴェニュー， ノース・イースト 15016 (72)発明者 ステパン，アンソニー・エム アメリカ合衆国ワシントン州98116，シア トル，フォーティファースト・アヴェニュ ー，サウス・ウェスト 3211 (72)発明者 マンソン，キース アメリカ合衆国ワシントン州98103，シア トル，エヴァンストン・アヴェニュー 4422，エヌ＃ビー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 GA18 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA532 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA53

Claims (67)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも1つのエンハンサーと少なくとも1つのプロモータ
   ーとが作動可能に結合したＢドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオ
   チド配列を含有する組み換えアデノ随伴ウィルス(rAAV)ベクター。
2. 【請求項２】 スペーサーDNAをさらに含有する請求項1に記載のrAAVベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 前記rAAVが、血清型1と、血清型2と、血清型3と、血清型4と
   血清型5とからなる群から選択される、請求項1に記載のrAAVベクター。
4. 【請求項４】 前記Ｂドメイン欠失第VIII因子がヒトＢドメイン欠失第VIII
   因子である、請求項1に記載のrAAVベクター。
5. 【請求項５】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号２に示すアミノ酸配
   列を有するＢドメイン欠失第VIII因子をコードする、請求項4に記載のrAAVベク
   ター。
6. 【請求項６】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオチ
   ド配列中のヌクレオチド419位から4835位の配列を有する、請求項4に記載のrAAV
   ベクター。
7. 【請求項７】 前記プロモーターがAAV ITRである、請求項1に記載のrAAVベ
   クター。
8. 【請求項８】 請求項1に記載のrAAVベクターを製薬学的に許容されうる担
   体中に含有する医薬製剤。
9. 【請求項９】 肝臓選択的発現制御因子が作動可能に結合した第VIII因子を
   コードする異種ヌクレオチド配列を含有する組み換えアデノ随伴ウィルス(rAAV)
   ベクター。
10. 【請求項１０】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオ
    チド配列中のヌクレオチド419位から4835位の配列を有する、請求項9に記載のrA
    AVベクター。
11. 【請求項１１】 前記肝臓選択的発現制御因子が、α1ミクログロブリン/ビ
    クニンエンハンサーと、B型肝炎ウィルスEnhIエンハンサーと、B型肝炎ウィルス
    EnhIIエンハンサーと、ヒトアルブミンE_1.7エンハンサーとヒトアルブミンE₆エ
    ンハンサーとからなる群から選択される少なくとも1つのエンハンサーを含有す
    る、請求項9に記載のrAAVベクター。
12. 【請求項１２】 前記肝臓選択的発現制御因子が、配列番号１に示すヌクレ
    オチド配列中のヌクレオチド419位から4835位の配列を有するB型肝炎ウィルスEn
    hIエンハンサーを含有する、請求項9に記載のrAAVベクター。
13. 【請求項１３】 前記肝臓選択的発現制御因子が、B型肝炎ウィルスコアプ
    ロモーターと、マウスアルブミンプロモーターと、ヒトU1 snRNAプロモーターと
    単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーターとからなる群から選択され
    る少なくとも1つのプロモーターを含有する、請求項9に記載のrAAVベクター。
14. 【請求項１４】 前記肝臓選択的発現制御因子がTATAボックスと、CAATボッ
    クスと、GCボックスと、ATFボックスと、C/EBP結合部位と、HNF1結合部位と、HN
    F2結合部位と、HNF3結合部位と、HNF4結合部位とTGT3結合部位とからなる群から
    選択される少なくとも1つの転写因子結合部位を含有する、請求項9に記載のrAAV
    ベクター。
15. 【請求項１５】 前記異種ヌクレオチド配列が、プロモーターをコードする
    配列とポリアデニル化配列とをさらに含有する、請求項9に記載のrAAVベクター
    。
16. 【請求項１６】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオ
    チド配列中のヌクレオチド150位から4914位の配列を含有する、請求項9に記載の
    rAAVベクター。
17. 【請求項１７】 前記異種ヌクレオチド配列が配列番号２に示すアミノ酸配
    列をコードする、請求項9に記載のrAAVベクター。
18. 【請求項１８】 エンハンサーが作動可能に結合したＢドメイン欠失第VIII
    因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含有する組み換えアデノ随伴ウィルス
    （rAAV）ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、 （a）配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド419〜4835として与
    えられるヌクレオチド配列と、 （b）高度にストリンジェントな条件下において(a)のヌクレオチド配列にハ
    イブリダイゼーションし、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド
    配列と、 （c）遺伝コードの縮重により上記の(a)および(b)のヌクレオチド配列と異
    なり、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列と からなる群から選択される組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベクター。
19. 【請求項１９】 前記rAAVがスペーサーDNAをさらに含有する、請求項18に
    記載のrAAVベクター。
20. 【請求項２０】 Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド
    配列を含有する少なくとも約10¹²の組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベクタ
    ー粒子群を含有する組成物。
21. 【請求項２１】 Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列
    を細胞に送達する方法であって、肝臓選択的発現制御因子が作動可能に結合した
    Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含有する組み換
    えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベクターを該細胞に接触させるステップを含む方
    法。
22. 【請求項２２】 前記の接触させるステップがインビトロにおいて実施され
    る、請求項21に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記の接触させるステップがインビボにおいて実施される
    、請求項21に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記細胞が、神経細胞と、肝細胞と、筋肉細胞と、網膜細
    胞と、上皮細胞と、線維芽細胞と、生殖細胞と、骨髄細胞と、造血幹細胞と、脾
    細胞と、膵臓細胞と中枢神経系細胞とからなる群から選択される、請求項21に記
    載の方法。
25. 【請求項２５】 前記細胞が肝細胞である請求項24に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記細胞がヒト細胞である、請求項21に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記肝臓選択的発現制御因子が、α1ミクログロブリン/ビ
    クニンエンハンサーと、B型肝炎ウィルスEnhIエンハンサーと、B型肝炎ウィルス
    EnhIIエンハンサーと、ヒトアルブミンE_1.7エンハンサーとヒトアルブミンE₆エ
    ンハンサーとからなる群から選択される少なくとも1つのエンハンサーを含有す
    る、請求項21に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記肝臓選択的発現制御因子が、配列番号１に示すヌクレ
    オチド配列中のヌクレオチド419位から4835位の配列を有するB型肝炎ウィルスEn
    hIエンハンサーを含有する、請求項21に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記肝臓選択的発現制御因子が、B型肝炎ウィルスコアプ
    ロモーターと、マウスアルブミンプロモーターと、ヒトU1 snRNAプロモーターと
    単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーターとからなる群から選択され
    る少なくとも1つのプロモーターを含有する、請求項21に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記肝臓選択的発現制御因子がTATAボックスと、CAATボッ
    クスと、GCボックスと、ATFボックスと、C/EBP結合部位と、HNF1結合部位と、HN
    F2結合部位と、HNF3結合部位と、HNF4結合部位とTGT3結合部位とからなる群から
    選択される少なくとも1つの転写因子結合部位を含有する、請求項21に記載の方
    法。
31. 【請求項３１】 前記AAV ITRが、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする
    前記ヌクレオチド配列を発現させるように、前記rAAVベクターが、Ｂドメイン欠
    失第VIII因子をコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に結合した少なくと
    も1つのAAV ITRをさらに含有する、請求項21に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記Ｂドメイン欠失第VIII因子はヒトＢドメイン欠失第VIII
    因子である、請求項21に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号２に示すアミノ酸
    配列を有するＢドメイン欠失第VIII因子をコードする、請求項32に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオ
    チド配列のヌクレオチド約419〜4835として与えられる配列を有する、請求項33
    に記載の方法。
35. 【請求項３５】 Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列
    を細胞に送達する方法であって、 （a）配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド419〜4835として与
    えられるヌクレオチド配列と、 （b）高度にストリンジェントな条件下において(a)のヌクレオチド配列にハ
    イブリダイゼーションし、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド
    配列と、 （c）遺伝コードの縮重により上記の(a)および(b)のヌクレオチド配列と異
    なり、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列と からなる群から選択されるＢドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオ
    チド配列を含有する組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベクターを該細胞に接
    触させるステップを含む方法。
36. 【請求項３６】 Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列
    を細胞に送達する方法であって、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌ
    クレオチド配列を含有する組み換えアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクター群を含
    有する組成物を該細胞に接触させるステップを含み、前記組成物が1ミリリッタ
    ーあたり少なくとも約10⁸感染単位の力価を有する方法。
37. 【請求項３７】 必要としている被検者において血液凝固を増強する方法で
    あって、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含有し
    、血液凝固を増強するのに十分な量の組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベク
    ターを該被検者に投与するステップを含む方法。
38. 【請求項３８】 少なくとも約2×10¹⁰粒子の前記rAAVベクターを前記被検
    者に投与する、請求項37に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記被検者が哺乳類被検者である、請求項37に記載の方法
    。
40. 【請求項４０】 前記被検者がヒト被検者である、請求項39に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記rAAVベクターが、経口投与と、直腸投与と、経粘膜投
    与と、経皮投与と、吸入投与と、静脈内投与と、皮下投与と、皮内投与と、頭蓋
    内投与と、筋肉内投与と関節内投与とからなる群から選択される経路によって投
    与される、請求項40に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記rAAVが前記被検者の肝臓に投与される、請求項41に記
    載の方法。
43. 【請求項４３】 前記rAAVが、静脈内投与と、門脈内投与と、胆嚢内投与と
    、動脈内投与と肝実質細胞とへの直接注射からなる群から選択される経路によっ
    て前記肝臓に投与される、請求項44に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記rAAVが、第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配
    列が作動可能に結合した肝臓選択的発現制御因子をさらに含有する、請求項37に
    記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記肝臓選択的発現制御因子が、α1ミクログロブリン/ビ
    クニンエンハンサーと、B型肝炎ウィルスEnhIエンハンサーと、B型肝炎ウィルス
    EnhIIエンハンサーと、ヒトアルブミンE_1.7エンハンサーとヒトアルブミンE₆エ
    ンハンサーとからなる群から選択される少なくとも1つのエンハンサーを含有す
    る、請求項44に記載の方法。
46. 【請求項４６】 前記肝臓選択的発現制御因子が、B型肝炎ウィルスエンハ
    ンサー因子EnhIまたはB型肝炎ウィルスエンハンサー因子EnhIIである、請求項45
    に記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記Ｂドメイン欠失第VIII因子がヒトＢドメイン欠失第VI
    II因子である、請求項37に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記異種ヌクレオチド配列が、配列番号２に示す配列を有
    するＢドメイン欠失第VIII因子をコードする、請求項47に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記異種ヌクレオチド配列が配列番号２に示すアミノ酸配
    列をコードする、請求項48に記載の方法。
50. 【請求項５０】 Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド
    配列を含有する生物学的に有効な量の組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）を血
    友病被検者に投与するステップを含み、前記Ｂドメイン欠失第VIII因子は治療的
    に有効な量が発現される、血友病Aを治療する方法。
51. 【請求項５１】 Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド
    配列を含有する生物学的に有効な量の組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）を血
    友病被検者の肝臓に投与するステップを含む、血友病を治療する方法。
52. 【請求項５２】 前記肝臓が、コードされているＢドメイン欠失第VIII因子
    を発現し、該Ｂドメイン欠失第VIII因子が治療的に有効な量血中に分泌される、
    請求項51に記載の方法。
53. 【請求項５３】 Ｂドメイン欠失第VIII因子を発現する細胞を被検者に投与
    するステップを含む、Ｂドメイン欠失第VIII因子を被検者に投与する方法であっ
    て、Ｂドメイン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列を含有する組み換
    えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベクターを該細胞に接触させるステップを含む方
    法によって細胞が生産されている方法。
54. 【請求項５４】 前記細胞が、造血幹細胞と、肝細胞と、線維芽細胞と、上
    皮細胞と、脾細胞と、膵臓細胞と、ケラチン細胞と、内皮細胞と、筋原細胞と神
    経細胞とからなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
55. 【請求項５５】 高力価の組み換えアデノ随伴ウィルス（rAAV）ベクターを
    生産する方法であって、 （a）第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含有するrAAVベクタ
    ーをパッケージング細胞に感染させるステップと、 （b）パッケージング細胞によってrAAVゲノムを複製し、封入するステップ
    と、 （c）rAAV粒子を回収してrAAVストックを形成するステップであって、該rAA
    Vストックの力価が1ミリリッターあたり少なくとも約10⁶感染単位であるステッ
    プと を含む方法。
56. 【請求項５６】 第VIII因子をコードする異種ヌクレオチド配列に肝臓選択
    的発現制御因子が作動可能に結合している、請求項55に記載の方法。
57. 【請求項５７】 請求項55に記載の方法によって作製されるウィルスストッ
    ク。
58. 【請求項５８】 肝炎ウィルス発現制御因子が作動可能に結合したＢドメイ
    ン欠失第VIII因子をコードするヌクレオチド配列。
59. 【請求項５９】 前記肝炎ウィルス発現制御因子がB型肝炎ウィルス由来で
    ある、請求項58に記載のヌクレオチド配列。
60. 【請求項６０】 前記肝炎ウィルス発現制御因子がB型肝炎ウィルスEnhIま
    たはEnhIIエンハンサーである、請求項59に記載のヌクレオチド配列。
61. 【請求項６１】 前記肝炎ウィルス発現制御因子がB型肝炎ウィルスEnhIエ
    ンハンサーである、請求項60に記載のヌクレオチド配列。
62. 【請求項６２】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオチド
    配列中のヌクレオチド150位から4835位の配列を有する、請求項58に記載のヌク
    レオチド配列。
63. 【請求項６３】 前記ヌクレオチド配列が、プロモーターとポリアデニル化
    配列とをさらに含有する、請求項62に記載のヌクレオチド配列。
64. 【請求項６４】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示すヌクレオチド配
    列のヌクレオチド150〜4914として与えられる配列を有する、請求項63に記載の
    ヌクレオチド配列。
65. 【請求項６５】 請求項58に記載のヌクレオチド配列を含有するベクター。
66. 【請求項６６】 前記ベクターが、本明細書においてpDLZ6として開示され
    ている、請求項65に記載のベクター。
67. 【請求項６７】 請求項65に記載のベクターを含有する細胞。