JPH10511264A

JPH10511264A - 高力価組換えａａｖベクターの生成のためのパッケージング細胞株

Info

Publication number: JPH10511264A
Application number: JP8517764A
Authority: JP
Inventors: エム．アレン，ジェイムズ
Original assignee: ターゲティッドジェネティックスコーポレイション
Priority date: 1994-12-06
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 1998-11-04
Also published as: AU707866B2; EP0796339A1; WO1996017947A1; AU4596396A; CA2207927A1

Abstract

(57)【要約】 AAVベクターは、遺伝子治療で有用性を有し得るが、これまで、ヒト遺伝子治療の適用に臨床的に有用である量で、十分な量のこのような組換えベクターを生成できないことが重大な障害であった。安定なAAVパッケージング細胞株は、主にRepタンパク質の活性のため捕らえどころがなかった。Repタンパク質は、それ自身の発現をダウンレギュレートし、宿主細胞に負に影響し得る。本発明は、これらの問題を効率的に回避し、そしてパッケージング効率を実質的に増加し得る、AAVベクターをパッケージングするためのパッケージング系およびプロセスを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】高力価組換えAAVベクターの生成のためのパッケージング細胞株発明の技術分野本発明は、遺伝子治療、およびさらに詳細には遺伝子治療手順に使用するための高力価組換えAAVベクターの生成に使用される物質および方法に関する。発明の背景 AAVベクターは、遺伝子治療に有用性を有し得るが、これまでは、ヒトへの遺伝子治療の適用のために臨床的に有用な量で、このような組換えベクターの十分量を生成する能力がないという重大な障害があった。これは、肺に直接送達するようなインビボでの適用に特に問題である。アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、インビボの遺伝子転移因子として有用性を有することが示された数少ない組換えウイルスベクター系の中のものであり（Carter、1992、Current Opinion in Biotechnology、3:533-539;Muzcyzka、1992、C urr.Top.Microbiol.Immunol .158:97-129に総説されている）、従って潜在的にヒトの遺伝子治療に大変重要である。AAVベクターは、嚢胞性線維症(CF)気管支および鼻上皮細胞(Flotteら、1992a、Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356;Eganら、 1992、Nature、358:581-584;Flotteら、1993a、J.Biol.Chem.268:3781-3790;および Flotteら、1993b、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:10163-10167)、ヒト骨髄由来赤白血病細胞(Walshら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:7257-7261)、およびいくつかの別のものを包含する種々の細胞で、高頻度の安定なDNA組込みおよび発現をし得る。AAVは、安定な発現のために活発な細胞分裂を必要とし得ず、これはレトロウイルスに対して、特に大部分の細胞が最終的に分化を終えており、そして非分裂であるヒトの気道上皮のような組織では明らかに有利である。 AAVは、一定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞においてのみ増殖する欠陥パルボウイルスである（図１を参照のこと）。一般的なAA Vの総説は、Carter、1989、Handbook of Parvoviruses、第I巻、169-228頁、Berns、1 9 90、Virology、1743-1764頁、Raven Press、(New York)に見出され得る。AAVの増殖および複製に対するヘルパー機能を提供する同時感染ウイルスの例は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびある場合にはワクシニアのような天然痘ウイルスである。ヘルパー機能の性質は完全には知られていないが、細胞をAAV複製に対して許容させるヘルパーウイルスのある程度の間接的な効果であるようである。この概念は、細胞を遺伝子毒性のある(genotoxic)薬剤または細胞周期を中断させる薬剤のいずれかで処理すると、特定の場合に、ヘルパーウイルスの同時感染なしではAAV複製が低レベルの効率で生じ得るという観察により支持される。 AAVは、特定の通常でない条件下では、ヘルパーウイルス非存在下で限られた程度で複製し得るにもかかわらず、上記のように、より一般的な結果は、ヘルパー機能非存在下での細胞のAAVでの感染が、AAVの宿主細胞ゲノムへの組込みをもたらすことである。組込まれたAAVゲノムは、組込まれたAAVプロウイルスを含有する細胞をアデノウイルスのようなヘルパーウイルスで追いうち感染した場合、感染性の子孫AAV粒子のバーストを与えるために回収および複製され得る。なぜなら、AAVの組込みは効果的な反応と思われることから、このことはAAVがヒトの遺伝子治療のような用途のために細胞に遺伝子を導入し、安定に発現させる有用なベクターであることを示唆した。 AAVは、明らかな種特異性も組織特異性も伴わない非常に広い宿主域を有し、そして、適切なヘルパーが存在すれば、ヒト、サル、齧歯類起源の事実上任意の細胞株で複製する。AAVは遍在し、そして大部分の哺乳動物およびいくつかのトリ種を包含する広範囲の動物種から単離されている。 AAVは、いずれの疾患の原因とも関係しない。AAVは、トランスフォーミングウイルスまたは腫瘍ウイルスではない。ヒト細胞株の染色体へのAAVの組込みによって、細胞の増殖特性または形態的特徴におけるいずれの顕著な変化も生じない。また、これらのAAVの特性から、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクターとしてAAVが勧められる。なぜなら、この適用に提案されるレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスのような他の大部分のウイルス系は、疾患を引き起こすウイルスであるからである。 AAV粒子は、３つのキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を有するタンパク質キャプシドからなっており、そしてDNAゲノムを囲んでいる。AAVのDNAゲノムは、約1.5×10⁶ダルトンの分子量またはおよそ4680ヌクレオチドの長さを有する直鎖状一本鎖DNA分子である。相補的センスの「プラス」または「マイナス」鎖のいずれかの鎖が個々の粒子にパッケージングされるが、それぞれの粒子は１つのDNA分子しか有しない。同数のAAV粒子が、プラス鎖またはマイナス鎖のいずれかを含有する。どちらの鎖も同等に感染性であり、そして複製は親の感染一本鎖を二本鎖の形態に変換し、次に二本鎖分子の大きなプールの増幅が起き、その二本鎖から子孫の一本鎖がはずされ、そしてキャプシドにパッケージングされる。細菌プラスミドまたはファージミドに挿入された二本鎖または一本鎖コピーの AAVゲノムは、アデノウイルス感染細胞にトランスフェクトされた場合に感染性であり、そしてこれはAAV遺伝学の研究およびAAVベクターの開発を可能にしている。 AAV2ゲノムは、２コピーの145ヌクレオチド長のITR（逆方向末端反復）をゲノムの各末端に有し、そしてrepおよびcap遺伝子(Hermonatら、J.Virol. 、51:329-3 39;Tratschinら、1984a、J.Virol.、51:611-619)の２つの主要なオープンリーディングフレームを含有する4470ヌクレオチド長(Srivastavaら、1983、J.Virol.、45 ;555-564)の非反復配列領域を有する。非反復領域は、repおよびcap遺伝子を発現させるために使用される３つの転写プロモーターp5、p19およびp40(Laughlin ら、1979、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76:5567-5571)を含有する。ITR配列は、シスで必要とされ、そして機能的な複製開始点(ori)を提供するのに十分であり、そしてまた細胞ゲノムへの組込みおよび宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよび回収に必要とされるシグナルを供給するのに十分である。さらに、ITRは、AAVベクターの転写プロモーターとして直接機能し得ることが示されている(Flotteら、1993、前出)。 repおよびcap遺伝子は、それぞれウイルスゲノムの複製およびキャプシド化機能を提供するためにトランスで必要とされる。rep遺伝子は、２つのプロモーター p5およびp19から発現される。p5からの転写は、タンパク質Rep78をコードするスプライシングされない4.2kbのmRNA、およびタンパク質Rep68をコードするスプライシングされた3.9kbのmRNAを生成する。p19からの転写は、Rep52をコードするスプライシングされないmRNA、およびRep40をコードするスプライシングされた3.3kbのmRNAを生成する。従って、４つのRepタンパク質全てが、共通する内部領域配列を含むが、それらのアミノ末端およびカルボキシル末端領域については異なる。Rep78およびRep68のみが、AAV二本鎖DNAの複製に必要とされるが、Re p52およびRep40は、子孫の一本鎖DNAの蓄積に必要とされるようである。Rep78およびRep68の変異は、表現型がRep^-であり、一方Rep52およびRep40のみに影響する変異はRep⁺であるがSsd^-である。Rep68およびRep78は、AAVのITRのヘアピン立体構造に特異的に結合し、そしてAAV末端で複製を決定するのに必要ないくつかの酵素活性を有する。Rep52およびRep40は、これらの特性のいずれもを有さない。 Repタンパク質、主としてRep78およびRep68は、AAV遺伝子の正の調節または負の調節、およびいくつかの異種プロモーターからの発現を包含するいくつかの多面的調節活性、ならびに細胞増殖に対する阻害効果を示す(Tratschinら、1986、Mo l.Cell.Biol. 6:2884-2894;Labowら、1987、Mol.Cell.Biol.7:1320-1325;Khleifら、Virology、 181:738-741)。AAVのp5プロモーターは、Rep78またはRep68によって負に自己調節される(Tratschinら、1986、Mol.Cell.Biol.6:2884-2894)。細胞増殖に対するrepの発現阻害効果ゆえに、細胞株でのrepの構成的発現は、容易に達成されていない。例えば、Mendelsonら(1988、Virology、166:154-165)は、AAVゲノムの安定な組込み後の特定の細胞株でのいくつかのRepタンパク質の非常に低レベルな発現を報告した。タンパク質VP1、VP2、およびVP3は全て共通の重復配列を共有するが、VP1およびVP2が付加的なアミノ末端配列を含むという点で異なっている。３つの全てのタンパク質とも、p40プロモーターから転写された2.3kbのスプライシングされた mRNAから発現される同じcap遺伝子のリーディングフレームからコードされる。V P2およびVP3は、別の開始コドンを使用して同じmRNAから生成される。VP1は、VP 2およびVP3をコードする主要mRNAに使用される3'ドナーから30ヌクレオチド上流の3'ドナー部位を使用する主要でないmRNAからコードされる。VP1、VP2、および VP3は、全てキャプシド産生に必要とされる。３つの全てのタンパク質を除去する変異(Cap^-)が、一本鎖子孫AAVのDNAの蓄積を妨げる一方、VP1アミノ末端内の変異(Lip^-、Inf^-)は、一本鎖の産生を可能にするが、安定な感染性粒子のアセンブリを妨げる。上記のAAVの遺伝解析は、細菌のプラスミドに分子的にクローン化されたAAVゲノムの変異解析に基づいていた。初期の研究では、AAVの感染性ゲノムの分子クローンは、GCテーリング(Samulskiら、1982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79:2077-20 81)、制限エンドヌクレアーゼを含有する合成リンカーの付加(Laughlinら、1983、Gene、 23:65-73)または直接平滑末端連結(SenapathyおよびCarter、1984、J.Biol.C hem.、 259:4661-4666)のような手順でプラスミドにAAVの二本鎖分子を挿入することにより構築した。次に、アデノウイルスのような適当なヘルパーウイルスでもまた感染させた哺乳動物細胞にこのようなAAV組換えプラスミドをトランスフェクトすると、任意のプラスミド配列を含まないAAVゲノムの回収および切り出し、および回収されたゲノムの複製ならびに一定量の子孫の感染性AAV粒子の産生をもたらした。これは、上記で概略したようにAAVの遺伝解析を行うための基礎を提供し、そしてAAV形質導入ベクターの構築を可能にした。遺伝解析に基づいて、AAVベクター構築の一般原理は、最近考察されたように定義された(Carter、1992、Current Opinions in Biotechnology、3:533-539;Muzyc zka、1992、Current Topics in Microbiology and Immunology、158:97-129)。AAV ベクターは、ベクタープラスミドを生成するためにAAVをコードする配列部分を外来DNAに置換することによりAAV組換えプラスミド内に構築される。ベクタープラスミドでは、AAV配列の末端(ITR)部分は完全に保持されていなければならない。なぜなら、これらの領域はトランスフェクション後のプラスミドからの切り出し、ベクターゲノムの複製、ならびに宿主細胞ゲノムからの組込みおよび回収を含むいくらかの機能がシスで要求されるからである。次に、AAV形質導入ウイルスの生成のために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような適切なヘルパーウイルスで感染した細胞にベクタープラスミドをトランスフェクトすることにより、ベクターはAAV粒子にパッケージングされ得る。複製およびベクターゲノムのAAV粒子へのキャプシド化を達成するために、ベクタープラスミドは、ベクタープラスミドの構築物に欠失しているトランスで必要な任意のAAV機能、すなわちrepおよびcapを相補しなければならない。ヒトの遺伝子治療に使用するために設計した任意のAAVベクターの所望の特徴は少なくとも２つある。第１に、形質導入ベクターは、送達系として実用的な十分に高い力価で生成されねばならない。これは、インビボでのベクター送達を目的とした遺伝子治療ストラテジーでは特に重要である。気道へのインビボでの直接送達による嚢胞性線維症の処置のようなAAVベクターの多くの所望される適用については、必要とされる形質導入ベクターの量は10¹⁰を越えるようである。第２に、ベクター調製物には、野生型のAAVウイルスが存在してはならない。高力価AAVベクターの達成は、野生型AAVゲノムが存在するまたは組換えにより生成される場合、野生型AAVゲノムを優先的にキャプシド化すること、およびrepまたは capのような十分な相補機能を生成することが不可能であることを包含するいくつかの理由から困難である。このような相補機能を発現する有用な細胞株は、部分的にはrep遺伝子のいくつかの阻害機能のため、生成されていない。記載された最初のAAVベクターは、AAV転写プロモーターまたはSV40プロモーターから発現されるneoまたはcatまたはdhfrのような外来レポーター遺伝子を含有した(Tratschinら、1984b、Mol.Cell.Biol.4:2072-2081;HermonatおよびMuzyczka 、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6466-6470；Tratschinら、1985、Mol.Cell.Bi ol. 5:3251-3260;McLaughlinら、1988、J.Virol.、62:1963-1973;Lebkowskiら、198 8、Mol.Cell.Biol.、7:349-356)。これらのベクターは、アデノウイルス感染細胞に、天然の野生型AAV転写プロモーターから発現されるAAVのrepおよびcap遺伝子を含有する第２のパッケージングプラスミドとともに同時トランスフェクションすることにより、AAV形質導入粒子中にパッケージングされた。パッケージングプラスミドのAAV粒子へのパッケージを妨げる試みでは、いくつかのアプローチが行われた。いくつかの場合(HermonatおよびMuzyczka、1984;McLaughlinら、198 8)、パッケージングプラスミドは、AAV配列内のバクテリオファージラムダDNAのラージ領域を挿入し、パッケージングされ得ない過剰サイズのゲノムを生成した。他の場合において(Tratschinら、1984b;Tratschinら、1985、Lebkowskiら、1988) 、パッケージングプラスミドは、切り出しおよび複製ができず、そのためパッケージングできないように、AAVのITR領域を欠失した。これらの全てのアプローチは、野生型AAVのDNAを含有する粒子の生成を妨げず、そしてまた効果的な高力価のAAV形質導入粒子を生成しなかった。実際、10⁴mlを越えない力価は、Hermonat およびMuzyczka、1984により引用されなかった。これらの研究での野生型AAV粒子の生産は、おそらくベクターおよびパッケージングプラスミドに存在するAAV配列間の重複する相同性の存在によるものであった。SenapathyおよびCarter(1984、J.B iol.Chem.、 259:4661-4666)により、このような系の組換えの程度が、配列の重復の程度とほぼ同等であることが示された。初期の研究の総説(Carter 1989、Handb ook of Parvoviruses、第II巻、247-284ページ、CRC Press、Boca Raton、FL)で、１m lあたり10⁶の力価が得られたことが示唆されたが、これはベクター調製物に大量の野生型AAVが混入している上記の研究に基づいていた。野生型AAVを含有するこのようなベクター調製物は、ヒトの遺伝子治療には有用でない。さらに、これらの初期のベクターは、低い形質導入効率を表し、そして細胞あたり50,000粒子までの多重度でベクターを供給したとしても、様々なヒトの細胞株培養物中で１％より多いまたは２％の細胞を形質導入しなかった。これは、部分的には野生型AA V粒子の混入およびベクター中のAAVのrep遺伝子の存在を反映し得た。さらに、S amulskiら(1989、J.Virol.63:3822-3828)は、野生型AAVの存在が、パッケージングされたベクターの収量を著しく高めることを示した。従って、野生型AAVの生産が除去されるパッケージング系では、パッケージングされたベクターの収量は実際に減少し得る。それにもかかわらず、任意のヒトの臨床適用で使用するためには、野生型AAVの生産を除去することが必須である。 AAVのrepまたはcap遺伝子を含有しないAAVベクターを生成するための別の研究 (McLaughlinら、1988;Lebkowskiら、1988)では、なお野生型AAVの生成をうけ、そしてなおヒト細胞株で非常に低い形質導入頻度を生じた。従って、McLaughlinら (1988)は、HermonatおよびMuzyczka(1984)により初期に使用された同じパッケージングプラスミドでパッケージングされたneo遺伝子を含有するAAVのrep^-cap^-ベクターはなお、野生型AAVを含有することを報告した。結果として、ベクターおよび野生型粒子の二重ヒットを避けるために、このウイルスを細胞あたり0.03粒子の多重度（すなわち、10,000細胞あたり300感染単位）でしか使用し得なかった。このようにして実験を行った場合、1000感染単位で32,000細胞を感染させることにより、平均800個のゲネチシン(geneticin)耐性コロニーが得られた。これは、ウイルスが80％の形質導入頻度を得ることができることを示すと解釈されるが、実際は細胞の2.5％のみが形質導入された。従って、このベクターの効果的な有用な力価は制限された。さらに、この研究は、このベクター調製物の実際の力価が、HermonatおよびMuzyczka(1984)により以前に得られた力価より少しでも高いことを示さなかった。同様に、Lebkowskiら、1988は、repまたはcap遺伝子のどちらも含有しないAAVベクターをパッケージングし、そしてTratschinら、(19 84b、1985)によって初期に使用されたものと同一のori^-パッケージングプラスミドpBa1Aを使用し、そして同様に低い形質導入頻度（最も濃縮したベクターストックでも、数種のヒト細胞株では、１％を越えない細胞がゲネチシン耐性に形質導入され得た）を報告した。Lebkowskiら、(1988)は、有意には実際のベクター力価を報告しなかった。しかし、３mlのベクター調製物に５×10⁶細胞を曝した場合、１％より高くない形質導入頻度を示す生物学的アッセイは、力価が２×10⁴ 未満であることを示した。pBa1パッケージングプラスミドはまた、ベクター中に ITR配列との重復する相同性を含有し、そして野生型AAVの組換えによる生成をもたらす。 Lafaceら、(1988)は、同様にして調製されたHermonatおよびMuzyczka(1984)で使用されたのと同じベクターを使用し、そしてまた非常に低い力価を示すマウス骨髄培養物中で1.5％の形質導入頻度を得た。 Samulskiら(1987、J.Virol.61:3096-3101)は、pSub201と呼ばれるプラスミドを構築した。これは、細菌プラスミド中の完全なAAVゲノムであるが、各ITRの末端で13ヌクレオチドの欠失を有し、従ってAAVゲノム全体を含有する他のAAVプラスミドよりも低い効率で回収および複製された。Samulskiら(1989、J.Virol.63:382 2-3828)は、pSub201に基づくが、repおよびcapを欠失していて、そしてSV40初期遺伝子プロモーターから発現するhygまたはneo遺伝子のいずれかを含有するAAV ベクターを構築した。彼らは、アデノウイルスITRの１コピーでいずれかの末端が囲まれたヌクレオチド190-4490のAAVヌクレオチド配列全体からなるpAAV/Adと呼ばれるパッケージングプラスミドでの同時トランスフェクションにより、これらのベクターをパッケージングした。このパッケージングプラスミドでは、AAV のrepおよびcap遺伝子は、天然のAAVプロモーターp5、p19、およびp40から発現された。pAAV/AdでのアデノウイルスITRの機能は、AAVキャプシドタンパク質の発現レベルを高めることであると考えられた。しかし、repは、その相同なプロモーターから発現され、そして負に調節されており、従ってその発現は制限される。これらのキャプシド化系を使用して、Samulskiら、1989は、AAVベクターストックを生成した。これは、実質的に野生型AAVを含まないが、上清１mlあたりのハイグロマイシン耐性単位が３×10⁴のみの形質導入力価を有した。野生型AAV ゲノムをパッケージングプラスミドに使用した場合、AAVベクター調製物の力価は、５×10⁴に増加した。従って、この系で生産される低力価は、部分的にはベクター構築に使用された基本的なpSub201プラスミドのITR配列の欠損が原因で、そして部分的にはpAAV/AdからのAAV遺伝子の発現を制限することが原因だったようである。AAVneoベクター調製物の力価を増加させる試みでは、Samulskiら、198 9は、293細胞の30枚の10 cm皿に大量にトランスフェクトし、そしてCsClでのバンド形成によりベクターストックを濃縮させることにより、ベクターストックを生成した。これは、DNAドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで測定したところ、合計10⁸粒子を含有するAAVneoベクターストックを生産した。このベクターストックを細胞あたり1,000粒子までの多重度で使用した場合、70％の形質導入頻度が得られた。これは、細胞あたり１形質導入単位の比では、形質導入されるべき細胞の予想された比率が、ポアソン分布によれば63％であることから、粒子対形質導入比が、約500〜1,000粒子であることを示唆している。ベクタープラスミドpSub201およびパッケージングプラスミドpAAV/Adを用いる Samulskiら(1989)の系は、２つのプラスミドの間に重複するAAV配列の相同性を有さなかったが、XbaI部位で重複する相同性があり、そしてこれらの部位の組換えにより完全な野生型AAVを生成する。すなわち、AAV配列の重複する相同性は存在しないが、完全なAAV配列が２つのプラスミド内に含有され、そしてこのように組換えにより野生型AAVを生成し得るが、これは望ましくない。このクラスの組換えがAAVプラスミド中で起こることはSenapathyおよびCarterにより示された (1984,J.Biol.Chem.259:4661-4666)。それゆえ、低力価および野生型組換え体を生成する能力の問題のため、Samulskiら(1989)により説明された系はヒト遺伝子治療において有用性を有さない。他のいくつかの報告がAAVベクターについて記載している。Srivastavaら(1989 , Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,86:8078-8082)は、Samulskiら(1987)のpSub201プラスミドに基づくAAVベクターについて記載した。そこではAAVのコーディング配列は他のパルボウイルスB19のコーディング配列で置き換えられた。このベクターはp AAV/Adパッケージングプラスミドを用いてAAV粒子にパッケージングされ、機能的ベクターを生成したが、力価は報告されなかった。この系はpSub201に基づいていたので、このプラスミドに関する上記の欠陥を被る。第２に、ベクターおよびパッケージングプラスミドは両方とも重複するAAV配列(ITR領域)を含有していたので、野生型ウイルスの混入をもたらす組換えが非常によく起こる。 Chatterjeeら(1991,Vaccines 91,Cold Spring Harbor Laboratory Press,85-8 9ページ)、Wongら(1991 Vaccines 91,Cold Spring Harbor Laboratoy Press,183 -189ページ)、およびChatterjeeら(1992,Science,258:1485-1488)は、HIVまたは単純ヘルペスウイルスのような感染性ウイルスに対するアンチセンスRNAを発現するよう設計されたAAVベクターについて記載している。しかし、これらの著者はそのAAVベクターストックの力価についてなにも報告しなかった。さらに、彼らは、Tratschinら(1984b,1985)により使用された、AAVゲノムのBalAフラグメントを含有するプラスミドに類似のOri^-パッケージングプラスミドを用いてベクターをパッケージングし、それ故彼らのパッケージングプラスミドは、ベクター構築物中に存在するAAV配列に相同性を有するAAVベクター配列を含有した。これはまた、野生型AAVの生成を生じる。このように、Chatterjeeら、およびWongらは低力価しか示さないことが公知のパッケージング系を使用した。そして、それはベクターおよびパッケージング配列の重複する相同性のため、野生型AAVゲノムの生成を生じ得る。他の報告は、ヒトリンパ球(Muro-Cachoら,1992,J.Immunotherapy,11:231-237) またはヒト赤白血病細胞株(Walshら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:7257-726 1)中で遺伝子を発現するAAVベクターの、pSub201ベクタープラスミドおよびpAAV /Adパッケージングプラスミドに基づいたベクターとの使用を記載している。また、ベクターストックの力価は報告されておらず、そして明らかに低かった。なぜなら、選択マーカー遺伝子が、ベクターで首尾よく形質導入されたそれらの細胞を同定するために使用されたからである。嚢胞性線維症患者由来のインビトロで増殖したヒト気道上皮細胞の、AAV p5プロモーターから選択マーカー遺伝子neoを発現するAAVベクターでの形質導入が報告された(Flotteら,1992,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 7:349-356)。この研究では、AAVneoベクターはpAAV/Adパッケージングプラスミドを用いてAAV粒子にパッケージングされた。培養物中の細胞の70%までがゲネチシン耐性に対して形質導入され得、そして粒子対形質導入比は、Samulskiら(1989)により報告されたものと同様であった。このように細胞の70%の形質導入を得るためには、細胞当たり数百までのベクター粒子の多重度が必要であった。AAV ITRプロモーターからCFT R遺伝子を発現するAAV形質導入ベクターを用いるインビトロ培養でのヒト気道上皮細胞の形質導入は、この細胞が嚢胞性線維症患者由来の細胞に存在する塩化物チャンネル機能の電気生理学的欠陥について機能的に修正され得ることを示した (Eganら,Nature,1992,358:581-584;Flotteら,J.Biol.Chem.268:3781-3790)。上記の研究は、AAVベクターが遺伝子治療によるヒト疾病の治療のためのベクターとしての潜在的な有用性を有し得ることを示唆する。しかし、十分な量のAA Vベクターを生成する能力は、AAVベクターを使用するヒト遺伝子治療の発展における厳しい制限であった。この制限の１つの局面は、インビボ動物モデルでAAV ベクターを使用する研究がまさにほとんどなかったことである（例えば、Flotte ら、1993b;およびKaplittら、1994、Nature Genetics 8:148-154を参照のこと）。これは一般的に、インビボでの送達および遺伝子発現の分析に有用であるのに高い十分な力価を有するAAVベクターストックを十分量生成することに関する困難の反映である。AAV遺伝子治療の制限要因の１つは、使用されているベクターパッケージング系が比較的効率的でなかったことである。repおよびcapのような AAVトランス相補機能を発現する細胞株の欠如のため、AAVベクターのパッケージングは、パッケージングプラスミドおよびベクタープラスミドの同時トランスフェクションによってアデノウイルス感染細胞中で達成された。このプロセスの効率は、それぞれのプラスミド構築物のトランスフェクションの効率により、および今まで記載されたパッケージングプラスミド由来のRepタンパク質の発現レベルにより制限され得る。これらの問題はそれぞれ、AAV Repタンパク質の生物学的活性に関連しているようである。さらに、上記のように、上述の全てのパッケージング系は組換えにより野生型AAVを生成する能力を有する。機能的Repを安定して発現する細胞株の欠如は、Repによるneo-耐性コロニー形成の阻害(Labowら,1987;Trempeら,1991)により示されるように、Repの細胞傷害性または細胞増殖抑制性の機能を明らかに反映する。これはまた、Repが培養細胞中の不死化表現型を逆転させる傾向を有することに関連するようであり、それが機能的Repを安定して発現する細胞株の生成を極めて困難にしている。Repを発現する細胞株を生成する試みはいくつか行われている。Mendelsonら(1988,Virol ogy ,166:154-165)は、１つの細胞株で、AAV rep遺伝子を含有するプラスミドでのHeLaまたは293細胞の安定なトランスフェクション後、AAV Rep52タンパク質のある低いレベルの発現を得たが、Rep78またはRep68タンパク質の発現を得なかったことを報告した。Rep78およびRep68タンパク質が存在しないため、細胞株においてベクターは生成され得なかった。別の細胞株はかろうじて検出できる量の非機能性Rep78を生成した。 Vincentら(1990,Vaccines 90,Cold Spring Harbor Laboratory Press,353-359 ページ)は正常AAVプロモーターから発現するAAV repおよびcap遺伝子を含有する細胞株の生成を試みた。しかし、これらの試みはベクターが100倍の過剰の野生型AAV粒子が混入したからか、またはベクターが４×10³より小さい非常に低い力価でしか生成されなかったからかのいずれかのために成功しなかった。別のアプローチでは、Lebkowskiら(米国特許第5,173,414号、1992年12月22日発行)がエピソームプラスミドにおいてAAVベクターを含有する細胞株を構築した。次いで、これらの細胞株はアデノウイルスで感染され、トランス相補AAV機能のrepおよびcapでトランスフェクションされ、AAVベクターの調製物を生じ得た。このことにより高力価のAAVストックが生成できるようになることが主張される。しかし、示された例において、示された力価に関する唯一の情報は、１つのヒト細胞株K562がわずか１％あるいはそれより低い効率で形質導入され得たということであり、それはいかなる高力価のAAVベクターの生成をも示してない。この系においては、ベクターはエピソーム性（非組込み構築物）として運ばれ、そしてベクターの組込まれたコピーが好ましくないと述べられる。引き続く特許（米国特許第5,354,678号、1992年10月11日発行）、Lebkowskiらは、細胞ゲノム中にre pおよびcap遺伝子を導入するが、しかし、その方法は、エプスタイン-バールウイルス核抗原(EBNA)遺伝子およびエプスタイン-バールウイルス潜在性複製起点を含むエピソームAAV形質導入ベクターの使用を必要とする；そして、再び力価に関する唯一の情報は、かなり低い力価を示した。 Lebkowskiら、(1992)により記載されたAAVベクターのパッケージングへのアプローチは、いくつかの望ましくない局面を有する。第１に、細胞株中で組込まれていない高コピー数のエピソームプラスミドとしてベクターを維持することは望ましくない。なぜなら、細胞当たりのコピー数は厳密に制御され得ず、そしてエピソームDNAは、欠陥ベクターの生成を導く再配列をよりずっと受けるようであるからである。第２に、この系においては、ベクターはなお、アデノウイルスによって細胞を感染させ、そしてAAV repおよびcap遺伝子を含有するプラスミドを導入することによりパッケージングされなければならない。Lebkowskiら(1992) により再び使用されたプラスミドはpBa1であり、これは、上記のように、ベクターITR配列と重複する相同性を有し、そして結果として野生型AAVを生成する。第３に、Lebkowskiら(1988,1992)により使用されたpBa1パッケージングプラスミド中で、rep遺伝子はその相同なp5プロモーターから離れて発現し、このように負に自己調節され、それ故にrepの発現は制限されるようである。プラスミドのトランスフェクション後のrep発現が最適以下のレベルであるという問題は、これらのタンパク質の別の生物学的活性に関連し得る。AAV-Repタンパク質は、pAAV/Ad(Samulskiら,1989)またはpBa1(Lebkowskiら,1988,1992)のような以前に記載の全てのパッケージング構築物に使用されたAAV-p5プロモーターからのそれ自体の発現をダウンレギュレートするという証拠がある(Tratschin ら,1986,Mol.Cell.Biol.6:2884-2894)。によって公開された（1994、J.Virol.68:7169-7177）。彼らは、repが糖質コルチコイド応答性MMTVプロモーターの制御下に置かれた細胞株の生成を記載した。彼らは、粒子形成を観察したが、その粒子は、明らかに、非感染性であった。さらなる実験は、欠損が非常に重要である；すなわち、細胞中で、一本鎖rAAV DNA の蓄積が実際にはないということを示した。感染性粒子の産生は、構成的な高発現rep構築物でのさらなる一過性のトランスフェクションを必要とした（すなわち、それらは、rep活性を、自身で提供し得ると仮定された細胞に「加え戻さ(ad d back)」なければならない。発明の要旨遺伝子治療の基本的挑戦の１つは，エクスビボで容易に操作され得ず，活発に分裂しない細胞および組織の形質導入のためのストラテジーの開発であった。AA Vベクターは、例えば、気道でのインビボ遺伝子転移を達成し得るが、可能な限り少量での十分に高い多重度のベクターの送達を可能にするように、高力価が重要である。これは、AAVに基づく遺伝子治療の可能性を決定するにおいて、中心的に重要な最適のパッケージングの方法論を作出する。安定でヘルパーを含まないAAVパッケージング細胞株は、主にRepタンパク質の活性のために捕らえどころがなかった。Repタンパク質は、それ自体の発現をダウンレギュレートし、そして宿主細胞に負に影響し得る。本発明において記載されるアプローチは、効果的にこれらの問題を回避し、そしてパッケージング効率の実質的な改良を可能とした。本発明のいくつかの好適な実施態様を、以下に要約する：１．組換えAAV(rAAV)ベクターの高い効率でパッケージングし得る哺乳動物細胞を産生する方法であって、以下の工程：（ａ）プロモーターと作動可能に連結された安定に組み込まれたAAV cap遺伝子および異種プロモーターと作動可能に連結された安定に組み換えられたAAV rep遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）に記載の細胞を複製し、細胞集団を産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の細胞集団へ、ヘルパーウイルスを導入する工程；および（ｄ）ヘルパーウイルス誘導repタンパク質活性を示す細胞を選択する工程、を包含する、方法。２．上記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、実施態様１に記載の方法。３．上記パッケージング細胞が、AAV rep遺伝子を含まない親型細胞の少なくとも半分の早さで増殖し得、そして上記パッケージング細胞が少なくとも100 rA AV粒子／細胞を産生するrAAVベクターをパッケージングし得る、実施態様１に記載の方法。４．工程（ａ）の上記哺乳動物細胞が、p5プロモーターが異種プロモーターにより置換されたAAVの結合されたrep遺伝子およびcap遺伝子を含む、実施態様１に記載の方法。５．上記異種プロモーターが、マウスメタロチオメインI(mMT-I)プロモーターである、実施態様４に記載の方法。６．実施態様１の方法で産生される、細胞およびその子孫。７．実施態様３の方法で産生される、細胞およびその子孫。８．実施態様４の方法で産生される、細胞およびその子孫。９．実施態様５の方法で産生される、細胞およびその子孫。１０．組換えAAV(rAAV)ベクターを高い効率でパッケージングし得る哺乳動物細胞であり、上記細胞は、プロモーターに作動可能に連結された安定に組み込まれたcap遺伝子、および異種プロモーターに作動可能に連結された安定に組み込まれたrep遺伝子を含む；上記細胞が、ヘルパーウイルス誘導repタンパク質活性を示す、哺乳動物細胞。１１．上記ヘルパーウイルス導入repタンパク質活性が、アデノウイルスにより誘導される、実施態様１０に記載のAAVパッケージング細胞。１２．上記パッケージング細胞が、AAV rep遺伝子を含まない親型細胞の少なくとも半分の早さで増殖し得、そして上記パッケージング細胞が、少なくとも10 0 rAAV粒子／細胞を産生するためのrAAVベクターをパッケージングし得る、実施態様１０に記載のAAVパッケージング細胞。１３．上記細胞が、p5プロモーターが異種プロモーターにより置換されたAAV の結合されたrep遺伝子およびcap遺伝子を含む、実施態様１０に記載のAAVパッケージング細胞。１４．上記異種プロモーターが、マウスメタロチオネインI(mMT-I)プロモーターである、実施態様１３に記載のAAVパッケージング細胞。１５．安定に組み込まれた組換えAAVベクターをさらに含み、上記ベクターが、２つのAAV逆方向末端反復(ITR)領域の間に位置する目的のポリヌクレオチド配列を含む、実施態様１０に記載のAAVパッケージング細胞。１６．組換えAAVベクターをパッケージングする方法であって、以下の工程：（ａ）実施態様１０に記載のAAVパッケージング細胞を提供する工程；（ｂ）組換えAAVベクターを導入する工程であって、上記ベクターが２つのAAV逆方向末端反復(ITR)領域の間に位置する、目的のポリヌクレオチド配列を含む工程；（ｃ）ヘルパーウイルスを導入する工程；および（ｄ）AAVの複製およびパッケージングに適切な条件下で、上記細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。１７．組換えAAVベクターをパッケージングする方法であって、以下の工程：（ａ）安定に組み込まれたrAAVベクターを含む、実施態様１５に記載のAAVパッケージング細胞を提供する工程；（ｂ）ヘルパーウイルスを導入する工程；および（ｃ）AAVの複製およびパッケージングに適切な条件下で、上記細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。１８．実施態様１６に記載の方法に従ってパッケージングされた、組換えAAV ベクター。１９．実施態様１７に記載の方法に従ってパッケージングされた、組換えAAV ベクター。２０．上記ベクターが嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)をコードするポリヌクレオチドを含む、実施態様１９に記載の組換えAAVベクター。２１．rAAVベクター調製物の関連する感染力価を決定する方法であって、以下の工程：（ａ）実施態様１０に記載のAAVパッケージング細胞へ、ヘルパーウイルスおよびrAAVベクター調製物の連続希釈物を導入する工程；（ｂ）AAVの複製に適切な条件下で、上記細胞をインキュベートする工程；および（ｃ）複製されたrAAVベクターの量を決定する工程、を包含する、方法。図面の簡単な説明図１は、実施例１に記載のようなプラスミドpMt-rep/cap//pKO-neoの模式図である。図２は、実施例４に記載のように、本発明に従って生成されたパッケージング細胞が、侵入rAAVベクターを複製するのに十分なrep活性を有することを立証するサザンブロットの写しである。図３は、実施例５に記載のように、本発明に従って生成されたパッケージング細胞が、アデノウイルスの存在下でAAVゲノムを複製し得ること、およびこの活性が、所定のサンプル中に存在する感染性ウイルス粒子の数を定量するために用いられ得ることを立証するサザンブロットの写しである。図４は、実施例６に記載のように、本発明に従って生成されたパッケージング細胞がrepタンパク質を発現し、そしてトランスフェクションにより導入された組換えAAVプラスミドDNAゲノムを複製し得ることを立証するサザンブロットの写しである。図５は、実施例７に記載のように、実施例５に記載の感染性rAAV滴定アッセイが、最大に達するに十分な時間にわたって進行したことを立証するサザンブロットの写しである。図６および７は、実施例９および１０に記載のように、本発明に従って生成されたパッケージング細胞がトランスフェクションまたは感染のいずれかによって、rAAVベクターを複製し得、そしてそれを感染性ビリオンにパッケージングし得ることを実証するサザンブロットの写しである。図８は、実施例１１に記載のように、本発明に従って生成されたパッケージング細胞が、組込まれたrAAVベクターを認識し、切り出し、そして増幅するのに十分なrep活性を有することを実証するサザンブロットの写しである。発明の詳細な説明 AAVベクターは、目的のタンパク質をコードする異種ポリヌレオチドとともに、複製およびキャプシド化に必要なAAV構成要素を含有する、AAVウイルスの組換え構築物である。これらの組換えAAVベクターは、ヒト遺伝子治療のために、潜在的に効果的な道具であり、嚢胞性線維症および鎌形赤血球貧血のような疾病に特に有効である。遺伝子治療への他のアプローチに勝るAAVベクターの主要な利点は、細胞のゲノムに恒久的に組み込まれるために、標的細胞の複製の進行を必要としないことである。本明細書に記載の発明は、遺伝子治療において使用される高力価組換えAAVベクターの生成に使用される方法および材料を提供する。rAAV調製物の相対的感染力価を決定する方法および材料もまた提供する。本発明の実施には、他に示されていなければ、分子生物学、微生物学、組換え DNA、および免疫学の従来の技術が使用されており、それらは当業者の技術範囲内である。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook,F ritsch,およびManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版(1989) ,Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編,1984),Animal Cell Culture(R.I.Fres hney編,1987),Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press,Inc.);Gene Tra nsfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.MillerおよびM.P.Calos編,1987),Hand book of Experimental Immunology ,(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編),Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moor e,J.G.Siedman,J.A.Smith,およびK.Struhl編,1987),およびCurrent Protocols i n Immunology(J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.ShevachおよびW. Strober編,1991)を参照のこと。本明細書中の前記および後記の全ての特許、特許出願、および出版物は本明細書中で参照として援用されている。定義：用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを言うために交換可能に用いられる。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通して翻訳後修飾されたタンパク質を含む。「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。この用語は、分子の一次構造についてのみいう。従って、二本鎖および一本鎖DNAならびに二本鎖および一本鎖RNAを含む。メチル化またはキャップされたポリヌクレオチドのような改変されたポリヌクレオチドも含む。「組換え体」は、ポリヌクレオチドに対して適用され、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／または連結工程、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドと区別される構築物を生じる他の手順の種々の組み合わせの産物であることを意味する。「配列重複」は、ヌクレオチドが、組換えが容易である十分な長さおよび同一性の相同配列を共有するときに、２つのポリヌクレオチドの間で生じる。相同性のレベルおよび対応する組換えの頻度は、相同配列の長さの増加およびそれらの共有の同一性のレベルに伴って増加する。与えられた系の関係を示す相同性のレベルは、当業者に周知のように、理論的に決定され得、そして実験的に確認され得る。しかし、代表的には、組換えは、重複配列が約25ヌクレオチド未満の配列のときはその全長に対して少なくとも80％一致した場合、または重複配列が約50 ヌクレオチド未満の配列のときは全長に対して少なくとも70％一致した場合、実質的に減少され得るか、または排除され得る。もちろん、より低レベルの相同性でさえも、組換えの見込みがさらに減少するため好ましい。「ベクター」は、インビトロまたはインビボのどちらかにおいて、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミドまたはウイルスをいう。ときには「標的ポリヌクレオチド」としていわれる、送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコード配列を含み得る。「組換えAAVベクター」（または「rAAVベクター」）は、AAV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接される１つ以上の目的のポリヌクレオチドを含むベクターをいう。このようなrAAVベクターは、適切なヘルパーウイルスに感染しており、そして AAVのrepおよびcap遺伝子を発現している宿主細胞内に存在するとき、複製され得、そして感染可能なウイルス粒子中にパッケージングされ得る。 AAV「rep」および「cap」遺伝子（それぞれ、複製およびキャプシド化タンパク質をコードしている）は、試験された全てのAAV血清型において見出されており、そして上記および本明細書中に引用される文献に記載されている。代表的には、repおよびcap遺伝子は、AAVゲノム中においてお互いに隣接して見出されており、そしてこれらは一般にAAV血清型において保存されている。 AAVのための「ヘルパーウイルス」は、野生型AAV（これは「欠損」パルボウイルスである）が宿主細胞により複製され、パッケージングされることを可能とする第２のウイルスをいう。多くのこのようなヘルパーウイルスは同定されており、ワクシニアのようなアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスを含む。本明細書中で用いられる「パッケージング」は、rAAVベクターのアセンブリーおよびキャプシド化を生じる一連の亜細胞性の事象をいう。従って、適切なベクタープラスミドが適切な条件下でパッケージング細胞株に導入される場合、それはベクターウイルス粒子内にアセンブルされる。「異種」は、比較される異種の残りの実体と遺伝子型的に異なる実体に由来するものを意味する。例えば、遺伝子工学技術により異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現した場合は、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、その天然ののコード配列から除去され、そして異なるコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。本明細書中で用いられる「プロモーター」は、プロモーターが作動可能に連結されている遺伝子またはコード配列の転写を増大する、ゲノム領域をいう。「作動可能に連結された」は、記載のような組成物がそれらの意図される様式で機能し得る関係にある並列をいう。プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写を促進する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたプロモーターは、通常コード配列とシス配置であるが、必ずしもコード配列に隣接する必要はない。「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および他のこのような用語は、高等真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞を示す。これらは、組換えベクターまたは他の転移ポリヌクレオチドのレシピエントとして使用され得、そして形質導入された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的にまたはゲノム相補性において）である必要はないことが理解される。細胞内へのポリヌクレオチドの「安定な組み込み」は、ポリヌクレオチドが細胞の染色体またはミニ染色体へ導入され、そしてそれゆえ、細胞ゲノムの比較的不変の部分となることを意味する。プラスミドのような「エピソーム」は、しばしば多くの世代で維持されるが（特に選択圧下にある場合）、エピソームにより送達された遺伝物質は、一般に、染色体に組み込まれた物質より損失されやすい。また、真核生物の染色体のクロマチン構造は組み込まれたポリヌクレオチドの発現のレベルに影響し得る；そして、本発明者らは、このような効果は、本明細書中に記載したような状況において、時に有益であることを証明し得ることを確信する（ここで、AAV rep遺伝子の発現のレベルは、細胞代謝において負の効果を有し得る）。本発明の内容において特に望ましい特性を有する安定な細胞株の選択は、以下の発明の詳細な説明および実施例に記載される。細胞株を記載する場合に使用する「効率」は、その株の有用な特性をいう；特に増殖率、および（パッケージング細胞株について）細胞あたりの産生された多くのウイルス粒子の数をいう。「高効率パッケージング」は、細胞あたり少なくとも100ウイルス粒子の産生を示す。発明を実施するための態様：高力価の組換えAAVベクターの産生方法はいくつかの工程を包含する。一般のストラテジーは、プロモーターに作動可能に連結され、安定に組み込まれたAAV cap遺伝子、および異種プロモーターに作動可能に連結され、安定に組み込まれたAAV cap遺伝子を含む哺乳動物パッケージング細胞株の調製を包含する。次いで、パッケージング細胞は、AAV ITR領域および標的ポリヌクレオチドを含むプラスミドで感染またはトランスフェクトされる。適切な条件下での（適切な増殖条件およびコンピテントヘルパーウイルスでの感染を含む）、パッケージング細胞のrepおよびcap遺伝子の発現は、それぞれAAVベクターの複製およびキャプシド化を媒介するrepおよびcapタンパク質の合成をもたらす。rAAVベクターのAAV ITR配列の間に存在する目的のポリヌクレオチド（「標的ポリヌクレオチド」ともいわれる）の提供は、従って、標的ポリヌクレオチドの感染性rAAV粒子へのパッケージングを生じる。この粒子は所望の宿主細胞にポリヌクレオチドを送達するために使用し得る。パッケージング細胞株中のAAV遺伝子とこれらのベクタープラスミド中のAAV遺伝子との間の配列重複の程度の極小化により、野生型AAVの比率（すなわち、粒子は標的ポリヌクレオチドを含んでいない）を極小化し得る。背景のセクションで記載したように、野生型AAVの混在は、rAAVベクター調製物の治療能力を制限する。本発明の構築物における配列重複の欠損に加えて、p5プロモーター領域は異なるプロモーターで置き換えられる。本発明のパッケージング細胞株は、高力価で実質的に野生型AAVの混在のないrAAVの調製物の効率的な産生を可能にする；AAV媒介遺伝子治療の内容において特に有用な特性である。本発明の原理の最初の例示はAAV2血清型を用いて行われたが、種々の血清型がかなり密接に関係している（機能的および構造的の両方において、遺伝子レベルにおいても（Blacklow,1988,「Parvovirus and Human Disease」165-174頁、J.R .Pattison（編）；およびRose,1974,Comprehensive Virology 3:1〜61を参照のこと））ことが現在公知なので、これらの同様の原理は他のAAV血清型に対しても適用され得ることが期待される。例えば、全てのAAV血清型が、相同rep遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示す；そしてすべてがAAV2 において発現されるような３つの関連キャプシドタンパク質を有する。関連の程度は、ゲノムの長さに沿う血清型の間の広範囲のクロスハイブリダイゼーションを示すヘテロ二重鎖解析によりさらに示唆される；およびITRに対応する末端の異種自己アニーリングセグメントの存在によっても示唆される。類似の感染性のパターンはまた、各血清型における複製能が類似の調節制御下にあるということを示唆する。パッケージング細胞株の産生：パッケージング細胞が生成される親株は、AAV感染が可能である任意の細胞株から得られ得、そしてインビトロ培養に影響を受けやすい。先に示したように、 AAVはかなり広範な宿主領域を有し、そしてサル、ヒト、および齧歯類細胞を含む種々の哺乳動物細胞型から単離されている。ヒト遺伝子治療のために、代表的には適切なヘルパー機能が発現され得るヒト細胞株が好ましい。パッケージング細胞株が由来され得るこのようなヒト細胞株は、例えば、Hela、A549、293、KB 、Detroit、およびWI38細胞を含む。本発明者らは、Hela細胞およびA549細胞の両方を、本発明の実証のために最初に選択した。以下の実施例に記載するように、本発明者らは、両方の試験された親株からパッケージング細胞を容易に生成し得た。野生型AAVの場合（例示の目的のためにAAV2を用いる）、rep遺伝子はp5プロモーターの調整下にあり、プロモーター自身がrepの発現により強力にダウンレギュレートされる。本発明に従ってパッケージング細胞株を構築する際、細胞は、プロモーターに作動可能に連結され、安定に組み込まれたAAV cap遺伝子、および異種プロモーターに作動可能に連結され、安定に組み込まれたAAV rep遺伝子を提供する；本明細書中に記載および例示したように。rep遺伝子発現により強力にダウンレギュレートされていない任意の異種プロモーターが適切である；しかし、rep遺伝子の構成的な発現は宿主細胞においてネガティブな影響を有し得るので誘導プロモーターが好ましい。本発明のrepおよびcap遺伝子が、宿主細胞中に安定に組み込まれるため、本発明者らは、配置の影響（クロマチン構造により得る）はまた、遺伝子の発現に影響を及ぼし得、そして好ましいパッケージング株を得る際に有利であり得ると考える。特に、以下に記載の方法は、所望の特性を示すパッケージング細胞を生成および選択するために使用し得る。多くの種類の誘導プロモーターは、当業者に公知である；例示により、重金属イオン誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）；ステロイドホルモン誘導プロモーター（例えば、MMTVプロモーターまたは成長ホルモンプロモーター）；および例えば、T7 RNAポリメラーゼの存在下で活性であるT7ファージ由来のプロモーターのようなプロモーター、を含む。特に好ましい誘導プロモーターのサブクラスは、rAAVベクターの複製およびパッケージングを完了するために用いられるヘルパーウイルスにより誘導されるプロモーターである。多くのヘルパーウイルス誘導プロモーターが公知であり、例えば、アデノウイルスE1Aタンパク質により誘導されるアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；VP16または1CP4のようなヘルペスウイルスタンパク質により誘導されるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニアまたはポックスウイルス誘導プロモーターを含む。以下の実施例は、プロモーターがヘルパーウイルス誘導可能か否か、および高効率パッケージング細胞を生成することにおいて有用であるか否かを容易に決定することについて推定のプロモーターを試験するために使用し得る一般的に適用可能な方法を例示する。簡潔には、この方法は、AAV rep遺伝子のp5プロモーターを推定のヘルパーウイルス誘導プロモーター（当業者に周知であるかまたはプロモーター欠損「レポーター」遺伝子に連結するような周知の技術を用いて同定される）に置き換えることを含む。抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択マーカーに好ましく連結されたAAV rep-cap遺伝子（p5置換）は、次いで、適切な宿主細胞（例えば、以下に例示するHelaまたはA549細胞）に安定に組み込まれる。次いで、選択条件下で（例えば、抗生物質の存在下において）比較的よく増殖し得る細胞が、ヘルパーウイルスの添加におけるrepおよびcap遺伝子の発現能力を試験される。repおよび／またはcap発現についての最初の試験として、細胞が、repおよび／またはcapタンパク質を検出するために免疫蛍光法を用いて容易にスクリーニングされ得る（以下の実施例に例示される）。この方法を用いて、本発明者らは、p5プロモーターをマウスメタロチオネイン遺伝子由来のヘルパーウイルス誘導プロモーターに置換し、生じた構築物を用いて高力価のrAAV粒子を産生し得るパッケージング細胞株を生成した。本発明者らの系において、AAV cap遺伝子はまたパッケージング細胞株中に安定に組み込まれる。好ましい実施態様において、repおよびcap遺伝子は、親株にこれら両方を含むプラスミドを用いて共に導入される（本質的に、repの上流配列、すなわちp5プロモーター領域の置換を除いて、これらはAAVゲノム中に配置される）。以下の例示される実施例において、本発明者らは、pMT-rep/cap//pKO -neoと称されるプラスミドを調製した（図１に示す）。プラスミドは、rep-cap 遺伝子を含む領域に連結される異種プロモーターを含む。p19プロモーターおよびp40プロモーターを含むrep-cap領域の残部は保持される。このプラスミドはまた、AAVポリアデニル化シグナルを含む。従って、プラスミドに存在しない天然のAAVの構成要素は、p5プロモーター領域（異種プロモーターにより置換された）およびITR（別々に導入されたベクタープラスミドに存在する）を含む。上述のrepおよびcap遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、次いで、当業者において通常の方法に従って、非トランスフェクト細胞から選択される。最も簡便には、選択は、１つ以上の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）にrep およびcap遺伝子を連結させることにより達成される。例えば、以下に記載のpMt -rep-rep/cap//pKO-neo構築物において、ネオマイシン耐性遺伝子は続くrep-cap 配列に含まれる。好ましくは、このような選択マーカーは構成プロモーターに駆動される；そして好ましくは、このようなマーカーは、AAV-cap遺伝子に対して逆方向で導入される。なぜなら逆方向での導入は、選択マーカーを駆動するプロモーターのrep遺伝子の発現に影響を与える能力（宿主細胞に対して有害であり得る）を減少させる傾向にあるからである。トランスフェクションおよび回収の後、細胞株は耐性を提供された抗生物質に曝される（上述の構築物の場合、ゲネチシンが用いられる）。宿主細胞への組み込みは、例えばサザン分析を用いて簡便にモニターされ得る。repおよびcapタンパク質の発現は、種々の技術を用いてアッセイされ得る；構造アッセイ（例えば、免疫蛍光法）、および機能アッセイ（例えば、侵入rAAVベクターの複製およびパッケージング）を含む−これらの両方は以下の実施例において例示される。以前の研究において、哺乳動物細胞におけるrepタンパク質の発現は、移植効率の減少および／または増殖速度の減少と関連した。例えば、メタロチオネインプロモーターおよびpSV2neoの制御下でのrepコード配列のヒト293細胞への同時トランスフェクションは、重金属の非存在下においてさえも、コントロール細胞より遅い速度でDNA合成の進行を示すネオマイシン耐性細胞株の生成をもたらした(Yangら、1994、J.Virol. 68:4847-4856を参照のこと)。同時トランスフェクションは両方のプラスミドの取り込みおよび維持を必要とするが、ゲネチシンはネオマイシン耐性プラスミドのみを選択するので、rep含有プラスミドは最終的に失われ得るという可能性が存在する。さらに、repの導入が宿主細胞に負の効果を働かせる場合（プロモーターを誘導しない場合さえも）、rep活性の損失を好む選択圧が存在する。これらの初期の観察に基づいて、r epを維持しおよび発現する細胞はゆっくりと増殖することが当業者には予想される。逆に、細胞がrep活性の損失により正常増殖度を復活することを予想し得る。本発明者らの好ましい系において、選択マーカーはrep-cap配列として同じプラスミド上に含まれる；そしてこの両方が宿主ゲノム中に安定して組み込まれる。プラスミドMt-rep/cap//pKOneoの場合、例えば、ゲネチシン耐性細胞は、neo 遺伝子ならびにpMt-rep/capの組み込まれたコピーを有することが予想される。本発明者らの系において、rep配列は容易に失われ得ないため、先の技術によりレシピエント細胞が増殖速度の減少を示すことが予想される。驚くべきことに、本発明者らの構築物を典型的な哺乳動物宿主細胞(HelaおよびA549)に導入すると、ゲネチシン耐性クローンの増殖速度は細胞株のいずれにおいても有意に影響されなかった。先に観察されたrep活性と増殖速度の減少との間の関連に基づき、実質的に正常な増殖速度を示す細胞は、rep遺伝子がいくぶん不活性化または損失している宿主を表すことが当業者には予想され得る。実際、さらなる実験（以下に記載）は、rep遺伝子が生じた細胞株に安定に組み込まれることを示した；そして、さらに、培地へのアデノウイルスの導入が、機能的rep遺伝子の比較的に高レベルの合成を生じることを示した。これらの結果は、本発明者らのアプローチが、過去に観察された増殖制限に従属されない安定な細胞株を生成するために用いられ得るということを示唆した；そして、以下に記載するように、その後の実験により、これらの方法が組換えAA Vベクターを効果的にパッケージングし得る細胞株を生成するために用いられ得ることを確認した。これらの方法を用いて、本発明者らは、当業者が少なくとも親細胞の２分の１の速度で複製し得、そして１細胞あたり100rAAV粒子より多くの粒子を産生し得るパッケージング細胞を容易に得られることを見出した。本発明の好ましい実施態様において、細胞は親株の少なくとも３分の２の速度で増殖し、そして１細胞あたり250rAAV粒子より多い粒子を産生する。これまでに２つの異なる親株を用いて、本発明者らは、実質的に親細胞と同じ速度で複製し（少なくとも約80％の速度で）、そして１細胞あたり約500rAAV粒子より多くの粒子を産生するパッケージング細胞を生成した。rAAV ベクターの生成：遺伝子治療のような目的のために有用である組換えAAV粒子を生成するために、１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または「標的」ポリヌクレオチド）を囲むAAV逆方向末端反復(ITR)領域を含む組換えAAVベクターとともにパッケージング細胞株が供給される。この標的ポリヌクレオチドは、自身のプロモーターまたは異種プロモーターのいずれかのプロモーターに作動可能に連結されている。多くの適切なプロモーターが当該分野において公知であり、その選択は標的ポリペプチドの所望の発現レベルに依存する；構成的な発現、誘導可能な発現、細胞特異的または組織特異的な発現などのうちどれを所望するかに依存する。好ましくは、rAAVベクターはまた、rAAVベクターにより感染された細胞の選択を可能にするために、ポジティブ選択的マーカーを含む。ネガティブ選択的マーカーもまた含まれ得る；必須または所望となるべきこれらの同じ細胞に対して選択する方法として。好ましい実施態様において、S.D.Lupton(PCT/US91/08442およびPCT/US94/05601を参照のこと)により記載された「二機能性選択融合遺伝子」を使用し得る。簡潔には、これらの構築物は優性のポジティブ選択的マーカーとネガティブ選択的マーカーとの間の直接翻訳融合物を含む。好ましいポジティブ選択的マーカーは、hph、neo、およびgptからなる群より選択される遺伝子由来であり、そして、好ましいネガティブ選択的マーカーは、シトシンデアミナーゼ、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT、およびgptより構成される群から選択される遺伝子由来である。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択的マーカーがhp hまたはneo由来であり、そしてネガティブ選択的マーカーがシトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子由来である、二機能性選択融合遺伝子である。例示の方法により、本発明者らはプロモーターに作動可能に連結された機能的な嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターポリペプチド (CFTR)をコードするポリヌクレオチドを含むrAAVベクターを使用した。現在、当業者に公知であるように、嚢胞性線維症細胞患者由来の細胞においてCFTR機能欠損を再構築し得る種々のCFTRポリペプチドが存在する。例えば、Richら(1991,Sc ience,253:205-207)は、塩化物を送達し得、そして天然に存在するCFTR欠損を修正し得るアミノ酸残基708〜835欠損CFTR誘導体について記載した。Eganら（19 93）は、正常なCFTRの電気生理学的特徴を回復し得る他のCFTR誘導体（関連のないタンパク質由来の約25アミノ酸に続いて残基119より開始する天然のCFTR配列を含む）について記載した。２つのさらなる例を引用することで、Arispeら(199 2,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 89:1539-1543)は、残基433〜586を含むCFTRフラグメントは、脂質２重層において正しい塩化物チャンネルを再構成するために十分であることを示した；およびSheppardら(1994,Cell,76:1091-1098)は、その約半分の長さに残基836において切断されたCFTRポリペプチドがまだ制御された塩化物チャンネルを構築し得ることを示した。従って、天然のCFTRタンパク質および変異体ならびにそれらのフラグメントは、それゆえ、すべてが本発明において有用であるCFTRポリペプチドを構成する。他の有用な標的ポリヌクレオチドは、多くの異なる適用のためのrAAVベクターを生成するために本発明において使用され得る。このようなポリヌクレオチドは以下を含むが、これらに限定されない：(i)損失しているか、欠損しているか、または最適のレベルよりやや低めの構造タンパク質または酵素により生じる遺伝子欠損を軽減するための遺伝子治療の他の形態において有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；(ii)アンチセンス分子へと転写されるポリヌクレオチド；(iii)転写因子または翻訳因子に結合するデコイへと転写されるポリヌクレオチド；(iv)サイトカインのような細胞調節因子をコードするポリヌクレオチド ;(v)ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特異的な薬剤に影響されやすいレシピエント細胞を作製し得るポリヌクレオチド；および(vi)いくつかの肺ガンおよび乳ガンと関連する損失または損傷しているp53遺伝子の置換のための野生型p53腫瘍抑制cDNAのような、ガン治療のためのポリヌクレオチド。生じた組換えAAVベクターの治療的特異性が導入されたプラスミドにより決定されるので、同一のパッケージング細胞株を任意のこれらの適用に使用し得る。特異的な標的ポリヌクレオチドを含むこのプラスミドは、数種類の可能な方法の１つにより（例えば、エレクトロポレーションを含む）、AAVベクターの産生のためにパッケージング細胞株に導入される。ヘルパーウイルスは、rAAVベクターの導入前、導入の間、導入後に導入され得る。実施例10に例示したように、プラスミドはヘルパーウイルスとともに培養物を同時感染させられ得る。次いで、これれらの細胞は、当該分野で公知である適切な期間、代表的には２〜５日、複製およびパッケージングに適切な条件で培養される（上記の文献および下記の実施例を参照のこと）。溶解物を調製し、そして組換えAAVベクター粒子を当該分野で公知の技術により精製する。好ましい実施態様において、以下の実施例にも例示したが、組換えAAVベクターウイルスは、自身がパッケージング細胞株のクローン中に安定に組み込まれる。このような安定な、ベクター含有パッケージング株は増殖され得、そして使用直前まで保存され得る。rAAV粒子の産生を誘導するために、使用者は簡単にヘルパーウイルスで細胞を感染させ、そしてAAVの複製およびパッケージングに適切な条件下で細胞を培養する（以下に記載のように）。AAV の力価をアッセイするための細胞株の使用本発明者らはまた、rAAV感染力価アッセイを行うために、本発明のパッケージング細胞株を使用した。特に、上述のように、本発明者らは侵入rAAVと複製rAAVとの間には２対数より大きな範囲において直線関係があることを実証した。従って、本発明の他の実施様態において、本発明者らはrAAV調製物の相対的な感染力価の決定のための方法を提供する。ヘルパーウイルスの量およびインキュベート時間がrep活性の量に影響するが、以下の例示のように、これらは容易に最適化され得、そして一定に保持され得る。アッセイを行うために、パッケージング細胞株のアリコートが、標準量のヘルパーウイルスおよび試験されるrAAV調製物の連続希釈物とともに導入される。AAVの相対的な感染力価は、適切なインキュベーション後の各アリコートにおける複製AAVの存在量により示される；そして既知の力価の調製物と比較され得る。当業者に対するさらなる手引きとして以下に示される実施例を提供する。これらの実施例がいかなる方式でも本発明を限定すると解釈されるべきではない。実施例実施例１異種プロモーターに作動可能に連結された rep-cap 配列をコードするプラスミドの構築最初の例として、本発明者らは、マウスメタロチオネインI（mMt-I）遺伝子プロモーター（転写の開始に対して−650から＋64まで；Srivastavaら（1983）J.V irol. 45:555-564；ならびにHamerおよびWalling（1992）J ．Mol．Appl．Genet. 1:273-288により記載される）に作動可能に連結された野生型repおよびcap遺伝子（AAVゲノムのデオキシリボヌクレオチド311から4493まで）を含有するプラスミドを構築した。この構築物は、AAVリーディングフレーム、p19プロモーター、p40プロモーターおよびポリアデニル化シグナルの全てを維持しながら、両方のITRを効果的に除去し、そしてp5プロモーターをmMt-Iプロモーターに置換する。このベクターには、neo遺伝子（ネオマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する）をSV40初期プロモーターの制御下に含むpKOneo、ならびにpMt-rep/capとは反対の転写方向に配向したSV40ポリアデニル化シグナルおよびSV40スモールtイントロンもまた含まれる（Itoら（1994）Cancer Lett. 76:33-39）。プラスミドの構築、生育および精製は標準的な手法に従った（Ausubelら編（1 987）Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associate s，Brooklyn，N.Y.）。生じたプラスミド（pMt-rep/cap//pKO-neoと命名した）を図１に示す。実施例２ rep-cap 遺伝子の哺乳動物細胞株への組込み宿主細胞ゲノムに組込まれた後のrepおよびcap遺伝子の発現を調べるため、本発明者らはプラスミドpMt-rep/cap//pKO-neoを典型的な哺乳動物細胞株に導入した。ヒトHela細胞およびA549細胞［American Type Culture Collection（ATCC）］を、抗生物質および10％ウシ胎児血清を補足したDulbecco改変Eagle培地（DME M）中で生育させた。全てのDNAトランスフェクションは、Gene Pulser（Bio-Rad ）を用い、250ボルト/960μFで、0.4cmキュベット内の800μl血清非含有培地中の4×10⁶細胞への、15〜30μｇpMt-rep/cap//pKO-neoプラスミドのエレクトロポレーションによって行なった。エレクトロポレーション後、細胞を、1mg/ml活性成分ゲネチシン（Gibco-BRL ）の存在下、低密度でプレーティングした。個々のコロニーをリングクローニングし、1mg/mlゲネチシン中で拡大、および維持した。先行する研究では、哺乳動物細胞中のrepタンパク質の発現は、プレーティング効率の低下および/または増殖速度の減少と相関していた。例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にあるrepコード配列とpSV2neoとのヒト293細胞への同時トランスフェクションはneo耐性細胞株の生成をもたらし、それは重金属の非存在下でさえ、コントロール細胞よりも速度の遅いDNA合成によって発達するようであった（Yangら（1994）J ．Virol. 68:4847-4856）。同時トランスフェクションには両方のプラスミドの取り込みおよび維持が必要であるが、ゲネチシンはneo耐性プラスミドを選択するに過ぎず、rep含有プラスミドが結局失われ得るという可能性がある。さらに、repの導入が（プロモーターが誘導されない場合でさえ）宿主細胞に対して負の効果を発揮するのだとすれば、rep活性の喪失を助長する選択圧が存在するだろう。これらのより初期の観察結果に基づけば、repを維持し、そして発現した細胞はゆっくり生育すると予想される。逆に、細胞はrep活性を失うことによって正常な生育速度を再開すると予言し得た。本発明者らの好ましい系では、選択可能なマーカーがrep-cap配列と同じプラスミド上に含まれ、そして両者は宿主ゲノムに安定に組込まれる。例えばプラスミドMt-rep/cap//pKOneoの場合、ゲネチシン耐性細胞は組み込まれたneo遺伝子のコピーならびにpMt-rep/capを有すると予想される。本発明者らの系では、rep 配列が容易に失われ得ないので、先行技術は、その受容細胞が低下した生育速度を示すと予測する。驚くべきことに、本発明者らの構築物を典型的な哺乳動物宿主細胞（HelaおよびA549）に導入した場合、ゲネチシン耐性クローンの増殖速度はどちらの細胞株においても有意な影響を受けなかった。以前に観察されたrep活性と生育速度低下との間の連関に基づいて、実質的に正常な生育速度を示す細胞は、rep遺伝子がどういうわけか不活化されているか、または失われている宿主を表すのだと予想されるかもしれない。実際には、追加実験（下記）によって、rep遺伝子が得られた細胞株中に安定に組込まれることが示され；そしてさらに、培地へのアデノウイルスの導入により、比較的高レベルの機能的repタンパク質の合成がもたらされることが示された。これらの結果は、本発明者らのアプローチを用い、過去に観察された類の生育制限を受けない安定な細胞株を作成し得ることを示唆した。そして、下記のように、続く実験によって、これらの方法を用いて、組換えAAVベクターを効率よくパッケージングする能力を持つ細胞株を作成し得ることが確認された。本明細書中に記載の方法論を当該分野で利用可能な教示および物質と組み合わせることによって、当業者は、これらの実施例中で例示するような本発明の実施態様を容易に調製し得る。しかし、便宜上、本発明者らは典型的なプラスミド（ pMt-rep/cap//pKO-neo）、ならびに典型的なパッケージング細胞（Helaクローン 37およびA549クローン20）（これらは全てこれらの実施例中に記載される）をAm erican Type Culture Collection（12301 Parklawn Dr.，Rockville，Maryland 29852）に寄託している。これらは以下の３つの受託番号を有する（現在指定中）。これらの寄託はブダペスト条約の約定に基づいて行われ、そして参考として本明細書中に援用される。本願が米国特許として認可され発行される際、この寄託の入手可能性に関する全ての制限が撤回不能に取り除かれる。そして本願の係属中は、特許商標庁長官が37CFR1.14および35USC1.22に基づいてその資格を有すると決定した者は、指定された寄託を入手する手段を利用できる。さらに、指定された寄託は、寄託の日から30年間、または当該寄託に対する最新の請求の後５年間、あるいは当該米国特許の実施可能な期間中は、そのいずれが長くても、維持される。本明細書で言及する寄託物質は単に便宜のために意図されるに過ぎず、そしてこれらの物質は本明細書中の記載からみて、本発明の実施には必ずしも必要でない。さらにこれらの物質は参考として本明細書中に援用される。実施例３間接的免疫蛍光によるRepタンパク質の検出本発明者らは、間接的免疫蛍光（IF）を用いて、トランスフェクションした細胞株（HelaまたはA549細胞から派生した典型的クローン）におけるrepタンパク質の発現を調べた。トランスフェクションした細胞およびコントロール細胞を、200μl培養培地中、Lab-Tek８ウェルチャンバースライド（Nunc Inc.，III.）上に播種（1.6×10⁴ 細胞/チャンバー）し、そして終夜インキュベートした。次に、細胞を個別に、もしくは野生型AAV（MOI＝5）、アデノウイルス（MOI＝10）およびZnSO₄（100μ M）と組み合わせて、約30時間処理した。培養培地を除去した後、細胞を０℃のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で３回洗浄し、そしてアセトンで１〜２分間固定した。次に、細胞をPBSでさらに３回洗浄し、そして「WT」培地（１％脱脂乾燥乳，0.5mg/mlウシ血清アルブミン，150mM NaCl，50mM HEPES（pH7.5），0.1％ Tween 20および１mM NaN₃）と共に終夜インキュベートした。抗rep抗体（ウサギ抗Rep78.93；Trempeら（1987）Virology 161:18-28）をWT 中に１:250に希釈し、そして100μlを室温（RT）で１時間各ウェルに加えた。細胞をWTで５回洗浄し、次いで抗ウサギIgG FITC結合二次抗体（Sigma Chemical C orp.）の１:100希釈液100μlと共に暗所室温で１時間インキュベートした。次に、暗所で細胞をWTで３回、そしてPBSで２回洗浄し、そしてAxioskop H蛍光顕微鏡（Zeiss，Germany）で調べた。アデノウイルスが培養培地中に含まれる場合、調べた細胞の多くでrepタンパク質が検出可能だった（23のA549クローン中８クローン、および28のHelaクローン中３クローン）。重金属の添加は、いずれの条件下でも、観察されるrep発現に有意な影響を与えなかった。これらの観察結果は、アデノウイルス感染の非存在下では、これらの細胞内で repタンパク質が合成されたとしてもそれは極めてわずかであることを示唆している。rep（IF）陽性細胞のサブセットから単離したゲノムDNAを、標識化したca pプローブとハイブリダイゼーションさせたサザン分析は、rep-cap配列の単一コピーが細胞DNA中に組込まれたことを立証した。メタロチオネインプロモーターをヘルパーウイルス誘導性にしている機構に関する理論に束縛されることは望まないが、本発明者らの結果は、それがアデノ応答性エレメントを含み得ることを示唆している。このことは、Carthewら（1985 ）Cell 43:439-448によってなされた観察と一致する。いずれにせよ、ヘルパーウイルス誘導性プロモーターを得、そしてそれを試験するための記載の方法は、単にrep構築物中のプロモーターを入れ替え、そして本明細書に記載するようにコロニーについてスクリーニングすることだけにより、潜在的に興味深い任意のプロモーターに容易に適用し得る一般的な方法である。以降の実験では、下記のように、Hela起源およびA549起源の典型的クローンを、それらの感染後組換えAAVゲノムを複製する能力について試験した。実施例４ IF+ 細胞の複製活性 pMt-rep/cap//pKO-neoでトランスフェクションした細胞株が機能的な複製活性を示すかどうかを調べた。典型的な組換えAAVとして、嚢胞性線維症cDNAを含む組換えAAV調製物（AAVCFTR）（Riordanら（1989）Science 245:1066-1073）を選択した。このrAAV調製物の連続希釈液を、rep IF+細胞（Helaクローン37およびA 549クローン20）上で、アデノウイルスあり/なし（MOI＝25）でインキュベートした。AAVCFTRウイルスを、1.2×10⁸〜1.2×10³粒子（スロットブロットによって決定した）に希釈し、そして両方の細胞株（６ウェルディッシュ中2.5×10⁵細胞/ウェル）上で、アデノウイルスあり/なし（MOI＝25pfu/細胞）で48時間インキュベートした。このウイルスに感染した細胞に対するアデノウイルス感染の効果について制御するため、各ウェルからの培養培地をラベルしたチューブに取り出し、そして培養ディッシュにまだ付着している全ての細胞をトリプシン処理し、そして培地中に存在する細胞とともにプールした。その細胞懸濁液を3000rpm で５分間遠心分離した後、その上清を除去し、そして全核酸を細胞ペレットから調製した（Ausubelら編（1987）Current Protocols in Molecular Biology，Gre ene Publishing Associates，Brooklyn，N.Y.に従う）。この実験の陰性コントロールには、全ての細胞株上でのアデノウイルスを伴わない1.2×10⁸AAVCFTR粒子のインキュベートが含まれた。各試料につき、15μgの核酸および無処理のHelaクローン37 DNA＋/−20pg AAV CFTRプラスミド（サザン用陽性コントロール）をEcoRIで消化し、ゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、そしてCFTR cDNA内からの1.488kb EcoRIフラグメントでプローブした。それぞれ内因性ヒトCFTR遺伝子（Rommensら（1989）S cience 245:1059-1065）のハイブリダイゼーションパターンおよび1.488kb CFTR cDNAシグナルを示すため、図２のレーン15〜18は親のHelaおよびA549ゲノムDNA ＋/−20pg AAVCFTRプラスミドを含んでいる。1.488kbに移動するハイブリダイゼーションシグナルが、AAVCFTRウイルスおよびアデノウイルスによる感染後のHel aクローン37細胞株およびA549クローン20細胞株の両方から単離したDNAに存在する（図２のレーン１、２および８）。これらの結果によって、Helaクローン37株およびA549クローン20株の両方は、アデノウイルスを絶対的に必要とするが（図２のレーン１および７、または８および14を比較のこと）、両方の株は、感染時に侵入AAVCFTR DNAを複製するのに十分なrep活性を有することが立証された。実施例５ rAAV 感染力価アッセイ侵入AAVCFTRウイルスと複製されるAAVCFTR配列との間に直線的な関係（これは、rAAV感染力価アッセイの原理として利用され得る）が存在するかどうかを決定するため、さらなるrep活性アッセイを行なった。スロットブロットハイブリダイゼーションによって決定した1.2×10⁹〜1.2×1 0⁷AAVCFTR粒子の３種類の対数希釈液を、６ウェル培養プレート中の2.5ml培地内で、2.5×10⁵Helaクローン37細胞（アデノウイルスあり（MOI＝25pfu/細胞））上で48時間培養した。陰性コントロールとして、1.2×10⁹AAVCFTR粒子（アデノウイルスなし）が含まれた。48時間後、複製したCFTR配列を検出するため、既述のように、サザン分析用の全核酸を細胞から調製した（図３）。1.2×10⁹AAVCFT R粒子のみの存在下で培養したHelaクローン37細胞（図３のレーン１）は、内因性ヒトCFTR遺伝子のゲノム構成を反映するハイブリダイゼーションパターンを示した。Helaクローン37 DNAへの20pgのAAVCFTRプラスミドの添加のより、1.488kb EcoRIフラグメントがこのブロットのどこに移動するかが示される（図３のレーン５）。AAVCFTRウイルスの連続希釈液（アデノウイルスあり）からの試料を、それぞれ図３のレーン２〜４に示す。1.488kbで観察されるハイブリダイゼーションは、投入したAAVCFTRウイルスに比例し、そしてアデノウイルスの存在に絶対的に依存するようである（レーン１および２を比較のこと）。これらの結果は、本発明に従って産生されたパッケージング細胞がアデノウイルスの存在下でAAVゲノムを複製し得ること、ならびに、この活性を用いて、所定の試料中に存在する感染性ウイルス粒子の数を定量し得ることを立証している。この特定のアッセイでは、直線的応答には、2.5×10⁵Helaクローン37細胞上で少なくとも1.2×10⁷AAVCFTR粒子（≧MOI＝48粒子/細胞）を培養する必要があった。粒子数は、AAVCFTRウイルス調製物のスロットブロットハイブリダイゼーションによって決定した。この粒子数は、感染性AAVCFTR粒子および欠陥AAVCFTR粒子の寄与を反映し得る。それに対して、上記の感染アッセイでは、感染性粒子のみが検出されるはずである。実施例６パッケージング細胞へのAAVCFTRプラスミドDNA遺伝子移入現在の組換えAAV（rAAV）ウイルス産生法には、rAAV配列を含有するプラスミドベクターの一過性のトランスフェクションが含まれる。rAAV調製物からそのプラスミドDNAを除去するには、１つ以上の工程が企てられる。上記の感染アッセイが非ウイルスDNAを検出するかどうかを決定するため、AAVCFTRプラスミドDNA を、パッケージング細胞（Helaクローン37）（アデノウイルスあり/なし）上で直接インキュベートした。コントロールとして、AAVCFTRプラスミド（10μg）を、既述のように、４×10⁶Helaクローン37細胞中にエレクトロポレーションし、次いで100mm培養ディッシュに移した。翌日、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（P BS）中で洗浄し、トリプシン処理し、そして2.5×10⁵細胞を６ウェルディッシュ中にアデノウイルスあり/なし（MOI＝25pfu/細胞）で２連で播種した。７つのさらなるウェルにそれぞれ2.5×10⁵Helaクローン37細胞を播種し、そしてAAVCFTR プラスミドの希釈系列（アデノウイルスあり/なし）（MOI＝25pfu/細胞）、またはAAVCFTRウイルス（１×10⁹粒子）（アデノウイルスあり）と共に培養した。感染の48時間後に全核酸を調製し、そして既述のようにサザン分析を行なった。レーン９および10（図４）は、EcoRIで消化し、そして1.488kb CFTR cDNAフラグメントでプローブした場合の、内因性CFTR遺伝子およびヒトゲノムDNAに添加されたCFTR cDNA（20pg）の移動のハイブリダイゼーションパターンを示す。AAVCFTR プラスミドのHelaクローン37細胞へのエレクトロポレーションは1.488kbに移動するシグナルをもたらし（図４のレーン１）、そしてトランスフェクション24時間後にこれらの細胞中に存在するAAVCFTRプラスミドの量を表す。アデノウイルスと共にインキュベートされたエレクトロポレーションした同じ数の細胞は、He laクローン37細胞のエレクトロポレーション後にAAVCFTRプラスミドゲノムを増幅する能力を反映して、1.488kbに移動するかなり多くのシグナルを示す（図４のレーン２）。レーン３および４は、５μgのAAVCFTRプラスミド（それぞれアデノウイルスあり/なし）をトランスフェクションしないで直接Helaクローン37細胞上でインキュベートした結果を示す。アデノウイルスの存在下で増幅された少量のハイブリダイゼーションが存在するが、そのシグナルは、AAVCFTRプラスミドトランスフェクション（図４のレーン２）またはAAVCFTRウイルス感染（図４のレーン11）のいずれかから由来するものよりかなり低い。レーン５〜８は、それぞれ１μg、100ng、10ngおよび１ngのAAVCFTRプラスミドを、アデノウイルスの存在下で、Helaクローン37細胞上でインキュベートした結果を示す。これらの結果は、アデノウイルス感染の存在下では、本発明に従って産生されたパッケージング細胞がrepタンパク質を発現し、そしてトランスフェクションによって導入された組換えAAVプラスミドDNAゲノムを複製し得ることを立証している。この活性は、AAVプラスミドDNAのパッケージング細胞へのトランスフェクションに依存した（例えば、AAV配列を含有するプラスミドDNAとアデノウイルス感染との同時インキュベーションはこの投入プラスミドの顕著な複製をもたらさなかった）。実施例７ rAAV 感染力価アッセイの時間経過ウイルスインキュベーションの時間が上記のrAAV感染アッセイに影響を及ぼしていないことを証明するため、アデノウイルスの存在下でパッケージング細胞の感染後のAAVCFTRウイルスの複製の時間経過を調べた。 AAVCFTRウイルス複製の時間経過を決定するため、1.5×10⁵Helaクローン37細胞を1.2×10⁹AAVCFTR粒子およびアデノウイルス（MOI＝5pfu/細胞）と共に６ウェルディッシュ中で培養し、そしてサザン分析のため、感染後種々の時間に収集した。コントロールヒトDNA＋/−添加されたAAVCFTRプラスミド（20pg）もまた、コントロールとしてサザン分析に含まれた（図５のレーン12および13）。レーン２〜６は、感染後20、24、39、42、および48時間で全核酸を収集した結果を示す（図５）。1.488kbに観察されるシグナルは、39時間までに最大まで増大し（図５のレーン４）、そしてレーン１および６の比較により、このアッセイの投入アデノウイルス依存性が立証される。これらの結果は、実施例５に記載の感染性rAAV滴定アッセイが最大に達するのに十分な時間進行していたことを立証している。実施例８ rAAV 感染力価アッセイのアデノウイルス滴定アデノウイルスがrAAV感染力価アッセイにおいて制限的でないことを確認するため、このアッセイに対するアデノウイルスMOIの効果を調べた。 1.2×10⁹AAVCFTR粒子と共に2.5×10⁵Helaクローン37細胞上で培養し、そして4 8時間後に収集した、MOI＝25.0〜0.1の投入アデノウイルスの希釈液は、1.488kb に移動するシグナル強度を減少させなかった（図５のレーン７〜11）。これらのデータを総合すると、インキュベーション時間も添加したアデノウイルスの量も、実施例４および５に示される初期滴定結果に顕著な悪い影響を与えないことを示している。実施例９トランスフェクション後の感染性AAVCFTRビリオンの産生次に、本発明のパッケージング細胞に導入したAAVCFTRプラスミドが、感染性A AVCFTRビリオンに効果的にパッケージングされ得ることを立証した。詳細には、AAVCFTRプラスミド（10μg）を、既述のように、2×10⁶個の典型的なパッケージング細胞（Helaクローン37）にエレクトロポレーションし、そして 100mm培養ディッシュ上にプレーティングした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、ペレット化し、そして培養培地中で生育させた。細胞を計数し、そして２×10⁵個を６ウェル培養ディッシュの２つのウェルに播種した。細胞を、2.5mlの培地（アデノウイルスあり/なし）（MOI＝10）と共にインキュベートした。48時間後、細胞を培地中に掻き出し、そしてドライアイス/EtOH槽および3 7℃のH₂O槽中で、それぞれ３回の凍結/融解サイクルにかけた。3000rpmで10分間の遠心分離後、滴定のために上清を取り出し（約2.5ml）、そしてrAAVCFTR複製中間体を捜すために、凍結/融解後の細胞残渣ペレットから全核酸を単離した。実施例４および５に記載のように滴定するために、エレクトロポレーションしたパッケージング細胞（アデノウイルスあり）からの上清（50μlおよび500μl）、およびアデノウイルスで感染していないコントロールの希釈液（500μl）を、追加のアデノウイルス（MOI＝５）の存在下、2.5mlの最終容量中で48時間培養した。エレクトロポレーションまたはアデノウイルスに由来する潜在的プラスミドの混入を、追加のrAAVCFTRビリオンを生成するための初期培養物から除去する工程は何も企てなかった。凍結/融解後の細胞ペレットから単離した核酸（EcoRIで消化し、CFTR配列についてプローブした）のサザン分析を図６に示す。図４で既述したように、AAVCFT Rプラスミドは、エレクトロポレーション後のHelaクローン37細胞中に検出され得、そして1.488kbに移動するハイブリダイゼーションシグナルは、アデノウイルスによる感染後に増大する（図６のレーン１および２）。 AAVCFTRプラスミドでエレクトロポレーションしたHelaクローン37細胞（アデノウイルスあり/なし）から得られる上清の滴定を、図７のレーン１〜３に示す。アデノウイルスなしのコントロールから得られる上清と共にインキュベートした Helaクローン37細胞から単離したDNA中には、1.488kbに移動するかすかなシグナルが検出され得、そしてエレクトロポレーションに由来する少量の混入している投入AAVCFTRプラスミドを反映している（図７のレーン１）。アデノウイルスと共に培養した２連のウェルから得られ、そしてHelaクローン37細胞上で滴定された上清は、コントロール条件と比較してかなり多くの1.488kbに移動するハイブリダイゼーションを表した（図７のレーン３および１を比較のこと）。これらの結果は、組換えAAVプラスミドによるパッケージング細胞のトランスフェクションおよびアデノウイルスによる感染の後に、rAAV配列が複製され、そして感染性rAAVビリオンに組み立てられることを立証している。実施例10 rAAV ウイルスによる感染後の感染性組換えAAVビリオンの産生さらに、パッケージング細胞の感染後の感染性rAAVビリオン生成能力を調べた。新たに合成されたウイルスが生成されるかどうかを決定するために、いくつかのコントロール実験が含まれた。これらには、親のHela細胞の使用およびrAAVの生成を許容するはずのない条件の使用が含まれる。Helaクローン37細胞および親のHela細胞の両者（2.5×10⁵）を、６ウェルディッシュに播種し、そして以下の条件下で48時間インキュベートした：＋10⁹AAVCFTR粒子のみ；＋10⁹AAVCFTR粒子と、アデノウイルス（MOI＝10）または野生型AAV（MOI＝５）のいずれか；あるいは３つ全て。48時間後、細胞を実施例９に記載のように収集した。サザン分析のために、核酸を凍結/融解後の細胞ペレットから単離し、そして上清を滴定した。上記の条件下で処理したHelaクローン37細胞（レーン３〜６）、または親のHe Ia細胞（レーン７〜10）のいずれかから単離した核酸のサザン分析を、図６に示す。10⁹AAVCFTR粒子のみによるいずれの細胞株の処理も、複製されたAAVCFTR配列の生成をもたらさなかった（それぞれ図６のレーン３および７）。Helaクローン37細胞へのアデノウイルスの添加は、1.488kbに移動する有意な量のシグナルを生成し（親のHela細胞ではこれが起こらなかった）、以前の観察結果と合致した（図６のレーン４および８）。野生型AAVは、アデノウイルスヘルパー機能を欠くので、いずれの細胞株でも複製されたAAVCFTRの生成をもたらさなかった（図６のレーン５および９）。最後に、10⁹AAVCFTR粒子と、アデノルイスおよび野生型AAVの両方との同時感染は、Helaクローン37細胞および親のHela細胞の両方中で複製されたAAVCFTR配列の生成をもたらす（図６のレーン６および10）。野生型ウイルス複製と組換えAAVCFTRウイルス複製との間の競合のため、1.488kbに移動するシグナルは、Helaクローン37細胞では減少し得、そして全体のレーンバックグラウンドは増大する。滴定のため、凍結/融解後に生成した上清を、アデノウイルス（MOI＝5）の存在下で、新鮮なHelaクローン37細胞上でインキュベートした（特に示さない限り、500μlを2.5mlに希釈）。さらなるrAAVCFTRビリオンを生成するために、初期培養物から、投入AAVCFTRウイルス、野生型AAV、またはアデノウイルスを除去する工程を何も企てなかった。48時間後、AAVCFTR複製の検出について既述したように、全核酸を調製し、そしてサザン分析を行なった。 Helaクローン37細胞および親のHela細胞の両方を、10⁹AAVCFTR粒子と共に種々の条件下で培養した結果を図７のレーン４〜12に示す。全てのレーンが、上清中にrAAVCFTRウイルスが存在することを明らかにした。これは、新たに生成されたビリオンを投入ウイルスから精製するための試みがなされなかったという事実による。投入シグナルを超えるシグナルはいずれも、図６で観察されるAAVCFTRシグナルの増幅をもたらした条件に相関するはずである。これらの条件には、10⁹A AVCFTR粒子（アデノウイルスあり）および/または野生型AAV（親のHela細胞における）が含まれる（図６のレーン４、６および10）。他の条件は全てAAVCFTR配列の複製をもたらさなかった。そして他の条件は全て、投入AAVCFTRウイルスの存在を反映して、滴定後に類似のシグナルを示すはずである（図７のレーン４、７、９〜11）。予想されたように、AAVCFTR、アデノウイルス、および野性型AAVの同時インキュベーションは、Helaクローン37細胞および親のHela細胞の両方で、新たなAAVC FTRウイルス産生の生成をもたらした（図７のレーン８および12）。AAVCFTRウイルス産生はまた、アデノウイルスのみを伴うHelaクローン37細胞でも観察されたが、親のHela細胞では観察されなかった（図７のレーン６および４を比較のこと）。このことは、図６のレーン４で、これらの細胞から単離したDNA中にAAVCF TRシグナルの増大が観察されたことと合致する。レーン６（図７）で1.488kbに観察されるハイブリダイゼーションの強度と、投入AAVCFTRウイルスを表すシグナルの強度（レーン４、７、９〜11）との相違は、Helaクローン37細胞における AAVCFTRの感染および増幅時のAAVCFTR力価の増大を表している。これらの結果は、パッケージング細胞がアデノウイルスの存在下で、トランスフェクションまたは感染のいずれかによって、rAAVベクターゲノムを複製し得、それを感染性ビリオンにパッケージングし得ることを立証している（図６および７）。実施例11 パッケージング細胞からの組込まれたrAAVベクターの回収および増幅パッケージング細胞（Helaクローン37に由来する）を、CMVエンハンサー/プロモーターに作動可能に連結したハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する組換えAA Vベクター（rAAV-CMV-Hygroと命名された）で、既述のようにエレクトロポレーションし、そして300μg/mlハイグロマイシン中で選択することによって、安定なポリクローナルな株を得た。このパッケージング細胞中に存在するrep活性が、組込まれたrAAV-CMV-Hygro ベクターを効率よく認識し、切り出し、そして増幅し得るかどうかを決定するため、ポリクローナルなhygro耐性Helaクローン37株（2.5×10⁵細胞/ウェル）を６ウェルディッシュ上に播種し、アデノウイルス（MOI＝50）のみ、＋野生型AAV（ MOI＝５）で感染するか、もしくは感染しなかった。48時間後、既述のように核酸を調製し、NheI/Asp718で消化し、そしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する標識された1048bp NheI/Asp718フラグメントをプローブとして用いて、サザン分析を行なった。この分析の結果を図８に示す。レーン１は、親のHelaクローン37細胞株から単離したDNAを表し、それ故hygro耐性遺伝子を含有しない。レーン２は、ポリクローナルなhygro耐性Helaクローン37株からのDNAを含有し、これは、この暴露時間で、平均約１コピー/ウェルで存在する（データは示していない）耐性遺伝子の存在を示さない。アデノウイルスで処理したhygro耐性Hela クローン37細胞を含む２連のウェルから単離したDNAを、レーン３に流した。104 8bpに存在するハイブリダイゼーションは、このHelaクローン細胞に組込まれた組込みAAVCMVHygroベクターの切り出しおよび増幅に由来する物質を表わす。アデノウイルス感染物に対する野生型AAVの添加は同様の結果を与えた（レーン４）。これらの結果は、このrAAVパッケージング細胞中で生成したrep活性が、組込まれた組換えAAVベクターを認識し、切り出し、そして増幅するに十分であることを立証している。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１月２０日【補正内容】６．１明細書を以下の通り補正します。明細書第３２頁１９〜２０行の「（現在指定中）」を削除し、代わりに「（９７０４９，ＣＲＬ−１１８３１，ＣＲＬ１１８７７）」を挿入します。６．２図５および図８をそれぞれ別紙の通り補正します。【図５】【図８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．組換えAAV(rAAV)ベクターの高い効率でパッケージングし得る哺乳動物細胞を産生する方法であって、以下の工程：（ａ）プロモーターと作動可能に連結された安定に組み込まれたAAV cap遺伝子および異種プロモーターと作動可能に連結された安定に組み換えられたAAV rep 遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）に記載の細胞を複製し、細胞集団を産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の細胞集団へ、ヘルパーウイルスを導入する工程；および（ｄ）ヘルパーウイルス誘導repタンパク質活性を示す細胞を選択する工程、を包含する、方法。２．前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項１に記載の方法。３．前記パッケージング細胞が、AAV rep遺伝子を含まない親型細胞の少なくとも半分の早さで増殖し得、そして該パッケージング細胞が少なくとも100 rAAV粒子／細胞を産生するrAAVベクターをパッケージングし得る、請求項１に記載の方法。４．工程（ａ）の前記哺乳動物細胞が、p5プロモーターが異種プロモーターにより置換されたAAVの結合されたrep遺伝子およびcap遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。５．前記異種プロモーターが、マウスメタロチオメインI(mMT-I)プロモーターである、請求項４に記載の方法。６．請求項１の方法で産生される、細胞およびその子孫。７．請求項３の方法で産生される、細胞およびその子孫。８．請求項４の方法で産生される、細胞およびその子孫。９．請求項５の方法で産生される、細胞およびその子孫。１０．組換えAAV(rAAV)ベクターを高い効率でパッケージングし得る哺乳動物細胞であり、該細胞は、プロモーターに作動可能に連結された安定に組み込まれた cap遺伝子、および異種プロモーターに作動可能に連結された安定に組み込まれたrep遺伝子を含む；該細胞が、ヘルパーウイルス誘導repタンパク質活性を示す、哺乳動物細胞。１１．前記ヘルパーウイルス導入repタンパク質活性が、アデノウイルスにより誘導される、請求項１０に記載のAAVパッケージング細胞。１２．前記パッケージング細胞が、AAV rep遺伝子を含まない親型細胞の少なくとも半分の早さで増殖し得、そして該パッケージング細胞が、少なくとも100 rA AV粒子／細胞を産生するためのrAAVベクターをパッケージングし得る、請求項１０に記載のAAVパッケージング細胞。１３．前記細胞が、p5プロモーターが異種プロモーターにより置換されたAAVの結合されたrep遺伝子およびcap遺伝子を含む、請求項１０に記載のAAVパッケージング細胞。１４．前記異種プロモーターが、マウスメタロチオネインI(mMT-I)プロモーターである、請求項１３に記載のAAVパッケージング細胞。１５．安定に組み込まれた組換えAAVベクターをさらに含み、該ベクターが、２つのAAV逆方向末端反復(ITR)領域の間に位置する目的のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のAAVパッケージング細胞。１６．組換えAAVベクターをパッケージングする方法であって、以下の工程：（ａ）請求項１０に記載のAAVパッケージング細胞を提供する工程；（ｂ）組換えAAVベクターを導入する工程であって、該ベクターが２つのAAV逆方向末端反復(ITR)領域の間に位置する、目的のポリヌクレオチド配列を含む工程；（ｃ）ヘルパーウイルスを導入する工程；および（ｄ）AAVの複製およびパッケージングに適切な条件下で、該細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。１７．組換えAAVベクターをパッケージングする方法であって、以下の工程：（ａ）安定に組み込まれたrAAVベクターを含む、請求項１５に記載のAAVパッケージング細胞を提供する工程；（ｂ）ヘルパーウイルスを導入する工程；および（ｃ）AAVの複製およびパッケージングに適切な条件下で、該細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。１８．請求項１６に記載の方法に従ってパッケージングされた、組換えAAVベクター。１９．請求項１７に記載の方法に従ってパッケージングされた、組換えAAVベクター。２０．前記ベクターが嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の組換え AAVベクター。２１．rAAVベクター調製物の関連する感染力価を決定する方法であって、以下の工程：（ａ）請求項１０に記載のAAVパッケージング細胞へ、ヘルパーウイルスおよびr AAVベクター調製物の連続希釈物を導入する工程；（ｂ）AAVの複製に適切な条件下で、該細胞をインキュベートする工程；および（ｃ）複製されたrAAVベクターの量を決定する工程、を包含する、方法。