JP6986444B2 - Ｄｍｄ遺伝子のエクソン５内の内部リボソーム進入部位を活性化するための方法及び材料 - Google Patents

Description

本出願は、２０１４年８月９日出願の米国仮特許出願第６２／０３５，３９５号の出願日の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府の利益の陳述
本発明は、認可番号Ｒ０１ ＮＳ０４３２６４の下、国立神経系伝染病卒中研究所により与えられた政府支援によって為された。政府は、本発明において一定の権利を有する。

配列表の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：４８８７３ ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０，２７９バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル、２０１５年８月６日作成）を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（技術分野）

本発明は、ＤＭＤエクソン２重複以外で、ＤＭＤ遺伝子内に５’突然変異を有する患者を治療するためのオリゴマーの送達に関する。本発明は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５内の内部リボソーム進入部位を活性化して、ジストロフィンの機能的切断アイソフォームをもたらすための方法及び材料を提供する。該方法及び材料は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーなどのＤＭＤ遺伝子内の５’突然変異から生じる筋ジストロフィーの治療のために使用され得る。

筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝的疾患の群である。この群は、動きを制御する骨格筋の進行性脆弱化及び変性を特徴とする。いくつかの形態のＭＤは、幼児または小児において発達するが、中年以降まで出現しない場合もある。これらの障害は、筋脆弱性の分布及び程度（いくつかの形態のＭＤは、心筋にも影響する）、発症年齢、進行速度、及び遺伝のパターンに関して異なる。

ＭＤの一形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これは最も一般的な重症の小児形態の筋ジストロフィーであり、新生男児５０００人当たり１人に影響を及ぼす。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子内の突然変異によって引き起こされ、骨格筋及び心筋、ならびに消化管及び網膜内のジストロフィンタンパク質（４２７ＫＤａ）の非存在につながる。ジストロフィンは、サルコレンマをエキセントリック収縮から保護するだけでなく、多くのシグナル伝達タンパク質をサルコレンマに近接して係留させる。ＤＭＤの多くの臨床例は、ＤＭＤ遺伝子内の欠失突然変異と関連付けられる。ＤＭＤ遺伝子の特定に続く多系統の研究にもかかわらず、治療オプションは限定されている。コルチコステロイドは、明らかに有益であるが、歩行運動の年数が増加したとしても、その利点は長期の副作用によって相殺される。２０年以上前に報告された、元の制御されたランダム化二重盲検研究は、プレドニゾンを使用する利点を示した［Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０：１５９２−１５９７（１９８９）］。後次の報告は、ナトリウム保持性ステロイドであるデフラザコートを使用して、等しい効能を示した［Ｂｉｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１３８：４５−５０（２００１）］。最近の研究もまた、６ＭＷＴにおける歩行距離を長くするという、エクソンスキッピングによる効能を実証している。これまでのところ、公開された臨床研究は、読取り枠がエクソン５１をスキップすることによって回復される突然変異に対してのみ、利点を報告している［Ｃｉｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３７８：５９５−６０５（２０１１）及びＧｏｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４：１５１３−１５２２（２０１１）］。二重盲検ランダム化治療治験の報告のみが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であるエテプリルセンを用いて、有望な結果を実証した［Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，７４（５）：６３７−６４７（２０１３）］。これらのエクソンスキッピング治験の全てにおいて、結果の共通点は、初期の中程度の改善後の、歩行能力のプラトーであった。別のエクソンスキッピングに関する論文は、Ｇｒｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，３：３１５５（２０１４）である。

また、２０１２年３月２９日公開の米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号、２０１３年３月２１日公開の同第２０１３／００７２５４１号、及び２０１３年２月２１日公開の同第２０１３／００４５５３８号を参照されたい。

欠失突然変異とは対照的に、ＤＭＤエクソン重複は、ジストロフィン異常症患者の不偏標本において、疾患の原因となる突然変異の約５％を占めるが［Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，１３４（３）：２９５−２９８（２００５）］、突然変異のいくつかのカタログにおいて、重複の数はより多い［Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，３０（１２）：１６５７−１６６６（２００９）におけるＵｎｉｔｅｄ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ Ｐｒｏｊｅｃｔによって公開されたものを含み、それは１１％であった］。

ＤＭＤ遺伝子内の突然変異は、より重症のＤＭＤ、またはより軽度のベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）のいずれかをもたらす。表現型は、一般に、突然変異がタンパク質生成物ジストロフィンの完全な非存在をもたらすか（ＤＭＤにおいて）、または部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の翻訳を可能にする読取り枠を保存するか（ＢＭＤにおいて）に左右される［Ｍｏｎａｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４：４１２−４１５（１９８９）］。我々は以前に、この読取り枠規則に従わない特定のＢＭＤ創始者対立遺伝子（ｃ．９Ｔ＞Ｇ、ｐ．Ｔｒｐ３Ｘ）を特定した[Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，１９：７４３−７４８（２００９）及びＦｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３０：１６５７−１６６６（２００９）］。このナンセンス突然変異は、タンパク質翻訳をもたらさないことが予測されるが、筋生検は、相当量（約２１％）の、最小限しか減少されていないサイズのジストロフィン発現を明らかにし、臨床表現型は、非常に軽度のジストロフィン異常症のうちの１つである［Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，１９：７４３−７４８（２００９）］。小細胞内及び生体外翻訳研究は、ｐ．Ｔｒｐ３Ｘ患者において、翻訳がエクソン６内のＡＵＧから開始されることを実証し、表現型回復の機序としての代替翻訳開始を示唆する［Ｇｕｒｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３０：６３３−６４０（２００９）］。５’エクソンにおいて報告された大部分の切断突然変異が、実際に、ＤＭＤではなくＭＢＤと関連付けられたことに留意して、変更された翻訳開始が、この遺伝子における５’突然変異の表現型救済の一般機序であり得ることを提案し、予測は、後次の報告によって支持された［Ｗｉｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，２３：２５−２８（２０１３）及びＦｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，２３：１９２（２０１３）］。正準アクチン結合ドメイン１（ＡＢＤ１）は、タンパク質機能に必須であることが以前に提案された［Ｇｉｍｏｎａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５１３：９８−１０６（２００２）。

翻訳開始は、ｃａｐ依存性開始によって起こると一般に理解されている。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、真核細胞内のｃａｐ非依存性翻訳開始を左右するＲＮＡ制御配列であり、ｃａｐ依存性翻訳が損なわれた場合（例えば、細胞ストレス中）に活性化される。リボソームは、ｍＲＮＡ上のこれらのＩＲＥＳに直接動員され、次に、代替開始コドンに対して５’〜３’方向に走査を継続することができる。それらは、ウイルスにおいて最初に説明され、中でも脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳが最も早く特徴付けられた。これまでに約８５の細胞ＩＲＥＳが説明され、主に５’ＵＴＲ領域内に位置し、例えば、ジストロフィンの常染色体相同体であるウトロフィンＡの５’ＵＴＲは、いずれも筋肉を再生することにおいて特に活性であり、グルココルチコイドへの曝露（ＤＭＤのための療法の基幹）によって誘導可能なＩＲＥＳを含有する［Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：３２９９７−３３００５（２００５）及びＭｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，３：ｅ２３０９（２００８）］。しかしながら、他の真核性ＩＲＥＳは、コード配列内で説明され、病理の調節に関係したものもあった。これらには、軽度型の家族性大腸腺腫症に関連したＡＰＣ遺伝子内のＩＲＥＳが挙げられ、ある特定の５’突然変異を有する患者が、下流開始コドンの使用を通じて、部分的に機能的なタンパク質を依然として生成する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチド逆位末端配列（ＩＴＲ）を含めて、約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が知られている。例えば、ＡＡＶ−１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７号において提供され、ＡＡＶ−２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）において提供され、ＡＡＶ−３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９において提供され、ＡＡＶ−４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９において提供され、ＡＡＶ−５の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６において提供され、ＡＡＶ−６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２において提供され、ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部分は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９において提供され（ＡＡＶ−８に関して米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照されたい）、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）において提供され、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）において提供され、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）において提供される。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、本明細書において提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモータ（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と呼ばれる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープン読取り枠の発現を駆動する。単一ＡＡＶイントロンの差異的スプライシングにより（ヌクレオチド２１０７及び２２２７において）連結された２つのｒｅｐプロモータ（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の生成をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する、多重酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモータから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連したカプシドタンパク質の生成に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）においてレビューされる。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養物中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、多くの異なる組織を生体内で標的する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、ゆっくり分割する細胞及び非分割細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）として、本質的にそれらの細胞の寿命に渡って持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ−ｃａｐ）の一部または全てが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定かつ頑健なウイルスであることである。アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６ｏ〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの冷蔵保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥されてもよい。最後に、ＡＡＶ感染した細胞は、重複感染に耐性がない。
ＤＭＤ及びＢＭＤを含む筋ジストロフィーの治療に対する必要性が、当該技術分野において依然として存在する。

米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００７２５４１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００４５５３８号明細書

Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０：１５９２−１５９７（１９８９） Ｂｉｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１３８：４５−５０（２００１） Ｃｉｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３７８：５９５−６０５（２０１１） Ｇｏｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４：１５１３−１５２２（２０１１） Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，７４（５）：６３７−６４７（２０１３） Ｇｒｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，３：３１５５（２０１４） Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，１３４（３）：２９５−２９８（２００５） Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，３０（１２）：１６５７−１６６６（２００９） Ｍｏｎａｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４：４１２−４１５（１９８９） Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，１９：７４３−７４８（２００９） Ｇｕｒｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３０：６３３−６４０（２００９） Ｗｉｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，２３：２５−２８（２０１３） Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，２３：１９２（２０１３） Ｇｉｍｏｎａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５１３：９８−１０６（２００２） Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：３２９９７−３３００５（２００５） Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，３：ｅ２３０９（２００８） Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３） Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４） Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）

本開示は、疾患を予防する、疾患の進行を遅らせる、及び／またはＤＭＤ遺伝子の１つ以上の５’突然変異を有する患者を治療する方法及び生成物を企図する。該方法は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５内のグルココルチコイド誘導性ＩＲＥＳの特定に基づき、この活性化が、機能的Ｎ末端切断ジストロフィンアイソフォームを生成し得る。

本開示は、ＤＭＤ遺伝子内に５’突然変異を有する患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを改善する方法であって、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を患者に投与するステップを含み、患者が、ＤＭＤエクソン２重複を有していない、方法を企図する。

方法のいくつかの実施形態において、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の以下の部分、
５’ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ ３’（配列番号１）、
５’ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ ３’（配列番号２）、
５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣ ３’（配列番号３）、または
５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣ ３’（配列番号４）のうちの１つを標的とする。

方法のいくつかの実施形態において、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、組換えアデノ随伴ウイルスのゲノム内のＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、組換えアデノ随伴ウイルスのゲノムは、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡが欠如している。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ウイルスゲノムは、自己相補的ゲノムである。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組換えＡＡＶ１ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルス、組換えＡＡＶ９ウイルス、または組換えＡＡＶ ｒｈ７４ウイルスである。いくつかの実施形態において、Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体は、Ｕ７−ＢアンチセンスポリヌクレオチドＴＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号５）、Ｕ７−ＣアンチセンスポリヌクレオチドＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（配列番号６）、Ｕ７−ＡＬアンチセンスポリヌクレオチドＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号７）、またはＵ７−ＡＳアンチセンスポリヌクレオチドＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号８）を含む。

方法のいくつかの実施形態において、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、アンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、エクソン２標的アンチセンスオリゴマー、ＢアンチセンスオリゴマーＵＡＣＣＣＡＵＵＵＵＧＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡ（配列番号９）、ＣアンチセンスオリゴマーＡＵＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＵＧＣ（配列番号１０）、ＡＬアンチセンスオリゴマーＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１１）、またはＡＳアンチセンスオリゴマーＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１２）である。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であるか、細胞貫通ペプチド共役されたＰＭＯ（ＰＰＭＯ）であるか、ＰＭＯ内在化ペプチド（ＰＩＰ）であるか、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を含むか、または２’Ｏ−メチル−ホスホロチオエート修飾を含む。

方法のいくつかの実施形態において、ジストロフィーの病状の進行が、患者において阻害される。

方法のいくつかの実施形態において、筋機能が、患者において改善される。筋機能の改善は、筋力の改善、または起立及び歩行の安定性の改善であり得る。

いくつかの実施形態において、企図される方法は、グルココルチコイドを患者に投与することをさらに含む。

本開示は、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を企図し、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、Ｕ７−Ｂアンチセンス配列ＴＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号５）、Ｕ７−Ｃアンチセンス配列ＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（配列番号６）、Ｕ７−ＡＬアンチセンス配列ＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号７）、またはＵ７−ＡＳアンチセンス配列ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号８）を含むＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体である。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡが欠如している。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶゲノムは、自己相補的ゲノムである。いくつかの実施形態において、組換えアデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ１ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルス、組換えＡＡＶ９ウイルス、または組換えＡＡＶ ｒｈ７４ウイルスである。いくつかの実施形態において、自己相補的ゲノムは、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体Ｕ７＿ＡＣＣＡを含む（図１５Ａは、ゲノムインサート３’〜５’を示すが、図１５Ｂは、図１５Ａの配列の逆相補を示す）。

本開示は、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を企図し、該ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、エクソン２標的アンチセンスオリゴマー、ＢアンチセンスオリゴマーＵＡＣＣＣＡＵＵＵＵＧＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡ（配列番号９）、ＣアンチセンスオリゴマーＡＵＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＵＧＣ（配列番号１０）、ＡＬアンチセンスオリゴマーＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１１）、またはＡＳアンチセンスオリゴマーＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１２）である。いくつかの実施形態において、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＯ）であるか、細胞貫通ペプチド共役されたＰＭＯ（ＰＰＭＯ）であるか、ＰＭＯ内在化ペプチド（ＰＩＰ）であるか、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を含むか、または２’Ｏ−メチル−ホスホロチオエート修飾を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ＤＭＤ遺伝子内に５’突然変異を有する患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを改善する方法であって、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を前記患者に投与するステップを含み、前記患者が、ＤＭＤエクソン２重複を有していない、方法。
（項目２）
前記ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体が、組換えアデノ随伴ウイルスのゲノム内のＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体が、アンチセンスオリゴマーである、項目１に記載の方法。
（項目４）
ジストロフィー病理の進行が、前記患者内で阻害される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目５）
筋機能が、前記患者において改善される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目６）
前記筋機能の改善が、筋力の改善である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記筋機能の改善が、起立及び歩行の安定性の改善である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記組換えアデノ随伴ウイルスのゲノムが、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠失する、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記ウイルスゲノムが、自己相補的ゲノムである、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、組換えＡＡＶ１ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルス、組換えＡＡＶ９ウイルス、または組換えＡＡＶ ｒｈ７４ウイルスである、項目２に記載の方法。
（項目１１）
グルココルチコイドを前記患者に投与することをさらに含む、項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体が、前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の以下の部分、
５’ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ ３’（配列番号１）、
５’ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ ３’（配列番号２）、
５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣ ３’（配列番号３）、または
５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣ ３’（配列番号４）のうちの１つを標的とする、項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体が、
Ｕ７−ＢアンチセンスポリヌクレオチドＴＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号５）、
Ｕ７−ＣアンチセンスポリヌクレオチドＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（配列番号６）、
Ｕ７−ＡＬアンチセンスポリヌクレオチドＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号７）、または
Ｕ７−ＡＳアンチセンスポリヌクレオチドＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号８）を含む、項目２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１に記載の方法。
（項目１４）
前記アンチセンスオリゴマーが、エクソン２標的アンチセンスオリゴマー、
ＢアンチセンスオリゴマーＵＡＣＣＣＡＵＵＵＵＧＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡ（配列番号９）、
ＣアンチセンスオリゴマーＡＵＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＵＧＣ（配列番号１０）、
ＡＬアンチセンスオリゴマーＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１１）、または
ＡＳアンチセンスオリゴマーＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１２）である、項目３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１に記載の方法。
（項目１５）
ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体が、
Ｕ７−ＢアンチセンスポリヌクレオチドＴＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号５）、
Ｕ７−ＣアンチセンスポリヌクレオチドＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（配列番号６）、
Ｕ７−ＡＬアンチセンスポリヌクレオチドＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号７）、または
Ｕ７−ＡＳアンチセンスポリヌクレオチドＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号８）を含むＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体を含む、組換えアデノ随伴ウイルス。
（項目１６）
前記組換えＡＡＶのゲノムが、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠失する、項目１５に記載の組換えＡＡＶ。
（項目１７）
前記組換えＡＡＶゲノムが、自己相補的ゲノムである、項目１５または１６に記載の組換えＡＡＶ。
（項目１８）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、組換えＡＡＶ１ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルス、組換えＡＡＶ９ウイルス、または組換えＡＡＶ ｒｈ７４ウイルスである、項目１５、１６、または１７に記載の組換えＡＡＶ。
（項目１９）
前記ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体が、
エクソン２標的アンチセンスオリゴマー、
ＢアンチセンスオリゴマーＵＡＣＣＣＡＵＵＵＵＧＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡ（配列番号９）、
ＣアンチセンスオリゴマーＡＵＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＵＧＣ（配列番号１０）、
ＡＬアンチセンスオリゴマーＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１１）、または
ＡＳアンチセンスオリゴマーＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１２）である、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体。
（項目２０）
ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体Ｕ７＿ＡＣＣＡを含む自己相補的ゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルスであって、前記自己相補的ゲノムが、図１５に記載のゲノムである、組換えアデノ随伴ウイルス。
（項目２１）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、組換えＡＡＶ１ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルス、組換えＡＡＶ９ウイルス、または組換えＡＡＶｒｈ７４ウイルスである、項目２０に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
（項目２２）
前記エクソン２標的アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＯ）であるか、細胞貫通ペプチド共役されたＰＭＯ（ＰＰＭＯ）であるか、ＰＭＯ内在化ペプチド（ＰＩＰ）であるか、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を含むか、または２’Ｏ−メチル−ホスホロチオエート修飾を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記エクソン２標的アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＯ）であるか、細胞貫通ペプチド共役されたＰＭＯ（ＰＰＭＯ）であるか、ＰＭＯ内在化ペプチド（ＰＩＰ）であるか、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を含むか、または２’Ｏ−メチル−ホスホロチオエート修飾を含む、項目１９に記載のＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体。

ヒト生検標本は、エクソン６からの翻訳を確証する。（ａ）フレームシフト及び早期停止コドン（ｐ．Ｔｙｒ１１ＰｈｅｆｓＸ７）をもたらすエクソン２の欠失（ＤＥＬ２）を有する無症候個体からの筋肉の免疫ブロット分析は、最小限しか減少されていないサイズのジストロフィンの発現を実証する。抗体：ＮＣＬ−ＤＹＳ１（棒ドメイン）、ＮＣＬ−ＤＹＳ２（Ｃ末端） ヒト生検標本は、エクソン６からの翻訳を確証する。（ｂ）欠失エクソン２個体の筋生検からのジストロフィンペプチドの質量分析的分析は、Ｍ１２４（エクソン６内）の前にコードされるペプチドを特定しないが、エクソン２、３、４内でコードされるペプチドは、対照筋（対照）内で容易に特定された。ジストロフィン参照配列ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１１５３２。それぞれ配列番号２７〜２９。 ヒト生検標本は、エクソン６からの翻訳を確証する。（ｃ）エクソン２内に切断フレームシフト（ＦＳ）突然変異（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）を有するＢＭＤ患者から、正常対照（ＷＴ）から、及びエクソン２の重複（ＤＵＰ２）を有するＤＭＤ患者からの筋肉のジストロフィン発現の免疫ブロット分析。フレームシフト突然変異によって誘導された早期停止コドンの存在下で、減少したサイズ及び量のジストロフィンタンパク質は、Ｃ末端抗体（ＰＡ１−２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｎｃ．；赤色）を使用して検出され得るが、エクソン１内でコードされたエピトープに対して検出された抗体（Ｍａｎｅｘ１Ａ、緑色）を使用すると検出されない。対照的に、ジストロフィンは、Ｄｕｐ２患者において全体的に非存在である。 ヒト生検標本は、エクソン６からの翻訳を確証する。（ｄ）リボソームプロファイリングデータを使用して、患者ＦＳ（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）及び正常対照筋からの最も豊富な１０００転写物（ｍＲＮＡ質量により）の各々に対して翻訳効率（ＴＥ）メトリックを計算した。各遺伝子のＴＥ値は、リボソームフットプリント配列読取り値の正規化した数を、コード（ＣＤＳ）配列内でマップされたＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りの数で割って計算した。上位１０００遺伝子の順位転写物量は、転写当たりのマップされた読取りの総数から計算した。遺伝子オントロジーアノテーションにより「サルコメリック」として分類された遺伝子の下位群は、赤で色付けされ、ＤＭＤ遺伝子の位置は円で囲まれる。 ヒト生検標本は、エクソン６からの翻訳を確証する。（ｅ）ＤＭＤ遺伝子（ｈｇ１９、ｃｈｒＸ：３２，７３７，５９９〜３３，４８７，３９０）の５’領域にマップされた筋総ＲＮＡからのＲＮＡ−Ｓｅｑ読取り深度。Ｄｐ４２７ｍエクソン１〜７の読取り深度は、１ヌクレオチド当たり４０読取りで切断され、エクソン読取り深度は、１ヌクレオチド当たり６７〜９１（ＦＳ、ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）及び５８〜８９（正常）読取りの範囲であった。 ヒト生検標本は、エクソン６からの翻訳を確証する。（ｆ）Ｄｐ４２７ｍ（ＮＭ＿００４００６．２）転写の５’領域（ｎｔ．１〜１５００）にマップされたリボソームフットプリント。エクソン１ Ｄｐ４２７ｍ開始コドン及びｃ．４０＿４１ｄｅｌ突然変異の位置は、エクソン６代替ＡＵＧ（緑色）開始コドンで始まるＣＤＳ（緑色）の残りから分離された第１のＣＤＳセグメント（緑色）としての短いＯＲＦ（ｐ．Ｇｌｕ１４Ａｒｇｆｓ＊１７）と共に示される。アスタリスクは、エクソン１〜５内の９個のアウトオブフレームＡＵＧコドンの位置を示す。 ジストロフィンエクソン５は、ｃａｐ非依存性翻訳を誘導し得る。（ａ）生体外転写／翻訳系（ウサギ網状赤血球溶解産物［ＲＲＬ］、左）内の下流（ＦＬｕｃ）シストロンの翻訳、及び続くジシストロニック二重ルシフェラーゼレポーターにおけるＣ２Ｃ１２細胞（右）への形質移入の誘導。結果は、ホタル：ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｆ／Ｌ）の比として表され、空ベクターに対して正規化される（１として設定）。 ジストロフィンエクソン５は、ｃａｐ非依存性翻訳を誘導し得る。（ｂ）ＲＲＬアッセイにおいて使用されるＴ７転写生成物のホルムアルデヒド電気泳動は、ＲＮＡ完全性を確認する。 ジストロフィンエクソン５は、ｃａｐ非依存性翻訳を誘導し得る。（ｃ）エクソン５ ＩＲＥＳのマッピング：ｃａｐ非依存性翻訳活性をマップするために使用されるジシストロニックマッピング構築体（左）。各例において、付番は、Ｄｐ４２７ｍ ｃＤＮＡ配列に基づき、全長構築体ｐＲｄＥＦ＋４＋３６９（エクソン１〜６）は、＋４位で始まり、天然ＡＵＧ開始コドンを除外する。エクソン６が保存され、ＡＵＧ２（Ｍ１２４）及びＡＵＧ３（Ｍ１２８）が、下流ＦＬｕｃレポーターを用いてフレーム内でクローン化された。ＦＬｕｃ発光（ｃａｐ依存性）は、Ｃ２Ｃ１２細胞（右）内のジシストロニック構築体の翻訳後のＲＬｕｃ発光（ｃａｐ依存性）のパーセンテージとして表される。全ての結果は、エクソン６単独ベクターに対して正規化し、ＦＬｕｃ：ＲＬｕｃの比は、値１に設定した。クラスカル・ワリス検定を使用して統計分析を行い、各構築体対エクソン６単独ベクターの結果を比較したところ、全体的に空ベクターに相当する発現レベルをもたらした（ｐ＞．９９）。下流レポーターの有意に増加した翻訳は、エクソン１〜６（ｐ＜．０００１）、エクソン２〜６（ｐ＝０．０１７５）、エクソン３〜６（ｐ＝０．０００９）、エクソン３＊〜６（ｐ＝０．００７８）、エクソン４〜６（ｐ＝０．００７８）、またはエクソン５〜６（ｐ＝０．００１９）で実証された。対照的に、エクソン５の欠失（全体または部分的のいずれか）は、エクソン６単独と比較して、３つ全てにおいて有意差をもたらさなかった。 ジストロフィンエクソン５は、ｃａｐ非依存性翻訳を誘導し得る。（ｄ）パネル（ｃ）のスキーム上に矢印として描かれるように位置するプライマーを使用して、形質移入されたＣ２Ｃ１２細胞に由来するＲＮＡから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ生成物は、変更されたスプライシングの証拠を示さない。 ジストロフィンエクソン５は、ｃａｐ非依存性翻訳を誘導し得る。（ｅ）ＦＬｕｃシストロンを標的とするＰ^３２放射標識されたプローブを使用する、Ｃ２Ｃ１２形質移入された細胞のノーザンブロット分析は、ジストロフィンエクソン１〜５の存在下で増加したシグナルを説明するためのＲＮＡらせん破壊の証拠を示さない。（約３ｋｂの非特異的バンドが、空ベクターを含むあらゆる形質移入条件下で検出され、したがって、空ベクターと比較して、ＦＬｕｃまたはＥＭＣＶシグナルにおける増加には関連しない。 ジストロフィンエクソン５は、ｃａｐ非依存性翻訳を誘導し得る。（ｆ）ＩＲＥＳ活性は、エクソン２の欠失によってではなく、重複したエクソン２の存在によって抑制される。エラーバーは、標準偏差を表す。 アウトオブフレームエクソンスキッピングは、患者由来の細胞株内のＩＲＥＳ活性を刺激する。（ａ）ヒトＤＭＤエクソン１〜１０読取り枠（青色）及び５’ＵＴＲ（赤色）の概略表示。各エクソンの上の青色の数字は、ｃＤＮＡ位置を示し、各エクソンの下の赤色の数字は、アミノ酸位置を示す。正準アクチン結合ドメイン１は、予測される（ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅを介して）ＣＨ及びＡＢＳドメインと共に表される。 アウトオブフレームエクソンスキッピングは、患者由来の細胞株内のＩＲＥＳ活性を刺激する。（ｂ）エクソン２（配列番号３０）の概略表示。スプライスアクセプター（Ｓ．Ａ．）、スプライスドナー（Ｓ．Ｄ．）、またはエクソンスプライスエンハンサー（Ｅ．Ｓ．Ｅ）配列（ヒトスプライシングファインダーまたはＥＳＥファインダー３．０を使用して予測される）のいずれかに影響を及ぼす、選択された標的配列が下に示される。 アウトオブフレームエクソンスキッピングは、患者由来の細胞株内のＩＲＥＳ活性を刺激する。（ｃ）Ｕ７−Ｃ及びＵ７−ＡＬの各々の２つのコピーは、エクソン２をスキッピングする際に最も効率的であったため、同じＡＡＶプラスミドにクローン化された（図１０を参照されたい）。結果として得られる構築体は、Ｕ７−ＡＣＣＡと称される。Ｕ７−ＡＣＣＡベクター（１Ｅ１１ ｖｇ）またはＨ２Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ Ｈ２Ａ）の、ｗｔまたは重複したエクソン２ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ（ＦＭ）細胞のいずれかへの感染後のＲＴ−ＰＣＲ結果。これらは、ｈＴＥＲＴ及びｔｅｔ誘導性ＭｙｏＤレンチウイルスに安定して感染した患者線維芽細胞株に由来し、ドキシシクリンでの治療は、後次ジストロフィンｍＲＮＡ発現と共に、筋原性系統への分化転換をもたらす。 アウトオブフレームエクソンスキッピングは、患者由来の細胞株内のＩＲＥＳ活性を刺激する。（ｄ）Ｕ７−ＡＣＣＡによるＦＭ細胞の感染の１４日後に行われた免疫ブロットは、より小さいＮ末端ジストロフィンタンパク質の発現を示す（矢印）。抗体：Ｃ末端ジストロフィン（ＰＡ１−２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｎｃ．）。約３９０ｋＤａのより小さいバンドが全てのレーンで検出されるが、非特異的であり（未治療標本において見られるように）、ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームに対応しない。（画像は、明確性のために組み立てられた。完全な画像は、図１１として含まれる）。 Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて著しいＮ切断ジストロフィン発現をもたらし、ジストロフィン関連タンパク質の局在化を回復する。（ａ、ｂ）１ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡのＴＡ筋内注入の４週間後に行われたＲＴ−ＰＣＲ結果は、（ａ）Ｄｕｐ２及び（ｂ）対照ＢＩ６マウス（ＰＤＮ：メチルプレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）の両方において、エクソン２の両コピーのほぼ完全なスキッピングを示す。Ｄｕｐ２動物（ａ）において、定量は、Ｄｕｐ２転写が全体の５．１％であることを明らかにしたが、野生型は、８．６％であり、Ｄｅｌ２転写は、８６．３％であった。野生型ＢＩ６動物（ｂ）において、野生型転写は、１４．２％であり、Ｄｅｌ２転写は、８５．８％であった。 Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて著しいＮ切断ジストロフィン発現をもたらし、ジストロフィン関連タンパク質の局在化を回復する。（ａ、ｂ）１ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡのＴＡ筋内注入の４週間後に行われたＲＴ−ＰＣＲ結果は、（ａ）Ｄｕｐ２及び（ｂ）対照ＢＩ６マウス（ＰＤＮ：メチルプレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）の両方において、エクソン２の両コピーのほぼ完全なスキッピングを示す。Ｄｕｐ２動物（ａ）において、定量は、Ｄｕｐ２転写が全体の５．１％であることを明らかにしたが、野生型は、８．６％であり、Ｄｅｌ２転写は、８６．３％であった。野生型ＢＩ６動物（ｂ）において、野生型転写は、１４．２％であり、Ｄｅｌ２転写は、８５．８％であった。 Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて著しいＮ切断ジストロフィン発現をもたらし、ジストロフィン関連タンパク質の局在化を回復する。（ｃ）マウスＤｍｄ遺伝子の５’領域にマップされたＤｕｐ２ Ｕ７−ＡＣＣＡ治療（上）及びＤｕｐ２未治療（下）マウスからの前脛骨筋総ＲＮＡライブラリーを使用するＲＮＡ−Ｓｅｑ読取り深度（ｍｍ９、ｃｈｒＸ．８０、１５０，０００〜８１，０５０，０００）。 Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて著しいＮ切断ジストロフィン発現をもたらし、ジストロフィン関連タンパク質の局在化を回復する。（ｄ）感染の１ヶ月後に行われた免疫ブロットは、Ｄｕｐ２マウス及び対照ＢＩ６マウスの両方において、Ｎ切断アイソフォーム（アスタリスク）の有意な発現を示す。Ｕ７−ＡＣＣＡを注入したＢＩ６雄において誘導されたタンパク質は、Ｄｕｐ２治療動物において発現したものと同じサイズであり、このタンパク質と全長アイソフォームとの間のサイズ差を確認する。（Ｃ末端抗体：ＰＡ１−２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｎｃ）。同じ標本のクマシー染色は、移行挙動の差を実証しない。 Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて著しいＮ切断ジストロフィン発現をもたらし、ジストロフィン関連タンパク質の局在化を回復する。（ｅ）ジストロフィン（Ｃ末端抗体：ＰＡ１−２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｎｃ）、β−ジストログリカン（β−ＤＧ、ＭＡＮＤＡＧ２）、及び神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ、ｓｃ−６４８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の免疫蛍光染色。 Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて著しいＮ切断ジストロフィン発現をもたらし、ジストロフィン関連タンパク質の局在化を回復する。（ｆ）１ｅ１１ｖｇの筋内注入の１ヶ月後のＤｕｐ２マウスにおけるエヴァンスブルー（ＥＢＤ）保護アッセイは、筋膜の安定化を示す。エヴァンスブルーの取込み（赤色）は、陽性ジストロフィン発現のない線維においてのみ見られる（緑色、Ｃ末端抗体：ＰＡ１−２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｎｃ）。（これらのパネルに使用されたＤｕｐ２マウス、ｎ＝５） ジストロフィンＩＲＥＳのグルコルチコイド活性化。（ａ）エクソン５〜６ ＩＲＥＳ構築体を担持するｐＲＤＥＦベクターで形質移入されたＣ２Ｃ１２細胞からの溶解物上で行われた二重ルシフェラーゼアッセイ。メチルプレドニゾロン（ＰＤＮ）は、用量依存的にＩＲＥＳ活性を増加させる。エラーバーは、標準偏差を表す。 ジストロフィンＩＲＥＳのグルコルチコイド活性化。（ｂ）Ｕ７−ＡＣＣＡ及びＰＤＮ（６．４μＭ）の両方で処置したＤｕｐ２ ＦＭ細胞は、増加したジストロフィン発現を示す。野生型レーンの画像強度を下げて、バンドの特定を可能にした。ＭＨＣ＝ミオシン重鎖（負荷対照）。 ジストロフィンＩＲＥＳのグルコルチコイド活性化。（ｃ）代表的な免疫ブロットは、ＰＤＮ（１ｍｇ／ｋｇ／日）での治療後に１ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡを注入したＤｕｐ２マウスにおいて、増加したジストロフィンの発現を実証する。％Ｄｙｓ：対照筋に対して正規化されたジストロフィン：α−アクチニンの強度比。 ジストロフィンＩＲＥＳのグルコルチコイド活性化。（ｄ）ＰＤＮの存在または非存在下でのＵ７−ＡＣＣＡ治療された筋肉におけるジストロフィン／α−アクチニンシグナルの定量。前脛骨筋内でＵ７−ＡＣＣＡで治療した５匹の動物に、ＰＢＳまたはＰＤＮ（１ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかを注入した。免疫ブロットを各筋肉上で二重に行い、結果として得られる５レーンからのジストロフィン及びα−アクチニンの両方に対するシグナルを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。有意に多くのジストロフィンが、ＰＤＮ治療動物からの筋肉内に存在した（Ｐ＝０．０１５９、両側マン・ホイットニー検定、エラーバーは、標準偏差を表す）。 ジストロフィンＩＲＥＳのグルコルチコイド活性化。（ｅ）代表的なウェスタンブロットは、ＢＩ６マウスと比較して、Ｄｕｐ２内の増加したウトロフィンレベルを実証する。ＰＤＮ（１ｍｇ／ｋｇ／日）での治療は、ウトロフィンの発現を増加させない。 ジストロフィンＩＲＥＳのグルコルチコイド活性化。（ｆ）Ｕ７−ＡＣＣＡ及びＰＤＮの存在または非存在下での治療された筋肉におけるウトロフィン／α−アクチニンシグナルの定量。前脛骨筋内でＵ７−ＡＣＣＡで治療した５匹の動物に、ＰＢＳまたはＰＤＮ（１ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかを注入した。結果として得られる５レーンからのウトロフィン及びα−アクチニンの両方に対するシグナルを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。４つの間で有意差は検出されなかった（クラスカル・ワリス、エラーバーは、標準偏差を表す）。 ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現は、筋膜の完全性を改善し、収縮によって誘導される損傷からＤｕｐ２筋を保護する。Ｄｕｐ２前脛骨筋は、５ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡ単独の筋内注入によって、またはメチルプレドニゾロン（ＰＤＮ：１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で治療し、注入後４週間で分析した。（ａ）未治療のＤｕｐ２動物における中心核化（筋線維の７３．０±１．６％）は、Ｕ７−ＡＣＣＡ単独での治療によって有意に低減された（６５．２±２．２％、＊＊＊ｐ＝０．０００２）。Ｄｕｐ２とＤｕｐ２＋ＰＤＮとの間に有意差は観察されなかった。（ａ、ｂ、ｃ）各条件に対して試験された動物ｎ＝４、マウス１匹当たり２０００線維カウントが適用された場合、両側クラスカル・ワリス、標準偏差としてのエラーバー）。 ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現は、筋膜の完全性を改善し、収縮によって誘導される損傷からＤｕｐ２筋を保護する。Ｄｕｐ２前脛骨筋は、５ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡ単独の筋内注入によって、またはメチルプレドニゾロン（ＰＤＮ：１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で治療し、注入後４週間で分析した。（ｂ）未治療のＤｕｐ２筋におけるエヴァンスブルー染色（ＥＢＤ）陽性線維のパーセンテージ（１４．７±６．６％、１つの外れ値が、点として表される）は、Ｕ７−ＡＣＣＡ単独での治療によって（２．８±１．８％、＊ｐ＝０．０３１０）、またはプレドニゾンとの組み合わせで（０．６５±０．５％、＊＊＊ｐ＝０．０００５）低減される。Ｄｕｐ２とＤｕｐ２＋ＰＤＮとの間に有意差は観察されなかった。ＥＢＤ陽性線維は、動物１匹当たりにカウントされた合計５，０００線維のうちのパーセントとして定量された。（ａ、ｂ、ｃ）各条件に対して試験された動物ｎ＝４、マウス１匹当たり２０００線維カウントが適用された場合、両側クラスカル・ワリス、標準偏差としてのエラーバー）。 ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現は、筋膜の完全性を改善し、収縮によって誘導される損傷からＤｕｐ２筋を保護する。Ｄｕｐ２前脛骨筋は、５ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡ単独の筋内注入によって、またはメチルプレドニゾロン（ＰＤＮ：１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で治療し、注入後４週間で分析した。（ｃ）未治療のＤｕｐ２マウスにおける正規化された最大後肢（Ｎｏｒｍ ｍａｘ ＨＬ）握力（動物質量１ｋｇ当たり２．２２±０．２６ｋｇの力、またはｋｇｆ／ｋｇ）は、ＢＩ６よりも有意に低い（３．３６±０．３７ｋｇｆ／ｋｇ、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。Ｕ７−ＡＣＣＡ単独（３．３５±０．３２ｋｇｆ／ｋｇ、＊＊＊ｐ＜０．０００１）またはプレドニゾンとの組み合わせ（３．１７±０．２８ｋｇｆ／ｋｇ、＊＊＊ｐ＝０．０００２）のいずれかでの治療後に、強度が有意に改善し、いずれもＢＩ６において見られるものとは有意に異ならないレベルに強度を回復させる。Ｄｕｐ２とＤｕｐ２＋ＰＤＮとの間に有意差は観察されなかった。（ａ、ｂ、ｃ）各条件に対して試験された動物ｎ＝４、マウス１匹当たり２０００線維カウントが適用された場合、両側クラスカル・ワリス、標準偏差としてのエラーバー）。 ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現は、筋膜の完全性を改善し、収縮によって誘導される損傷からＤｕｐ２筋を保護する。Ｄｕｐ２前脛骨筋は、５ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡ単独の筋内注入によって、またはメチルプレドニゾロン（ＰＤＮ：１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で治療し、注入後４週間で分析した。（ｄ）未治療のＤｕｐ２動物におけるテタニー性攣縮後の正規化された特定力（１７０．９±１４．３ｍＮ／ｍｍ^２）は、ＢＩ６よりも有意に低い（２７４．０±１２．１ｍＮ／ｍｍ^２、＊＊ｐ＝０．００６１）。Ｕ７−ＡＣＣＡ単独（２３６．０４±１９．４ｍＮ／ｍｍ^２、＊ｐ＝０．０３５０）またはプレドニゾン（２５１．２±１０．４ｍＮ／ｍｍ^２、＊＊ｐ＝０．００２５）での治療に続いて力が有意に増加し、いずれもＢＩ６において見られるものとは有意に異ならないレベルに特定力を回復させる。Ｄｕｐ２とＤｕｐ２＋ＰＤＮとの間に有意差は観察されなかった。（ｄ、ｅ）少なくとも３匹の動物からの筋肉ｎ＝５、平均値の標準誤差としてのエラーバー）。 ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現は、筋膜の完全性を改善し、収縮によって誘導される損傷からＤｕｐ２筋を保護する。Ｄｕｐ２前脛骨筋は、５ｅ１１ｖｇ Ｕ７−ＡＣＣＡ単独の筋内注入によって、またはメチルプレドニゾロン（ＰＤＮ：１ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で治療し、注入後４週間で分析した。（ｅ）治療は、反復エキセントリック収縮に続く力の喪失からＤｕｐ２筋を有意に保護する。２要因分散分析は、未治療のＤｕｐ２に対する減衰曲線の有意な改善を実証し（＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１）、ボンフェローニ事後分析は、両方の治療の組み合わせが、収縮＃３〜＃１０に続く力保持において、対照ＢＩ６との有意差を示さなかったことを実証する（＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｄｕｐ２とＤｕｐ２＋ＰＤＮとの間に有意差は観察されなかった（ｐ＜０．９９）。２要因ＡＮＯＶＡは、Ｄｕｐ２＋Ｕ７とＤｕｐ２＋Ｕ７＋ＰＤＮとの間の有意差を実証する（＊ｐ＜０．０５）。（ｄ、ｅ）少なくとも３匹の動物からの筋肉ｎ＝５、平均値の標準誤差としてのエラーバー）。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ａ）エクソン２の欠失（ＤＥＬ２）を有する患者からのＨ＆Ｅ染色された筋部分は、ジストロフィン特徴の非存在を明らかにする。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ｂ）ＮＣＬ−ＤＹＳ３抗体を使用する同一患者からの筋部分の組織化学染色（エクソン１０〜１２）。Ｍａｎｅｘ１Ａ染色（エクソン１特異的）は、その時点では行われず、組織はもはや入手可能でない。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ｃ）エクソン２を含む１２．９８３ｂｐ欠失のゲノムコンテキスト（上パネル）及び全体Ｘ染色体（下パネル）のＣＧＨプロフィール（上パネルの下部のオーバーレイトラックに示される）。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ｄ）参照ゲノム配列（ＮＣＢＩ ｈｇ１８）との連続した接合部のアラインメント（それぞれ配列番号３１〜３３）。近位及び遠位参照配列には異なる色が付けられ、接合部は、黒色である。配列間の垂直バーは、配列相同性を表す。５ｂｐのマイクロホモロジー（ＣＴＧＴＧ、ボックスで示される）は、非相同性末端接合に特徴的な遠位配列と近位配列との間の接合部において見出される。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ｅ）青色で下線が引かれたマイクロホモロジー配列を有する区切り点のゲノム配列（配列番号３４）。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ｆ、ｇ）ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定結果は、ＲＮＡレベルでのエクソン２の欠失を確認する。 欠失エクソン２無症候性少年における突然変異分析。（ｆ、ｇ）ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定結果は、ＲＮＡレベルでのエクソン２の欠失を確認する。 フレームシフト（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）患者からの筋肉の免疫蛍光分析。（ａ）ジストロフィン抗体（Ａｂｃａｍ １５２７７、Ｃ末端）を使用する免疫染色は、対照及び患者筋生検の両方におけるサルコレンマ膜でのジストロフィンを示すが、Ｍａｎｅｘ１Ａ染色は、患者標本において非存在であり、エクソン１によってコードされたエピトープの発現の欠失を確認する。（ｂ）ＤＭＤ筋−アイソフォーム転写のリボソームプロファイリング。ＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りに対して正規化された平均読取り（１ｎｔ．当たりの読取り深度対ＮＭ＿００４００６上の平均読取り深度）は、５００ｂｐ．スライディングウィンドウから計算された１ヌクレオチド当たりの平均した正規化平均読取り深度を使用して、２５ヌクレオチド毎にプロットされる。患者ＦＳ（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）からの読取りは、赤色で示され、対照筋からの読取りは、灰色で示され、回帰線は、各平均の群に対して示される。（ｃ）ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りを使用することを除いて（ｂ）にあるように、線形回帰線を、ＣＤＳ領域のみに対して計算した。（ｄ）ＮＭ＿００４００６転写のエクソン構造は、（ｂ）及び（ｃ）からのｘ軸と同じスケールで描かれる。矢印は、エクソン６における代替翻訳開始部位の位置を示す。この実験は全ＲＮＡを使用したため、ＮＭ＿００４００６にマッピングするＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りは、初期転写及び成熟転写の両方に由来する。（ｂ）に示されるＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りの５’〜３’勾配は、ＲＮＡポリメラーゼが約２．２Ｍｂのｃｈｒに渡って複写するための走行時間（約１６時間）に起因して、初期ＲＮＡ内の相対過剰の５’エクソンのヒト骨格筋からの元の推定と一致する。筋アイソフォームの７９ＤＭＤエクソンを含有するＸ領域。ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りの回帰分析は、５’〜３’勾配を示さず、リボソームが成熟転写の長さに渡って均等に分布していることを推測する。 フレームシフト（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）患者からの筋肉の免疫蛍光分析。（ａ）ジストロフィン抗体（Ａｂｃａｍ １５２７７、Ｃ末端）を使用する免疫染色は、対照及び患者筋生検の両方におけるサルコレンマ膜でのジストロフィンを示すが、Ｍａｎｅｘ１Ａ染色は、患者標本において非存在であり、エクソン１によってコードされたエピトープの発現の欠失を確認する。（ｂ）ＤＭＤ筋−アイソフォーム転写のリボソームプロファイリング。ＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りに対して正規化された平均読取り（１ｎｔ．当たりの読取り深度対ＮＭ＿００４００６上の平均読取り深度）は、５００ｂｐ．スライディングウィンドウから計算された１ヌクレオチド当たりの平均した正規化平均読取り深度を使用して、２５ヌクレオチド毎にプロットされる。患者ＦＳ（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）からの読取りは、赤色で示され、対照筋からの読取りは、灰色で示され、回帰線は、各平均の群に対して示される。（ｃ）ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りを使用することを除いて（ｂ）にあるように、線形回帰線を、ＣＤＳ領域のみに対して計算した。（ｄ）ＮＭ＿００４００６転写のエクソン構造は、（ｂ）及び（ｃ）からのｘ軸と同じスケールで描かれる。矢印は、エクソン６における代替翻訳開始部位の位置を示す。この実験は全ＲＮＡを使用したため、ＮＭ＿００４００６にマッピングするＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りは、初期転写及び成熟転写の両方に由来する。（ｂ）に示されるＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りの５’〜３’勾配は、ＲＮＡポリメラーゼが約２．２Ｍｂのｃｈｒに渡って複写するための走行時間（約１６時間）に起因して、初期ＲＮＡ内の相対過剰の５’エクソンのヒト骨格筋からの元の推定と一致する。筋アイソフォームの７９ＤＭＤエクソンを含有するＸ領域。ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りの回帰分析は、５’〜３’勾配を示さず、リボソームが成熟転写の長さに渡って均等に分布していることを推測する。 フレームシフト（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）患者からの筋肉の免疫蛍光分析。（ａ）ジストロフィン抗体（Ａｂｃａｍ １５２７７、Ｃ末端）を使用する免疫染色は、対照及び患者筋生検の両方におけるサルコレンマ膜でのジストロフィンを示すが、Ｍａｎｅｘ１Ａ染色は、患者標本において非存在であり、エクソン１によってコードされたエピトープの発現の欠失を確認する。（ｂ）ＤＭＤ筋−アイソフォーム転写のリボソームプロファイリング。ＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りに対して正規化された平均読取り（１ｎｔ．当たりの読取り深度対ＮＭ＿００４００６上の平均読取り深度）は、５００ｂｐ．スライディングウィンドウから計算された１ヌクレオチド当たりの平均した正規化平均読取り深度を使用して、２５ヌクレオチド毎にプロットされる。患者ＦＳ（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）からの読取りは、赤色で示され、対照筋からの読取りは、灰色で示され、回帰線は、各平均の群に対して示される。（ｃ）ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りを使用することを除いて（ｂ）にあるように、線形回帰線を、ＣＤＳ領域のみに対して計算した。（ｄ）ＮＭ＿００４００６転写のエクソン構造は、（ｂ）及び（ｃ）からのｘ軸と同じスケールで描かれる。矢印は、エクソン６における代替翻訳開始部位の位置を示す。この実験は全ＲＮＡを使用したため、ＮＭ＿００４００６にマッピングするＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りは、初期転写及び成熟転写の両方に由来する。（ｂ）に示されるＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りの５’〜３’勾配は、ＲＮＡポリメラーゼが約２．２Ｍｂのｃｈｒに渡って複写するための走行時間（約１６時間）に起因して、初期ＲＮＡ内の相対過剰の５’エクソンのヒト骨格筋からの元の推定と一致する。筋アイソフォームの７９ＤＭＤエクソンを含有するＸ領域。ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りの回帰分析は、５’〜３’勾配を示さず、リボソームが成熟転写の長さに渡って均等に分布していることを推測する。 フレームシフト（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）患者からの筋肉の免疫蛍光分析。（ａ）ジストロフィン抗体（Ａｂｃａｍ １５２７７、Ｃ末端）を使用する免疫染色は、対照及び患者筋生検の両方におけるサルコレンマ膜でのジストロフィンを示すが、Ｍａｎｅｘ１Ａ染色は、患者標本において非存在であり、エクソン１によってコードされたエピトープの発現の欠失を確認する。（ｂ）ＤＭＤ筋−アイソフォーム転写のリボソームプロファイリング。ＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りに対して正規化された平均読取り（１ｎｔ．当たりの読取り深度対ＮＭ＿００４００６上の平均読取り深度）は、５００ｂｐ．スライディングウィンドウから計算された１ヌクレオチド当たりの平均した正規化平均読取り深度を使用して、２５ヌクレオチド毎にプロットされる。患者ＦＳ（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ）からの読取りは、赤色で示され、対照筋からの読取りは、灰色で示され、回帰線は、各平均の群に対して示される。（ｃ）ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りを使用することを除いて（ｂ）にあるように、線形回帰線を、ＣＤＳ領域のみに対して計算した。（ｄ）ＮＭ＿００４００６転写のエクソン構造は、（ｂ）及び（ｃ）からのｘ軸と同じスケールで描かれる。矢印は、エクソン６における代替翻訳開始部位の位置を示す。この実験は全ＲＮＡを使用したため、ＮＭ＿００４００６にマッピングするＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りは、初期転写及び成熟転写の両方に由来する。（ｂ）に示されるＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りの５’〜３’勾配は、ＲＮＡポリメラーゼが約２．２Ｍｂのｃｈｒに渡って複写するための走行時間（約１６時間）に起因して、初期ＲＮＡ内の相対過剰の５’エクソンのヒト骨格筋からの元の推定と一致する。筋アイソフォームの７９ＤＭＤエクソンを含有するＸ領域。ＲＰＦ−Ｓｅｑ読取りの回帰分析は、５’〜３’勾配を示さず、リボソームが成熟転写の長さに渡って均等に分布していることを推測する。 ジストロフィンＩＲＥＳは、偏在的に活性でない。（ａ）二重ルシフェラーゼアッセイは、ＨＥＫ２０９Ｋ細胞内ではなく、２つの筋原性細胞株（Ｃ２Ｃ１２、及び商用のヒト骨格筋筋芽細胞株［ｈＳＫＭＭ］）内で活性化を実証し、筋原性系統の細胞における優先的活性化を示唆する。 ジストロフィンＩＲＥＳは、偏在的に活性でない。（ｂ）ホタルルシフェラーゼに対してプローブを使用する、形質移入されたＣ２Ｃ１２及び２９３ｋからのノーザンブロットは、転写の存在ならびに前述された（図２）非特異的バンドを実証する。特にこのバンドは、エクソン６単独構築体による形質移入後を含む、全ての条件下で存在し、したがって、エクソン５含有構築体で見られる倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）には関連しない。 ジストロフィンＩＲＥＳは、偏在的に活性でない。（ｃ）形質移入された２９３ｋ細胞に由来するＲＮＡから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ生成物は、変更されたスプライシングの証拠を示さない。エラーバーは、標準偏差を表す。 ＡＡＶ媒介性Ｕ７エクソンのスキッピングの最適化。（ａ）４つの異なる標的配列（ＡＳ、ＡＬ、Ｂ、またはＣ）を、Ｕ７の制御下でＡＡＶにクローン化した。これらのＡＡＶの単独（ａ）または組み合わせ（ｂ）のいずれかでの感染を、対照及び重複エクソン２患者由来のＦｉｂｒｏＭｙｏＤの両方で行った。ＡＡＶ感染の３日後、ＲＴ−ＰＣＲ結果は、 Ｕ７−Ｃが、対照及び重複エクソン２患者のＦｉｂｒｏＭｙｏＤの両方においてエクソンスキッピングを誘導することができるが、Ｕ７−ＡＬは、患者の細胞株においてスキッピングを誘導することができるに過ぎないことを実証した。２つのコピーがＵ７−Ｃを構築し、Ｕ７−ＡＬは、同じＡＡＶプラスミドにクローン化された（Ｕ７−ＡＣＣＡ）。（ｃ）内部エクソン２配列を標的とするＡＯＮ（ＡＯＮＨ２Ａ）を使用する、Ｄｕｐ２患者の培養されたＭｙｏＤ形質転換線維芽細胞及び初代筋芽細胞の形質移入は、同様の結果をもたらしたが、Ｕ７媒介性スキッピングより低い効率であった。 ＡＡＶ媒介性Ｕ７エクソンのスキッピングの最適化。（ａ）４つの異なる標的配列（ＡＳ、ＡＬ、Ｂ、またはＣ）を、Ｕ７の制御下でＡＡＶにクローン化した。これらのＡＡＶの単独（ａ）または組み合わせ（ｂ）のいずれかでの感染を、対照及び重複エクソン２患者由来のＦｉｂｒｏＭｙｏＤの両方で行った。ＡＡＶ感染の３日後、ＲＴ−ＰＣＲ結果は、 Ｕ７−Ｃが、対照及び重複エクソン２患者のＦｉｂｒｏＭｙｏＤの両方においてエクソンスキッピングを誘導することができるが、Ｕ７−ＡＬは、患者の細胞株においてスキッピングを誘導することができるに過ぎないことを実証した。２つのコピーがＵ７−Ｃを構築し、Ｕ７−ＡＬは、同じＡＡＶプラスミドにクローン化された（Ｕ７−ＡＣＣＡ）。（ｃ）内部エクソン２配列を標的とするＡＯＮ（ＡＯＮＨ２Ａ）を使用する、Ｄｕｐ２患者の培養されたＭｙｏＤ形質転換線維芽細胞及び初代筋芽細胞の形質移入は、同様の結果をもたらしたが、Ｕ７媒介性スキッピングより低い効率であった。 患者由来の細胞株からのウェスタンブロット。（ａ）低（上パネル）及び高（下パネル）の２つの異なる撮像強度で見られる図３ｄからの元のウェスタンブロット。上パネルからのレーン１ならびに下パネルからのレーン２及び４を使用して、図３ｄを組み立てた。ＦＭ＝ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ由来の対照細胞株、ＦＭ Ｄｕｐ２＝エクソン２重複患者からのＦｉｂｒｏＭｙｏＤ患者由来の細胞株、ＦＳ＝ｃ．４０＿４１ｄｅｌの筋生検からのタンパク質。 患者由来の細胞株からのウェスタンブロット。（ｂ）図４ｃに見られるものと同じ標本のクマシー染色は、移行挙動の有意差を実証しない。 グルココルチコイドは、ＩＲＥＳ活性を増加させるが、その活性化を強制することはできない。（ａ）グルココルチコイドで処理した２９３ｋにおける３構築体の形質移入後の二重ルシフェラーゼアッセイ結果は、ＩＲＥＳ活性が、この化合物によって誘導され得ないことを実証する。エラーバーは、標準偏差を表す。 グルココルチコイドは、ＩＲＥＳ活性を増加させるが、その活性化を強制することはできない。（ｂ）ＡＡＶコピー数のゲノムｑＰＣＲは、ＰＤＮ治療されたマウスにおけるウェスタンブロットによって検出されたジストロフィンレベルの増加が、ＰＤＮ治療動物における増加した数のＡＡＶベクターに起因しないことを確認する。１群当たりの動物Ｎ＝４。エラーバーは、標準偏差を表す。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１４）であり、ヌクレオチド２１０〜２１４７は、Ｒｅｐ７８遺伝子オープン読取り枠であり、８８２〜２０８は、Ｒｅｐ５２オープン読取り枠であり、２０７９〜２０８１は、Ｒｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７は、Ｒｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００は、スプライスドナー部位であり、２０９４〜２０９７は、スプライスアクセプター部位であり、２１２１〜２１２４は、スプライスアクセプター部位であり、１７４〜１８１は、予測されるｐ５プロモータ＋１であり、１４５〜１５１は、ｐ５ ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は、予測されるｐ１９プロモータ＋１であり、７３２〜７３８は、ｐ１９ ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４は、ＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子オープン読取り枠であり、２５０９〜２５１１は、ＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９は、ＶＰ３開始であり、４３２８〜４３３３は、ポリＡシグナルである。 例示のエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡのＡＡＶゲノムインサートを有するプラスミドのマップを示す。 （ａ）は、図１４のプラスミドのＡＡＶゲノムインサート（３’〜５’）（配列番号１５は、５’〜３’方向の同じ配列である）を示す。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）における配列の逆相補（配列番号２６）を示す。 Ｕ７は、スプライセオソームｓｎＲＮＰといくつかの特徴を共有するＵ７ｓｎＲＮＰをコードする。プレｍＲＮＡスプライシングに関与しないが、ヒストンｍＲＮＡの３’末端を処理する（Ｍuｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈuｍｐｅｒｌｉ １９９７、Ｄｏｍｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｍａｒｚｌｕｆｆ １９９９）。配列番号１５のヌクレオチド１〜１１３は、３’ＩＴＲに対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１４〜２２０は、３’未翻訳領域（ＵＴＲ）（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド２２１〜２５１は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応する。ＳｍＯＰＴは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの元のＳｍ結合部位の、スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列による修飾である（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．１９９３、Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．１９９５ａ）。配列番号１５のヌクレオチド２５２〜２６２は、ループ（逆配向配列）に対応する。ヌクレオチド２６３〜２９５は、エクソン２のアクセプター部位を標的とするアンチセンス配列である、Ｕ７−Ａｌｏｎｇ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド２９６〜５５１は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド５５８〜６６４は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド６６５〜６９５は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド６９６〜７０６は、ループ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド７０７〜７３１は、エクソン２のドナー部位を標的とするアンチセンス配列である、Ｕ７−Ｃ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド７３２〜９８７は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド９９４〜１１００は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１１１〜１１３１は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１３２〜１１４２は、ループ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１４３〜１１６７は、Ｕ７−Ｃ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１６８〜１４２３は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１４３０〜１５３６は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５３７〜１５６７は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５６８〜１５７８は、ループ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５７９〜１６１１は、Ｕ７−Ａｌｏｎｇ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１６１２〜１８６７は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１９２０〜２０５２は、ＩＴＲに対応する。 （ａ）は、図１４のプラスミドのＡＡＶゲノムインサート（３’〜５’）（配列番号１５は、５’〜３’方向の同じ配列である）を示す。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）における配列の逆相補（配列番号２６）を示す。 Ｕ７は、スプライセオソームｓｎＲＮＰといくつかの特徴を共有するＵ７ｓｎＲＮＰをコードする。プレｍＲＮＡスプライシングに関与しないが、ヒストンｍＲＮＡの３’末端を処理する（Ｍuｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈuｍｐｅｒｌｉ １９９７、Ｄｏｍｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｍａｒｚｌｕｆｆ １９９９）。配列番号１５のヌクレオチド１〜１１３は、３’ＩＴＲに対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１４〜２２０は、３’未翻訳領域（ＵＴＲ）（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド２２１〜２５１は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応する。ＳｍＯＰＴは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの元のＳｍ結合部位の、スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列による修飾である（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．１９９３、Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．１９９５ａ）。配列番号１５のヌクレオチド２５２〜２６２は、ループ（逆配向配列）に対応する。ヌクレオチド２６３〜２９５は、エクソン２のアクセプター部位を標的とするアンチセンス配列である、Ｕ７−Ａｌｏｎｇ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド２９６〜５５１は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド５５８〜６６４は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド６６５〜６９５は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド６９６〜７０６は、ループ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド７０７〜７３１は、エクソン２のドナー部位を標的とするアンチセンス配列である、Ｕ７−Ｃ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド７３２〜９８７は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド９９４〜１１００は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１１１〜１１３１は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１３２〜１１４２は、ループ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１４３〜１１６７は、Ｕ７−Ｃ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１６８〜１４２３は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１４３０〜１５３６は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５３７〜１５６７は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５６８〜１５７８は、ループ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５７９〜１６１１は、Ｕ７−Ａｌｏｎｇ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１６１２〜１８６７は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１９２０〜２０５２は、ＩＴＲに対応する。 （ａ）は、図１４のプラスミドのＡＡＶゲノムインサート（３’〜５’）（配列番号１５は、５’〜３’方向の同じ配列である）を示す。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）における配列の逆相補（配列番号２６）を示す。 Ｕ７は、スプライセオソームｓｎＲＮＰといくつかの特徴を共有するＵ７ｓｎＲＮＰをコードする。プレｍＲＮＡスプライシングに関与しないが、ヒストンｍＲＮＡの３’末端を処理する（Ｍuｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈuｍｐｅｒｌｉ １９９７、Ｄｏｍｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｍａｒｚｌｕｆｆ １９９９）。配列番号１５のヌクレオチド１〜１１３は、３’ＩＴＲに対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１４〜２２０は、３’未翻訳領域（ＵＴＲ）（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド２２１〜２５１は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応する。ＳｍＯＰＴは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの元のＳｍ結合部位の、スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列による修飾である（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．１９９３、Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．１９９５ａ）。配列番号１５のヌクレオチド２５２〜２６２は、ループ（逆配向配列）に対応する。ヌクレオチド２６３〜２９５は、エクソン２のアクセプター部位を標的とするアンチセンス配列である、Ｕ７−Ａｌｏｎｇ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド２９６〜５５１は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド５５８〜６６４は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド６６５〜６９５は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド６９６〜７０６は、ループ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド７０７〜７３１は、エクソン２のドナー部位を標的とするアンチセンス配列である、Ｕ７−Ｃ（逆配向配列）に対応する。配列番号１５のヌクレオチド７３２〜９８７は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド９９４〜１１００は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１１１〜１１３１は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１３２〜１１４２は、ループ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１４３〜１１６７は、Ｕ７−Ｃ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１１６８〜１４２３は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１４３０〜１５３６は、３’ＵＴＲ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５３７〜１５６７は、ＳｍＯＰＴ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５６８〜１５７８は、ループ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１５７９〜１６１１は、Ｕ７−Ａｌｏｎｇ（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１６１２〜１８６７は、Ｕ７（逆配向配列）に対応し、配列番号１５のヌクレオチド１９２０〜２０５２は、ＩＴＲに対応する。 ｍｄｘ^ｄｕｐ２（Ｄｕｐ２）マウスの形成において使用されるベクターの概略を示す。 （ａ）ＡＡＶ９．Ｕ７−ＡＣＣＡ（３．３Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）の尾静脈注入の１ヶ月後に５つの異なるＤｕｐ２マウス筋に関して行ったＲＴ−ＰＣＲを示す。複数の転写の存在によって実証されるように（ここではＤｕｐ２、ｗｔ、及びＤｅｌ２と標識される）、Ｕ７−ＡＣＣＡ治療は、試験した全ての筋肉においてエクソン２の一方または両方のコピーのスキッピングを強制することができる。（ＴＡ：前脛骨、Ｇａｓ：腓腹筋、

：心筋、Ｔｒｉ：三頭筋、ｄｉａ：横隔膜）
（ｂ）注入の１ヶ月後に５つの異なる筋肉に関して行ったウェスタンブロットは、全ての試験した筋肉内のジストロフィンの存在を実証する。 （ｃ）同じ標本に関するジストロフィンの免疫染色は、サルコレンマにおけるジストロフィンの発現及びその適切な局在化を確認する。 （ｄ）前肢及び後肢両方の握力の評価は、ＡＡＶ９．Ｕ７−ＡＣＣＡで治療されたＤｕｐ２動物における握力の完全な補正を実証する。 （ｅ）テタニー性収縮に続く正規化された特定力及び総力は、未治療のＤｕｐ２動物と比較して、筋力の改善を示す。（ｆ）心乳頭筋は、治療動物における長さ依存性力生成の改善を実証する。 （ｆ）心乳頭筋は、治療動物における長さ依存性力生成の改善を実証する。 （ａ）ＩＭ研究設計。漸増用量のＡＡＶ９．Ｕ７ｓｎＲＮＡ−ＡＣＣＡベクターを、２ヶ月目に前脛骨筋に送達し、３ヶ月目に、ｍＲＮＡ、タンパク質、及び電気生理学試験によって筋肉を分析した。 （ｂ）上昇用量レベルのＩＭ注入におけるＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量。転写は、エクソン２の２つ（Ｄｕｐ２）、１つ（ＷＴ）のコピーを含むか、または含まない（Δ２）。上昇用量レベルのＩＭ注入に続くＮ切断ジストロフィンの発現。 （ｃ）免疫蛍光または（ｄ）免疫ブロットによるタンパク質発現は、用量応答を実証する。 （ｃ）免疫蛍光または（ｄ）免疫ブロットによるタンパク質発現は、用量応答を実証する。 （ｅ）免疫ブロットの定量は、３．１Ｅ１１ｖｇにおける最大タンパク質発現を示唆する。 ３．１Ｅ１１ｖｇの前脛骨筋へのＩＭ注入に続くエキセントリック収縮に応答する絶対力（ｆ）、特定力（ｇ）の欠乏の改善。 ３．１Ｅ１１ｖｇの前脛骨筋へのＩＭ注入に続くエキセントリック収縮に応答する絶対力（ｆ）、特定力（ｇ）の欠乏の改善。 （ａ）ＩＶ研究設計。漸増用量のＡＡＶ９．Ｕ７ｓｎＲＮＡ−ＡＣＣＡベクターを、２ヶ月目に全身に送達し、３ヶ月目に、ｍＲＮＡ、タンパク質、及び電気生理学試験によって筋肉を分析した。 （ｂ）上昇用量レベルのＩＶ注入におけるＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量。転写は、エクソン２の２つ（Ｄｕｐ２）、１つ（ＷＴ）のコピーを含むか、または含まない（Δ２）。 （ｃ）ＩＶ注入に続く免疫ブロットによるジストロフィンの定量。発現は、用量応答に従い、三頭筋内の発現は、心筋及び横隔膜内の発現よりも遅れる。 （ｄ）ＢＩ６及びＤｕｐ２からのジストロフィンの免疫染色。 （ｅ）ＩＶ注入に続く発現。用量応答が見られ、より高い用量で心筋及び横隔膜内に有意なジストロフィン発現を伴う。 ＡＡＶ９．Ｕ７−ＡＣＣＡの早期注入は、Ｄｕｐ２マウスにおける筋病理学を予防する。ジストロフィンの免疫染色は、形質膜におけるＮ末端切断ジストロフィンの生成及び局在化を実証する。ヘマトキシリン及びエオシン染色に続いて中心核化は観察されなかった。６ヶ月齢までに、未治療のＤｕｐ２マウスは、典型的に、それらの線維の６０％が中心核を有することを実証する（データ図示せず）。 最初の９個のエクソン内に突然変異を担持する患者に由来するヒト細胞株内の代替Ｎ末端切断されたジストロフィンの生成。エクソン１〜４内に突然変異を担持する様々な患者細胞株においてＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡベクター（１×１０Ｅ１１ベクターゲノム）またはＨ２Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ Ｈ２Ａ）いずれかを使用する、エクソン２のスキッピング後のＲＴ−ＰＣＲ結果。これは、転写欠失エクソン２の約９０％をもたらす（定量図示せず）。ＦＭ＝健康なヒト対象由来のＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞。ＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡを有するＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞の注入の１４日後に行われた免疫ブロットは、Ｎ末端切断されたジストロフィンタンパク質の発現を示す。約３９０ｋＤａのより小さいバンドが、全てのレーンで検出されるが、非特異的であり（未治療の標本において見られる）、ＩＲＥＳ駆動されるアイソフォームに対応しない。（画像は明確性のために組み立てられ、野生型対比は、バンドを明らかに示すように変更された）。 ＰＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチドでの治療に続くＮ切断ジストロフィンの発現。（ａ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞内の形質移入、及び（ｂ）ＡＬ−ＰＰＭＯのＤｕｐ２マウス前脛骨筋への筋内注入。処置された細胞または筋肉からのＲＴ−ＰＣＲ結果は、エクソン２の効率的なスキッピングを実証する。 ＰＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチドでの治療に続くＮ切断ジストロフィンの発現。（ａ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞内の形質移入、及び（ｂ）ＡＬ−ＰＰＭＯのＤｕｐ２マウス前脛骨筋への筋内注入。処置された細胞または筋肉からのＲＴ−ＰＣＲ結果は、エクソン２の効率的なスキッピングを実証する。 ＰＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチドでの治療に続くＮ切断ジストロフィンの発現。（ｃ）ジストロフィンの免疫蛍光は、ＡＬ−ＰＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチドの筋内注入に続く形質膜の発現を示す。

上記のように、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５内のグルココルチコイド誘導性ＩＲＥＳの活性化に基づく、ＤＭＤ遺伝子の１つ以上の５’突然変異を有する患者を予防し、進行を遅らせ、及び／または治療するための方法及び生成物を企図する。ＤＭＤ遺伝子のエクソン５における誘導性ＩＲＥＳの活性化は、機能的Ｎ末端切断ジストロフィンアイソフォームを生成する。

本明細書において使用される「ＤＭＤ遺伝子の５’突然変異」は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン１、２、３、または４内またはそれらに影響を及ぼす突然変異である。本発明の方法において、治療された患者は、ＤＭＤエクソン２重複を有しないが、本明細書において企図される「エクソン１、２、３、または４に影響を及ぼす突然変異」は、ＤＭＤエクソン２重複以外の重複であり得る。

一態様において、方法は、「ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体」を使用することを必要とする。本明細書において使用される、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、エクソン２を標的として、変更されたスプライシングを誘導し、成熟ＲＮＡからのエクソン２の排除をもたらし、ＤＭＤ遺伝子読取り枠においてフレームシフトを引き起こし、翻訳開始のためのエクソン５内のＩＲＥＳの利用を誘導する。

いくつかの実施形態において、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の以下の部分（５’〜３’に示される）のうちの１つを標的とする。
Ｂ：ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ（＋１７＋４４）（配列番号１）
Ｃ：ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ（＋４８−８）（配列番号２）
ＡＬ：ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣ（−３＋２８）（配列番号３）
ＡＳ：ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣ（−３＋１８）（配列番号４）

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶを使用して、アンチセンスポリヌクレオチドによってＤＭＤエクソン２に標的される、Ｕ７小核ＲＮＡポリヌクレオチド構築体を送達する。いくつかの実施形態において、Ｕ７小核ＲＮＡは、ヒトＵ７小核ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド構築体は、ｒＡＡＶ９のゲノム、ｒＡＡＶ６のゲノム、またはｒＡＡＶｒｈ７４のゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、Ｕ７小ヌクレオチドＲＮＡ構築体は、以下を含むが、それらに限定されない例示の標的アンチセンスポリヌクレオチドを含み、例えば、「Ｕ７−ＡＬアンチセンスポリヌクレオチド」は、それぞれ前述のパラグラフの「ＡＬ」エクソン２配列に相補的であり、それを標的とする。
Ｕ７−Ｂアンチセンスポリヌクレオチド：ＴＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号５）
Ｕ７−Ｃアンチセンスポリヌクレオチド：ＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（配列番号６）
Ｕ７−ＡＬアンチセンスポリヌクレオチド：ＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号７）
Ｕ７−ＡＳアンチセンスポリヌクレオチド：ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡ（配列番号８）

いくつかの実施形態において、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体は、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、天然のホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドポリマーと比較して、それらのヌクレアーゼ感受性を制限するように修飾を含むことが企図される。企図される修飾としては、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＯ）、細胞貫通ペプチド共役ＰＭＯ（ＰＰＭＯ）、ＰＭＯ内部化ペプチド（ＲＩＰ）［（Ｂｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，５：８９８６（２０１５）］、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２１：２７０−２７５（２０１５）］、及び２’Ｏ−メチル−ホスホロチオエート修飾が挙げられるが、これらに限定されない。エクソン２標的アンチセンスオリゴマーである、例示のＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体としては、以下のアンチセンスオリゴマー（５’〜３’に示される）が挙げられるが、これらに限定されず、例えば、「Ｂアンチセンスオリゴマー」は、それぞれパラグラフ［００３２］の「Ｂ」エクソン２標的を標的とする。
Ｂアンチセンスオリゴマー：ＵＡＣＣＣＡＵＵＵＵＧＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡ（配列番号９）
Ｃアンチセンスオリゴマー：ＡＵＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＵＧＣ（配列番号１０）
ＡＬアンチセンスオリゴマー：ＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１１）
ＡＳアンチセンスオリゴマー：ＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１２）
Ｈ２Ａ（＋１２＋４１）：ＣＣＡＵＵＵＵＧＵＧＡＡＵＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣ（配列番号１３）

別の態様において、ＤＭＤ遺伝子の５’突然変異を有する患者における筋ジストロフィー（ＤＭＤまたはＢＭＤなど）を改善する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ｒＡＡＶを患者に投与するステップを含み、ｒＡＡＶのゲノムは、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む。いくつかの実施形態において、方法は、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーである、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、患者は、グルコルチコイドでも治療される。

さらに別の態様において、本発明は、筋ジストロフィー（ＤＭＤまたはＢＭＤなど）と関連付けられるジストロフィー病理の進行を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＭＤ遺伝子の５’突然変異を有する患者にｒＡＡＶを投与するステップを含み、ｒＡＡＶのゲノムは、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む。いくつかの実施形態において、方法は、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーである、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、患者は、グルコルチコイドでも治療される。

さらに別の態様において、ＤＭＤ遺伝子の５’突然変異を有する患者において筋機能を改善する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ｒＡＡＶを患者に投与するステップを含み、ｒＡＡＶのゲノムは、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む。いくつかの実施形態において、方法は、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーである、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、筋機能の改善は、筋力の改善である。筋力の改善は、最大自主等尺性収縮試験（ＭＶＩＣＴ）などの当該技術分野において既知の技法によって決定される。場合によっては、筋機能の改善は、起立及び歩行の安定性の改善である。安定性強度の改善は、６分歩行試験（６ＭＷＴ）または時間制限付き階段昇りなどの当該技術分野において既知の技法によって決定される。いくつかの実施形態において、患者は、グルコルチコイドでも治療される。

別の態様において、本発明は、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を、ＤＭＤ遺伝子の５’突然変異を有する動物（ヒトが挙げられるが、これに限定されない）に送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ｒＡＡＶを患者にするステップを含み、ｒＡＡＶのゲノムは、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む。いくつかの実施形態において、方法は、エクソン２標的アンチセンスオリゴマーである、ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、動物は、グルコルチコイドでも治療される。

本明細書に記載される本発明の方法の細胞形質導入効率は、少なくとも約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、または約９５％であり得る。

本発明の前述の方法のいくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的ゲノムである。方法のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡが欠如している。方法のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、図１５に記載される例示のゲノムを含む、ＳＣ ｒＡＡＶ Ｕ７＿ＡＣＣＡである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ６である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ ｒｈ７４である（図１３）。

さらに別の態様において、本発明は、ＡＡＶ ｒＡＡＶ９カプシドを含むｒＡＡＶ、及び例示のＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体Ｕ７＿ＡＣＣＡを含むゲノムを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡが欠如している。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、自己相補的ゲノムを含む。方法のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、図１５に記載される例示のゲノムを含む、ＳＣ ｒＡＡＶ Ｕ７＿ＡＣＣＡである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ６である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ ｒｈ７４である（図１３）。

本発明の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。パラグラフ［００３３］に記載される標的アンチセンス配列の各々を含むＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体を有するゲノム、ならびにパラグラフ［００３３］に記載される標的アンチセンス配列のうちの２つ以上の可能な各組み合わせを含むＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築体を有するゲノムが特に企図される。例示された実施形態を含むいくつかの実施形態において、Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドは、その独自のプロモータを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、及びＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。上記の背景部分に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。本発明のいくつかの実施形態において、プロモータＤＮＡは、筋特異的制御要素であり、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１−７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４−４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９−４０９９（１９８７）］、心アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３−３３９９（１９８９）］、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ＭＣＫ）要素、デスミンプロモータ、骨高速攣縮トロポニンＣ遺伝子に由来する制御要素、低速攣縮心トロポニンＣ遺伝子、及び低速攣縮トロポニンＩ遺伝子：低酸素症誘導性核内因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０−５６８４（１９９１）］、ステロイド誘導性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモータ［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３−５６０７（１９９３）］、ならびに他の制御要素が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの、感染性ウイルス粒子への組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）による感染に許容される細胞に移される。ＡＡＶゲノムがパッケージングされるｒＡＡＶ粒子、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を生成する技法は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの生成は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ＡＡＶ ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書において、パッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型であり得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、及びＡＡＶ ｒｈ７４が挙げられるが、これらに限定されない。同種成分の使用が特に企図される。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生成のための必須成分の全てを安定して発現する細胞株を形成することである。例えば、ｒＡＡＶゲノムが欠如したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣ追跡［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１（１９８２）］、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含む合成リンカーの付加［Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３（１９８３）］、または直接平滑末端結紮［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６（１９８４）］などの手順によって細菌プラスミドに導入された。次に、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生成に適していることである。好適な方法の他の例は、プラスミドよりもむしろアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入することである。

ｒＡＡＶ生成の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−１５３９（１９９２）、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９（１９９２）においてレビューされる。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、国際公開第９５／１３３６５号及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号、国際公開第９５／１３３９２号、同第９６／１７９４７号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号、国際公開第９７／０９４４１号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号）、同第９７／０８２９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号）、同第９７／２１８２５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号）、同第ＷＯ９７／０６２４３号（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号）、同第９９／１１７６４号、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４−１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９−６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４−１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、同第５，８７１，９８２号、及び同第６，２５８，５９５号に記載される。前述の文書は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ生成に関連する文書のそれらの部分を特に強調する。

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを生成するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であってもよい。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低通路２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

ｒＡＡＶは、当該技術分野において標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製されてもよい。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１−１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７−４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及び国際公開第９８／０９６５７号に開示される方法を含む。

別の実施形態において、本発明は、ウイルス送達ベクターまたは他の送達ビヒクルに本発明のＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む組成物を企図する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含む。組成物はまた、希釈剤などの他の成分を含んでもよい。許容される担体及び希釈剤は、レシピエントに非傷害性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

滅菌注射剤は、必要量の活性成分を、上に列挙される様々な他の成分と共に、適切な溶媒に組み込むことによって、その後、必要に応じてフィルター滅菌によって調製される。一般に、分散剤は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒質及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、活性成分に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥及びフリーズドライ技法である。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的される個体及び細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３〜約１×１０^１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×１０^１４ｖｇ）。

本発明のｒＡＡＶを有するＤＭＤ遺伝子の５’突然変異を有する患者の標的細胞（例えば、骨格筋）を、生体内または生体外で形質導入する方法が、本明細書において企図される。方法は、本発明のｒＡＡＶを含む、有効用量、または有効な複数用量の組成物を、ＤＭＤ遺伝子の５’突然変異を有する動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量がＤＭＤの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量がＤＭＤの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態において、「有効用量」は、治療されるＤＭＤと関連付けられる少なくとも１つの症状を軽減する（排除または低減する）、ＤＭＤへの進行を遅らせるか、もしくは予防する、障害／疾患状態の進行を遅らせるか、もしくは予防する、疾患の程度を縮小させる、疾患の緩解（部分的または完全）をもたらす、及び／または生存を延長する、用量である。

有効用量の組成物の投与は、筋内、非経口、静脈内、経口、頬側、経鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むが、これらに限定されない当該技術分野において標準の経路であり得る。本発明のｒＡＡＶ（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）のＡＡＶ成分の投与経路及び血清型は、治療される感染及び／または病態、ならびに標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／または適合されてもよい。いくつかの実施形態において、投与経路は、筋内である。いくつかの実施形態において、投与経路は、静脈内である。

複合療法もまた、本発明によって企図される。本明細書において使用される複合療法は、同時治療または連続治療を含む。上記の背景部分で述べられるものなどの他の療法との複合と同様に、本発明の方法と、標準の医学的処置（例えば、コルチコステロイド及び／または免疫抑制薬）との複合が特に企図される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、プレドニゾン、デフラザコート、またはメドロール（６−メチル−プレドニゾロン、ＰＤＮ）などのグルココルチコイドである。

本発明の態様及び実施形態は、以下の実施例によって例証される。

ＤＭＤ遺伝子の読取り枠を切断する大部分の突然変異は、ジストロフィン発現の喪失を引き起こし、ＤＭＤにつながる。しかしながら、疾患重症度の改善は、ＤＭＤエクソン６内で始まる代替翻訳開始から生じ得、高度に機能的なＮ切断ジストロフィンの発現につながる。この新規のアイソフォームは、グルココルチコイド誘導性のエクソン５内のＩＲＥＳの使用から生じる。ＩＲＥＳ活性は、下記のペプチド配列決定及びリボソームプロファイリングの両方によって患者筋内で確認された。エクソンスキッピングによるＩＲＥＳ上流の切断読取り枠の生成は、患者由来の細胞株及びＤＭＤマウスモデルの両方において、機能的Ｎ切断アイソフォームの合成につながり、発現が、筋肉を収縮誘導性傷害から保護し、筋力を対照マウスと同レベルに補正する。これらの結果は、ＤＭＤ遺伝子の５’エクソン内に突然変異を有する患者のための、新規の治療的アプローチを支持する。Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ／Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２３：７３８−８５２（２０１３）も参照されたい。

実施例１
ヒト筋標本からのＩＲＥＳ誘導性翻訳の証拠
少なくとも最初の２つのＤＭＤエクソン内の停止コドンにつながるナンセンス及びフレームシフト突然変異が、エクソン６翻訳開始を介して軽度のＢＭＤ表現型をもたらすはずであることを我々は以前に公開した［Ｇｕｒｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３０：６３３−６４０（２００９）］。しかしながら、最も一般的な単一エクソン重複であり、重複したエクソン２配列内で早期停止コドンをもたらす、エクソン２の重複は、それが通常はＤＭＤと関連付けられるため、この予測に対する例外であると思われる［Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，２７：９３８−９４５（２００６）］。しかしながら、早期停止コドンももたらすエクソン２の欠失は、我々の大規模集団［Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，３０：１６５７−１６６６（２００９）］または他の公的に入手可能な大規模カタログ（ｗｗｗ．ｄｍｄ．ｎｌ）のいずれも記載されていなかった。この報告された症例の欠如は、エクソン２欠失を有する患者における臨床特徴が、無症候性であるか、またはＮ切断アイソフォームの発現に起因して非常に軽度であるかのいずれかを意味すると解釈した。

この解釈は、偶然に検出された血清クレアチンキナーゼ漸増の評価のために（５５０ｉｕ／Ｌ、正常値＜２００ｉｕ／Ｌ）、６歳で最初に示されたイタリア人少年におけるエクソン２の欠失（ＤＥＬ２）の検出によって確認された。正常な早期運動マイルストーンが報告され、家族内で筋ジストロフィーが報告されたことはなかった。彼の神経学的検査は、１５歳で全体的に正常であった。筋生検は、わずかな線維サイズの変動性を示し（図７ａ）、いくつかの部分において、いくつかの濃く染色された超収縮線維と共に、増加した数の中心核を示した。Ｃ末端抗体を使用する免疫蛍光分析は、膜におけるジストロフィンの存在を示した（図７ｂ）。興味深いことに、ウェスタンブロットは、検出されたジストロフィンが、より小さい分子量（約４１０ｋＤａ）を有していたことを明らかにし（図１ａ）、突然変異分析は、エクソン２の欠失を明らかにした（７ｃ〜ｇ）。タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）^２０を使用する後次ペプチド配列決定は、エクソン６内の翻訳開始と一致して、ジストロフィンに対して検出され、適合された９９個の固有ペプチドの中で、エクソン１〜５によってコードされる任意の残基の非存在を確認した（図１ｂ及び表１）。

表１ ヒト筋肉におけるペプチドスペクトル適合。エクソン１〜１０内でコードされるジストロフィンペプチド。（Ｎ）は、ペプチド配列が正常な対照筋またはエクソン２の欠失を有する患者からの筋肉内で検出された回数を表す。

相補的アプローチにおいて、エクソン２フレームシフト突然変異（ｃ．４０＿４１ｄｅｌ［ｐ．Ｇｌｕ１４ＡｒｇｆｓＸ１７］、ＦＳと称される）を有する軽度ＢＭＤ患者から単離された筋ＲＮＡを使用して、ＤＭＤ翻訳効率、プロモータ使用、及び代替スプライシングを調べたところ、そのウェスタンブロットは、Ｎ末端エピトープが欠如した同じ小分子量のジストロフィン（約４１０ｋＤａ）の発現も明らかにした（図１ｃ、図８ａ）。ウェスタンブロット結果を確認するために、同じＦＳ患者からの筋ホモジネートを使用して、リボソーム保護された断片について（すなわち、ＲＮａｓｅ消化後に単離されたリボソームフットプリント）及び総ＲＮＡについて、ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを構築した。リボソーム保護された断片（ＲＰＦ）からの読取り対ＲＮＡ−Ｓｅｑからの読取りの比を使用して、正常な筋肉と患者の筋肉におけるｍＲＮＡ翻訳効率を比較した。最も豊富な筋ｍＲＮＡの上位１０００の中で、ＤＭＤは、翻訳効率の最も大きい変化を示し（図１ｄ）、フレームシフトされた患者ＦＳにおけるＤＭＤ筋転写を翻訳するリボソームの量の約５倍低減を示す。この減少した翻訳量は、患者の軽度ＢＭＤ表現型を考慮して予想されるジストロフィンレベルの低減、ならびにｐ．Ｔｒｐ３Ｘ患者^４及び他の５’突然変異対立遺伝子において見られるジストロフィンの量の両方と一致する（図１ｃ）。

ＤＭＤイントロン１〜８において観察される鋸歯ＲＮＡ−Ｓｅｑパターン（図１ｅ）は、主要な転写開始が、ジストロフィン筋特異的プロモータ（Ｄｐ４２７ｍ）に位置していたこと、及びＤＭＤエクソン１〜７が、対照及びＦＳ患者標本の両方において、効率的な共転写スプライシングを受けたことを確認した［Ａｍｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１８：１４３５−１４４０（２０１１）］。ジストロフィンの２つの代替４２７ｋＤアイソフォーム（Ｄｐ４２７ｐ及びＤｐ４２７ｃ）は、主に中枢神経系において発現され、代替エクソン１配列の使用においてのみ、Ｄｐ４２７ｍとは異なる。Ｄｐ４２７ｐまたはＤｐ４２７ｃプロモータのいずれかからの強力な初期ＲＮＡシグナルの欠失は、代替プロモータの上方制御が、エクソン６内の代替ＡＵＧ使用に寄与しないことを確認した（図１ｅ）。両標本において、代替プロモータから新規５’ＵＴＲのスプライシングを示すＤｐ４２７ｍエクソン１とエクソン１１との間の既知の接合部に排他的にマップされたエクソン−エクソン接合部に及ぶＲＮＡ−Ｓｅｑ読取りは、エクソン６ ＡＵＧ使用に寄与しなかった。Ｄｐ４２７ｍ エクソン１〜１１上にマップされたリボソームフットプリントの分布は、正常レベルのエクソン１ ＡＵＧ開始、続いてエクソン２における早期終結、及びエクソン６フレーム内ＡＵＧコドン後の翻訳の再開（図１ｆ）を明らかにし、ＤＭＤ転写の本体へと続いて（図８ｂ、ｃ、及びｄ）、効率的な代替翻訳開始と一致する。

実施例２
生体外転写／翻訳研究
リボソームプロファイリング及びタンパク質分析の両方を患者筋において直接使用して、効率的な代替翻訳開始の新たな証拠を実証し、高い翻訳効率に寄与する要素を特徴付けることを求めた。ＤＭＤのエクソン１〜５がＩＲＥＳを含有するかどうかを決定するために、エクソン１〜＋４位置で始まるエクソン６の一部を包含して天然ＡＵＧ開始コドン（ｃ．４＿ｃ．３６９、エクソン１〜６と称される）を除外するｃＤＮＡの５’部分を、ジシストロニック二重ルシフェラーゼレポーターベクターｐＲＤＥＦにクローン化した。このベクターは、上流ｃａｐ依存性ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）オープン読取り枠（ＯＲＦ）を、ＳＶ４０プロモータの制御下で含有し、下流ｃａｐ非依存性ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）ＯＲＦを、関心対象の配列の制御下で含有し、２つのＯＲＦは、リボソーム走査を予防する二次構造要素（ｄＥＭＣＶ）によって分離された（図２ｃ）。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列を陽性対照として使用し、全ての値を空ベクターに対して正規化した。各例において、エクソン６ ＡＵＧを、下流ＦＬｕｃレポーターと共にフレーム内に置いたエクソン６から４９ヌクレオチドを含めた。この配列は、２つのフレーム内ＡＵＧ（Ｍ１２４及びＭ１２８）、及びクローン化目的で使用される１０個の追加ヌクレオチドを含めて、最初の３９ｎｔに対応する。Ｔ７媒介性ＲＮＡは、異なる構築体から生成され、それらを使用して、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）翻訳アッセイを行った（図２ａ、左パネル）。対応するＲＮＡのサイズ及び完全性は、ホルムアルデヒドアガロースゲルを使用してチェックした（図２ｂ）。ＤＭＤのエクソン１〜５のＣａｐ非依存性翻訳活性（下流ＦＬｕｃ対ＲＬｕｃ発光の比として表される）は、ＦＬｕｃシグナルの１．５〜１．７倍の増加をもたらし、対照ＥＭＣＶ ＩＲＥＳで見られる３．４〜３．８倍の増加より少ないが、ＩＲＥＳ活性と一致した（図２ａ、左パネル）。

実施例３
細胞培養物中のＩＲＥＳ活性
ＲＲＬベースの翻訳は、おそらくは、この特殊化した抽出物中の限定量のＲＮＡ結合タンパク質に起因して、または組織特異的ＩＲＥＳトランス作用因子（ＩＴＡＦ）の欠如に起因して、ウイルス性または真核細胞性ＩＲＥＳのいずれかのＩＲＥＳ活性を過小評価し得る。したがって、アッセイは、ジストロフィンを発現するＣ２Ｃ１２筋芽細胞において行われ、エクソン１〜６構築体の存在が、エクソン６単独ベクターに対して、約８倍高いＦｌｕｃ発現につながることを観察した（図２ａ、右パネル）。これは、対照ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの活性の約５０％を表し、エクソン１〜５内の比較的強いＩＲＥＳの存在を示唆する。ＩＲＥＳの位置をマップするために、ＤＭＤ遺伝子の５’部分（エクソン１〜５）からなる欠失構築体または適切な対照を、ｐＲＤＥＦにクローン化した（図２ｃ）。この配列の最初の３００ヌクレオチド（ｎｔ）の欠失は、ＦＬｕｃ発現を著しく変化させなかったが、最後の７１ｎｔ（エクソン５のほぼ全てを表す）の除去または反転は、ＦＬｕｃレポーターの発現を完全に抑制し、さらにエクソン５内の欠失は、大幅に低減したＦＬｕｃ発現をもたらす。推定ＩＲＥＳが筋特異的因子を必要とするという仮説を検証するために、ジストロフィンを内因的に発現しないＨＥＫ２９３Ｋ細胞において、及び商用のヒト筋芽細胞株（ｈＳＫＭＭ）において実験を繰り返した。ＥＣＭＶ ＩＲＥＳとは異なり、推定ＤＭＤ ＩＲＥＳは、２９３Ｋ細胞においてＦＬｕｃ発現を刺激しなかったが、ｈＳＫＭＭ細胞内の刺激のレベルは、Ｃ２Ｃ１２結果を複製し（図９ａ）、ＩＲＥＳが筋内で優先的に活性であることを示唆する。

対照実験を行い、異常なスプライシング事象、不可解なプロモータ活性、またはジシストロニックアッセイの誤解釈につながる他の潜在的な人為的結果の可能性を排除した。上流ＳＶ４０プロモータを除去して、エクソン１〜６（ｃ．４＿ｃ．３６９）ＤＭＤ配列を含有するｐＲＤＥＦベクターのプロモータレスバージョンを生成した。この構築体のＣ２Ｃ１２筋芽細胞への形質移入は、ＲＬｕｃ及びＦＬｕｃの両方からほんのわずかなバックグラウンド発光を示し、ＤＭＤコード配列におけるいかなる不可解なプロモータ活性に対しても強く反論する（データ図示せず）。ＲＴ−ＰＣＲ（図２ｄ及び９ｃ）によって異常なスプライシングは検出されず、ＲＮＡ完全性は、ノーザンブロットによって確認された（図２ｅ及び９ｂ）。

特に、エクソン２の重複または欠失のいずれかが、中断された読取り枠をもたらすが、異なる関連臨床表現型は、ＩＲＥＳ活性が、エクソン２重複の存在下で消滅し得るという仮説につながった。この仮説をＣ２Ｃ１２細胞内で試験し、ＩＲＥＳ活性化が、全長（エクソン１〜６）と欠失２ ｃＤＮＡとの間で等しかったが、エクソン２重複の存在下で顕著に低減し（図２ｆ）、エクソン２の欠失ではなく重複が、ＩＲＥＳ活性を除去することを確認した。

実施例４
アウトオブフレームエクソンスキッピングは、ＩＲＥＳ媒介性ジストロフィンを生体外で駆動することができる。
エクソン５ ＩＲＥＳの前のエクソンのスキッピングを考慮すると、エクソン２の除去のみが、読取り枠を崩壊させ、早期停止コドンをもたらすであろう（図３ａ）。このエクソンの欠失を治療的に使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用によっても［Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：Ａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１３３：９５７−９７２（２０１０）、ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５７：２６７７−２６８６（２００７）、及びＫｉｎａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８：９１８−９２８（２００９）］、またはＡＡＶ−Ｕ７媒介性アンチセンス送達の使用によっても［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：１７９６−１７９９（２００４）、及びＶｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：２１２０−２１３３（２０１２）］、ＩＲＥＳの活性化を増加させ得ることを企図した。４つの異なる配列（図３ｂにおいてそれぞれ「Ｂ」、「ＡＬ」、「ＡＳ」、及び「Ｃ」と標識される）を、Ｕ７ｓｎＲＮＡ標的のために選択し、各々をＡＡＶ１にクローン化して、ドキシシクリン誘導性ＭｙｏＤを発現する野生型またはエクソン２重複線維芽細胞株（ＦｉｂｒｏＭｙｏＤと称される）のいずれかから生成された筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率を評価した［Ｃｈａｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：７８４−７９０（２００９）］。全ての構築体は、エクソン２の１つまたは２つのコピーのいずれかをスキップすることができた（図１０）。後次に、スキッピング効率を増加させるために、Ｕ７−Ｃ及びＵ７−ＡＬ標的アンチセンス配列の各々の２つのコピーを、単一自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ１ベクター（及び指定されたＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡ）にクローン化され、そのゲノムは、図１５に３’〜５’配向で示される。Ｕ７−Ｃ及びＵ７−ＡＬを使用して、ＡＬとＢとの間のアンチセンス配列における任意の可能な重複を回避した。既知のアンチセンス配列（ＡＯＮ Ｈ２Ａ）を、スキッピングの陽性対照として使用した［Ｔｅｎｎｙｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｒｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：３０５９−３０６４（１９９６）］。ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞の感染によって、ＤＭＤ転写の８８．６％がエクソン２の完全スキッピングを有し、Ｎ末端切断ジストロフィンの生成につながった（図３ｃ、３ｄ、及び１２ａ）。

実施例５
ＩＲＥＳ駆動されたＮ切断ジストロフィンは、エクソン２の重複を内包する新規のマウスモデルにおけるアウトオブフレームエクソンスキッピング後に発現される。
Ｕ７−ＡＣＣＡベクターが、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでエクソン２の重複を担持するマウスモデル（Ｄｕｐ２マウス、下の実施例８で説明される）において生体内でエクソン２をスキップする能力を試験した。結果として得られるＤＭＤ ｍＲＮＡは、エクソン２の２つのコピーを含有し、読取り枠を崩壊させて、ジストロフィン発現のほぼ完全な非存在をもたらす。ＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡ（１ｅ１１ｖｇ）を、６〜８週齢のＤｕｐ２マウス（ｎ＝５）またはＢＩ６対照マウスの前脛骨に直接注入した。４週間後、注入された筋肉からのＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｄｕｐ２またはＢＩ６におけるエクソン２のほぼ完全なエクソンスキッピングを実証する（図４ａ、４ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲ結果と一致して、Ｄｍｄイントロン１及び２で観察された鋸歯ＲＮＡ−Ｓｅｑパターンは、重複したエクソン２の共転写スプライシングの抑制、ならびに治療マウスにおけるエクソン１〜エクソン３の共転写スプライシングの高い効率性を確認した（図４ｃ）。ウェスタンブロット及び免疫染色は、Ｎ切断タンパク質の発現を実証する。サルコレンマ染色は、β−ジストログリカン及びｎＮＯＳに対して回復され（図４ｄ、４ｅ）、機能的ジストログリカン複合体の存在を示唆する。

エクソンスキッピング及びタンパク質発現の用量応答の程度を評価するために、Ｄｕｐ２マウスの前脛骨（ＴＡ）への筋内注入（ＩＭ）を使用して、用量漸増研究も行った。ＩＭ漸増用量は、図１８ａに記載される。図１８ｂに見られるように、スキップされた転写の程度は、予想された用量応答を示す。図１８ｂは、タンパク質発現において同様の予想された用量応答を示し、１注入当たり３．１Ｅ１１ｖｇで最大であり、生理学的力欠陥の著しい補正を伴う（図１８ｃ）。

実施例６
グルココルチコイドは、ジストロフィンＩＲＥＳの活性化を増加させる。
ジストロフィンの類似体であるウトロフィンの５’ＵＴＲにおいて見出される筋特異的ＩＲＥＳが、グルココルチコイド活性化されることが見出されたため、ＩＲＥＳ活性に対するグルココルチコイド曝露の効果を調べた［Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，３：ｅ２３０９（２００８）］。さらに、グルココルチコイド、プレドニゾン、及びデフラザコートでの治療は、ＤＭＤのための標準治療である。増加濃度の６−メチル−プレドニゾロン（ＰＤＮ）の存在下で、Ｃ２Ｃ１２細胞内のエクソン５〜６構築体を使用して、エクソン５ ＩＲＥＳ活性を評価したところ、下流ＦＬｕｃ活性が、ＰＤＮの存在下での約７倍変化から、６．４μＭ ＰＤＮでの２０倍超へと用量依存的に増加した（図５ａ）。このグルココルチコイド活性化は、エクソン６単独もしくは反転されたエクソン５対照構築体の形質移入後、または２９３Ｋにおいて見られなかった（図５ａ及びＳ５ａ）。ジストロフィン発現の増加は、６．４μＭ ＰＤＮで処置したＤｕｐ２ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞において見られ（図５ｂ）、Ｄｕｐ２マウス（ｎ＝５）の、Ｕ７−ＡＣＣＡ及びＰＤＮ両方での共治療は、Ｕ７−ＡＣＣＡ単独を超えるジストロフィン発現の増加をもたらし（図５ｃ〜ｄ）、グルココルチコイド誘導性と一致する。未治療のＤｕｐ２と比較して３％未満の増加は、希少標本においてＰＤＮ単独で見られ（図５ｃに表される）、Ｄｕｐ２モデルにおけるＩＲＥＳのいくらかの漏出性を示唆する。全ての例において、このジストロフィン発現の増加は、ＡＡＶベクターゲノムコピー数の差に起因しなかった（データ図示せず）。ウトロフィン翻訳が、コルチコステロイドによって制御され得、過剰発現が、非存在ジストロフィンを補償し得るため、同じ注入筋におけるウトロフィンレベルを評価した（図５ｅ）。未治療のＤｕｐ２動物において、ウトロフィンレベルは、ｍｄｘ、標準ジストロフィノパシーマウスモデルにおいて報告されたものと同様に、ＢＩ６と比較して増加した。４群の比較は、ＰＤＮ治療動物と未治療動物との間のウトロフィンレベルの統計的有意差を明らかにせず（図５ｆ）、ＰＤＮ治療後の機能的救済の原因として、ウトロフィン上方制御を除外する。

実施例７
局所ＩＲＥＳ駆動されたＮ切断ジストロフィン発現は、筋膜を安定させ、Ｄｕｐ２マウス筋の力欠陥を補正する。
ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現が、Ｄｕｐ２マウスにおいて筋完全性及び生理学を改善したかどうかを調べた。ｍｄｘマウスの場合と同様に、Ｄｕｐ２マウスのジストロフィン変化は、中心化核を特徴とする広範囲の筋再生として、４週齢で定量可能である（Ｖｕｌｉｎら、原稿印刷中）。４週齢のＤｕｐ２マウスの前脛骨筋へのＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡの筋内注入の１ヶ月後、ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現は、中心化核の著しい低減をもたらす（図６ａ）。このアイソフォームが膜完全性を回復することを実証するために、治療及び未治療のＤｕｐ２マウスを、ダウンヒル走行プロトコルに供し、エヴァンスブルー染料（ＥＢＤ）を注入し、これが膜損傷によって透過処理された骨格筋線維に入る。ＥＢＤの腹腔内注入に続いて、ジストロフィン染色していない線維においてのみ取込みが見出され、Ｎ切断タンパク質が、サルコレンマを安定させ、このタンパク質の生体内の機能性についてさらなる証拠を提供することを示唆する（図４ｆ）。ＥＢＤ陽性線維の数の定量は、ＩＲＥＳ駆動されたアイソフォームの発現が、これらのマウスにおいて筋線維の保護をもたらすことを確認する（図６ｂ）。重要なことに、この膜保護は、後肢握力（図６ｃ）及び筋特定力（図６ｄ）の、ＢＩ６対照マウスにおいて見られるレベルへの回復と関連付けられる。プレドニゾンの有無にかかわらず、Ｕ７−ＡＣＣＡを注入したＤｕｐ２筋は、未治療のＤｕｐ２筋よりも収縮誘導性傷害に対して著しく高い耐性を示し、両方の治療の複合は、ＢＩ６対照との有意差を示さなかった（図６ｅ）。ＰＤＮによるいくつかのＤｕｐ２筋において見られるジストロフィンの最小（＜３％）発現にもかかわらず（図５ｃ）、ＰＤＮ単独によるＤｕｐ２筋の治療は、筋生理の有意な改善をもたらさない（図６）。

実施例８
ＤＭＤモデル
ＤＭＤエクソン２重複のモデルの実施例は、以下のように、生体内及び生体外モデルを含む。
ｍｄｘｄｕｐ２マウスモデル

ＤＭＤ遺伝子座内にエクソン２の重複を担持するマウスを発育させた。エクソン２重複突然変異は、最も一般的なヒト重複突然変異であり、比較的重症のＤＭＤをもたらす。

挿入ベクターのマップを図Ｄに示す。このマップにおいて、数字は、クローン化部位、及びエクソン、及び制限部位の相対位置を示す。ネオカセットは、遺伝子の同一方向であり、挿入点は、正確にはイントロン２内の３２２０７／３２２０８ｂｐである。少なくとも１５０ｂｐ超過のイントロン配列は、挿入されたエクソン２の各側で保持され、Ｅ２領域は、１７７５−２１９５ｂｐである。エクソン２及びイントロン２のサイズは、それぞれ６２ｂｐ及び２０９５７２ｂｐである。

雄Ｃ５７ＢＬ／６ ＥＳ細胞は、エクソン２構築体を担持するベクターで形質移入し（図Ｄ）、次に挿入をＰＣＲによってチェックした。多くのアルビノＢＬ／６胚盤胞において、１つの良好なクローンが見出され、増幅され、注入された。注入された胚盤胞を、レシピエントマウスに移植した。キメラ雄からのジストロフィン遺伝子は、ＰＣＲによって、次にＲＴ−ＰＣＲによってチェックした。コロニーは拡大され、ホモ接合性に繁殖された数匹の雌マウスを含む。４週齢ヘミ接合性ｍｄｘｄｕｐ２マウスからの筋肉内のジストロフィン発現は、本質的に非存在であった。
不死化された条件誘導性のｆｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞株

哺乳動物線維芽細胞内のＭｙｏＤ遺伝子の発現は、筋原性系統への細胞の分化転換をもたらす。そのような細胞は、筋管へとさらに分化され得、それらは、ＤＭＤ遺伝子を含む筋遺伝子を発現する。

テトラシクリン誘導性プロモータの制御下でＭｙｏＤを条件的に発現する不死化細胞株を生成した。これは、ｔｅｔ誘導性ＭｙｏＤであり、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲ）を含有する、レンチウイルスの初代線維芽細胞株の安定した形質移入によって達成される。結果として得られる安定した株は、ＭｙｏＤ発現が、ドキシシクリンでの治療によって開始されるのを可能にする。そのような細胞株は、エクソン２の重複を担持するＤＭＤ患者から生成された。

この株を使用し、Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅ Ｗｉｌｔｏｎ（Ｐｅｒｔｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって提供された２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴマー（ＡＯＮ）を使用して、重複スキッピングが実証された。複数の細胞株を試験した。
一時的にＭｙｏＤ形質移入された一次細胞株

アデノウイルス−ＭｙｏＤで一時的に形質移入された初代線維芽細胞株を使用して、原理証明実験を行った。アデノウイルス構築体は、細胞ゲノムに統合されなかったが、ＭｙｏＤは一時的に発現された。結果として得られるＤＭＤ発現は、エクソンスキッピング実験を行うのに十分であった（しかし、再現性は、安定して形質移入された株を支持する）。

実施例９
Ｄｕｐ２マウスモデルにおけるＡＡＶ９−Ｕ７＿ＡＣＣＡの静脈内注入は、Ｎ切断アイソフォームの著しい発現及び強度低下の補正をもたらす。
ＡＡＶ９−Ｕ７−ＡＣＣＡゲノムが、静脈内注入時に、Ｄｕｐ２マウスにおいて生体内でエクソン２をスキップする能力を試験した。マウスへの投与のために、Ｕ７−ＡＣＣＡゲノムを、ｒＡＡＶ９ベクター（本明細書において、ＡＡＶ９−Ｕ７＿ＡＣＣＡと指定される）にクローン化した。ＡＡＶ９−Ｕ７＿ＡＣＣＡを、５匹のＤｕｐ２マウスの尾静脈（３．３Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）に注入した。注入の１ヶ月後に、治療動物を調べた。

実験の結果を図１７に示す。

静脈内投与の用量漸増研究も実行した（図１９ａ）。図１９ｂに見られるように、スキップされた転写の程度は、ＩＭ研究において見られるように、予想された用量応答を示す。最高レベルにおいて、転写の大半は、全長ジストロフィンに翻訳される野生型転写、またはＮ切断アイソフォームに翻訳されるエクソン２欠失した転写のいずれかからなり、いずれかのアイソフォームは、マウスへの機能的利益を提供する（ヒトと同様）。図１９ｃは、タンパク質発現において、同様の予想される用量応答を示す。非常に重要なことに、臨床的有用性に関して、より高い用量で、横隔膜及び心筋におけるジストロフィンの疑いなく豊富な発現が存在する。免疫ブロット上のタンパク質発現の定量（図１９ｄ）は、用量漸増応答を確認する。

ヒト新生児におけるＤＭＤの新生児スクリーニング（ＮＢＳ）は、現在実行可能であり、したがって、Ｄｕｐ２マウスにおける出生後１日目（Ｐ１）に、ＡＡＶ９．Ｕ７−ＡＣＣＡベクター（８×１０^１１ｖｇ）結果の送達によるＮ切断アイソフォームの早期発現の利点を検証した。この単一注入は、全ての筋肉においてＮ切断アイソフォームの広範囲の発現をもたらし、治療後１〜６ヶ月に渡って筋線維の保護を持続した（図２０）。

実施例１０
以下の配列（５’〜３’に示される）を有するＰＰＭＯを、Ｄｕｐ２マウスに投与する。
Ｃアンチセンスオリゴマー：ＡＵＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＧＡＡＡＡＵＵＧＵＧＣ（配列番号１０）
ＡＬアンチセンスオリゴマー：ＧＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＣＵＣＵＵＵＣＡＵＣＵＡ（配列番号１１）

ＡＬ−ＰＰＭＯを、野生型Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞に形質移入した（図２２）。形質移入の３日後に、ＲＴ−ＰＣＲを行い、効率的なエクソン２スキッピングを実証した（図２２ａ）。同様の実験を、Ｄｕｐ２マウスモデルにおいて行った。エクソン２スキッピング及びタンパク質発現の程度を評価するために、ＡＬ−ＰＰＭＯの、Ｄｕｐ２マウスの前脛骨（ＴＡ）への筋内注入を行った。図２２ｂに示されるように、エクソン２スキッピングは、効率的に達成された。図２２ｃは、同じ治療ＴＡ筋を使用して得られた。ジストロフィンの免疫染色を実行し、ジストロフィンの結果は、効率的な生成及び形質膜タンパク質の局在化を実証した。

別の実験において、１２ｍｇ／ｋｇで週３用量の別の集団のマウスの尾静脈において、全身注入が与えられる。第１の注入後４週間目に、スキッピング及びジストロフィン回復を評価する。

実施例１１
エクソン１または２内にナンセンス突然変異を内包する患者は、依然として、高度に機能的なＮ末端切断ジストロフィンアイソフォームを発現する。これは、リボソームの再入及びエクソン６からの翻訳を可能にする、エクソン５内のＩＲＥＳの存在に起因する。したがって、ナンセンス突然変異の形成が、ミスセンス突然変異またはフレーム内欠失重複のいずれかを、エクソン１〜４内に担持するヒト患者細胞株において、ＩＲＥＳの活性化を強制するはずであると仮定する。エクソン２の除去のみが、エクソン３において停止コドンを生成する。したがって、上述の突然変異を担持する患者におけるエクソン２の完全スキッピングは、エクソン３において停止コドンを誘導し、それによりＩＲＥＳ媒介性Ｎ末端切断アイソフォームの生成を誘導する。。

これらのエクソン内に突然変異を担持するヒト患者から細胞を収集した。次に、これらの細胞を、ジストロフィンを発現する細胞型である筋管（以降、「筋線維芽細胞」と称される）へと次にさらに分化し得る線維芽細胞の変換を強制する誘導性ＭｙｏＤを発現するレンチウイルスに感染させた。エクソン１〜４内にミスセンス突然変異またはフレーム内欠失もしくは重複を内包する患者からの細胞を収集することを目的とするにもかかわらず、ナンセンス突然変異を担持する患者からの細胞のみが入手可能であった。これらの細胞は、ＢＭＤ患者に由来し、該患者は、ナンセンス突然変異を担持するため、既にＮ末端切断ジストロフィンアイソフォームを天然に発現していた。しかしながら、分化におけるＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡでの治療は、１４日目までにＩＲＥＳ開始されたアイソフォームの、より高い発現をもたらした（図２１）。

実施例における結果の考察
Ｎ切断されているが機能的なジストロフィンの発現を駆動し得る、ＤＭＤエクソン５内のグルココルチコイド応答性ＩＲＥＳの存在を実証した。エクソン２フレームシフト突然変異を有するＢＭＤ患者からのリボソームプロファイリングは、ジストロフィン翻訳効率の軽度低減、ならびにエクソン５及び６内で始まるリボソーム負荷と一致するリボソームフットプリントパターンを実証した。我々がエクソン１ナンセンス突然変異を有する患者において最初に説明した［Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，１９：７４３−７４８（２００９）］、このＩＲＥＳ誘導されたアイソフォームの、疾患重症度の改善との関連はまた、エクソン２欠失の最初に報告された症例から質量分析データによって確認され、全体的に無症候性の対象において見出された。最後に、新規治療アプローチにおいて、アウトオブフレームエクソンスキッピングを誘導して、早期停止コドンを生成し、結果として、患者由来の細胞株及び新規ＤＭＤマウスモデルの両方において、ＩＲＥＳの活性化を強制し、ジストロフィン複合体の成分を回復し、筋障害の病理学的及び生理学的特徴を補正した。

ほとんどの真核性ｍＲＮＡは、モノシストロン性であり、それらの５’末端に特殊化されたｃａｐ構造を有し、４０Ｓリボソームサブユニットによる走査が始まる場所であるため、翻訳開始に必要とされる。ｃａｐ依存性５’→３’走査モデルの開始に対する明らかな証拠にもかかわらず、生物情報学的分析は、ヒト転写の約５０％が、転写特異的翻訳効率を媒介し制御し得る、５’ＵＴＲの短い上流オープン読取り枠（ｕＯＲＦ）を含むことを示唆した。ｕＯＲＦは、漏出性走査または末端依存性再開のいずれかを調節することによって機能し得るが、ｕＯＲＦはまた、哺乳動物陽イオン性アミノ酸輸送因子１遺伝子、ＣＡＴ１／ＳＬＣ７Ａ１に対して示されるように、ＩＲＥＳ要素へのアクセスを動的に制御することができる。レポーターアッセイを介したＩＲＥＳ特定に関して挙げられる注意事項を認識して、ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロットによるＲＮＡ完全性の評価、プロモータのないプラスミドの使用、及び適切な陽性ＩＲＥＳ対照の使用を含む、本研究において行われた全ての対照実験は、ＩＲＥＳ活性に起因するｃａｐ非依存性開始と一致した。ＤＭＤ ＩＲＥＳ活性を担持する最小領域を、ＥＭＣＶ（５８８ｎｔ）と比較して長さは短いが、ｃ−ｍｙｃ ５’ＵＴＲ（５０ｎｔ）において特定されるものと同様のサイズの７１ｎｔにマップした。これは、そのような小ＩＲＥＳが、ジシストロニックベクター内で使用され得るため重要な特徴であり、ＡＡＶなどのウイルスベクターにパッケージされる場合、空間が制限される。

細胞ＩＲＥＳが翻訳を調節する精密な分子機序は、文献において定義されていないが、ＩＴＡＦの要件が強く示唆された。これらの細胞タンパク質は、ＩＲＥＳ活性を補助するようにトランスで作用する。ほぼ全てのＩＴＡＦが、ＲＮＡ結合ドメインを担持することが示され、ＲＮＡシャペロンとして作用し、ＩＲＥＳ一次配列が、その活性に固有の適切な立体構造状態を獲得するのを助けると仮定された。これは、エクソン２重複の存在下でのジストロフィンＩＲＥＳ活性の喪失と関連する可能性があり、複雑な二次構造の形成によってＩＲＥＳ機能を除外し得るか、またはエクソン５ ＩＲＥＳへのＩＴＡＦアクセスを干渉する阻害性ｕＯＲＦの形成を引き起こす。

我々の結果は、ジストロフィン発現の転写後制御のこれまでに説明されていない機序を介した５’切断突然変異の救済のための分子説明を提供する。この新たな細胞ＩＲＥＳの特定及び結果として生じるジストロフィンアイソフォームは、筋肉及びジストロフィンの基本生物学を理解するための重要な意味合いを有する。我々はＤＭＤのエクソン５が高度に保存されることに気づき、イヌ、マウス、ウマ、及びニワトリＤＭＤ遺伝子において、ヒトとの８７％同一性、ならびにＤ．レリオ及びＸ．トロピカリスを含む３９種の中で６７％の同一性が見出される。そのような高度に保存された領域内のＩＲＥＳの存在は、代替翻訳開始に対するプログラムされた役割を支持する選択的圧力を強く示唆する。通常条件下でのＩＲＥＳの役割は、明らかでないが、関連細胞系統特異的及び／または条件活性化シグナルを理解するための継続的な努力が、ＩＲＥＳ制御の基礎となる機序を解明し、ジストロフィンの潜在的に新規の機能を明瞭にするであろう。

興味深い疑問は、Ｎ切断されたアイソフォームがどのように機能的であり続けるかである。ジストロフィンの主な細胞的役割は、Ｆ−アクチン細胞骨格と筋形質膜との間の重要な構造的架橋の役割として機能することによって、収縮力を、サルコレンマを渡って細胞外構造に伝達することであると想定される。ジストロフィン内の２つの領域、ＡＢＤ１（アクチン結合ドメイン、残基１５〜２３７に及ぶ）及びＡＢＤ２（残基１４６８〜２２０８に及ぶ）は、Ｆ−アクチン結合に関与する。多くの研究が、ＡＢＤ１ドメイン内の欠失の設定において、ジストロフィンの安定性の欠如を示した。しかしながら、これらの研究の大半が、ＡＢＤ２ドメインを欠失するマイクロジストロフィン構築体を用いて行われたことに気づき、ＡＢＤ１とアクチンとの間の相互作用を増強することが示された。そのようなミニタンパク質は、アクチンに結合し、全長バージョンと比較して異なる方法でアクチン動態を修飾する。そのような構築体による結果は、ＡＢＤ２の非存在が、アクチンへのジストロフィンの結合を完全に排除しないことを示すが、ＡＢＤ１の非存在は、ジストロフィンとアクチンとの間の相互作用を完全に妨害する可能性は低い。ＡＢＤ１に対して欠失されたトランス遺伝子の発現は、ｍｄｘ表現型を減少させ、Ｍバンド及びＺラインのコスタマー（ｃｏｓｔａｍｅｒｉｃ）パターンを回復し、ジストロフィンとサブサルコレンマ細胞骨格との間のリンクが、ＡＢＤ１との相互作用よりも多くを必要とすることを示唆する。これと一致して、細胞骨格の他のメンバーが、ジストロフィンスペクトリン反復と相互作用することが示された。

いくつかのシリーズは、ＡＢＤ１に影響を及ぼす突然変異に起因するＢＭＤが、より重症であることを示唆するが［Ｂｅｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４９：５４−６７（１９９１）］、我々の臨床的及び実験的観察は、ＡＢＤ１ドメインの一部または全てが欠如した他のＢＭＤ患者の報告と同様に［Ｗｉｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：７３７−７４４（１９９３）；Ｗｉｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５６：１５８−１６６（１９９５）及びＨｅａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４４：２３８８−２３９０（１９９４）］、正準ＡＢＤ１の最初の半分が欠如しているにもかかわらず、ＩＲＥＳ駆動されたＮ切断アイソフォームの重要な機能性を明らかに示す（図３ａ）。ＩＲＥＳ活性を誘導するために、アウトオブフレーム転写を生成することによって、このアイソフォームの発現を強制することは、実質的な治療可能性を保持するため、これは特に関心対象である。この新規のアウトオブフレーム戦略は、ＤＭＤ／ＢＭＤ患者において既に使用されている薬物である、グルココルチコイド治療と組み合わせることができ、ＩＲＥＳ活性化を増加させるはずである。重要なことに、エクソン２重複を有する患者（１つの大きなシリーズにおいてＤＭＤ患者のほぼ２％を表す）に対して個人化されたエクソンスキッピングアプローチではなく、そのようなタンパク質の発現を誘導するためのエクソン２のアウトオブフレームスキッピングが、ＤＭＤ遺伝子の５’末端における突然変異を担持する全ての患者（同じ集団において最大６％）の治療に企図される［Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ，１９：７４３−７４８（２００９）］。

本発明は、特定の実施形態に関して説明されたが、当業者であれば、変型及び修飾を思いつくであろうことが理解される。したがって、特許請求の範囲内に現れるような限定のみが、本発明に課されるべきである。

本出願に対して参照される全ての文書は、特にそれらが参照される内容に特に注意して、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (4)

1. ＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体Ｕ７＿ＡＣＣＡを含む自己相補的ゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルスであって、前記自己相補的ゲノムが、配列番号１５に記載のゲノムである、組換えアデノ随伴ウイルス。
2. 前記組換えアデノ随伴ウイルスが、組換えＡＡＶ１ウイルス、組換えＡＡＶ２ウイルス、組換えＡＡＶ３ウイルス、組換えＡＡＶ４ウイルス、組換えＡＡＶ５ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルス、組換えＡＡＶ７ウイルス、組換えＡＡＶ８ウイルス、組換えＡＡＶ９ウイルス、組換えＡＡＶ１０ウイルス、組換えＡＡＶ１１ウイルス、または組換えＡＡＶｒｈ７４ウイルスである、請求項１に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
3. ＤＭＤ遺伝子内に５’突然変異を有する患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィーの処置のための、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のゲノム内のＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む組成物であって、前記患者が、ＤＭＤエクソン２重複を有しておらず、
   前記ＤＭＤエクソン５内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）活性化オリゴマー構築体が、
   前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の以下の部分、
   ５’ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ ３’（配列番号１）、
   ５’ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ ３’（配列番号２）、
   ５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣ ３’（配列番号３）、または
   ５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣ ３’（配列番号４）
   のうちの１つを標的とし、
   前記ＤＭＤエクソン５内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）活性化オリゴマー構築体が、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む、組成物。
4. ＤＭＤ遺伝子内に５’突然変異を有する患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィーの処置のための、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のゲノム内のＤＭＤエクソン５ ＩＲＥＳ活性化オリゴマー構築体を含む組成物であって、前記患者が、ＤＭＤエクソン２重複を有しておらず、
   前記ＤＭＤエクソン５内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）活性化オリゴマー構築体が、
   前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の以下の部分、
   ５’ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ ３’（配列番号１）、
   ５’ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ ３’（配列番号２）、
   ５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣ ３’（配列番号３）、または
   ５’ＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣ ３’（配列番号４）
   のうちの１つを標的とし、
   前記ＤＭＤエクソン５内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）活性化オリゴマー構築体が、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むＲＮＡを発現するヌクレオチド配列を含む、組成物。

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