JP2021038262A - Dmd遺伝子のエクソン5内の内部リボソーム進入部位を活性化するための方法及び材料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、DMDエクソン2重複以外で、DMD遺伝子内に5’突然変異を有する患者を治療するためのオリゴマーの送達に関する。本発明は、DMD遺伝子のエクソン5内の内部リボソーム進入部位を活性化して、ジストロフィンの機能的切断アイソフォームの翻訳をもたらすための方法及び材料を提供する。該方法及び材料は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーなどのDMD遺伝子内の5’突然変異から生じる筋ジストロフィーの治療のために使用され得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、認可番号R01 NS043264の下、国立神経系伝染病卒中研究所により与えられた政府支援によって為された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表(ファイル名:48873 PCT_SeqListing.txt、20,279バイト−ASCIIテキストファイル、2015年8月6日作成)を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(技術分野)
rs:NMD,19:743−748(2009)及びFlanigan et al.,Human Mutation,30:1657−1666(2009)]。このナンセンス突然変異は、タンパク質翻訳をもたらさないことが予測されるが、筋生検は、相当量(約21%)の、最小限しか減少されていないサイズのジストロフィン発現を明らかにし、臨床表現型は、非常に軽度のジストロフィン異常症のうちの1つである[Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders:NMD,19:743−748(2009)]。小細胞内及び生体外翻訳研究は、p.Trp3X患者において、翻訳がエクソン6内のAUGから開始されることを実証し、表現型回復の機序としての代替翻訳開始を示唆する[Gurvich et al.,Human Mutation,30:633−640(2009)]。5’エクソンにおいて報告された大部分の切断突然変異が、実際に、DMDではなくMBDと関連付けられたことに留意して、変更された翻訳開始が、この遺伝子における5’突然変異の表現型救済の一般機序であり得ることを提案し、予測は、後次の報告によって支持された[Witting and Vissing,Neuromuscular Disorders:NMD,23:25−28(2013)及びFlanigan et al.,Neuromuscular Disorders:NMD,23:192(2013)]。正準アクチン結合ドメイン1(ABD1)は、タンパク質機能に必須であることが以前に提案された[Gimona et al.,FEBS Letters,513:98−106(2002)。
AAVは、例えば、遺伝子療法において、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養物中の細胞のAAV感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、AAVは、多くの哺乳動物細胞に感染し、多くの異なる組織を生体内で標的する可能性を可能にする。さらに、AAVは、ゆっくり分割する細胞及び非分割細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム(染色体外因子)として、本質的にそれらの細胞の寿命に渡って持続し得る。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローン化DNAとして感染性である。さらに、AAV複製、ゲノムカプシド形成、及び組込みを指示するシグナルが、AAVゲノムのITR内に含有されるため、内部約4.3kbのゲノム(複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、rep−cap)の一部または全てが、外来DNAで置換されてもよい。rep及びcapタンパク質は、トランスで提供され得る。AAVの別の重要な特徴は、それが極めて安定かつ頑健なウイルスであることである。アデノウイルスを不活性化するために使用される条件(56o〜65℃で数時間)に容易に耐え、AAVの冷蔵保存の重要性を低くする。AAVは、凍結乾燥されてもよい。最後に、AAV感染した細胞は、重複感染に耐性がない。
DMD及びBMDを含む筋ジストロフィーの治療に対する必要性が、当該技術分野において依然として存在する。
5’TCAAAAGAAAACATTCGCAAAATGGGTA 3’(配列番号1)、
5’GCACAATTTTCTAAGGTAAGAAT 3’(配列番号2)、
5’TAGATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAAC 3’(配列番号3)、または
5’TAGATGAAAGAGAAGATGTTC 3’(配列番号4)のうちの1つを標的とする。
本開示のいくつかの実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
DMD遺伝子内に5’突然変異を有する患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを改善する方法であって、DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体を前記患者に投与するステップを含み、前記患者が、DMDエクソン2重複を有していない、方法。
(項目2)
前記DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体が、組換えアデノ随伴ウイルスのゲノム内のU7snRNAポリヌクレオチド構築体である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体が、アンチセンスオリゴマーである、項目1に記載の方法。
(項目4)
ジストロフィー病理の進行が、前記患者内で阻害される、項目1、2、または3に記載の方法。
(項目5)
筋機能が、前記患者において改善される、項目1、2、または3に記載の方法。
(項目6)
前記筋機能の改善が、筋力の改善である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記筋機能の改善が、起立及び歩行の安定性の改善である、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記組換えアデノ随伴ウイルスのゲノムが、アデノ随伴ウイルスrep及びcap DNAを欠失する、項目2に記載の方法。
(項目9)
前記ウイルスゲノムが、自己相補的ゲノムである、項目2に記載の方法。
(項目10)
前記組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)が、組換えAAV1ウイルス、組換えAAV6ウイルス、組換えAAV9ウイルス、または組換えAAV rh74ウイルスである、項目2に記載の方法。
(項目11)
グルココルチコイドを前記患者に投与することをさらに含む、項目1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10に記載の方法。
(項目12)
前記DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体が、前記DMD遺伝子のエクソン2の以下の部分、
5’TCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTA 3’(配列番号1)、
5’GCACAATTTTCTAAGGTAAGAAT 3’(配列番号2)、
5’TAGATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAAC 3’(配列番号3)、または
5’TAGATGAAAGAGAAGATGTTC 3’(配列番号4)のうちの1つを標的とする、項目1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11に記載の方法。
(項目13)
前記U7snRNAポリヌクレオチド構築体が、
U7−BアンチセンスポリヌクレオチドTACCCATTTTGCGAATGTTTTCTTTTGA(配列番号5)、
U7−CアンチセンスポリヌクレオチドATTCTTACCTTAGAAAATTGTGC(配列番号6)、
U7−ALアンチセンスポリヌクレオチドGTTTTCTTTTGAAGATCTTCTCTTTCATCTA(配列番号7)、または
U7−ASアンチセンスポリヌクレオチドGAAGATCTTCTCTTTCATCTA(配列番号8)を含む、項目2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11に記載の方法。
(項目14)
前記アンチセンスオリゴマーが、エクソン2標的アンチセンスオリゴマー、
BアンチセンスオリゴマーUACCCAUUUUGCGAAUGUUUUCUUUUGA(配列番号9)、
CアンチセンスオリゴマーAUUCUUACCUUAGAAAAUUGUGC(配列番号10)、
ALアンチセンスオリゴマーGUUUUCUUUUGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号11)、または
ASアンチセンスオリゴマーGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号12)である、項目3、4、5、6、7、8、9、10、または11に記載の方法。
(項目15)
DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)であって、前記DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体が、
U7−BアンチセンスポリヌクレオチドTACCCATTTTGCGAATGTTTTCTTTTGA(配列番号5)、
U7−CアンチセンスポリヌクレオチドATTCTTACCTTAGAAAATTGTGC(配列番号6)、
U7−ALアンチセンスポリヌクレオチドGTTTTCTTTTGAAGATCTTCTCTTTCATCTA(配列番号7)、または
U7−ASアンチセンスポリヌクレオチドGAAGATCTTCTCTTTCATCTA(配列番号8)を含むU7snRNAポリヌクレオチド構築体を含む、組換えアデノ随伴ウイルス。
(項目16)
前記組換えAAVのゲノムが、AAV rep及びcap DNAを欠失する、項目15に記載の組換えAAV。
(項目17)
前記組換えAAVゲノムが、自己相補的ゲノムである、項目15または16に記載の組換えAAV。
(項目18)
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、組換えAAV1ウイルス、組換えAAV6ウイルス、組換えAAV9ウイルス、または組換えAAV rh74ウイルスである、項目15、16、または17に記載の組換えAAV。
(項目19)
前記DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体が、
エクソン2標的アンチセンスオリゴマー、
BアンチセンスオリゴマーUACCCAUUUUGCGAAUGUUUUCUUUUGA(配列番号9)、
CアンチセンスオリゴマーAUUCUUACCUUAGAAAAUUGUGC(配列番号10)、
ALアンチセンスオリゴマーGUUUUCUUUUGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号11)、または
ASアンチセンスオリゴマーGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号12)である、DMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体。
(項目20)
DMDエクソン5 IRES活性U7 snRNAポリヌクレオチド構築体U7_ACCAを含む自己相補的ゲノムを有する、組換えアデノ随伴ウイルスであって、前記自己相補的ゲノムが、図15に記載のゲノムである、組換えアデノ随伴ウイルス。
(項目21)
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、組換えAAV1ウイルス、組換えAAV6ウイルス、組換えAAV9ウイルス、または組換えAAVrh74ウイルスである、項目20に記載の組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)。
(項目22)
前記エクソン2標的アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PPO)であるか、細胞貫通ペプチド共役されたPMO(PPMO)であるか、PMO内在化ペプチド(PIP)であるか、トリシクロ−DNA(tcDNA)を含むか、または2’O−メチル−ホスホロチオエート修飾を含む、項目14に記載の方法。
(項目23)
前記エクソン2標的アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PPO)であるか、細胞貫通ペプチド共役されたPMO(PPMO)であるか、PMO内在化ペプチド(PIP)であるか、トリシクロ−DNA(tcDNA)を含むか、または2’O−メチル−ホスホロチオエート修飾を含む、項目19に記載のDMDエクソン5 IRES活性化オリゴマー構築体。
B:TCAAAAGAAAACATTCGCAAAATGGGTA(+17+44)(配列番号1)
C:GCACAATTTTCTAAGGTAAGAAT(+48−8)(配列番号2)
AL:TAGATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAAC(−3+28)(配列番号3)
AS:TAGATGAAAGAGAAGATGTTC(−3+18)(配列番号4)
U7−Bアンチセンスポリヌクレオチド:TACCCATTTTGCGAATGTTTTCTTTTGA(配列番号5)
U7−Cアンチセンスポリヌクレオチド:ATTCTTACCTTAGAAAATTGTGC(配列番号6)
U7−ALアンチセンスポリヌクレオチド:GTTTTCTTTTGAAGATCTTCTCTTTCATCTA(配列番号7)
U7−ASアンチセンスポリヌクレオチド:GAAGATCTTCTCTTTCATCTA(配列番号8)
Bアンチセンスオリゴマー:UACCCAUUUUGCGAAUGUUUUCUUUUGA(配列番号9)
Cアンチセンスオリゴマー:AUUCUUACCUUAGAAAAUUGUGC(配列番号10)
ALアンチセンスオリゴマー:GUUUUCUUUUGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号11)
ASアンチセンスオリゴマー:GAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号12)
H2A(+12+41):CCAUUUUGUGAAUGUUUUCUUUUGAACAUC(配列番号13)
rh74である(図13)。
Gene Therapy,4:609−615(1993)、Clark et al.,Gene Therapy,3:1124−1132(1996)、米国特許第5,786,211号、同第5,871,982号、及び同第6,258,595号に記載される。前述の文書は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれ、rAAV生成に関連する文書のそれらの部分を特に強調する。
et al.,Abstracts/Neuromuscular Disorders,23:738−852(2013)も参照されたい。
ヒト筋標本からのIRES誘導性翻訳の証拠
少なくとも最初の2つのDMDエクソン内の停止コドンにつながるナンセンス及びフレームシフト突然変異が、エクソン6翻訳開始を介して軽度のBMD表現型をもたらすはずであることを我々は以前に公開した[Gurvich et al.,Human Mutation,30:633−640(2009)]。しかしながら、最も一般的な単一エクソン重複であり、重複したエクソン2配列内で早期停止コドンをもたらす、エクソン2の重複は、それが通常はDMDと関連付けられるため、この予測に対する例外であると思われる[White et al.,Human Mutation,27:938−945(2006)]。しかしながら、早期停止コドンももたらすエクソン2の欠失は、我々の大規模集団[Flanigan et al.,Human Mutation,30:1657−1666(2009)]または他の公的に入手可能な大規模カタログ(www.dmd.nl)のいずれも記載されていなかった。この報告された症例の欠如は、エクソン2欠失を有する患者における臨床特徴が、無症候性であるか、またはN切断アイソフォームの発現に起因して非常に軽度であるかのいずれかを意味すると解釈した。
表1 ヒト筋肉におけるペプチドスペクトル適合。エクソン1〜10内でコードされるジストロフィンペプチド。(N)は、ペプチド配列が正常な対照筋またはエクソン2の欠失を有する患者からの筋肉内で検出された回数を表す。
エクソン1〜11上にマップされたリボソームフットプリントの分布は、正常レベルのエクソン1 AUG開始、続いてエクソン2における早期終結、及びエクソン6フレーム内AUGコドン後の翻訳の再開(図1f)を明らかにし、DMD転写の本体へと続いて(図8b、c、及びd)、効率的な代替翻訳開始と一致する。
生体外転写/翻訳研究
リボソームプロファイリング及びタンパク質分析の両方を患者筋において直接使用して、効率的な代替翻訳開始の新たな証拠を実証し、高い翻訳効率に寄与する要素を特徴付けることを求めた。DMDのエクソン1〜5がIRESを含有するかどうかを決定するために、エクソン1〜+4位置で始まるエクソン6の一部を包含して天然AUG開始コドン(c.4_c.369、エクソン1〜6と称される)を除外するcDNAの5’部分を、ジシストロニック二重ルシフェラーゼレポーターベクターpRDEFにクローン化した。このベクターは、上流cap依存性ウミシイタケルシフェラーゼ(RLuc)オープン読取り枠(ORF)を、SV40プロモータの制御下で含有し、下流cap非依存性ホタルルシフェラーゼ(FLuc)ORFを、関心対象の配列の制御下で含有し、2つのORFは、リボソーム走査を予防する二次構造要素(dEMCV)によって分離された(図2c)。EMCV IRES配列を陽性対照として使用し、全ての値を空ベクターに対して正規化した。各例において、エクソン6 AUGを、下流FLucレポーターと共にフレーム内に置いたエクソン6から49ヌクレオチドを含めた。この配列は、2つのフレーム内AUG(M124及びM128)、及びクローン化目的で使用される10個の追加ヌクレオチドを含めて、最初の39ntに対応する。T7媒介性RNAは、異なる構築体から生成され、それらを使用して、ウサギ網状赤血球溶解物(RRL)翻訳アッセイを行った(図2a、左パネル)。対応するRNAのサイズ及び完全性は、ホルムアルデヒドアガロースゲルを使用してチェックした(図2b)。DMDのエクソン1〜5のCap非依存性翻訳活性(下流FLuc対RLuc発光の比として表される)は、FLucシグナルの1.5〜1.7倍の増加をもたらし、対照EMCV IRESで見られる3.4〜3.8倍の増加より少ないが、IRES活性と一致した(図2a、左パネル)。
細胞培養物中のIRES活性
RRLベースの翻訳は、おそらくは、この特殊化した抽出物中の限定量のRNA結合タンパク質に起因して、または組織特異的IRESトランス作用因子(ITAF)の欠如に起因して、ウイルス性または真核細胞性IRESのいずれかのIRES活性を過小評価し得る。したがって、アッセイは、ジストロフィンを発現するC2C12筋芽細胞において行われ、エクソン1〜6構築体の存在が、エクソン6単独ベクターに対して、約8倍高いFluc発現につながることを観察した(図2a、右パネル)。これは、対照EMCV IRESの活性の約50%を表し、エクソン1〜5内の比較的強いIRESの存在を示唆する。IRESの位置をマップするために、DMD遺伝子の5’部分(エクソン1〜5)からなる欠失構築体または適切な対照を、pRDEFにクローン化した(図2c)。この配列の最初の300ヌクレオチド(nt)の欠失は、FLuc発現を著しく変化させなかったが、最後の71nt(エクソン5のほぼ全てを表す)の除去または反転は、FLucレポーターの発現を完全に抑制し、さらにエクソン5内の欠失は、大幅に低減したFLuc発現をもたらす。推定IRESが筋特異的因子を必要とするという仮説を検証するために、ジストロフィンを内因的に発現しないHEK293K細胞において、及び商用のヒト筋芽細胞株(hSKMM)において実験を繰り返した。ECMV IRESとは異なり、推定DMD IRESは、293K細胞においてFLuc発現を刺激しなかったが、hSKMM細胞内の刺激のレベルは、C2C12結果を複製し(図9a)、IRESが筋内で優先的に活性であることを示唆する。
アウトオブフレームエクソンスキッピングは、IRES媒介性ジストロフィンを生体外で駆動することができる。
エクソン5 IRESの前のエクソンのスキッピングを考慮すると、エクソン2の除去のみが、読取り枠を崩壊させ、早期停止コドンをもたらすであろう(図3a)。このエクソンの欠失を治療的に使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の使用によっても[Wood et al.,Brain:A Journal of Neurology,133:957−972(2010)、van Deutekom et al.,New England Journal of Medicine,357:2677−2686(2007)、及びKinali et al.,Lancet Neurology,8:918−928(2009)]、またはAAV−U7媒介性アンチセンス送達の使用によっても[Goyenvalle et al.,Science,306:1796−1799(2004)、及びVulin et al.,Molecular Therapy:Journal of the American Society of Gene Therapy,20:2120−2133(2012)]、IRESの活性化を増加させ得ることを企図した。4つの異なる配列(図3bにおいてそれぞれ「B」、「AL」、「AS」、及び「C」と標識される)を、U7snRNA標的のために選択し、各々をAAV1にクローン化して、ドキシシクリン誘導性MyoDを発現する野生型またはエクソン2重複線維芽細胞株(FibroMyoDと称される)のいずれかから生成された筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率を評価した[Chaouch et al.,Human Gene Therapy,20:784−790(2009)]。全ての構築体は、エクソン2の1つまたは2つのコピーのいずれかをスキップすることができた(図10)。後次に、スキッピング効率を増加させるために、U7−C及びU7−AL標的アンチセンス配列の各々の2つのコピーを、単一自己相補的(sc)AAV1ベクター(及び指定されたAAV1.U7−ACCA)にクローン化され、そのゲノムは、図15に3’〜5’配向で示される。U7−C及びU7−ALを使用して、ALとBとの間のアンチセンス配列における任意の可能な重複を回避した。既知のアンチセンス配列(AON H2A)を、スキッピングの陽性対照として使用した[Tennyson and Worton,Nucleic Acids Res.,24:3059−3064(1996)]。FibroMyoD細胞の感染によって、DMD転写の88.6%がエクソン2の完全スキッピングを有し、N末端切断ジストロフィンの生成につながった(図3c、3d、及び12a)。
IRES駆動されたN切断ジストロフィンは、エクソン2の重複を内包する新規のマウスモデルにおけるアウトオブフレームエクソンスキッピング後に発現される。
U7−ACCAベクターが、C57BL/6バックグラウンドでエクソン2の重複を担持するマウスモデル(Dup2マウス、下の実施例8で説明される)において生体内でエクソン2をスキップする能力を試験した。結果として得られるDMD mRNAは、エクソン2の2つのコピーを含有し、読取り枠を崩壊させて、ジストロフィン発現のほぼ完全な非存在をもたらす。AAV1.U7−ACCA(1e11vg)を、6〜8週齢のDup2マウス(n=5)またはBI6対照マウスの前脛骨に直接注入した。4週間後、注入された筋肉からのRT−PCR分析は、Dup2またはBI6におけるエクソン2のほぼ完全なエクソンスキッピングを実証する(図4a、4b)。RT−PCR結果と一致して、Dmdイントロン1及び2で観察された鋸歯RNA−Seqパターンは、重複したエクソン2の共転写スプライシングの抑制、ならびに治療マウスにおけるエクソン1〜エクソン3の共転写スプライシングの高い効率性を確認した(図4c)。ウェスタンブロット及び免疫染色は、N切断タンパク質の発現を実証する。サルコレンマ染色は、β−ジストログリカン及びnNOSに対して回復され(図4d、4e)、機能的ジストログリカン複合体の存在を示唆する。
グルココルチコイドは、ジストロフィンIRESの活性化を増加させる。
ジストロフィンの類似体であるウトロフィンの5’UTRにおいて見出される筋特異的IRESが、グルココルチコイド活性化されることが見出されたため、IRES活性に対するグルココルチコイド曝露の効果を調べた[Miura et al.,PloS One,3:e2309(2008)]。さらに、グルココルチコイド、プレドニゾン、及びデフラザコートでの治療は、DMDのための標準治療である。増加濃度の6−メチル−プレドニゾロン(PDN)の存在下で、C2C12細胞内のエクソン5〜6構築体を使用して、エクソン5 IRES活性を評価したところ、下流FLuc活性が、PDNの存在下での約7倍変化から、6.4μM PDNでの20倍超へと用量依存的に増加した(図5a)。このグルココルチコイド活性化は、エクソン6単独もしくは反転されたエクソン5対照構築体の形質移入後、または293Kにおいて見られなかった(図5a及びS5a)。ジストロフィン発現の増加は、6.4μM PDNで処置したDup2 FibroMyoD細胞において見られ(図5b)、Dup2マウス(n=5)の、U7−ACCA及びPDN両方での共治療は、U7−ACCA単独を超えるジストロフィン発現の増加をもたらし(図5c〜d)、グルココルチコイド誘導性と一致する。未治療のDup2と比較して3%未満の増加は、希少標本においてPDN単独で見られ(図5cに表される)、Dup2モデルにおけるIRESのいくらかの漏出性を示唆する。全ての例において、このジストロフィン発現の増加は、AAVベクターゲノムコピー数の差に起因しなかった(データ図示せず)。ウトロフィン翻訳が、コルチコステロイドによって制御され得、過剰発現が、非存在ジストロフィンを補償し得るため、同じ注入筋におけるウトロフィンレベルを評価した(図5e)。未治療のDup2動物において、ウトロフィンレベルは、mdx、標準ジストロフィノパシーマウスモデルにおいて報告されたものと同様に、BI6と比較して増加した。4群の比較は、PDN治療動物と未治療動物との間のウトロフィンレベルの統計的有意差を明らかにせず(図5f)、PDN治療後の機能的救済の原因として、ウトロフィン上方制御を除外する。
局所IRES駆動されたN切断ジストロフィン発現は、筋膜を安定させ、Dup2マウス筋の力欠陥を補正する。
IRES駆動されたアイソフォームの発現が、Dup2マウスにおいて筋完全性及び生理学を改善したかどうかを調べた。mdxマウスの場合と同様に、Dup2マウスのジストロフィン変化は、中心化核を特徴とする広範囲の筋再生として、4週齢で定量可能である(Vulinら、原稿印刷中)。4週齢のDup2マウスの前脛骨筋へのAAV1.U7−ACCAの筋内注入の1ヶ月後、IRES駆動されたアイソフォームの発現は、中心化核の著しい低減をもたらす(図6a)。このアイソフォームが膜完全性を回復することを実証するために、治療及び未治療のDup2マウスを、ダウンヒル走行プロトコルに供し、エヴァンスブルー染料(EBD)を注入し、これが膜損傷によって透過処理された骨格筋線維に入る。EBDの腹腔内注入に続いて、ジストロフィン染色していない線維においてのみ取込みが見出され、N切断タンパク質が、サルコレンマを安定させ、このタンパク質の生体内の機能性についてさらなる証拠を提供することを示唆する(図4f)。EBD陽性線維の数の定量は、IRES駆動されたアイソフォームの発現が、これらのマウスにおいて筋線維の保護をもたらすことを確認する(図6b)。重要なことに、この膜保護は、後肢握力(図6c)及び筋特定力(図6d)の、BI6対照マウスにおいて見られるレベルへの回復と関連付けられる。プレドニゾンの有無にかかわらず、U7−ACCAを注入したDup2筋は、未治療のDup2筋よりも収縮誘導性傷害に対して著しく高い耐性を示し、両方の治療の複合は、BI6対照との有意差を示さなかった(図6e)。PDNによるいくつかのDup2筋において見られるジストロフィンの最小(<3%)発現にもかかわらず(図5c)、PDN単独によるDup2筋の治療は、筋生理の有意な改善をもたらさない(図6)。
DMDモデル
DMDエクソン2重複のモデルの実施例は、以下のように、生体内及び生体外モデルを含む。
mdxdup2マウスモデル
不死化された条件誘導性のfibroMyoD細胞株
一時的にMyoD形質移入された一次細胞株
Dup2マウスモデルにおけるAAV9−U7_ACCAの静脈内注入は、N切断アイソフォームの著しい発現及び強度低下の補正をもたらす。
AAV9−U7−ACCAゲノムが、静脈内注入時に、Dup2マウスにおいて生体内でエクソン2をスキップする能力を試験した。マウスへの投与のために、U7−ACCAゲノムを、rAAV9ベクター(本明細書において、AAV9−U7_ACCAと指定される)にクローン化した。AAV9−U7_ACCAを、5匹のDup2マウスの尾静脈(3.3E12vg/kg)に注入した。注入の1ヶ月後に、治療動物を調べた。
以下の配列(5’〜3’に示される)を有するPPMOを、Dup2マウスに投与する。
Cアンチセンスオリゴマー:AUUCUUACCUUAGAAAAUUGUGC(配列番号10)
ALアンチセンスオリゴマー:GUUUUCUUUUGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA(配列番号11)
エクソン1または2内にナンセンス突然変異を内包する患者は、依然として、高度に機能的なN末端切断ジストロフィンアイソフォームを発現する。これは、リボソームの再入及びエクソン6からの翻訳を可能にする、エクソン5内のIRESの存在に起因する。したがって、ナンセンス突然変異の形成が、ミスセンス突然変異またはフレーム内欠失重複のいずれかを、エクソン1〜4内に担持するヒト患者細胞株において、IRESの活性化を強制するはずであると仮定する。エクソン2の除去のみが、エクソン3において停止コドンを生成する。したがって、上述の突然変異を担持する患者におけるエクソン2の完全スキッピングは、エクソン3において停止コドンを誘導し、それによりIRES媒介性N末端切断アイソフォームの生成を誘導する。。
N切断されているが機能的なジストロフィンの発現を駆動し得る、DMDエクソン5内のグルココルチコイド応答性IRESの存在を実証した。エクソン2フレームシフト突然変異を有するBMD患者からのリボソームプロファイリングは、ジストロフィン翻訳効率の軽度低減、ならびにエクソン5及び6内で始まるリボソーム負荷と一致するリボソームフットプリントパターンを実証した。我々がエクソン1ナンセンス突然変異を有する患者において最初に説明した[Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders:NMD,19:743−748(2009)]、このIRES誘導されたアイソフォームの、疾患重症度の改善との関連はまた、エクソン2欠失の最初に報告された症例から質量分析データによって確認され、全体的に無症候性の対象において見出された。最後に、新規治療アプローチにおいて、アウトオブフレームエクソンスキッピングを誘導して、早期停止コドンを生成し、結果として、患者由来の細胞株及び新規DMDマウスモデルの両方において、IRESの活性化を強制し、ジストロフィン複合体の成分を回復し、筋障害の病理学的及び生理学的特徴を補正した。
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MOL THER NUCLEIC ACIDS, vol. 3, JPN6019028468, 2014, pages 155, ISSN: 0004840374 * |
MOLECULAR THERAPY ;16TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN-SOCIETY-OF-GENE-AND-CELL-THERAPY, JPN7019002330, 2013, pages 71, ISSN: 0004840375 * |
MOLECULAR THERAPY, vol. Vol.20(6), JPN6019028465, 2012, pages 1212 - 1221, ISSN: 0004840372 * |
MOLECULAR THERAPY, vol. Vol.22(Suppl.1), JPN6019028464, 2014, pages 294 - 295, ISSN: 0004840371 * |
SCIENCE, vol. 306, JPN6019028467, 2004, pages 1796 - 1799, ISSN: 0004840373 * |
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