JP2024514160A - ダイナミン１バリアントの発現の阻害のための産物及び方法 - Google Patents

Abstract

病原性ダイナミン１バリアントの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの方法及び産物が提供される。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達ビヒクルが、ダイナミン１バリアントの発現を阻害するＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。本方法は、例えば、発達性及びてんかん性脳症を治療する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１５日に出願された米国特許出願第１７／２３１９６３号の優先権を主張し、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

米国政府権益の声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＲ３７ ＮＳ０３１３４８及びＦ３１ ＮＳ１１１８０８の下で政府の支援とともに行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によってその全体が組み込まれ、以下のように特定されるコンピュータ可読形態での配列表を含む：２０２２年４月１４日に作成されたファイルサイズ１８，９５０バイトの「５６６９４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイル。

病原性ダイナミン１バリアントの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの方法及び産物が提供される。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達ビヒクルが、ダイナミン１バリアントの発現を阻害するＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。本方法は、発達性及びてんかん性脳症を治療する。

ＤＮＭ１は、エンドサイトーシスを媒介するシナプス前に局在する重要な多量体脳特異的ＧＴＰアーゼ、ダイナミン１をコードする。病原性ＤＮＭ１バリアントを有する個体は、最も重度な発達性及びてんかん性脳症（ＤＥＥ）症候群のうちの２つ、レノックス－ガストー症候群及び幼児けいれんに罹患する。罹患した個人の特定は、今日では、ＤＮＭ１が重度の小児てんかんのスクリーニングパネルに含まれるようになったため、増加する可能性が高い。ＤＮＭ１変異を有する小児は、早期発病発作、全般的な発達遅延、深刻な知的障害、言語の欠如、筋緊張低下、ジストニア、及び痙縮として現れる難治性の状態に罹患している。罹患した個人は、多くのＤＥＥの場合と同様に、抗てんかん薬への応答がよくなく、８０％超の患者が発作を有したままである。

病原性ヒトバリアントの特定の前には、ＤＮＭ１と重度のてんかんとの間の最初の直接的な関係性は、「断続的（ｆｉｔｆｕｌ）」と称される、マウスオルソログにおける自然発生的ミスセンス変異であった（遺伝子記号：Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌ）［非特許文献１］。この変異は、Ｄｎｍ１ａを定義するＤｎｍ１の中間ドメインの相互排他的な代替エクソンで生じ、それは、Ｄｎｍ１ｂとともに、Ｄｎｍ１の２つの機能的に半冗長なアイソフォームを含む。これらの非常に高度に保存されたエクソンによってコードされるペプチドは、エンドサイトーシスを行う環構造へのダイナミン単量体のオリゴマー化に重要なアセンブリドメインの一部を形成する［非特許文献２及びＢｏｕｍｉｌ、上記非特許文献１］。

Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／＋}ヘテロ接合マウスは、２～３か月齢の軽度の自然発生及び操作誘発性の発作のみを示し、正常な寿命を有するが、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}ホモ接合体は、出生後第３週の終わりまでに、重度の運動失調、発達遅延、及び完全浸透性致死性発作を伴うＤＥＥ様表現型を示す。Ｄｎｍ１ｂは主に妊娠中に発現され、発現は出生後早期発達中に減少するが、Ｄｎｍ１ａ発現は出生後早期発達中に増加し、出生後第２週中にピークを迎え、成人期の主要なアイソフォームになる。しかしながら、Ｄｎｍ１ａ又はＤｎｍ１ｂのどちらのアイソフォーム特異的ホモ接合ノックアウトマウス（Ｄｎｍ１^{Δａ／Δａ}又はＤｎｍ１^{Δｂ／Δｂ}）も、Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌ対立遺伝子に関連する発作又は他の明白な表現型特徴を示さない［非特許文献３及び非特許文献４］。これら及び他のインビボ及びインビトロ研究は、Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌが、全てのＤＮＭ１病原性バリアントについてモデル化又は予測されたように、タンパク質機能に対する優性阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）効果を発揮することを示唆している［非特許文献５、Ａｓｉｎｏｆ（２０１６）、上記非特許文献４、及びｖｏｎ Ｓｐｉｃｚａｋ、上記非特許文献２］。

ＤＥＥの治療は現在、主に抗てんかん薬の使用による症状の治療に限定されている。薬物は、根底にある遺伝的欠陥に対処せず、したがって、疾患の進行を停止又は遅延させる期待はなく、長期間投与されると、有効性の喪失をもたらす可能性がある。

したがって、当該技術分野では、ＤＥＥの治療のための産物及び方法が必要とされている。

Ｂｏｕｍｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，６：ｅ１００１０４６（２０１０） ｖｏｎ Ｓｐｉｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８９：３８５－３９４（２０１７） Ａｓｉｎｏｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，１１：ｅ１００５３４７（２０１５） Ａｓｉｎｏｆｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，９５：１－１１（２０１６） Ｄｈｉｎｄｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：ｅ４（２０１５）

本明細書の開示は、ＤＭＮ１ ｍＲＮＡを標的化する人工阻害性ＲＮＡを発現するベクターを使用して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による有害なＤＮＭ１アイソフォームの発現停止を特異的に誘発する方法を提供する。企図される人工ＤＭＮ１阻害性ＲＮＡには、病原性ＤＮＭ１アイソフォームの発現を阻害する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（短鎖干渉ＲＮＡ、低分子阻害性ＲＮＡ、又は短鎖阻害性ＲＮＡとも称される）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｍｉＲＮＡシャトル（人工ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。人工阻害性ＲＮＡは、本明細書ではｍｉＤＮＭ１と称される。ｍｉＤＮＭ１は、小さな調節配列であり、例えば、ＤＮＭ１ ｍＲＮＡのコード領域又は３’ＵＴＲを逆相補的な様式で標的とすることによって転写後に作用し、ＤＮＭ１のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを低減させる。本方法及び産物の使用は、例えば、ＤＥＥの予防又は治療において示される。

ＤＮＭ１阻害性ＲＮＡ及びＲＮＡのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドが提供される。提供される例示的なＤＮＭ１阻害性ＲＮＡは、Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌを収容するアイソフォームであるＤｎｍ１ａを標的とするｍｉＲＮＡである。提供される他の例示的な阻害性ＲＮＡは、１０ａ及び１０ｂと称される代替的スプライシングされたＤＮＭ１エクソン１０において異なるヒトＤＮＭ１ａ及びＤＮＭ１ｂアイソフォームを標的とする。

本明細書では、以下の例示的なｍｉＲＮＡ及び配列が提供される。

本開示は、配列番号１～１７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＲＮＡコード鋳型ＤＮＡ配列を含む核酸を提供する。

例示的なｍｉＤＮＭ１は、配列番号１８～３４のうちのいずれか１つに示される全長配列、又は配列番号１８～３４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアントを含む。対応する最終的に処理されたアンチセンスガイド鎖配列は、配列番号３５～５１にそれぞれ示されているか、又は配列番号３５～５１のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそれらのバリアントである。処理されたアンチセンスガイド鎖は、最終的に配列特異的遺伝子発現停止に関与するＲＮＡ誘発発現停止複合体のＲＮＡ成分となる成熟ｍｉＲＮＡ二本鎖の鎖である。

ｍｉＤＮＭ１は、ヒトＤＮＭ１遺伝子のエクソン１０ａ（配列番号５２）
ヒトＤＮＭ１エクソン１０ａ（５’から３’へ）（配列番号５２）
ＧＡＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＣＴＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＡＡＡＡＧ
又はエクソン１０ｂ
ヒトＤＮＭ１エクソン１０ｂ（５’から３’へ）（配列番号５３）
ＡＡＣＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＣＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧ
を含むが、これらに限定されない、ヒトＤＮＭ１遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに特異的に結合し得、このセグメントは、それぞれ、マウスＤＮＭ１遺伝子のエクソン１０ａ（配列番号５４）
マウスＤｎｍ１エクソン１０ａ（５’から３’へ）（配列番号５４）
ＧＡＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＣＴＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡ
又はエクソン１０ｂ（配列番号５５）
マウスＤｎｍ１エクソン１０ｂ（５’から３’へ）（配列番号５５）
ＡＡＣＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣＧＡＧＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＣＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＧＣＡＣＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧ
を含むが、これらに限定されない、野生型マウスＤＮＭ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対して保存されている。例えば、ｍｉＤＮＭ１は、配列番号５２のヌクレオチド１１５～１３６内の配列に相補的であるｍＲＮＡセグメントに特異的に結合し得る。

ｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡの送達は、ＤＮＡを細胞に送達する送達ビヒクルを使用して達成され得る。例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して、ｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡを送達し得る。他のベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、及びワクシニアウイルスなどの他のウイルスベクター）を使用して、ｍｉＤＮＭ１をコードするポリヌクレオチドを送達し得る。したがって、１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするウイルスベクターもまた提供される。ウイルスベクターがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶであり得る。別の例として、脂質ナノ粒子などの非ウイルスベクターが送達に使用され得る。

各々ｍｉＤＮＭ１をコードするｒＡＡＶが本明細書に提供される。また、１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするｒＡＡＶも提供される。１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするｒＡＡＶ（一本鎖ゲノムを有する、ｓｃＡＡＶ）は、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のｍｉＤＮＭ１をコードし得る。１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするｓｃＡＡＶは、１、２、３、又は４個のｍｉＤＮＭ１をコードし得る。

本明細書に記載の核酸又はウイルスベクターを含む組成物が提供される。
細胞におけるＤＮＭ１遺伝子の発現の防止又は阻害する方法であって、細胞を、ｍｉＤＮＭ１をコードする送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）と接触させることを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、方法が更に提供される。本方法では、重複及び／又は変異ＤＮＭ１対立遺伝子の発現は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、又は１００パーセント阻害される。本方法では、野生型ＤＮＭ１対立遺伝子の発現は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、又は１００パーセント阻害される。

ｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡの送達を必要とする対象にそれを行う方法であって、ｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、方法がなお更に提供される。ｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡの送達を必要とする対象にそれを行う他の方法は、１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。

ＤＥＥを予防又は治療する方法であって、ｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、方法もまた提供される。ＤＥＥを予防又は治療する他の方法は、１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠いている。これらの方法は、罹患していない対象における正常なＤＮＭ１発現の少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、又は１００パーセント以上のＤＮＭ１発現の回復をもたらす。

本開示は、本明細書に記載の核酸及び／又はそのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含むウイルスベクターである送達ビヒクルを提供する。提供されるウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、ＡＡＶであり得る。ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、又はＡＡＶ ｒｈ．７４である。ＡＡＶは、ＡＡＶ－９であり得る。ＡＡＶは、偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９であり得る。

本開示は、本明細書に記載の核酸と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に記載の核酸及び／又はそのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含むウイルスベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。

本開示は、組成物であって、ｍｉＤＮＭ１をコードする核酸を細胞に送達することができる送達ビヒクルであって、ｍｉＤＮＭ１が、ヒトＤＮＭ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのセグメント（セグメントは、ＤＥＥに関連する変異を含む配列をコードするか又はコードしないかのいずれか）に結合し、セグメントが、野生型マウスＤＮＭ１遺伝子に対して保存されている、送達ビヒクルと、任意選択で、薬学的に許容される担体と、を含む組成物を提供する。ヒトＤＮＭ１遺伝子エクソン１０ａは、配列番号５２の配列、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含み得る。マウスＤＮＭ１遺伝子エクソン１０ａは、配列番号５４の配列、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含み得る。ｍｉＤＮＭ１は、例えば、配列番号５２のヌクレオチド１１５～１３６内の配列に相補的であるｍＲＮＡセグメント（例えば、ｍｉＤＮＭ１ａ－４が結合するヌクレオチド）に特異的に結合する。ヒトＤＮＭ１遺伝子エクソン１０ｂは、配列番号５３の配列、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含み得る。マウスＤＮＭ１遺伝子エクソン１０ｂは、配列番号５５の配列、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含み得る。

本開示は、ウイルスベクターである、組成物中の送達ビヒクルを提供する。組成物中のウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスであり得る。ウイルスベクターは、ＡＡＶであり得る。ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶ ｒｈ．７４から選択されるカプシド血清型であるか、又はそれを有する。ＡＡＶは、ＡＡＶ－９のカプシド血清型であり得るか、又はそれを有し得る。ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９などの偽型ＡＡＶであり得る。

本開示は、重複及び／又は変異ＤＮＭ１遺伝子を含むニューロンに、以下を送達する方法を提供する：（ａ）配列番号１～１７のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＤＮＭ１をコードする鋳型核酸を含む核酸、配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される全長ｍｉＤＮＭ１配列をコードする核酸、若しくは配列番号１８～３４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号３５～５１のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＤＮＭ１の処理されたアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、（ｂ）本明細書に記載の核酸のうちの任意の１つ以上を含むベクター、あるいは（ｃ）本明細書に記載の核酸又はベクターのうちの任意の１つ以上を含む組成物。

本開示は、重複及び／又は変異ＤＮＭ１遺伝子に罹患している対象を治療する方法であって、本方法が、対象に、（ａ）配列番号１～１７のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＤＮＭ１をコードする鋳型核酸を含む核酸、配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される全長ｍｉＤＮＭ１配列をコードする核酸、若しくは配列番号１８～３４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号３５～５１のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＤＮＭ１の処理されたアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、（ｂ）本明細書に記載の核酸のうちの任意の１つ以上を含むベクター、あるいは（ｃ）本明細書に記載の核酸又はベクターのうちの任意の１つ以上を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。

本開示は、ＤＥＥに罹患している、本明細書の方法によって治療される対象を企図する。本開示はまた、ＤＮＭ１遺伝子の変異によりＤＥＥのリスクがある対象の治療を企図する。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、ヒト対象であり得る。

本開示はまた、病原性ＤＮＭ１遺伝子バリアントに罹患している対象を治療するための医薬品の製造における、又はその治療における、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクター、又は本明細書に記載の組成物の使用を提供する。

本開示はまた、ＤＥＥの治療を必要とする対象におけるＤＥＥを治療するための医薬品の製造における、又はその治療における、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクター、又は本明細書に記載の組成物の使用を提供する。

本開示の他の特徴及び利点は、以下の図面の説明及び詳細な説明から明らかであろう。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、図面、詳細な説明、及び実施例から明らかとなるであろうから、図面、詳細な説明、及び実施例は、開示された主題の実施形態を示すが、例示のみを目的として与えられることが理解されるべきである。

本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な費用の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。

フォールディング及び処理部位を示す人工ｍｉＲＮＡシャトル配列の例を示す。成熟ガイド鎖には下線が引かれている。灰色の矢じりは、Ｄｒｏｓｈａ切断部位を示し、黒色の矢じりは、Ｄｉｃｅｒ切断部位を示す。５’及び３’最末端の影付き配列は、Ｕ６プロモーターの前のｍｉＲＮＡシャトルをクローニングするために使用される鋳型ＤＮＡにおける制限部位である。 図２Ａ～図２Ｄは、ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａがＤｎｍ１ａを選択的に阻害することを示す。Ａ）４つの異なるｍｉＲＮＡ構築物によるインビトロでのＤｎｍ１ａのノックダウン有効性。ｍｉＤｎｍ１ａ－４は、９５％のノックダウンで最も有効であった。Ｂ）ＰＮＤ０でＩＣＶ注射を介して送達された実験構築物及び対照構築物。黒色のボックスは、ウイルス逆位末端反復を示し、ｐＡは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを示す。Ｃ）ｓｃＡＡＶ９－ｅＧＦＰ対照（ｎ＝６）と比較したｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａ（ｎ＝８）によるインビボでのＤｎｍ１ａノックダウン有効性の検証は、ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａで処置されたマウス由来の全脳抽出物においてＤｎｍ１ａの有意な減少を示したが、Ｄｎｍ１ｂは示さなかった（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｎｓ、多重比較のためのＳｉｄａｋの補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）。Ｄ）ＩＣＶ注射の３０日後のＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}及びＤｎｍ１^＋／＋ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａで処置されたマウスの両方の広範なウイルス形質導入。１０倍の倍率で画像を撮影した。データは、平均±ＳＥＭとして報告した。脳全体のスケールバーは、５００μｍを表し、関心領域（ＲＯＩ）のスケールバーは、２０μｍを表す。 図３Ａ～図３Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、生存、成長、及び発作転帰を改善することを示す。Ａ）ＰＮＤ０で投与されるＩＣＶ注射、ＰＮＤ４～ＰＮＤ１１の間に実行される発達表現型決定、ＰＮＤ４～ＰＮＤ３０（研究のエンドポイント）から評価される生存、発作、及び成長の測定、並びにＰＮＤ１８及びＰＮＤ３０で実施される細胞表現型決定を伴う実験設計。Ｂ）ｍｉＤｎｍ１ａによる処置は、ＰＮＤ２０の前に１００％致死的であった対照が注射されたマウス（ｅＧＦＰ又は生理食塩水、ｎ＝２７）と比較して、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス（ｎ＝２５）のＰＮＤ３０までの７５％の生存をもたらした（ｐ＜０．０００１、ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置されたＤｎｍ１^＋／＋（ｎ＝２４）又は対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋（ｎ＝１９）マウスとは異なる（それぞれ、ｐ＝０．０２３９、ｐ＝０．００９７、ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。Ｃ）処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ８の早くに顕著に小さかったが、ｍｉＤｎｍ１ａで処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}は、ＰＮＤ１２で開始する成長改善を示した。遺伝子型処置効果（２つの対照処置、ｅＧＦＰ及び生理食塩水を組み合わせたもの）に加えて、性別、ウイルス用量、及び同腹子サイズを含む他の独立した変数を含む、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスが研究を終了したＰＮＤ１８まで反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}対対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}では、処置の効果は、同腹子サイズの有意な効果（ｐ＝１．４×１０^－７）にもかかわらず、非常に有意であった（ｐ＝３．３×１０^－１３）が、ウイルスの用量又は性別の有意な影響はなかった。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}と処置された野生型との間のＰＮＤ３０研究エンドポイントにおける成長の差異は、有意であり（ｐ＝０．００４）、同腹子サイズの適度な効果を有した（ｐ＝０．０４８）。同様の分析を使用して、処置された野生型マウスも、対照野生型と比較して成長の遅延（ｐ＝０．００４）を示し、性別（ｐ＝０．０１）及び同腹子サイズ（ｐ＝０．０３３）の適度な影響を示した。Ｄ）ｍｉＤｎｍ１ａで処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの両方が発作様行動を示すが、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１４及びＰＮＤ１８で有意により多くの発作を有した。処置されたマウスの発作行動は、経時的に減少した。試料番号及び分析については表１を参照されたい。データは、平均±ＳＥＭとして報告した。図４Ａ～図４Ｃも参照されたい。 図４Ａ～図４Ｃは、ｍｉＤｎｍ１ａが、用量依存的に生存を改善することを示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統バックグラウンドパイロット実験、図２Ａ～図２Ｃに関連する）。Ａ）パイロット研究のための実験計画。３つのｍｉＤｎｍ１ａ用量を新生児に投与し、生存及び成長について調べた。Ｂ）処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの生存曲線は、１．８５ｘ１０^１１（ｎ＝１０）及び３．２ｘ１０^１１（ｎ＝６）用量についてのみ、未処置のＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと有意に異なる（それぞれ、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０１、ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。Ｃ）これらの用量について、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、未処置のマウスと比較して成長改善を示す（ｐ＝０．００３、反復測定ＡＮＯＶＡ）。 図５Ａ～図５Ｆは、ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａ処置が発達転帰を改善することを示す。Ａ）処置は、対照が注射された（ｎ＝２８）マウスと比較して、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス（ｎ＝３０）のＰＮＤ１１での握力を有意に改善し（ｐ＝０．０００９、ランク及び正規分位変換データを使用した最小二乗回帰）、同腹子サイズ、性別、又はウイルス用量の影響はなかった。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置された（ｎ＝２４）又は対照が注射された（ｎ＝１９）Ｄｎｍ１^＋／＋マウスとは異ならなかった（ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後検定を伴う上記と同じ検定、ｐ＞０．０５）。Ｂ、Ｃ）感覚運動発達についてのアッセイでは、ＰＮＤ９及びＰＮＤ１１で、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、より高い潜時を有したが、容易な９０°回転については有意ではなかった（ｐ＞０．０５、ランク及び正規分位変換データを使用した最小二乗回帰、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定）。しかしながら、困難な１８０°回転については、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、他の３つの群と比較して、ＰＮＤ１１で有意に高い潜時を示した（ｐ＜０．００１、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定）。Ｄ）対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス（ｎ＝２４）は、重度の運動失調を示し、重要なことに、ｍｉＤｎｍ１ａでの処置（ｎ＝１７）は、この表現型を排除し（ｐ＝６．９×１０^－１７、対数－Ｐｏｉｓｓｏｎ検定）、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}運動協調を、処置された（ｎ＝１６）及び対照が注射された（ｎ＝２３）Ｄｎｍ１^＋／＋マウスのレベルに戻す（ｐ＝０．１９混合モデルの対数－Ｐｏｉｓｓｏｎ検定）。Ｅ、Ｆ）可能性のある多動性の代用として移動及び速度を使用して、全ての群間に有意差がなかったことを観察した（ｐ＞０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図６Ａ～図６Ｄは、ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、ＰＮＤ１８でのグリオーシス及び細胞変性をＰＮＤ３０までに減少させることを示す。Ａ）対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと比較して、マーカーＧＦＡＰで特定される海馬ＣＡ１において特異的に顕著に増加したグリオーシスを示した（ｐ＝０．０１８）。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８で、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。Ｂ）ＰＮＤ３０まで、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}は、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスと比較して有意に多くのＧＦＡＰ強度を示した（それぞれｐ＝０．００５２及びｐ＝０．００７２）。画像（Ａ～Ｂ）を１０倍の倍率で撮影し、分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡ、続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して行った。海馬全体のスケールバーは、２００μｍを表し、関心領域（ＲＯＩ）のスケールバーは、２０μｍを表す。Ｃ、Ｄ）ＰＮＤ１８でのＦＪＣ標識は、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスとは異なり、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス、特にＣＡ１に沿った海馬における有意な細胞死を示した（ｐ＝０．０１５）。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。ＰＮＤ３０までに、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＦＪＣ標識によって特定されるほとんど明らかな細胞死を有しなかった。しかしながら、それらは、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。１０倍の倍率で画像を撮影し、スケールバーは、１００μｍに対応した。分析は、ＪａｍｏｖｉのソフトウェアのＧＭＬＪモジュールのＰｏｉｓｓｏｎ過分散オプションを使用して実行した。３～５匹のマウスをこれらの分析に使用し、データは、平均±ＳＥＭとして報告する。図７Ａ－図７Ｂも参照されたい。 同上。 図７Ａ～図７Ｂは、ＰＮＤ１８及びＰＮＤ３０の細胞表現型画像（ＧＦＡＰ及びＦＪＣ、２つの他の代表的な複製セット、図６Ａ～図６Ｄに関連する）を示す。Ａ）対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８で、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス及びＤｎｍ１^＋／＋対照には存在しない海馬ＧＦＡＰの増加を示す。ＰＮＤ３０で、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、Ｄｎｍ１^＋／＋対照と比較して、ＧＦＡＰの有意な増加を示す。スケールバーは、２００．Ｌｍに対応する。Ｂ）対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、海馬ＣＡ１における細胞死を示す。この表現型は、ＰＮＤ１８では、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス及びＤｎｍ１^＋／＋対照には存在しない。しかしながら、ＰＮＤ３０までに、Ｄｎｍ１^＋／＋対照と比較して、処置されたマウスのＣＡ１にいくつかの顕著な細胞死がある。スケールバーは、１００．Ｌｍに対応する。 図８Ａ～図８Ｄは、ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、ＰＮＤ１８での代謝細胞活性をＰＮＤ３０までに改善することを示す。Ａ）異常なＮＰＹ発現が、ＰＮＤ１８で、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの海馬、及び特にＣＡ３で観察された。ｍｉＤｎｍ１ａでの処置は、この表現型を元に戻した（ｐ＝０．００１２）。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。Ｂ）ＮＰＹ発現は、ＰＮＤ３０で、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス間で変化した。しかしながら、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置されたＤｎｍ１^＋／＋マウス（ｐ＝０．０５７）及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウス（ｐ＝０．０７４）と比較して、有意性に向かう傾向があった。Ｃ）ＰＮＤ１８で、ｃ－Ｆｏｓ染色は、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの海馬ＣＡ３においてニューロン活性化の増加を示し、これは、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスにおいて有意に減少した（ｐ＜０．００００１）。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、Ｄｎｍ１^＋／＋対照とは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。Ｄ）ＰＮＤ３０までに、Ｄｎｍ１^＋／＋対照と比較して、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの海馬、特にＣＡ３領域において、ニューロン活性化の適度な増加があったが、この増加は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。全ての画像（Ａ～Ｄ）を１０倍の倍率で撮影した。海馬全体のスケールバーは、２００μｍを表し、ＲＯＩのスケールバーは、２０μｍを表す。分析は、ＪａｍｏｖｉのソフトウェアのＧＭＬＪモジュールのＰｏｉｓｓｏｎ過分散オプションを使用して実行した。３～５匹のマウスをこれらの分析に使用し、データは、平均±ＳＥＭとして報告する。図９Ａ－図９Ｂも参照されたい。 同上。 図９Ａ～図９Ｂは、ＰＮＤ１８及びＰＮＤ３０の細胞表現型画像（ＮＰＹ及びｃ－Ｆｏｓ、２つの他の代表的な複製セット、図８Ａ～図８Ｄに関連する）を示す。Ａ）Ｄｎｍ１Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ処置されたマウスは、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと比較して、ＰＮＤ１８及びＰＮＤ３０で海馬におけるＮＰＹ＋細胞の減少を示す。ＰＮＤ３０までに、処置されたマウスは、ＣＡ３において、Ｄｎｍ１^＋／＋対照と比較して、増加したＮＰＹを示し始める。Ｂ）処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８で、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと比較して、ｃ－Ｆｏｓの減少を示す。ＰＮＤ３０までに、処置されたマウスは、Ｄｎｍ１^＋／＋マウスと比較して、海馬のｃ－Ｆｏｓ発現の可変的な増加を示す。スケールバーは、２００μｍに対応する。 ｍｉＤＮＭ１－１０ｂ－７２が、ヒト及びマウスの転写産物において保存されているＤＮＭ１エクソン１０配列を発現停止させることを実証するルシフェラーゼアッセイの結果を示す。

図面に関する統計解析
統計分析が、試験に応じて、Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ）、ＪＭＰ１４ソフトウェア（ＪＭＰ，Ｉｎｃ）のいずれかを使用して行われた。ｑＰＣＲデータ（図２）を、二元配置ＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ８）を使用して分析した。パイロット研究の生存分析（図３）を、ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定（Ｐｒｉｓｍ８）を使用して分析し、一次研究（図４）については、リスク比を伴う比例ハザード検定を使用して、共変量を調整した（ＪＭＰ１４）。成長（図３、図４）を、反復測定ＭＡＮＯＶＡ（ＪＭＰ）を使用して分析した。発作様行動（図３）を、２×２Ｆｉｓｈｅｒ正確検定（ＪＭＰ１４）を使用して分析した。握力及び負の走地性（図５）を、データのランク及び正規分位変換（ＪＭＰ）後の最小二乗回帰を使用して分析した。運動失調（落下及びぐらつきの数）を、対数－Ｐｏｉｓｓｏｎ検定及びコントラストモデリングを使用して分析し、特定の群を比較した（ＪＭＰ１４）。ＩＨＣ定量を、Ｊａｍｏｖｉの線形モデルの一般化分析のモジュール（ｇａｍｌｊ）のＰｏｉｓｓｏｎ過分散オプションを使用して分析した^３１。Ｐ値をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整した。

本明細書に記載の産物及び方法は、病原性ＤＮＭ１アイソフォームに関連する疾患の治療において使用される。ＤＮＭ１に関連する疾患としては、例えば、ＤＥＥが挙げられる。ＤＥＥには、Ｌｅｎｎｏｘ－Ｇａｓｔｏｕｔ症候群及び幼児けいれんが含まれるが、これらに限定されない。

主に重要なＧＴＰａｓｅ及びＤＮＭ１の中間ドメインにおいて、３３人の患者において特定された少なくとも２０個のヘテロ接合性デノボバリアントは、ＥｕｒｏＥＰＩＮＯＭＩＣＳ－ＲＥＳ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１００：１７９（２０１７）、Ａｓｉｎｏｆ（２０１５）、上記、ｖｏｎ Ｓｐｉｃｚａｋ、上記、Ｂｒｅｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ．，６：２９４－３００（２０１８）、Ｋｏｌｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｉｚｕｒｅ，５６：３１－３３（２０１８）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０：１４５４，（２０１９）において記載されている。

ヒトＤＮＭ１エクソン１０ａをコードする核酸は、配列番号５２に示されている。ヒトＤＮＭ１エクソン１０ｂをコードする核酸は、配列番号５３に示されている。本開示の様々な産物及び方法は、配列番号５２又は５３に示されるヒトＤＮＭ１ヌクレオチド配列のバリアントを標的とし得る。バリアントは、配列番号５２又は５３に示されるヌクレオチド配列と、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を示し得る。

マウスＤＮＭ１エクソン１０ａをコードする核酸は、配列番号５４に示されている。マウスＤＮＭ１エクソン１０ｂをコードする核酸は、配列番号５４に示されている。本開示の様々な産物及び方法は、配列番号５４又は５５に示されるヌクレオチド配列のバリアントを標的とし得る。バリアントは、配列番号５４又は５５に示されるヌクレオチド配列と、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を示し得る。

本開示には、ＤＮＭ１の過剰発現に起因する疾患又は障害を有する対象を改善及び／又は治療するために、ＤＮＭ１の発現を阻害又は干渉するためのＲＮＡ干渉の使用が含まれる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真核細胞における遺伝子調節のメカニズムであり、様々な疾患の治療のために考慮されている。ＲＮＡｉは、阻害性ＲＮＡによって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。阻害性ＲＮＡは、同族メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と配列相同性を共有し、塩基対形成する、小さい（２１～２５ヌクレオチド）、非コードＲＮＡである。阻害性ＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、ｍＲＮＡの翻訳を防止するために細胞遺伝子発現停止機構を誘導する。ＲＮＡｉ経路は、Ｄｕａｎ（Ｅｄ．），Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７，Ｓｅｃｔｉｏｎ７．３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０）に要約されている。

天然のＲＮＡｉ経路の理解が進むにつれて、研究者は、疾患を治療するために、標的遺伝子の発現の調節に使用するための人工阻害性ＲＮＡを設計した。いくつかのクラスの低分子ＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉプロセスを誘発することが知られている［Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：３２９－４０（２０１１）、Ｈａｒｐｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：９３３－９３８（２００９）］。人工阻害性ＲＮＡは、プラスミド又はウイルスベースのベクターからインビボで発現され、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモーターが活性である限り、１回の投与で長期の遺伝子発現停止を達成し得る［Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３９２：１４５－７３，（２００５）］。重要なことに、このベクター発現アプローチは、筋肉遺伝子療法の分野で既に数十年にわたって行われてきた進歩を活用しているが、タンパク質をコードする遺伝子を発現させる代わりに、ＲＮＡｉ療法戦略におけるベクターカーゴは、目的の疾患遺伝子を標的化する人工阻害性ＲＮＡカセットである。

ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現を発現停止するために使用され得る緊密なヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、それが分解及び代謝回転の速度が比較的低いという点でＲＮＡｉの有利な媒介物であるが、それは発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムを形質導入すると、次にｓｈＲＮＡは、プロモーター選択によってポリメラーゼＩ又はポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。産物は、プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を模倣し、Ｄｒｏｓｈａによって処理される。得られたプレ－ｓｈＲＮＡは、エクスポーチン５によって核から排出される。次にこの産物はＤｉｃｅｒによって処理され、ＲＮＡ誘発発現停止複合体（ＲＩＳＣ）中へとロードされる。センス（パッセンジャー）鎖は分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的な配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを配向する。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を阻止する。これらの場合ではどちらも、ｓｈＲＮＡは標的遺伝子の発現停止を引き起こす。

本開示は、人工ＤＭＮ１阻害性ＲＮＡを発現するウイルスベクターの産生及び投与を含む。人工ＤＭＮ１阻害性ＲＮＡの発現は、様々なプロモーターの使用によって調節される。本開示は、Ｕ６及びＨ１プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はポリメラーゼＩＩプロモーターの使用を企図する。

本明細書で提供される産物及び方法は、ＤＮＭ１の発現を修飾する（例えば、発現をノックダウン又は阻害する）ためのｍｉＲＮＡシャトルを含み得る。ｓｈＲＮＡと同様に、ｍｉＲＮＡシャトルは、ＤＮＡ導入遺伝子から細胞内で発現される。ｍｉＲＮＡシャトルは、典型的には、正しい処理を誘導するために必要な天然のｍｉＲＮＡ配列を含有するが、ステムにおける天然の成熟ｍｉＲＮＡ二重鎖は、（例えば、図１に示されるように）意図された標的転写産物に特異的な配列によって置き換えられる。発現後、人工ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒによって切断されて、埋め込まれたｓｉＲＮＡ様領域を遊離する。Ｕ６及びＨ１プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーター、並びにポリメラーゼＩＩプロモーターも、ｍｉＲＮＡシャトルの発現を駆動するために使用される。

本開示は、ＤＮＭ１遺伝子の発現を阻害するためのｍｉＤＮＭ１をコードする配列を提供する。本開示は、配列番号１８～３４のうちのいずれか１つに示される全長ｍｉＤＮＭ！ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、ｍｉＤＮＭ１をコードする核酸を提供する。本開示は、配列番号３５～５１のうちのいずれか１つに示されるアンチセンスガイド鎖ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、ｍｉＤＮＭ１の処理されたアンチセンスガイド鎖をコードする核酸を提供する。

本開示は、配列番号１～１７のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、ｍｉＤＮＭ１をコードする核酸を提供する。

例示的なｍｉＤＮＭ１は、配列番号１８～３４のうちのいずれか１つ以上に示されるポリヌクレオチド配列、又は配列番号１８～３４のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む。配列番号１８～３４に対応する最終的に処理されたガイド鎖配列は、それぞれ配列番号３５～５１に示される。本開示は更に、図？に示されるアンチセンスガイド鎖を提供し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、これらのアンチセンスガイド鎖の各々のバリアントを企図する。

本開示は、これらの配列のうちの１つ以上のコピーをコードするポリヌクレオチドが、ベクターなどの単一の送達ビヒクルに組み合わされることを企図する。したがって、本開示は、本開示の核酸又は本開示の核酸の組み合わせを含む、ベクターを含む。本明細書に開示の核酸を送達するためのベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び／若しくは外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなど）が提供される。ＡＡＶベクターが例示される。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む長さが約４．７ｋｂである。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８６２に提示されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３ （２００４）で提供されており、ＡＡＶ－１２ゲノムの一部は、Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号ＤＱ８１３６４７に提供されており、ＡＡＶ－１３ゲノムの一部は、Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ－Ｂ１ゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。ウイルスのＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体への組み込みを誘導するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と共役した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを誘導するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てを、外来ＤＮＡで置き換えることができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。

本明細書に例示されるように、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠いている。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．８、又はＡＡＶｒｈ．１０由来であり得るカプシド血清型を有する。

ウイルスベクターには、例えば、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ ＩＴＲ及びＡＡＶ３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ ＩＴＲ及びＡＡＶ４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ ＩＴＲ及びＡＡＶ７カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ及びＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、又はＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ及びＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）が含まれる。

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染が許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０及びＡＡＶ－ｒｈ．７４を含むが、これに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が具体的に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。

ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ及び異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含有する偽型ＡＡＶであり得る。偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）であり得る。偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）であり得る。偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）であり得る。

ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８若しくはＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３からのカプシドタンパク質のうちの１つ以上のキメラを含有するカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含有し得る。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドバリアントを有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

本開示は、ＤＮＭ１ ｍＲＮＡを標的としてＤＮＭ１発現を阻害するｍｉＤＮＭ１を送達するためのＡＡＶを提供する。ＡＡＶは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）ベースのプロモーターの制御下で、ｍｉＤＮＭ１を送達するために使用され得る。ＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。ＡＡＶは、Ｈ１プロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。ＡＡＶは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）ベースのプロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。ＡＡＶは、Ｕ７プロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。ＡＡＶは、ニューロン特異的プロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。例えば、ＡＡＶは、ニューロン特異的シナプシンプロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。ＡＡＶは、ＤＮＭ１プロモーターの制御下でｍｉＤＮＭ１を送達するために使用される。

自然界において、Ｕ６プロモーターは、スプライシングに関与し、十分に特徴付けられている低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ＲＮＡの発現を制御する［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２２（６０７４）：７３－７７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８（６）：１２８３－１２９８（２０００）］。（１）プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ポリＩＩＩ）によって認識され、かつＲＮＡの高レベルの恒常的発現を制御し、（２）プロモーターが、大半の哺乳動物細胞型において活性であるため、Ｕ６プロモーターが、哺乳動物細胞におけるベクターベースの発現を制御するために使用される［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（３）：１４４３－１４４８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（５）：５０５－５１８（２００２）］。本開示は、マウス及びヒトＵ６プロモーターの両方の使用を含む。

本明細書のＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ、組換え一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。

本開示のｒＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のｍｉＤＮＭ１をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）などの商業的プロバイダーが、カスタム阻害性ＲＮＡ分子を作製する。加えて、市販のキットが、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）又はｐｓｉＲＮＡシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのカスタムｓｉＲＮＡ分子を産生するために利用可能である。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１（１９８２）］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加［Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３（１９８３）］、又は直接的な平滑末端ライゲーション［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６（１９８４）］などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－１５３９（１９９２）、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。様々なアプローチが以下に記載されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、特に、ｒＡＡＶ産生に関する文書のセクションに重点を置く。自己相補的ｒＡＡＶの産生及び使用が特に企図され、例示される。

本開示は、ＡＡＶベクターを産生するパッケージング細胞を更に提供する。パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

そのため、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）が本明細書に提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡが存在しない。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などの当該技術分野で標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示された方法を含む。

本開示の核酸及びウイルスベクターを含む組成物が提供される。本明細書に記載の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物が提供される。このような組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。組成物はまた、希釈剤及びアジュバントなどの他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、若しくは他の有機酸）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジン）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）、並びに／又は非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる。

髄腔内送達を含むが、これらに限定されないＣＳＦ送達の場合、本明細書で提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、又はイオキシランなどの非イオン性低浸透圧化合物又は造影剤を含有する、薬学的に許容される水性賦形剤を含み得、非イオン性低浸透圧化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性のうちの１つ以上を有し得る：約１８０ｍｇＩ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法によるオスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐ及び３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、並びに３７℃で約１．１６４の比重。例示的な組成物は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧化合物、又は約２５～３５％の非イオン性低浸透圧化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、及び約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧化合物中に製剤化されたｓｃＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス粒子を含む。別の例示的な組成物は、１×ＰＢＳ及び０．００１％のプルロニックＦ６８中に製剤化されたｓｃＡＡＶを含む。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方式、治療目標、個体、及び標的にされる細胞型に応じて異なり、当該技術分野で標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌ当たり約１×１０^６個、約１×１０^７個、約１×１０^８個、約１×１０^９個、約１×１０^１０個、約１×１０^１１個、約１×１０^１２個、約１×１０^１３個、約１×１０^１４個、約１×１０^１６個、又はそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。本明細書で企図される投薬量は、約１×１０^７ｖｇ、約１×１０^８ｖｇ、約１×１０^９ｖｇ、約５×１０^９ｖｇ、約６×１０^９ｖｇ、約７×１０^９ｖｇ、約８×１０^９ｖｇ、約９×１０^９ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇ、約２×１０^１０ｖｇ、約３×１０^１０ｖｇ、約４×１０^１０ｖｇ、約５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇ、約１．１×１０^１１ｖｇ、約１．２×１０^１１ｖｇ、約１．３×１０^１１ｖｇ、約１．２×１０^１１ｖｇ、約１．３×１０^１１ｖｇ、約１．４×１０^１１ｖｇ、約１．５×１０^１１ｖｇ、約１．６×１０^１１ｖｇ、約１．７×１０^１１ｖｇ、約１．８×１０^１１ｖｇ、約１．９×１０^１１ｖｇ、約２×１０^１１ｖｇ、約３×１０^１１ｖｇ、約４×１０^１１ｖｇ、約５×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ、約１×１０^１３ｖｇ、約１．１×１０^１３ｖｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ、約１．３×１０^１３ｖｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ、約２×１０^１３ｖｇ、約２．５×１０^１３ｖｇ、約３×１０^１３ｖｇ、約３．５×１０^１３ｖｇ、約４×１０^１３ｖｇ、約４．５×１０^１３ｖｇ、約５×１０^１３ｖｇ、約６×１０^１３ｖｇ、約１×１０^１４ｖｇ、約２×１０^１４ｖｇ、約３×１０^１４ｖｇ、約４×１０^１４ｖｇ、約５×１０^１４ｖｇ、約１×１０^１５ｖｇ、～約１×１０^１６ｖｇ、又はそれを超える全ウイルスゲノムを含む。約１×１０^９ｖｇ～約１×１０^１０ｖｇ、約５×１０^９ｖｇ～約５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇ～約１×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇ～約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ～約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ～約１×１０^１４ｖｇ、約１×１０^１３ｖｇ～約６×１０^１４ｖｇ、及び約６×１０^１３ｖｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ、２．０×１０^１４ｖｇ、３．０×１０^１４ｖｇ、５．０×１０^１４の投薬量も企図される。例えば、ＣＳＦ用量は、年齢群に基づいて、約１×１０^１３ｖｇ／患者～約１×１０^１５ｖｇ／患者の範囲であり得る。例えば、静脈内送達用量は、１×１０^１３ｖｇ／キログラム（ｋｇ）体重～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲であり得る。

インビボ又はインビトロで、標的細胞に送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を形質導入する方法が企図される。インビボ方法は、有効用量又は有効複数回用量の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物を、それを必要とする対象（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する用量であり、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは予防する用量であり、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防する用量であり、疾患の程度を軽減する用量であり、疾患の寛解（部分若しくは完全）をもたらす用量であり、並びに／又は生存を延長する用量である。本発明の方法による予防又は治療が企図される疾患の例は、ＤＥＥである。ＤＥＥには、レノックス－ガストー症候群及び幼児けいれんが含まれるが、これらに限定されない。病理学的ＤＮＭ１遺伝子バリアントを保有することが知られている家族では、本方法は、疾患の発病前に行われ得る。他の患者では、本方法は診断後に行われる。

髄腔内投与の場合、対象は、ｒＡＡＶの注射後、トレンデレンブルク体位（頭低位）に維持され得る（例えば、約５、約１０、約１５、又は約２０分間）。例えば、患者は、頭低位で約１度～約３０度、約１５～約３０度、約３０～約６０度、約６０～約９０度、又は約９０～約１８０度で傾けられてもよい。

分子的、生化学的、組織学的、及び機能的な転帰尺度は、本方法の治療有効性を実証する。転帰尺度は、例えば、Ａｉｍｉｕｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２８（７）：１７０６－１７１６（２０２０）に記載されている。転帰尺度には、罹患した組織における変異ＤＮＭ１ ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の低減又は除去、ＤＮＭ１遺伝子のノックダウン、生存率の増加、成長の増加、及び発作の減少のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。他には、神経組織学の改善（軸索数、軸索サイズ、及びミエリン形成）、運動機能の改善、握力の改善、脳におけるグリオーシス及び神経変性の低減、並びに代謝活性の改善が含まれるが、これらに限定されない。

本開示の方法では、対象における変異ＤＮＭ１の発現は、治療前の対象における発現と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、又は１００パーセント阻害される。

併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次治療の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療及び支持療法との組み合わせは、特に企図される。

有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、経直腸、又は膣内が含まれるが、これらに限定されない。有効用量は、経路の組み合わせによって送達され得る。例えば、有効用量は、静脈内及び筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。有効用量は、連続して又は逐次的に送達され得る。有効用量は、同時に送達され得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される感染症及び／又は疾患状態、並びにｍｉＲＮＡを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。

特に、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を対象の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与としては、筋肉への注射、血流への注入、及び／又は神経系若しくは肝臓への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法において避ける必要がある）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に援用される）。薬学的組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本発明を実施に使用することができる。送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に入手可能である。

注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な通針性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合には、必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。

滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分に加えて予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

本明細書で提供されるｒＡＡＶでのニューロンなどの細胞の形質導入は、ＤＮＭ１ ｍｉＲＮＡの持続発現をもたらす。したがって、本発明は、ＤＮＭ１ ｍｉＲＮＡを発現するｒＡＡＶを、好ましくはヒトである対象に投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、細胞及び組織（中枢神経系ニューロンを含むが、これらに限定されない）を本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することを含む。形質導入は、細胞特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行うことができる。

「形質導入」という用語は、例として、標的細胞によるｍｉＤＮＭ１の発現をもたらす本明細書に記載の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの標的細胞へのｍｉＤＮＭ１の投与／送達を指す。

そのため、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量）の本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。

本発明の態様及び例示的な実施形態は、以下の実施例によって例示される。
実施例１
マウスＤＮＭ１を標的とするｍｉＤＮＭ１の設計及びインビトロ試験
Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌをノックダウンするために、マイクロＲＮＡは、断続的な変異を有するマウスＤｎｍ１ａアイソフォームを特異的かつ効率的に標的とするように設計された。

人工ｍｉＲＮＡは、天然のｍｉｒ－３０に基づいており、正常なｍｉＲＮＡの生合成に必要な重要な構造及び配列エレメントを維持しているが、成熟ｍｉｒ－３０配列が、ＤＮＭ１遺伝子に相補的な２２ｎｔで置き換えられている。例示的な一般的なｍｉＲＮＡシャトル構造を示す図１を参照されたい。

以前に、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０：１４１７－１４２３（２０１２）に記載されているように、Ｄｎｍ１ａを標的とする４つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＤｎｍ１ａ－１からｍｉＤｎｍ１ａ－４と称される）を設計し、Ｕ６プロモーターによって駆動される発現を有するｍｉｒ－３０ベースの構築物にクローニングした。ｍｉＤＮＭ１配列は、概して、Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２ ｏｆ Ｈａｒｐｅｒ（Ｅｄ．），ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１１）に従って設計された。適格なｍｉＲＮＡは、２２ｎｔ長であり、最初の４つ及び最後の４つのヌクレオチドが、それぞれ、少なくとも７５％のＧＣリッチ及びＡＵリッチであった。加えて、２２ヌクレオチドのストリングは、４０％のＡＵリッチであった。Ｄｎｍ１ａのｍｉＲＮＡ特異的標的化は、Ｄｎｍ１ａとＤｎｍ１ｂとの間の４２ｎｔの差異を利用した。

ｍｉＲＮＡの活性を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してインビトロで試験した。ルシフェラーゼアッセイは、それぞれ、ホタル及びＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の２つの異なるルシフェラーゼ遺伝子を含有するデュアルレポータープラスミドの開発を必要とする。ＤＮＭ１遺伝子配列は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの３’ＵＴＲとして挿入され、ホタルルシフェラーゼは、内部対照として機能する。Ｕ６．ｍｉＤＮＭ１プラスミドを、デュアルルシフェラーゼプラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションする。ＤＮＭ１遺伝子ノックダウンは、対照ホタルルシフェラーゼ活性に対して、ＤＮＭ１配列でタグ付けされたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性を測定することによって決定される。ｍｉＤｎｍ１ａ－１は、約８４％のノックダウンを示し、ｍｉＤｎｍ１ａ－２は、約６４％のノックダウンを示し、ｍｉＤｎｍ１ａ－３は、約８０％のノックダウンを示した。ｍｉＤｎｍ１ａ－４は、Ｄｎｍ１ａ ｍＲＮＡの量の低減で最も効果的であり（図２Ａ）、約９５％のノックダウンを示した。全長ｍｉＤｎｍ１ａ－４ ｍｉＲＮＡ配列は以下のとおりである。

成熟ｍｉＲＮＡ（下線付き）のアンチセンス鎖は、Ｄｎｍ１ａ ｍＲＮＡに結合する。
実施例２
ｍｉＤＮＭ１をコードするｓｃＡＡＶ９の産生
次いで、インビボでの検証のために、ｍｉＤｎｍ１ａ－４鋳型ＤＮＡをｓｃＡＡＶ９ウイルスベクターにクローニングした（ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａ）（図２Ｂ）。

ｍｉＤＮＭ１鋳型配列を、インビボ送達のために、一般的に「ｓｃＡＡＶ９－ＮＰベクター」と称されるｓｃＡＡＶ９構築物にクローニングした。ｓｃＡＡＶ９はまた、ＣＭＶプロモーター駆動型ｅＧＦＰレポーター遺伝子も含有した。ｓｃＡＡＶ９は、自己相補的ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする変異ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）及び野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含んだ。得られたｓｃＡＡＶ９は、「ｓｃＡＡＶ９－ＮＰベクター」と称される。非標的化ｓｃＡＡＶは、「ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ」（ｓｃＡＡＶ構築物ｓｃＡＡＶ－ＮＰ．Ｕ６．ｍｉＲＬａｃＺ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの略）と称される。

ＳｃＡＡＶ９は、２９３細胞において、以前に記載されているように［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）］、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とともにＲｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを有する二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースのベクターを使用した一過性トランスフェクション手順によって産生された。実験のためにｓｃＡＡＶ９を、３つの別々のバッチで産生し、２つの塩化セシウム密度勾配精製ステップによって精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防止するために０．００１％プルロニック－Ｆ６８を用いて製剤化し、４℃で保存した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ－Ｍａｎ技術を使用して、定量的ＰＣＲによって滴定した。ベクターの純度を、４～１２％のドデシル硫酸ナトリウム－アクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって評価した。ｓｃＡＡＶ９ウイルスを、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＲｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって生成し、滴定した。

実施例３
形質導入及びＤｎｍ１ａノックダウンのインビボ定量化
マウスに、出生後日数０（ＰＮＤ０）に１回の両側脳室内（ＩＣＶ）注射を介して、処置（ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａ）又は対照（ｓｃＡＡＶ９－ｅＧＦＰ）ＡＡＶのいずれかを投与した。

ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａのＩＣＶ送達のために、ＰＮＤ０のＤｎｍ１^＋／＋マウスを、適切に麻酔されるまで冷却された金属ブロック上に配置することによって、低体温を使用して麻酔した。注射部位は、ラムダ縫合から各眼までの距離の約２／５であった。全ての注射を、点スタイル４、３３ゲージの針、及び１０μＬ又は２５μＬのハミルトンシリンジ（カタログ番号６５４６０－０６及びカタログ番号６５４６０－１０）を使用して自由裁量で実行した。対照ｓｃＡＡＶ９－ｅＧＦＰ注射を、ｍｉＤｎｍ１ａ投薬量に一致させ、生理食塩水対照を注射したウイルスの量に一致させた。

全脳を、ＰＮＤ１４で６匹のｅＧＦＰが注射されたマウス及び８匹のｍｉＤｎｍ１ａが注射されたマウスから単離した。組織を、２－メチルブタンで急速凍結し、－８０℃で保存した。試料を、ｄｏｕｎｃｅを使用して均質化し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号１５５９６０１８）を使用してＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，カタログ番号１８０８００５１）を使用して、ｃＤＮＡに変換した。Ｄｎｍ１ａノックダウンを、プライマー５’－ＣＴＣＧＣＴＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴ－３’（配列番号５６）及び３’－ＴＴＴＣＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧ－５’（配列番号５７）を使用して評価した。Ｄｎｍ１ｂ発現を、プライマー５’－ＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡ－３’（配列番号５８）及び３’－ＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡ－５’（配列番号５９）を使用して評価した。ＳＹＢＲ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号４４７２９０３）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５を使用して実行したｑＰＣＲに使用した。

結果を図２Ｃ～図２Ｄに示す。
実施例４
パイロット研究
生存延長におけるｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａの有効性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６Ｊ）マウス系統バックグラウンドでパイロット研究を実施した。Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、マウス系統のバックグラウンドに関係なく、出生後第３週までに致死性をもたらす、重度の完全浸透性強直間代発作及び併存疾患を経験する^１１。Ｂ６Ｊ－Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスを、３用量のｍｉＤｎｍ１ａ：１×１０^１０、１．８５×１０^１１、３．２５×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）で処置した。

Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}変異体の処置は、用量依存的に生存を延長した：後者の２つの用量でそれぞれ処置されたマウスの３０％（ｐ＝０．０００１）及び５０％（ｐ＝０．０１）は、ＰＮＤ３０まで生存し、成長の改善を示した（ｐ＝０．００３、図４Ｂ～図４Ｃ）。３．２５×１０^１１ｖｇでの最高用量は、明らかな副作用を生じなかった。

実施例５
拡大研究
ｍｉＤｎｍ１ａの有効性を更に評価するために、それらの大きな同腹子サイズ、動物サイズ、及び良好な母体ケアのため、（Ｂ６Ｊ×ＦＶＢ／ＮＪ）Ｆ_２ハイブリッドバックグラウンドマウスを使用した。Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}及びＤｎｍ１^＋／＋Ｆ_２ハイブリッドを、ＰＮＤ０で、処置（ｓｃＡＡＶ９－ｍｉＤｎｍ１ａ）又は対照の注射（すなわち、ｓｃＡＡＶ９－ｅＧＦＰ又は生理食塩水、図３Ａ）のいずれかを行った。Ｆ_２マウスを、取得した力価に基づいて、マウス当たり約５．２×１０^１１ｖｇ～６．０×１０^１１ｖｇで処置した。マウスを、本研究のために選択されたエンドポイントであるＰＮＤ３０までの生存、発作活性、及び体重について観察した（図３Ａ）。

研究設計
実験は、遺伝子型及び処置に対して盲検で実施され、必要に応じて無作為化された。出生後日数（ＰＮＤ）３０は、典型的には、子マウスはＰＮＤ２２とＰＮＤ２８との間で離乳し、発達期間の終わりを示すため、成体エンドポイントとして先を見越して選択された。生きたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスからの施設コンプライアンスデータ収集に準拠するために、瀕死時に停止した。変異Ｄｎｍ１ａの阻害からの改善の検出における９５％信頼性については、８０％の力で効果を検出するには、群当たり少なくとも１２匹の動物（遺伝子型ｘ処置、性別合わせて）が必要であった。一次研究では、可能な用量効果を評価するために、以下の２つのウイルス用量を表す、２つの実験をＦ_２ハイブリッドバックグラウンドで実行した：約５．２ｘ１０^１１ｖｇ、約６．０ｘ１０^１１ｖｇ。マウスを、ｍｉＤｎｍ１ａ処置又はｅＧＦＰ若しくは生理食塩水投与を含む対照条件のいずれかに無作為に割り当てた。単純化のための分析では、２つの対照条件は、効果に差異がなかったため、合わせた。したがって、処置された群対対照が注射された群をモデリングする分析のために、２つの用量実験及び性別（それぞれについてカテゴリー的指標変数を使用して）及び同腹子サイズを共変量として組み合わせた。細胞分析は、ほとんど全ての未処置又は対照が注射されたマウスが瀕死になる時点であるため、ＰＮＤ１８、及び研究のエンドポイントであるＰＮＤ３０で実行された。この研究について、ｍｉＤｎｍ１ａ処置の効果の細胞特性評価のための３つの代表的な反復を示す。

動物及び遺伝子型決定
これらの研究に使用したＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ－ｆｌｏｘ}マウス（以下、Ｂ６Ｊ－Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌと称する）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’ｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙコアによってＤｎｍ１^{Δ１ａ／Δ１ａ}マウスで作製し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＤｎｍ１^Ｆｔｆｌ変異を導入した。系統間Ｆ_２ハイブリッドマウスを作製するために、Ｂ６Ｊ－Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／＋}マウスをＦＶＢ／ＮＪ雌（ＪＡＸ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ストック００４６２４）に交配させ、Ｆ_１ハイブリッドマウスを系統間交配させた。マウスは、断片的対立遺伝子におけるｌｏｘＰ部位の存在を検出するように設計されたＰＣＲプロトコルで遺伝子型決定された。遺伝子型決定プライマー５’－ＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＴＴ－３’（配列番号６０）及び３’－ＡＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＴＡＧＡＡＣＣＴ－５’（配列番号６１）は、３２１ｂｐの変異対立遺伝子及び２１５ｂｐの野生型対立遺伝子を産生する。この研究のためのマウスは、０～３０日齢であった。個々の子マウスを特定するために、Ｋｅｔｃｈｕｍ Ａｎｉｍａｌ Ｔａｔｔｏｏ Ｉｎｋ（カタログ番号３２９ＡＡ）を使用して、ＡＩＭＳ子タトゥー識別システム（Ｂｕｄｄ Ｌａｋｅ，ＮＪ）に従って、それらをＰＮＤ０でタトゥーを入れた。マウスはまた、ＰＮＤ１０で耳切開された。ＰＮＤ２１での離乳後、マウスは、ホームケージ内で自由に餌及び水を摂取することができた。子マウスは、一度に１０分を超えてホームケージから分離されることはなかった。明かりを１２時間の明暗サイクルで維持し、サイクルの明かりの部分の間に行動試験を行った。全ての手順は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、実験動物のケア及び使用についての Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅに従って実施された。

実施例６
処置されたマウスにおける成長、発達、及び発作の評価
成長及び生存監視
ＰＮＤ４～ＰＮＤ３０に、実施例５のマウスを隔日で体重測定した。加えて、一般的な健康及び生存を、ＰＮＤ０～ＰＮＤ３０（研究エンドポイント）に毎日監視した。

先行の研究［Ｂｏｕｍｉｌ、上記］から示されるように、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８～１９までの瀕死又は末期発作事象まで、ＰＮＤ８から成長欠損を示し始めた（図３Ｂ、Ｃ）。対照的に、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ３０まで着実に成長したが、それぞれＰＮＤ８及びＰＮＤ１８から開始した、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスより遅れた（図３Ｃ）。全体として、ＰＮＤ１８まで、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}と比較して、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスに有意な成長改善があった（反復測定ＡＮＯＶＡ、ｐ＝３．３×１０^－１３）。処置されたＤｎｍ１^＋／＋マウスでさえ、対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋と比較して、ＰＮＤ８から始まるいくらかの成長遅延を示した（ｐ＝０．００４、図３Ｃ）。生殖細胞系Ｄｎｍ１ａ ｎｕｌｌマウスは、任意の明白な障害を欠くことが以前に報告された［Ａｓｉｎｏｆ（２０１５）、上記、Ａｓｉｎｏｆ（２０１５）、上記］が、処置されたＤｎｍ１^＋／＋に見られるような適度な成長遅延が、出生後Ｄｎｍ１ａ除去の特徴であること考えられる。あるいは、処置されたＤｎｍ１^＋／＋マウスにおいて観察された成長欠損は、ｍｉＤｎｍ１ａの予測不可能なオフターゲット効果に起因する可能性がある。それにもかかわらず、これらのデータは、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの成長転帰の改善におけるｍｉＤｎｍ１ａの有効性を強化する。

発作の定量化
発作表現型に対するｍｉＤｎｍ１ａの効果を決定するために、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}ホモ接合体を、明らかな発作及び発作関連活動について評価した。子マウスの各同腹子は、体重測定中に約５分間監視された。発作活動は、野性的な走行、ストラウブ尾、その後の顔の毛づくろいを伴う１０秒以上続く垂直ジャンプ、前肢及び後肢の連続的なけいれん、並びに強直間代発作によって特徴付けられた。観察窓内の全ての発作を１つの事象として計数した。評価は、体重検査セッション中のＰＮＤ１４から開始して、隔日で行われた。

処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの両方が発作行動を示したが、処置されたマウスは、ＰＮＤ１４～１８の間に全体的に観察された事象が少なかった（図３Ｄ、表１）。ＰＮＤ１８までに、全ての対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、瀕死であり、直立状態を維持することができなかった。処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１４～２４の間の操作発作を示した（表１）。この期間後、観察された発作及び発作様事象の数及び強度は減少した（図３Ｄ、表１）。これらのデータは、ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスにおける発作及び発作関連活動を減少させたことを示唆する。

発達
子マウスにおける発達マイルストーンは、発達遅延の重要な読み出しである。試験を開始するために、各子マウスを巣から静かに取り出し、清潔なベンチプロテクターの上に配置した。巣の中の動揺を低減するために、ケージの蓋をすぐに穏やかに戻した。全ての評価は、３分以内に熟練の実験者によって完了された。セッションの終わりに、子マウスはすぐに巣に戻された。全ての行動について、両群からのマウス（遺伝子型ｘ処置）を、ＰＮＤ４～１２から毎日操作した。全ての偶数日（ＰＮＤ４～ＰＮＤ１２）に体重測定し、奇数日（ＰＮＤ５～ＰＮＤ１１）に強度及び感覚運動発達を評価した。ＰＮＤ１４～ＰＮＤ３０のマウスを、偶数日、隔日で体重測定した。試験を盲検で実行した。

垂直スクリーンホールド
力を評価するために、マウスを垂直メッシュスクリーン上に置き、スクリーンから落下する潜時を記録した。マウスを３０秒間観察し、課題を完了するための２回の試みを許可した。両方の試験のスコアを平均化した。この課題を実施するためのげっ歯類の平均齢がＰＮＤ８であるため、マウスをＰＮＤ９及びＰＮＤ１１で試験した。

処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス（ｎ＝３０）は、ＰＮＤ１１で対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス（ｎ＝２８）と比較して、握力の改善を示した（ｐ＝０．０００９、図５Ａ）。しかしながら、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ９及びＰＮＤ１１では、処置された（ｎ＝２４）、又は対照が注射された（ｎ＝１９）Ｄｎｍ１^＋／＋（ｐ＞０．０５；図５Ａ）と握力は異ならなかった。

負の走地性
可能性のある感覚運動障害を、負の走地性アッセイを使用して評価した。これは、運動協調のためにマウスの先天的な行動に挑戦して前庭合図を利用する。マウスは、４５°の角度で設定されたメッシュスクリーン上に頭を下に配置される。子マウスが下向きの開始位置から９０°（横向き）及び１８０°（頭上）に回転するための潜時を記録した。マウスに、課題を実施するために３０秒を与え、２回の試みを許可した。両方の試みを分析のために平均化した。

対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスとは異なり、野生型対照と同様に処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１１で９０°及び１８０°回転するのにより短い潜時を示す傾向があったが、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと比較して、より困難な１８０°回転のみが統計的に有意であった（ｐ＝０．０００４、図５Ｂ、Ｃ）。

オープンフィールド
運動失調表現型を定量化するために、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴビデオト追跡ソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して、オープンフィールドでＰＮＤ１４の子マウスを観察した。マウスを、１００ｌｕｘの発光を有する２８．５ｃｍアリーナで試験した。マウスを１０分間記録した。続いて、１０分間の窓にわたる移動中に各マウスがぐらついたり落下したりした回数を計数することによって、ビデオを盲検でスコア化した。１００ｃｍ未満移動したマウスを除外した。加えて、移動距離及び各マウスの速度を定量した。

予想通り、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、多数の運動失調事象（明らかにぐらついた歩行及び落下）を有したが、ｍｉＤｎｍ１ａ処置は、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスで観察されたこの運動失調表現型を完全に廃止した（ｐ＜０．０００１、図５Ｄ）。この時間中に歩行も定量化され、群間の移動距離又は速度のいずれにおいても差異は見られなかった（ｐ＞０．０５、図５Ｅ、Ｆ）。

これらの結果は、ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの発達転帰を改善したことを示す。
要約
処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、生存の延長、成長の改善、致死性発作の減少、発達転帰の改善、及び運動失調の非存在を示した。これらのデータは、発作、成長、及び運動失調を含む最も重度な断続的な行動表現型の抑制又は排除、最終的にそれらの生活の質及びエンドポイントまでの生存の全体的な改善に至る、ｍｉＤｎｍ１ａの有効性をともに示している。

実施例７
組織学
重度の発作及び神経発達障害に対するＤｎｍ１^Ｆｔｆｌ ｍＲＮＡ発現停止の顕著な緩和効果は、治療が根底にある細胞病理に影響を及ぼす程度の調査を促した。グリオーシス及び神経細胞死は、神経損傷及び再発性発作活動の特徴であり、Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌマウスモデルに関する公表された研究において以前に調査されていない特徴である。ここでは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びＦｌｕｏｒｏ－Ｊａｄｅ Ｃ（ＦＪＣ）を使用した免疫標識を介して、グリオーシス及び細胞変性の存在を調査した。

各群から少なくとも３～５匹のマウス（遺伝子型：Ｄｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}及びＤｎｍ１^＋／＋Ｘ処置：ｍｉＤｎｍ１ａ及びｅＧＦＰ）を、ＰＮＤ１８での免疫組織化学的評価のための４％ＰＦＡで灌流した。また、ＰＮＤ３０まで生存するＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ} ｍｉＤｎｍ１ａマウスを、及びＤｎｍ１^＋／＋対照を評価した。全ての動物は、安楽死の前に同じ方法で処理された。脳を頭蓋骨から解剖し、４℃で一晩、４％ＰＦＡ中で固定した。脳を、４℃で一晩、スクロースの勾配濃度（１５％及び３０％）に移した。飽和したら、脳をＯＣＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号４５８５）に埋め込み、凍結した。自由に浮遊する４０μｍ切片を、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ）を使用して収集した。切片を、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎＸで３０分間透過化し、室温で１時間、ＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清（ブロッキング緩衝液）でブロッキングした。薄片を、抗ＮＰＹ（１：５００、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ、Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ カタログ番号２２９４０）、抗ｃ－Ｆｏｓ（１：２５０、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ａｂ１９０２８９）、抗ＧＦＰ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、カタログ番号Ａ１１１２０）、又は抗ＧＦＡＰ（１：７５０、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ｍ４４０３）のいずれかとともに、ブロッキング緩衝液中で、４℃で一晩インキュベーションした。その後、切片をＰＢＳＴで１０分間洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ５５５（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、参照番号Ａ３１４２８及び参照番号Ａ３２７２７）中で、室温で２時間インキュベーションした。切片をＤＡＰＩ中で５分間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄した。切片を最終的にスライド上に取り付け、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ、カタログ番号０１００－０１）でカバースリップをした。

ＦＪＣ標識のために、３～５匹のＰＮＤ１８及びＰＮＤ３０のマウス（遺伝子型ｘ処置）を安楽死させ、それらの脳を解剖し、急速凍結した。２０μｍの厚さの切片をクライオスタットで収集し、ゼラチンコーティングされたスライド（ＦＤ ＮｅｕｒｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ、カタログ番号ＰＯ１０１）上に取り付けた。切片を２％ＰＦＡで後固定し、ＰＢＳで洗浄した。スライドを５０℃の加熱ブロック上で２０～３０分間空気乾燥させ、続いて、１％のＮＡＯＨからなる８０％のエタノール溶液中に５分間置いた。スライドを７０％のエタノールに２分間移動させ、脱イオン水中で２分間すすぎ、脱イオン水中の０．０６％過マンガン酸カリウム中で１０分間インキュベーションし、脱イオン水中で２分間すすぎ、最終的に０．１％酢酸中の０．０００１％ＦＪＣからなるＦＪＣ作業溶液中で１０分間インキュベーションした。最後に、スライドを脱イオン水中で各々２分間３回洗浄し、完全に空気乾燥させ、キシレン中で少なくとも１分間透明にした後、それらを取り付け媒体（ＤＰＸ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号０６５２２）で覆った^３０。スライドを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ－８００共焦点顕微鏡及びＺｅｎ ｖ２．３を使用して画像化した。レーザー及びゲイン設定を一定に保ちながら、各切片について海馬の１０倍の倍率のタイル画像を取得した。ＦＪＣについては、Ａｘｉｏ Ｘ－Ｃｉｔｅシリーズ１２０Ｑ落射蛍光顕微鏡を使用し、１０倍の倍率の画像を取得した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）で画像の後処理を行った。全ての画像処理は一貫性を保った。

ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ、ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用して、ＩＨＣ画像を盲検で定量化した。画像を８ビットに変換し、明るさ及びコントラストを一定に保った。細胞計数器プラグインを使用して、海馬ＣＡ３全体における異常なＮＰＹ及びｃ－Ｆｏｓ陽性細胞を計数し、海馬ＣＡ１におけるＦＪＣ陽性細胞を計数した。ＧＦＡＰ蛍光強度は、ＣＡ１において関心領域（ＲＯＩ）を有する測定ツールを使用して決定した。測定は、面積、最小及び最大灰色値、並びに統合密度を含むように設定した。蛍光強度測定のために、バックグラウンド強度を収集した。相対蛍光は、最初にＣＡ１のＲＯＩの統合強度からバックグラウンドの統合強度を差し引くことによって計算し、バックグラウンド補正強度を得た。面積は、全ての強度測定にわたって一定に保たれた。次いで、野生型対照群の補正強度を平均化した。各補正強度を、野生型対照の補正強度の平均で割って、１００を乗じた。

ＰＮＤ１８では、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウス（ｐ＝０．０１８）と比較して、海馬、特にＣＡ１周辺で強力な原線維性グリオーシス（ＧＦＡＰ）を示し、これはストレス下での海馬を示す（図６Ａ）。対照的に、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、グリオーシスを示さず、それらの海馬は、野生型対照とは異ならなかった（ｐ＞０．０５、図６Ａ、図７Ａ）。ＰＮＤ３０での研究エンドポイントまでに、生存した処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスと比較して、海馬におけるＧＦＡＰ強度の増加を示した（それぞれ、ｐ＝０．００５９及びｐ＝０．００７２、図６Ｂ、図７Ａ）。対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスのＦＪＣ標識により、海馬における顕著な細胞変性が明らかになり、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと比較して、ＣＡ１領域においてよりそうであった（ｐ＝０．０１５、図６Ｃ、図７Ｂ）。この細胞死表現型は、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと差異がなかった処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスにおいて有意に減少した（図６Ｃ）。ＰＮＤ３０エンドポイントまで、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、いくらかの細胞死を示したが、しかしながら、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスと比較して有意に多くはなかった（図６Ｄ、図７Ｂ）。これらの結果は、海馬ニューロンのＤｎｍ１^Ｆｔｆｌに対する感受性を明らかにし^た。加えて、これらの結果は、ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、ＰＮＤ１８及びＰＮＤ３０でのＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの海馬におけるグリオーシス及び細胞変性を成功裏に抑制又は遅延させたことを示した。（図６Ａ～図６Ｄ、図７Ａ～図７Ｂ）。

対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの海馬において観察されたグリオーシス及び細胞変性の増加を考慮して、海馬の関与を、典型的には再発性辺縁発作行動に関連する代謝活性の細胞フットプリントを使用することによって更に調べた。海馬におけるＮＰＹの上方調節は、てんかんのげっ歯類モデルにおける過興奮性を証明する既知の方法であるため、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を調査した。ＰＮＤ１８で、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスと比較して、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの海馬アンモン角領域、具体的にはＣＡ３において異常な細胞ＮＰＹ発現が観察された（ｐ＝０．００１２、図８Ａ、図９Ａ）。しかしながら、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８で、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスと同様のＮＰＹ発現を示した（ｐ＞０．０５、図８Ａ、図９Ａ）。ＰＮＤ３０までに、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスと依然として差異がなかったが、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＣＡ３において、より異常なＮＰＹ^＋細胞を有する傾向にあった（ｐ＞０．０５、図８Ｂ、図９Ａ）。加えて、ニューロン活性の即時早期遺伝子マーカーであるｃ－Ｆｏｓの免疫染色も実施した。海馬におけるｃ－Ｆｏｓ^＋細胞の著しい増加が、特に、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスのＣＡ３において見出された（図８Ｃ、図９Ｂ）。対照的に、この神経活性の増加は、ＰＮＤ１８で、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスにおいて減少し（ｐ＜０．００００１）、ＰＮＤ３０まで持続した（図８Ｃ～図８Ｄ、図９Ｂ）。更に、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８又はＰＮＤ３０で、処置された、及び対照が注射されたＤｎｍ１^＋／＋マウスとは異ならなかった（ｐ＞０．０５、図８Ｃ～図８Ｄ、図９Ｂ）。これらの結果は、ｍｉＤｎｍ１ａ処置がＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスの異常な細胞代謝活性を減少させたことを示唆する。

全体的に、対照が注射されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスとは異なり、処置されたＤｎｍ１^{Ｆｔｆｌ／Ｆｔｆｌ}マウスは、ＰＮＤ１８で、グリオーシス、細胞死、及び異常な神経細胞活性の減少を示し、これは持続し、ＰＮＤ３０エンドポイントまで生存をもたらした。これらの結果はともに、ｍｉＤｎｍ１ａ処置が、Ｄｎｍ１^Ｆｔｆｌ変異に関連する細胞病理を減少させたことを示している。

実施例８
ヒト及びマウスＤＮＭ１エクソン１０ｂを標的とするｍｉＤＮＭ１の設計及びインビトロ試験
ヒトＤＮＭ１又はマウスＤｎｍ１をノックダウンするために、両方の種由来のエクソン１０ｂを特異的かつ効率的に標的とするマイクロＲＮＡを設計した。実施例１に記載の方法によって、ｍｉＤＮＭ１－１０ｂ－７２ ｍｉＲＮＡをｍｉｒ－３０ベースの構築物にクローニングした。完全な相補性でヒト及びマウスのエクソン１０ｂの両方に結合する。全長ｍｉＤｎｍ１ｂ－７２ ｍｉＲＮＡ配列は以下のとおりである。

５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＵＧＧＡＣＡＵＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＧＵＣＣＡＣＡＣＡＣＵＵＧＡＧＡＣＡＣＧＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＡ ３’（配列番号２９）
成熟アンチセンスガイド鎖配列は、配列番号４６に示される（５’から３’へ）。

ｍｉＤＮＭ１－１０ｂ－７２の活性を、実施例１に記載のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してインビトロで試験した。ｍｉＤＮＭ１－１０Ｂ－７２は、非標的化対照（空のＵ６プラスミド、Ｕ６Ｔ６又はｍｉＬａｃＺ）と比較して約９０％のノックダウンを示した（図１０）。

本発明は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更及び修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本発明に課せられるべきである。

本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (26)

1. 核酸であって、
   （ａ）配列番号１～１７のうちのいずれか１つに示されるダイナミン１（ＤＮＭ１）人工阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む核酸、
   （ｂ）配列番号１８～３４のうちのいずれか１つに示される人工阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むＤＮＭ１人工阻害性ＲＮＡをコードする核酸、又は
   （ｃ）配列番号３５～５１のうちのいずれか１つに示されるアンチセンスガイド鎖ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むＤＮＭ１アンチセンスガイド鎖をコードする核酸を含む、核酸。
2. 請求項１に記載の核酸又はそのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ウイルスベクター。
3. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項２に記載のウイルスベクター。
4. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項３に記載のウイルスベクター。
5. 前記ＡＡＶが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項４に記載のウイルスベクター。
6. 前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項４又は５に記載のウイルスベクター。
7. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、又はＡＡＶ ｒｈ．７４のカプシド血清型を有する、請求項４～６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
8. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、請求項４～７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
9. 前記ＡＡＶが、偽型ＡＡＶである、請求項４～８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
10. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９である、請求項９に記載のウイルスベクター。
11. 前記ＤＮＭ１人工阻害性ＲＮＡをコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーターの制御下である、請求項４～１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
12. 請求項１に記載の核酸と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
13. 請求項２～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
14. ニューロンに薬剤を送達することができる送達ビヒクルと、人工阻害性ＲＮＡをコードする核酸であって、前記人工阻害性ＲＮＡが、ダイナミン１（ＤＮＭ１）遺伝子によってコードされたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに結合する、核酸と、任意選択で、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
15. 前記ＤＮＭ１遺伝子が、配列番号５２若しくは５３のヒトエクソン配列、又は配列番号５２若しくは５３の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそれらのバリアントを含む、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記送達ビヒクルが、ウイルスベクターである、請求項１４又は１５に記載の組成物。
17. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記ＡＡＶが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、組換え一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１８又は１９に記載の組成物。
21. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶ ｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記ＡＡＶが、偽型ＡＡＶである、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９である、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記ＤＮＭ１人工阻害性ＲＮＡをコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーターの制御下である、請求項１２～２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. ダイナミン１（ＤＮＭ１）遺伝子を有するニューロンへ送達する方法であって、前記方法が、前記ニューロンを有する対象に、
    （ａ）請求項１に記載の核酸、
    （ｂ）請求項２～１１のいずれか一項に記載のベクター、又は
    （ｃ）請求項１２～２５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。