JP2022516515A - Rna標的化crispr-cas13bを使用するdux4 rna発現停止 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表(ファイル名:2019年12月30日に作成された53307A_Seqlisting.txt、34,420バイト、ASCIIテキストファイル)を含み、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
DUX4標的化Cas13b-gRNAの設計および試験
DUX4標的化Cas13b-gRNAの設計
DUX4標的化Cas13b-gRNAを設計した。Prevotella sp.P5-125(PspCas13b)由来のCas13b酵素および関連するgRNAをこの研究で使用した。DUX4特異的gRNAを設計するために、mi405、mi406、およびmi1155などのリードマイクロRNA(miRNA)miDUX4コンストラクトと位置が一致するように標的化配列を選択した。米国特許第9,469,851号を参照されたい。PspCas13b gRNAの構造およびそれらの標的部位を図1に示す。ヒトU6プロモーターを含むgRNA配列は、Integrated DNA Technologies(IDT)(Skokie,IL)によって合成された。ヒトコドン最適化PspCas13b(pc0046)を発現するプラスミドは、Addgene(Cambridge,MA)から購入した。
HEK293細胞(250,000細胞/ウェル)をトランスフェクションの16時間前に24ウェルプレートに播種した。翌朝、Lipofectamine 2000(Thermofisher,US)を使用して、900ngのPspCas13bおよび1800ngのgRNAプラスミドを細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの8~10時間後に培地を交換し、180ngのDUX4プラスミドを細胞に再トランスフェクトした。トランスフェクションの20時間後、プロテアーゼ阻害剤を含むカクテルを補充したRIPA緩衝液(50mM Tris、150mM NaCl、0.1%SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1%TritonX100)に細胞を溶解した。タンパク質濃度を、DCタンパク質アッセイキット(Bio-Rad Laboratories)によって決定した。20μgの各総タンパク質試料を12%SDS-ポリアクリルアミドゲルで実行した。GE Healthcare Rainbow Molecular Weight Marker(Fisherscientific,USA)を使用して、タンパク質バンドの分子量を決定した。タンパク質を、半乾燥転写法により、SDS-PAGEゲルからPVDF膜に転写した。膜を5%脱脂乳で遮断し、次いで、一次モノクローナルマウス抗DUX4(1:500;P4H2、Novus Biologicals)またはウサギポリクローナル抗αチューブリン抗体(1:1,000;ab15246、Abcam,Cambridge,MA)と共に4℃で一晩インキュベートした。洗浄後の翌日、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ二次抗体(1:100,000;Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)で、室温で1時間プローブした。Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore,Billerica,MA)での短時間のインキュベーション後、X線フィルム上に相対的タンパク質バンドが発生した。
lipofectamine 2000を使用して、HEK293細胞(50,000細胞/ウェル)に、DUX4、Cas13b、およびgRNA発現プラスミドを同時トランスフェクトし、96ウェルプレートにプレーティングした。蛍光プレートリーダー(Spectra max M2,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を使用して、トランスフェクションの48時間後に、細胞死を、Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7 Assay(Promega,Madison,WI)を使用して測定した。個々のアッセイは3つ組で実施され(n=3)、データは、DUX4のみをトランスフェクトした対照に対する平均カスパーゼ活性として報告された。結果を図2Bに示す。
lipofectamine 2000を使用して、HEK293細胞(250,000細胞/ウェル)に、DUX4、Cas13b、およびgRNA発現プラスミドを同時トランスフェクトし、24ウェルプレートにプレーティングした。5%CO2で、37℃で48時間インキュベートした後、細胞をトリプシン処理し、1mlの増殖培地に回収した。自動細胞計数は、Countess(登録商標)Cell Counting Chamber Slides(Thermofisher,US)を使用して実施した。次いで、血球計数器およびトリパンブルー染色を使用した従来の細胞計数で結果を確認した。データは、実験ごとの平均総細胞数として報告された。エラーバーはSDを示す。結果を図2Cに示す。
Lonza Nucleofector Kit(Lonza,VVPD-1001)を使用して、Cas13bおよびgRNAプラスミド(それぞれ3および6μg)を、FSHD筋芽細胞に同時トランスフェクトした[15A細胞(Jones et al.,Human Molecular Genetics 21(20):4419-30,2012);500,000 cells/reaction]。次いで、FSHD筋芽細胞を、筋芽細胞成長培地を含む24ウェルプレートの2つのウェルのガラスカバースリップ上で培養した。24時間後、成長培地を分化培地に交換し、細胞を7日間筋管に分化させた。筋管を、室温で30分間、4%PFA(Fisher Scientific,USA)に固定した。次いで、室温でそれぞれ5分間、50%、70%、および100%のエチルアルコール勾配で脱水した。製造業者のプロトコルに従って、RNAscope 2.5 HD Assay Brown(Advanced Cell Diagnostics)を使用して、設計されたDUX4プローブで細胞を染色した。Olympus DP71顕微鏡で、画像を撮影した。
Cas13bおよびgRNAプラスミド(それぞれ3および6μg)を、Lonza Nucleofector Kit(Lonza,VVPD-1001)を使用してFSHD筋芽細胞(15A、500,000細胞/反応)に同時トランスフェクトし、次いで、12ウェルプレートで培養した。24時間後、成長培地を廃棄し、筋芽細胞を筋管に分化させることを目的とした細胞に新しい分化培地を加えた。細胞を7~9日間分化させた。全RNAは、製造業者のプロトコルに従って、Trizol(Fisher,Waltham,MA)を使用して抽出した。単離されたRNAの質および量は、NanoDrop(商標)(ThermoFisher Scientific)で調べた。次いで、単離されたRNAをDNase処理し(DNA-Free,Ambion,TX)、ランダムヘキサマー(Applied Biosystems cDNA Archive Kit;Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用するRT-PCRに使用した。その後のcDNA試料は、次いで、事前に設計されたPRAMEF12(DUX4活性のバイオマーカー)およびヒトRPL13A対照プライマー/プローブセット(Applied Biosystems)を使用するTaqman Assayのテンプレートとして使用された。各試料は2つ組で行われた。全てのデータは、Cas13b発現試料に対して正規化された。
DUX4-mRNA標的化gRNA
細菌性免疫系であるCRISPR-Cas系は、哺乳類細胞のゲノムまたはRNA編集に使用されている。この研究の目的は、CRISPR-Cas13アプローチを標的とするDUX4遺伝子発現停止RNAを使用して、FSHDなどの筋ジストロフィーの前向き治療法を開発することであった。これを行うために、ヒトDUX4 mRNAを標的とする11の異なるCas13b gRNA(図1)が操作された。各gRNA配列をU6プロモーター駆動型発現カセットにクローン化し、インビトロスクリーニングアッセイを実施して、リードDUX4標的化gRNAを特定した。
DUX4-mRNA標的化gRNAの選択
本明細書に開示されるdUX4-mRNA標的化gRNA配列は、DUX4タンパク質およびその毒性を減少させるそれらの能力のために選択された。
RNAscopeインサイツハイブリダイゼーションは、処理されたFSHD筋管におけるDUX4 mRNA量の有意な減少を示した。
RNAレベルでのDUX4発現停止を調査するために、特別に設計されたDUX4標的化プローブを使用して、筋管に分化した処理されたFSHD筋芽細胞およびRNAscopeインサイツハイブリダイゼーションを行った。
処理された細胞におけるPRAMEF12バイオマーカー発現レベルの減少は、DUX4活性の低下を示す
Cas13bを用いたDUX4を標的とするgRNAの導入によってもたらされるDUX4標的の遺伝子発現の減少を決定するために、PRAMEF12特異的プローブおよびプライマーを使用して、定量的RT-PCRを行って、DUX4-mRNA標的化gRNA-Cas13b配列で処理したFSHD筋管におけるPRAMEF12発現(すなわち、DUX4活性を示すバイオマーカー)を測定した。FSHDに罹患したヒト筋芽細胞(15A)に、Cas13bおよびgRNAを発現するプラスミドを同時トランスフェクトし、その後、7日間超筋管に分化させた。全RNAを、製造行業者のプロトコルに従ってTrizol(Ambion)により単離した。相補的DNA(cDNA)は、ゲノムDNAを排除した後、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を使用して生成された。定量的PCR(qPCR)反応は、TaqMan Gene Expression Master Mixプロトコル(Thermo-Fisher Scientific)を使用して行った。次のプログラムをqPCR分析に使用した:95℃で10分間の1サイクルの変性、60℃で1分間の後に95℃で15秒間の39サイクル、40℃での1サイクルの冷却。Human Ribosomal Protein L13A(RPL13A)を参照遺伝子として使用した。データを、相対的な遺伝子発現を計算するために、Delta-Delta-CT(2-ΔΔCT)アルゴリズムにより分析した。PRAMEF12の発現は、陰性対照としてCas13bトランスフェクトされた筋管のみに正規化された。
有効投薬量の決定
Cas13bおよびgRNAの用量漸増実験を行って、DUX4ノックダウンの有効用量範囲を定義する。本明細書に記載のCRISPR-Cas13法を使用してDUX4遺伝子発現停止の効率を高めるために、各リードgRNAの組み合わせを同じプラスミド骨格にクローン化し、DUX4の発現、およびZSCAN4、PRAMEF12、PRAMEF2、MBD3L2、KHDC1L、TRIM43、LEUTXなどの様々なDUX4バイオマーカーの発現を調べることによって、FSHD患者の筋芽細胞株におけるDUX4の発現を阻害するそれらの能力について試験した。このようなFSHD筋芽細胞株には、例えば、Wellstone17A、12A、18Aなどが含まれるが、これらに限定されない(Jones et al.,Human Mol.Genetics 21(20):4419-30,2012)。DUX4発現およびDUX4バイオマーカー発現レベルを、qRT-PCRおよび/またはRNAscopeインサイツハイブリダイゼーションにより分析する。
Cas13bおよびgRNAのパッケージング
本明細書に記載のCas13bおよび様々なgRNAは、インビボでのDUX4発現停止の有効性を試験するためにAAVベクターにパッケージングされる。いくつかの態様では、Cas13bおよびgRNAは2つの異なるAAVベクターにパッケージングされる。PspCas13b遺伝子は、3270ヌクレオチド配列であり、Prevotella sp.P5-125(PspCas13b)とも呼ばれる(Cox et al.,RNA Editing with CRISPR-Cas13,Science.24;358(6366):1019-1027,2017)。この配列を含むプラスミドは、Addgeneから購入し(カタログ番号:103862、プラスミド名:pC0046-EF1a-PspCas13b-NES-HIV)、一本鎖(ss)AAVベクターにパッケージングするのに十分なサイズである。様々な態様では、Cas13b遺伝子発現カセットは、ミニCMVプロモーターなどの短くて弱いプロモーター、またはコンパクトunc45bなどの骨格筋特異的プロモーター、およびCK6もしくはtMCKなどの最小MCKプロモーターを使用して構築される。いくつかの態様では、本明細書に記載のCas13b配列の最初に存在するコザック配列、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)、HIV核外輸送シグナル(NES)、およびSV40polyAシグナルなどの調節配列が、翻訳の効率およびmRNAの安定性を高めるカセットに加えられる。例えば、コザック、WPRE、およびHIV NES配列は、Cas13bプラスミド(Addgene(PC0046)、配列番号36を参照されたい)に存在する。
DUX4マウスモデルでの試験
AAVベクターにパッケージングされたCas13bおよび様々なgRNAは、様々なマウスモデル、例えば、最近公開されたTIC-DUX4マウスモデル(Giesige et al.,JCI Insight,3(22):e123538,2018)および/または以前に公開されたiDUX4pAマウスモデル(Bosnakovski et al.,Nature Commun.8(1):550,2017)において、インビボでのDUX4発現停止における有効性について試験される。筋肉内注射(IM)または血管内注射は、AAVベクターをマウスに送達するために使用される。DUX4の発現は、強制経口投与を介したタモキシフェン(TIC-DUX4)またはドキシサイクリン(iDUX4pA)投与によって活性化される。治療されたマウスの筋肉組織学、分子分析、身体活動、および生理学的分析は、記載されるように実施される(Giesigeら、上記)。
DUX4マウスモデルでの試験
Cas13bおよびgRNAベクターの安全性、毒性学、および有効性を決定するために、gRNA、Cas13酵素、およびそれらの組み合わせを発現するAAVベクターの用量漸増実験を行う。
Cas13bおよびgRNAプラスミドのトランスフェクション後に減少したFSHD筋管におけるDUX4活性
本明細書に開示されるDUX4-mRNA標的化gRNA配列がDUX4タンパク質活性を減少させることができるかどうかを決定するために、500,000のFSHD筋芽細胞(15A)に3μgのCas13bおよび6μgのgRNAプラスミドを電気穿孔した。次いで、分化培地を加えた後、細胞を7日間筋管に分化させた。製造業者のプロトコルに従って、TRIZOL(登録商標)方法を使用して全RNAを単離し、3つのDUX4活性バイオマーカー、すなわち、TRIM43、MBD3L2、およびPRAMEF12に対してqRT-PCRを行った。
Cas13bおよびgRNAプラスミド(それぞれ3および6μg)を、Lonza Nucleofector Kit(Lonza,VVPD-1001)を使用してFSHD筋芽細胞(15A、500,000細胞/反応)に同時トランスフェクトし、次いで、12ウェルプレートで培養した。24時間後、成長培地を廃棄し、筋芽細胞を筋管に分化させることを目的とした細胞に新しい分化培地を加えた。細胞を7~9日間分化させた。全RNAは、製造業者のプロトコルに従って、Trizol(Fisher,Waltham,MA)を使用して抽出した。単離されたRNAの質および量をNanodropにより調べ、次いで、DNase処理し(DNA-Free,Ambion,TX)、ランダムヘキサマー(Applied Biosystems cDNA Archive Kit;Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用するRT-PCRに使用した。その後のcDNA試料は、次いで、事前に設計されたTRIM43、MBD3L2、およびPRAMEF12(DUX4活性のバイオマーカー)およびヒトRPL13A対照プライマー/プローブセット(Applied Biosystems)を使用するTaqman Assayのテンプレートとして使用された。各試料を3つ組で行い、実験を3回繰り返した。全てのデータは、Cas13b発現試料に対して正規化された。
追加のDUX4-mRNA標的化gRNAの選択
追加のDUX4-mRNA標的化gRNA配列(すなわち、gRNA 13~16)は、DUX4タンパク質およびその毒性を減少させるそれらの能力のために設計および選択された。
Cas13bおよびgRNAによって発現停止されたDUX4-mRNAの発現
DUX4を発現停止する各gRNAの能力は、ルシフェラーゼアッセイおよびインビトロ蛍光アッセイを使用して調査された。
二重ルシフェラーゼレポータープラスミドは、トランスフェクション対照として機能するホタルルシフェラーゼカセット、および3’UTRとして機能するRenillaルシフェラーゼ停止コドンの下流にクローン化されたヒトDUX4遺伝子(コード領域とイントロンを含む3’UTR)を用いてPsicheck2(Promega)から変更された(Wallace et al.,2018,Pre-clinical Safety and Off-Target Studies to Support Translation of AAV-Mediated RNAi Therapy for FSHD,Mol Ther Methods Clin Dev.)。HEK293細胞に、ルシフェラーゼDUX4レポーター、Cas13b、および個々のU6.gRNA発現プラスミドを1:6:28のモル比で同時トランスフェクト(Lipofectamine 2000;Invitrogen)した。DUX4遺伝子発現停止は以前に記載されたように決定された(Wallace et al.,RNA interference inhibits DUX4-induced muscle toxicity in vivo: implications for a targeted FSHD therapy.Mol.Ther.2012;20:1417-1423.)3つ組のデータを実験ごとに平均し、個々の実験を3回実施した。結果は、全ての組み合わせ実験について、ホタルルシフェラーゼ活性に対するRenillaの平均比±SDとして報告された。
HEK293細胞に、3’UTRとしてmCherry停止コドンの下流にクローン化されたヒトDUX4遺伝子(コード領域およびイントロンを含む3’UTRを)を含むプラスミド、ならびにCas13bおよびgRNA発現プラスミド(gRNA1およびgRNA2)を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞の写真を撮影した。
新生仔TIC-DUX4マウスモデルでの試験
TIC-DUX4マウスは、タモキシフェンによって誘発され、軽度で進行性の筋病理を発症させる可能性がある。したがって、TIC-DUX4マウスは、筋病理を発症させ、Cas13および本開示のgRNAの投与が筋病理に及ぼす作用を測定するために1mg/kgのタモキシフェンを週に3回受けた。マウスを治療し、Cas13およびgRNA1で治療した後、異なる時間に屠殺した。
DUX4毒性の低減およびアポトーシスからの細胞の保護
次いで、各gRNAを、カスパーゼ3/7アッセイを介してトランスフェクトされた細胞においてDUX4誘導アポトーシスを低減するその能力について試験した。
DUX4の毒性を低減し、細胞をアポトーシスから保護するgRNAの能力を調査するために、カスパーゼ3/7アッセイを行った。lipofectamine 2000を使用して、HEK293細胞(50,000細胞/ウェル)に、30ngのDUX4プラスミド、80ngのCas13bプラスミド、および350ngの各gRNA発現プラスミドを同時トランスフェクトし、96ウェルプレートにプレーティングした。蛍光プレートリーダー(Spectra max M2,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を使用して、トランスフェクションの48時間後に、細胞死を、Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7 Assay(Promega,Madison,WI)を使用して測定した。3つの個々のアッセイは3つ組で実施し(n=3)、データは、DUX4のみをトランスフェクトした対照に対する平均カスパーゼ活性として報告された。
インビボでのマウス筋肉におけるDUX4の発現の阻害
筋肉においてDUX4を標的とするAAV.CRISPR-Cas13療法の能力を調査するために、成体マウスに、DUX4(1E9)、ssAAV6-Cas13b(2.5 E10)、およびscAAV6-gRNA1(5E10)、またはDUX4のみ(1E9)をTA筋肉に同時注射した。
Claims (43)
- 配列番号3~13および51~54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス4(DUX4)コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、核酸。
- 配列番号14~24および55~58のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むDUX4をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするダブルホメオボックス4(DUX4)コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、核酸。
- Cas13b直接反復配列をさらに含む、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記Cas13b直接反復が、前記DUX4コード化gRNAをコードする前記核酸の下流または3’末端に位置する、請求項3に記載の核酸。
- 前記Cas13b直接反復配列が、配列番号37に記載のヌクレオチド配列、または配列番号37に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項3または4に記載の核酸。
- 配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、または配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項5に記載の核酸。
- プロモーター配列をさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、U6、U7、tRNA、H1、最小CMV、T7、EF1-アルファ、最小EF1-アルファ、または骨格筋特異的プロモーターのいずれかである、請求項7に記載の核酸。
- 前記筋特異的プロモーターが、unc45b、tMCK、最小MCK、CK6、CK7、MHCK7、またはCK1である、請求項8に記載の核酸。
- 配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、または配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項8に記載の核酸。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の核酸を含む、アデノ随伴ウイルス。
- 前記ウイルスが、repおよびcap遺伝子を欠損している、請求項11に記載のアデノ随伴ウイルス。
- 前記ウイルスが、組換えAAV(rAAV)または自己相補的組換えAAV(scAAV)である、請求項11または12に記載のアデノ随伴ウイルス。
- 前記ウイルスが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-anc80、またはAAV rh.74である、請求項11~13のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
- 前記ウイルスが、AAV-9である、請求項11~14のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
- 請求項11~15のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 細胞におけるダブルホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害および/または妨害する方法であって、前記細胞を、
(a)請求項11~15のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項16に記載の組成物、および
(b)Cas13タンパク質、またはそのCas13オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることを含む、方法。 - 前記Cas13タンパク質が、Cas13bまたはそのCas13bオルソログもしくはバリアントである、請求項18に記載の方法。
- 前記Cas13bタンパク質が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列、または配列番号36に記載の配列と少なくとも約80%の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞を、DUX4阻害性RNAをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む、請求項17~19のいずれか一項に記載の方法。
- DUX4阻害性RNAをコードする前記核酸の発現が、U6プロモーター、U7プロモーター、T7プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、最小EF1-アルファプロモーター、miniCMVプロモーター、CMVプロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、アルファ-ミオシン重鎖エンハンサー-/MCKエンハンサー-プロモーター(MHCK7)、またはデスミンプロモーターの制御下にある、請求項20に記載の方法。
- 筋ジストロフィーを患っている対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
(a)請求項11~15のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項16に記載の組成物、および
(b)Cas13タンパク質、またはCas13オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスを投与することを含む、方法。 - 前記Cas13タンパク質が、Cas13bまたはそのCas13bオルソログもしくはバリアントである、請求項22に記載の方法。
- 前記Cas13bタンパク質が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列、または配列番号36に記載の配列と少なくとも約80%の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞を、DUX4阻害性RNAをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む、請求項22~24のいずれか一項に記載の方法。
- DUX4阻害性RNAをコードする前記核酸の発現が、U6プロモーター、U7プロモーター、T7プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、最小EF1-アルファプロモーター、miniCMVプロモーター、CMVプロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、アルファ-ミオシン重鎖エンハンサー-/MCKエンハンサー-プロモーター(MHCK7)、またはデスミンプロモーターの制御下にある、請求項25に記載の方法。
- 治療を必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法であって、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することを含み、前記アデノ随伴ウイルスのゲノムが、
(a)配列番号3~13および51~54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス4(DUX4)コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、少なくとも1つの核酸、
(b)配列番号14~24および55~58のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むDUX4をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするDUX4コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、少なくとも1つの核酸、
(c)配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも1つの核酸、
(d)配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも1つの核酸、または
(e)その(a)~(d)のいずれかの組み合わせ、を含む、方法。 - Cas13タンパク質、またはCas13オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記Cas13タンパク質が、Cas13bまたはそのCas13bオルソログもしくはバリアントである、請求項28に記載の方法。
- 前記Cas13bタンパク質が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列、または配列番号36に記載の配列と少なくとも約80%の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項28または29に記載の方法。
- DUX4阻害性RNAをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項27~30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)である、請求項22~31のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え遺伝子編集複合体であって、
(a)Cas13またはCas13オルソログもしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの核酸、および
(b)ダブルホメオボックス4(DUX4)をコードする標的核酸配列およびCas13b直接反復配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの核酸を含み、
前記複合体が前記標的核酸配列に結合することによって、DUX4遺伝子発現が阻害される、組換え遺伝子編集複合体。 - 前記gRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および前記Cas13b直接反復配列を含む前記核酸が、
(a)配列番号3~13および51~54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス4(DUX4)コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、少なくとも1つの核酸、
(b)配列番号14~24および55~58のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むDUX4をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするDUX4コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、少なくとも1つの核酸、
(c)配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも1つの核酸、
(d)配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも1つの核酸、または
(e)その(a)~(d)のいずれかの組み合わせ、を含む、請求項33に記載の組換え遺伝子編集複合体。 - 前記Cas13タンパク質が、Cas13bまたはそのCas13bオルソログもしくはバリアントである、請求項33または34に記載の組換え遺伝子編集複合体。
- 前記Cas13bタンパク質が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列、または配列番号36に記載の配列と少なくとも約80%の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項35に記載の組換え遺伝子編集複合体。
- DUX4阻害性RNAをコードする核酸をさらに含む、請求項33~36のいずれか一項に記載の組換え遺伝子編集複合体。
- 治療を必要とする対象における癌を治療する方法であって、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することを含み、前記アデノ随伴ウイルスのゲノムが、
(a)配列番号3~13および51~54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス4(DUX4)コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、少なくとも1つの核酸、
(b)配列番号14~24および55~58のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むDUX4をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするDUX4コード化ガイドRNA(gRNA)をコードする、少なくとも1つの核酸、
(c)配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号25~35および59~62のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも1つの核酸、
(d)配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号38~48および63~66のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90%の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも1つの核酸、または
(e)その(a)~(d)のいずれかの組み合わせ、を含む、方法。 - Cas13タンパク質、またはCas13オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記Cas13タンパク質が、Cas13bまたはそのCas13bオルソログもしくはバリアントである、請求項39に記載の方法。
- 前記Cas13bタンパク質が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列、または配列番号36に記載の配列と少なくとも約80%の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項39または40に記載の方法。
- DUX4阻害性RNAをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項38~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、ラブドイド癌(またはラブドイド肉腫)、肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺腫、黒色腫、または転移性黒色腫である、請求項38~42のいずれか一項に記載の方法。
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