JP2022516515A - Ｒｎａ標的化ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ１３ｂを使用するｄｕｘ４ ｒｎａ発現停止 - Google Patents

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Abstract

ヒト染色体４ｑ３５上のダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの製品および方法が開示される。本開示には、ＲＮＡのＣａｓｌ３タンパク質発現停止が含まれ、Ｃａｓｌ３は、配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、目的のＤＵＸ４領域を特異的に標的とする。本開示の組換えアデノ随伴ウイルスは、ＤＵＸ４の発現をノックダウンするためにＣａｓｌ３直接反復で構築される阻害性ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。方法は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含むがこれに限定されない筋ジストロフィー、および癌を含むＤＵＸ４発現の上昇に関連する他の障害の治療に適用される。【選択図】なし

Description

本開示は、ヒト染色体４ｑ３５上のダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を発現停止または阻害するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３製品および方法に関する。本開示は、組換え遺伝子編集タンパク質、すなわち、Ｃａｓ１３、およびＤＵＸ４遺伝子の領域をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む組換え遺伝子編集複合体を提供し、複合体が標的核酸配列に結合することによって、ＤＵＸ４遺伝子発現が阻害される。本開示の組換えアデノ随伴ウイルスは、ＤＵＸ４の発現をノックダウンするようなｇＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。方法は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含むがこれに限定されない筋ジストロフィー、および癌などのＤＵＸ４阻害が示される他の障害の治療に適用される。
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０１９年１２月３０日に作成された５３３０７Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、３４，４２０バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期または小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝形式の点で異なる。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、ゆっくりと進行する衰弱を特徴とする遺伝性変性筋疾患であり、顔面、肩甲骨、および上腕の筋肉が最も影響を受ける。最初はＬａｎｄｏｕｚｙ－Ｄｅｊｅｒｉｎｅと名付けられたＦＳＨＤは、通常常染色体優性であり、はじめに顔面（顔面（ｆａｃｉｏ））、肩甲骨（ｓｃａｐｕｌａ）（肩甲骨（ｓｃａｐｕｌａ）または肩甲骨）、および上腕（上腕骨）の骨格筋に影響を与える遺伝性の筋ジストロフィー（ＭＤ）である。ＦＳＨＤは、３番目に多い骨格筋の遺伝性疾患であり、人口の１０万人に約４～１２人に存在する。歴史的に、ＦＳＨＤは３番目に多いＭＤとして分類され、世界中の２万人に１人が罹患している。しかしながら、最近のデータは、ＦＳＨＤがヨーロッパで最も多いＭＤであることを示しており、その世界的な発生率が過小評価されている可能性があることを示唆している。
症状は、幼児期に発達する可能性があり、通常は１０代で顕著になり、罹患した個人の９５％が２０歳までに疾患を発症する。進行性の骨格筋の衰弱は、通常、体の他の領域でも発症し、非対称であることが多い。平均余命は呼吸不全によって脅かされる可能性があり、罹患した個人の最大２０％が重度の障害になり、車椅子または電動カートの使用が必要となる。現在、この重度の障害に利用可能な治療的処置はなく、患者には症状管理の選択しか残されていない。
ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２と呼ばれる２つの臨床的に区別できないＦＳＨＤの形態がある。症例の大部分（約９５％）は、ＦＳＨＤ１として分類され、残りは、ＦＳＨＤ２として分類されるか、または典型的なＦＳＨＤの症状を示すが、まだ遺伝的に特徴付けられていない。簡単に言えば、両方のＦＳＨＤの形態は、毒性のＤＵＸ４遺伝子の抑制解除によって引き起こされる。ＤＵＸ４オープンリーディングフレームは、ヒト染色体４ｑサブテロメアに位置するＤ４Ｚ４反復内にコードされている。ヒトは、両方の４ｑ対立遺伝子でＤ４Ｚ４反復のコピー数が異なる場合がある。数が１０を超えるＤ４Ｚ４アレイは、典型的には、ヘテロクロマチンに包埋されているため、各反復に位置するＤＵＸ４遺伝子が抑制される。
ＦＳＨＤ１は、１つの対立遺伝子でのＤ４Ｚ４反復数（１～１０のＤ４Ｚ４コピー）の先天的低下によって引き起こされ、これにより、この領域のエピジェネティックな発現停止が中断される。ＦＳＨＤ２は、クロマチン修飾遺伝子（ＳＭＣＨＤ１、ＤＮＭＴ３Ｂ）の変異に起因し、Ｄ４Ｚ４反復のエピジェネティックな抑制解除にもつながる。どちらの場合も、ＤＵＸ４遺伝子は、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡに転写され得る。しかしながら、個々の反復はＤＵＸ４転写産物を安定化するためのポリＡシグナルを欠くため、ＤＵＸ４のエピジェネティックな発現停止の低下は、ＦＳＨＤを引き起こすのに十分ではない。ＦＳＨＤを引き起こすには、最後の反復に隣接して位置するｐＬＡＭ領域を含む４ｑＡと呼ばれる特定の染色体バックグラウンドの遺伝が必要である。ｐＬＡＭ領域は、ポリＡシグナルを最後のＤＵＸ４コピーに寄与する。したがって、ＤＵＸ４転写が４ｑＡハプロタイプで生じた場合、テロメアの最も近くに位置する完全長ＤＵＸ４転写産物が安定化され、筋肉に毒性であるＤＵＸ４タンパク質に翻訳される。当該技術分野では、ＦＳＨＤを含むこのような筋ジストロフィーのための治療、ならびに治療のための製品および方法の必要性が残っている。同様に、ＤＵＸ４は様々な癌に関係しているため、当該技術分野において、ＤＵＸ４の阻害が治療的である、ＤＵＸ４の発現に関連する癌の治療の必要性が残っている。
ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）の発現または過剰発現によって悪影響を受ける筋ジストロフィーを治療するための製品および方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、筋ジストロフィーはＦＳＨＤである。
本開示は、Ｃａｓ１３の補助によりＤＵＸ４の発現を阻害するように設計される核酸を含む、核酸、組成物、およびウイルスベクター、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害および／または妨害するためのこれらの製品を使用するための方法、筋ジストロフィーを患っている対象を治療するための方法、ならびにＣａｓ１３またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を含む組換え遺伝子編集複合体；ならびにＤＵＸ４およびＣａｓ１３ｂ定方向反復配列をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を提供し、複合体が標的核酸配列に結合することによって、ＤＵＸ４遺伝子発現が阻害をされる。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸を提供する。
いくつかの態様では、核酸は、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復配列をさらに含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復は、ＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸の下流または３’末端に位置する。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復配列は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３７に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、または配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む核酸を提供する。
いくつかの態様では、本開示の核酸は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、または骨格筋特異的プロモーターのいずれかである。いくつかの態様では、筋特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＭＨＣＫ７、またはＣＫ１である。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、または配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む核酸を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本開示において提供される任意の１つ以上の核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様では、ＡＡＶは、同じ核酸の複数のコピーを含む。例えば、いくつかの態様では、ＡＡＶは、同じｇＲＮＡの複数のコピーを含む。いくつかの態様では、ＡＡＶは、異なる核酸の複数のコピーを含む。例えば、いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｇＲＮＡの組み合わせの複数のコピーを含む。いくつかの態様では、ウイルスは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの態様では、ウイルスは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの態様では、アデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、アデノ随伴ウイルスは、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ－９である。
本開示はまた、組成物中に本開示の核酸のうちの任意の１つまたは複数、および本開示のＡＡＶのうちの任意の１つまたは複数を提供する。いくつかの態様では、組成物はまた、希釈剤、賦形剤、および／または許容される担体を含む。いくつかの態様では、担体は、薬学的に許容される担体または生理学的に許容される担体である。
いくつかの態様では、本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害および／または妨害する方法を提供し、これには、細胞を、アデノ随伴ウイルス、あるいは配列番号３～１３および５１～５４、２５～３５および５９～６２、ならびに３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む核酸のいずれか、ならびに／または配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸、およびＣａｓ１３タンパク質またはそのＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスを含む組成物と接触させることが含まれる。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するそのバリアントによってコードされる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある。
いくつかの態様では、本開示は、筋ジストロフィーを患っている対象を治療する方法を提供し、これには、有効量のアデノ随伴ウイルス、あるいは配列番号３～１３および５１～５４、２５～３５および５９～６２、ならびに３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む核酸のいずれか、ならびに／または配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸、およびＣａｓ１３タンパク質またはそのＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスを含む組成物を対象に投与することが含まれる。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するそのバリアントによってコードされる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある。さまざまな態様では、筋ジストロフィーはＦＳＨＤである。
いくつかの態様では、本開示は、治療を必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法を提供し、これには、有効量のアデノ随伴ウイルスを対象に投与することが含まれ、アデノ随伴ウイルスのゲノムは、（ａ）配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、（ｂ）配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、（ｄ）配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、または（ｅ）その（ａ）～（ｄ）のいずれかの組み合わせを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質、またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するそのバリアントによってコードされる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある。さまざまな態様では、筋ジストロフィーはＦＳＨＤである。
いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４の発現または上昇したＤＵＸ４の発現レベルに関連する癌を患っている対象を治療する方法を提供し、これには、有効量のアデノ随伴ウイルス、あるいは配列番号３～１３および５１～５４、２５～３５および５９～６２、ならびに３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む核酸のいずれか、ならびに／または配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸、およびＣａｓ１３タンパク質またはそのＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスを含む組成物を対象に投与することが含まれる。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するそのバリアントによってコードされる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある。いくつかの態様では、癌は、ＤＵＸ４＋癌である。様々な態様では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、ラブドイド癌（またはラブドイド肉腫）、肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺腫、黒色腫、または転移性黒色腫である。
いくつかの態様では、本開示は、治療を必要とする対象におけるＤＵＸ４の発現または上昇したＤＵＸ４の発現レベルに関連する癌を治療する方法を提供し、これには、有効量のアデノ随伴ウイルスを対象に投与することが含まれ、アデノ随伴ウイルスのゲノムは、（ａ）配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、（ｂ）配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、（ｄ）配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、または（ｅ）その（ａ）～（ｄ）のいずれかの組み合わせを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質、またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するそのバリアントによってコードされる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある。いくつかの態様では、癌は、ＤＵＸ４＋癌である。様々な態様では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、ラブドイド癌（またはラブドイド肉腫）、肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺腫、黒色腫、または転移性黒色腫である。
いくつかの態様では、本開示は、Ｃａｓ１３またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸、ならびにＤＵＸ４およびＣａｓ１３ｂ定方向反復配列をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を含む組換え遺伝子編集複合体を提供し、複合体が標的核酸配列に結合することによって、ＤＵＸ４遺伝子発現が阻害される。いくつかの態様では、核酸は、（ａ）配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４ＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする、少なくとも１つの核酸、（ｂ）配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする、少なくとも１つの核酸、（ｃ）配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、または（ｅ）その（ａ）～（ｄ）のいずれかの組み合わせを含む、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１３ｂ定方向反復配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、組換え遺伝子編集複合体は、Ｃａｓ１３タンパク質、またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスをさらに含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するそのバリアントによってコードされる。いくつかの態様では、組換え遺伝子編集複合体は、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスをさらに含む。いくつかの態様では、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある。様々な態様では、組換え遺伝子編集複合体は、筋ジストロフィーの治療において、または筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造において使用される。いくつかの態様では、組換え遺伝子編集複合体は、ＦＳＨＤの治療において、またはＦＳＨＤの治療のための薬剤の製造において使用される。
いくつかの態様では、本開示は、細胞におけるＤＵＸ４発現および／もしくはＤＵＸ４過剰発現を減少させるための、ならびに／または筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造のための、本明細書に記載の核酸および組換え遺伝子編集複合体の使用を提供する。いくつかの態様では、筋ジストロフィーはＦＳＨＤである。
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本開示の好ましい実施形態を示すが、本開示の趣旨および範囲内である様々な変更および修正はこの詳細な説明から当業者には明らかになるため、単に例示としてのみ与えられることを理解されたい。
図１Ａ～Ｂは、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ上の各Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡの標的化部位を示す。灰色のボックスは、ＤＵＸ４エクソン１、エクソン２、およびエクソン３を示す。イントロン１、エクソン２、イントロン２、およびエクソン３は、ＤＵＸ４の３’ＵＴＲとして機能する。ＤＵＸ４標的化ｍｉＲＮＡリードは矢印で示される。ｍｉＲＮＡの位置が一致するｇＲＮＡは線で示される。ガイドＲＮＡ１～１１を図１Ａに示す。ガイドＲＮＡ１～１１および１３～１６を図１Ｂに示す。 図１Ａ～Ｂは、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ上の各Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡの標的化部位を示す。灰色のボックスは、ＤＵＸ４エクソン１、エクソン２、およびエクソン３を示す。イントロン１、エクソン２、イントロン２、およびエクソン３は、ＤＵＸ４の３’ＵＴＲとして機能する。ＤＵＸ４標的化ｍｉＲＮＡリードは矢印で示される。ｍｉＲＮＡの位置が一致するｇＲＮＡは線で示される。ガイドＲＮＡ１～１１を図１Ａに示す。ガイドＲＮＡ１～１１および１３～１６を図１Ｂに示す。 図２Ａ～Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞のＤＵＸ４遺伝子を発現停止するように設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ配列のスクリーニング結果を示す。図２Ａは、タンパク質レベルでＤＵＸ４遺伝子を効率的に発現停止する各ｇＲＮＡ（本明細書に記載されるｇＲＮＡ１～１２）の能力のウエスタンブロット試験の結果を示す。アルファ－チューブリンは、ローディングコントロールとして機能した。図２Ｂは、トランスフェクションの４８時間後のカスパーゼ－３／７細胞死アッセイを示す。ＤＵＸ４は細胞死を引き起こし、ＤＵＸ４のみを発現する細胞は、カスパーゼ－３／７活性が上昇し、これは細胞がアポトーシスを受けていたことを示す。対照的に、効果的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１～１２）と共にＣａｓ１３ｂを受けた全てのＤＵＸ４トランスフェクトされた細胞は、カスパーゼ－３／７活性のベースラインレベルによって示される細胞死から保護された。図２Ｃは、細胞生存率アッセイの結果を示しており、図２Ｂのデータを確認する。Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡで処理されたＤＵＸ４トランスフェクトされた試料には、ＤＵＸ４のみを受けた試料と比較して有意に多くの生細胞が存在した。図２Ｄは、ウエスタンブロットを使用した対照実験の結果を示しており、Ｃａｓ１３ｂ自体がガイドＲＮＡなしでＤＵＸ４タンパク質の発現を減少させないことを示す。 図２Ａ～Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞のＤＵＸ４遺伝子を発現停止するように設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ配列のスクリーニング結果を示す。図２Ａは、タンパク質レベルでＤＵＸ４遺伝子を効率的に発現停止する各ｇＲＮＡ（本明細書に記載されるｇＲＮＡ１～１２）の能力のウエスタンブロット試験の結果を示す。アルファ－チューブリンは、ローディングコントロールとして機能した。図２Ｂは、トランスフェクションの４８時間後のカスパーゼ－３／７細胞死アッセイを示す。ＤＵＸ４は細胞死を引き起こし、ＤＵＸ４のみを発現する細胞は、カスパーゼ－３／７活性が上昇し、これは細胞がアポトーシスを受けていたことを示す。対照的に、効果的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１～１２）と共にＣａｓ１３ｂを受けた全てのＤＵＸ４トランスフェクトされた細胞は、カスパーゼ－３／７活性のベースラインレベルによって示される細胞死から保護された。図２Ｃは、細胞生存率アッセイの結果を示しており、図２Ｂのデータを確認する。Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡで処理されたＤＵＸ４トランスフェクトされた試料には、ＤＵＸ４のみを受けた試料と比較して有意に多くの生細胞が存在した。図２Ｄは、ウエスタンブロットを使用した対照実験の結果を示しており、Ｃａｓ１３ｂ自体がガイドＲＮＡなしでＤＵＸ４タンパク質の発現を減少させないことを示す。 図２Ａ～Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞のＤＵＸ４遺伝子を発現停止するように設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ配列のスクリーニング結果を示す。図２Ａは、タンパク質レベルでＤＵＸ４遺伝子を効率的に発現停止する各ｇＲＮＡ（本明細書に記載されるｇＲＮＡ１～１２）の能力のウエスタンブロット試験の結果を示す。アルファ－チューブリンは、ローディングコントロールとして機能した。図２Ｂは、トランスフェクションの４８時間後のカスパーゼ－３／７細胞死アッセイを示す。ＤＵＸ４は細胞死を引き起こし、ＤＵＸ４のみを発現する細胞は、カスパーゼ－３／７活性が上昇し、これは細胞がアポトーシスを受けていたことを示す。対照的に、効果的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１～１２）と共にＣａｓ１３ｂを受けた全てのＤＵＸ４トランスフェクトされた細胞は、カスパーゼ－３／７活性のベースラインレベルによって示される細胞死から保護された。図２Ｃは、細胞生存率アッセイの結果を示しており、図２Ｂのデータを確認する。Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡで処理されたＤＵＸ４トランスフェクトされた試料には、ＤＵＸ４のみを受けた試料と比較して有意に多くの生細胞が存在した。図２Ｄは、ウエスタンブロットを使用した対照実験の結果を示しており、Ｃａｓ１３ｂ自体がガイドＲＮＡなしでＤＵＸ４タンパク質の発現を減少させないことを示す。 図２Ａ～Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞のＤＵＸ４遺伝子を発現停止するように設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ配列のスクリーニング結果を示す。図２Ａは、タンパク質レベルでＤＵＸ４遺伝子を効率的に発現停止する各ｇＲＮＡ（本明細書に記載されるｇＲＮＡ１～１２）の能力のウエスタンブロット試験の結果を示す。アルファ－チューブリンは、ローディングコントロールとして機能した。図２Ｂは、トランスフェクションの４８時間後のカスパーゼ－３／７細胞死アッセイを示す。ＤＵＸ４は細胞死を引き起こし、ＤＵＸ４のみを発現する細胞は、カスパーゼ－３／７活性が上昇し、これは細胞がアポトーシスを受けていたことを示す。対照的に、効果的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１～１２）と共にＣａｓ１３ｂを受けた全てのＤＵＸ４トランスフェクトされた細胞は、カスパーゼ－３／７活性のベースラインレベルによって示される細胞死から保護された。図２Ｃは、細胞生存率アッセイの結果を示しており、図２Ｂのデータを確認する。Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡで処理されたＤＵＸ４トランスフェクトされた試料には、ＤＵＸ４のみを受けた試料と比較して有意に多くの生細胞が存在した。図２Ｄは、ウエスタンブロットを使用した対照実験の結果を示しており、Ｃａｓ１３ｂ自体がガイドＲＮＡなしでＤＵＸ４タンパク質の発現を減少させないことを示す。 図３Ａ～Ｅは、処理されたおよび未処理の筋管のＲＮＡｓｃｏｐｅ画像を示す。図３Ａは、未処理のＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｂは、未処理の健康な筋管を示す。図３Ｃは、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｄは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ３で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｅは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ病巣は、矢印で示される暗い点状のスポットとして検出される。ＤＵＸ４ ＲＮＡ病巣は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ処理された試料で減少した（図３Ｄおよび３Ｅ）。 図３Ａ～Ｅは、処理されたおよび未処理の筋管のＲＮＡｓｃｏｐｅ画像を示す。図３Ａは、未処理のＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｂは、未処理の健康な筋管を示す。図３Ｃは、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｄは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ３で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｅは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ病巣は、矢印で示される暗い点状のスポットとして検出される。ＤＵＸ４ ＲＮＡ病巣は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ処理された試料で減少した（図３Ｄおよび３Ｅ）。 図３Ａ～Ｅは、処理されたおよび未処理の筋管のＲＮＡｓｃｏｐｅ画像を示す。図３Ａは、未処理のＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｂは、未処理の健康な筋管を示す。図３Ｃは、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｄは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ３で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｅは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ病巣は、矢印で示される暗い点状のスポットとして検出される。ＤＵＸ４ ＲＮＡ病巣は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ処理された試料で減少した（図３Ｄおよび３Ｅ）。 図３Ａ～Ｅは、処理されたおよび未処理の筋管のＲＮＡｓｃｏｐｅ画像を示す。図３Ａは、未処理のＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｂは、未処理の健康な筋管を示す。図３Ｃは、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｄは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ３で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｅは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ病巣は、矢印で示される暗い点状のスポットとして検出される。ＤＵＸ４ ＲＮＡ病巣は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ処理された試料で減少した（図３Ｄおよび３Ｅ）。 図３Ａ～Ｅは、処理されたおよび未処理の筋管のＲＮＡｓｃｏｐｅ画像を示す。図３Ａは、未処理のＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｂは、未処理の健康な筋管を示す。図３Ｃは、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｄは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ３で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。図３Ｅは、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管を示す。ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ病巣は、矢印で示される暗い点状のスポットとして検出される。ＤＵＸ４ ＲＮＡ病巣は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ処理された試料で減少した（図３Ｄおよび３Ｅ）。 図４は、Ｃａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡまたは対照で処理されたＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４関連バイオマーカーＰＲＡＭＥファミリーメンバー１２（ＰＲＡＭＥＦ１２）の発現を示す。ＤＵＸ４は、ＰＲＡＭＥＦ１２を含むいくつかの下流遺伝子を活性化することが知られている転写因子である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、およびｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管は、Ｃａｓ１３ｂのみ、またはＣａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ１２で処理された細胞と比較してＰＲＡＭＥＦ１２の発現を有意に低下させた。これらの結果は、ＤＵＸ４の発現の低下がＤＵＸ４活性化バイオマーカーの低下と関連していることを示す。各個々のアッセイは、各条件において２つ組で実施された。 図５は、本開示の様々な態様に開示されるように、ヒトＵ６プロモーター、ｇＲＮＡ（配列番号３～１３および５１～５４に記載される）、およびＣａｓ１３ｂ定方向反復（配列番号３７）を含む、ｇＲＮＡ１～１１および１３～１６（配列番号１４～２４および５５～５８）およびｇＲＮＡ１～１１および１３～１６発現カセット（配列番号３８～４８および６３～６６）のＤＵＸ４標的化配列を示す。 図５は、本開示の様々な態様に開示されるように、ヒトＵ６プロモーター、ｇＲＮＡ（配列番号３～１３および５１～５４に記載される）、およびＣａｓ１３ｂ定方向反復（配列番号３７）を含む、ｇＲＮＡ１～１１および１３～１６（配列番号１４～２４および５５～５８）およびｇＲＮＡ１～１１および１３～１６発現カセット（配列番号３８～４８および６３～６６）のＤＵＸ４標的化配列を示す。 図５は、本開示の様々な態様に開示されるように、ヒトＵ６プロモーター、ｇＲＮＡ（配列番号３～１３および５１～５４に記載される）、およびＣａｓ１３ｂ定方向反復（配列番号３７）を含む、ｇＲＮＡ１～１１および１３～１６（配列番号１４～２４および５５～５８）およびｇＲＮＡ１～１１および１３～１６発現カセット（配列番号３８～４８および６３～６６）のＤＵＸ４標的化配列を示す。 図５は、本開示の様々な態様に開示されるように、ヒトＵ６プロモーター、ｇＲＮＡ（配列番号３～１３および５１～５４に記載される）、およびＣａｓ１３ｂ定方向反復（配列番号３７）を含む、ｇＲＮＡ１～１１および１３～１６（配列番号１４～２４および５５～５８）およびｇＲＮＡ１～１１および１３～１６発現カセット（配列番号３８～４８および６３～６６）のＤＵＸ４標的化配列を示す。 図６Ａ～Ｃは、Ｃａｓ１３ｂおよび様々なｇＲＮＡプラスミドによるトランスフェクション後のＤＵＸ４活性に対する、様々なＤＵＸ ４標的（バイオマーカー）、すなわちＴＲＩＭ４３（図６Ａ）、ＭＢＤ３Ｌ２（図６Ｂ）、およびＰＲＡＭＥＦ１２（図６Ｃ）の相対的発現レベルの減少によって示されるＤＵＸ４活性の阻害のｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。参照遺伝子としてヒトＲＰＬ１３Ａを使用した。これらのバイオマーカーの発現レベルは、陰性対照としてＣａｓ１３ｂのみをトランスフェクトされた筋管に正規化された。３つのバイオマーカーのそれぞれの発現レベルは、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡでトランスフェクトした後、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされた細胞のみと比較して低下した。 図６Ａ～Ｃは、Ｃａｓ１３ｂおよび様々なｇＲＮＡプラスミドによるトランスフェクション後のＤＵＸ４活性に対する、様々なＤＵＸ ４標的（バイオマーカー）、すなわちＴＲＩＭ４３（図６Ａ）、ＭＢＤ３Ｌ２（図６Ｂ）、およびＰＲＡＭＥＦ１２（図６Ｃ）の相対的発現レベルの減少によって示されるＤＵＸ４活性の阻害のｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。参照遺伝子としてヒトＲＰＬ１３Ａを使用した。これらのバイオマーカーの発現レベルは、陰性対照としてＣａｓ１３ｂのみをトランスフェクトされた筋管に正規化された。３つのバイオマーカーのそれぞれの発現レベルは、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡでトランスフェクトした後、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされた細胞のみと比較して低下した。 図６Ａ～Ｃは、Ｃａｓ１３ｂおよび様々なｇＲＮＡプラスミドによるトランスフェクション後のＤＵＸ４活性に対する、様々なＤＵＸ ４標的（バイオマーカー）、すなわちＴＲＩＭ４３（図６Ａ）、ＭＢＤ３Ｌ２（図６Ｂ）、およびＰＲＡＭＥＦ１２（図６Ｃ）の相対的発現レベルの減少によって示されるＤＵＸ４活性の阻害のｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。参照遺伝子としてヒトＲＰＬ１３Ａを使用した。これらのバイオマーカーの発現レベルは、陰性対照としてＣａｓ１３ｂのみをトランスフェクトされた筋管に正規化された。３つのバイオマーカーのそれぞれの発現レベルは、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡでトランスフェクトした後、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされた細胞のみと比較して低下した。 図７は、インビトロ遺伝子発現停止アッセイの結果を示す。全てのｇＲＮＡはＤＵＸ４を標的とし、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現を低下させることができた。この特定のアッセイで見られた最も顕著な発現停止は、ｇＲＮＡ１、２、および１５によって達成された。 図８は、ｍＣｈｅｒｒｙの発現をマーカーとして使用して、ＤＵＸ４の発現における低下を測定するために行ったインビトロ蛍光アッセイの結果を示す。非標的化ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１２）またはＣａｓ１３ｂのみをトランスフェクトされた細胞と比較して、ｇＲＮＡ１および２で処理した細胞ではｍＣｈｅｒｒｙの発現が大幅に低下した。 図９Ａ～Ｃは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスモデルを用いたインビボ実験の結果を示す。図９Ａは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスが、タモキシフェン治療のみでの経時的なマウスの筋肉（前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、および三頭筋（ＴＲＩ）におけるＷＡＰ ４ジスルフィドコアドメインタンパク質３（ＷＦＤＣ３）の相対的発現によって示されるように、軽度で進行性の筋病理を発症させるように誘導され得ることを示す。図９Ｂは、１ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを週に３回経時的に投与した後（ＤＵＸ４を標的とするｇＲＮＡの投与なしのＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスのＴＡおよびＧＡＳ筋肉におけるＤＵＸ４発現および組織損傷の増加を示す。 図９Ａ～Ｃは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスモデルを用いたインビボ実験の結果を示す。図９Ａは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスが、タモキシフェン治療のみでの経時的なマウスの筋肉（前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、および三頭筋（ＴＲＩ）におけるＷＡＰ ４ジスルフィドコアドメインタンパク質３（ＷＦＤＣ３）の相対的発現によって示されるように、軽度で進行性の筋病理を発症させるように誘導され得ることを示す。図９Ｂは、１ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを週に３回経時的に投与した後（ＤＵＸ４を標的とするｇＲＮＡの投与なしのＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスのＴＡおよびＧＡＳ筋肉におけるＤＵＸ４発現および組織損傷の増加を示す。 図９Ａ～Ｃは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスモデルを用いたインビボ実験の結果を示す。図９Ａは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスが、タモキシフェン治療のみでの経時的なマウスの筋肉（前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、および三頭筋（ＴＲＩ）におけるＷＡＰ ４ジスルフィドコアドメインタンパク質３（ＷＦＤＣ３）の相対的発現によって示されるように、軽度で進行性の筋病理を発症させるように誘導され得ることを示す。図９Ｂは、１ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを週に３回経時的に投与した後（ＤＵＸ４を標的とするｇＲＮＡの投与なしのＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスのＴＡおよびＧＡＳ筋肉におけるＤＵＸ４発現および組織損傷の増加を示す。図９Ｃ～Ｅは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスにおけるＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３（ｇＲＮＡ１を含む）の新生仔筋肉内注射の結果を示す。新生仔ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウス（１～２日の新生仔）に、５ｅ１０ＡＡＶ．Ｃａｓ１３およびＡＡＶ．ｇＲＮＡ１を１～２日で片側に同時注射した。４週間後、マウスはタモキシフェンプロトコル（１ｍｇ／ｋｇ、週に３回、４週間）を開始した。ＷＦＤＣ３の発現は、ｇＲＮＡ１およびＣａｓ１３ｂで治療されたマウスで低下した。 図９Ｃ～Ｅは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスにおけるＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３（ｇＲＮＡ１を含む）の新生仔筋肉内注射の結果を示す。新生仔ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウス（１～２日の新生仔）に、５ｅ１０ＡＡＶ．Ｃａｓ１３およびＡＡＶ．ｇＲＮＡ１を１～２日で片側に同時注射した。４週間後、マウスはタモキシフェンプロトコル（１ｍｇ／ｋｇ、週に３回、４週間）を開始した。ＷＦＤＣ３の発現は、ｇＲＮＡ１およびＣａｓ１３ｂで治療されたマウスで低下した。 図９Ｃ～Ｅは、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスにおけるＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３（ｇＲＮＡ１を含む）の新生仔筋肉内注射の結果を示す。新生仔ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウス（１～２日の新生仔）に、５ｅ１０ＡＡＶ．Ｃａｓ１３およびＡＡＶ．ｇＲＮＡ１を１～２日で片側に同時注射した。４週間後、マウスはタモキシフェンプロトコル（１ｍｇ／ｋｇ、週に３回、４週間）を開始した。ＷＦＤＣ３の発現は、ｇＲＮＡ１およびＣａｓ１３ｂで治療されたマウスで低下した。 図１０は、ｇＲＮＡ１～１１および１３～１６がＤＵＸ４の毒性を低下させ、カスパーゼ３／７アッセイで細胞をアポトーシスから保護したことを示す。 図１１は、ｓＡＡＶ６－Ｃａｓ１３ｂおよびｓｃＡＡＶ６－ｇＲＮＡ１（５ｅ１０）をマウスＴＡに同時注射した後、ＤＵＸ４（１ｅ９）を注射した３週間後のＤＵＸ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質（ＷＦＤＣ３の相対的発現で示される）の低下を示す。
本開示は、筋肉におけるダブルホメオボックスタンパク質４（ＤＵＸ４）の発現が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含むがこれに限定されない筋ジストロフィーを引き起こすことが知られているため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３を使用してｍＲＮＡレベルでＤＵＸ４遺伝子発現停止を達成するための新規戦略を提供する。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の製品および方法は、ＦＳＨＤの治療に使用される。
ＦＳＨＤの重要な将来の治療標的としてのＤＵＸ４の出現は、ＦＳＨＤのトランスレーショナルリサーチを追求することへの障壁を下げた。Ｃａｓ１３ｂ系と共にＤＵＸ４ ｍＲＮＡを標的とするガイドＲＮＡを使用してＤＵＸ４の発現を低下させることにより、この疾患の治療を提供することができる。この開示は、Ｃａｓ１３系の活用と共に操作された人工ガイドＲＮＡによって引き起こされるＤＵＸ４遺伝子発現停止が、ＤＵＸ４の発現を下方調節して、細胞死からの保護およびＦＳＨＤなどの筋ジストロフィーを治療するための有望な治療アプローチを提供するという証拠を提供する。
ＤＵＸ４遺伝子は、約４５ｋＤＡのタンパク質をコードする。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＵＢＸ２（ＤＵＸ４＿ＨＵＭＡＮ）を参照されたい。ＤＵＸ４遺伝子の抑制解除は、ＦＳＨＤの病因に関与する。抑制解除は、Ｄ４Ｚ４反復収縮、またはクロマチン修飾遺伝子ＳＭＣＨＤ１もしくはＤＮＭＴ３Ｂの変異の２つの既知の機序によって生じ得る。前者の場合、罹患していない対象では、Ｄ４Ｚ４アレイは１１～１００の反復で構成されているが、ＦＳＨＤ１患者では、アレイは１～１０の反復に低下する（ＰｕｂＭｅｄ：１９３２０６５６）。どちらの条件も、染色体４ｑ３５でＤＮＡの低メチル化を引き起こし、それによってＤＵＸ４の発現を許容する染色体環境を作り出す可能性がある。
ＤＵＸ４は、体細胞組織においてエピジェネティックに抑制されるＤ４Ｚ４マクロサテライトに位置する。ＦＳＨＤ１のＤ４Ｚ４クロマチン緩和は、ＤＵＸ４の非効率的なエピジェネティックな抑制、および骨格筋核のサブセットにおけるＤＵＸ４タンパク質発現の多彩なパターンをもたらす。骨格筋におけるＤＵＸ４の異所性発現は、幹細胞および生殖系列遺伝子の発現を活性化し、体細胞において過剰発現すると、ＤＵＸ４は最終的に細胞死をもたらし得る。
各Ｄ４Ｚ４反復単位には、２つのホメオボックスをコードするオープンリーディングフレーム（ＤＵＸ４と名付けられる）があり、反復アレイおよびＯＲＦは他の哺乳動物でも保存されている。コードされたタンパク質は、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＴＲＩＭ４３、およびＭＢＤ３Ｌ２（ＰＭＩＤ：２４８６１５５１）を含む、ＦＳＨＤ疾患のバイオマーカーと見なされるいくつかの遺伝子を含む、多数の遺伝子の転写活性化因子として機能することが報告されている。マクロサテライト反復の収縮は、常染色体優性ＦＳＨＤを引き起こす。選択的スプライシングは、複数の転写産物のバリアントをもたらす。
いくつかの態様では、ヒトＤＵＸ４をコードする核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列において記載される。いくつかの態様では、ヒトＤＵＸ４のアミノ酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において記載される。様々な態様では、本開示の方法はまた、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のアイソフォームおよびバリアントも標的とする。いくつかの態様では、バリアントは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、および７０％の同一性を有する。いくつかの態様では、本開示の方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸のアイソフォームおよびバリアントを標的とする。いくつかの態様では、バリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、および７０％の同一性を有する。
現在、ＦＳＨＤの治療法はなく、筋ジストロフィーの中で比較的豊富であるにもかかわらず、ＦＳＨＤを標的としたトランスレーショナルリサーチはほとんど発表されていない。いくつかのＦＳＨＤ候補遺伝子が特定されているが、最近の多くの研究は、ＦＳＨＤの病因の主な原因が転写因子をコードするアポトーシス促進性のＤＵＸ４遺伝子であることを支持する。したがって、簡単に言えば、ＤＵＸ４の過剰発現は、ＦＳＨＤの根底にある主な病原性傷害である。
本開示は、変異したＤＵＸ４遺伝子および結果として生じる変更されたバージョンのｍＲＮＡに起因するＦＳＨＤまたは他の障害を含むがこれらに限定されない筋ジストロフィーを有する対象を回復させる、および／または治療するために、ＤＵＸ４の発現を発現停止または下方調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３の使用を含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ適応免疫系は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを介して外来核酸から微生物を防御する。Ｃａｓ１３酵素は、正確なＲＮＡ編集のためのＣＲＩＳＰＲ分野で急速に主要なプレーヤーになりつつある（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８（６３６６）：１０１９－２７，２０１７）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３は、様々な疾患を治療するために考慮されてきた、真核細胞における遺伝子調節機序である。
本開示は、ＤＵＸ４の発現を発現停止または下方調節して、ＤＵＸ４発現癌を有する対象を回復させる、および／または治療するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３の使用を含む。正常組織では典型的には発現停止される初期胚性転写因子であるＤＵＸ４が、膀胱、乳房、肺、腎臓、胃、およびその他の器官部位の多くの固形腫瘍で再発現されることが報告されている（Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ５０（５）：６５８－７１．ｅ７（２０１９）。ＤＵＸ４は、黒色腫および転移性黒色腫にも関係している。同文献。ＤＵＸ４は通常、胚が形成され発症するときに発現するが、その後、体細胞組織においてエピジェネティックに抑制され、発現停止される。ＤＵＸ４が肉腫における腫瘍形成および転移において役割を果たすことも報告されている（Ｏｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９；１２９（８）：３４０１－３４０６）。全体として、ＤＵＸ４は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、ラブドイド癌（またはラブドイド肉腫）、肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺腫、黒色腫、または転移性黒色腫に関係している。癌免疫療法の進歩により、抗原提示および腫瘍免疫相互作用を調節する遺伝子を特定することが重要になっている。ＤＵＸ４の発現は、インターフェロン－γを介したＭＨＣクラスＩの誘導を遮断することが示されており、ＤＵＸ４を介した免疫回避における抗原提示の抑制を示唆している。転移性黒色腫の臨床データにより、ＤＵＸ４の発現が抗ＣＴＬＡ－４に応答した無増悪生存期間および全生存期間の大幅な低下と関連していることが確認された。したがって、本明細書に記載されるように、ＤＵＸ４の発現またはＤＵＸ４の過剰発現を阻害する方法は、ＤＵＸ４関連腫瘍または癌の治療および予防において治療的である。
核酸編集は、特にＲＮＡレベルで遺伝性疾患を治療するために使用され、疾患に関連する配列を救出して機能的なタンパク質産物をもたらすことができる。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、プログラム可能な単一エフェクターＲＮＡガイドリボヌクレアーゼＣａｓ１３を含む。ＶＩ型系は、堅牢なノックダウンが可能なＣａｓ１３オルソログを操作するためにプロファイリングされ、哺乳類細胞において、触媒的に不活性なＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）を使用して、ＡＤＡＲ２（ＲＮＡ２型に作用するアデノシンデアミナーゼ）によるアデノシンからイノシンへのデアミナーゼ活性を転写産物に指向することにより、ＲＮＡ編集を示した。この系は、プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集（ＲＥＰＡＩＲ）と呼ばれ、病原性変異を含む完全長の転写産物を編集するために使用することができる（Ｃｏｘら、上記）。
いくつかの態様では、本開示は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用する、プログラム可能な単一エフェクターＲＮＡガイドリボヌクレアーゼＣａｓ１３を含む。いくつかの態様では、本開示は、Ｃａｓ１３ｂ（Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６５：６１８－３０，２０１７）を使用し、これは、２つのｃｒＲＮＡバリアントを有するＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイドＲＮａｓｅである。Ｃａｓ１３ｂは、短い定方向反復および長い定方向反復を用いて独自のＣＲＩＳＰＲアレイを処理し、標的ＲＮＡを切断し、付随的なＲＮａｓｅ活性を示す。
本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様では、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、本質的にヌクレオチド配列からなる。いくつかの態様では、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。
本開示は、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３オルソログ、およびＣａｓ１３バリアント、ならびに該Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３オルソログ、およびＣａｓ１３バリアントを使用する方法を含む。したがって、いくつかの態様では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１３ｃである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１３ｃは、哺乳類コドン最適化される。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂは、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（カタログ番号ｐＣ００４６、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１０３８６２／、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：３５８（６３６６）：１０１９－１０２７，２０１７も参照されたい）である。例示的な態様では、Ｃａｓ１３は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含むＣａｓ１３ｂ、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するそのバリアントである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３は、細胞における発現のためのウイルスベクターを含む哺乳類発現ベクターに挿入される。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１３ｃオルソログのための哺乳類ｇＲＮＡは、細胞における発現のためのウイルスベクターを含む哺乳類発現ベクターにクローン化される。いくつかの態様では、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ１３をコードするＤＮＡは、プロモーターの発現下にある。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。
いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ ＤＵＸ４ ＲＮＡの発現停止は、ＤＵＸ４遺伝子が同一のＤ４Ｚ４ ＤＮＡ反復内に包埋されているという事実に起因してＤＮＡ指向された編集戦略よりも優れており、単一部位ＤＮＡ編集戦略でさえ、４番染色体の全末端の切除、または４番染色体のエピジェネティックな状態を変更し、ＤＵＸ４の抑制解除をもたらす可能性のあるＤ４Ｚ４反復のより短いアレイの産生をもたらす。重要なことに、本開示は、ＤＵＸ４の発現を大幅に低下させるＣａｓ１３特異的ガイドＲＮＡを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４ ＲＮＡ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。より具体的には、本開示は、配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸を提供する。これらの配列は、様々なサイズの本開示のアンチセンス「ガイド」鎖配列を含む。アンチセンスガイド鎖は、最終的に配列特異的遺伝子発現停止に関与するＲＮＡ誘発発現停止複合体のＲＮＡ成分となる成熟ｍｉＲＮＡ二本鎖の鎖である。Ｄｕａｎ（Ｅｄ．）のセクション７．３、Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０）の第７章セクション７．３を参照されたい。
例えば、第１のアンチセンスガイド鎖、すなわち、配列番号３のｇＲＮＡは、配列番号１４に記載のＤＵＸ４配列に対応する（その逆相補体であり、したがってそれに結合する）。ｇＲＮＡ配列およびそれが結合するＤＵＸ４標的配列を示す図５および表１を参照されたい。第２のアンチセンスガイド鎖、すなわち、配列番号４のｇＲＮＡは、配列番号１４に記載のＤＵＸ４配列に結合するなどである。
したがって、本開示は、配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む。様々な態様では、本開示は、これらのｇＲＮＡをそれぞれｇＲＮＡ１～１１および１３～１６として提供する。いくつかの態様では、本開示は、対照として使用されるｇＲＮＡ１２を提供する。ｇＲＮＡ１２は、Ｃａｓ１３ｂ非標的化ｇＲＮＡである（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：３５８（６３６６）：１０１９－２７，２０１７）。
様々な態様では、本開示は、配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。本開示はまた、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号３７、または配列番号３７に記載の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するそのバリアント）をさらに含む核酸を含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復は、下流に位置するか、またはｇＲＮＡの３’末端に位置する。したがって、いくつかの態様では、核酸は、配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの態様では、核酸は、配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの態様では、本開示は、プロモーター、ｇＲＮＡ、および配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＣａｓ１３定方向反復配列を含む核酸を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するバリアントを含む。本明細書に記載されるように、このような機能的ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むコンストラクトは、ＤＵＸ４ ＲＮＡを標的とするように設計される。
本開示は、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤と組み合わせて、本明細書に記載の核酸のいずれかを含む組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸のいずれかを含むベクターを含む。
Ｃａｓ１３ｂ定方向反復配列を有するｇＲＮＡを含むこれらのｇＲＮＡの送達は、Ｃａｓ１３酵素を発現するベクター（例えば、Ｃａｓ１３ｂ）と共に、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡの分解を引き起こし、ＤＵＸ４タンパク質の低下をもたらす。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂ酵素をコードする核酸は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するそのバリアント、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子配列は、ｐＣ００４６－ＥＦ１ａ－ＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ＮＥＳ－ＨＩＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）である。
いくつかの態様では、ＤＵＸ４遺伝子の標的化のために、１つ以上のＣａｓ１３コンストラクトが１つ以上のｇＲＮＡコンストラクトと目的の細胞に同時トランスフェクトされる。追加の態様では、１つ以上のＣａｓ１３コンストラクトは、目的の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子発現を阻害するように設計された１つ以上のｇＲＮＡコンストラクト、および１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と同時トランスフェクトされる。
いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４の発現を下方調節または阻害するためのＲＮＡ干渉の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、種々の疾患を処置するために検討されてきた、真核細胞における遺伝子調節機序である。ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡによって媒介された遺伝子発現の転写後制御を指す。ｍｉＲＮＡは、小さく（２１～２５ヌクレオチド）、配列相同性を共有し、同族のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域と塩基対を形成する非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、細胞の遺伝子発現停止機構に、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように指示する。
例示的な態様では、本開示は、ＤＵＸ４の発現を妨害するためのｇＲＮＡの使用を含む。追加の態様では、本開示は、ＤＵＸ４の発現をさらに低下または遮断するために、本明細書に記載のｇＲＮＡと組み合わせて使用される他の阻害性ＲＮＡの使用を含む。
天然ＲＮＡｉ経路の理解が進展したため、研究者は、疾患を処置するため、標的遺伝子の発現を調節する際に使用するための人工ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡを設計してきた。小分子（または低分子）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに小分子（または低分子）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、哺乳類細胞でＲＮＡｉプロセスを引き起こすいくつかのクラスの低分子ＲＮＡが知られており、これらは同様のクラスのベクター発現トリガーを構成する［Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３２９－４０，２０１１、Ｈａｒｐｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：９３３－８，２００９］。ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベースのベクターからインビボで発現されるため、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモーターが活性である限り、１回の投与で長期の遺伝子発現停止を達成し得る（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：１４５－７３，２００５）。重要なことには、このベクター発現アプローチは、筋遺伝子治療分野にて既に行われていた数十年の長さにわたる進歩を強化する。ただし、遺伝子をコードするタンパク質を発現する代わりに、ＲＮＡｉ治療戦略におけるベクターカーゴは、関心対象の疾患遺伝子を標的とする人工ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡカセットである。この戦略は天然ｍｉＲＮＡを発現させるために使用される。各ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ配列および構造に基づいている。天然ｍｉｒ－３０ａ成熟配列は、標的遺伝子に由来する固有のセンスおよびアンチセンス配列によって置き換えられる。
上述のように、本開示は、ＤＵＸ４の発現をさらに低下または遮断するために、本明細書に記載のｇＲＮＡと組み合わせて使用される他の阻害性ＲＮＡの使用を含む。したがって、いくつかの態様では、本開示の産物および方法は、ＤＵＸ４の発現に影響を与える（例えば、ノックダウンまたは発現を阻害する）ための低分子ヘアピンＲＮＡまたは小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含む。低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現を発現停止させるために使用され得る、堅固なヘアピンターンを伴う人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、比較的低い割合の分解および代謝回転を有するという点でＲＮＡｉの有益なメディエータであるが、これは発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムを形質導入すると、次にｓｈＲＮＡは、プロモーター選択によってポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。産物は、プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を模倣し、Ｄｒｏｓｈａによって処理される。得られたプレ－ｓｈＲＮＡは、エクスポーチン５によって核から排出される。次にこの産物はＤｉｃｅｒによって処理され、ＲＮＡ誘発発現停止複合体（ＲＩＳＣ）中へとロードされる。センス（パッセンジャー）鎖は分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的な配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを配向する。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を阻止する。これらの場合ではどちらも、ｓｈＲＮＡは標的遺伝子の発現停止を引き起こす。いくつかの態様では、本開示は、ｓｈＲＮＡを介してＤＵＸ４アンチセンス配列を発現するＡＡＶベクターの産生および投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、種々のプロモーターの使用によって調節される。プロモーター選択は、頑強なｓｈＲＮＡ発現を得るためには必須である。種々の態様では、Ｕ６およびＨ１などのポリメラーゼＩＩプロモーター、およびポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用される。いくつかの態様では、Ｕ６ｓｈＲＮＡが使用される。
したがって、いくつかの態様では、本開示はＵ６ｓｈＲＮＡ分子を使用して、ＤＵＸ４遺伝子発現をさらに阻害、ノックダウン、または妨害する。従来のスモール／ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は通常、Ｕ６などのｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むベクターから細胞核内部へ転写される。内因性Ｕ６プロモーターは通常、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ ＲＮＡの発現を制御し、十分に特徴付けられている［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様では、（１）プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ポリＩＩＩ）によって認識され、かつｓｈＲＮＡの高レベルの恒常的発現を制御し、（２）プロモーターは大半の哺乳類細胞型において活性であるため、Ｕ６プロモーターが、哺乳類細胞のｓｈＲＮＡ分子のベクターに基づく発現を制御するために使用される［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３－８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）］。いくつかの態様では、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するのに必要な全因子が転写開始部位の上流に位置付けられる（Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００））という点で、ＩＩＩ型ｐｏｌＩＩＩプロモーターである。本開示は、マウスおよびヒトの両方のＵ６プロモーターを含む。ループによって接続された、標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核からＤｉｃｅｒがこれを低分子／小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと処理する箇所である細胞質内部へと輸送される。
いくつかの実施形態では、本開示の産物および方法は、ＤＵＸ４遺伝子発現をノックダウンまたはさらに阻害するために、一般的にはＵ－ＲＮＡとも呼ばれる核内低分子リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）を含む。ｓｎＲＮＡは、真核細胞の細胞核のスプライシングスペックルおよびカハール体内で見られる低分子ＲＮＡ分子のクラスである。核内低分子ＲＮＡは、一連の特異タンパク質と関連しており、その複合体は核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ、多くの場合には「スナープス」と発音される）と呼ばれる。各ｓｎＲＮＰ粒子は、ｓｎＲＮＡ成分と、複数のｓｎＲＮＰ－特異タンパク質（核内タンパク質のファミリーであるＳｍタンパク質を含む）からなる。ｓｎＲＮＡは、その関連タンパク質と共にリボ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）を形成し、プレ－ｍＲＮＡ基質上の特異的な配列に結合する。これらはＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのいずれかによって転写される。ｓｎＲＮＡは多くの場合、ＲＮＡ結合ＬＳｍタンパク質といった共通配列の特徴および関連タンパク質因子の両方に基づき２つのクラスに分類される。Ｓｍ－クラスｓｎＲＮＡとして既知である第１のクラスは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ４ａｔａｃ、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ１１およびＵ１２からなる。Ｓｍ－クラスｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。Ｌｓｍ－クラスｓｎＲＮＡとして既知である第２のクラスは、Ｕ６およびＵ６ａｔａｃからなる。Ｌｓｍ－クラスｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、Ｓｍ－クラスｓｎＲＮＡと比較すると核を離れることがない。いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４アンチセンス配列を送達するための、Ｕ７ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶベクターの産生および投与を含む。
いくつかの態様では、本開示はＵ７ｓｎＲＮＡ分子を使用して、ＤＵＸ４遺伝子発現をさらに阻害、ノックダウン、または妨害する。Ｕ７ｓｎＲＮＡは通常、ヒストンプレ－ｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与しているが、いくつかの態様では、スプライシング調節用の可変性ツールへと変換されるか、または細胞内で継続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして変換される［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４）］。野生型Ｕ７Ｓｍ結合部位と、スプライセオソームのｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列を置き換えることで、得られたＲＮＡは、スプライセオソームのｓｎＲＮＡ内で見られる７つのＳｍタンパク質で会合する（図７）。結果として、このＵ７ ＳｍＯＰＴ ＲＮＡは核細胞質内にさらに効率的に蓄積し、それ以上ヒストンプレ－ｍＲＮＡ切断を媒介しない。ただし、依然としてこのＵ７ ＳｍＯＰＴ ＲＮＡはヒストンプレ－ｍＲＮＡに結合することができ、野生型Ｕ７ｓｎＲＮＰ用の競合抑制剤として機能する。ヒストン下流因子に結合している配列と、スプライシング基質における特定の標的に相補的な配列とをさらに置き換えることで、特異的なスプライシング現象を調節可能であるＵ７ｓｎＲＮＡを生成することができる。Ｕ７誘導体を使用する利点は、アンチセンス配列が核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体内へと包埋されることである。さらに、遺伝子治療ベクターに包埋されると、これらの低分子ＲＮＡは、１回の注射後に標的細胞内で持続的に発現され得る［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２，（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。ＡＡＶアプローチを使用した神経筋障害におけるＵ７ｓｎＲＮＡ系の可能性がインビボで調査された（ＡＡＶ．Ｕ７）［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルの欠損ＲＮＡを標的にするこのＡＡＶ９．Ｕ７の単回注射により、心臓および横隔膜を含むあらゆる筋肉内の疾患の長期にわたる補正がもたらされる。心臓を標的とする能力は、ＤＭ１患者が心臓異常を示すことから非常に重要度が高い。
Ｕ７ｓｎＲＮＡは通常、ヒストンプレ－ｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与しているが、これはまたスプライシング調節用の可変性ツールとして使用されるか、または細胞内で継続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして使用される。Ｕ７誘導体を使用する１つの利点は、アンチセンス配列が核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体内へと包埋されることである。さらには、遺伝子治療ベクターに包埋される場合には、これらの低分子ＲＮＡは単回注射後に標的細胞内部で持続的に発現され得る。
本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示されるＤＵＸ４阻害性ＲＮＡおよびＤＵＸ４ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを送達する。いくつかの態様では、各ｇＲＮＡおよび各Ｃａｓ１３ｂは、ベクターに個別にクローン化される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、本開示において上述のようにヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数を含むベクターを含む。いくつかの態様では、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ベクターは一本鎖ＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。
いくつかの態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用して、ＤＵＸ４発現をノックダウンまたは阻害するためにＤＵＸ４ ｍＲＮＡを標的とする、ｇＲＮＡを含む阻害性ＲＮＡをコードする核酸を送達する。いくつかの態様では、ＡＡＶは、Ｃａｓ１３またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を送達するために使用される。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８６２に提示されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており（ＡＡＶ－８に関して米国特許第７，２８２，１９９および同第７，７９０，４４９も参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体の導入を指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的である固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および導入を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部または全てが、外来ＤＮＡで置き換えられてよい。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは凍結乾燥されてよく、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性がない。いくつかの態様では、ＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下で、ｇＲＮＡを含む阻害性ＲＮＡを送達するために使用される。いくつかの態様では、ＡＡＶは、Ｕ７プロモーターの制御下で阻害性ＲＮＡを送達するために使用される。いくつかの態様では、ＡＡＶは、Ｕ７およびＵ６プロモーターの制御下で、ｇＲＮＡおよび他の阻害性ＲＮＡの両方を送達するために使用される。いくつかの態様では、ＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ、およびＣａｓ１３（またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアント）を送達するために使用される。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＤＵＸ４標的化ポリヌクレオチドコンストラクトに隣接している１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡである。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、ＤＵＸ４を標的とする他のポリヌクレオチドコンストラクトと共に投与される。様々な態様では、ｇＲＮＡは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ（例えば、ｍｉｎｉＣＭＶ）、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、骨格筋特異的プロモーターなどのプロモーターを含むがこれらに限定されない様々なプロモーターの下で発現される。いくつかの態様では、このような筋特異的プロモーターには、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＭＨＣＫ７、ＣＫ１が含まれるが、これらに限定されない。具体的には、この戦略は、様々な態様で、単一の骨格における複数のコピーで同じｇＲＮＡのより効率的な発現を達成するために使用される。ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０およびＡＡＶ－ｒｈ．７４を含むがこれに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。上記の背景部分に記載されるように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムの組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染に許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分であるｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０およびＡＡＶ－ｒｈ．７４を含むがこれに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来している。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記に記載されるように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が、特に熟考されている。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、例えば、１つまたは複数のＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）などの商用供給者は、受注生産の阻害性ＲＮＡ分子を生成する。これに加え、受注生産のｓｉＲＮＡ分子を産生するために、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）またはｐｓｉＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）といった市販のキットが利用可能である。実施形態は、配列番号２５～３６および５９～６２のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む核酸を含む、ｒＡＡＶゲノムを含む。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの、安定状態で形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製される。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
別の実施形態では、本開示は本明細書に記載のコンストラクトのうち任意のものを含むｒＡＡＶを含む組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のｇＲＮＡを送達するためのｒＡＡＶを含む組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、１つまたは複数のＤＵＸ４阻害性ＲＮＡと共に、本明細書に記載のｇＲＮＡのうちの１つまたは複数を含む組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡおよびＣａｓ１３を送達するためのｒＡＡＶを含む組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１３を送達するためのｒＡＡＶ、ならびに１つまたは複数のＤＵＸ４阻害性ＲＮＡを含む組成物を含む。本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤を含む。許容される担体および希釈剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度では不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分と共に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、および細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（例えば、それぞれ１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇおよび１×１０１４ｖｇ）で表されてもよい。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３～１３および５１～５４、２５～３５および５９～６２、もしくは３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする任意の１つまたは複数の核酸を、それを必要とする対象に送達する方法を提供し、これには、本明細書に記載のＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードするＡＡＶを対象に投与することが含まれる。
いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４ ｇＲＮＡを送達するためのＡＡＶ形質導入細胞を提供する。インビボまたはインビトロにて、ｒＡＡＶを用いて標的細胞を形質導入する方法が、本開示に含まれる。方法は、対象に、本開示のｒＡＡＶを含む有効量または複数の有効量の組成物を投与する工程を含み、この対象には、それを必要とする動物（例えばヒト）が含まれる。用量が筋ジストロフィーの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または低減）する、筋ジストロフィーの進行を遅らせるかもしくは予防する、筋ジストロフィーの進行を遅らせるかもしくは予防する、疾患の程度を軽減させる、疾患の程度を軽減させる、筋ジストロフィーの寛解（部分的または完全な）をもたらす、および／または生存を延長させる用量である。いくつかの態様では、筋ジストロフィーはＦＳＨＤである。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準の経路であり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、治療される感染症および／または疾患状態、ならびにＤＵＸ４を発現する細胞などの標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。いくつかの実施形態では、投与経路は筋肉内投与である。いくつかの実施形態では、投与経路は静脈内投与である。
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示に従う投与には、筋肉、血流、中枢神経系への注射および／または直接脳もしくは他の器官への注射が含まれるがこれに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁するのみで、筋肉組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、担体またはｒＡＡＶと共投与できる他の成分に既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避すべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ第０２／０５３７０３号を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体と共に使用することができる。
筋肉内注射を目的として、ゴマ油や落花生油などのアジュバント溶液、または水性プロピレングリコール溶液、および滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。いくつかの態様では、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分と共に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＤＵＸ４阻害性ＲＮＡの発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞への１つまたは複数のＤＵＸ４阻害性ＲＮＡ（ｇＲＮＡおよび１つまたは複数のＣａｓ１３コード化ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない）の投与／送達を指すように使用される。
一態様では、ｒＡＡＶを用いた形質導入はインビトロで実行される。一実施形態では、所望の標的細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶを用いて形質導入され、対象に再導入される。代替的には、同系または異種細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種細胞が使用され得る。
対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、目的とするＤＮＡを持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによって、インビトロで形質導入され得る。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。
本開示は、ＤＵＸ４発現を妨害することを標的とするｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ならびにＣａｓ１３ｂ定方向反復およびＣａｓ１３をコードするＤＮＡを含む、有効量（または本質的に同時に投与される用量または間隔を置いて与えられる用量）のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。
本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＤＵＸ４発現およびＣａｓ１３ｂ定方向反復を標的とするガイドＲＮＡの持続発現をもたらす。したがって本開示は、抑制ＲＮＡを発現するｒＡＡＶを、対象に投与／送達する方法を提供する。こうした対象は動物対象であり、いくつかの態様では対象はヒトである。
こうした方法には、血管系、中枢神経系および組織（筋細胞および神経細胞、骨格筋を含む筋肉などの組織、心臓、脳、皮膚、眼などの器官、ならびに内分泌系、ならびに内分泌腺および口腔腺などの腺を含むがこれに限定されない）に、本開示の１つまたは複数のｒＡＡＶを用いて形質導入することを含む。いくつかの態様では、形質導入は組織特異性制御要素を含む遺伝子カセットを用いて行われる。例えば、本開示の一実施形態は、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなどのアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御エレメント［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、ならびにマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、急収縮性骨格トロポニンＣ遺伝子、遅収縮性心筋トロポニンＣ遺伝子、および遅収縮性心筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御エレメント：低酸素誘導性核因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１）］、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導性エレメントおよびプロモーター［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい］、ｔＭＣＫプロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：１４８９－１４９９（２００８）を参照されたい］、ＣＫ６プロモーター［Ｗａｎｇら、上記を参照されたい］、ならびに他の制御エレメントに由来するものを含むが、これらに限定されない筋特異的制御エレメントによって指向される筋細胞および筋組織を形質導入する方法を提供する。
ＡＡＶは、ＤＵＸ４を発現する罹患した器官全てを標的とするため、本開示は、阻害性ＲＮＡをコードするＤＮＡの、対象の全細胞、組織、および器官への送達を含む。いくつかの態様では、血管系、中枢神経系、筋組織、心臓および脳はインビボでのＤＮＡ送達のための誘引標的である。本開示は、形質導入された細胞からのＤＵＸ４阻害性ｇＲＮＡの持続発現を含み、ＤＵＸ４発現に影響を与える（例えば、ノックダウンまたは発現の阻害）。いくつかの態様では、本開示は、形質導入された筋線維からのＤＵＸ４阻害性ｇＲＮＡの持続発現を含む。「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織に由来する骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。こうした筋細胞はいくつかの態様では、筋原細胞、ミオサイト、筋管、心筋細胞および心筋原細胞などに区別されるか、または区別されない。
さらに別の態様では、本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を防止または阻害する方法を提供し、これには、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ｇＲＮＡをコードするｒＡＡＶと接触させることが含まれ、ｇＲＮＡは、配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載の配列と約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、ＤＵＸ４の発現は、少なくとも約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００パーセント阻害される。
さらに別の態様では、本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を防止または阻害する方法を提供し、これには、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ｇＲＮＡをコードするｒＡＡＶと接触させることが含まれ、ｇＲＮＡは、配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ＤＵＸ４の発現は、少なくとも約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００パーセント阻害される。
さらに別の態様では、本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を防止または阻害する方法を提供し、これには、細胞を、ＤＵＸ４阻害性ｇＲＮＡおよびＣａｓ１３ｂ定方向反復をコードするベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターと接触させることが含まれ、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１３ｂ反復は、配列番号２５～３５および５９～６２に記載のヌクレオチド配列、またはそのバリアントによってコードされる。別の態様では、本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を防止または阻害する方法を提供し、これには、細胞を、プロモーターをコードするヌクレオチド配列、ＤＵＸ４阻害性ｇＲＮＡ、ならびに配列番号３８～４８および６３～６６に記載のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含むＣａｓ１３ｂ定方向反復を含むベクターと接触させることが含まれる。いくつかの態様では、そのバリアントは、配列番号２５～３５および５９～６２または３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載の配列と少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有する。いくつかの態様では、ＤＵＸ４の発現は、少なくとも約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００パーセント阻害される。
さらに別の態様では、本開示は、筋ジストロフィー（ＦＳＨＤを含むがこれに限定されない）を予防または治療する方法を提供し、これには、Ｕ６プロモーター配列、ＤＵＸ４を標的とするｇＲＮＡ配列、およびＣａｓ１３ｂ定方向反復配列を含むポリヌクレオチド配列をコードするベクターを対象に投与することを含み、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３～１３および５１～５４、２５～３５および５９～６２、または３８～４８および６３～６６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復配列は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ベクターはＡＡＶである。いくつかの態様では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＲＮＡを編集するＣａｓ１３タンパク質と共に使用される。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３は、配列特異的ｇＲＮＡを使用して目的の転写産物に特異的に指向される。
いくつかの態様では、本開示は、ＤＵＸ４遺伝子を編集するためにＣａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ｂ）と組み合わせて送達される、Ｃａｓ１３ｂ定方向反復配列に結合された本明細書に記載の様々なｇＲＮＡヌクレオチド配列を含む核酸を含む、組換え遺伝子編集複合体を提供する。このような遺伝子編集複合体は、ＤＵＸ４などの疾患関連配列が異常に発現される場合、特にＲＮＡレベルで、ＤＵＸ４の発現を操作するため、および筋ジストロフィーなどの異常なＤＵＸ４発現に関連する遺伝性疾患を治療するために使用される。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、プログラム可能な単一エフェクターＲＮＡガイドＲＮａｓｅｓ Ｃａｓ１３を含む。Ｃａｓ１３酵素は、堅牢なノックダウンが可能であり、哺乳類細胞の転写産物に対して触媒的に不活性なＣａｓ１３を使用することによってＲＮＡ編集を示す（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４；３５８（６３６６）：１０１９－１０２７，２０１７）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３が原核生物由来であり、より伝統的な遺伝子置換戦略を使用して標的細胞に送達されるため、標的遺伝子発現停止を達成するために内因性酵素に依存しない。ＤＵＸ４を標的とするために本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３系は、発現停止を改善するために、単独で、または阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）と組み合わせて使用され得る。ＲＮＡｉはＤＵＸ４発現停止を効率的に達成するが、ＲＮＡｉによる発現停止は、標的ＤＵＸ４遺伝子の１００％の発現停止を誘発することはめったにない。したがって、いくつかの態様では、本開示は、他のＲＮＡｉ製品と組み合わせた本明細書に記載の組換え遺伝子編集系およびＤＵＸ４遺伝子を標的とする方法の両方の使用を提供する。
「治療」には、筋消耗、筋力低下、筋緊張症、骨格筋の問題、網膜の異常、股関節の筋力低下、顔面の筋力低下、腹筋の筋力低下、関節および脊椎の異常、下腿の筋力低下、肩の筋力低下、聴力損失、筋肉の炎症、ならびに非対称性筋力低下が含まれるがこれらに限定されない、筋ジストロフィーの１つまたは複数の症状の回復または阻害が含まれる。
分子的、生化学的、組織学的、および機能的エンドポイントは、ＲＮＡのＣａｓ１３タンパク質編集およびヒト染色体４ｑ３５上のＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための本明細書に開示される方法を含むＲＮＡ干渉に基づく製品の治療効果を示す。本開示によって企図されるエンドポイントは、ＦＳＨＤおよびＤＵＸ４発現の上昇に関連する他の障害を含むがこれらに限定されない筋ジストロフィーの治療に適用される、ＤＵＸ４タンパク質発現の低下または排除のうちの１つまたは複数を含む。
本開示はまた、本明細書に記載の障害の治療に使用するためのキットを提供する。このようなキットは、薬学的に許容される担体中に、上述される核酸のいずれかまたは上述されるウイルスベクターのいずれかを含む少なくとも第１の滅菌組成物を含む。別の成分は、任意選択で、治療組成物の投与のための適切な容器およびビヒクルと共に、障害を治療するための第２の治療薬である。キットは、任意選択で、第１および第２の組成物の送達を懸濁、希釈、または実施するための溶液または緩衝液を含む。
一実施形態では、このようなキットは、密封ボトルまたは容器（ｖｅｓｓｅｌ）などの容器の中にパッケージングされた希釈剤中に核酸またはベクターを含み、核酸またはベクターの使用を説明するラベルが容器に貼付されているかまたはパッケージに含まれている。一実施形態では、希釈剤は、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気の量）が非常に小さいように容器内にある。好ましくは、ヘッドスペースの量はごくわずかである（すなわち、ほとんどない）。
いくつかの態様では、製剤は安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱もしくは凍結中に発生するものなどの悪条件から製剤を保護し、かつ／または安定状態での製剤の安定性もしくは貯蔵寿命を延長する物質または賦形剤を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース、およびマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシンまたはグルタミン酸などのアミノ酸、ならびにヒト血清アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、製剤は、抗菌性防腐剤を含む。「抗菌性防腐剤」という用語は、使用されるバイアルまたは容器に繰り返し穿刺したときに導入される可能性のある微生物の成長を阻害する、組成物に添加される任意の物質を指す。抗菌性防腐剤の例としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、およびフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、キットは、キットに提供される試薬の使用を説明するラベルおよび／または説明書を含む。キットはまた、任意選択で、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つまたは複数を送達するためのカテーテル、注射器、または他の送達デバイスを含む。
この文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、または段落、またはセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形例よりも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。属として記載される開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様と見なされる。「ａ」または「ａｎ」で記載または請求される本開示の態様に関して、文脈がより限定された意味を明確に要求しない限り、これらの用語は「１つまたは複数」を意味することを理解されたい。本開示の態様が特徴を「含む」と記載される場合、実施形態もその特徴「からなる」または「から本質的になる」と企図される。
本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、本開示と矛盾しない範囲内において、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。
本開示の態様および実施形態は、以下の実施例によって図示されるが、これらは、本発明の範囲を限定することを決して意味するものではない。
実施例１
ＤＵＸ４標的化Ｃａｓ１３ｂ－ｇＲＮＡの設計および試験
ＤＵＸ４標的化Ｃａｓ１３ｂ－ｇＲＮＡの設計
ＤＵＸ４標的化Ｃａｓ１３ｂ－ｇＲＮＡを設計した。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）由来のＣａｓ１３ｂ酵素および関連するｇＲＮＡをこの研究で使用した。ＤＵＸ４特異的ｇＲＮＡを設計するために、ｍｉ４０５、ｍｉ４０６、およびｍｉ１１５５などのリードマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ｍｉＤＵＸ４コンストラクトと位置が一致するように標的化配列を選択した。米国特許第９，４６９，８５１号を参照されたい。ＰｓｐＣａｓ１３ｂ ｇＲＮＡの構造およびそれらの標的部位を図１に示す。ヒトＵ６プロモーターを含むｇＲＮＡ配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）によって合成された。ヒトコドン最適化ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｐｃ００４６）を発現するプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。
ウエスタンブロットアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞（２５０，０００細胞／ウェル）をトランスフェクションの１６時間前に２４ウェルプレートに播種した。翌朝、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳ）を使用して、９００ｎｇのＰｓｐＣａｓ１３ｂおよび１８００ｎｇのｇＲＮＡプラスミドを細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの８～１０時間後に培地を交換し、１８０ｎｇのＤＵＸ４プラスミドを細胞に再トランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、プロテアーゼ阻害剤を含むカクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）に細胞を溶解した。タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定した。２０μｇの各総タンパク質試料を１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで実行した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質バンドの分子量を決定した。タンパク質を、半乾燥転写法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。膜を５％脱脂乳で遮断し、次いで、一次モノクローナルマウス抗ＤＵＸ４（１：５００；Ｐ４Ｈ２、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）またはウサギポリクローナル抗αチューブリン抗体（１：１，０００；ａｂ１５２４６、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄後の翌日、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１００，０００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で、室温で１時間プローブした。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）での短時間のインキュベーション後、Ｘ線フィルム上に相対的タンパク質バンドが発生した。
細胞死アッセイ
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（５０，０００細胞／ウェル）に、ＤＵＸ４、Ｃａｓ１３ｂ、およびｇＲＮＡ発現プラスミドを同時トランスフェクトし、９６ウェルプレートにプレーティングした。蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、トランスフェクションの４８時間後に、細胞死を、Ａｐｏ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定した。個々のアッセイは３つ組で実施され（ｎ＝３）、データは、ＤＵＸ４のみをトランスフェクトした対照に対する平均カスパーゼ活性として報告された。結果を図２Ｂに示す。
生存率アッセイ
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（２５０，０００細胞／ウェル）に、ＤＵＸ４、Ｃａｓ１３ｂ、およびｇＲＮＡ発現プラスミドを同時トランスフェクトし、２４ウェルプレートにプレーティングした。５％ＣＯ２で、３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞をトリプシン処理し、１ｍｌの増殖培地に回収した。自動細胞計数は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳ）を使用して実施した。次いで、血球計数器およびトリパンブルー染色を使用した従来の細胞計数で結果を確認した。データは、実験ごとの平均総細胞数として報告された。エラーバーはＳＤを示す。結果を図２Ｃに示す。
ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ
Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，ＶＶＰＤ－１００１）を使用して、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡプラスミド（それぞれ３および６μｇ）を、ＦＳＨＤ筋芽細胞に同時トランスフェクトした［１５Ａ細胞（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１（２０）：４４１９－３０，２０１２）；５００，０００ ｃｅｌｌｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ］。次いで、ＦＳＨＤ筋芽細胞を、筋芽細胞成長培地を含む２４ウェルプレートの２つのウェルのガラスカバースリップ上で培養した。２４時間後、成長培地を分化培地に交換し、細胞を７日間筋管に分化させた。筋管を、室温で３０分間、４％ＰＦＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に固定した。次いで、室温でそれぞれ５分間、５０％、７０％、および１００％のエチルアルコール勾配で脱水した。製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＨＤ Ａｓｓａｙ Ｂｒｏｗｎ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、設計されたＤＵＸ４プローブで細胞を染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１顕微鏡で、画像を撮影した。
ＤＵＸ４バイオマーカーの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡプラスミド（それぞれ３および６μｇ）を、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，ＶＶＰＤ－１００１）を使用してＦＳＨＤ筋芽細胞（１５Ａ、５００，０００細胞／反応）に同時トランスフェクトし、次いで、１２ウェルプレートで培養した。２４時間後、成長培地を廃棄し、筋芽細胞を筋管に分化させることを目的とした細胞に新しい分化培地を加えた。細胞を７～９日間分化させた。全ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して抽出した。単離されたＲＮＡの質および量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で調べた。次いで、単離されたＲＮＡをＤＮａｓｅ処理し（ＤＮＡ－Ｆｒｅｅ，Ａｍｂｉｏｎ，ＴＸ）、ランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＲＴ－ＰＣＲに使用した。その後のｃＤＮＡ試料は、次いで、事前に設計されたＰＲＡＭＥＦ１２（ＤＵＸ４活性のバイオマーカー）およびヒトＲＰＬ１３Ａ対照プライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＴａｑｍａｎ Ａｓｓａｙのテンプレートとして使用された。各試料は２つ組で行われた。全てのデータは、Ｃａｓ１３ｂ発現試料に対して正規化された。
実施例２
ＤＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ
細菌性免疫系であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、哺乳類細胞のゲノムまたはＲＮＡ編集に使用されている。この研究の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３アプローチを標的とするＤＵＸ４遺伝子発現停止ＲＮＡを使用して、ＦＳＨＤなどの筋ジストロフィーの前向き治療法を開発することであった。これを行うために、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡを標的とする１１の異なるＣａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ（図１）が操作された。各ｇＲＮＡ配列をＵ６プロモーター駆動型発現カセットにクローン化し、インビトロスクリーニングアッセイを実施して、リードＤＵＸ４標的化ｇＲＮＡを特定した。
Ｃｏｘら（上記）によると、この研究で使用されたＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）由来のＣａｓ１３ｂ酵素は、哺乳類のＲＮＡ編集に非常に効率的なＣａｓ１３酵素である。Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡには、哺乳類細胞に干渉する任意の特定のプロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）の制約はないが、５’末端またはデュアル３’および５’末端のＧ塩基は、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ酵素の効率をわずかに増加させる可能性がある（Ｃｏｘら、上記）。強いＰＦＳ優先度がないため、所望のｍＲＮＡの任意の部分を標的配列として選択することができ、関連する逆相補配列をＣａｓ１３ｂ ｇＲＮＡで使用することができる。以前は、研究者は、各方法の効率のより良い比較を容易にするために、ｓｈＲＮＡの位置が一致するｇＲＮＡを使用した（Ｏｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０（７６７５）：２８０－４，２０１７）。
この実験では、ｍｉ４０５、ｍｉ４０６、およびｍｉ１１５５などのいくつかのｍｉＤＵＸ４ ＲＮＡ配列と位置が一致するように標的化配列を選択した（米国特許第９，４６９，８５１号を参照されたい）。これらのｍｉＲＮＡがＤＵＸ４ ｍＲＮＡの量の大幅な低下を示したため、標的ｍＲＮＡ配列は、標的化ｍｉＲＮＡ、続いて位置が一致するｇＲＮＡのための良好なアクセス可能性（解放または部分的解放構造）を有すると理論付けられた。ＰｓｐＣａｓ１３ｂ ｇＲＮＡの標的部位を図１Ａ～Ｂに示す。各ｇＲＮＡの配列は、配列番号３～１３および５１～５４に記載される。各ｇＲＮＡのＤＵＸ４ ＤＮＡ標的配列は、配列番号１４～２４および５５～５８に記載される。
実施例３
ＤＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡの選択
本明細書に開示されるｄＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ配列は、ＤＵＸ４タンパク質およびその毒性を減少させるそれらの能力のために選択された。
各ｇＲＮＡプラスミドは、Ｃａｓ１３ｂプラスミドおよびＤＵＸ４プラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。タンパク質レベルでＤＵＸ４を発現停止させる各ｇＲＮＡの能力を調査した（図２Ａ）。試験した各ｇＲＮＡは、インビトロでＤＵＸ４タンパク質の発現を低下させることがわかった。
次いで、各ｇＲＮＡを、カスパーゼ３／７アッセイを介してトランスフェクトされた細胞においてＤＵＸ４誘導アポトーシスを低減するその能力について試験した。各ｇＲＮＡは、ＤＵＸ４（対照）のみをトランスフェクトした細胞と比較して、カスパーゼ３／７活性を低下させた（図２Ｂ）。行われた細胞生存率アッセイは、各ｇＲＮＡが処理された細胞の生存率を増加させること、すなわち、ＤＵＸ４誘導アポトーシスを低下させることを示した（図２Ｃ）。
ＨＥＫ２９３細胞に異なる比率のＤＵＸ４：Ｃａｓ１３ｂ発現プラスミドを同時トランスフェクトして、異なる比率がより効果的かどうかを決定し、ウエスタンブロットアッセイを行ってＤＵＸタンパク質発現に対する作用を調べた。試験した全ての比率は、ＤＵＸ４タンパク質量の減少を示した（図２Ｄ）。
実施例４
ＲＮＡｓｃｏｐｅインサイツハイブリダイゼーションは、処理されたＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４ ｍＲＮＡ量の有意な減少を示した。
ＲＮＡレベルでのＤＵＸ４発現停止を調査するために、特別に設計されたＤＵＸ４標的化プローブを使用して、筋管に分化した処理されたＦＳＨＤ筋芽細胞およびＲＮＡｓｃｏｐｅインサイツハイブリダイゼーションを行った。
未処理のＦＳＨＤ筋管は高レベルのＤＵＸ４ ｍＲＮＡを示したが（図３Ａ）、Ｃａｓ１３ｂを用いたＤＵＸ４を標的としたｇＲＮＡで処理した全ての試料は、茶色の染色から明らかであるように、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡの量が大幅に低下した（図３Ｄおよび図３Ｅ）。実際、Ｃａｓ１３ｂを用いたＤＵＸ４を標的とするｇＲＮＡで処理された試料は、健康な筋管で観察されたレベルと同様のＤＵＸ４ ｍＲＮＡレベルを示した（図３Ｂ（対照））。Ｃａｓ１３ｂのみ（対照）での処理は、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡレベルのいくらかの低下をもたらした（図３Ｃ）が、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡレベルは依然として健康な対照のレベルよりも高く（図３Ｂ）、Ｃａｓ１３ｂ対照（図３Ｃ）とＤＵＸ４標的化ｇＲＮＡ－Ｃａｓ１３ｂで処理された試料（図３Ｄおよび３Ｅ）との間に有意な差があった。
実施例５
処理された細胞におけるＰＲＡＭＥＦ１２バイオマーカー発現レベルの減少は、ＤＵＸ４活性の低下を示す
Ｃａｓ１３ｂを用いたＤＵＸ４を標的とするｇＲＮＡの導入によってもたらされるＤＵＸ４標的の遺伝子発現の減少を決定するために、ＰＲＡＭＥＦ１２特異的プローブおよびプライマーを使用して、定量的ＲＴ－ＰＣＲを行って、ＤＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ－Ｃａｓ１３ｂ配列で処理したＦＳＨＤ筋管におけるＰＲＡＭＥＦ１２発現（すなわち、ＤＵＸ４活性を示すバイオマーカー）を測定した。ＦＳＨＤに罹患したヒト筋芽細胞（１５Ａ）に、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡを発現するプラスミドを同時トランスフェクトし、その後、７日間超筋管に分化させた。全ＲＮＡを、製造行業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）により単離した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ゲノムＤＮＡを排除した後、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して生成された。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応は、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。次のプログラムをｑＰＣＲ分析に使用した：９５℃で１０分間の１サイクルの変性、６０℃で１分間の後に９５℃で１５秒間の３９サイクル、４０℃での１サイクルの冷却。Ｈｕｍａｎ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１３Ａ（ＲＰＬ１３Ａ）を参照遺伝子として使用した。データを、相対的な遺伝子発現を計算するために、Ｄｅｌｔａ－Ｄｅｌｔａ－ＣＴ（２－ΔΔＣＴ）アルゴリズムにより分析した。ＰＲＡＭＥＦ１２の発現は、陰性対照としてＣａｓ１３ｂトランスフェクトされた筋管のみに正規化された。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、およびｇＲＮＡ９で処理されたＦＳＨＤ筋管は、Ｃａｓ１３ｂ単独またはＣａｓ１３ｂ＋ｇＲＮＡ１２トランスフェクトされた細胞と比較して、ＰＲＡＭＥＦ１２発現を有意に低下させた（ｇＲＮＡ３で処理された細胞で最大８０％）（図４を参照されたい）。
実施例６
有効投薬量の決定
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡの用量漸増実験を行って、ＤＵＸ４ノックダウンの有効用量範囲を定義する。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３法を使用してＤＵＸ４遺伝子発現停止の効率を高めるために、各リードｇＲＮＡの組み合わせを同じプラスミド骨格にクローン化し、ＤＵＸ４の発現、およびＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＰＲＡＭＥＦ２、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＴＲＩＭ４３、ＬＥＵＴＸなどの様々なＤＵＸ４バイオマーカーの発現を調べることによって、ＦＳＨＤ患者の筋芽細胞株におけるＤＵＸ４の発現を阻害するそれらの能力について試験した。このようなＦＳＨＤ筋芽細胞株には、例えば、Ｗｅｌｌｓｔｏｎｅ１７Ａ、１２Ａ、１８Ａなどが含まれるが、これらに限定されない（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１（２０）：４４１９－３０，２０１２）。ＤＵＸ４発現およびＤＵＸ４バイオマーカー発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはＲＮＡｓｃｏｐｅインサイツハイブリダイゼーションにより分析する。
実施例７
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡのパッケージング
本明細書に記載のＣａｓ１３ｂおよび様々なｇＲＮＡは、インビボでのＤＵＸ４発現停止の有効性を試験するためにＡＡＶベクターにパッケージングされる。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡは２つの異なるＡＡＶベクターにパッケージングされる。ＰｓｐＣａｓ１３ｂ遺伝子は、３２７０ヌクレオチド配列であり、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）とも呼ばれる（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４；３５８（６３６６）：１０１９－１０２７，２０１７）。この配列を含むプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入し（カタログ番号：１０３８６２、プラスミド名：ｐＣ００４６－ＥＦ１ａ－ＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ＮＥＳ－ＨＩＶ）、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクターにパッケージングするのに十分なサイズである。様々な態様では、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子発現カセットは、ミニＣＭＶプロモーターなどの短くて弱いプロモーター、またはコンパクトｕｎｃ４５ｂなどの骨格筋特異的プロモーター、およびＣＫ６もしくはｔＭＣＫなどの最小ＭＣＫプロモーターを使用して構築される。いくつかの態様では、本明細書に記載のＣａｓ１３ｂ配列の最初に存在するコザック配列、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ＨＩＶ核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、およびＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナルなどの調節配列が、翻訳の効率およびｍＲＮＡの安定性を高めるカセットに加えられる。例えば、コザック、ＷＰＲＥ、およびＨＩＶ ＮＥＳ配列は、Ｃａｓ１３ｂプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ（ＰＣ００４６）、配列番号３６を参照されたい）に存在する。
様々な態様では、ｇＲＮＡは、異なるプロモーター、例えば、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、ｍｉｎｉＣＭＶ、Ｔ７、または最小ＥＦ１－アルファなどのプロモーター下で発現される。具体的には、この戦略は、単一の骨格内の複数のコピーで同じｇＲＮＡのより効率的な発現を提供することが企図される。各ｇＲＮＡの複数のコピーまたは２つ以上のｇＲＮＡの組み合わせを含むＡＡＶプロウイルスプラスミドが作製され、ＡＡＶ粒子の作製に使用される。各ｇＲＮＡは、独自のプロモーター、標的化配列、Ｃａｓ１３ｂ ｇＲＮＡ定方向反復、および末端シグナルでクローン化される。これらのコンストラクトは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターにパッケージングするのに十分小さい。ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ２を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶベクターの異なる血清型が生成され、試験される。上述されるように、本開示の製品および方法と共に使用するために全ての種類のベクターが含まれるため、本開示はこれらのＡＡＶベクターに限定されない。Ｃａｓ１３ｂまたはｇＲＮＡ発現カセットを有するＡＡＶ粒子は、Ｒａｓｈｎｏｎｅｊａｄら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８（１）：３０－６，２０１６）およびＧａｏら（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ： Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ： Ｇｒｅｅｎ ＭＲ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｖｏｌ．２．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２０１２．ｐｐ．１２０９－１３１３）によって記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞の一過性三重トランスフェクションにより作製される。
実施例８
ＤＵＸ４マウスモデルでの試験
ＡＡＶベクターにパッケージングされたＣａｓ１３ｂおよび様々なｇＲＮＡは、様々なマウスモデル、例えば、最近公開されたＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスモデル（Ｇｉｅｓｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，３（２２）：ｅ１２３５３８，２０１８）および／または以前に公開されたｉＤＵＸ４ｐＡマウスモデル（Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：５５０，２０１７）において、インビボでのＤＵＸ４発現停止における有効性について試験される。筋肉内注射（ＩＭ）または血管内注射は、ＡＡＶベクターをマウスに送達するために使用される。ＤＵＸ４の発現は、強制経口投与を介したタモキシフェン（ＴＩＣ－ＤＵＸ４）またはドキシサイクリン（ｉＤＵＸ４ｐＡ）投与によって活性化される。治療されたマウスの筋肉組織学、分子分析、身体活動、および生理学的分析は、記載されるように実施される（Ｇｉｅｓｉｇｅら、上記）。
実施例９
ＤＵＸ４マウスモデルでの試験
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡベクターの安全性、毒性学、および有効性を決定するために、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ１３酵素、およびそれらの組み合わせを発現するＡＡＶベクターの用量漸増実験を行う。
安全性研究のために、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ１３酵素、およびそれらの組み合わせを有する様々な用量のＡＡＶベクターを、成体マウス（７～８週齢）の筋肉内（ＩＭ、４０ｕｌ＝ＴＡ、１００ｕｌ＝ＧＡＳ）または尾静脈注射により野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのマウスに投与する。ＩＶ投与の場合、容量はマウスの体重／血液量に依存し、動物の総体重の１０％を超えないようにする。ＡＡＶの用量は、いくつかの態様では、１Ｅ８ ＤＮＡｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）から１Ｅ１３ ＤＲＰ以上の範囲であり、野生型マウスで無毒であることが示されているものは、ＦＳＨＤ動物の保護特性について試験される。
表現型、組織病理学、筋肉変性、筋肉再生、および分子分析は、異なる時点で測定される。様々な態様では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射したマウスを対照として使用する。マウスに高用量のケタミン／キシラジンを与えた後、異なる時点でマウスを安楽死させる。組織学、分子分析、および病理学的分析のために、様々な筋肉および器官が抽出および単離される。
ＴＩＣ－ＤＵＸ４または／およびｉＤｕｘ４ｐＡマウスでのＤＵＸ４発現が誘導される。野生型マウスの用量漸増研究で安全であり、毒性を引き起こさないことが示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ１３の最高用量のいくつかが試験される。ｇＲＮＡおよびＣａｓ１３ｂなどのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分のＡＡＶ送達は、新生仔または若い成体マウスで実施される。新生仔の注射は生後１日目から３日目に行われる。１０マイクロリットルの容量は、筋肉内または側頭静脈注射のいずれかによる新生仔の注射に使用される。成体の注射は、筋肉内または尾静脈注射のいずれかによって実施される。Ｃａｓ１３／ｇＲＮＡ遺伝子送達後の様々な時点で、動物の血液、器官、および肢の筋肉を試験し（強度および活動パラメーターの測定を含む）、かつ／または治療効果を決定するための様々な分子、組織学的、機能的、および生理学的分析のために収集する。
実施例１０
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡプラスミドのトランスフェクション後に減少したＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４活性
本明細書に開示されるＤＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ配列がＤＵＸ４タンパク質活性を減少させることができるかどうかを決定するために、５００，０００のＦＳＨＤ筋芽細胞（１５Ａ）に３μｇのＣａｓ１３ｂおよび６μｇのｇＲＮＡプラスミドを電気穿孔した。次いで、分化培地を加えた後、細胞を７日間筋管に分化させた。製造業者のプロトコルに従って、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）方法を使用して全ＲＮＡを単離し、３つのＤＵＸ４活性バイオマーカー、すなわち、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、およびＰＲＡＭＥＦ１２に対してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
ＤＵＸ４バイオマーカーの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡプラスミド（それぞれ３および６μｇ）を、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，ＶＶＰＤ－１００１）を使用してＦＳＨＤ筋芽細胞（１５Ａ、５００，０００細胞／反応）に同時トランスフェクトし、次いで、１２ウェルプレートで培養した。２４時間後、成長培地を廃棄し、筋芽細胞を筋管に分化させることを目的とした細胞に新しい分化培地を加えた。細胞を７～９日間分化させた。全ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して抽出した。単離されたＲＮＡの質および量をＮａｎｏｄｒｏｐにより調べ、次いで、ＤＮａｓｅ処理し（ＤＮＡ－Ｆｒｅｅ，Ａｍｂｉｏｎ，ＴＸ）、ランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＲＴ－ＰＣＲに使用した。その後のｃＤＮＡ試料は、次いで、事前に設計されたＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、およびＰＲＡＭＥＦ１２（ＤＵＸ４活性のバイオマーカー）およびヒトＲＰＬ１３Ａ対照プライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＴａｑｍａｎ Ａｓｓａｙのテンプレートとして使用された。各試料を３つ組で行い、実験を３回繰り返した。全てのデータは、Ｃａｓ１３ｂ発現試料に対して正規化された。
図６Ａ～Ｃは、Ｃａｓ１３ｂおよび様々なｇＲＮＡプラスミドによるトランスフェクション後のＤＵＸ４活性に対する、様々なＤＵＸ ４標的（バイオマーカー）、すなわちＴＲＩＭ４３（図６Ａ）、ＭＢＤ３Ｌ２（図６Ｂ）、およびＰＲＡＭＥＦ１２（図６Ｃ）の相対的発現レベルの減少によって示されるＤＵＸ４活性の阻害のｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。参照遺伝子としてヒトＲＰＬ１３Ａを使用した。これらのバイオマーカーの発現レベルは、陰性対照としてＣａｓ１３ｂのみをトランスフェクトされた筋管に正規化された。３つのバイオマーカーのそれぞれの発現レベルは、Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡでトランスフェクトした後、Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされた細胞のみと比較して低下した。
Ｃａｓ１３ｂトランスフェクトされた細胞（対照）と比較して、試験した全てのｇＲＮＡは、３つ全てのバイオマーカーの発現レベルを低下させることができた（図６Ａ～Ｃ）。
これらの実験は、本明細書に開示されるｇＲＮＡ配列が、ＤＵＸ４のバイオマーカーの発現の減少によって示されるように、ＤＵＸ４活性の低下に成功したことを示す。これらの実験は、１つのＡＡＶベクタープラスミドにおけるｇＲＮＡ配列の複数のコピーがＤＵＸ４バイオマーカーの発現を減少させるのに効果的であることも示す。
実施例１１
追加のＤＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡの選択
追加のＤＵＸ４－ｍＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ配列（すなわち、ｇＲＮＡ １３～１６）は、ＤＵＸ４タンパク質およびその毒性を減少させるそれらの能力のために設計および選択された。
ガイドＲＮＡ１３および１４は、ＤＵＸ４ポリＡシグナル（ＰＬＡＭ）、
ｇＲＮＡ １３標的化部位：ＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣ（配列番号５５）、および
ｇＲＮＡ１４標的化部位：ＧＴＧＣＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＡＡＧＧＧＡＧＣ（配列番号５６）を標的とするように設計された。
ガイドＲＮＡ１５および１６は、ＤＵＸ４エクソン１、
ｇＲＮＡ１５標的化部位：ＴＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣ（配列番号５７）、および
ｇＲＮＡ１６標的化部位：ＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣ（配列番号５８）を標的化するように設計された。
これらの追加のｇＲＮＡは、本明細書に記載の実験においても試験され、ＤＵＸ４発現の低下に効果的であることが示された。
実施例１２
Ｃａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡによって発現停止されたＤＵＸ４－ｍＲＮＡの発現
ＤＵＸ４を発現停止する各ｇＲＮＡの能力は、ルシフェラーゼアッセイおよびインビトロ蛍光アッセイを使用して調査された。
ルシフェラーゼアッセイ
二重ルシフェラーゼレポータープラスミドは、トランスフェクション対照として機能するホタルルシフェラーゼカセット、および３’ＵＴＲとして機能するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ停止コドンの下流にクローン化されたヒトＤＵＸ４遺伝子（コード領域とイントロンを含む３’ＵＴＲ）を用いてＰｓｉｃｈｅｃｋ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）から変更された（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＦＳＨＤ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．）。ＨＥＫ２９３細胞に、ルシフェラーゼＤＵＸ４レポーター、Ｃａｓ１３ｂ、および個々のＵ６．ｇＲＮＡ発現プラスミドを１：６：２８のモル比で同時トランスフェクト（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）した。ＤＵＸ４遺伝子発現停止は以前に記載されたように決定された（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＤＵＸ４－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｓｃｌｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＦＳＨＤ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２；２０：１４１７－１４２３．）３つ組のデータを実験ごとに平均し、個々の実験を３回実施した。結果は、全ての組み合わせ実験について、ホタルルシフェラーゼ活性に対するＲｅｎｉｌｌａの平均比±ＳＤとして報告された。
全てのｇＲＮＡはＤＵＸ４を標的とし、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現を低下させることができた。この特定のアッセイで見られた最も重要な発現停止は、ｇＲＮＡ１、２、および１５によって達成された（図７）。
インビトロ蛍光アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に、３’ＵＴＲとしてｍＣｈｅｒｒｙ停止コドンの下流にクローン化されたヒトＤＵＸ４遺伝子（コード領域およびイントロンを含む３’ＵＴＲを）を含むプラスミド、ならびにＣａｓ１３ｂおよびｇＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２）を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞の写真を撮影した。
非標的化ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１２）と比較して、またはＣａｓ１３ｂのみをトランスフェクトした細胞と比較して、ｇＲＮＡ１および２で処理した細胞ではｍＣｈｅｒｒｙの発現（ＤＵＸ４発現の指標として）が大幅に低下した（図８）。
試験した各ｇＲＮＡは、インビトロでＤＵＸ４の発現を低下させることがわかった。
実施例１３
新生仔ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスモデルでの試験
ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスは、タモキシフェンによって誘発され、軽度で進行性の筋病理を発症させる可能性がある。したがって、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスは、筋病理を発症させ、Ｃａｓ１３および本開示のｇＲＮＡの投与が筋病理に及ぼす作用を測定するために１ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを週に３回受けた。マウスを治療し、Ｃａｓ１３およびｇＲＮＡ１で治療した後、異なる時間に屠殺した。
ＷＡＰ ４ジスルフィドコアドメインタンパク質３（ＷＦＤＣ３）の発現レベルは、進行性筋病理の指標としてタモキシフェン治療のみで、マウスの筋肉（前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、および三頭筋（ＴＲＩ））で経時的に（図９Ａ）増加した。ＤＵＸ４を介した筋損傷は、経時的に（３０、３７、および４４日）マウスの筋肉（ＴＡおよびＧＡＳ）で増加した（図９Ｂ）。
１～２日齢のＴＩＣ－ＤＵＸ４の仔は、５ｅ１０ ＡＡＶ．Ｃａｓ１３ およびＡＡＶ．ｇＲＮＡ１の片側同時注射を受けた。４週間後、マウスは１ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを週３回、４週間受け始めた。治療された筋肉におけるＷＦＤＣ３の発現は、同じマウスの未治療の筋肉に対して正規化された。新生仔マウスの筋肉（ＴＡ（図９Ｃ）、Ｑｕａｄ（図９Ｄ）、およびＧａｓ（図９Ｅ））におけるＷＦＤＣ３の発現レベル（定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定される）は、Ｃａｓ１３およびｇＲＮＡ１での治療後に減少し、有意な低下を示した（＊Ｐ＜０．０２）（図９Ｄ）。
この研究は、インビボでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３－ＤＵＸ４系の有効性を示し、インビボでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３を介したＤＵＸ４の発現の阻害の証拠を示す。
実施例１４
ＤＵＸ４毒性の低減およびアポトーシスからの細胞の保護
次いで、各ｇＲＮＡを、カスパーゼ３／７アッセイを介してトランスフェクトされた細胞においてＤＵＸ４誘導アポトーシスを低減するその能力について試験した。
細胞死アッセイ
ＤＵＸ４の毒性を低減し、細胞をアポトーシスから保護するｇＲＮＡの能力を調査するために、カスパーゼ３／７アッセイを行った。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（５０，０００細胞／ウェル）に、３０ｎｇのＤＵＸ４プラスミド、８０ｎｇのＣａｓ１３ｂプラスミド、および３５０ｎｇの各ｇＲＮＡ発現プラスミドを同時トランスフェクトし、９６ウェルプレートにプレーティングした。蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、トランスフェクションの４８時間後に、細胞死を、Ａｐｏ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定した。３つの個々のアッセイは３つ組で実施し（ｎ＝３）、データは、ＤＵＸ４のみをトランスフェクトした対照に対する平均カスパーゼ活性として報告された。
各ｇＲＮＡは、ＤＵＸ４のみ（対照）をトランスフェクトした細胞と比較して、カスパーゼ３／７活性を低下させ（図１０）、ｇＲＮＡ１～１１および１３～１６がＤＵＸ４の毒性を低減し、細胞をアポトーシスから保護したことを示す。行われた細胞生存率アッセイは、各ｇＲＮＡが処理された細胞の生存率を増加させること、すなわち、ＤＵＸ４誘導アポトーシスを低下させることを示した。
実施例１５
インビボでのマウス筋肉におけるＤＵＸ４の発現の阻害
筋肉においてＤＵＸ４を標的とするＡＡＶ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３療法の能力を調査するために、成体マウスに、ＤＵＸ４（１Ｅ９）、ｓｓＡＡＶ６－Ｃａｓ１３ｂ（２．５ Ｅ１０）、およびｓｃＡＡＶ６－ｇＲＮＡ１（５Ｅ１０）、またはＤＵＸ４のみ（１Ｅ９）をＴＡ筋肉に同時注射した。
注射の３週間後、マウスを屠殺し、組織学および分子分析のためにＴＡ筋肉を抽出し、凍結した。本明細書で説明するように、ＤＵＸ４タンパク質は、ヒトおよびマウス細胞における他の遺伝子の転写活性化因子として機能し得る。したがって、ＤＵＸ４標的遺伝子の発現レベルの任意の変化は、ヒトおよびマウスにおけるＤＵＸ４活性の指標として広く使用されている。
マウスにおけるＤＵＸ４活性化バイオマーカーは、ＷＦＤＣ３およびＴＲＩＭ３６である。この実験では、ＷＦＤＣ３プローブおよびプライマーを使用して、治療された、および未治療の筋肉から採取したＲＮＡ／ｃＤＮＡに対してＱＲＴ－ＰＣＲを行った。図１１は、ｓＡＡＶ６－Ｃａｓ１３ｂおよびｓｃＡＡＶ６－ｇＲＮＡ１（５ｅ１０）をマウスＴＡに同時注射した後、ＤＵＸ４（１ｅ９）を注射した３週間後のＤＵＸ４活性化バイオマーカーの発現レベル（ＷＦＤＣ３の相対的発現で示される）の低下を示す。図１１に示すように、未治療の筋肉と比較して、治療された筋肉ではＷＦＤＣ３の発現レベルの８０％を超える低下が検出された。
本開示は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更および修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本開示に課せられるべきである。
本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に記載された表１に明記されている。
Figure 2022516515000001
Figure 2022516515000002
Figure 2022516515000003
Figure 2022516515000004
Figure 2022516515000005
Figure 2022516515000006
Figure 2022516515000007

Claims (43)

  1. 配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、核酸。
  2. 配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、核酸。
  3. Ｃａｓ１３ｂ直接反復配列をさらに含む、請求項１または２に記載の核酸。
  4. 前記Ｃａｓ１３ｂ直接反復が、前記ＤＵＸ４コード化ｇＲＮＡをコードする前記核酸の下流または３’末端に位置する、請求項３に記載の核酸。
  5. 前記Ｃａｓ１３ｂ直接反復配列が、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３７に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項３または４に記載の核酸。
  6. 配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、または配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項５に記載の核酸。
  7. プロモーター配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸。
  8. 前記プロモーターが、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、または骨格筋特異的プロモーターのいずれかである、請求項７に記載の核酸。
  9. 前記筋特異的プロモーターが、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＭＨＣＫ７、またはＣＫ１である、請求項８に記載の核酸。
  10. 配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、または配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項８に記載の核酸。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸を含む、アデノ随伴ウイルス。
  12. 前記ウイルスが、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠損している、請求項１１に記載のアデノ随伴ウイルス。
  13. 前記ウイルスが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１１または１２に記載のアデノ随伴ウイルス。
  14. 前記ウイルスが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  15. 前記ウイルスが、ＡＡＶ－９である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  16. 請求項１１～１５のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  17. 細胞におけるダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害および／または妨害する方法であって、前記細胞を、
    （ａ）請求項１１～１５のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項１６に記載の組成物、および
    （ｂ）Ｃａｓ１３タンパク質、またはそのＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることを含む、方法。
  18. 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである、請求項１８に記載の方法。
  19. 前記Ｃａｓ１３ｂタンパク質が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項１９に記載の方法。
  20. 前記細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある、請求項２０に記載の方法。
  22. 筋ジストロフィーを患っている対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
    （ａ）請求項１１～１５のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項１６に記載の組成物、および
    （ｂ）Ｃａｓ１３タンパク質、またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスを投与することを含む、方法。
  23. 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記Ｃａｓ１３ｂタンパク質が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記細胞を、ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることをさらに含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、またはデスミンプロモーターの制御下にある、請求項２５に記載の方法。
  27. 治療を必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法であって、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することを含み、前記アデノ随伴ウイルスのゲノムが、
    （ａ）配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、
    （ｂ）配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、
    （ｃ）配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、
    （ｄ）配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、または
    （ｅ）その（ａ）～（ｄ）のいずれかの組み合わせ、を含む、方法。
  28. Ｃａｓ１３タンパク質、またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記Ｃａｓ１３ｂタンパク質が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 組換え遺伝子編集複合体であって、
    （ａ）Ｃａｓ１３またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの核酸、および
    （ｂ）ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）をコードする標的核酸配列およびＣａｓ１３ｂ直接反復配列に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの核酸を含み、
    前記複合体が前記標的核酸配列に結合することによって、ＤＵＸ４遺伝子発現が阻害される、組換え遺伝子編集複合体。
  34. 前記ｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列および前記Ｃａｓ１３ｂ直接反復配列を含む前記核酸が、
    （ａ）配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、
    （ｂ）配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、
    （ｃ）配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、
    （ｄ）配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、または
    （ｅ）その（ａ）～（ｄ）のいずれかの組み合わせ、を含む、請求項３３に記載の組換え遺伝子編集複合体。
  35. 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである、請求項３３または３４に記載の組換え遺伝子編集複合体。
  36. 前記Ｃａｓ１３ｂタンパク質が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項３５に記載の組換え遺伝子編集複合体。
  37. ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子編集複合体。
  38. 治療を必要とする対象における癌を治療する方法であって、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することを含み、前記アデノ随伴ウイルスのゲノムが、
    （ａ）配列番号３～１３および５１～５４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、
    （ｂ）配列番号１４～２４および５５～５８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＵＸ４コード化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、少なくとも１つの核酸、
    （ｃ）配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号２５～３５および５９～６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、
    （ｄ）配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３８～４８および６３～６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するそのバリアントを含む、少なくとも１つの核酸、または
    （ｅ）その（ａ）～（ｄ）のいずれかの組み合わせ、を含む、方法。
  39. Ｃａｓ１３タンパク質、またはＣａｓ１３オルソログもしくはバリアントをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂまたはそのＣａｓ１３ｂオルソログもしくはバリアントである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記Ｃａｓ１３ｂタンパク質が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも約８０％の同一性を有するバリアントによってコードされる、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. ＤＵＸ４阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含む、有効量のアデノ随伴ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、ラブドイド癌（またはラブドイド肉腫）、肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺腫、黒色腫、または転移性黒色腫である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
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