JP2022020839A - 筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達 - Google Patents

Abstract

【課題】筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達の提供。【解決手段】本発明は、小型化ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を含む組換えＡＡＶベクター、及び筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減または予防するためにその組換えベクターを使用する方法を提供する。本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ２９を送達することによって結合組織の３つの主要成分（コラーゲン１、コラーゲン３、及びフィブロネクチン）を直接減少させる遺伝子療法を対象とする。このシステムにおいて、ｍｉＲ２９はコラーゲン及びフィブロネクチン遺伝子の３’ＵＴＲに結合して発現を下方調節する。本発明は、マイクロＲＮＡのガイド鎖ｍｉＲ２９を発現する、遺伝子療法ベクター、例えばＡＡＶ、ならびに線維症を軽減及び／または予防するために筋肉にｍｉＲ２９を送達する方法を対象とする。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１６年４月１５日に出願された米国仮出願第６２／３２３，１６３号及び２０１７年３月１７日に出願された米国仮出願第６２／４７３，２５３号の優先権を主張するものであり、その両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野

本発明は、小型化ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような遺伝子療法ベクター、ならびに筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減及び予防するためにこれらのベクターを使用する方法を提供する。本発明はまた、筋線維を損傷から保護し、筋肉強度を増加する併用遺伝子療法を提供する。

運動及び呼吸などの日常活動、ならびに全身代謝のための筋肉量及び強度の重要性は疑う余地がない。筋機能の障害は、筋肉の衰弱及び消耗を特徴とし、生活の質に重大な影響を与える筋ジストロフィー（ＭＤ）を生じる。最もよく特徴付けられたＭＤは、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の突然変異から生じる。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘－細胞骨格テザリングの喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人に１人の新生男児に影響を与える最も壊滅的な筋肉疾患の１つである。

本出願には、ＤＭＤの治療を開発するための２つの変換アプローチが含まれる。線維症浸潤はＤＭＤにおいて深刻であり、いずれの潜在的な療法にとっても重大な障害である。ＤＭＤを有する非常に低年齢の小児に既に存在する線維症の重症度によって遺伝子置換のみが妨害されることを考慮することも重要である。実際、診断の通常の年齢、４～５歳での筋生検は、非常に顕著なレベルの線維症を示す。

ＤＭＤは、ｍＲＮＡの減少及びジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に関連する４２７ｋＤの筋鞘タンパク質であるジストロフィンの非存在をもたらすＤＭＤ遺伝子の突然変異によって引き起こされる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、アクチン結合タンパク質であるジストロフィン及びラミニン結合タンパク質であるα－ジストログリカンを介して細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と細胞骨格との間の構造的連結を形成する筋鞘における複数のタンパク質からなる。これらの構造的連結は、収縮中に筋細胞膜を安定させ、収縮誘発性損傷から保護するように作用する。ジストロフィン喪失と共に、膜の脆弱性は、筋鞘断裂及びカルシウムの流入をもたらし、カルシウム活性化プロテアーゼ及び分節状線維壊死を誘発する（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－７５，１９９７）。筋肉変性及び再生のこの制御されていないサイクルは、最終的に筋幹細胞集団を枯渇させ（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９－７１、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７）、進行性の筋力低下、筋内膜炎症、及び線維症瘢痕形成が生じる。

ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンからの膜安定化なしでは、ＤＭＤは組織損傷及び修復の制御されていないサイクルを示し、最終的に失われた筋線維を結合組織増殖によって線維症瘢痕組織で置換する。線維症は、コラーゲン及びエラスチンを含むＥＣＭマトリックスタンパク質の過剰沈着を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は主に、ストレス及び炎症に応答する活性化線維芽細胞によって放出されるＴＧＦβなどのサイトカインから産生される。ＤＭＤの主要な病理学的特徴は、筋線維の変性及び壊死であるが、病理学的結果としての線維症は、同等の影響を有する。線維症組織の過剰産生は筋再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性筋力低下の一因となる。一研究では、初期ＤＭＤ筋生検での線維症の存在は、１０年間の追跡調査での運動転帰不良と非常に相関していた（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７）。これらの結果は、線維症がＤＭＤ筋機能不全の主な原因であることを指摘し、線維症組織を減少させる療法を開発する必要性を強調する。ｍｄｘマウスで試験されたほとんどの抗線維症療法は、ＴＧＦβ経路の阻害によって線維症サイトカインシグナル伝達をブロックするように作用する。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基との対合、翻訳の阻害、またはｍＲＮＡ分解の促進により、転写後レベルで遺伝子サイレンシングを媒介する～２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの５’末端の７ｂｐのシード配列はｍｉＲＮＡを標的とし、追加の認識は、標的配列の残部、およびその二次構造によって提供される。ｍｉＲＮＡは、筋疾患病理において重要な役割を果たし、問題の筋ジストロフィーのタイプに一意的に依存する発現プロファイルを示す（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１）。ｍｉＲＮＡが心臓、肝臓、腎臓、及び肺を含む多くの器官における線維症プロセスに関与していることを示唆する証拠が増えている（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１）。最近、ｍｉＲ－２９の下方調節は、心臓線維症の一因となることが示され（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，２０１０．１２（４）：ｐ．３４１－５１）、ｍｉＲ－２９の発現の減少は、ヒトＤＭＤ患者の筋肉と遺伝的に関連していた（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２）。ｍｉＲ－２９ファミリーは、２つのバイシストロン性ｍｉＲＮＡクラスターから発現する３つのファミリーメンバーからなる。ＭｉＲ－２９ａは、ｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１）と同時発現し、ｍｉＲ－２９ｃは、ｍｉＲ－２９ｂの第２のコピー（ｍｉＲ－２９ｂ－２）と同時発現する。ｍｉＲ－２９ファミリーは保存されたシード配列を共有し、ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂはそれぞれｍｉＲ－２９ｃから１塩基だけ異なる。さらに、ｍｄｘマウス筋肉へのｍｉＲ－２９プラスミド（ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂ－１のクラスター）のエレクトロポレーションは、ＥＣＭ成分、コラーゲン、及びエラスチンの発現レベルを低下し、治療の２５日以内に筋肉切片におけるコラーゲン沈着を大幅に減少させた（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，２０１０．１２（４）：ｐ．３４１－５１）。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例としては、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されており（ＡＡＶ－８に関して米国特許第７，２８２，１９９号及び第７，７９０，４４９号も参照）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一ＡＡＶイントロンの差異的スプライシングにより（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７において）連結された２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の生成をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）においてレビューされる。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部または全てが、プロモーター、目的のＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットのような外来ＤＮＡで置換されてもよい。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。

複数の研究は、筋肉内での長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉が高度に血管新生されるため、組換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後に体循環に導入遺伝子産物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
ＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーに罹患している患者における機能改善には、遺伝子回復及び線維症の軽減の両方が必要である。ＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を軽減する方法が必要とされている。ｍｉＲ２９は、筋線維症を軽減するための潜在的な遺伝子調節因子であり、理想的な候補である。

Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８，１９８７

本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ２９を送達することによって結合組織の３つの主要成分（コラーゲン１、コラーゲン３、及びフィブロネクチン）を直接減少させる遺伝子療法を対象とする。このシステムにおいて、ｍｉＲ２９はコラーゲン及びフィブロネクチン遺伝子の３’ＵＴＲに結合して発現を下方調節する。本発明は、マイクロＲＮＡのガイド鎖ｍｉＲ２９を発現する、遺伝子療法ベクター、例えばＡＡＶ、ならびに線維症を軽減及び／または予防するために筋肉にｍｉＲ２９を送達する方法を対象とする。

さらに、本発明は、ＤＭＤで観察される遺伝子欠損に対処するマイクロジストロフィンと共に線維症を抑制するｍｉＲ－２９を送達する遺伝子療法ベクターを用いて線維症を軽減及び予防するための併用療法及びアプローチを提供する。実施例５～７に示されるように、併用治療は、線維症のより大きな軽減、筋肉サイズの増大、及び筋力の増加をもたらした。

一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３のｍｉＲ－２９ｃ標的ガイド鎖、配列番号４のｍｉＲ－２９ｃガイド鎖、ならびに天然ｍｉＲ－３０及びステムループ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列のようなｍｉＲ２９ｃを発現するポリヌクレオチド配列を含む。ｍｉＲ－３０骨格中のｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡを含む例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２として示される（図１）。

本発明の例示的なｒＡＡＶは、配列番号１のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｍｉｒ２９Ｃであり、ＣＭＶプロモーターはヌクレオチド１２０～５２６に及び、ＥＦ１ａイントロンはヌクレオチド９２７～１０８７及びヌクレオチド１３８０～１８５４に及び、ｍｉＲ－２９ｃのガイドスタンドはヌクレオチド１２５７～１２８４に及び、一次シード配列を有するｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ２９－ｃはヌクレオチド１０８８～１３７５に及び、ポリＡ配列はヌクレオチド１８９６～２０９１に及ぶ。一態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である。

本発明の別の例示的なｒＡＡＶは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＨＣ．Ｍｉｒ２９Ｃであり、ＭＣＫエンハンサーはヌクレオチド１９０～３９５に及び、ＭＨＣプロモーターはヌクレオチド３９６～７５３に及び、ＥＦ１ａイントロンはヌクレオチド１１５５～１３１５及びヌクレオチド１６０９～２０８３に及び、ｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖はヌクレオチド１４８７～１５１２に及び、一次シード配列を有するｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ２９－ｃはヌクレオチド１３１６～１６０８に及び、ポリＡ配列はヌクレオチド２０９４～２１４６に及ぶ。一態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である。

別の態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（短縮ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。

例えば、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかは、配列番号１０のＭＣＫエンハンサーヌクレオチド配列及び／または配列番号１１のＭＣＫプロモーター配列を含む筋特異的制御要素に作動可能に連結される。

本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む薬学的組成物（または本明細書では単に「組成物」と称することもある）を提供する。

別の実施形態では、本発明は、本発明の任意のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収することとを含む、ｒＡＡＶベクター粒子を産生する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子も提供する。

別の実施形態では、本発明は、治療有効量のｍｉＲ－２９を発現する本発明の任意のｒＡＡＶベクターを投与することを含む、必要とする対象において線維症を軽減する方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかは、筋ジストロフィーに罹患している対象に、線維症を軽減、特に対象の骨格筋または心筋における線維症を軽減するために投与される。これらの方法は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを投与するステップをさらに含むことができる。

「線維症」とは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または未制御沈着ならびに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓を含む損傷後の組織における異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、フィブロネクチン及びコラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２、またはコラーゲン３が含まれる。

別の実施形態では、本発明は、治療有効量のｍｉＲ－２９を発現する本発明の任意の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む、必要とする対象において線維症を予防する方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかは、筋ジストロフィーに罹患している対象に、線維症を予防するために投与され、例えば、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶは、対象において線維症が観察される前に投与される。さらに、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤに罹患しているか、またはそう診断されているような、線維症を発症するリスクのある対象に投与される。本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィーに罹患している対象に、これらの対象において新たな線維症を予防するために投与される。これらの方法は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを投与するステップをさらに含むことができる。

本発明はまた、治療有効量のｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力及び／または筋肉量を増加する方法を提供する。これらの方法は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを投与するステップをさらに含むことができる。
「併用療法」及び「併用治療」という用語は、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの投与を指す。

本発明の方法のいずれにおいても、対象は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患している可能性がある。加えて、本発明の方法のいずれにおいても、対象は、ジストロフィン異常症に罹患している可能性がある。

別の実施形態では、本発明は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを提供する。本発明は、ａ）配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有し、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列、またはｃ）配列番号９のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。

本発明のマイクロジストロフィンを発現する例示的なｒＡＡＶは、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、図１０及び１１に示されるｐＡＡＶ．ｍｃｋ．マイクロジストロフィンである。このｒＡＡＶベクターは、ＭＣＫプロモーター、キメライントロン配列、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、アンピシリン耐性、及びｐＢＲ３２２起点または複製を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。一態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である。

本発明は、例えば、配列番号８と少なくとも少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性であるマイクロジストロフィンタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターを提供し、タンパク質はマイクロジストロフィン活性を保持する。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋肉収縮中に筋膜に安定性を提供し、例えば、マイクロジストロフィンは、筋肉収縮中に衝撃吸収材として作用する。

本発明は、例えば、配列番号７と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを提供する。

本発明は、ストリンジェントな条件下で配列番号７の核酸配列またはその補体にハイブリダイズし、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを提供する。

「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤等）も使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度に影響が及ぼされるであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが懸念される例では、追加の例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（２３塩基オリゴ）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。

非特異的及び／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的のために、他の薬剤がハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に含まれ得る。例には、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランがあるが、他の好適な薬剤を使用することもできる。これらの添加物の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの可変物を適応し、かつ異なる配列関連性を有するＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整され得る。

別の態様では、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列を含む。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（短縮ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。

さらに、本発明は、配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む筋特異的制御要素を含むマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを提供する。

本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む薬学的組成物（または本明細書では単に「組成物」と称することもある）を提供する。

別の実施形態では、本発明は、本発明の任意のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収することとを含む、ｒＡＡＶベクター粒子を産生する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子も提供する。

本発明はまた、宿主細胞を本発明のマイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターで感染させることと、宿主細胞中に機能性マイクロジストロフィンタンパク質を発現させることとを含む、機能性マイクロジストロフィンタンパク質の産生方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、治療有効量のマイクロジストロフィンを発現する本発明の任意のｒＡＡＶベクターを投与することを含む、必要とする対象において線維症を軽減する方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかは、筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症に罹患している対象に、線維症を軽減、特に対象の骨格筋または心筋において線維症を軽減するために投与される。

別の実施形態では、本発明は、治療有効量のマイクロジストロフィンを発現する本発明の任意の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む、必要とする対象において線維症を予防する方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかは、筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症に罹患している対象に、線維症を予防するために投与され、例えば、マイクロジストロフィンを発現する本発明のｒＡＡＶは、対象において線維症が観察される前に投与される。さらに、マイクロジストロフィンを発現する本発明のｒＡＡＶは、ジストロフィン異常症もしくは筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤもしくはベッカー型筋ジストロフィーに罹患しているか、またはそう診断されているような、線維症を発症するリスクのある対象に投与される。本発明のｒＡＡＶは、ジストロフィン異常症またはジストロフィン異常症筋ジストロフィーに罹患している対象に、これらの対象において新たな線維症を予防するために投与される。

本発明はまた、治療有効量のｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを投与することを含む、筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症に罹患している対象において筋力及び／または筋肉量を増加する方法を提供する。

本発明のｍｉＲ－２９ｃを発現するｒＡＡＶを投与するステップを含む前述の方法のいずれかは、本明細書に記載のマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶのいずれかを投与するさらなるステップを含み得る。「併用療法」及び「併用治療」という用語は、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの投与を指す。

ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターを投与する方法において、これらのｒＡＡＶベクターは同時投与してもよく、またはマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶの直前にｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターを投与して連続投与してもよく、またはマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶの直後にｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターを投与して連続投与してもよい。あるいは、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与後の約１～５時間もしくは５～１２時間もしくは１２～１５時間もしくは１５～２４時間以内に投与される本発明の方法が実施され、またはマイクロジストロフィンタンパク質を発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９ｃを発現するｒＡＡＶの投与前の約１～５時間もしくは５～１２時間もしくは１２～１５時間もしくは１５～２４時間以内に投与される本発明の方法が実施される。あるいは、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与後の約１もしくは６もしくは１２もしくは２４時間以内に投与される本発明の方法が実施され、またはマイクロジストロフィンタンパク質を発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９ｃを発現するｒＡＡＶの投与前の約１もしくは６もしくは１２もしくは２４時間以内に投与される本発明の方法が実施される。

本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかを、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症または筋ジストロフィーと診断された患者に、対象において線維症が観察される前に、または対象において筋力が低下する前に、または対象において筋肉量が減少する前に投与することを企図する。

本発明はまた、本発明のｒＡＡＶのいずれかを、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患し、既に線維症を発症している対象に、これらの対象において新たな線維症を予防するために投与することも企図する。本発明はまた、本発明のｒＡＡＶのいずれかを、筋ジストロフィーに罹患し、既に筋力が低下している、または筋肉量が減少している患者に、さらなる損傷から筋肉を保護するために投与することを提供する。

本発明の方法のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶベクターは、筋肉内注射または静脈内注射により投与される。

加えて、本発明の方法のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶベクターは、全身投与される。例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入、または移植によって非経口投与される。

別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターのいずれかもしくはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターのいずれかを含む、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、必要とする対象において線維症を軽減するための組成物を提供する。さらに、本発明は、ｍｉＲ２９を発現する組換えＡＡＶベクターのいずれかもしくはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターのいずれかを含む、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している患者において線維症を予防するための組成物を提供する。

本発明はまた、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかもしくはマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターのいずれかを含む、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーのような、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力及び／または筋肉量を増加させるための組成物を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかもしくはマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターのいずれかを含む、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーのような、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィーの治療のための組成物を提供する。

本発明の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。本発明の組成物はまた、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。さらに、組成物のいずれかは、ＤＭＤ、ベッカー型ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象への投与のために製剤化される。

さらなる実施形態では、本発明は、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターもしくはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターのいずれかの、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、必要とする対象において線維症を軽減するための薬剤の調製のための使用を提供する。例えば、対象は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患し、治療を必要としている。

別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかもしくはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターのいずれかの、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、筋ジストロフィーに罹患している対象において線維症を予防するための薬剤の調製のための使用を提供する提供する。加えて、本発明は、ｍｉＲ２９を発現する本発明の組換えＡＡＶベクターもしくはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターのいずれかの、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーのような、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力及び／または筋肉量を増加させるための薬剤の調製のための使用を提供する。

本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかの、ＤＭＤと診断された患者への、対象において線維症が観察される前、または対象において筋力が低下する前、または対象において筋肉量が減少する前の投与用の薬剤の調製のための使用を企図する。

本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターのいずれかの、筋ジストロフィーに罹患し、既に線維症を発症している対象に、これらの対象において新たな線維症を予防するために投与する投与用の薬剤の調製のための使用を企図する。本発明はまた、本発明のｒＡＡＶのいずれかを、筋ジストロフィーに罹患し、既に筋力が低下している、または筋肉量が減少している患者に、さらなる損傷から筋肉を保護するために投与することを提供する。

本発明はまた、ｍｉＲ２９６を発現する本発明のｒＡＡＶベクターもしくはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターのいずれかの、またはｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの両方を含む、筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための使用を提供する。

本発明の使用のうちのいずれかにおいて、薬剤は、筋肉内注射用に製剤化される。さらに、薬剤のいずれかは、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患している対象への投与のために調製され得る。

さらに、本発明の薬剤のいずれかは、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクター及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターが同時投与される、またはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶの直前にｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターを投与して連続投与される、またはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶの直後にｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターを投与して連続投与される、併用療法であってもよい。あるいは、薬剤は、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与後の約１～５時間以内に投与されマイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターの投与を含み、または薬剤は、ｍｉＲ－２９ｃを発現するｒＡＡＶの投与前の約１～５時間以内に投与されるマイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ａ）配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有し、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列、または
ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列を含む、組換えＡＡＶベクター。
(項目２)
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である、項目１に記載の組換えＡＡＶベクター。
(項目３)
前記ポリヌクレオチド配列が、筋特異的制御要素に作動可能に連結される、項目１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
(項目４)
前記筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）である、項目３に記載の組換えＡＡＶベクター。
(項目５)
前記筋特異的制御要素が、配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、項目３または４に記載の組換えＡＡＶベクター。
(項目６)
項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
(項目７)
治療有効量の項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症を治療する方法。
(項目８)
治療有効量の項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症に罹患している対象における線維症を軽減または予防する方法。
(項目９)
治療有効量の項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーまたはジストロフィン異常症に罹患している対象における筋力または筋肉量を増加する方法。
(項目１０)
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射、静脈内注射、非経口投与、または全身投与により投与される、項目７～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記組換えＡＡＶが、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目７～１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである、項目７～１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
筋ジストロフィーの治療のための、項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
(項目１４)
筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を軽減または予防するための、項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
(項目１５)
筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力を増加するための、項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
(項目１６)
前記組成物が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１７)
前記対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーに罹患している、項目１３～１６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１８)
筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための、項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物の使用。
(項目１９)
筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症の軽減または予防用の薬剤の調製のための、項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物の使用。
(項目２０)
筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力または筋肉量の増加用の薬剤の調製のための、項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物の使用。
(項目２１)
前記薬剤が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目１６～１８のいずれか一項に記載の使用。
(項目２２)
前記対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーに罹患している、項目１８～２１のいずれか一項に記載の使用。
(項目２３)
前記組成物または薬剤が、筋肉内投与、静脈内注射、非経口投与、または全身投与用に製剤化される、項目１３～２２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
(項目２１)
宿主細胞を項目１～５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターで感染させることと、前記宿主細胞中に機能性マイクロジストロフィンタンパク質を発現させることとを含む、機能性マイクロジストロフィンタンパク質の産生方法。

ｒＡＡＶベクターｓｃＡＡＶＣｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃならびに天然ｍｉＲ－３０骨格におけるｍｉＲ－２９ｃのヌクレオチド配列及び予測ヘアピン構造のヌクレオチド配列の概略図を提供する。 筋肉へのｍｉＲ－２９ｃの注射が筋肉全体のコラーゲンを減少させ、ｍｉＲ－２９ｃ発現を回復させることを示す。 同上。 同上。 ｍｉＲ－２９ｃの注射が絶対筋力（パネルＡ）及び比筋力（パネルＢ）を改善するが、収縮誘発性損傷（パネルＣ）に対して保護しないことを示す。 同上。 同上。 導入遺伝子送達の有効性を測定する筋線維発現マイクロジストロフィンの数を示す。 同上。 同上。 マイクロジストロフィンとのｍｉＲ－２９ｃの同時送達が、コラーゲン発現（パネルＡ）及び線維症誘発性ジストロフィン発現を減少させることを示す。 同上。 同上。 コラーゲン１アルファ（パネルＡ）、コラーゲン３アルファ（パネルＢ）、フィブロネクチン（パネルＣ）、及びＴＧＦ－β（パネルＤ）によって測定されるように、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの筋肉内注射がｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスにおいて細胞外マトリックスを阻害することを示す。 同上。 同上。 同上。 ｍｉＲ－２９ｃの筋肉内注射が筋肉における絶対力を増加し（パネルＡ）、比力を正常化し（パネルＢ）、収縮誘発性損傷からの保護を追加した（パネルＣ）ことを実証する。 同上。 同上。 ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用が３ヶ月齢で治療されたマウスにおいて筋肉サイズを増加させることを示す。コラーゲンを染色するピクロシリウスレッドで染色された被治療及び未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－腓腹筋の切片を示す。線維症の領域はピンク色であり、無傷の筋肉は緑色である。巨視的なレベルでは、ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用は線維症を減少させ、総断面積を増加させる。 マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、及び筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大及び過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－と比較し、平均直径は２５．９６から３０．９７μｍに増加した 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症及びＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、野生型、未注射、４～５週齢でＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．マイクロジストロフィン、及びＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィンが注射され、注射の１２週間後に取り出されたマウスのピクロシリウスレッド染色を示す。パネルＢは、併用治療された筋肉が未注射ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５１．１％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量ｑＲＴ－ＰＣＲは、反対側の肢及び単剤療法の各々と比較したＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるコラーゲンＩ及びＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）、ならびにＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す。エラーバー、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウス）のＳＥＭ。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１） 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 早期併用療法が力を回復させ、収縮誘発性損傷に対して保護することを実証する。すべての３つの治療が注射されたＧＡＳ筋の強縮性収縮後の絶対（パネルＡ）及び正常化比力（パネルｂ）の測定は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉（パネルＣ）と比較して有意に増加した。筋肉は次いで反復伸張性収縮後の力の喪失について評価された。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療及びマイクロジストロフィンで単剤治療されたマウスのみは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－筋肉（青色）と比較して力の喪失からの保護を示した。二元配置分散分析は、減衰曲線における有意性を実証する。エラーバー、ｎ＝５（ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝６（ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン）、ｎ＝５（ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン）、ｎ＝１５（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）のＳＥＭ。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療が１ヶ月齢で治療されたマウスにおいて筋肉サイズを増加させることを示す。被治療及び未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－ＧＡＳ筋を切片化し、コラーゲンを染色するピクロシリウスレッドで染色した。線維症の領域はピンク色であり、無傷の筋肉は緑色である。巨視的なレベルでは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの組み合わせは線維症を減少させ、総断面積を増加させる。 ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症及びＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、未注射及び４～５週齢でＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを注射され、注射の１２週間後に取り出されたマウスのピクロシリウスレッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量ｑＲＴ－ＰＣＲは、反対側の肢と比較したＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ、パネルＤ）及びコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ、パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ、パネルＦ）、ならびにＴｇｆβ１（パネルＧ）レベルの有意な減少を示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症及びＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射の１２週間後の、未治療、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ、及びＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィンのピクロシリウスレッド染色を提供する。元の倍率、２０倍。パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの３０．３％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量ｑＲＴ－ＰＣＲは、反対側の肢と比較したＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ、パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ、パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ、パネルＦ）、及びＴｇｆβ１（パネルＧ）レベルの有意な減少を実証した。一元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 早期併用療法（４～５週での治療）が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ及びマイクロジストロフィンが注射されたＧＡＳ筋の強縮性収縮後の絶対（パネルＡ）及び正常化比力（パネルＢ）の測定は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉と比較して有意に増加した。（Ｃ）筋肉は次いで反復伸張性収縮後の力の喪失について評価された。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療及びマイクロジストロフィンで単剤治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉（赤色）と比較して力の喪失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭを表す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 後期併用療法が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶが注射されたＧＡＳ筋の強縮性収縮後の絶対（パネルＡ）及び正常化比力（パネルＢ）の測定は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉と比較して有意に増加した。パネルＣでは、筋肉は次いで反復伸張性収縮後の力の喪失について評価された。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶで併用治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉（赤色）と比較して力の喪失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭを表す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 併用治療が注射の３ヶ月後に筋肥大を増加させることを示す。パネルＡはｒＡＡＶを示す。マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶと同時送達されたＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃは、注射されたＧＡＳの全重量を増加させなかった。パネルＢは、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶ併用治療が平均線維サイズの増加を誘発したことを実証する。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－と比較し、平均直径は２８．９６から３６．０３μｍに増加した。パネルＣは、同時送達が野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらしたことを示す。パネルＤは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ^２当たりの筋線維の数が、未治療マウス及び野生型より有意に少なかったことを提供した（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 同上。 ｍｉＲ－２９ｃの成熟ガイド鎖（ヌクレオチド１２５７～１２８４）及び天然ｍｉ－３０骨格（ヌクレオチド１０８８～１３７５）を含む例示的なｒＡＡＶベクターの核酸配列（配列番号１ ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｍｉｒ２９Ｃ）を提供する。構築物はまた、ＣＭＶプロモーター（ヌクレオチド１２０～５２６）、ヌクレオチド９２７～１０８７及び１３８０～１８５４における２つのＥＦ１ａイントロン、ならびにヌクレオチド１８９６～２０９１におけるｐｏｌＡを含む。 同上。 ｒＡＡＶベクターｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの概略図を提供する。 マイクロジストロフィンを発現する例示的なｒＡＡＶベクターの核酸配列（配列番号９、ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン）を提供する。 同上。 同上。 同上。 ヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列（配列番号７）のヌクレオチド配列を提供する。 同上。 同上。 ｍｉＲ－２９ｃの成熟ガイド鎖（ヌクレオチド１４８７～１５１２）及び天然ｍｉ－３０骨格（ヌクレオチド１０８８～１３７５）を含む例示的なｒＡＡＶベクターのヌクレオチド配列（配列番号１２ ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．Ｍｉｒ２９Ｃ）を提供する。構築物はまた、ＭＣＫエンハンサー（ヌクレオチド１９０～３９５）、ＭＣＫプロモーター（ヌクレオチド３９６～７５３）、ヌクレオチド１１５５～１３１５及び１６０９～２０８３における２つのＥＦ１ａイントロン、ならびにヌクレオチド２０９４～２１４８におけるｐｏｌＡを含む。 同上。 同上。

本発明は、ｍｉＲ－２９マイクロＲＮＡを過剰発現する、遺伝子療法ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、ならびに筋ジストロフィー患者において線維症を軽減及び予防する方法を提供する。本発明はまた、ＤＭＤ患者において欠失したマイクロジストロフィンを発現する遺伝子療法ベクターと組み合わせてｍｉＲ－２９を発現する遺伝子療法ベクターを投与することを含む、併用遺伝子療法を提供する。

ＤＭＤの診断の最若齢で採取された筋生検は、顕著な結合組織増殖を明らかにする。筋線維症は複数の点で有害である。これは結合組織関門を通る筋内膜栄養素の正常な運搬を減少させ、血流を減少させ、筋肉から血液由来栄養成分を奪い、機能的に四肢拘縮による早期歩行喪失の一因となる。時間の経過に伴い、筋肉における著しい線維症の結果として治療課題は倍増する。これは連続した時点で結合組織増殖を比較する筋生検で観察され得る。このプロセスは悪化し続けて歩行喪失を引き起こし、特に車椅子に依存している患者において、制御不能を加速する。

線維症を軽減するための平行したアプローチなしでは、エクソンスキッピング、終止コドンリードスルー、または遺伝子置換療法の利益を完全に達成することができる可能性は低い。小分子またはタンパク質置換戦略でさえ、筋線維症を軽減するアプローチなしでは失敗する可能性が高い。ＡＡＶ．マイクロジストロフィンで治療された既存の線維症を有する老齢のｍｄｘマウスにおける以前の研究は、完全な機能回復を達成できなかったことを示した（Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２，４９２９－４９３７（２０１３））。ＤＭＤ心筋症の進行には、心室壁における瘢痕形成及び線維症が伴うことも知られている。マイクロＲＮＡ送達は、免疫バリアの欠如及び比較的容易な送達によって特に革新的である。マイクロＲＮＡは小さく（～２００ｂｐ）、したがって遺伝子欠損を補正または迂回する治療カセットと共にＡＡＶにパッケージングすることができる。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型が１３存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。

本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。

ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景部分に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。

本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に導入される。ＡＡＶゲノムがパッケージングされるｒＡＡＶ粒子、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型であり得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な成分を全て安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）等の手法によって細菌プラスミドに導入されている。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、ならびに米国特許第６，２５８，５９５号。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）等の安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低通路２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態において、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠き、すなわち、ゲノムのＩＴＲの間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡは存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築することができるｒＡＡＶの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法が含まれる。

別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む。本組成物は、希釈剤及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的される個体、及び細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。

インビボまたはインビトロでのｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態において、「有効用量」は、治療される障害／疾患状態と関連付けられる少なくとも１つの症状を軽減する（排除または低減する）、障害／疾患状態への進行を遅らせるか、もしくは予防する、障害／疾患状態の進行を遅らせるか、もしくは予防する、疾患の程度を縮小させる、疾患の緩解（部分的または完全）をもたらす、及び／または生存を延長する、用量である。本発明の方法による予防または治療のために企図される疾患の例は、ＦＳＨＤである。

併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療及び連続治療を含む。新規の療法との併用等の本発明の方法と標準の医療処置（例えば、コルチコステロイド）との併用が特に企図される。

本組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準の経路により得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、治療される感染症及び／または疾患状態、ならびにｍｉＲ－２９ ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロジストロフィンを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択及び／または適合され得る。

本発明は、有効用量の、本発明の併用療法を含む本発明のｒＡＡＶ及び組成物の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与は、体全体が影響を受けるように循環系への投与である。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与及び注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。

具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。

本明細書に開示される方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的される個体、及び細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、または約１×１０１５以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、それぞれ１ｘ１０^７ｖｇ、１ｘ１０^８ｖｇ、１ｘ１０^９ｖｇ、１ｘ１０^１０ｖｇ、１ｘ１０^１１ｖｇ、１ｘ１０^１２ｖｇ、１ｘ１０^１３ｖｇ、１ｘ１０^１４ｖｇ、１×１０^１５ｖｇ）で表されてもよい。投薬量は、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、それぞれ１ｘ１０^１０ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ）で表されてもよい。ＡＡＶを滴定する方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。

具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。

筋肉内注射の目的のために、例えば、ゴマ油もしくはピーナッツ油等のアジュバント中の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液が用いられ得る。かかる水溶液は、所望の場合、緩衝され、液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグルコースで等張性にする。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡが酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容される塩は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶ分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中でも調製され得る。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準の技法によって容易に得ることが可能である。

注射可能な使用に好適な薬学的担体、希釈剤、または賦形剤としては、滅菌水溶液または分散剤、及び注射可能な滅菌溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、必要量のｒＡＡＶを、上に列挙される様々な他の成分を有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥及びフリーズドライ技法である。

ｒＡＡＶでの形質導入もインビトロで行われ得る。一実施形態では、所望の標的筋細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種筋細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種筋細胞が使用され得る。

対象への形質導入細胞の形質導入及び再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／またはＰＣＲ等の従来の技法を使用して目的とするＤＮＡを持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによってインビトロで形質導入され得る。その後、形質導入された細胞は、薬学的組成物に製剤化され得、この組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射等の様々な技法によって、または例えばカテーテルを使用して、平滑心筋に注射することによって対象に導入される。

本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、ｍｉＲ－２９またはマイクロジストロフィンの持続発現をもたらす。したがって、本発明は、ｍｉＲ－２９及びまたはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶでの形質導入組織（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の器官、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、これらに限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘発性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ならびに他の制御要素を含む、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供する。

筋組織は、重要な器官ではなく、アクセスが容易であるため、インビボＤＮＡ送達のための魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来のｍｉＲＮＡの持続発現を企図する。

「筋細胞」または「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織由来の、例えば、骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。かかる筋細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞等の分化または未分化のものであり得る。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるｍｉＲ２９またはマイクロジストロフィンの発現をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのｍｉｉＲ２９ガイド鎖またはマイクロジストロフィンのコード領域の投与／送達を指すために使用される。

したがって、本発明は、有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくはある間隔で与えられる用量）の、ｍｉＲ２９及び／またはマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。

実施例１
デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルの確認
ｍｄｘマウスは、ＤＭＤ病因を研究するための、便利だがまだ不完全な、動物モデルを提供する。このモデルは、ｍｄｘマウスとユートロフィン遺伝子のヘテロ接合型ノックアウトとの交配（ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－）であり、増加した線維症を呈し、ヒトＤＭＤの病理をより忠実に再現する。Ｍｄｘマウスは、比較的軽度の表現型及びほぼ正常な寿命をもたらすＤＭＤのエクソン２３にナンセンス突然変異を有する。３週齢までに、ｍｄｘマウスの横隔膜及び四肢筋は、筋内膜炎症の徴候を発現する。これらの症状は、マウスが成体期に達した後の四肢筋では鎮静するが、横隔膜筋における炎症は徐々に悪化し続ける。テロメラーゼを欠くｍｄｘマウスでは、筋ジストロフィーは齢と共に次第に悪化し、ユートロフィンを欠くｍｄｘマウス（ＤＫＯ）は、早期発症筋力低下、重度線維症、及び早期死亡を伴うヒトＤＭＤにより特徴的な表現型を有する。ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンは、二重ＫＯ（ジストロフィン＋ユートロフィン）のｍｄｘマウスにおけるジストロフィンの欠如を補い得る高度の配列相同性を共有し、早期死亡を伴う重度の表現型が観察される。ＤＫＯマウスにおける早期死亡は炎症及び線維症の進行を排除するが、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ^＋／－マウスは、顕著な程度の線維症、及びＤＫＯよりも長い生存期間を示す、ヒト疾患との類似性を有するモデルを提示し、提案する変換研究のためのより良好なモデルを提供する。最近の報告では、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ^＋／－マウスの使用は、ＤＭＤとの関連で線維症を研究するのに理想的なモデルとして確認されている。本研究では、シリウスレッド染色により測定される線維症の増加は、コラーゲン転写物レベルの増加及びｍｉｒ２９ｃレベルの減少を伴った。

実施例２
ＤＭＤマウスへのｍｉＲ２９の送達は線維症を軽減する
予備研究は、ヒトＤＭＤ患者及びｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスにおいて、コラーゲンについてのシリウスレッド染色の有意な増加及びｍｉＲ－２９ｃレベルの減少があることを実証している。筋特異的ＡＡＶベクターを用いたｍｉＲ－２９の遺伝子送達は、潜在的に安全かつ効率的である。本明細書においてｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃと称されるｒＡＡＶベクターを生成するために、２２ヌクレオチドｍｉＲ２９ｃ配列（標的鎖配列番号３及びガイド鎖配列番号４）を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｍｉＲ－３０スカフォールドにクローニングした。発現カセット（配列番号２）を自己相補的ＡＡＶプラスミドにクローニングし、筋肉中でよく発現することが知られている血清型ＡＡＶｒｈ．７４を用いてパッケージングした。ｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡは、ｍｉＲ－３０骨格にｍｉＲ－３０ｃ標的（センス）鎖、ｍｉＲ－３０ステムループ、及びｍｉＲ－２９ｃガイド（アンチセンス）鎖を含むカスタムプライマーを用いて合成した。ｍｉＲ－２９ｃ配列の３つの塩基を改変した。次いで、この配列を、ＣＭＶプロモーター及びポリＡ配列によって駆動される自己相補的ＡＡＶ ＩＴＲ含有プラスミドにクローニングした。

図１に示すように、ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するｍｉＲ－３０ステムループ骨格にｍｉｒ２９ｃ ｃＤＮＡを含む。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化されたのはこの配列である。さらに、ｍｉＲ－２９ｃ標的配列内のいくつかのヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ（ｌｕｃ）のように、この部位でワトソン－クリック対合を模倣するように変更された。ＳｈＲＮＡ－ｌｕｃ設計に従って、ヘアピンはその長さ全体にわたって完全に相補的でなければならない。加えて、パッセンジャー鎖への変更が多いほど、ステムを介してｍｉＲＮＡを認識することができるｍｉＲ－２９プロセシングを調節する内在性機構の排除の可能性が高い。ガイド鎖の１９番目の塩基をシトシンに改変して、天然ｍｉ－２９ｃ配列の切断部位に先行するヌクレオチドを模倣し、他方の鎖上の対応する塩基を変更して対合を保存した。

遺伝子療法ベクターｓｃｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃ（１×１０^１１ｖｇ）を３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスの四頭筋に注射した。四頭筋をシリウスレッド染色により注射の３ヶ月後に分析し、Ｎｅｖｏ ｅｔ ａｌ．（ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１８０４９（２０１１））に記載されているようにＮＩＨ ＩｍａｇｅＪフトウェアにより分析した。ＭｉＲ２９ｃ、コラーゲン、及びエラスチンレベルをＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。若齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスへのｍｉＲ－２９ｃの送達は、６ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウス（注射の３ヶ月後）の四頭筋において、ｍｉｒ－２９ｃレベルを有意に増加させ、シリウスレッド染色を有意に減少させる。ＲＴ－ＰＣＲによって評価した場合、被治療筋肉におけるコラーゲン及びエラスチンレベルの減少があった。

ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウス及びジストロフィン欠損患者における線維症の増加及びｍｉＲ２９発現の減少の実証は、ヒト疾患の代表としてのマウスモデルの有効性を認める。抗線維症療法としてＡＡＶで送達されたｍｉＲ２９を使用した初期の結果は、線維症の重要な要因である、シリウスレッド染色ならびにコラーゲン及びエラスチンレベルの減少に有意な有益な効果があることを示唆している。

実施例３
ＭｉＲ－２９ｃの注射はコラーゲンを減少させ、ｍｉＲ－２９ｃを回復させる
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃが線維症を軽減することができるかを決定するために、１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－マウスは、左腓腹（ＧＡＳ）筋に５ｘ１０^１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃの筋肉内注射を受けた。注射の１２週間後にマウスを分析した。ピクロシリウスレッド染色は、未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋と比較して、ＧＡＳ筋（図２ａ）全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少を明らかにした。ピクロシリウスレッド染色の定量化は、被治療筋肉が未治療筋肉と比較してコラーゲンの１８．３％減少を有したことを示す（被治療－２３．３％±１．３対未治療－２９．５％±０．７）（図２ｂ）。被治療筋肉におけるｍｉＲ－２９ｃの過剰発現を確認するために、２４週齢のＷＴ、ｍｉＲ－２９ｃ治療マウス、及びｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスからのＧＡＳ筋から全ＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ－２９ｃ発現についての定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析に供した。結果は、未治療マウスと比較して、被治療マウスのＧＡＳ筋においてｍｉＲ－２９ｃが有意に増加したことを示した（図２ｄ）。

実施例４
ＭｉＲ－２９ｃは絶対及び比筋力を改善するが、収縮誘発性損傷に対して保護しない
線維症が筋機能に影響を与え得ることは分かっているので、ＭｉＲ－２９ｃの発現を増加させることによる線維症の軽減が収縮誘発性損傷からｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉を保護し、全体的な力を増加させるかを試験したかった。ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃで治療されたｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスからの腓腹筋の機能特性を評価した。注射の１２週間後、ＧＡＳを単離してインビボ力測定を行った。

ＧＡＳ手順は、横腹筋生理を分析するためにＨａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７０９：７５－８９、２０１１）に列挙されたプロトコルに従うが、ＧＡＳに適合させる。簡潔には、ケタミン／キシラジン混合物を用いてマウスを麻酔した。後肢の皮膚を除去して、ＧＡＳ筋及びアキレス腱を露出させた。遠位腱を切除し、できるだけ筋肉の近くで４－０縫合糸を腱の周りで二重本結びにし、第１の結び目のすぐ隣に別の第２の二重本結びを作り、次いで腱を切断した。露出した筋肉は常に生理食塩水で湿らせた。次いで、マウスを熱制御プラットフォームに移し、３７℃に維持した。膝を膝蓋腱に通した針でプラットフォームに固定し、腱を力変換器（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）のレベルアームに縫合し、足をテープで固定した。双極性白金電極を介して坐骨神経を刺激することにより、ＧＡＳ筋収縮を誘発した。筋肉が安定化されたら、最大収縮力が達成されるまで筋肉を漸増伸長することにより、最適長さを決定した。３分の休止期間後、ＧＡＳを、各刺激間に１分の休止期間を設けて、５０、１００、１５０、及び２００Ｈｚで刺激して、最大強縮力を決定した。筋肉の長さを測定した。５分の休止後、収縮誘発性損傷に対するＧＡＳ筋の感受性を評価した。５００ｍｓの刺激後、筋肉は最適長さの１０％長くなった。これは１５０Ｈｚで７００ｍｓにわたり筋肉を刺激することからなった。刺激後、筋肉は最適長さに戻った。このサイクルを１分毎に合計５サイクル繰り返した。比力は、最大強縮力をＧＡＳ筋断面積で割ることによって計算した。伸張性収縮後、マウスを次に安楽死させ、ＧＡＳ筋を切除し、秤量し、分析のために凍結した。

各ＧＡＳは一連の反復伸張性収縮を受けた。第１の収縮に対する各収縮の力比を比較することにより、第５の収縮後、未治療筋肉は、被治療０．５０±０．０４に対して０．５６±０．０５に減衰したことが明らかになった（Ｐ≦０．０００１）。被注射群は、０．９２±０．０２に減衰したＷＴ対照と比較して保護の程度のわずかな減少を示した（図３ｃ）。このデータは、ｍｉＲ－２９ｃの発現を増加させることによる線維症の軽減が、絶対力及び比力の両方を増加させるが、筋肉を収縮誘発性損傷から有意に保護しないことを示す。

ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃ治療ＧＡＳ筋は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－ＧＡＳ筋と比較した場合に絶対力の有意な改善を示し（ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ－２２７７±１６１．７対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－未治療－１７２２±１４５．７、図３ａ）、また未治療ＧＡＳ筋と比較した場合にｒＡＡＶｒｈ．７４．ｍｉＲ－２９ｃ治療ＧＡＳ筋特異的改善において比力を正常化した（ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ－２０４．７±１１．７対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－未治療－１５１．６±１４．５、図３ｂ）。野生型対照と比較した場合、力は依然として有意に低下した（ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ－２０４．７±１１．７対野生型－３１２．０±３４．１）。

実施例５
マイクロジストロフィンとの同時送達は線維症をさらに軽減する
ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用遺伝子療法アプローチが線維症を軽減するのにより有益であるかを決定するために、１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－マウスは、左腓腹筋に５ｘ１０^１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃの筋肉内注射を受けた。以下の遺伝子療法ベクター：ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンとの同時送達、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン単独を、３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウス、ＤＭＤマウスモデルの左腓腹筋（ＧＡＳ）筋への筋肉内注射（ＩＭ）によって投与した。

ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、図１０に示すように、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含む。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化されたのはこの配列である。Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：１０９－１７）に記載されているように、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列を駆動するＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターに挿入することにより、ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドを構築した。ＭＣＫプロモーター／エンハンサー配列は、筋特異的遺伝子発現を駆動するのに使用され、３５１ｂｐのＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）からなる。コアプロモーターの後、５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫ Ｅｘｏｎ１（非翻訳）が効率的な転写開始のために存在し、ＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）及び小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロン及び５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスＫｏｚａｋ及びｍＲＮＡ終結のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４－Ｒ２３／Δ７１－７８）ドメインを含む。相補的ＤＮＡは、ヒト使用のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。

注射の１２週間後及び２４週間後にマウスを分析した。まず、マイクロジストロフィンを発現する筋線維の数を用いて、導入遺伝子送達の有効性を評価し、各群で同様のレベルのマイクロジストロフィンが発現するようにした。マイクロジストロフィンは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法（７５．０３±１．９１％）と比較して、マイクロジストロフィン単独（７１．８５±２．２５％）で治療されたコホート間では差がないことが見出された（図４）。

ＧＡＳ筋を注射の１２ヶ月後に分析して、シリウスレッド染色及びその後のＩｍａｇｅＪでの定量化によりコラーゲン蓄積を評価した。さらなる結果には、ｍｉＲ－２９ｃ及びコラーゲン転写物レベル、ＧＡＳ筋における力測定、線維直径測定、ならびに筋肉再生に関与するタンパク質（ＭｙｏＤ、ミオゲニン）のウエスタンブロット分析が含まれた。線維症の量はピクロシリウスレッド染色によって分析され、未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋またはマイクロジストロフィン単独と比較して、すべての治療群においてＧＡＳ筋全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少を明らかにした（図５ａ）。ピクロシリウスレッド染色の定量化は、併用治療筋肉が未治療筋肉と比較してコラーゲンの４０．８％減少を有したことを示す（被治療－１７．４７％±０．７５対未治療－２９．５％±０．７）（図５ｂ）。ｍｉＲ－２９ｃの発現を確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲをＧＡＳ筋で行い、すべての治療群は、未治療筋肉と比較してｍｉＲ－２９ｃの増加を有した（図５ｃ）。

ＤＭＤ組織と類似して、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉におけるｍｉＲ－２９ｃレベルの有意な減少が観察され、ピクロシリウスレッド染色によって測定された線維症の増加と相関した。ｓｃＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独での治療の３ヶ月後、ＧＡＳ筋における線維症の有意な減少（被治療－２３．５％±１．３対未治療－２７．８％±０．６）があった。マイクロジストロフィンと同時送達された場合、ピクロシリウスレッド染色により、コラーゲンのさらなる減少（４１％）が観察された（併用治療：１７．４７％±０．７５対未治療：２９．５％±０．７）（ｐ＜０．０００１）（図５ｂ）。ｍｉＲ－２９ｃの発現を確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲをＧＡＳ筋で行い、すべての治療群は、未治療筋肉と比較してｍｉＲ－２９ｃの増加を有した（図５ｂ）。

注射の２４週間後、結果は注射の１２週間後に観察された結果と類似していた。未治療筋肉と比較してピクロシリウスレッド染色によるコラーゲンの４７％減少（併用療法：１６．５±１．２３対未治療：３１．０７±０．９３、ｐ＜０．０００１）及び同時にｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加があった。

ピクロシリウスレッド染色により観察されたコラーゲンの減少をさらに検証するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを筋肉で行い、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、及びまた別のＥＣＭ成分であるフィブロネクチン（Ｆｂｎ）の転写物レベルを定量化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、各治療後のＣｏｌ１Ａ及びＣｏｌ３Ａの減少を検出したが、マイクロジストロフィン及びｍｉＲ－２９ｃの両方で治療されたコホートのみが有意な減少を示した（図６ａ及び６ｂ）。分析は、併用治療コホートにおいてのみＦｂｎが有意に減少したことを明らかにした（図６ｃ）。

ＴＧＦ－β１は、ジストロフィー筋において上方調節されることが以前に示されており、線維症カスケードの開始に関与する可能性が高い。ＴＧＦ－β１は、ｍｉＲ－２９ｃを下方調節し、コラーゲン及び筋線維形成の増加を伴う筋芽細胞の筋線維芽細胞への変換を担う、既知の線維症促進性サイトカインである。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、併用治療された筋肉が、未注射筋肉及びいずれかの単剤治療と比較して有意に低いレベルのＴＧＦ－β１を有したことを示す（図６ｄ）。注射の６ヵ月後、併用治療された筋肉は、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、Ｆｂｎ、及びＴＧＦ－β１レベルの低下を示し続けたが、ｍｉＲ－２９及びマイクロジストロフィンのみの群ではＣｏｌ１Ａ ｍＲＮＡレベルのごくわずかな減少が観察された。

未治療四肢と比較してｍｉＲ－２９ｃ単独で治療された筋肉では、比力及び絶対力の増加が観察され、マイクロジストロフィンと組み合わせた場合、野生型と有意な差がない絶対力及び比力をもたらした。また、併用治療された筋肉における腓腹筋重量の有意な増加が観察された。

ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃを抗線維症療法として使用した初期の結果は、線維症の主要な原因であるコラーゲンレベルの低下に有益な効果があることを示唆している。さらに、膜安定性を改善するためにマイクロジストロフィンと組み合わせると、ｍｉＲ２９上方調節は筋力を正常化した。

実施例６
絶対力のさらなる増加及び収縮誘発性損傷からの保護の追加
ｍｉＲ－２９治療筋肉が絶対力及び比力の控えめだが有意な増加を有したことがわかったので、ｍｉＲ－２９ｃ過剰発現及びマイクロジストロフィン遺伝子置換の併用療法の筋機能への影響を調べた。注射の１２週間後、ＧＡＳを単離し、インビボ力測定を行った。実施例２で上記したｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃベクター及びｒＡＡＶ

併用治療のｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃ及びマイクロジスを発現するｒＡＡＶで治療されたＧＡＳ筋は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－ＧＡＳ筋と比較した場合に絶対力の有意な改善を示し（併用治療－３５８２．４±７９．４ｎＭ対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－未治療－１７２２±１４５．７ｎＭ対野生型－３００５±１６７．３ｎＭ）（図７）、また未治療ＧＡＳ筋と比較した場合のｒＡＡＶｒｈ．７４．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジス被治療ＧＡＳ筋に特異的な改善において比力を正常化した（併用治療マウス－２４４．２±６．６ｎＭ／ｍｍ^２対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－未治療－１５１．６±１４．５ｎＭ／ｍｍ^２対３１２．０±３４．１ｎＭ／ｍｍ^２）（図７）。絶対力及び比力の両方は野生型対照と有意な差がなかった。

各ＧＡＳは一連の反復伸張性収縮を受けた。第１の収縮に対する各収縮の力比を比較することにより、第５の収縮後、未治療筋肉は、併用治療０．６６±０．０４に対して０．５４±０．０６に減衰したことが明らかになり（Ｐ≦０．０００１）、マイクロジストロフィン単独でも０．６６±０．０４に減衰したので、これはマイクロジストロフィンに起因し得る。被治療群は、０．９２±０．０２に減衰した野生型よりも依然として有意に低かった（図７ｃ）。注射の２４週間後に同様の所見が認められた。このデータは、線維症の軽減及び遺伝子置換が、絶対力及び比力の両方を増加させ、筋肉を収縮誘発性損傷から有意に保護することを示す。

実施例７
併用療法は筋肥大及び過形成を増加させる
マイクロジストロフィンと同時送達されたＭｉＲ－２９ｃは、３ヶ月齢で単独で注射されたいずれか一方と比較して、被注射腓腹筋の全重量を増加させた（図８、図９ａ）。筋肉量の増加の原因を調べるために、筋線維直径を測定する。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療は、平均線維サイズの増加を示した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－と比較して、平均直径は２５．９６から３０．９７μｍに増加した（図９ｂ）。同時送達は野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらした（図９ｃ）。平均線維サイズは増加したが、総筋肉重量の～３０％増加は説明されない。筋肉の総断面積も測定した。すべての群からの腓腹筋をフルスライドスキャンし、総面積を測定した。マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃで併用治療された筋肉は、未治療及びいずれかの単剤治療と比較して断面積の有意な増加を有した（未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）（図８、図９ｄ）。

ｍｉＲ－２９ｃはｍｙｏＤ／Ｐａｘ７／ミオゲニン経路において役割を果たすことが報告されており、ｍｉＲ－２９ｃは筋原性系列において分化する衛星細胞（筋幹細胞）の再生及び活性化に影響している可能性があるという仮説が立てられた。これを試験するために、フルスライドスキャン画像からの筋線維の総数を数えた。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療後の筋線維の数の増加（図９ｅ）。最後に、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおける筋線維直径が多くの小径線維及びいくつかの肥大線維とは異なることを考慮して、単位面積当たりの線維数（細胞／ｍｍ２）が治療によって影響を受けるかが決定された。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療は野生型と変わらなかった（図９ｆ）。

実施例８
早期併用治療は線維症を予防する
ＤＭＤの予防療法としてのコンビナトリアルｍｉＲ－２９ｃ及びマイクロジストロフィンの潜在的重要性を考慮して、より若齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスのコホートを４週齢で治療した。本明細書に記載の他の群と同じパラダイムを用いて、以下の治療：同じ用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独、ｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン＋ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ併用療法、またはｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン単独を、ＧＡＳの筋肉内注射による線維症予防の有効性について比較した。注射の１２週間後にマウスを剖検した。未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－ＧＡＳ筋と比較して、すべての被治療群においてＧＡＳ筋全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少が観察された（図１０Ａ）。ピクロシリウスレッド染色の定量化は、マイクロジストロフィン／ｍｉＲ－２９ｃで併用治療された筋肉が未治療筋肉と比較してコラーゲンの５１％減少を有したことを示し（被治療－１１．３２％±１．１８対未治療－２３．１５％±０．９０）（ｐ＜０．０００１）（図１０）、ｐＲＴ－ＰＣＲは、コンビナトリアル療法後にＣｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、Ｆｂｎ、及びＴＧＦ－β１の減少を確認した（図１０Ｄ及びＥ）。

実施例９
早期併用療法は後期治療よりも良好に力を回復し、収縮誘発性損傷から保護する
インビボ力測定を、実施例８に記載されているように併用療法で早期に治療されたマウスのＧＡＳについて行った。４週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスにおいて、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンを用いた併用療法は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスと比較した場合、絶対力の有意な改善を示し、野生型との差はなかった（併用治療：２９０８±１２９．５ｍＮ対未治療：１６３９．４±１１６．９ｍＮ対野生型：３３６９．７３±１５４．１ｍＮ）。比力もまた、コンビナトリアル療法後に野生型レベルまで正常化した（併用治療３３８．９±２２．３４ｍＮ／ｍｍ２対未治療１８４．３±１３．４２ｍＮ／ｍｍ^２対ＷＴ３６４．３±７．７９ｍＮ／ｍｍ^２）（図１１Ａ及びＢならびに１２）。

次に、各ＧＡＳは一連の反復伸張性収縮を受けた。第５の収縮による各収縮の力比を比較することにより、未治療筋肉は、併用治療０．８２±０．０４に対して０．５３±０．０４に減衰した（Ｐ≦０．０００１）。コンビナトリアル治療群は、０．９３±０．０１に減衰した野生型よりもわずかに低かったが、有意な差はなかった（図１１Ｃ）。これらのデータは、線維症の軽減及び遺伝子置換が、絶対力及び比力の両方を増加させ、筋肉を収縮誘発性損傷から有意に保護することを示す。

これらの実験は、遺伝子置換を新生児期に開始すべきであることを示唆している。取り組みは明らかに、新生児期にＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーを特定する方向に向かっている。Ｏｈｉｏ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｔｕｄｙは、同じ乾燥血液スポット上でのＤＮＡ確認を伴うバイオマーカー（＞２０００Ｕ／Ｌ）としてＣＫ ７ Ｎｅｕｒｏｌ．を用いた新生児におけるＤＭＤの特定の可能性を示す（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１：３０４－３１３，２０１２）。この方法論は現在、米国（ＰＰＭＤ２０１６年５月１６日：Ｎｅｘｔ Ｓｔｅｐｓ ｗｉｔｈ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）ならびに他の国、特に英国（ＵＫ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及び中国（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（商標）が中国でスクリーニングを開始）において拡張されている。

ｍｉＲ－２９はまた、心臓、肺、及び肝臓線維症のための治療モダリティとしての有望性を示している。マウス及びヒトにおける心筋梗塞は、ｍｉＲ－２９下方調節に関連する。Ｒｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ １０５：１３０２７－１３０３２，２００８）は、線維芽細胞をｍｉＲ－２９ｂ模倣体に曝露することが、コラーゲン転写物を減少させ、心臓線維症の臨床的変換のための経路を提供することを実証した。その後の研究は、ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルにおいて、ｍｉＲ－２９ｂのＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステムに基づく送達を用いて線維症の減弱を達成できることを示した。１４現在、ｍｉＲ－２９ｂ模倣体は、健康なボランティアでの臨床Ｐｈａｓｅ １ Ｓａｆｅｔｙ－Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ局所経皮試験中である（ｍｉＲａｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（商標）ＭＲＧ－２０１）。オリゴヌクレオチドの半減期に関連する反復投与を必要とするｍｉＲ－２９オリゴヌクレオチド送達と比較して、ＡＡＶ遺伝子療法は、単一送達遺伝子導入のための経路を潜在的に提供することができる。

実施例１０
ｍｉＲ－２９及びマイクロジストロフィンの筋特異的発現による治療は線維症及びＥＣＭ発現を減少させた
ｍｉＲ２９ｃ配列及び筋特異的プロモーターＭＣＫを含むＡＡＶベクターも生成し、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターとの併用療法として試験した。本明細書においてｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ２９ｃと称されるｒＡＡＶベクターを生成するために、２２ヌクレオチドｍｉＲ２９ｃ配列（標的鎖配列番号３及びガイド鎖配列番号４）を、ＭＣＫプロモーターによって駆動されるｍｉＲ－３０スカフォールド（配列番号１１）にクローニングした。発現カセット（配列番号１２）を一本鎖ＡＡＶプラスミドにクローニングし、筋肉中でよく発現することが知られている血清型ＡＡＶｒｈ７４を用いてパッケージングした。ｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡは、ｍｉＲ－３０骨格にｍｉＲ－３０ｃ標的（センス）鎖、ｍｉＲ－３０ステムループ、及びｍｉＲ－２９ｃガイド（アンチセンス）鎖を含むカスタムプライマーを用いて合成した。ｍｉＲ－２９ｃ配列の３つの塩基を改変した。次いで、この配列を、ＭＣＫプロモーター及びポリＡ配列によって駆動される一本鎖ＡＡＶ ＩＴＲ含有プラスミドにクローニングした。

ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ２９Ｃプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するｍｉＲ－３０ステムループ骨格にｍｉｒ２９ｃ ｃＤＮＡを含む。ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにカプシド化されたのはこの配列である。さらに、ｍｉＲ－２９ｃ標的配列内のいくつかのヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ（ｌｕｃ）のように、この部位でワトソン－クリック対合を模倣するように変更された。ＳｈＲＮＡ－ｌｕｃ設計に従って、ヘアピンはその長さ全体にわたって完全に相補的でなければならない。加えて、パッセンジャー鎖の変化が多いほど、ステムを介してｍｉＲＮＡを認識することができるｍｉＲ－２９プロセシングを調節する内在性機構の排除の可能性がある。ガイド鎖の１９番目の塩基をシトシンに改変して、天然ｍｉ－２９ｃ配列の切断部位に先行するヌクレオチドを模倣し、他方の鎖上の対応する塩基を変更して対合を保存した。

ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療は、線維症及びＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であった。４～５週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－マウスは、実施例５に記載されているように、左腓腹筋に５ｘ１０^１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ＭｉＲ－２９ｃ及びｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの筋肉内注射を受けた。筋肉を注射の１２週間後に採取した。未注射及びｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの併用療法で注射されたマウスから採取した筋肉のピクロシリウスレッド染色は、併用治療筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示し（図１３ａ及び１３ｂ参照）、ｑＲＴ－ＰＣＲは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認した（図１３ｃ）。半定量ｑＲＴ－ＰＣＲは、反対側の肢の療法と比較したＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるコラーゲン１Ａ及びコラーゲン３Ａ（図１３ｄ、ｅ）、フィブロネクチン（図１３ｆ）、ならびにＴｇｆβ１（図１３ｇ）レベルの有意な減少を示した。（＊ｐ＜０．０５，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の後期治療は、線維症及びＥＣＭ発現を減少させるのに有効である。３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－マウスは、実施例５に記載されているように、左腓腹筋に５ｘ１０^１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ＭｉＲ－２９ｃ及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの筋肉内注射を受けた。筋肉を注射の１２週間後に採取した。未治療、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ、及びＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉のピクロシリウスレッド染色は、併用治療筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの３０．３％減少を有したことを示し（図１４ａ及び１４ｂ参照）、ｑＲＴ－ＰＣＲは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認した（図１４ｃ）。半定量ｑＲＴ－ＰＣＲは、反対側の肢と比較したＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるコラーゲン１Ａ及びコラーゲン３Ａ（図１４ｄ、ｅ）、フィブロネクチン（図１４ｆ）、ならびにＴｇｆβ１（図１４ｇ）レベルの有意な減少を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

実施例１１
早期併用療法は後期治療よりも良好に力を回復し、収縮誘発性損傷から保護する
インビボ力測定を、実施例８及び９に記載されているように、ｍｉＲ－２９及びマイクロジストロフィンの筋特異的発現で早期に治療されたマウスのＧＡＳについて行った。４週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスにおいて、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを用いた併用療法は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスと比較した場合、絶対力の有意な改善を示し、野生型との差はなかった（図１５ａ）。比力もまた、併用療法後に野生型レベルまで正常化した（図１５ｂ）。

筋肉は次いで、実施例９に記載されているように、反復伸張性収縮後の力の喪失について評価された。ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンで併用治療及びｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンで単剤治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－筋肉と比較して力の喪失からの保護を示した（図１５ｃ）。

１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－マウスでは、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを用いた併用治療は、力を回復させ、収縮誘発性損傷に対して保護した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ及びマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶが注射されたＧＡＳ筋の強縮性収縮後の絶対力（図１６ａ）及び正常化比力（図１６ｂ）の測定は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋肉と比較して有意に増加した。その後、筋肉は、実施例９に記載されているように、反復伸張性収縮後の力の喪失について評価された。ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋￥－筋肉と比較して力の喪失からの保護を示した（図１６ｃ）。これらのデータは、線維症の軽減及び遺伝子置換が、絶対力及び比力の両方を増加させ、筋肉を収縮誘発性損傷から有意に保護することを示す。

実施例１２
早期併用治療は筋肥大及び過形成を増加させる
マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶとのｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９の同時送達は、注射の３ヶ月後、単独で注射されたいずれか一方と比較して、被注射腓腹筋の全重量を増加させなかった（図１７ａ）。筋線維直径も測定した。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療は、平均線維サイズの増加を示した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－と比較し、平均直径は２８．９６から３６．０３μｍに増加した（図１７ｂ）。同時送達は野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらした（図１７ｃ）。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ^２当たりの筋線維の数は、未治療マウス及び野生型より有意に少なかった（図１７ｄ、＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

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Ｒ．Ｊ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ： ｔｏｗａｒｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １２， ５５３－５６０ （２０１０）．
１４．Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ， ｔｙｐｅ ２Ｄ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６８， ６２９－６３８ （２０１０）．
１５．Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２Ｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６， ２９０－２９７ （２００９）．
１６．Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １／２ａ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌ ｆｏｒ ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３， １９２－２０１ （２０１５）．
１７．Ｃａｒｎｗａｔｈ， Ｊ．Ｗ．＆ Ｓｈｏｔｔｏｎ， Ｄ．Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌａｒ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ： ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｅｕｓ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ
ｌｏｎｇｕｓ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ８０， ３９－５４ （１９８７）．
１８．Ｃｏｕｌｔｏｎ， Ｇ．Ｒ．， Ｍｏｒｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ， Ｔ．Ａ．＆ Ｓｌｏｐｅｒ， Ｊ．Ｃ． Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｐａｔｈｙ： Ｉ．Ａ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ， ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １４， ５３－７０ （１９８８）．
１９．Ｃｕｌｌｅｎ， Ｍ．Ｊ．＆ Ｊａｒｏｓ， Ｅ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ （ｍｄｘ） ｍｏｕｓｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ７７， ６９－８１ （１９８８）．
２０．Ｄｕｐｏｎｔ－Ｖｅｒｓｔｅｅｇｄｅｎ， Ｅ．Ｅ．＆ ＭｃＣａｒｔｅｒ， Ｒ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｖｅｒｓｕｓ ｈｉｎｄｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １５， １１０５－１１１０ （１９９２）．
２１．Ｓｔｅｄｍａｎ， Ｈ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ５３６－５３９ （１９９１）．
２２．Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ， Ａ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０， ７１７－７２７
（１９９７）．
２３．Ｇｒａｄｙ， Ｒ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０， ７２９－７３８ （１９９７）．
２４．Ｌｏｖｅ， Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３３９， ５５－５８ （１９８９）．
２５．Ｔｉｎｓｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ５９１－５９３ （１９９２）．
２６．Ｔｉｎｓｌｅｙ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ４， １４４１－１４４４ （１９９８）．
２７．Ｓｑｕｉｒｅ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｕｔｒｏｐｈｉｎ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１， ３３３３－３３４４ （２００２）．
２８．Ｒａｆａｅｌ， Ｊ．Ａ．， Ｔｉｎｓｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ａ．Ｃ．， Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ， Ａ．Ｅ．＆ Ｄａｖｉｅｓ， Ｋ．Ｅ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｒｅｓｃｕｅｓ ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９， ７９－８２ （１９９８）．
２９．Ｚｈｏｕ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ
ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｏｒｓｅｎｓ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２６４， １０６－１１１ （２００８）．
３０．Ｇｕｔｐｅｌｌ， Ｋ．Ｍ．， Ｈｒｉｎｉｖｉｃｈ， Ｗ．Ｔ．＆ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｌ．Ｍ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ Ｍｏｕｓｅ Ｖａｌｉｄａｔｅｓ Ｉｔｓ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０， ｅ０１１７３０６ （２０１５）．
３１．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｄ ＤＭＤ ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２， ４９２９－４９３７ （２０１３）．
３２．Ｃｕｓｈｉｎｇ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．ＭＩＲ－２９ ｉｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （２０１０）．
３３．Ｒｏｄｅｒｂｕｒｇ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｍｉＲ－２９ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３， ２０９－２１８ （２０１１）．
３４．Ｎｅｖｏ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ， ｆａｒｎｅｓｙｌｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ （ＦＴＳ）， ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ
ｉｎ ｄｙ／ｄｙ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６， ｅ１８０４９ （２０１１）．
３５．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５， ４５ （２００７）．
３６．Ｍｕｌｉｅｒｉ， Ｌ．Ａ．， Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ， Ｇ．， Ｉｔｔｌｅｍａｎ， Ｆ．， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｅ．Ｍ．＆ Ａｌｐｅｒｔ， Ｎ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｆｒｏｍ ｃｕｔｔｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ ｍｏｎｏｘｉｍｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ６５， １４４１－１４４９ （１９８９）．
３７．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８， １０９－１１７ （２０１０）．
３８．Ｇｒｏｓｅ， Ｗ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ５ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７， ｅ３９２３３ （２０１２）．
３９．Ｌｉｕ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｙｏｕｎｇ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１， ２４５－２５６ （２００５）．

Claims (1)

1. 本願明細書に記載の発明。

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