BR112020025995A2 - administração de microdistrofina músculo-específica por vetor de vírus adeno-associado para tratar a distrofia muscular - Google Patents

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Jerry R. Mendell
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Research Institute At Nationwide Children's Hospital
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Abstract

“administração de microdistrofina músculo-específica por vetor de vírus adeno-associado para tratar a distrofia muscular''. a invenção fornece vetores de terapia gênica, tais como vetores de vírus adeno-associados (aav) que expressam um gene da microdistrofina humana em miniatura e método de uso desses vetores para expressar a microdistrofina em músculos esqueléticos, incluindo o diafragma e o músculo cardíaco e para proteger as fibras musculares de lesões, aumentar a força muscular e reduzir e/ou prevenir a fibrose em sujeitos que sofrem de distrofia muscular.

Description

“ADMINISTRAÇÃO DE MICRODISTROFINA MÚSCULO-ESPECÍFICA POR VETOR DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADO PARA TRATAR A DISTROFIA MUSCULAR”
[001] Este pedido reivindica benefício prioritário ao Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/686,668, depositado em 18 de junho de 2018; Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/740,402, depositado em 2 de outubro de 2018; Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/752,841, depositado em 30 de outubro de 2018; Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/823,649, depositado em 25 de março de 2019 e Pedido de Patente Provisório U.S. N° 62/860,220 depositado 11 de junho de 2018 cada um dos quais estão incorporados por referência neste documento em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE
[002] Este pedido contém, como uma parte separada da divulgação, uma Listagem de Sequência em forma legível por computador que está incorporada por referência em sua totalidade e identificada da seguinte forma: Nome do arquivo: 53169ARTW_Seqlisting.txt; Tamanho: 60.103 bytes, criado em 17 de junho de 2019.
CAMPO DE INVENÇÃO
[003] A invenção fornece vetores de terapia gênica, tais como vetores de vírus adeno-associados (AAV) que expressam um gene da microdistrofina humana em miniatura e método de uso desses vetores para expressar a microdistrofina em músculos esqueléticos, incluindo o diafragma e o músculo cardíaco e para proteger as fibras musculares de lesões, aumentar a força muscular e reduzir e/ou prevenir a fibrose em sujeitos que sofrem de distrofia muscular.
FUNDAMENTOS
[004] A importância da massa muscular e da força para as atividades diárias, como locomoção e respiração, e para o metabolismo de todo o corpo é inequívoca.
Os déficits na função muscular produzem distrofias musculares (MDs) que são caracterizadas por fraqueza e desgaste musculares e têm sérios impactos na qualidade de vida. As MDs mais bem caracterizados resultam de mutações em genes que codificam membros do complexo proteico associado à distrofina (DAPC). Essas MDs resultam da fragilidade da membrana associada à perda de fixação sarcolemal- citoesqueleto pelo DAPC. A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma das doenças musculares mais devastadoras que afetam 1 em cada 5000 recém-nascidos do sexo masculino.
[005] A DMD é causada por mutações no gene DMD que levam a reduções no mRNA e a ausência de distrofina, uma proteína sarcolemal de 427 kD associada ao complexo proteico associado à distrofina (DAPC) (Hoffman et al., Cell 51(6):919- 28, 1987). O DAPC é composto por várias proteínas no sarcolema muscular que formam uma ligação estrutural entre a matriz extracelular (ECM) e o citoesqueleto através da distrofina, uma proteína de ligação à actina, e alfa-distroglicano, uma proteína de ligação à laminina. Essas ligações estruturais atuam para estabilizar a membrana celular muscular durante a contração e protegem contra danos induzidos pela contração. Com a perda de distrofina, a fragilidade da membrana resulta em rupturas do sarcolema e um influxo de cálcio, desencadeando proteases ativadas por cálcio e necrose segmentar de fibras (Straub et al., Curr Opin. Neurol. 10(2): 168-75, 1997). Esse ciclo descontrolado de degeneração e regeneração muscular acaba esgotando a população de células-tronco musculares (Sacco et al., Cell, 2010. 143(7): p. 1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 37-57), resultando em fraqueza muscular progressiva, inflamação do endomísio e cicatrização fibrótica.
[006] Sem estabilização da membrana da distrofina ou de uma microdistrofina, a DMD irá manifestar ciclos descontrolados de lesão tecidual e reparação, em última análise, substituir as fibras musculares perdidas por tecido cicatricial fibrótico através da proliferação do tecido conjuntivo. A fibrose é caracterizada pelos depósitos excessivos de proteínas da matriz ECM, incluindo colágeno e elastina. As proteínas da ECM são produzidas principalmente a partir de citocinas, como o TGF , que é liberado por fibroblastos ativados respondendo ao estresse e inflamação. Embora a principal característica patológica da DMD seja a degeneração e necrose da miofibra, a fibrose como consequência patológica tem repercussões iguais. A superprodução de tecido fibrótico restringe a regeneração muscular e contribui para a fraqueza muscular progressiva no paciente com DMD. Em um estudo, a presença de fibrose nas biópsias musculares iniciais da DMD foi altamente correlacionada com resultado motor ruim em um acompanhamento de 10 anos (Desguerre et al., J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(7): p. 762-7). Estes resultados apontam para a fibrose como um importante contribuinte para a disfunção muscular DMD e destacam a necessidade de intervenção precoce antes da fibrose evidente.
[007] Existe uma necessidade de tratamentos que aumentem a força muscular e protejam contra lesões musculares em doentes que sofrem de DMD.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A presente invenção é direcionada a vetores de terapia gênica, por exemplo, AAV, expressando o gene da microdistrofina aos músculos esqueléticos incluindo diafragma e músculo cardíaco para proteger as fibras musculares de lesões, aumentar a força muscular e reduzir e/ou prevenir a fibrose.
[009] A invenção fornece terapias e abordagens para aumentar a força muscular e/ou aumentar a massa muscular usando vetores de terapia gênica para distribuir microdistrofina para abordar o defeito gênico observado na DMD. O Exemplo 2 descreve um ensaio clínico de distribuição de gene sistêmico para distrofia muscular de Duchenne, neste estudo, os sujeitos receberam 2x1014 vg/kg de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. O estudo clínico descrito no Exemplo 3 fornece um novo protocolo clínico central que inclui um desenho randomizado, duplo-cego,
controlado por placebo. No início do estudo, os sujeitos são randomizados e recebem 2x1014 vg/kg de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina ou solução de Ringer com lactato.
[010] A invenção fornece moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3, 8 ou 9. A invenção também fornece rAAV compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9 ou nucleotídeos 1- 4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, e partículas de rAAV compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9 ou nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
[011] Outro aspecto da invenção fornece composições que compreendem uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, 8 ou 9, rAAV compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9 ou nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3 e partículas de rAAV compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9 ou nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO:
3. Qualquer um dos métodos divulgados neste documento pode ser realizado com estas composições.
[012] A invenção fornece métodos para tratar uma distrofia muscular em um sujeito humano em necessidade, compreendendo a etapa de administrar um adenovírus recombinante associado (rAAV) rAAV.MHCK7.microdistrofina, em que o rAAV é administrado por uma via de administração sistêmica a uma dose de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1015vg/kg. A distrofia muscular pode ser distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker.
[013] Por exemplo, a dose de rAAV administrada é de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 2,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de
1,0x1013 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 6.0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 4,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 1,0x1015, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,5 x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,5 x1014 vg/kg, ou 1,5x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a 4,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou 1,75x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a 4,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a 1,0x1015, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg.
[014] Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem a administração sistêmica de rAAV, em que a via de administração sistêmica é uma via intravenosa e a dose de rAAV administrada é de cerca de 2,0 x1014 vg/kg. Em outra modalidade, os métodos da invenção compreendem a administração sistêmica de rAAV, em que a via de administração sistêmica é uma via intravenosa e a dose do rAAV administrada é de cerca de 5,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 6,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 7,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 8,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 9,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1013 vg/kg, ou de cerca de 2,25x1013 vg/kg, ou de cerca de 2,5x1013 vg/kg, ou de cerca de 2,75x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,25x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,5x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,75x1013 vg/kg, ou de cerca de 4,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 6,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 7,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 8,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 9,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1x1015 vg/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina ou AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[015] Em qualquer um dos métodos da invenção, a dose de rAAV pode ser administrada em cerca de 5 mL/kg a cerca de 15 mL/kg, ou cerca de 8 mL/kg a cerca de 12 mL/kg, ou 8 mL/kg a cerca de 10 mL/kg, ou 5 mL/kg a cerca de 10 mL/kg ou cerca de 10 mL/kg a 12 mL/k, ou cerca de 10 mL/kg a 15 mL/kg ou 10 mL/kg a cerca de 20 mL/kg. Em uma modalidade particular, a dose ou o rAAV é administrada em cerca de 10 mL/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina ou AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[016] Em qualquer um dos métodos da invenção, a dose de rAAV pode ser administrada por injeção, infusão ou implantação. Por exemplo, a dose de rAAV é administrada por infusão durante aproximadamente uma hora. Além disso, a dose de rAAV é administrada por via intravenosa através de uma veia periférica do membro, como uma veia periférica do braço ou uma veia periférica da perna. Como alternativa, a infusão pode ser administrada durante aproximadamente 30 minutos, ou aproximadamente 1,5 hora, ou aproximadamente 2 horas, ou aproximadamente 2,5 horas ou aproximadamente 3 horas. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[017] O rAAV administrado por qualquer um dos métodos da invenção pode compreender a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1, a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7. Além disso, o rAAV administrado por qualquer um dos métodos da invenção compreende a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7. Por exemplo, o rAAV pode compreender a sequência de nucleotídeos do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ IDNO:
6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6.
[018] Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[019] Em qualquer um dos métodos da invenção, o rAAV administrado é do sorotipo AAVrh7.4.
[020] Em algumas modalidades, os métodos da invenção tratam a distrofia muscular de Duchenne ou a distrofia muscular de Becker. Uma modalidade exemplar é um método de tratamento de distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker em um sujeito humano em necessidade, compreendendo a etapa de administrar uma dose de rAAV.MHCK7.microdistrofina associado a adenovírus recombinante (rAAV), em que a via de administração é infusão intravenosa e a dose de rAAV administrada é de cerca de 2x1014 vg/kg por aproximadamente uma hora, e em que o vetor rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou de nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO, 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, AAVrh74.MCK.microdistrofina é AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[021] Em uma modalidade, a invenção fornece um rAAV que compreende uma sequência nucleotídica de elemento de controle específico muscular e uma sequência nucleotídica que codifica a proteína microdistrofina. Por exemplo, a sequência nucleotídica codifica uma proteína microdistrofina funcional, em que o nucleotídeo tem, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, ou 89%, mais tipicamente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, ou 94%, e ainda mais tipicamente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID
NO:1, em que a proteína mantem a atividade de microdistrofina. A proteína microdistrofina fornece estabilidade à membrana muscular durante a contração muscular, por exemplo, a microdistrofina atua como um amortecedor durante a contração muscular. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[022] A invenção também fornece rAAV em que a sequência nucleotídica compreende uma sequência nucleotídica que hibridiza sob condições rigorosas à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, ou complementos desta, e codifica uma proteína microdistrofina funcional.
[023] Em uma modalidade, o rAAV é um vírus adeno-associado recombinante (AAV) não replicante denominado AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Este genoma do vetor contém elementos mínimos necessários para a expressão gênica, incluindo repetições terminais invertidas (ITR) de AAV2, o sinal de microdistrofina, íntron SV40 (SD/SA) e poliadenilação sintética (Poly A), todos sob o controle do promotor/potenciador MHCK7. O esquema do genoma do vetor e o cassete de expressão são mostrados na Figura 1. O sorotipo AAVrh74 pode ser empregado para obter transferência gênica eficiente no músculo esquelético e cardíaco após administração IV.
[024] O termo "rigoroso" é usado para se referir a condições que são comumente compreendidas na técnica como rigorosas. A rigorosidade de hibridização é determinada principalmente pela temperatura, força iônica e concentração de agentes desnaturantes, como a formamida. Exemplos de condições rigorosas para hibridização e lavagem são cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M a 65- 68 oC ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M e formamida a 50% a 42 oC. Ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY 1989). Condições mais rigorosas (como temperatura mais alta, força iônica mais baixa, formamida mais alta ou outro agente desnaturante) também podem ser usadas, no entanto, a taxa de hibridização será afetada. Em casos em que a hibridização de desoxioligonucleotídeos está relacionada, as condições de hibridização rigorosas exemplares adicionais incluem lavagem em 6x SSC de pirofosfato de sódio a 0,05% a 37°C (para oligos de 14 bases), 48°C (para oligos de 17 bases), 55°C (para oligos de 20 bases) e 60°C (para oligos de 23 bases).
[025] Outros agentes podem ser incluídos nos tampões de hibridização e lavagem com o propósito de reduzir a hibridização não específica e/ou de fundo. Os exemplos são albumina sérica bovina a 0,1%, polivinil-pirrolidona a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, dodecilsulfato de sódio a 0,1%, NaDodSO4, (SDS), ficoll, solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (ou outro DNA não complementar) e sulfato de dextrano, embora outros agentes adequados também possam ser usados. A concentração e os tipos desses aditivos podem ser alterados sem afetar substancialmente a rigorosidade das condições de hibridização. Experimentos de hibridização são geralmente realizados a pH 6,8-7,4, no entanto, em condições de força iônica típicas, a taxa de hibridização é quase independente do pH. Ver Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Cap. 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra). As condições de hibridização podem ser ajustadas por aquele versado na técnica para acomodar essas variáveis e permitir que DNAs de diferentes relações de sequência formem híbridos.
[026] O termo "elemento de controle específico muscular" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que regula a expressão de uma sequência codificante que é específica para expressão no tecido muscular. Esses elementos de controle incluem potenciadores e promotores. A invenção fornece construtos compreendendo o promotor MCKH7 dos elementos de controle específicos musculares, promotor MCK e potenciador MCK.
[027] O termo "operacionalmente ligado" refere-se ao posicionamento da sequência nucleotídica do elemento regulador, por exemplo, sequência nucleotídica promotora, para conferir a expressão da referida sequência nucleotídica pelo referido elemento regulador.
[028] Em um aspecto, a invenção fornece um rAAV em que o elemento de controle específico muscular é um elemento do gene da actina esquelética humana, fator de ligação potencializador específico de miócitos (MEF), creatinoquinase muscular (MCK), MCK truncado (tMCK), cadeia pesada de miosina (MHC), potenciador de cadeia pesada de α-miosina híbrida/promotor de potencializador de MCK (MHCK7), C5-12, elemento potenciador de creatina quinase murina, elemento do gene troponina c de rápida contração esquelética, elemento do gene da troponina c cardíaca de contração lenta, o elemento do gene da troponina i de contração lenta, fatores nucleares induzíveis por hipóxia, elemento induzível por esteroides ou elemento de resposta a glicocorticoide (GRE).
[029] Por exemplo, o elemento de controle específico muscular é a sequência nucleotídica do promotor MHCK7 SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7, ou o elemento de controle específico muscular é a sequência nucleotídica MCK SEQ ID NO: 4. Além disso, em qualquer um dos vetores rAAV da invenção, a sequência nucleotídica do elemento de controle específico muscular, por exemplo, sequência nucleotídica MHCK7 ou MCK, está operacionalmente ligada à sequência nucleotídica que codifica a proteína microdistrofina. Por exemplo, a sequência nucleotídica do promotor de MHCK7 (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7) está operacionalmente ligada à sequência codificante de microdistrofina humana (SEQ ID NO: 1) conforme estabelecido no construto fornecido na Figura 1 ou Figura 2 (SEQ ID NO: 3) ou Figura 13 (SEQ ID NO: 9). Em outro exemplo, o promotor MCK (SEQ ID NO: 4) está operacionalmente ligado à sequência codificante de microdistrofina humana (SEQ ID NO: 1) conforme estabelecido no construto fornecido na Figura 5 ou Figura 6 (SEQ ID NO: 5). Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor rAAV compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7. A invenção também fornece um vetor rAAV compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4.
[030] Em outro aspecto, a invenção fornece um construto de rAAV contido no plasmídeo compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 8. Por exemplo, o vetor AAVrh74.MHCK7.microdistrofina compreende a sequência nucleotídica dentro e incluindo as ITRs da SEQ ID NO: 3 e mostrada na Figura 2. O vetor rAAV compreende a 5' ITR, promotor MHCK7, uma sequência de íntron quimérico, a sequência codificante para o gene da microdistrofina humana, poliA e 3' ITR. Em uma modalidade, o vetor compreende nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3. O plasmídeo estabelecido na SEQ ID NO: 3 compreende ainda resistência à ampicilina e a estrutura principal do plasmídeo pGEX com origem pBR322 de replicação.
[031] Em outro aspecto, a invenção fornece um rAAV que compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9. Por exemplo, o construto de vetor AAVrh74.MHCK7.microdistrofina compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9 e mostrada na Figura 13. Este construto do vetor de rAAV compreende o promotor de MHCK7, uma sequência de íntron quimérica, a sequência codificante para o gene da microdistrofina humana e poliA. Em uma modalidade, o construto de vetor rAAV compreende ainda uma 5'ITR para o promotor e uma 3'ITR para a poliA. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.
[032] Em outro aspecto, o vetor AAVrh74.MHCK7.microdistrofina compreende a sequência nucleotídica dentro e incluindo as ITRs da SEQ ID NO: 8 e mostrada na Figura 15. O vetor rAAV compreende a 5' ITR, promotor MHCK7, uma sequência de íntron quimérico, a sequência codificante para o gene da microdistrofina humana, poliA e 3' ITR. Em uma modalidade, o vetor compreende nucleotídeos 1- 4977 da SEQ ID NO: 9. O plasmídeo estabelecido na SEQ ID NO: 3 compreende ainda resistência à canamicina e a estrutura principal do plasmídeo pGEX com origem de replicação pBR322.
[033] Em outro aspecto, a invenção fornece um plasmídeo que compreende o construto de vetor AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, o plasmídeo compreende a 5' ITR, promotor de MHCK7, uma sequência de íntron quimérica, a sequência codificante para o gene da microdistrofina humana, poliA, e 3' ITR. Em uma modalidade, o plasmídeo compreende resistência à canamicina e, opcionalmente, compreende a estrutura principal do plasmídeo pGEX com origem de replicação de pBR322. Em uma modalidade particular, o plasmídeo é estabelecido na SEQ ID NO: 8 e mostrado nas Figuras 14 e 15.
[034] A invenção fornece um vetor AAV recombinante compreendendo a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica do promotor de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7. Esse vetor rAAV é o sorotipo AAVrh.74 de AAV.
[035] A invenção também proporciona um rAAV compreendendo a sequência de nucleotídeos do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina dentro e incluindo as ITRs na SEQ ID NO: 3, a sequência de nucleotídeos dentro e incluindo as ITRs na SEQ ID NO: 8 ou a sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:
9. Esse vetor rAAV é o sorotipo AAVrh.74 de AAV.
[036] Os vetores de rAAV da invenção podem ser qualquer sorotipo de AAV, como o sorotipo AAVrh.74, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9,
AAV10, AAV11, AAV12 ou AAV13.
[037] A invenção também fornece composições farmacêuticas (ou às vezes referidas neste documento como simplesmente "composições") compreendendo qualquer um dos vetores rAAV da invenção.
[038] Em outra modalidade, a invenção fornece métodos de produção de uma partícula de vetor rAAV compreendendo cultivar uma célula que foi transfectada com qualquer vetor rAAV da invenção e recuperar partículas de rAAV do sobrenadante das células transfectadas. A invenção também fornece partículas virais compreendendo qualquer um dos vetores AAV recombinantes da invenção.
[039] Em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular, o nível de expressão do gene da microdistrofina em uma célula do sujeito aumenta após a administração de rAAV. A expressão do gene da microdistrofina na célula é detectada pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot no músculo submetido à biópsia antes e após a administração do rAAV. Em particular, o nível da proteína microdistrofina é aumentado em pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 80% a pelo menos cerca de 90% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração de rAAV. Por exemplo, o nível da proteína microdistrofina aumenta em pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 71% ou pelo menos cerca de 72% ou pelo menos cerca de 73% ou pelo menos cerca de 74% ou pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 76% ou pelo menos cerca de 77% ou pelo menos cerca de 78% ou pelo menos cerca de 79% ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração de rAAV.
[040] Além disso, a expressão do gene da microdistrofina na célula é detectada pela medição do nível de proteína microdistrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV. O nível da proteína microdistrofina é aumentado em pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 80% a pelo menos cerca de 90% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração de rAAV. Por exemplo, o nível da proteína microdistrofina aumenta em pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 71% ou pelo menos cerca de 72% ou pelo menos cerca de 73% ou pelo menos cerca de 74% ou pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 76% ou pelo menos cerca de 77% ou pelo menos cerca de 78% ou pelo menos cerca de 79% ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração de rAAV.
[041] Em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV. Por exemplo, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 65% a cerca de 90% ou cerca de 65% a cerca de 95% ou cerca de 75% a cerca de 90% ou cerca de 80% a cerca de 90% ou cerca de 85% a cerca de 95% ou cerca de 87% a cerca de 95% ou cerca de 87% até cerca de 90% até 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV. Em particular, em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 87% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 72% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV, ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 73% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV, ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 78% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV, ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 95% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV. Em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular, o número de fibras positivas para microdistrofina no tecido muscular do sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o número de fibras positivas para microdistrofina antes da administração do rAAV. Por exemplo, o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
[042] Em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular, a administração do rAAV regula positivamente a expressão de proteínas DAPC, tais como alfa-sarcoglicano ou beta-sarcoglicano. Por exemplo, o nível de alfa- sarcoglicano no sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o nível de alfa-sarcoglicano antes da administração do rAAV. Além disso, o nível de beta-sarcoglicano no sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o nível de beta-sarcoglicano antes da administração do rAAV. O nível de alfa- sarcoglicano ou beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa- sarcoglicano ou beta-sarcoglicano por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
[043] Em qualquer um dos métodos de tratamento da distrofia muscular, a progressão da doença no sujeito é retardada após a administração de rAAV, conforme medido por qualquer um dos seguintes: teste de caminhada de seis minutos, tempo para levantar, subida de 4 degraus, subida e descida de 4 degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), teste cronometrado de 10 metros, teste cronometrado de 100 metros, dinamometria manual (HHD), Subida e Descida Cronometradas, e/ou escore em Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III).
[044] Por exemplo, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 6 pontos no escore de NSAA pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o escore de NSAA antes da administração do rAAV. Adicionalmente, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de cerca de 0,8 segundos no tempo para levantar pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo para levantar antes da administração do rAAV. Além disso, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem pelo menos uma melhora de cerca de 1,2 segundo no tempo do teste de subida de 4 degraus pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo do teste de subida de 4 degraus antes da administração do rAAV. Além disso, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de pelo menos cerca de 7 segundos no teste cronometrado de 100 m pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o teste cronometrado de 100 m antes da administração do rAAV.
[045] Em outra modalidade, a invenção fornece métodos de expressão do gene da microdistrofina em uma célula do paciente, compreendendo administrar ao paciente a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO:6. Por exemplo, a expressão do gene da microdistrofina na célula do paciente é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do construto de rAAV.MHCK7.microdistrofina. Além disso, a expressão do gene da microdistrofina é medida no paciente através da detecção de um número maior de genomas do vetor por núcleo, em que 1 genoma do vetor por núcleo é cerca de 50% de expressão da microdistrofina e maior que 1 cópia por núcleo é consistente com o nível de expressão da microdistrofina. Por exemplo, as células têm 1,2 cópias de vetor por núcleo, ou 1,3 cópias de vetor por núcleo, ou 1,4 cópias de vetor por núcleo, ou 1,5 cópias de vetor por núcleo, ou 1,6 cópias de vetor por núcleo, ou 1,7 cópias de vetor por núcleo, ou 1,8 cópias de vetor por núcleo, ou 1,9 cópias de vetor por núcleo.
[046] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece métodos para diminuir os níveis de CK sérica em um paciente em necessidade, o método compreendendo administrar ao paciente a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO:8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Por exemplo, o nível de CK sérica no paciente é reduzido em pelo menos cerca de 65% a cerca de 90% ou cerca de 65% a cerca de 95% ou cerca de 75% a cerca de 90% ou cerca de 80% a cerca de 90% ou cerca de 85% a cerca de 95% ou cerca de 87% a cerca de 95% a cerca de 87% até cerca de 90% até cerca de 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV. Em particular, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 87% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 72% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV, ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 73% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV, ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 78% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV, ou em qualquer um dos métodos de tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 95% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV.
[047] A invenção também fornece métodos para aumentar as fibras positivas para microdistrofina em um tecido muscular do paciente, compreendendo administrar ao paciente a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO:8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Por exemplo, o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína distrofina por Western blot e imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV. Além disso, a expressão do gene da microdistrofina é medida no paciente através da detecção de um número maior de genomas do vetor por núcleo, em que 1 genoma do vetor por núcleo é cerca de 50% de expressão da microdistrofina e maior que 1 cópia por núcleo é consistente com o nível de expressão da microdistrofina. Por exemplo, as células têm 1,2 cópias de vetor por núcleo, ou 1,3 cópias de vetor por núcleo, ou 1,4 cópias de vetor por núcleo, ou 1,5 cópias de vetor por núcleo, ou 1,6 cópias de vetor por núcleo, ou 1,7 cópias de vetor por núcleo, ou 1,8 cópias de vetor por núcleo, ou 1,9 cópias de vetor por núcleo.
[048] Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para aumentar a expressão de alfa-sarcoglicano em um paciente em necessidade, compreendendo administrar ao paciente a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO:8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Por exemplo, o nível de alfa-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa-sarcoglicano por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
[049] Além disso, a invenção fornece métodos para aumentar a expressão de beta-sarcoglicano em um paciente em necessidade, compreendendo administrar ao paciente a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO:8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Por exemplo, o nível de beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína beta-sarcoglicano por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
[050] A invenção também fornece métodos para tratar um paciente com distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker, compreendendo administrar ao paciente a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6, de modo que a progressão da doença no paciente seja retardada conforme medido por qualquer um dos seguintes: teste de caminhada de seis minutos, tempo para levantar, subida de 4 degraus, subida e descida de 4 degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), teste cronometrado de 10 metros, teste cronometrado de 100 metros, dinamometria manual (HHD), Subida e Descida Cronometradas e/ou escore em Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III).
[051] Por exemplo, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 6 pontos no escore de NSAA pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o escore de NSAA antes da administração do rAAV. Adicionalmente, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de cerca de 0,8 segundos no tempo para levantar pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo para levantar antes da administração do rAAV. Além disso, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem pelo menos uma melhora de cerca de 1,2 segundo no tempo do teste de subida de 4 degraus pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo do teste de subida de 4 degraus antes da administração do rAAV. Além disso, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de pelo menos cerca de 7 segundos no teste cronometrado de 100 m pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o teste cronometrado de 100 m antes da administração do rAAV.
[052] “Fibrose” refere-se à deposição excessiva ou não regulada de componentes da matriz extracelular (ECM) e processos de reparo anormais em tecidos após lesão, incluindo músculo esquelético, músculo cardíaco, fígado, pulmão, rim e pâncreas. Os componentes da ECM que são depositados incluem fibronectina e colágeno, por exemplo, colágeno 1, colágeno 2 ou colágeno 3.
[053] A invenção também fornece métodos para reduzir ou prevenir a fibrose em um sujeito que sofre de distrofia muscular compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um rAAV compreendendo a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7; ou um vetor rAAV compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO:
9. Em outra modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina dos nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou nucleotídeos 56-5066 da SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[054] Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para prevenir a fibrose em um sujeito em necessidade, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica do promotor de MHCK7 da SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO: 7; ou vetor rAAV compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAV74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Por exemplo, qualquer um dos rAAV da invenção pode ser administrado a sujeitos que sofrem de distrofia muscular para prevenir fibrose, por exemplo, o rAAV da invenção que expressa uma proteína de microdistrofina humana administrada antes da fibrose ser observada no sujeito. Além disso, o rAAV da invenção que expressa um gene da microdistrofina humana pode ser administrado a um sujeito em risco de desenvolver fibrose, tal como aqueles que sofrem ou foram diagnosticados com distrofia muscular, por exemplo, DMD. O rAAV da invenção pode ser administrado ao sujeito sofrendo de distrofia muscular a fim de prevenir nova fibrose nesses sujeitos.
[055] A invenção contempla a administração de rAAV antes da fibrose ser observada no sujeito. Além disso, o rAAV pode ser administrado a um sujeito em risco de desenvolver fibrose, como aqueles que sofrem ou diagnosticados com uma distrofia muscular, por exemplo, DMD. O rAAV pode ser administrado ao participante que sofre de distrofia muscular e que já desenvolveu fibrose para prevenir nova fibrose nesses sujeitos.
[056] A invenção também fornece métodos para aumentar a força muscular e/ou massa muscular em um sujeito sofrendo de uma distrofia muscular compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica do promotor de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7; ou um rAAV compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6.
[057] A invenção contempla a administração de vetores rAAV a sujeitos diagnosticados com DMD antes da fibrose ser observada no sujeito ou antes da força muscular ter sido reduzida ou antes da massa muscular ter sido reduzida.
[058] A invenção também fornece a administração da sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica do promotor de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7; ou um rAAV compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 a um sujeito que sofre de uma distrofia muscular que já desenvolveu fibrose, a fim de prevenir novas fibroses nesses sujeitos ou reduzir a fibrose nesses sujeitos. A invenção também fornece a administração da sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica do promotor de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7; ou um rAAV compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID
NO: 6 a um sujeito que sofre de uma distrofia muscular que já possui força muscular reduzida ou massa muscular reduzida, a fim de proteger o músculo de lesões adicionais.
[059] Em qualquer um dos métodos da invenção, o sujeito pode estar sofrendo de uma distrofia muscular, tal como DMD ou qualquer outra distrofia muscular associada à distrofina.
[060] Em outras modalidades de qualquer um dos métodos da invenção descrita neste documento, o nível de CK sérica no sujeito diminui após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV em um nível percentual selecionado do grupo que consiste em: a) pelo menos 78% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; b) pelo menos 46, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 85% em 270 dias após a administração; c) pelo menos 72, 73, 74 ou 95% em 180 dias após a administração; d) pelo menos 87, 88, 93 ou 95% em 90 dias após a administração; e) pelo menos 70% em 270 dias após a administração; f) 70 a 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; g) pelo menos 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, ou 95% por 90, 180, ou 270 dias após a administração; e h) pelo menos 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, ou 95 % em 90, 180, ou 270 dias após a administração.
[061] Em outra modalidade, a invenção fornece composições para tratar uma distrofia muscular em um sujeito humano em necessidade, em que a composição compreende uma dose de rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), em que a composição é formulada para uma via de administração sistêmica e a dose do rAAV é de cerca de 1x1014 vg/kg a cerca de 4x1014 vg/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[062] Por exemplo, a composição da invenção compreende uma dose de rAAV de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg,/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 2,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1013 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou
1,0x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou 1,0x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 4,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a 1,0x1015, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,5 x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,5 x1014 vg/kg, ou 1,5x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a 4,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou 1,75x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a 4,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a 1,0x1015, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a 6,0x1014, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a 5,0x1014, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014 vg/kg,
ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56- 4820 da SEQ ID NO: 5.
[063] Em uma modalidade, as composições da invenção são formuladas para administração intravenosa e compreendem uma dose de rAAV que é de cerca de 2,0x1014 vg/kg. Em outra modalidade, as composições da invenção são formuladas para administração intravenosa e compreendem uma dose de rAAV que é cerca de 5,0x1012 vg/kg, ou cerca de 6,0x1012 vg/kg, ou cerca de 7,0x1012 vg/kg, ou cerca de 8,0x1012 vg/kg, ou cerca de 9,0x1012 vg/kg, ou cerca de 1,0x1013 vg/kg, ou cerca de 1,25x1013 vg/kg, ou cerca de 1,5x1013 vg/kg, ou cerca de 1,75x1013 vg/kg, ou cerca de 2,25x1013 vg/kg, ou cerca de 2,5x1013 vg/kg, ou cerca de 2,75x1013 vg/kg, ou cerca de 3,0x1013 vg/kg, ou cerca de 3,25x1013 vg/kg, ou cerca de 3,5x1013 vg/kg, ou cerca de 3,75x1013 vg/kg, ou cerca de 4,0x1013 vg/kg, ou cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou cerca de 6,0x1013 vg/kg, ou cerca de 7,0x1013 vg/kg, ou cerca de 8,0x1013 vg/kg, ou cerca de 9,0x1013 vg/kg, ou cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou cerca de 1,25x1014 vg/kg, ou cerca de 1,5x1014 vg/kg, ou cerca de 1,75x1014 vg/kg, ou cerca de 2,25x1014 vg/kg, ou cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou cerca de 1x1015. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56- 4820 da SEQ ID NO: 5.
[064] Em qualquer uma das composições da invenção, a dose de rAAV é distribuída em cerca de 5 mL/kg a cerca de 15 mL/kg, ou em cerca de 8 mL/kg a cerca de 12 mL/kg, ou em cerca de 8 mL/kg a cerca de 10 mL/kg, ou em cerca de 5 mL/kg a cerca de 10 mL/kg, ou em cerca de 10 mL/kg a cerca de 12 mL/kg, ou em cerca de 10 mL/kg a cerca de 15 mL/kg ou em cerca de 10 mL/kg a cerca de 20 mL/kg. Em uma modalidade particular, a composição compreende uma dose do rAAV distribuída em cerca de 10 mL/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[065] As composições da invenção são formuladas para administração por injeção, infusão ou implante. Por exemplo, as composições são formuladas para administração por infusão durante aproximadamente uma hora. Além disso, as composições da invenção são formuladas para administração intravenosa através de uma veia periférica do membro, tal como uma veia periférica do braço ou uma veia periférica da perna. Como alternativa, a infusão pode ser administrada durante aproximadamente 30 minutos, ou aproximadamente 1,5 hora, ou aproximadamente 2 horas, ou aproximadamente 2,5 horas ou aproximadamente 3 horas.
[066] Qualquer uma das composições da invenção compreende um rAAV que compreende a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:7 ou um vetor rAAV que compreende a sequência nucleotídica de construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6.
[067] Em particular, as composições da invenção são para tratar a distrofia muscular de Duchenne ou a distrofia muscular de Becker. Por exemplo, a invenção fornece composições para tratar a distrofia muscular de Duchenne ou a distrofia muscular de Becker em um sujeito humano em necessidade, em que a composição compreende uma dose de rAAV.MHCK7.microdistrofina recombinante associada a adenovírus (rAAV), em que a composição é formulada para administração por infusão intravenosa durante aproximadamente uma hora e a dose de rAAV administrada é de cerca de 2x 1014 vg/kg, e em que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, ou os nucleotídeos 56- 5022 da SEQ ID NO: 6.
[068] Em outra modalidade, a invenção também fornece uma composição compreendendo rAAV para reduzir a fibrose em um sujeito em necessidade. Além disso, a invenção fornece uma composição compreendendo vetores rAAV para prevenir fibrose em um sujeito que sofre de uma distrofia muscular.
[069] A invenção também fornece composições compreendendo rAAV para aumentar a força muscular e/ou massa muscular em um sujeito que sofre de uma distrofia muscular. Em outra modalidade, a invenção fornece composições compreendendo qualquer um dentre o rAAV da invenção para o tratamento de distrofia muscular.
[070] Em outras modalidades de qualquer uma das composições da invenção, após a administração da referida composição a um sujeito humano em necessidade de tratamento para distrofia muscular, o nível de CK sérica no sujeito diminui em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição em um nível percentual selecionado do grupo que consiste em: a) pelo menos 78% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; b) pelo menos 46. 55, 70 ou 85% em 270 dias após a administração; c) pelo menos 72, 73, 74 ou 95% em 180 dias após a administração; d) pelo menos 87, 99, 93 ou 95% em 90 dias após a administração; e) pelo menos 70% em 270 dias após a administração; f) 70 a 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; g) pelo menos 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; e h) 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração.
[071] Em outra modalidade. a invenção fornece o uso de uma dose de rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma distrofia muscular em um sujeito humano em necessidade, em que o medicamento é formulado para uma via de administração sistêmica e a dose do rAAV é de cerca de 1x1014 vg/kg a cerca de 4x 1014 vg/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[072] Por exemplo, o medicamento compreende uma dose de rAAV de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 2,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,5 x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de
1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg a cerca de 3,5 x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 4,0x1014, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg a cerca de 2,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 1,0x1015, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 6,0x1014, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 5,0x1014, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca e 4,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,0x1014 vg/kg a cerca de 3,25x1014 vg/kg.
Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da
SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[073] Em uma modalidade, os medicamentos da invenção são formulados para administração sistêmica de uma dose de rAAV em que a via de administração sistêmica é uma via intravenosa e a dose do rAAV administrada é de cerca de 2,0 x1014 vg/kg. Em outra modalidade, o medicamento da invenção é formulado para administração sistêmica de uma dose de rAAV em que a via de administração sistêmica é uma via intravenosa e a dose do rAAV é de cerca de 5,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 6,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 7,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 8,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 9,0x1012 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1013 vg/kg, ou de cerca de 2,25x1013 vg/kg, ou de cerca de 2,5x1013 vg/kg, ou de cerca de 2,75x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,25x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,5x1013 vg/kg, ou de cerca de 3,75x1013 vg/kg, ou de cerca de 4,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 6,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 7,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 8,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 9,0x1013 vg/kg, ou de cerca de 1,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 1,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 2,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,25x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,5x1014 vg/kg, ou de cerca de 3,75x1014 vg/kg, ou de cerca de 4,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 5,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 6,0x1014 vg/kg, ou de cerca de 1x1015 vg/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é
AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[074] Em qualquer um dos usos da invenção, o medicamento compreende uma dose do rAAV de cerca de 5 mL/kg a cerca de 15 mL/kg, ou de cerca de 8 mL/kg a cerca de 12 mL/kg, ou de cerca de 8 mL/kg a cerca de 10 mL/kg, ou de cerca de 5 mL/kg a cerca de 10 mL/kg, ou de cerca de 10 mL/kg a cerca de 12 mL/kg, ou de cerca de 10 mL/kg a cerca de 15 mL/kg, ou de cerca de 10 mL/kg a cerca de 20 mL/kg. Em uma modalidade particular, a dose do rAAV é de cerca de 10 mL/kg. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina é a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o rAAV é AAVrh74.MCK.microdistrofina. Em uma modalidade, a AAVrh74.MCK.microdistrofina é a AAVrh74.MCK.microdistrofina dos nucleotídeos 56-4820 da SEQ ID NO: 5.
[075] Em qualquer um dos usos da invenção, o medicamento é formulado para administração por injeção, infusão ou implantação. Por exemplo, o medicamento é formulado para administração por infusão durante aproximadamente uma hora. Além disso, o medicamento é formulado para administração intravenosa através de uma veia periférica do membro, como uma veia periférica do braço ou uma veia periférica da perna. Como alternativa, a infusão pode ser administrada durante aproximadamente 30 minutos, ou aproximadamente 1,5 hora, ou aproximadamente 2 horas, ou aproximadamente 2,5 horas ou aproximadamente 3 horas.
[076] Em qualquer um dos usos da invenção, o medicamento compreende um rAAV que compreende a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:7 ou a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ
ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6.
[077] Uma utilização particular da invenção é para a preparação de um medicamento para o tratamento da distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker. Por exemplo, a invenção fornece o uso de uma dose de rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para a preparação de um medicamento para tratar a distrofia muscular de Duchenne em um sujeito humano em necessidade, em que o medicamento é formulado para administração por infusão intravenosa por aproximadamente uma hora e a dose do rAAV administrado é de cerca de 2x 1014 vg/kg e em que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6.
[078] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de um rAAV para a preparação de um medicamento para reduzir a fibrose em um sujeito em necessidade. Por exemplo, o sujeito em necessidade pode estar sofrendo de uma distrofia muscular, como a DMD ou qualquer outra distrofia muscular associada à distrofina.
[079] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de um rAAV para a preparação de um medicamento para prevenir fibrose em um sujeito que sofre de uma distrofia muscular.
[080] Além disso, a invenção prevê o uso de um rAAV para a preparação de um medicamento para aumentar a força muscular e/ou massa muscular em um sujeito sofrendo de distrofia muscular.
[081] A invenção também fornece o uso do rAAV para a preparação de um medicamento para o tratamento da distrofia muscular.
[082] A invenção proporciona a utilização de um vetor rAAV compreendendo a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma distrofia muscular ou um vetor rAAV compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrf74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para tratamento de distrofia muscular.
[083] Em outras modalidades de qualquer um dos usos da invenção, o nível de CK sérica no sujeito diminui após a administração do rAAV ao sujeito em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV em um nível percentual selecionado do grupo que consiste em: a) pelo menos 78% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; b) pelo menos 46. 55, 70 ou 95% em 270 dias após a administração; c) pelo menos 72, 73, 74 ou 95% em 180 dias após a administração; d) pelo menos 87, 88, 93 ou 95% em 90 dias após a administração; e) pelo menos 70% em 270 dias após a administração; f) 70 a 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; g) pelo menos 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; e h) 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração.
[084] Em qualquer uma das composições para tratar uma distrofia muscular ou os usos de um medicamento para tratar uma distrofia muscular, o nível de expressão do gene da microdistrofina numa célula do indivíduo aumenta após a administração da composição ou medicamento. A expressão do gene da microdistrofina na célula é detectada pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot no músculo submetido à biópsia antes e após a administração da composição ou medicamento. Em particular, o nível da proteína microdistrofina é aumentado em pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 80% a pelo menos cerca de 90% após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração da composição ou medicamento. Por exemplo, o nível da proteína microdistrofina aumenta em pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 71% ou pelo menos cerca de 72% ou pelo menos cerca de 73% ou pelo menos cerca de 74% ou pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 76% ou pelo menos cerca de 77% ou pelo menos cerca de 78% ou pelo menos cerca de 79% ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85% após a administração da composição em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração da composição ou medicamento.
[085] Além disso, a expressão do gene da microdistrofina na célula é detectada pela medição do nível de proteína microdistrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração da composição ou medicamento. O nível da proteína microdistrofina é aumentado em pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 70% a pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 80% a pelo menos cerca de 90% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração da composição ou medicamento. Por exemplo, o nível da proteína microdistrofina aumenta em pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 71%, ou pelo menos cerca de 72%, ou pelo menos cerca de 73%, ou pelo menos cerca de 74%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%
após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração da composição ou medicamento.
[086] Em qualquer uma das composições para tratar uma distrofia muscular, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido após a administração do rAAV em comparação ao nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento. Por exemplo, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 65% a cerca de 90%. ou em cerca de 65% a cerca de 95%, ou em cerca de 75% a cerca de 90%, ou em cerca de 80% a cerca de 90%. ou em cerca de 85% a cerca de 95%, ou em cerca de 87% a cerca de 95%, ou em cerca de 87% a cerca de 90% em cerca de 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento. Em particular, em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 87% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento, ou em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 72% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento, ou em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 73% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento, ou em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 78% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição, ou em qualquer uma das composições para tratar uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular da invenção, o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em cerca de 95% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento. Em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular, o número de fibras positivas para microdistrofina no tecido muscular do sujeito é aumentado após a administração da composição ou medicamento em comparação com o número de fibras positivas para microdistrofina antes da administração da composição ou medicamento. Por exemplo, o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração da composição ou medicamento.
[087] Em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular, a administração da composição ou medicamento regula positivamente a expressão de proteínas DAPC, tais como alfa-sarcoglicano ou beta-sarcoglicano. Por exemplo, o nível de alfa-sarcoglicano no sujeito é aumentado após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de alfa-sarcoglicano antes da administração da composição ou medicamento. Além disso, o nível de beta- sarcoglicano no sujeito é aumentado após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de beta-sarcoglicano antes da administração da composição ou medicamento. O nível de alfa-sarcoglicano ou beta- sarcoglicano é detectado pela medição do nível da proteína alfa-sarcoglicano ou beta- sarcoglicano por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração da composição ou medicamento.
[088] Em qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular, a progressão da doença no sujeito é retardada após a administração da composição ou medicamento, conforme medido por qualquer um dos seguintes testes: teste de caminhada de seis minutos, tempo para levantar, subida de 4 degraus, subida e descida de 4 degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), teste cronometrado de 10 metros, teste cronometrado de 100 metros, dinamometria manual (HHD), Subida e Descida Cronometradas, e/ou escore em Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III).
[089] Por exemplo, após a administração de qualquer uma das composições para tratamento de uma distrofia muscular ou dos usos de um medicamento para tratamento de uma distrofia muscular, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 6 pontos na pontuação da NSAA pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com a pontuação da NSAA antes da administração do rAAV. Ademais, em qualquer um dos métodos, o sujeito tem uma melhora de pelo menos cerca de 0,8 segundo no tempo para levantar pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o tempo para levantar antes da administração da composição ou medicamento. Além disso, em qualquer um dos métodos ou usos da invenção, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 1,2 segundo no tempo do teste de subida de 4 degraus pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o tempo do teste de subida de 4 degraus antes da administração da composição ou medicamento. Além disso, em qualquer um dos métodos ou usos da invenção, o sujeito tem pelo menos cerca de 7 segundos de melhora no teste cronometrado de 100 m pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o teste cronometrado de 100 m antes da administração da composição ou medicamento.
[090] Em outra modalidade, a invenção fornece composições para expressão do gene da microdistrofina na célula de um paciente compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o uso de uma dose de uma sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para a preparação de um medicamento para expressão do gene da microdistrofina na célula de uma paciente. Por exemplo, a expressão do gene da microdistrofina na célula do paciente é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do construto de rAAV.MHCK7.microdistrofina. Além disso, a expressão do gene da microdistrofina é medida no paciente através da detecção de um número maior de genomas do vetor por núcleo, em que 1 genoma do vetor por núcleo é cerca de 50% de expressão da microdistrofina e maior que 1 cópia por núcleo é consistente com o nível de expressão da microdistrofina. Por exemplo, as células têm 1,2 cópias de vetor por núcleo, ou 1,3 cópias de vetor por núcleo, ou 1,4 cópias de vetor por núcleo, ou 1,5 cópias de vetor por núcleo, ou 1,6 cópias de vetor por núcleo, ou 1,7 cópias de vetor por núcleo, ou 1,8 cópias de vetor por núcleo, ou 1,9 cópias de vetor por núcleo.
[091] Numa modalidade adicional, a invenção fornece composições para diminuição dos níveis séricos de CK num paciente em necessidade, a composição compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da
SEQ ID NO: 6. Além disso, a invenção fornece o uso de uma dose da sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para a preparação de um medicamento para diminuição dos níveis séricos de CK em um paciente em necessidade. Por exemplo, o nível de CK sérica no paciente é reduzido em pelo menos cerca de 65% a cerca de 90%, ou em cerca de 65% a cerca de 95%, ou em cerca de 75% a cerca de 90%, ou em cerca de 80% a cerca de 90%, ou em cerca de 85% a cerca de 95%, ou em cerca de 87% a cerca de 95%, ou em cerca de 87% a cerca de 90% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento. Em particular, o nível de CK sérica no sujeito é diminuído em cerca de 87% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento, ou diminuído em cerca de 72% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérico antes da administração da composição ou medicamento, ou diminuído em cerca de 73% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento, ou diminuído em cerca de 78% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição ou medicamento, ou diminuído em cerca de 95% em 60 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o nível de CK sérico antes da administração da composição ou medicamento.
[092] A invenção também fornece composições para aumento das fibras positivas para microdistrofina em um tecido muscular de paciente compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID
NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. Além disso, a invenção fornece o uso de uma dose da sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para a preparação de um medicamento para aumento das fibras positivas para microdistrofina no tecido muscular de um paciente. Por exemplo, o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína distrofina por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração da composição ou medicamento. Além disso, a expressão do gene da microdistrofina é medida no paciente através da detecção de um número maior de genomas do vetor por núcleo, em que 1 genoma do vetor por núcleo é cerca de 50% de expressão da microdistrofina e maior que 1 cópia por núcleo é consistente com o nível de expressão da microdistrofina. Por exemplo, as células têm 1,2 cópias de vetor por núcleo, ou 1,3 cópias de vetor por núcleo, ou 1,4 cópias de vetor por núcleo, ou 1,5 cópias de vetor por núcleo, ou 1,6 cópias de vetor por núcleo, ou 1,7 cópias de vetor por núcleo, ou 1,8 cópias de vetor por núcleo, ou 1,9 cópias de vetor por núcleo.
[093] Em outra modalidade, a invenção proporciona composições para aumentar a expressão de alfa-sarcoglicano num paciente em necessidade compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. A invenção também fornece o uso de uma dose da sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para a preparação de um medicamento para aumento da expressão de alfa-sarcoglicano em um paciente em necessidade. Por exemplo, o nível de alfa-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa-sarcoglicano por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração da composição ou medicamento.
[094] Além disso, a invenção fornece composições para aumentar a expressão de beta-sarcoglicano num paciente em necessidade compreendendo a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6. A invenção também fornece o uso da sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para a preparação de um medicamento para aumento da expressão de beta-sarcoglicano em um paciente em necessidade. Por exemplo, o nível de beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína beta-sarcoglicano por Western blot ou imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração da composição ou medicamento.
[095] A invenção também fornece o uso de uma dose da sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8 ou os nucleotídeos 56-5022 da SEQ ID NO: 6 para a preparação de um medicamento para tratamento de um paciente com distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker, de modo que a administração do medicamento resulta na progressão da doença no paciente sendo retardada conforme medido por qualquer um dos seguintes testes: teste de caminhada de seis minutos, tempo para levantar, subida de 4 degraus, subida e descida de 4 degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), teste cronometrado de 10 metros, teste cronometrado de 100 metros, dinamometria manual (HHD), Subida e Descida Cronometradas e/ou escore em
Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III).
[096] Por exemplo, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 6 pontos na pontuação NSAA pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com a pontuação NSAA antes da administração da composição ou medicamento. Ademais, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 0,8 segundo no tempo para levantar pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o tempo para levantar antes da administração da composição ou medicamento. Além disso, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 1,2 segundo no tempo do teste de subida de 4 degraus pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o tempo do teste de subida de 4 degraus antes da administração da composição ou medicamento. Além disso, o sujeito tem uma melhora de pelo menos 7 segundos no teste cronometrado de 100 m pelo menos 270 dias após a administração da composição ou medicamento em comparação com o teste cronometrado de 100 m antes da administração da composição ou medicamento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[097] A Figura 1 ilustra o construto de rAAV.MHCK7.microdistrofina. Neste construto, o cassete de expressão de cDNA é flanqueado por sequências de repetição terminal invertidas (ITR) de AAV2. O construto é caracterizado por uma deleção de coluna in-frame (R4–R23), enquanto as dobradiças 1, 2 e 4 (H1, H2 e H4) e o domínio rico em cisteína permanecem produzindo uma proteína de 138 kDa. A expressão da proteína microdistrofina (3579 bp) é guiada por um promotor MHCK7 (795 bp). O íntron e a 5’ UTR são derivados do plasmídeo pCMVß (Clontech). O cassete de microdistrofina tinha uma Kozak consenso imediatamente à frente do início de ATG e um pequeno sinal sintético poliA de 53 bp para terminação de mRNA. O cassete de microdistrofina humana continha os domínios (R4–R23/Δ71–78), conforme descrito anteriormente por Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)).
[098] A Figura 2 fornece a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) AAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
[099] A Figura 3 fornece o mapa do plasmídeo auxiliar de AAV de pNLREP2- Caprh74.
[0100] A Figura 4 fornece o pHELP do plasmídeo de Ad Helper.
[0101] A Figura 5 ilustra o construto do plasmídeo de rAAV.MCK.microdistrofina.
[0102] A Figura 6 fornece a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) rAAVrh74.MCK.microdistrofina.
[0103] A Figura 7 demonstra a expressão do gene da microdistrofina nas fibras musculares da biopsia do músculo gastrocnêmio conforme medido pela imunocitoquímica.
[0104] As Figuras 8A- 8C fornecem Western blots demonstrando expressão da proteína microdistrofina no peso molecular correto. Na Fig. 8C, as amostras do Sujeito 4 (*) foram diluídas 1:4 (em faixa linear) pois ULDQ (>80%) se excedeu na análise inicial, e os valores médios foram multiplicados pelo fator de correção de diluição para o valor final em comparação ao normal. A Expressão Média de Microdistrofina Vs. Normal foi de 182,7% no método 1 e 222,0% no método 2.
[0105] As Figuras 9A-9C demonstram que a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina regula positivamente a expressão das proteínas DAPC, alfa-sarcoglicano e beta-sarcoglicano.
[0106] A Figura 10 demonstra uma redução dramática sustentada na creatina quinase (CK) com a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
[0107] A Figura 11 fornece a alteração média de CK desde a avaliação inicial até o dia 270. Estes dados demonstraram que a CK diminui significativamente ao longo do tempo após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
[0108] A Figura 12 fornece a alteração média da NSAA e a alteração média da CK desde a avaliação inicial até o dia 270. Estes dados demonstraram que a NSAA aumentou significativamente ao longo do tempo após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
[0109] A Figura 13 fornece a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 9) AAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
[0110] A Figura 14 ilustra o construto de plasmídeo de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina.
[0111] A Figura 15 fornece a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 8) do construto de plasmídeo de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina, que compreende o gene de resistência à canamicina.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0112] A presente invenção fornece vetores de terapia gênica, por exemplo, vetores rAAV, superexpressão de microdistrofina humana e métodos de redução e prevenção de fibrose em pacientes com distrofia muscular. As biópsias musculares realizadas no início do diagnóstico de DMD revelam proliferação proeminente do tecido conjuntivo. A fibrose muscular é deletéria de várias maneiras. Ela reduz o trânsito normal de nutrientes no endomísio através de barreiras do tecido conjuntivo, reduz o fluxo sanguíneo e priva o músculo de constituintes nutricionais derivados de origem vascular e contribui funcionalmente para a perda precoce da deambulação através de contraturas dos membros. Com o tempo, os obstáculos do tratamento se multiplicam como resultado de fibrose acentuada no músculo. Isso pode ser observado em biópsias musculares comparando a proliferação do tecido conjuntivo em pontos de tempo sucessivos. O processo continua a exacerbar, levando à perda da deambulação e acelerando sem controle, especialmente em pacientes dependentes de cadeira de rodas.
[0113] Sem tratamento precoce, incluindo uma abordagem paralela para reduzir a fibrose, é improvável que os benefícios do exon skipping, da leitura completa até o códon de parada ou das terapias de reposição gênica possam ser alcançados completamente. Mesmo moléculas pequenas ou estratégias de substituição de proteínas provavelmente falharão sem uma abordagem para reduzir a fibrose muscular. O trabalho anterior em ratos mdx idosos com fibrose existente tratados com AAV.microdistrofina demonstrou que não poderíamos alcançar uma restauração funcional completa (Liu, M.et al., Mol Ther 11, 245-256 (2005)). Sabe-se também que a progressão da cardiomiopatia da DMD é acompanhada por cicatrizes e fibrose na parede ventricular.
[0114] Conforme usado neste documento, o termo "AAV" é uma abreviação padrão de vírus adeno-associado. O vírus adeno-associado é um parvovírus de DNA de cadeia simples que se desenvolve apenas em células nas quais certas funções são fornecidas por um vírus auxiliar coinfectante. Há atualmente treze sorotipos de AAV que foram caracterizados. Informações gerais e análises de AAV podem ser encontradas, por exemplo, em Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, and Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (Nova York). No entanto, é absolutamente esperado que esses mesmos princípios sejam aplicáveis a sorotipos adicionais de AAV, uma vez que se sabe que os vários sorotipos são bastante intimamente relacionados, tanto estrutural quanto funcionalmente, mesmo no nível genético. (Ver, por exemplo, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV aparentemente exibem propriedades de replicação muito semelhantes mediadas por genes de rep homólogos; e todos possuem três proteínas do capsídeo relacionadas, tais como aquelas expressas em AAV2. O grau de relação é ainda sugerido pela análise heteroduplex que revela extensa hibridização cruzada entre os sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos de autoanelamento análogos nos terminais que correspondem a "sequências de repetição terminal invertidas" (ITRs). Os padrões de infectividade semelhantes também sugerem que as funções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulador semelhante.
[0115] Um "vetor AAV", conforme usado neste documento, refere-se a um vetor que compreende um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetição terminal (ITRs) de AAV. Tais vetores AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectada com um vetor que codifica e expressa produtos gênicos rep e cap.
[0116] Um "vírion AAV" ou "partícula viral AAV" ou "partícula de vetor AAV" refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor de AAV de polinucleotídeo encapsulado. Se a partícula compreender um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV do tipo selvagem, tal como um transgene a ser liberado em uma célula de mamífero), esta é tipicamente chamada de "partícula de vetor AAV" ou simplesmente "vetor AAV". Assim, a produção de partícula de vetor AAV necessariamente inclui a produção de vetor AAV, uma vez que um vetor está contido dentro de uma partícula de vetor AAV.
AAV
[0117] O vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus de replicação deficiente, cujo genoma de DNA de fita única possui cerca de 4,7 kb de comprimento, incluindo 145 repetições terminais invertidas de nucleotídeos (ITRs). Há vários sorotipos de AAV. As sequências nucleotídicas dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas. Por exemplo, a sequência nucleotídica do genoma do sorotipo 2 do AAV (AAV2) é apresentada em Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) conforme corrigido por Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Como outros exemplos, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no Nº de Acesso do GenBank NC_002077; o genoma completo do AAV-3 é fornecido no Nº de Acesso do GenBank NC_1829; o genoma completo do AAV-4 é fornecido no Nº de Acesso do GenBank NC_001829; o genoma AAV-5 é fornecido no Nº de Acesso do GenBank AF085716; o genoma completo do AAV-6 é fornecido no Nº de Acesso do GenBank NC_00 1862; pelo menos porções dos genomas do AAV-7 e do AAV-8 são fornecidos no Nº de Acesso do GenBank AX753246 e AX753249, respectivamente (ver também Patente U.S. Nº 7,282,199 e 7,790,449 relativas ao AAV-8); o genoma do AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma do AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma do AAV-11 é fornecido em Virology,330(2): 375-383 (2004). A clonagem do sorotipo AAVrh.74 é descrita em Rodino-Klapac., et al. Journal of translational medicine 5, 45 (2007). As sequências de ação cis que direcionam a replicação viral do DNA (rep), a encapsulação/empacotamento e a integração do cromossomo da célula hospedeira estão contidas nas ITRs. Três promotores de AAV (chamados p5, p19 e p40 por suas localizações de mapa relativas) conduzem a expressão dos dois quadros de leitura abertos internos do AAV que codificam genes rep e cap. Os dois promotores rep (p5 e p19), acoplados ao splicing diferencial do íntron de AAV único (por exemplo, nos nucleotídeos 2107 e 2227 de AAV2), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) a partir do gene rep. As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são, em última instância, responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Sítios de splicing e de início da tradução não consenso alternativos são responsáveis pela produção das três proteínas do capsídeo relacionadas. Um único sítio de poliadenilação consenso está localizado na posição de mapa 95 do genoma do AAV. O ciclo de vida e a genética do AAV são analisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
[0118] O AAV possui características únicas que o tornam atraente como um vetor para a liberação de DNA estranho às células, por exemplo, na terapia gênica. A infecção por AAV de células em cultura não é citopática, e a infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamíferos, permitindo a possibilidade de direcionar-se a muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transduz lentamente células que se dividem e células que não se dividem, e pode persistir durante essencialmente toda a vida dessas células como um epissomo nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma pró-viral do AAV é infeccioso como DNA clonado em plasmídeos, o que torna a construção de genomas recombinantes viável. Além disso, como os sinais que orientam a replicação do AAV e a encapsulação e integração do genoma do AAV estão contidos dentro das ITRs do genoma do AAV, alguns ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (que codificam a replicação e as proteínas do capsídeo estruturais, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estranho, tal como um cassete de gene que contém um promotor, um DNA de interesse e um sinal de poliadenilação. As proteínas rep e cap podem ser fornecidas in trans. Outra característica significativa do AAV é que ele é um vírus extremamente estável e resistente. Ele suporta facilmente as condições usadas para inativar os adenovírus (56 oC a 65 oC por várias horas), tornando a preservação a frio do AAV menos crítica. O AAV pode até ser liofilizado. Por fim, as células infectadas por AAV não são resistentes à superinfecção.
[0119] Vários estudos demonstraram a expressão de proteínas mediada por AAV recombinante em longo prazo (> 1,5 anos) no músculo. Ver, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. EUA, 93: 14082- 14087 (1996); e Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Ver também, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) e Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Além disso, como o músculo é altamente vascularizado, a transdução de AAV recombinante resultou no aparecimento de produtos transgênicos na circulação sistêmica após injeção intramuscular, conforme descrito em Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA,
94: 5804-5809 (1997) e Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997). Além disso, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) demonstrou que as miofibras esqueléticas possuem os fatores celulares necessários para a glicosilação, o dobramento e a secreção corretos de anticorpos, indicando que o músculo é capaz de expressar de forma estável agentes terapêuticos proteicos secretados.
[0120] Os genomas de AAV recombinantes da invenção compreendem molécula de ácido nucleico da invenção e uma ou mais ITRs de AAV flanqueando uma molécula de ácido nucleico. O DNA de AAV nos genomas de rAAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinante pode ser derivado, incluindo, sem limitação, os sorotipos de AAV AAVrh.74, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV- 4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 e AAV-13. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, em WO 01/83692. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações de capsídeo, também são contemplados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900- 1909 (2014). Conforme observado na seção de Fundamentos acima, as sequências nucleotídicas dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Para promover a expressão específica do músculo esquelético, AAV1, AAV6, AAV8 ou AAVrh.74 podem ser usados.
[0121] Os plasmídeos de DNA da invenção compreendem genomas de rAAV da invenção. Os plasmídeos de DNA são transferidos para células permitidas para infecção com um vírus auxiliar de AAV (por exemplo, adenovírus, adenovírus com deleção de E1 ou herpesvírus) para a montagem do genoma do rAAV em partículas virais infecciosas. Técnicas para produzir partículas de rAAV, nas quais um genoma de AAV a ser empacotado, genes rep e cap e funções de vírus auxiliares são fornecidos a uma célula são padrão na técnica. A produção de rAAV requer que os seguintes componentes estejam presentes dentro de uma única célula (chamada neste documento de célula de empacotamento): um genoma de rAAV, genes rep e cap de AAV separados do (ou seja, não dentro) genoma de rAAV e funções de vírus auxiliares. Os genes rep e cap de AAV podem ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual o vírus recombinante pode ser derivado e pode ser de um sorotipo de AAV diferente das ITRs do genoma de rAAV, incluindo, sem limitação, os sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV- 10, AAV-11, AAV-12 e AAV-13. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, em WO 01/83692, que está incorporada por referência neste documento em sua totalidade.
[0122] Um método para gerar uma célula de empacotamento é criar uma linhagem celular que expressa estavelmente todos os componentes necessários para a produção de partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos) compreendendo um genoma de rAAV sem genes rep e cap de AAV, genes rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV e um marcador selecionável, tal como um gene de resistência à neomicina, são integrados no genoma de uma célula. Os genomas de AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos por procedimentos como a adição de cauda (“tailing”) de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), a adição de peptídeos de ligação sintéticos contendo sítios de clivagem de endonuclease de restrição (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) ou por ligação direta de extremidade cega (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). A linhagem celular de empacotamento é então infectada com um vírus auxiliar, como o adenovírus. As vantagens deste método são que as células são selecionáveis e são adequadas para produção em larga escala de rAAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir genomas de rAAV e/ou genes rep e cap em células de empacotamento.
[0123] Os princípios gerais da produção de rAAV são analisados, por exemplo, em Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; e Muzyczka,
1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); e Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); Patente U.S. Nº 5,173,414; WO 95/13365 e a correspondente Patente U.S. Nº 5,658,776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. Vaccine 13:1244-1250 (1995); Paul et al. Human Gene Therapy 4:609-615 (1993); Clark et al. Gene Therapy 3:1124-1132 (1996); Patente U.S. Nº 5,786,211; Patente U.S. Nº 5,871,982; e Patente U.S. Nº 6,258,595. Os documentos anteriores estão incorporados neste documento por referência em sua totalidade neste documento, com ênfase particular nas seções dos documentos relacionadas à produção de rAAV.
[0124] A invenção, portanto, fornece células de empacotamento que produzem rAAV infeccioso. Em uma modalidade, as células de empacotamento podem ser células cancerígenas transformadas estavelmente, tais como células HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linhagem 293 cognata). Em outra modalidade, células de empacotamento são células que não são células cancerígenas transformadas, tais como células 293 de baixa passagem (células renais fetais humanas transformadas com E1 de adenovírus), células MRC-5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), células Vero (células renais de macaco) e células FRhL-2 (células pulmonares fetais de rhesus).
[0125] O AAV recombinante (isto é, partículas de rAAV encapsuladas infecciosas) da invenção compreende um genoma de rAAV. Em modalidades exemplificativas, os genomas de ambos os rAAV não possuem DNA rep e cap de AAV, ou seja, não há DNA rep e cap de AAV entre as ITRs dos genomas. Exemplos de rAAV que podem ser construídos para compreender as moléculas de ácido nucleico da invenção são estabelecidos no Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352) incorporado por referência neste documento em sua totalidade.
[0126] Em uma modalidade exemplificativa, o vetor AAV recombinante da invenção é produzido pelo método de transfecção tripla(Xiao et al. , J Virol 72, 2224- 2232 (1998) usando os plasmídeos do vetor AAV rAAV.MHCK7.microdistrofina, pNLRep2-Caprh74 e pHelp, rAAV contém o cassete de expressão gênica de microdistrofina flanqueado por sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2. É essa sequência que é encapsulada em vírions AAVrh74. O plasmídeo contém a sequência de microdistrofina e o potencializador de MHCK7 e elementos promotores centrais do promotor específico do músculo para conduzir a expressão gênica. O cassete de expressão também contém um íntron SV40 (SD/SA) para promover a expressão gênica de alto nível e o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino é usado para terminação de transcrição eficiente.
[0127] O pNLREP2-Caprh74 é um plasmídeo auxiliar de AAV que codifica as 4 proteínas rep de AAV2 do tipo selvagem e as 3 proteínas de capsídeos VP de AAV do tipo selvagem a partir do sorotipo rh74. Um mapa esquemático do plasmídeo pNLREP2-Caprh74 é mostrado na Figura 3.
[0128] O plasmídeo auxiliar de adenovírus pHELP é 11.635 bp e foi obtido da Applied Viromics. O plasmídeo contém as regiões do genoma do adenovírus que são importantes para a replicação do AAV, ou seja, E2A, E4ORF6 e VA RNA (as funções do adenovírus E1 são fornecidas pelas células 293). As sequências de adenovírus presentes neste plasmídeo representam apenas ~40% do genoma do adenovírus e não contêm os elementos cis críticos para replicação, tais como as repetições terminais do adenovírus. Portanto, não se espera que nenhum adenovírus infeccioso seja gerado a partir de tal sistema de produção. Um mapa esquemático do plasmídeo pHELP é mostrado na Figura 4.
[0129] O rAAV pode ser purificado por métodos padrão na técnica, tais como por cromatografia em coluna ou gradientes de cloreto de césio. Métodos para purificar vetores rAAV do vírus auxiliar são conhecidos na técnica e incluem métodos divulgados em, por exemplo, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp e Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); Patente U.S. Nº 6,566,118 e WO 98/09657.
[0130] Em outra modalidade, a invenção contempla composições da presente invenção que compreendem rAAV. As composições da invenção compreendem rAAV e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições também podem compreender outros ingredientes, tais como diluentes e adjuvantes. Carreadores, diluentes e adjuvantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores e são preferencialmente inertes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões e surfactantes, tais como plurônicos.
[0131] Os títulos de rAAV a serem administrados nos métodos da invenção variarão dependendo, por exemplo, do rAAV específico, do modo de administração, do objetivo do tratamento, do indivíduo e do(s) tipo(s) de célula sendo visado(s) e podem ser determinados por métodos padrão na técnica. Os títulos de rAAV podem variar de cerca de 1x106, cerca de 1x107, cerca de 1x108, cerca de 1x109, cerca de 1x1010, cerca de 1x1011, cerca de 1x1012, cerca de 1x1013 a cerca de 1x1014 ou mais partículas resistentes à DNase (DRP) por ml. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg). Um método exemplificativo de determinação do título do genoma do vetor encapsulado usa PCR quantitativa, tal como os métodos descritos em (Pozsgai et al., Mol. 25(4): 855-869, 2017).
[0132] Métodos de transdução de uma célula-alvo com rAAV, in vivo ou in vitro, são contemplados pela invenção. Os métodos in vivo compreendem a etapa de administrar uma dose eficaz, ou doses múltiplas eficazes, de uma composição compreendendo um rAAV da invenção a um animal (incluindo um ser humano) em necessidade. Se a dose for administrada antes do desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é profilática. Se a dose for administrada após o desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é terapêutica. Nas modalidades da invenção, uma dose eficaz é uma dose que alivia (elimina ou reduz) pelo menos um sintoma associado ao estado do distúrbio/da doença sendo tratada, que desacelera ou impede a progressão para um estado de distúrbio/doença, que desacelera ou impede a progressão de um estado de distúrbio/doença, que diminui a extensão da doença, que resulta em remissão (parcial ou total) da doença e/ou que prolonga a sobrevida. Um exemplo de uma doença contemplada para ser prevenida ou tratada com métodos da invenção é a DMD.
[0133] Terapias combinadas também são contempladas pela invenção. A combinação, conforme usada neste documento, inclui tanto tratamento simultâneo quanto tratamentos sequenciais. As combinações de métodos da invenção com tratamentos médicos padrão (por exemplo, corticosteroides) são especificamente contempladas, assim como combinações com terapias novas.
[0134] A administração de uma dose eficaz das composições pode ser por vias padrão na técnica, incluindo, sem limitação, intramuscular, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraniana, intraóssea, intraocular, retal ou vaginal. A(s) via(s) de administração e o(s) sorotipo(s) dos componentes de AAV do rAAV (em particular, as ITRs de AAV e a proteína do capsídeo) da invenção podem ser escolhidos e/ou combinados por aqueles versados na técnica, levando em conta o estado da infecção e/ou da doença sendo tratadas e as células/tecido(s)-alvo que deverão expressar a proteína microdistrofina.
[0135] A invenção fornece administração local e administração sistêmica de uma dose eficaz de rAAV e de composições da invenção. Por exemplo, a administração sistêmica é a administração no sistema circulatório para que todo o corpo seja afetado. Administração sistêmica inclui administração enteral, tal como absorção através do trato gastrointestinal e administração parenteral por meio de injeção, infusão ou implantação.
[0136] Em particular, a administração real de rAAV da presente invenção pode ser realizada usando qualquer método físico que transportará o vetor recombinante rAAV para o tecido-alvo de um animal. A administração de acordo com a invenção inclui, sem limitação, injeção no músculo e injeção na corrente sanguínea. Foi demonstrado que a ressuspensão de um rAAV em solução salina tamponada com fosfato por si só é suficiente para fornecer um veículo útil para a expressão do tecido muscular, e não há restrições conhecidas sobre os carreadores ou outros componentes que possam ser coadministrados com o rAAV (embora composições que degradam o DNA devam ser evitadas de maneira normal com o rAAV). As proteínas do capsídeo de um rAAV podem ser modificadas de modo que o rAAV seja direcionado a um tecido alvo específico de interesse, tal como músculo. Ver, por exemplo, WO 02/053703, cuja divulgação está incorporada por referência neste documento. As composições farmacêuticas podem ser preparadas como formulações injetáveis ou como formulações tópicas a serem distribuídas aos músculos por transporte transdérmico. Várias formulações para injeção intramuscular e transporte transdérmico foram previamente desenvolvidas e podem ser usadas na prática da invenção. O rAAV pode ser usado com qualquer carreador farmaceuticamente aceitável para facilidade de administração e manuseio.
[0137] Em uma modalidade da invenção, a AAVrh74.MHCK7.microdistrofina descrita neste documento é formulada em um tampão contendo 20 mM de Tris (pH 8,0), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 200 mM de cloreto de sódio (NaCl) e poloxâmero 188 a 0,001%.
[0138] A dose de rAAV a ser administrada nos métodos divulgados neste documento variará dependendo, por exemplo, do rAAV específico, do modo de administração, do objetivo do tratamento, do indivíduo e do(s) tipo(s) de célula sendo visado(s), e pode ser determinada por métodos padrão na técnica. Os títulos de cada rAAV administrado podem variar de cerca de 1x106, cerca de 1x107, cerca de 1x108, cerca de 1x109, cerca de 1x1010, cerca de 1x1011, cerca de 1x1012, cerca de 1x1013, cerca de 1x1014, cerca de 2x1014 ou a cerca de 1x1015 ou mais partículas resistentes à DNase (DRP) por ml. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg) (isto é, 1x107 vg, 1x108 vg, 1x109 vg, 1x1010 vg, 1x1011 vg, 1x1012 vg, 1x1013 vg, 1x1014 vg, 2x1014 vg, 1x1015vg, respectivamente). Dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg) por quilograma (kg) de peso corporal (ou seja, 1x1010 vg/kg, 1x1011 vg/kg, 1x1012 vg/kg, 1x1013 vg/kg, 1x1014 vg/kg, 1,25x1014 vg/kg, 1.5x1014 vg/kg, 1,75x1014 vg/kg, 2,0x1014 vg/kg, 2,25x1014 vg/kg, 2,5x1014 vg/kg, 2,75x1014 vg/kg, 3,0x1014 vg/kg, 3,25x1014 vg/kg, 3,5x1014 vg/kg, 3,75x1014 vg/kg, 4,0x1014 vg/kg, 1x1015 vg/kg, respectivamente). Os métodos para titulação de AAV são descritos em Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999).
[0139] Em particular, a administração real de rAAV da presente invenção pode ser realizada usando qualquer método físico que transportará o vetor recombinante rAAV para o tecido-alvo de um animal. A administração de acordo com a invenção inclui, sem limitação, injeção no músculo e injeção na corrente sanguínea. Foi demonstrado que a ressuspensão de um rAAV em solução salina tamponada com fosfato por si só é suficiente para fornecer um veículo útil para a expressão do tecido muscular, e não há restrições conhecidas sobre os carreadores ou outros componentes que possam ser coadministrados com o rAAV (embora composições que degradam o DNA devam ser evitadas de maneira normal com o rAAV). As proteínas do capsídeo de um rAAV podem ser modificadas de modo que o rAAV seja direcionado a um tecido alvo específico de interesse, tal como músculo. Ver, por exemplo, WO 02/053703, cuja divulgação está incorporada por referência neste documento. As composições farmacêuticas podem ser preparadas como formulações injetáveis ou como formulações tópicas a serem distribuídas aos músculos por transporte transdérmico. Várias formulações para injeção intramuscular e transporte transdérmico foram previamente desenvolvidas e podem ser usadas na prática da invenção. O rAAV pode ser usado com qualquer carreador farmaceuticamente aceitável para facilidade de administração e manuseio.
[0140] Para fins de injeção intramuscular, soluções em um adjuvante, tal como óleo de gergelim ou óleo de amendoim ou em propilenoglicol aquoso, podem ser empregadas, bem como soluções aquosas estéreis. Tais soluções aquosas podem ser tamponadas, se desejado, e o diluente líquido é primeiramente tornado isotônico com solução salina ou glicose. As soluções de rAAV como um ácido livre (DNA contém grupos de fosfato ácido) ou um sal farmacologicamente aceitável podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um surfactante, tal como hidroxpropilcelulose. Uma dispersão de rAAV também pode ser preparada em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas destes e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de micro-organismos. Nesta conexão, os meios aquosos estéreis empregados são facilmente obtidos por técnicas padrão bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[0141] Os carreadores farmacêuticos, diluentes ou excipientes adequados para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista facilidade de sinergia. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra as ações contaminantes de micro- organismos, como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol,
propilenoglicol, polietilenoglicol líquido e similares), misturas adequadas destes e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de uma dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro- organismos pode ser garantida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0142] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando rAAV na quantidade necessária no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização de filtro. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o ingrediente ativo esterilizado em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e a técnica de liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado da solução anteriormente filtrada estéril deste.
[0143] A transdução com rAAV também pode ser realizada in vitro. Em uma modalidade, as células musculares-alvo desejadas são removidas do sujeito, transduzidas com rAAV e reintroduzidas no indivíduo. Alternativamente, células musculares singênicas ou xenogênicas podem ser usadas onde essas células não gerarão uma resposta imunológica inadequada no sujeito.
[0144] Métodos adequados para a transdução e reintrodução de células transduzidas em um sujeito são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as células podem ser transduzidas in vitro pela combinação de rAAV com células musculares, por exemplo, em meios apropriados, e triagem das células que abrigam o DNA de interesse usando técnicas convencionais, tais como Southern blots e/ou PCR, ou usando marcadores selecionáveis. Células transduzidas podem então ser formuladas em composições farmacêuticas, e a composição introduzida no sujeito por várias técnicas, tais como por injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal ou por injeção nos músculos liso e cardíaco usando, por exemplo, um cateter.
[0145] A transdução de células com rAAV da invenção resulta na expressão sustentada da proteína microdistrofina. A presente invenção fornece, assim, métodos de administração/distribuição de rAAV que expressam a proteína microdistrofina para um animal, preferencialmente um ser humano. Esses métodos incluem a transdução de tecidos (incluindo, sem limitação, tecidos como músculo, órgãos como fígado e cérebro e glândulas como glândulas salivares) com um ou mais rAAV da presente invenção. A transdução pode ser realizada com cassetes de gene compreendendo elementos de controle específicos de tecido. Por exemplo, uma modalidade da invenção fornece métodos de transdução de células musculares e tecidos musculares direcionados por elementos de controle específicos de músculo, incluindo, sem limitação, aqueles derivados das famílias de genes de actina e miosina, tal como da família de gene myoD (Ver Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)), o fator de ligação ao potencializador específico de miócitos MEF-2 (Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)), elementos de controle derivados do gene da actina esquelética humana (Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)), o gene da actina cardíaca, elementos da sequência da creatina quinase muscular (Ver Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)) e o elemento do potencializador da creatina quinase murina (mCK), elementos de controle derivados do gene da troponina C de contração rápida esquelética, o gene da troponina C cardíaca de contração lenta e o gene da troponina I de contração lenta: fatores nucleares induzíveis por hipoxia
(Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementos induzíveis por esteroide e promotores incluindo o elemento de resposta glucocorticoide (GRE) (Ver Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603- 5607 (1993)), e outros elementos de controle.
[0146] O tecido muscular é um alvo atraente para a liberação de DNA in vivo, pois não é um órgão vital e é de fácil acesso. A invenção contempla a expressão sustentada de microdistrofina a partir de miofibras transduzidas.
[0147] Os termos "célula muscular" ou "tecido muscular" significam uma célula ou grupo de células que derivam de qualquer tipo de músculo (por exemplo, músculo esquelético e músculo liso, por exemplo, do trato digestivo, da bexiga urinária, de vasos sanguíneos ou do tecido cardíaco). Essas células musculares podem ser diferenciadas ou indiferenciadas, tais como mioblastos, miócitos, miotubos, cardiomiócitos e cardiomioblastos.
[0148] O termo "transdução" é utilizado para se referir à administração/distribuição da região de codificação da microdistrofina a uma célula receptora, tanto in vivo quanto in vitro, através de um rAAV deficiente de replicação da invenção, resultando na expressão da microdistrofina pela célula receptora.
[0149] Assim, a invenção fornece métodos de administração de uma dose eficaz (ou doses, administradas essencialmente simultaneamente ou doses administradas em intervalos) de rAAV que codificam a microdistrofina a um sujeito em necessidade da mesma.
[0150] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas a título de ilustração e não a título de limitação. Os intervalos numéricos descritos incluem cada valor inteiro dentro de cada intervalo e incluem o número inteiro declarado mais baixo e mais alto.
EXEMPLOS Exemplo 1 A) Geração do construto AAVrh74.MHCK7.microdistrofina
[0151] O plasmídeo de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina contém um cassete de expressão de cDNA de microdistrofina humana flanqueada por sequências de repetição terminal (ITR) invertidas por AAV2 (ver Fig. 1). O construto de microdistrofina foi caracterizado por uma deleção de coluna in-frame (R4–R23), enquanto as dobradiças 1, 2 e 4 e o domínio rico em cisteína permanecem produzindo uma proteína de 138 kDa. A expressão da proteína microdistrofina (3579 bp) foi guiada por um promotor MHCK7 (792 bp). O plasmídeo foi construído do plasmídeo rAAV.MCK.microdistrofina através da remoção do promotor MCK e inserção do promotor MHCK7. Após o promotor de núcleo, o MCK de éxon 1 de camundongo endógeno de 53 bp (não traduzido) está presente para iniciação de transcrição eficiente, seguido pelos sinais de splice 16S/19S tardios SV40 (150 bp) e uma pequena 5’UTR (61 bp). O íntron e a 5’UTR são derivados do plasmídeo pCMVß (Clontech). O cassete de microdistrofina tinha uma Kozak consenso imediatamente à frente do início de ATG e um pequeno sinal sintético poliA de 53 bp para terminação de mRNA. O cassete de microdistrofina humana continha os domínios (R4–R23/Δ71– 78), conforme descrito anteriormente por Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)). O DNA complementar sofreu otimização de códon para uso humano e foi sintetizado por GenScript (Piscataway, NJ) (Mol Ther 18, 109-117 (2010)). As únicas sequências virais incluídas neste vetor foram as repetições terminais invertidas de AAV2, que são necessárias para replicação e embalagem do DNA viral. O cassete de microdistrofina tem um pequeno sinal de poliA sintético de 53 bp para terminação de mRNA.
[0152] Estudos anteriores validaram a expressão cardíaca usando o promotor MHCK7 (Salva et al. Mol Ther 15, 320-329 (2007) e AAVrh74 alcançando expressão esquelética, diafragmática e muscular cardíaca (Sondergaard et al. Annals of clinical and Transl Neurology 2, 256-270 (2015)), A sequência de construto da Fig. 1 foi encapsulada em vírions AAVrh.74. O clone molecular do sorotipo AAVrh.74 foi clonado de um linfonodo de macaco rhesus e é discutido em Rodino-Klapac et al. Journal of Translational medicine 5, 45 (2007). A Tabela 1 mostra as características moleculares do plasmídeo AAVrh74.MHCK7.microdistrofina (SEQ ID NO: 3) Tabela1. Características moleculares do plasmídeo rAAV.MHCK7.microdistrofina
TIPO INÍCIO EXTREMIDADE NOME DESCRIÇÃO Repetição terminal invertida REGIÃO 55 182 5'ITR de AAV2 do tipo selvagem Complexo de cadeia pesada de miosina de camundongo – REGIÃO 244 1035 MHCK7 potenciador/promotor de fusão de creatina quinase muscular E box sítio do doador 5’ do gene da β-globina humana e o sítio de Íntron ponto de ramificação e REGIÃO 1045 1194 quimérico aceptor de splice 3’ da região variável de cadeia pesada IgG cDNA de DNAc de microdistrofina GENE 1205 4783 huDys humana REGIÃO 4786 4838 PoliA PoliA sintético Repetição terminal invertida REGIÃO 4894 5021 3'ITR de AAV2 do tipo selvagem GENE 6760 7619 AmpR gene da β-lactamase Origem da replicação do REGIÃO 7823 8442 Ori plasmídeo B) Geração do construto AAVrh74.MHCK7.microdistrofina e plasmídeo que codifica a resistência à canamicina (Kan)
[0153] A clonagem de MHCK7.μDys.KAN foi obtida ao isolar o fragmento de MHCK7.μDys de um plasmídeo MHCK7.μDys.AMP e a estrutura principal de canamicina, e ao realizar o anelamento dos mesmos usando o fluxo de trabalho de clonagem NEBuilder. O fragmento de MHCK7.μDys foi isolado através da digestão com enzima de restrição com SnaBI. A digestão foi realizada em uma reação total de 50μL em 1x tampão CutSmart (NEB) e 1μL SnaBI, a 37°C durante 1 hora. O fragmento resultante foi isolado por eletroforese usando um gel de agarose a 1%, operando a
105 volts durante 1,5 hora.
A banda correspondente à inserção de MHCK7.μDys foi cortada e purificada usando um kit de purificação em gel (Macherey-Nagel). O fragmento resultante tinha uma concentração de DNA de 10ng/μL.
O fragmento da estrutura principal de Kan foi isolado através da digestão com enzima de restrição XbaI em uma reação de 50μL com 1x tampão CutSmart (NEB) e 1μL XbaI, a 37°C durante 1 hora.
O fragmento resultante foi isolado por eletroforese usando um gel de agarose a 1%, operando a 105 volts durante 1,5 hora.
A banda correspondente à estrutura principal de Kan foi cortada e purificada através do kit de purificação em gel (Macherey-Nagel). O fragmento resultante tinha uma concentração de DNA de 8,1ng/μL.
Os dois fragmentos foram anelados novamente usando o fluxo de trabalho de clonagem NEB Builder, que tem a capacidade de unir dois fragmentos com sequências sobrepostas.
A reação de clonagem de NEBuilder foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante a 50°C durante 15 minutos, usando uma razão de 1:1 de MHCK7,μDys em relação à base de canamicina em 1x mistura principal do conjunto de DNA HiFi de NEBuilder para um volume de reação total de 20μL.
O clone resultante foi transformado em E. coli competente estável NEB® (C3040) pela adição de 2,5 μL de produto de clonagem às células seguido por 30 minutos em gelo, depois 30 segundos a 42°C e mais 5 minutos em gelo.
Após a transformação, 950 μL de meio de crescimento foram adicionados às células e deixados crescer a 30°C durante 1,5 hora, agitando-se a 225 rpm.
Após o crescimento, 450 μL dessas células foram plaqueadas em uma placa de ágar canamicina LB de 50 μg/mL e incubadas durante a noite a 30°C em uma incubadora seca.
Uma colônia foi coletada desta placa e cultivada durante a noite em LB contendo 50 μg/mL de canamicina.
O DNA foi isolado de 3 ml desta cultura usando o kit QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen). Este DNA foi usado para confirmar o produto de clonagem.
O produto de clonagem foi confirmado por digestão com enzima de restrição com PmeI, MscI e SmaI seguida por eletroforese em gel.
O produto de clonagem foi adicionalmente confirmado por sequenciamento.
O plasmídeo resultante é apresentado na SEQ ID NO:8 e mostrado nas Figuras 14 e
15. A sequência do construto da Fig. 13 que corresponde à da SEQ ID NO: 9, e nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, foi encapsulada em vírions AAVrh.74, conforme descrito acima. Exemplo 2 Ensaio Clínico de Distribuição Gênica Sistêmica para Distrofia Muscular de Duchenne
[0154] Este é um ensaio controlado de dose única usando a rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 55-5021, para sujeitos com DMD. A Coorte A incluirá seis sujeitos de 3 meses a 3 anos de idade, e a Coorte B incluirá seis sujeitos de 4 anos a 7 anos de idade. Todos os sujeitos receberão vetor de microdistrofina intravenosa (2x1014 vg/kg em 10 mL/kg). A rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina é formulada em um tampão contendo 20 mM de Tris (pH 8,0), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 200 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 0,001% de poloxâmero 188.
[0155] No estudo, a rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina foi infundida através da veia periférica do braço para que pudesse alcançar todos os músculos do corpo. Foram admitidos seis sujeitos com DMD com idades entre 3 meses e 3 anos na Coorte A e seis sujeitos com DMD com idades entre 4 anos e 7 anos na Coorte B. Todos os sujeitos receberam vetor de microdistrofina intravenosa (2x1014 vg/kg em 10mL/kg). O título do genoma do vetor encapsulado para a dose administrada foi determinado usando PCR quantitativa usando um sistema detector Taqman Prism 7500 (PE Applied Biosystems) com primers direcionados contra o promotor MHCK7 em comparação com um padrão de plasmídeo de DNA superenrolado (Pozsgai et al. Mol. Ther. 25(4): 855- 869, 2017).
[0156] Os sujeitos receberam infusões durante 1 hora na Unidade de Terapia Intensiva Pediátrica (Pediatric Intensive Care Unit, PICU) no Nationwide Children's
Hospital. Foi realizada uma biópsia muscular antes da terapia gênica na visita de triagem. Os sujeitos serão submetidos a uma segunda biópsia muscular para determinar se o gene permitiu a substituição da proteína distrofina ausente 90 dias após o parto. Após a transferência gênica, os pacientes foram cuidadosamente monitorados quanto a quaisquer efeitos colaterais do tratamento. Esse monitoramento incluiu exames de sangue e urina, bem como exame físico durante as visitas de triagem e nos dias 0, 1, 7, 14, 30, 60, 90 e 180 e nos meses 9, 12, 18, 24, 30 e 36 para garantir que não houvesse efeitos colaterais da injeção genética.
[0157] Os sujeitos da Coorte A (n=6) tinham entre 3 meses e 3 anos de idade e receberam vetor de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina intravenosa (2x1014 vg/kg em 10 mL/kg). Sujeitos que receberam 1 mg/kg de prednisona ou deflazacorte um dia antes da transferência gênica na Coorte A foram iniciados e mantidos durante 30 dias enquanto monitoravam a resposta imune. Se negativos no dia 30, os esteroides seriam desmamados ao longo de 1 semana. Se a resposta de células T ao AAV ou microdistrofina fosse > 125 SFC/106 PBMCs, os esteroides seriam mantidos até que os níveis caíssem abaixo desse limite.
[0158] Os sujeitos da Coorte B (n=6) tinham entre 4 anos e 7 anos de idade e receberam vetor de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina intravenosa (2x1014 vg/kg em 10 mL/kg). Estes sujeitos foram mantidos em dose estável de corticosteroides durante todo o estudo, mas podem ter sido aumentados por um curto período se a resposta das células T ao AAV ou microdistrofina fosse >125 SFC/106 PBMCs. Critérios de elegibilidade
[0159] Os critérios de inclusão para o estudo foram os seguintes:  Idade da inclusão: Coorte A: 3 meses a 7 anos de idade e Coorte B: entre 4-7 anos de idade, inclusive.  Caracterização molecular do gene DMD com frameshift (deleção ou duplicação) ou mutação de códon de parada prematura entre os éxons 18 a 58.
 Aumento da CK > 1000 U/l  Sujeitos da coorte A: abaixo da média na avaliação motora de Bayley-III para a avaliação motora grossa definida como uma pontuação escalonada ≤9  Coorte B: Abaixo da média no teste cronometrado de 100 metros definido como < 80% previsto  Homens de qualquer grupo étnico.  Capacidade de cooperar com os testes de avaliação motora.  Sujeitos da Coorte A: Nenhum tratamento anterior com corticosteroides.  Sujeitos da Coorte B: Dose estável equivalente de corticoesteroides orais durante pelo menos 12 semanas antes da triagem e espera-se que a dose permaneça constante (exceto por modificações para acomodar mudanças de peso) ao longo do estudo
[0160] Os critérios de exclusão para o estudo foram os seguintes:  Infecção viral ativa com base em observações clínicas.  Sinais de cardiomiopatia, incluindo ecocardiograma com fração de ejeção abaixo de 40%.  Evidência sorológica de infecção por HIV ou infecção por hepatite B ou C.  Diagnóstico de (ou tratamento contínuo para) uma doença autoimune.  Valores laboratoriais anormais considerados clinicamente significativos  Doença concomitante ou necessidade de tratamento farmacológico crônico que, na opinião do IP, cria riscos desnecessários para a transferência gênica.  Sujeitos com títulos de anticorpos AAVrh74 ou AAV8 > 1:400, conforme determinado pelo imunoensaio ELISA.  A condição médica ou circunstância atenuante que, na opinião do investigador, possa comprometer a capacidade do sujeito de cumprir os testes ou procedimentos exigidos pelo protocolo ou comprometer o bem-estar, a segurança ou a capacidade de interpretação clínica do sujeito.  Infecção grave (por exemplo, pneumonia, pielonefrite ou meningite) dentro de 4 semanas antes da visita de transferência gênica (a inclusão pode ser adiada).  Ter recebido qualquer medicação em investigação (exceto corticosteroides) ou medicações de exon skipping (incluindo ExonDys 51®), experimental ou de outra forma, nos últimos 6 meses antes da triagem para este estudo.  Ter passado por qualquer tipo de terapia gênica, terapia baseada em células (por exemplo, transplante de células-tronco) ou terapia com CRISPR/Cas9.  A família não quer divulgar a participação do paciente no estudo ao clínico geral e a outros profissionais de saúde. Medidas do Resultado
[0161] A medida do resultado primário foi a segurança com base no número de sujeitos com eventos adversos (período: 3 anos). Os efeitos adversos foram monitorados e pontuados quanto à gravidade e relação com o artigo em estudo.
[0162] As medidas do resultado secundárias foram as seguintes:
[0163] Escore em Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III) (período: triagem, dia 30-3 anos): O Escore em Escala Motor Grosso mediu o desenvolvimento motor. O Subteste Motor Grosso Bayley-III foi pontuado para a Coorte A em cada visita de acompanhamento, começando no Dia 30 até 3 anos. Qualquer sujeito com 43-47 meses de idade, inclusive, no momento da triagem teve o escore em escala calculado em comparação aos dados normativos para crianças de 42 meses de idade. O Bayley- III forneceu dados normativos para crianças de 1-42 meses de idade.
[0164] Avaliações de Fisioterapia: Teste Cronometrado de 100 Metros (100 m) (período: triagem, Dia 30-3 Anos): O resultado motor primário de 100 m para a Coorte B. O Teste Cronometrado de 100 metros foi um resultado exploratório iniciado para a Coorte A assim que a criança atingiu 3 anos de idade.
[0165] Avaliações de Fisioterapia: Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA) (período: triagem, Dia 30-3 Anos): A Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA) foi um resultado exploratório iniciado para a coorte A assim que a criança atingiu quatro anos de idade e para a Coorte B. A NSAA mede a qualidade de ambulação em meninos jovens com Distrofia Muscular de Duchenne.
[0166] Avaliações de Fisioterapia de Subida e Descida modificadas para crianças (TUG) (período: triagem, Dia 30-3 Anos): Os resultados exploratórios para a Coorte B incluíram Subida e Descida Cronometradas modificado para crianças (TUG).
[0167] Avaliações de Fisioterapia Ascendentes e Descendentes de 4 etapas (período: triagem, Dia 30-3 Anos): Os resultados exploratórios para a Coorte B incluirão ascendente e descendente de 4 etapas.
[0168] Avaliações de Fisioterapia de Dinamometria Manual (HHD) (período: triagem, Dia 30-3 Anos): Os resultados exploratórios para a Coorte B incluíram Dinamometria Manual (HHD) para extensores do joelho e flexores do joelho e flexores do cotovelo e extensores do cotovelo.
[0169] Quantificação da expressão gênica de Microdistrofina por imunofluorescência (período: triagem, Dia 90): Os níveis de expressão gênica de Microdistrofina foram quantificados por imunofluorescência e comparados em biópsias pré e pós-músculo.
[0170] Quantificação da expressão gênica da microdistrofina por western blot (período: triagem, Dia 90): Os níveis de expressão gênica da microdistrofina foram quantificados por análise por western blot e comparados em biópsias pré e pós- músculo.
[0171] Uma diminuição na CK após terapia gênica (período: 3 anos): Redução nos níveis de CK no sangue em circulação.
[0172] Geração de imagens de ressonância magnética cardíaca (em 1 ano).
Expressão Gênica da Microdistrofina
[0173] Foi analisada e quantificada a alteração da expressão de microdistrofina em relação à avaliação inicial através da intensidade da fibra de imunofluorescência (IF). Conforme mostrado na Figura 7, o Sujeito 1 (5 anos de idade) demonstrou 78% de expressão de proteína microditrofina nas fibras musculares da biópsia do músculo gastrocnêmio após administração da rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina, o Sujeito 2 (4 anos de idade) demonstrou 73,5% de expressão de proteína microdistrofina nas fibras musculares da biópsia do músculo gastrocnêmio após administração da rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina e o Sujeito 3 (6 anos de idade) demonstrou 77,0% de expressão de proteína microdistrofina nas fibras musculares da biópsia do músculo gastrocnêmio após administração da rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. O Sujeito 4 (4 anos de idade) demonstrou 96,2% de expressão de microdistrofina nas fibras musculares da biópsia do músculo gastrocnêmio após administração da rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Todos os pacientes mostraram expressão robusta de microdistrofina transduzida, que está adequadamente localizada no sarcolema muscular, conforme medido por imuno- histoquímica. A expressão gênica média, medida pelo percentual de fibras positivas para microdistrofina foi de 76,2% e a intensidade média das fibras foi de 74,5% em comparação com o controle normal.
Sujeito Intensidade Média Percentual de fibras positivas para distrofina 1 82,0% 78,0% 2 59,0% 73,5% 3 83,0% 77,0% 4 160,0% 96,2% Média 96,0% 81,2%
[0174] A alteração na expressão gênica de microdistrofina da Avaliação Inicial até o Dia 60 também foi avaliada pela quantificação da expressão da proteína microdistrofina conforme medida por Western blot do tecido muscular biopsiado. Conforme mostrado nas Figuras 8A e 8B, a análise Western blot detectou a expressão da proteína microdistrofina no Sujeito 1 (5 anos de idade), Sujeito 2 (4 anos de idade) e Sujeito 3 (6 anos de idade). A Figura 8C fornece a análise de Western Blot detectando a expressão da proteína microdistrofina no Sujeito 4 (4 anos de idade). Todas as biópsias pós-tratamento mostraram níveis robustos de microdistrofina, conforme medidos por Western blot, com uma média para os sujeitos 1-4 de 74,3 em comparação com o método normal usando o método 1 e 95,8% em comparação com o método normal 2 que se ajusta para gordura e tecido fibrótico.
[0175] Para cada sujeito, a cópia do genoma do vetor por núcleo das fibras musculares foi medida. Conforme mostrado na Tabela 2, a cópia do genoma do vetor por nuclease foi maior que 1 para cada um dos sujeitos após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Uma cópia do vetor indica aproximadamente 50% de expressão do gene da microdistrofina. Uma média de 1,6 cópias do vetor por núcleo celular foi medida nos Sujeitos 1-3, consistente com os altos níveis de expressão de microdistrofina observados. Quando os valores para o Sujeito 4 foram incluídos, a média de cópias de vetores/µg DNA é >105 com uma média de 3,3 cópias de vetores por núcleo celular. Tabela 2 Sujeito Cópias de vetores/µg Cópias por Núcleo
DNA 1 >105 1,7 2 >10 5 1,3 3 >105 1,9
[0176] Os níveis de proteína de alfa-sarcoglicano e beta-sarcoglicano no tecido de biópsia muscular foram medidos por imuno-histoquímica antes e após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. A administração de rAAVrh74.MHCK7 também resultou na regulação positiva das proteínas do CPAD nos sujeitos. Conforme mostrado na Figura 9, a expressão de alfa-sarcoglicano e beta- sarcoglicano no tecido de biópsia muscular foi aumentada em comparação ao nível, de modo que essas proteínas em biópsias musculares antes da administração de rAAVrh74.MHCK7 nos Sujeito 1 (Fig. 9A), Sujeito 2 (Fig. 9B) e Sujeito 3 (Fig. 9C). Níveis de CK Sérica em Circulação
[0177] Foram coletadas amostras de sangue a cada 30 dias após a administração da infusão intravenosa do vetor de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina (2x1014 vg/kg em 10 mL/kg). Os níveis de CK foram medidos em cada visita e comparados ao nível de avaliação inicial obtido antes da administração do rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina (Consulta do Dia 0). Os níveis séricos de avaliação inicial de CK (unidades/litro) são fornecidos na Tabela 3 abaixo. Conforme mostrado na Figura 10, o nível de CK sérica em circulação diminuiu cerca de 87%, 2 meses após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Todos os sujeitos apresentaram reduções significativas dos níveis séricos de creatina quinase (CK), com uma redução média de CK de mais de 87% em 2 meses após o tratamento (n=3). A CK é uma enzima associada a danos musculares e os pacientes com DMD exibem uniformemente altos níveis de CK. De fato, a CK significativamente elevada é frequentemente usada como uma ferramenta de diagnóstico preliminar para a DMD, que é seguida por testes genéticos confirmatórios.
[0178] A Tabela 4 e a Figura 10 fornecem os níveis de CK para cada sujeito. A Figura 11 fornece os níveis médios de CK ao longo do tempo e demonstra que os níveis médios de CK diminuem significativamente ao longo do tempo após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. O nível de CK de avaliação inicial médio de 27.064 U/l (média para a Tabela 3) é reduzido em cerca de 63% para uma média de 9.982 U/l (média, Dia 270, Tabela 4).
Tabela 3 Sujeito Idade (anos) Níveis de CK na Avaliação Inicial Unidades/Litro (U/L) 1 5 206912062069191 2 4 23414 3 6 34942 4 4 29210 Tabela 4: Alteração nos níveis de CK desde a avaliação inicial até o Dia 270 Sujeito Avaliação Dia 30 Dia 60 Dia 90 Dia 180 Dia 270 Dia inicial 360 1 20691 - 2984 2444 18476 6317 - 2 23414 10427 4283 41920 6209 10494 - 3 34942 10430 2966 2546 9650 18855 6410 4 29210 7215 908 1382 2580 4262 - Avaliação de Eficácia
[0179] Além dos níveis de microdistrofina e CK, a eficácia foi medida pelos seguintes testes funcionais: Tempo para Levantar-se do Chão, Subida de 4 Degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), Teste de Tempo para Levantar-se, Teste de Subida de 4 Degraus, Teste Cronometrado de 10 Metros (10 m) e Teste Cronometrado de 100 Metros (100 m). Os dados são apresentados nas Tabelas 5 e 6 abaixo, e estes dados demonstram uma melhora durável consistente 9 meses após a administração de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. A melhora de NSAA ao longo do tempo também é fornecida na Figura 12. Tabela 5: Alteração de NSAA desde a Avaliação Inicial até o Dia 270 Sujeito Avaliação Dia 30 Dia 60 Dia 90 Dia 180 Dia 270 Alteração inicial em relação à Avaliação Inicial 1 18 22 24 23 25 26 8 2 19 21 23 25 27 27 8 3 26 28 28 30 30 28 2 4 19 20 20 25 25 27 8 Média 20,5 22,75 23,75 25,75 26,75 27 6,5 de melhora
Tabela 6: Alteração desde a Avaliação Inicial até o Dia 270 Sujeito Avaliação NSAA Tempo Subida 100 m 10 m para de 4 (segundos) levantar- Degraus se 1 Avaliação 18 3,7 3,4 49,3 5,1 inicial Dia 270 26 3,0 2,3 43,2 4,3 2 Avaliação 19 3,0 3,8 49,9 4,3 inicial Dia 180 27 3,7 2,6 48,6 3,9 Dia 270 27 3,3 2,7 50,3 3 Avaliação 26 3,9 1,9 59,3 4,7 inicial Dia 180 30 3,4 1,8 48,4 4,1 Dia 270 28 2,8 1,9 50,7 4 Avaliação 19 4,1 4,8 67,2 5,4 inicial Dia 90 25 2,3 2,2 50,7 4,4 Dia 270 27 2,4 2,2 49,7 Média Alteração Melhora 8 seg 1,2 seg Melhora de 14% em de 6,5 Melhora Melhora 7,95 seg Melhora relação à pontos Avaliação Inicial Avaliação de Segurança
[0180] Não foram observados eventos adversos sérios (EASs) no estudo. Três sujeitos apresentaram elevação da gama-glutamil transferase (GGT) que se resolveu com o aumento de esteroides dentro de uma semana e retornou aos níveis de avaliação inicial. Não houve descobertas laboratoriais clinicamente significativas. Pacientes apresentaram náusea transitória geralmente na primeira semana de terapia, coincidente com o aumento da dose de esteroide. Isto não teve correlação com elevações das enzimas hepáticas ou qualquer outra anomalia. Exemplo 3 Estudo Clínico de Fase I/IIa de Distribuição Gênica Sistêmica Randomizado,
Duplo-Cego, Controlado por Placebo
[0181] Este é um ensaio de dose única, randomizado, duplo-cego usando rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina para sujeitos com DMD. O estudo inclui vinte e quatro sujeitos com idades entre 4 e 7 anos. Os sujeitos são randomizados para o tratamento ou placebo no momento da inclusão. Doze sujeitos recebem vetor de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina por via intravenosa (2x1014 vg/kg em aproximadamente 10 mL/kg) e doze sujeitos receberão 10 ml/kg de placebo (Ringer com lactato). Sujeitos com placebo serão transferidos para o tratamento que será administrado da mesma maneira que os 12 sujeitos anteriormente tratados um ano após o último sujeito tratado receber a dose. Os sujeitos recebem infusões de rAAV com microdistrofina ou Ringer com lactato durante aproximadamente 1 hora. As biópsias musculares com agulha pré e pós-tratamento (90 dias) são realizadas nos músculos gastrocnêmios.
[0182] O objetivo principal deste estudo é a avaliação da segurança da administração intravenosa de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina para sujeitos com DMD através da veia periférica do membro. Os desfechos de segurança são avaliados pelas alterações na hematologia, bioquímica sérica, urinálise, resposta imune ao rAAVrh74 e microdistrofina, e histórico relatado e observações dos sintomas. A expressão gênica da distrofina serve como uma medida de resultado primário juntamente com a segurança. A quantificação é realizada usando ensaios validados de imunofluorescência e imunoblot. Uma diminuição na CK após a terapia gênica serve como um resultado secundário. A eficácia é medida pelos seguintes testes funcionais: Tempo para Levantar-se, Subida de 4 Degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), Teste Cronometrado de 10 Metros (10 m), Teste Cronometrado de 100 Metros (100 m). As medidas exploratórias incluem Dinamometria Manual (HHD) para extensores do joelho e flexores do joelho e flexores do cotovelo e extensores do cotovelo.
[0183] Os critérios de inclusão para o estudo são os seguintes:  Idade da admissão: entre 4-7 anos de idade, inclusive.  Caracterização molecular do gene DMD com frameshift (deleção ou duplicação) ou mutação de códon de parada prematura entre os éxons 18 a 58.  Indicação de distrofia muscular sintomática: Elevação de CK > 1000 U/l e tempo médio previsto abaixo do percentual no teste de caminhada de 100 metros  Sujeitos do sexo masculino de qualquer grupo étnico serão elegíveis.  Capacidade de cooperar com os testes de avaliação motora.  Ter estado em uso de doses estáveis ou doses equivalentes de corticosteroides orais por pelo menos 12 semanas antes da triagem e a dose deverá permanecer constante (exceto para as modificações em potencial para acomodar as mudanças de peso) durante todo o estudo.
[0184] Os critérios de exclusão para o estudo são os seguintes:  Infecção viral ativa com base em observações clínicas.  Sinais de cardiomiopatia, incluindo ecocardiograma com fração de ejeção abaixo de 40%.  Evidência sorológica de infecção por HIV ou infecção por hepatite B ou C.  Diagnóstico de (ou tratamento contínuo para) uma doença autoimune.  valores laboratoriais anormais considerados clinicamente significativos (GGT > 3XULN, bilirrubina ≥ 3,0 mg/dL, creatinina ≥ 1,8 mg/dL, Hgb < 8 ou > 18 g/Dl; WBC > 18,500 por mm³), plaquetas ≤ 50.000.  Doença concomitante ou necessidade de tratamento farmacológico crônico que, na opinião do IP, cria riscos desnecessários para a transferência gênica.  Sujeitos com títulos de anticorpos AAVrh74 ou AAV8 > 1:400, conforme determinado pelo imunoensaio ELISA. Se o título do desfecho for positivo na triagem, o teste pode ser repetido antes da exclusão.
 Apresentar um quadro clínico ou circunstância atenuante que, na opinião do investigador, possa comprometer a capacidade do sujeito de cumprir os testes ou procedimentos exigidos pelo protocolo ou comprometer o bem-estar, a segurança ou a capacidade de interpretação clínica do sujeito.  Infecção grave (por exemplo, pneumonia, pielonefrite ou meningite) dentro de 4 semanas antes da visita de transferência gênica (a inclusão pode ser adiada).  Ter recebido qualquer medicação em investigação (exceto corticosteroides) ou medicações de exon skipping (incluindo ExonDys 51®), experimental ou não, nos últimos 6 meses antes da triagem para este estudo.  Ter passado por qualquer tipo de terapia gênica, terapia baseada em células (por exemplo, transplante de células-tronco) ou terapia com CRISPR/Cas9.  A família não quer divulgar a participação do paciente no estudo ao clínico geral e a outros profissionais de saúde. Avaliações de Eficácia
[0185] A expressão gênica da distrofina serve como uma medida de resultado primário juntamente com a segurança. A quantificação é realizada usando ensaios validados de imunofluorescência e imunoblot. Uma diminuição na CK após a terapia gênica serve como um resultado secundário. Além disso, a eficácia é medida pelos seguintes testes funcionais: Tempo para Levantar-se do Chão, Subida de 4 Degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), Teste Cronometrado de 10 Metros (10 m), Teste Cronometrado de 100 Metros (100 m)]. As medidas exploratórias incluem Dinamometria Manual (HHD) para extensores do joelho e flexores do joelho e flexores do cotovelo e extensores do cotovelo.
[0186] As biópsias musculares com orientação por ultrassom são usadas para quantificar a expressão transgênica comparando a avaliação inicial ao Dia 90. As biópsias são realizadas no mesmo músculo que as biópsias originais, mas na perna oposta. um ano após todos os sujeitos terem recebido a dose, os sujeitos cruzados com placebo reiniciarão o cronograma do estudo na consulta 1. Sujeitos com placebo não terão os seguintes procedimentos realizados na segunda triagem de avaliação inicial: IRM cardíaca e biópsia muscular. Sujeitos com placebo são submetidos a uma biópsia muscular no dia 90 (total de 3 biópsias musculares). Seções congeladas são coradas para distrofina usando imunofluorescência indireta (IF). A digitalização de lâminas completas é realizada e a intensidade da microdistrofina e a porcentagem de fibras positivas são quantificadas usando a digitalização de imagem validada e o algoritmo de análise MuscleMapTM. As morfometrias musculares são realizadas em caráter cego, incluindo histogramas de tamanho de fibra. As raspagens de biopsias de músculo congelado cegas são usadas para realizar a análise quantitativa de proteínas para a microdistrofina usando um método validado de western blot.
[0187] As biópsias musculares com agulha do músculo gastrocnêmio (a menos que consideradas contraindicadas em um sujeito específico pelo IP, caso em que o IP selecionará um músculo alternativo para biópsia) são usadas para quantificar a expressão de microdistrofina. Análises de Eficácia
[0188] O desfecho primário de eficácia é a mudança da avaliação inicial até o Dia 90 na quantidade de expressão da proteína microdistrofina medida por Western blot do tecido muscular biopsiado. As diferenças do grupo de tratamento para o desfecho primário de eficácia são avaliadas com um modelo de análise de covariância (ANCOVA) com tratamento como fator fixo e valor de avaliação inicial como covariável. O teste de soma dos postos de Wilcoxon é realizado como uma análise de apoio. A mudança da expressão da microdistrofina em relação à avaliação inicial através da intensidade da fibra de imunofluorescência (IF) é analisada de forma semelhante.
[0189] Os desfechos de eficácia de apoio incluem mudança desde a avaliação inicial até cada avaliação programada de Tempo para Levantar-se do Chão, Subida de 4 Degraus, NSAA, Teste Cronometrado de 10 Metros (10 m), Teste Cronometrado de 100 Metros (100 m) e mudança na CK. As medidas exploratórias incluem HHD para extensores do joelho e flexores do joelho e flexores do cotovelo e extensores do cotovelo. As diferenças entre os grupos de tratamento são avaliadas com o modelo ANCOVA com tratamento como fator fixo e valor de avaliação inicial como covariável. O teste de soma dos postos de Wilcoxon é realizado como uma análise de apoio. Exemplo 4
[0190] Os ensaios e estudos descritos nos Exemplos 2 e 3 acima são alternativamente realizados usando o construto de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina estabelecido na SEQ ID NO: 9; conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8, nucleotídeos 1-4977; ou conforme estabelecido na SEQ ID NO: 6; nucleotídeos 56-5022. Exemplo 5 Geração do construto pAAV.MCK.microdistrofina
[0191] O plasmídeo pAAV.MCK.microdistrofina foi construído através da inserção do cassete de expressão MCK que conduz uma sequência de cDNA de microdistrofina humana com códon otimizado no vetor de clonagem AAV psub201 (Samulski et al., J. Virol. 61(10):3096-3101). Um elemento regulador específico do músculo foi incluído no construto para conduzir a expressão gênica específica do músculo. Este elemento regulador compreendeu o potenciador de núcleo MCK de camundongo (206 bp) fundido ao promotor de núcleo MCK de 351 bp (proximal). Após o promotor de núcleo, o construto compreende o éxon 1 MCK de camundongo endógeno de 53 bp (não traduzido) para iniciação de transcrição eficiente, seguido pelos sinais de splice 16S/19S tardios SV40 (97 bp) e uma pequena 5’UTR (61 bp). O íntron e a 5’UTR foram derivados do plasmídeo pCMVß (Clontech). O cassete de microdistrofina tem uma Kozak consenso imediatamente à frente do início de ATG e um pequeno sinal sintético poliA de 53 bp para terminação de mRNA. O cassete de microdistrofina humana contém os domínios (R4–R23/Δ71–78) conforme descrito anteriormente por Harper et al. Nat. Med. 8(3):253-61, 2002
[0192] O plasmídeo pAAV.MCK.microdistrofina continha o cassete de expressão de cDNA da microdistrofina humana flanqueada por sequências de repetição terminal (ITR) invertidas de AAV2 (ver Fig. 5). Esta sequência foi encapsulada em vírions AAVrh.74. O clone molecular do sorotipo AAVrh.74 foi clonado de um linfonodo macaco rhesus e é descrito em Rodino-Klapac et al. Journal de Tran. Med.45 (2007).
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Claims (78)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar a distrofia muscular em um sujeito humano em necessidade, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de administrar uma rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), em que o rAAV é administrado usando uma via de administração sistêmica e em uma dose de cerca de 5,0x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1015.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a via de administração sistêmica é uma via intravenosa e a dose de rAAV administrada é de cerca de 2x1014 vg/kg.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose de rAAV é administrada a uma concentração de cerca de 10 mL/kg.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV é administrado por injeção, infusão ou implantação.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV é administrado por infusão por aproximadamente uma hora.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV é administrado por uma via intravenosa pela veia periférica de um membro.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:7.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV é do sorotipo AAVrh.74.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de que a distrofia muscular é distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito humano sofre de distrofia muscular de Duchenne, e o rAAV é administrado por infusão intravenosa por aproximadamente uma hora em uma dose de cerca de 2x 1014 vg/kg e em que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão do gene da microdistrofina em uma célula do sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o nível de expressão do gene da microdistrofina antes da administração do rAAV.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão do gene da microdistrofina na célula é detectada pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot no músculo submetido à biópsia antes e após a administração do rAAV.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de proteína microdistrofina aumenta em pelo menos 72% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração de rAAV.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão do gene da microdistrofina na célula é detectada pela medição do nível de proteína microdistrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de proteína microdistrofina aumenta em pelo menos 72% após a administração de rAAV em comparação com o nível de microdistrofina antes da administração de rAAV.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de CK sérica no sujeito é reduzido após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de CK sérica no sujeito é reduzido em 87% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de fibras positivas para microdistrofina no tecido muscular do sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o número de fibras positivas para microdistrofina antes da administração do rAAV.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de alfa-sarcoglicano no sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o nível de alfa-sarcoglicano antes da administração do rAAV.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de alfa-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa-sarcoglicano por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de alfa-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa-sarcoglicano por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de beta-sarcoglicano no sujeito aumenta após a administração do rAAV em comparação com o nível de beta-sarcoglicano antes da administração do rAAV.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína beta-sarcoglicano por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína beta-sarcoglicano por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12,
CARACTERIZADO pelo fato de que a progressão da doença no sujeito é retardada após a administração de rAAV, conforme medido por qualquer um dos seguintes testes: teste de caminhada de seis minutos, tempo para levantar, subida de 4 degraus, subida e descida de 4 degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), teste cronometrado de 10 metros, teste cronometrado de 100 metros, dinamometria manual (HHD), Subida e Descida Cronometradas, e/ou escore em Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III).
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 6 pontos no escore de NSAA pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o escore de NSAA antes da administração do rAAV.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 0,8 segundo no tempo para levantar pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo para levantar antes da administração do rAAV.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 1,2 segundo no tempo do teste de subida de 4 degraus pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo do teste de subida de 4 degraus antes da administração do rAAV.
29. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 7 segundos no teste cronometrado de 100 m pelo menos 270 dias após a administração do rAAV em comparação com o teste cronometrado de 100 m antes da administração do rAAV.
30. Método de expressão do gene da microdistrofina em uma célula do paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao paciente, a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID
NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão do gene da microdistrofina na célula do paciente é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do construto de rAAV.MHCK7.microdistrofina.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão do gene da microdistrofina na célula do paciente é detectado pela medição do nível de proteína microdistrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do construto de rAAV.MHCK7.microdistrofina.
33. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão do gene da microdistrofina é medida no paciente pela detecção de mais de 1 cópia do genoma do vetor rAAV por núcleo.
34. Método para diminuir os níveis de CK sérica em um paciente em necessidade, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao paciente, a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de CK sérica no paciente diminui em pelo menos 87% em 60 dias após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV.
36. Método para aumentar as fibras positivas para microdistrofina em um tecido muscular do paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao paciente, a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína distrofina por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de fibras positivas para microdistrofina é detectado pela medição do nível de proteína distrofina por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
39. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de fibras positivas para microdistrofina é medido pela detecção de mais de 1 cópia do genoma do vetor rAAV por núcleo.
40. Método para aumentar a expressão de alfa-sarcoglicano em um paciente em necessidade, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao paciente, a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de alfa-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa-sarcoglicano por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de alfa-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína alfa-sarcoglicano por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
43. Método para aumentar a expressão de beta-sarcoglicano em um paciente em necessidade, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao paciente, a sequência nucleotídica do construto de
AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína beta-sarcoglicano por Western blot em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
45. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de beta-sarcoglicano é detectado pela medição do nível de proteína beta-sarcoglicano por imuno-histoquímica em biópsias musculares antes e após a administração do rAAV.
46. Método para tratar um paciente com distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao paciente, a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3 de modo que a progressão da doença no paciente seja retardada conforme medido por qualquer um dos seguintes testes: teste de caminhada de seis minutos, tempo para levantar, subida de 4 degraus, subida e descida de 4 degraus, Avaliação Ambulatorial North Star (NSAA), teste cronometrado de 10 metros, teste cronometrado de 100 metros, dinamometria manual (HHD), Subida e Descida Cronometradas e/ou escore em Escala do Subteste Motor Grosso (Bayley-III).
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 6 pontos no escore de NSAA pelo menos 90 dias após a administração do rAAV em comparação com o escore de NSAA antes da administração do rAAV.
48. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 0,8 segundo no tempo para levantar pelo menos 90 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo para levantar antes da administração do rAAV.
49. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 1,2 segundo no tempo do teste de subida de 4 degraus pelo menos 90 dias após a administração do rAAV em comparação com o tempo do teste de subida de 4 degraus antes da administração do rAAV.
50. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma melhora de pelo menos 7 segundos no teste cronometrado de 100 m pelo menos 90 dias após a administração do rAAV em comparação com o teste cronometrado de 100 m antes da administração do rAAV.
51. Composição para tratar uma distrofia muscular em um sujeito humano em necessidade, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende uma rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), em que a composição é formulada para uma via de administração sistêmica e a dose do rAAV é de cerca de 5x1012 vg/kg a cerca de 1,0x1015 vg/kg.
52. Composição, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADA pelo fato de que a via de administração sistêmica é uma via intravenosa e a dose de rAAV é de cerca de 2x 1014 vg/kg.
53. Composição, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, CARACTERIZADA pelo fato de que a dose de rAAV é de cerca de 10 mL/kg.
54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-53, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para administração por injeção, infusão ou implantação.
55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-53, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para administração por infusão por aproximadamente uma hora.
56. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-53,
CARACTERIZADA pelo fato de que a dose da composição é formulada para administração intravenosa por uma veia de membro periférico.
57. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-56, CARACTERIZADA pelo fato de que o rAAV compreende a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1.
58. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-57, CARACTERIZADA pelo fato de que o rAAV compreende a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:7.
59. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-58, CARACTERIZADA pelo fato de que o rAAV é do sorotipo AAVrh.74.
60. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-59, CARACTERIZADA pelo fato de que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO:9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
61. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-60, CARACTERIZADA pelo fato de que a distrofia muscular é distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker.
62. Composição para tratar a distrofia muscular de Duchenne em um sujeito humano em necessidade, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende uma rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), em que a composição é formulada para administração por infusão intravenosa por aproximadamente uma hora a uma dose de cerca de 2x 1014 vg/kg, e em que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh7.4.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
63. Uso de uma rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma distrofia muscular em um sujeito humano em necessidade, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para uma via de administração sistêmica e compreende uma dose de rAAV de cerca de 1x1014 vg/kg a cerca de 4x 1014 vg/kg.
64. Uso, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração intravenosa e a dose de rAAV é de cerca de 2x 1014 vg/kg.
65. Uso, de acordo com a reivindicação 63 ou 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose de rAAV é de cerca de 10 mL/kg.
66. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-65, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração por injeção, infusão ou implantação.
67. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-65, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para ser administrado por infusão por aproximadamente uma hora.
68. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-65, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração intravenosa pela veia periférica de um membro.
69. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-68, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende a sequência nucleotídica de microdistrofina humana da SEQ ID NO: 1.
70. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-69, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende a sequência promotora de MHCK7 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:7.
71. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-70, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV é do sorotipo AAVrh.74.
72. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-70,
CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO:9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
73. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-71, CARACTERIZADO pelo fato de que a distrofia muscular é distrofia muscular de Duchenne ou distrofia muscular de Becker.
74. Uso de uma rAAV.MHCK7.microdistrofina de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para a preparação de um medicamento para tratar a distrofia muscular de Duchenne em um sujeito humano em necessidade, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração por infusão intravenosa por aproximadamente uma hora e compreende uma dose do rAAV de cerca de 2x 1014 vg/kg e em que o rAAV compreende a sequência nucleotídica do construto de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina da SEQ ID NO: 9 ou dos nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-50, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de CK sérica no sujeito diminui após a administração do rAAV em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV em um nível percentual selecionado do grupo que consiste em: a) pelo menos 78% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; b) pelo menos 46, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 85% em 270 dias após a administração; c) pelo menos 72, 73, 74 ou 95% em 180 dias após a administração; d) pelo menos 87, 88, 93 ou 95% em 90 dias após a administração; e) pelo menos 70% em 270 dias após a administração; f) 70 a 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; g) pelo menos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração; e h) pelo menos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração.
76. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-62, CARACTERIZADA pelo fato de que após a administração da referida composição a um sujeito humano em necessidade de tratamento para distrofia muscular, o nível de CK sérica no sujeito diminui em comparação com o nível de CK sérica antes da administração da composição em um nível percentual selecionado do grupo que consiste em: a) pelo menos 78% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; b) pelo menos 46, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 85% em 270 dias após a administração; c) pelo menos 72, 73, 74 ou 95% em 180 dias após a administração; d) pelo menos 87, 88, 93 ou 95% em 90 dias após a administração; e) pelo menos 70% em 270 dias após a administração; f) 70 a 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; g) pelo menos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração; e h) pelo menos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração.
77. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-74, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de CK sérica no sujeito diminui após a administração do rAAV ao sujeito em comparação com o nível de CK sérica antes da administração do rAAV em um nível percentual selecionado do grupo que consiste em: a) pelo menos 78% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; b) pelo menos 46, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 85% em 270 dias após a administração; c) pelo menos 72, 73, 74 ou 95% em 180 dias após a administração; d) pelo menos 87, 88, 93 ou 95% em 90 dias após a administração; e) pelo menos 70% em 270 dias após a administração; f) 70 a 95% em 90, 180 ou 270 dias após a administração; g) pelo menos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração; e h) pelo menos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95 % em 90, 180 ou 270 dias após a administração.
78. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a) a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3, b) a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 8, c) a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9, d) rAAV compreendendo nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, e) rAAV compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9, f) rAAV compreendendo nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8, g) partículas de rAAV compreendendo nucleotídeos 55-5021 da SEQ ID NO: 3, h) partículas de rAAV compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9, ou i) partículas de rAAV compreendendo nucleotídeos 1-4977 da SEQ ID NO: 8.
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