JP2023081369A - 自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用 - Google Patents

自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】筋ジストフィー、例えばＬＧＭＤ２Ｄなどの肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）に罹患している対象における線維症を軽減し、予防するための治療用ベクターを提供する。【解決手段】自己相補的組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡベクターを構成する特定のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド配列、および前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０２１年１１月３０日に出願された、米国仮出願第６３／２８４４１８号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、サイズ：２４，１３１バイト、作成日：２０２２年１１月９日の５６７５７＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔとして識別される、コンピュータ可読形態の配列表を含む。
アルファ－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターのような治療ベクター、並びに筋ジストロフィー、例えばＬＧＭＤ２Ｄなどの肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）に罹患している対象における線維症を軽減し、予防するためにこれらのベクターを使用する方法が、本明細書に記載される。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期又は小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布及び程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、並びに遺伝形式の点で異なる。
ＭＤのうちの１つのグループは、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤは、まれな状態であり、発症年齢、筋力低下の領域、心臓及び呼吸器の関与、進行速度、並びに重症度に関して、ヒトによって症状が異なる。ＬＧＭＤは、小児期、青年期、若年成人期、又はそれ以降に始まる可能性がある。両方の性別が等しく影響を受ける。ＬＧＭＤは、肩及び骨盤帯に衰弱を引き起こし、上肢及び腕の近くの筋肉も時間とともに衰弱することがある。脚の脱力感は、腕の脱力感よりも前に現れることがよくある。顔の筋肉は、通常影響を受けない。状態が進行するにつれて、人々は、歩行に問題を抱えることがあり、時間の経過とともに車椅子を使用する必要があり得る。肩及び腕の筋肉が関与すると、腕を頭上に上げたり、物を持ち上げたりするのが困難になることがある。ＬＧＭＤの種類によっては、心臓及び呼吸筋が関与し得る。
ＬＧＭＤのための専門の検査は、診断のための全国的な計画であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＮＣＧ）を通じて現在利用可能である。
ＬＧＭＤサブタイプ２Ｄ（ＬＧＭＤ２Ｄ）は、しばしばα－サルコグリカノパチーと呼ばれ、アルファ－サルコグリカン遺伝子（ＳＧＣＡ；アルファ－サルコグリカン）の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、ジストロフィン関連タンパク質複合体の他の構造成分の喪失を伴う機能性タンパク質の完全又は削減された喪失をもたらす。特に、アルファ－サルコグリカンタンパク質の喪失は、３～８歳で発症する、筋機能の低下を伴う進行性筋ジストロフィーを引き起こす。症状には、歩行の遅延、脂肪の置換及び線維症によって引き起こされる近位筋の衰弱、クレアチンキナーゼの上昇、脊柱側弯症、並びに関節拘縮が含まれる。衰弱させる病気は、しばしば車椅子依存及び呼吸不全による死につながる。したがって、ＬＧＭＤ２Ｄの治療の必要性が残っている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレント及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。更に、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして挿入される。更に、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド形成を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
ＬＧＭＤ及び他の筋ジストロフィーに罹患している患者における機能改善には、遺伝子回復及び線維症の軽減の両方が必要である。ＬＧＭＤ及び他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を軽減させる方法が必要とされている。
アルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する遺伝子用治療ベクター（例えば、ＡＡＶ）、並びにアルファ－サルコグリカンを筋肉に送達し、線維症を軽減及び／又は予防する方法、及び／又は筋力を増加させる方法、及び／又は筋ジストロフィーを罹患している哺乳動物対象を治療する方法が、本明細書に記載される。
アルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）が、本明細書に提供される。例えば、提供されるｓｃＡＡＶは、ｉ）自己相補的であるアルファ－サルコグリカンタンパク質をコードする２つのヌクレオチド配列と、ｉｉ）自己相補的であり、ＡＡＶゲノム配列（発現カセット）の中心に位置する変異逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、２つのポリアデニル化配列と、を含む、ポリヌクレオチド配列を含む。
また、ポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターも提供され、ポリヌクレオチド配列は、５’から３’方向に、（１）ポリアデニル化配列の相補的配列と、（２）目的の遺伝子の相補的配列と、（３）イントロンの相補的配列と、（４）プロモーターの相補的配列と、（５）５’ＩＴＲ配列と、（６）プロモーターと、（７）イントロンと、（８）目的の遺伝子と、（９）ポリアデニル化配列と、を含み、ポリヌクレオチド配列は、２つの３’ＩＴＲ配列によって隣接され、２つの３’ＩＴＲ配列は、互いに相補的である。一実施形態では、目的の遺伝子は、ヒトサルコグリカン－β（ｈＳＣＧＢ）、ヒトサルコグリカンγ（ｈＳＣＧＧ）、ヒトジスフェルリン、又はヒトＡＮＯ５、又はカルパイン－３（Ｃａｐ３）遺伝子を含む。別の実施形態では、プロモーターは、筋特異的制御要素である。筋特異的制御要素の例は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ）要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ｔＭＣＫエンハンサー、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子結合要素、又はステロイド誘発性要素、又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含む。
一本鎖ＡＡＶベクター（ｓｓＡＡＶ）は、核に入ると、複製及び転写の準備が整う前に、第２の鎖の細胞媒介性合成を必要とする。しかしながら、ｓｃＡＡＶがｓｓＡＡＶにおいて必要とされる第２鎖の細胞合成の律速段階を迂回するので、本明細書において提供されるｓｃＡＡＶは、遺伝子療法においてｓｓＡＡＶよりも優れている。
２つの自己相補的ヌクレオチド配列（発現カセットとも称される）を含むポリヌクレオチドが、本明細書で提供され、各ヌクレオチド配列は、ｔＭＣＫプロモーター、ｈＳＧＣＡ ｃＤＮＡ配列、及びポリアデニル化配列、並びに２つのヌクレオチド配列の間に位置する単一の５’ＩＴＲを含む。５’ＩＴＲは、ヌクレオチド配列がハイブリダイズするときにヘアピンを形成する。
例えば、本開示は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を提供し、これはまた図１に概略図として示される。配列番号１のポリヌクレオチド配列は、配列番号３のアミノ酸配列をコードし、互いにハイブリダイズする２つのｈＳＧＣＡ ｃＤＮＡ配列（配列番号２及び／又は配列番号６）、互いにハイブリダイズする２つのｔＭＣＫプロモーター（配列番号７及び／又は配列番号９）、並びに互いにハイブリダイズする２つのポリアデニル化配列（配列番号５及び／又は配列番号１０）を含む、４８５７ヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチド配列の中心に位置するＩＴＲ配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する。追加のＩＴＲ配列は、配列番号４及び１１として示される。
本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列も提供する。
加えて、本開示は、開示されたポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。例えば、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶも提供する。
本開示はまた、ポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供し、ポリヌクレオチド配列は、ｉ）目的の遺伝子を各々コードする、２つの自己相補的ヌクレオチド配列であって、目的の遺伝子をコードする２つの自己相補的ヌクレオチド配列が、５’ＩＴＲ配列に隣接する、２つの自己相補的ヌクレオチド配列と、ｉｉ）２つの自己相補的ポリアデニル化配列と、を含み、ポリヌクレオチド配列は、２つの３’ＩＴＲ配列によって隣接され、２つの３’ＩＴＲ配列は、相補的である。例えば、目的の遺伝子は、ＧＡＤ、ＭＴＭ１、ＬＰＬ、ＲＰＥ、ＲＥＰ－１、ＣＮＧＢ３、Ｐ１ＮＤ４、ＸＬＲＳ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＩＸ１９、ＡＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＩＦＮ－β、ＡＲＳＡ、ＮＧＦ、ｈＡＲＳＢ、ニュールツリン、ＡＡＤＣ、ＳＵＭＦ、ＳＵＭＦ１、ＯＴＣ、ＦＧＦ－４、ＮＤ４、ＡＲＳＡ、ＲＥＰ１、シトシンデアミナーゼ、ＨＧＦ７２８、ＨＧＦ７２３、ｈＧＡＡ、β－グロビン遺伝子、Ｇａｇ、ＭＧ１ＭＡ３、Ｌ５２３Ｓ、ＭＥＴＲＡＰ、ＧＤＮＦ、ＡＱＰ１、ＰＧ９ＤＰ、ＨＢＢ、ＡＤＡ、ＴＣＲ、ＣＡＲ、フィルグラスチム、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣＰ３４．５、ＰＥＮＫ、ＲＢ９４、ＳＳＴ２、ＤＣＫ。Ｐ５３、ＨＳＣ、ヒトサルコグリカン－β（ｈＳＣＧＢ）、ヒトサルコグリカンγ（ｈＳＣＧＧ）、ヒトジスフェルリン、ヒトＡＮＯ５、カルパイン－３（Ｃａｐ３）遺伝子である。例えば、ポリヌクレオチド配列では、第１のヌクレオチド配列は、目的の遺伝子の補体配列であり、目的の遺伝子をコードする第２のヌクレオチド配列は、そのセンス配列であるため、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、互いに相補的である。
本開示はまた、ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを提供し、ポリヌクレオチド配列は、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列などの、ヒトアルファ－サルコグリカン（ｈＳＧＣＡ）タンパク質を各々コードする、２つの自己相補的ヌクレオチド配列と、ｉｉ）２つの自己相補的ポリアデニル化配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ｈＳＧＣＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９９％同一であるか、又はｈＳＧＣＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。例えば、ポリアデニル化配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターが、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２又は配列番号７に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一である配列を含み、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２又は配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなる。
別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、更により典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性である、アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含み、そのタンパク質は、アルファ－サルコグリカン活性を保持する。
別の態様では、ストリンジェントな条件下で配列番号２若しくは配列番号７の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む機能性アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列、又はその補体を含む、組換えＡＡＶベクターが、本明細書に記載される。
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム又は０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、又は他の変性剤など）も使用できるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、及び６０℃（２３塩基オリゴの場合）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄が含まれる。
分子量、濃度、又は投薬量などの物理的特性について本明細書で範囲が使用される場合、範囲及びその中の特定の実施形態の全ての組み合わせ及び部分的な組み合わせが含まれることが意図される。数値又は数値範囲を指す場合の「約」という用語は、参照される数値又は数値範囲が実験的変動内（又は統計的実験誤差内）の近似値であることを意味し、したがって、数値又は数値範囲は、例えば、記載された数値又は数値範囲の１％～１５％で変動し得る。
非特異的及び／又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的で、ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液に他の薬剤を含めることができる。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（又は他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランがあるが、他の好適な薬剤も使用できる。これらの添加物の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更できる。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を考慮して、異なる配列類似性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者によって調整され得る。
加えて、提供されるｒＡＡＶのうちのいずれかは、ポリヌクレオチドを含み、２つの自己相補的ヌクレオチド配列の各々は、筋特異的制御要素に作動可能に連結され、２つの筋特異的制御要素は、自己相補的である。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター（ＭＨＣ及びＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子結合要素、ステロイド誘発性要素、又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。
いくつかの実施形態では、開示されたｒＡＡＶは、ポリヌクレオチド配列を含み、２つの相補的ヌクレオチド配列の各々は、配列番号８又は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む筋特異的制御要素ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）に作動可能に連結される。
追加の実施形態では、開示されたｒＡＡＶは、３つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、１つのＩＴＲは、２つの相補的な筋特異的制御要素によって隣接される。例えば、ＩＴＲは、配列番号５及び／又は配列番号９及び／又は配列番号１２を含み得る。特定の例では、２つの自己相補的な筋特異的制御要素によって隣接されるＩＴＲは、配列番号８又は１０のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、２つのＩＴＲは、配列番号５及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、ＩＴＲのうちの１つは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。
ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４の任意の血清型、又は合成ＡＡＶ血清型であり得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。
本開示はまた、開示されたｒＡＡＶのいずれか又は開示されたポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は補助剤を更に含む。例えば、組成物は、本開示のｒＡＡＶ、緩衝剤、イオン強度剤、及び界面活性剤のいずれかを含む。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示はまた、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、筋力及び／又は筋肉量の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、線維症の軽減を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、収縮誘発性損傷の軽減を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、アルファ－サルコグリカン異常症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与されるか、又はｒＡＡＶは、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
別の実施形態では、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
加えて、開示された方法のうちのいずれかにおいて、全身投与経路は、静脈内経路である。例えば、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、注射、注入、又は移植によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、末梢四肢静脈を介した静脈内経路によって投与される。
開示された方法のうちのいずれかにおいて、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。例えば、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である。
例示的な実施形態では、筋ジストロフィーを治療する方法は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している対象にｒＡＡＶを投与することを含み、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。
例示的な実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための方法を提供し、この方法は、対象にｒＡＡＶを投与するステップを含み、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。例えば、これらの方法では、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。
開示された方法のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、かつ／又は対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少し、かつ／又は自発運動及び比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／又は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、又は線維症は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、ｒＡＡＶの投与後の対象において軽減し、かつ／又は、線維症は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、ｒＡＡＶの投与後の対象において軽減し、かつ／又は対象の筋肉における比力、線維直径サイズ、及び／若しくは偏心収縮は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。
いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子発現は、ウエスタンブロット及び／又は免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
別の態様では、本開示は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を提供する。例えば、本開示は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を提供する。加えて、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。
本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、この方法は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む。例えば、本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、この方法は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる方法を提供する。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカン陽性線維の増加を必要とする対象の筋肉組織においてそれを行う方法を提供し、この方法は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む。
本開示はまた、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、この方法は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む。加えて、開示された方法のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。
本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを含み、組成物は、全身経路による投与用に製剤化される。特に、組成物のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡである。
本開示はまた、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、筋力及び／又は筋肉量の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、線維症の軽減を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、収縮誘発性損傷の軽減を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、アルファ－サルコグリカン異常症の治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。
開示された組成物のうちのいずれかは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量、又はｒＡＡＶは、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量にある。
別の実施形態では、開示された組成物のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
加えて、開示された組成物のうちのいずかは、注射、注入、又は移植による投与用に製剤化された組成物など、静脈内経路による投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、開示された組成物は、末梢四肢静脈を介した静脈内経路による投与用に製剤化される。
開示された組成物のうちのいずれかは、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）などの肢帯型筋ジストロフィーの治療用である。
例示的な実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している対象を治療するための組成物を提供し、組成物は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇでｒＡＡＶの用量を含み、組成物は、静脈内注入による投与用に製剤化され、ｒＡＡＶは、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。
加えて、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーを治療すること必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇでｒＡＡＶの用量を含み、組成物は、静脈内注入による投与用に製剤化され、ｒＡＡＶは、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。例えば、組成物の投与は、組成物の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルを増加させる。
加えて、開示された組成物のうちのいずれかの投与は、組成物の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルを増加させ、かつ／又は開示された組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、対象における血清ＣＫレベルを減少させ、かつ／又は自発運動及び比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／又は、組成物の投与は、組成物の投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数を増加させ、かつ／又は組成物の投与は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、対象における線維症を軽減し、かつ／又は、組成物は、組成物の投与前と比較して、線維症を軽減し、又は組成物の投与は、組成物の投与前と比較して、対象の筋肉における比力、線維直径サイズ、及び／若しくは偏心収縮を増加させる。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子発現は、ウエスタンブロット及び／又は免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
別の態様では、本開示は、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを含む。例えば、本開示は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物を提供する。加えて、組成物のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。
本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む。例えば、本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを含む。例えば、本開示は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための組成物を提供し、組成物は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。
本開示はまた、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを含む。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。加えて、開示された組成物のうちのいずれかの投与後、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、開示された組成物のうちのいずれかの投与後、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、開示された組成物のうちのいずれかの投与後、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって対象において測定される。
本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供し、医薬は、全身経路による投与用に製剤化される。特に、本開示は、筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のためのＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡの使用を提供し、医薬は、全身投与経路による投与用に製剤化される。
本開示はまた、筋力及び／又は筋量の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用も提供する。特に、本開示は、ｒＡＡＶがＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶが全身投与経路を用いて投与される使用を提供する。
本開示はまた、線維症の軽減を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用も提供する。特に、本開示は、ｒＡＡＶがＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶが全身投与経路を用いて投与される使用を提供する。
本開示はまた、収縮誘発性損傷の軽減を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用も提供する。特に、本開示は、ｒＡＡＶがＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶが全身投与経路を用いて投与される使用を提供する。
本開示はまた、アルファ－サルコグリカン異常症の治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用も提供する。特に、本開示は、ｒＡＡＶがＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶが全身投与経路を用いて投与される使用を提供する。
開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量、又はｒＡＡＶは、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量にある。
別の実施形態では、開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。例えば、医薬は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。
加えて、開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、静脈内経路による投与用に製剤化される。例えば、開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、注射、注入、又は移植による投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬は、末梢四肢静脈を介した静脈内経路による投与用に製剤化される。
開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）などの肢帯型筋ジストロフィーの治療用である。
例示的な実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供し、医薬は、静脈内注入による投与用に製剤化され、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量にあり、ｒＡＡＶは、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。例えば、医薬の投与を必要とする対象への医薬の投与は、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現の増加をもたらす。
開示される使用のうちのいずれかにおいて、医薬の投与を必要とする対象への医薬の投与は、医薬の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルの増加をもたらし、かつ／又は対象への医薬の投与は、医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、対象における血清ＣＫレベルの減少をもたらし、かつ／又は自発運動及び比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／又は対象への薬剤の投与は、医薬の投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数の増加をもたらし、かつ／又は医薬の投与を必要とする対象への医薬の投与は、医薬の投与前と比較して、対象における線維症の軽減をもたらし、かつ／又は医薬の投与は、医薬の投与前と比較して、対象の筋肉における比力、線維直径サイズ、及び／若しくは偏心収縮の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子発現は、ウエスタンブロット及び／又は免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
別の態様では、本開示は、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現を必要する対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供する。例えば、本開示は、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現を必要する対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。加えて、使用のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、使用のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。
本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供する。例えば、本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供する。例えば、本開示は、対象の筋肉組織においてアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
本開示はまた、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供とする。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。加えて、開示された使用のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、開示された使用のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。
開示された方法、組成物、又は使用のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳のヒト対象、又は２５～５５歳のヒト対象、又は５０歳を超えるヒト対象である。
開示された方法、組成物、又は使用のうちのいずれかにおいて、対象は、小児対象、青年対象、又は若年成人対象である。代替的に、対象は、中年成人又は高齢対象である。
例えば、開示された方法、組成物、又は使用のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳であり、両方の対立遺伝子において確認されたアルファ－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）変異を有し、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、かつ／又は４０％超若しくは通常の１００メートルの歩行試験を有した、ヒト対象である。
別の態様では、プラスミドを細胞に移入することを含み、プラスミドが、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶを生成する方法が提供される。特に、プラスミドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
ｒＡＡＶを生成する開示された方法のうちのいずれかにおいて、方法は、パッケージングプラスミド及び／又はヘルパーウイルスを宿主細胞に移入することを更に含む。加えて、ｒＡＡＶを生成する開示された方法のうちのいずれかにおいて、パッケージング細胞は、安定に組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、及び／又はパッケージング細胞は、安定して組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。
別の態様では、本開示は、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む。
組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法であって、本明細書に記載のプラスミドでトランスフェクトされる細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することと、を含む、方法も提供される。本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子もまた企図される。一実施形態では、ｒＡＡＶを生成する方法は、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移すことを含む。別の実施形態では、プラスミドは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む細胞を提供する。本明細書に記載の細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（例えば、Ｓ２細胞若しくはＫｃ細胞）、カイコ細胞（例えば、Ｂｍｅ２１細胞）、又は蚊細胞（例えば、Ｃ６／３６細胞）、又は哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞、例えば、ヒト初代細胞若しくは確立された細胞株）であり得る。一実施形態では、哺乳動物細胞は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、又はＫＢ細胞である。
別の実施形態では、プラスミドは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定して発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定して保有する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを生成することができる。
本明細書で提供される組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法は、パッケージングプラスミド及び／又はヘルパーウイルスを宿主細胞に移入するステップを更に含み得る。例えば、この方法は、パッケージング細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むステップ、及び／又はパッケージング細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むステップを更に含む。本発明はまた、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミド、又は配列番号１のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞も提供する。配列番号１のヌクレオチド配列を含む細胞も提供される。
それを必要とする対象における線維症を軽減させる方法も提供される。この点について、方法は、治療有効量の、本明細書に記載のＡＡＶベクター（又は本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを含む組成物）を、哺乳動物対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター（又は本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを含む組成物）の投与は、対象の骨格筋又は心筋における線維症を軽減させる。
本明細書で使用される「筋ジストロフィー」という用語は、強度及び筋肉量が徐々に低下する障害を指す。筋ジストロフィー疾患の非限定的な例としては、ベッカー型筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、サルコグリカン異常症、部分的ＬＡＭＡ２欠損による先天性筋ジストロフィーなどの先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、１Ｄ型先天性筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、肢帯型１Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｂ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｄ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｅ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｆ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｇ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｈ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｊ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｋ型筋ジストロフィー、肢帯型ＩＣ型筋ジストロフィー、単純型表皮水疱症を伴う強直性脊椎型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、及びウルリッヒ型スクレロアトニック筋ジストロフィーを挙げることができる。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）に罹患している。
本明細書で使用される「線維症」という用語は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰又は未制御の沈着並びに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓を含む損傷後の組織における異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、コラーゲン（例えばコラーゲン１、コラーゲン２、又はコラーゲン３）及びフィブロネクチンが含まれる。
別の態様では、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（又は本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳動物の対象に投与することを含む、哺乳動物の対象における筋力及び／又は筋肉量を増加する方法が本明細書に記載される。一実施形態では、対象は、ヒトである。
提供される製剤又は組成物では、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、及びＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む。例えば、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０のトリスを含むか、又は緩衝剤は、約２０ｍＭでｐＨ８．０のトリスを含む。
提供される製剤又は組成物のうちのいずれかにおいて、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、及び酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む。例えば、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含むか、又はイオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含むか、又はイオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含むか、又はイオン強度剤は、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。
提供される製剤又は組成物のうちのいずれかにおいて、界面活性剤は、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、及びカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む。例えば、ポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、及びポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む。ポロキサマーは、約０．００００１％～約１％の濃度であってもよい。例示的な界面活性剤は、約０．００１％の濃度のポロキサマー１８８である。
前述の段落は、本発明の全ての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は、詳細な説明のような他のセクションに記載される。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが考慮されることを理解されたい。本発明は、追加の態様として、上記の特定の段落で定義される変形よりもいくらか範囲が狭い本発明の全ての実施形態を含む。例えば、本発明の特定の態様が属として記載される場合、属の各メンバーが個々に本発明の態様であると理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド配列。
（項目２）
前記ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列又は配列番号１を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
（項目３）
ポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、前記ポリヌクレオチド配列が、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を各々コードする、２つの相補的ヌクレオチド配列と、ｉｉ）２つの相補的ポリアデニル化配列と、を含む、組換えＡＡＶ。
（項目４）
前記２つの相補的ヌクレオチド配列の各々が、筋特異的制御要素に作動可能に連結され、前記２つの筋特異的制御要素が、互いに相補的である、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目５）
前記筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子結合要素、ステロイド誘発性要素、又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目６）
前記筋特異的制御要素が、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目７）
２つの相補的キメライントロンを更に含む、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目８）
３つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含み、１つのＩＴＲが、前記２つの相補的な筋特異的制御要素によって隣接される、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目９）
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目１０）
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３ ＡＡＶ ｒｈ．７４、又は合成ＡＡＶ血清型である、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
（項目１１）
先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶを含む、組成物。
（項目１２）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１３）
筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力及び／又は筋量を増加させる方法であって、前記対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１４）
筋ジストロフィーに罹患している対象において線維症を軽減させる方法であって、前記対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１５）
筋ジストロフィーに罹患している対象において収縮誘発性損傷を軽減させる方法であって、前記対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１６）
対象においてアルファ－サルコグリカン異常症を治療する方法であって、前記対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１７）
対象の筋肉組織においてアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる及び／又はＣＫレベルを減少させる方法であって、前記対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１８）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又は陽性アルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶ投与の前及び後の筋生検において、ウエスタンブロットで、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又はアルファ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、免疫組織化学によって、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記組換えＡＡＶ又は前記組成物が、筋肉内注射又は静脈内注射によって投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記組換えＡＡＶ又は前記組成物が、全身投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記組換えＡＡＶ又は前記組成物が、注射、注入、又は移植によって非経口投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記組換えＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡ又は線状プラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
哺乳動物対象における筋ジストロフィーを治療するための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
（項目３０）
筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象における筋力及び／又は筋量を増加させるための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
（項目３１）
筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象における線維症を軽減させるための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
（項目３２）
筋ジストロフィーに罹患している対象における収縮誘発性損傷を軽減させるための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
（項目３３）
治療を必要とする哺乳動物対象におけるβ－サルコグリカン異常症を治療するための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
（項目３４）
対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる及び／又はＣＫレベルを減少させるための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
（項目３５）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又は陽性アルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、ウエスタンブロットで、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又はアルファ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、免疫組織化学によって、アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
全身投与用に製剤化される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記全身投与が、注射、注入、又は移植による非経口投与である、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記組換えＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡ又は線状プラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４４）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
（項目４７）
筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象において筋力及び／又は筋量を増加させるための医薬の調製のための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
（項目４８）
筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象において線維症を軽減させるための医薬の調製のための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
（項目４９）
筋ジストロフィーに罹患している対象において収縮誘発性損傷を軽減させるための医薬の調製のための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
（項目５０）
β－サルコグリカン異常症の治療を必要とする哺乳動物対象においてβ－サルコグリカン異常症を治療するための医薬の調製のための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
（項目５１）
対象の筋肉組織においてアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる及び／又はＣＫレベルを減少させるための医薬の調製のための、先行する項目のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は先行する項目のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
（項目５２）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又は陽性アルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、ウエスタンブロットで、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目５３）
アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又はアルファ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、免疫組織化学によって、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目５４）
前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、先行する項目のいずれか一項のいずれか一項に記載の使用。
（項目５５）
前記医薬が、筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目５６）
前記医薬が、全身投与用に製剤化される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目５７）
前記全身投与が、注射、注入、又は移植による非経口投与である、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目５８）
前記組換えＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又は線状プラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目５９）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目６０）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目６１）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目６２）
前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
ポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記ポリヌクレオチド配列が、５’から３’方向に、
（１）ポリアデニル化配列の相補的配列と、
（２）目的の遺伝子の相補的配列と、
（３）イントロンの相補的配列と、
（４）プロモーターの相補的配列と、
（５）５’ＩＴＲ配列と、
（６）前記プロモーターと、
（７）前記イントロンと、
（８）前記目的の遺伝子と、
（９）前記ポリアデニル化配列と、を含み、
前記ポリヌクレオチド配列が、２つの３’ＩＴＲ配列によって隣接され、前記２つの３’ＩＴＲ配列が、互いに相補的である、組換えＡＡＶベクター。
（項目６４）
前記目的の遺伝子が、ヒトサルコグリカン－β（ｈＳＣＧＢ）、ヒトサルコグリカンγ（ｈＳＣＧＧ）、ヒトジスフェルリン、ヒトＡＮＯ５、及びカルパイン－３（Ｃａｐ３）遺伝子を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
（項目６５）
前記プロモーターが、筋特異的制御要素であり、前記筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）要素、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子結合要素、又はステロイド誘発性要素、又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
（摘要）
自己相補的組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡベクターを投与することを含む筋ジストロフィーを治療する方法、患者においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法、ｒＡＡＶを含む薬学的組成物、及びｒＡＡＶを生成する方法が、本明細書に記載される。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ治療用アルファ－サルコグリカン導入遺伝子カセットの概略図を提供する。コドン最適化ヒトアルファ－サルコグリカン遺伝子（ｈＳＧＣＡ）を含む自己相補的ＡＡＶベクター。筋肉特異的ｔＭＣＫプロモーターが発現を駆動する。カセットはまた、安定性のためにプロセシング及びポリアデニル化シグナルを増強するキメライントロンを含む。
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの注釈付きヌクレオチド配列を提供する。 ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの注釈付きヌクレオチド配列を提供する。 ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの注釈付きヌクレオチド配列を提供する。 ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの注釈付きヌクレオチド配列を提供する。
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内で、ウイルス学、微生物学、分子生物学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「培養物」への言及は、１つ以上の培養物及び当業者に周知されるその同等物への言及を含む、などである。「組換えＡＡＶ」への言及は、２つ以上のｒＡＡＶビリオンの混合物を含む、などである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替案が相互に排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替案及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されているデバイス又は方法に対する統計的実験誤差（誤差の標準偏差）を含むことを示すために使用される。
「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を移入することができる、任意の遺伝子要素を意味する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されるものなどの３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。類似感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が類似調節制御下にあることも示唆する。
本明細書で使用される場合の「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ１０、及びＡＡＶｒｈ．７４を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターである。ＡＡＶベクターは、好ましくはｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子で、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上が全部又は一部分において欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持することができる。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列を含むように本明細書で定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製、及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更され得る。
「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、生産的なＡＡＶ複製のために次にトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ、及びｃａｐを含む。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を所有することが示されている。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターから失われたトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
「組換えウイルス」とは、例えば、ウイルス粒子への異種核酸配列の付加又は挿入によって遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシドに包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。一実施形態では、ＡＡＶビリオンは、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の産生には、ＡＡＶベクターの産生が含まれ、例えば、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有される。
哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などのＡＡＶゲノム、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質コートに関連する線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む。ＡＡＶビリオンは、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ又は自己相補的（ＳＣ）ＡＡＶのいずれかであり得る。一実施形態では、相補的センス、例えば「センス」又は「アンチセンス」鎖のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされ得、両方の鎖は、等しく感染性である。
「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプセル化する、ＡＡＶタンパク質シェルからなる感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書で定義される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、好適な宿主細胞で産生され、これは、その中に導入されたＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、及びアクセサリー機能を有する。このようにして、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有する）を感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするために必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードすることができる。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに「トランスフェクト」される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を用いて、ヌクレオチド組み込みベクター及び他の核酸分子などの、１つ以上の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
「宿主細胞」という用語は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、又はその他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用できるか、又は使用されてきた、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的、又は意図的な変異のために、形態又はゲノム又は全ＤＮＡ補体において必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるβ－サルコグリカンの発現をもたらす、記載の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への目的のポリヌクレオチド（例えば、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列）の投与／送達を指すために使用される。
「筋肉細胞」又は「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、又は心臓組織に由来する骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞又は細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞など、分化又は未分化であり得る。
「異種」という用語は、コード配列及び制御配列などの核酸配列に関連するとき、通常は一緒に結合されていない、かつ／又は通常は特定の細胞に関連していない配列を示す。したがって、核酸構築物又はベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見られない、別の核酸分子内又は別の核酸分子に付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、自然界のコード配列に関連して見られない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が自然界で見られない（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、細胞内に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であるとみなされるであろう。本明細書で使用される場合、対立遺伝子変異又は自然に発生する変異事象は、異種ＤＮＡを生じさせない。
「コード配列」又は特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に配置されると、インビトロ又はインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。
「核酸」配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。核酸には、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、及び２，６－ジアミノプリンを含むが、これらに限定されないＤＮＡ及びＲＮＡの塩基類似体が含まれる。
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、集合的に、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指し、これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写、及び翻訳されることができる限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために、その通常の意味で本明細書において使用され、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’－方向）コーディング配列の転写を開始させることができる遺伝子に由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、及び「構成的プロモーター」が含まれ得る。一実施形態では、プロモーターは、筋特異的プロモーターであり、これには、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファアクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ｍｅｆ）結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、プロモーターは、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、又はＭＨＣＫ７プロモーターである。
「動作可能にリンクされた」という用語は、そのように記述された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次にコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳されるとき、プロモーターは、細胞内のコード配列の「転写を指示」する。
「発現カセット」又は「発現構築物」は、目的の配列又は遺伝子の発現を指示することができる集合体を指す。発現カセットは、上記のように、目的の配列又は遺伝子に（転写を指示するように）作動可能に連結されるプロモーターなどの制御要素を含み、ポリアデニル化配列も含むことが多い。本発明のある特定の実施形態内で、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル、少なくとも１つのマルチクローニング部位、及び「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
ヌクレオチド配列を指す場合の「単離された」とは、示された分子が、他のヌクレオチド配列、クロマチン材料などの他の生物学的高分子の実質的な不在下に存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、しかしながら、分子は、組成物の基本的な特性に悪影響を及ぼさないいくつかの追加の塩基又は部分を含み得る。
特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３’」、又は「５’に位置すると記載されている場合など、本出願全体にわたって特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的で、それは、当技術分野で慣習的であると称されるＤＮＡ分子の「センス」又は「コーディング」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。
核酸配列又はアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「配列同一性の割合」、又は「同一の割合」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長であり得るか、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドなど、より小さい断片間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性パーセントは、当該技術分野で知られている技法によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、及びＢＬＡＳＴなどの容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。一実施形態では、ＢＬＡＳＴがアラインメントツールとして使用される場合、次のデフォルトパラメータ、遺伝暗号＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリクッス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；並べ替え＝高得点；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋スイスプロテイン＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを指し、これには、ヒト並びにチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜、イヌ及びネコなどの家畜哺乳動物、マウス、ラット、及びモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、出生～２歳、１～１０歳の範囲、又は４～１５歳の範囲、又は１０～１９歳の範囲、又は２０～４０歳、又は１５～２９歳又は２５～５５歳の範囲、又は４０～６０歳の範囲、又は５０歳以上又は６０歳以上又は６５歳以上又は７０歳以上のヒトである。
ＡＡＶ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７で提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９で提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９で提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６で提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００ １８６２で提供されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９及び同第７，７９０，４４９もまた参照）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレント及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつか又は全ては、プロモーター、目的のＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡと置換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
複数の研究により、筋肉における長期（１．５年を超える）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。また、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）、及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。更に、筋肉は高度に血管形成されているため、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）、及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入が、筋肉内注射に続いて体循環において導入遺伝子産物の出現をもたらした。更に、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌のための必要な細胞因子を保有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬の安定した発現が可能であることを示した。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本開示の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導できる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。筋肉特異的な発現を促進するために、ＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、及びＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、並びに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
本開示の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態では、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐのＤＮＡが存在しない。本開示の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。
例示的な実施形態では、本開示の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクタープラスミドｓｃＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｐＮＬＲｅｐ２－Ｃａｐｒｈ７４、及びｐＨｅｌｐを使用した三重トランスフェクション法（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，２２２４－２２３２（１９９８）によって産生され、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接されるｈＳＣＧＡ遺伝子発現カセットを含有する。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化されるのはこの配列である。プラスミドは、ｈＳＣＧＡ配列、並びに遺伝子発現を駆動するＭＨＣＫ７エンハンサー及び筋肉特異的プロモーターのコアプロモーター要素を含有する。発現カセットには、高レベルの遺伝子発現を促進するＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）も含まれており、効率的な転写終結のためにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが使用される。
ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４は、血清型ｒｈ７４由来の４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質と３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。
ｐＨＥＬＰアデノウイルスヘルパープラスミドは１１，６３５ｂｐであり、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓから入手した。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１機能は２９３細胞によって提供される）。このプラスミドに存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約４０％に過ぎず、アデノウイルスの末端反復配列などの複製に重要なシスエレメントを含んでいない。したがって、このような生産システムから感染性アデノウイルスが生成されることは予想されない。
ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によってなど、当該技術分野で標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
別の実施形態では、本開示は、本開示のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本開示の組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む。本組成物は、希釈剤及びアジュバントなどの他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに対して無毒であり、好ましくは、採用された投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝液及びプルロニック（登録商標）などの界面活性剤を含む。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、及び細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。カプセル化されたベクターゲノム力価を決定する１つの例示的な方法は、（Ｐｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５－８６９，２０１７）に記載される方法などの定量的ＰＣＲを使用する。特に記載されない限り、本明細書に記載の投与量は、超らせんＤＮＡ標準によって決定される用量に対応する。
インビボ又はインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本開示によって企図される。インビボ方法は、有効用量又は有効複数回用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（人間を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）し、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは予防し、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。本開示の方法による予防又は治療のために企図される疾患の一例は、筋ジストロフィー、例えば、肢帯型筋ジストロフィー又はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次的治療の両方を含む。新規の療法との併用など、本開示の方法と標準の医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との併用が特に企図される。
有効用量の組成物、併用療法又は製剤の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される感染症及び／又は疾患状態、並びにｈＳＣＧＡタンパク質を発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。
本開示は、本開示のｒＡＡＶ、製剤、及び組成物の有効用量の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管を通した吸収などの経腸投与、及び注射、注入、又は移植を通した非経口投与が含まれる。
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉への注射及び血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の様式で避けられるべきであるが）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射を目的として、ゴマ油若しくは落花生油などのアジュバント溶液、又は水性プロピレングリコール溶液、及び滅菌水溶液を用いることができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
注射用途に好適な薬学的な担体、希釈剤、又は賦形剤には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射器使用可能性が存在する程度に流動性でなければならない。形態は、製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系又は異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。
対象への形質導入及び形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／又はＰＣＲなどの従来の技術を使用して、又は選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射による、又は例えばカテーテルを使用して平滑筋及び心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。
本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ｈＳＣＧＡタンパク質の持続的発現をもたらす。よって、本開示は、ｈＳＣＧＡタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、本開示の１つ以上のｒＡＡＶで組織（筋肉などの組織、肝臓及び脳などの臓器、並びに唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）を形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本開示の一実施形態は、これらに限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７））、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘発性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、並びに他の制御要素を含む、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供する。
筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本開示は、形質導入筋原線維由来のｈＳＣＧＡの持続発現を企図する。
よって、本開示は、ｈＳＣＧＡをコードするｒＡＡＶの有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔を置いて投与される用量）を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、処置目標、個体、及び標的とされる細胞型に応じて変化し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。ｒＡＡＶの力価は、超らせんプラスミド定量標準又は線状化プラスミド定量標準によって決定されてもよい。
インビボ又はインビトロで、標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量又は有効な複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療すべき障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは軽減）する用量であり、障害／疾患の状態への進行を緩徐化若しくは予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的若しくは完全な）をもたらす用量であり、並びに／又は生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防又は治療のために企図される疾患の例は、筋ジストロフィー、例えば肢帯型筋ジストロフィーである。よって、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで標的細胞を形質導入する方法が、提供される。
併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療又は連続治療を含む。本発明の方法と標準的な医学的治療（例えば、ステロイド、コルチコステロイド、及び／又は限定されないがプレドニゾン、プレドニゾロン、及びデフラザコートのうちの１つ以上を含むグルココルチコイド）との組み合わせは、新規療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。この観点で、この組み合わせは、本発明の方法のｒＡＡＶを対象に投与する前に、ｒＡＡＶを対象に投与すると同時に、又はｒＡＡＶを対象に投与した後に、１つ以上のステロイド、コルチコステロイド、及び／又は限定されないがプレドニゾン、プレドニゾロン、及びデフラザコートのうちの１つ以上を含むグルココルチコイドを対象に投与することを含む。
本発明によって企図される併用療法の関連する実施形態では、グルココルチコイドとしては、限定されないが、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、又はトリアムシノロンが挙げられる。
抗原特異的Ｔ細胞応答は、ｒＡＡＶベクターを投与された対象で起こり得ることが認識されている。これは、遺伝子移入後２～４週間で予想される応答である。このような抗原特異的Ｔ細胞応答に対する１つの考えられる結果は、形質導入された細胞のクリアランス及び導入遺伝子発現の喪失である。ｒＡＡＶベースの治療に対する宿主の免疫応答を弱めるために、治療前、例えば治療手順の２４時間前に、対象は、およそ１ｍｇ／ｋｇ／日の経口による予防的プレゾニゾン又は同等のグルココルチコイドから始め、最大用量６０ｍｇ／日で投与することができる。必要に応じて、同等のグルココルチコイドをおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で静脈内投与することも可能である。治療は、およそ１カ月続く。プレゾニゾン又は同等のグルココルチコイドの量を漸減させるプロトコルを、個々の対象の遺伝子移入に対する免疫応答に基づいて実施し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、またＧＧＴによる肝機能モニタリングによって評価することができる。
提供されているのは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であり、ｒＡＡＶは、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で使用して投与される。例えば、提供される方法のうちのいずれかにおいて、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内経路を含む全身経路によって投与される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。一実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。
加えて、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．５×１０１３ｖｇ～約３．５×１０１６ｖｇ、又は約３×１０１３ｖｇ～約１．０×１０１６ｖｇ、又は約１．５×１０１３ｖｇ～約２×１０１５ｖｇ、又は約１．５×１０１３ｖｇ～約１×１０１５ｖｇである。加えて、方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される。一実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。一実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型である。本開示における用量は、ｖｇ又はｖｇ／ｋｇのいずれかで表され、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による滴定認定法に基づく。ｑＰＣＲベースの滴定法は、当技術分野で知られている。
加えて、提供されているのは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少し、かつ／又は自発運動及び比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象の筋肉組織における線維直径サイズは、ｒＡＡＶの投与前の線維直径の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、又は対象の筋肉組織における中心核形成は、ｒＡＡＶの投与前の中心核形成と比較して、ｒＡＡＶの投与後に軽減する。筋肉組織には、上腕三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、腓腹筋、上腕二頭筋、僧帽筋、臀筋、大腰筋、三角筋、大腿四頭筋、及び横隔膜が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、筋肉組織には、前脛骨筋、腓腹筋、臀筋、大腰筋、及び上腕三頭筋が含まれる。アルファ－サルコグリカンの発現は、当業者に知られている方法によって決定される。一実施形態では、発現は、ウエスタンブロット、筋生検における免疫化学によって、及び／又はゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって決定される。
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法を含み、運動機能は、ｒＡＡＶの投与前の当該対象の運動機能と比較して、当該対象において明らかに改善される。
配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を患者に投与することを含む、アルファ－サルコグリカンの増加を必要とする患者においてそれを行う方法が、提供される。
提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用、及び組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳であり、両方の対立遺伝子において確認されたアルファ－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）変異を有し、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、かつ／又は４０％超若しくは通常の１００メートルの歩行試験を有した。提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用及び組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、１～２１歳の範囲の対象である。いくつかの実施形態では、対象は、１～１０歳、又は２～１２歳、４～１５歳、又は１０～１９歳である。一実施形態では、対象は、青年対象であり、例えば、１２～２１歳の範囲の対象である。加えて、対象は、一実施形態では、１５～２９歳又は１８～３９歳の年齢の範囲の対象などの若年成人対象である。いくつかの実施形態では、対象は、中年成人又は高齢対象であり、その結果、中年成人は、２５～５５歳の範囲であってもよく、それ以上の年齢の成人対象は、５０歳を超える範囲であってもよく、高齢対象は、６５歳を超える範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、注射、注入、又は移植によって投与される。例えば、ｒＡＡＶは、およそ１～２時間にわたる注入によって投与される。加えて、ｒＡＡＶは、末梢四肢静脈を介した静脈内経路によって投与される。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法では、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド配列を含むタンパク質をコードする。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２に示されるポリペプチド配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。加えて更に、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかは、配列番号７及び／又は配列番号９のｔＭＣＫプロモーター配列などのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号８の５’逆位末端反復配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４及び／又は配列番号１１の３’逆位末端反復配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５及び／又は配列番号１０のポリＡ配列を含む。
ＡＡＶ投薬量は、ＬＩＳＡ、逆転写酵素活性の評価、ＦＡＣＳ、形質導入アッセイノーザンブロッティング（例えば、半定量的ノーザン）、ドットブロット分析、又はＰＣＲ（例、ｑＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない複数の方法によって決定することができる。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）でＡＡＶベクターゲノムを測定することにより、ＡＡＶの用量を決定できることはよく知られている。そのようなｑＰＣＲ法は、従来の形質導入アッセイからの矛盾又は恣意的な結果を克服する。ＰＣＲ投薬量決定の一実施形態では、プラスミドＤＮＡが較正標準として使用される。プラスミドの形態は、ｑＰＣＲ法による投薬量の結果に影響を与える可能性がある。一実施形態では、環状又は超らせんＤＮＡ又はプラスミドが、定量標準として使用される。別の実施形態では、線状化されたＤＮＡ又はプラスミドが、定量標準として使用される。
「超らせんＤＮＡ」又は「超らせんプラスミド」という用語は、遊離端を含まないＤＮＡ又はプラスミドを指す。「線状化されたＤＮＡ」又は「線状化されたプラスミド」という用語は、互いに連結されていない遊離の５’末端及び遊離の３’末端を含むＤＮＡ又はプラスミドを指す。一実施形態では、線状化されたＤＮＡ又はプラスミドは、環状ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）の制限消化によってか、又はｄｂＤＮＡの制限消化によって得られる。別の実施形態では、制限消化は、少なくとも１つの平滑末端を生成する酵素を使用して行われる。
例示的な実施形態では、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ７．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含み、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ヒト対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。一実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で、約１～２時間にわたる静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ７．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列含む。別の実施形態では、用量は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇである。
本開示はまた、対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、配列番号１と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は９９％同一のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を対象に投与することを含む。
本開示はまた、対象の筋機能を改善する方法を更に提供し、この方法は、配列番号１と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む構築物を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、対象は、サルコグリカンタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異、又は筋ジストロフィーに苦しんでいる。いくつかの態様では、対象は、アルファ－サルコグリカンタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に苦しんでいる。
提供された方法のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。
加えて、提供された方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後に生検された筋肉におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学でアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
提供された方法のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。例えば、アルファ－サルコグリカンタンパク質のレベルのレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後に生検された筋肉におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出されるとき、少なくとも３３％増加するか、又は、アルファ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検における免疫組織化学及び／又はゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノム数を検出することによって測定される。
本明細書に提供される方法のうちのいずれかにおいて、対象における血清ＣＫレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に減少する。
本明細書に提供される方法のうちのいずれかにおいて、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。例えば、アルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検でのウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。例えば、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。
本明細書に提供された方法のうちのいずれかにおいて、対象におけるアルファ－サルコグリカンのレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前のアルファ－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。例えば、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検での免疫組織化学又はウエスタンブロットによりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
別の実施形態は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を患者に投与することを含む、患者の細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を提供する。提供された、患者の細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法のうちのいずれかにおいて、患者の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学でアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。一実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子は、１つの核当たり１つを超えるｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することによって、患者において測定される。別の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。
配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、血清ＣＫレベルの減少を必要とする患者においてそれを行う方法も、提供される。
配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、患者の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる方法が、提供される。これらの方法のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検でのウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
別の実施形態は、配列番号１のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。これらの方法のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検でのウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
治療有効量のｒＡＡＶベクターは、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。別の実施形態では、用量は、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含むように企図される。
投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。ｒＡＡＶの力価は、超らせんＤＮＡ若しくはプラスミド定量標準又は線状化されたＤＮＡ若しくはプラスミド定量標準によって決定されてもよい。ＡＡＶベクターの力価又は投薬量は、定量標準としてのプラスミド又はＤＮＡの物理的形態に基づいて変化する可能性がある。例えば、力価又は投薬量の値は、超らせん標準ｑＰＣＲ力価測定法又は線状化された標準ｑＰＣＲ力価測定法に基づいて変化し得る。一実施形態では、本開示における投薬量は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づく。別の実施形態では、本開示における投薬量は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づく。したがって、一実施形態では、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。別の実施形態では、用量は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、定量標準として線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。例えば、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量である。
一実施形態では、定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づく５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づく１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量と同等である。別の実施形態では、超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づく２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量は、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づく７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇと同等である。したがって、別の実施形態では、定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づく約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇである。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される感染症及び／又は疾患状態、並びにアルファ－サルコグリカンを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。
本発明は、本発明のｒＡＡＶ及び組成物の有効用量の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与及び注射、注入、又は移植による非経口投与が含まれる。
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／又は肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきであるが）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。
ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は９ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物も含む。
例えば、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ及び５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量である。ＡＡＶベクターの力価又は投薬量は、定量標準としてのプラスミドＤＮＡの物理的形態に基づいて変化する可能性がある。例えば、力価又は投薬量の値は、超らせん標準ｑＰＣＲ力価測定法又は線状標準ｑＰＣＲ力価測定法に基づいて変化し得る。一実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量、又は定量標準としての線状化プラスミドに基づいて１．８５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量である。別の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて２ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量、又は定量標準としての線状化プラスミドに基づいて７．４１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量である。別の実施形態では、治療有効量のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡは、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、又は９ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲の用量である。本発明はまた、これらの用量のｒＡＡＶベクターを含む組成物も含む。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される感染症及び／又は疾患状態、並びにβ－サルコグリカンを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。
本発明は、本発明のｒＡＡＶ及び組成物の有効用量の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与及び注射、注入、又は移植による非経口投与が含まれる。
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／又は肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきであるが）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。
医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。したがって、別の態様では、本出願は、ＡＡＶｒｈ７４由来のカプシドを含むｒＡＡＶと、緩衝剤と、イオン強度剤と、界面活性剤と、を含む製剤に関する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて、約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡベクターである。一実施形態では、組成物又は製剤中のｒＡＡＶの濃度は、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ～２×１０１４ｖｇ／ｍｌである。別の実施形態では、濃度は、定量標準としての超らせんプラスミドに基づいて、２×１０１３ｖｇ／ｍｌ、４×１０１３ｖｇ／ｍｌ、又は５×１０１３ｖｇ／ｍｌである。一実施形態では、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、及びＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む。別の実施形態では、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０のトリスを含む。一実施形態では、緩衝剤は、約２０ｍＭでｐＨ８．０のトリスを含む。一実施形態では、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、及び酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む。一実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。一実施形態では、界面活性剤は、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、及びカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、及びポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、界面活性剤は、約０．００００１％～約１％の濃度でポロキサマーを含む。別の実施形態では、界面活性剤は、約０．００１％の濃度でポロキサマー１８８を含む。筋肉内注射を目的として、ゴマ油若しくは落花生油などのアジュバント溶液、又は水性プロピレングリコール溶液、及び滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
したがって、本明細書では、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくはある間隔で与えられる用量）の、アルファ－サルコグリカンをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする哺乳動物の対象に投与する方法も記載される。
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本出願が、本明細書中のいかなる定義も含み、優先される。
本発明は、以下の実施例において更に説明され、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを使用した前臨床試験は、国際特許公開第２０１３／０７８３１６号、並びに米国特許第９，４３４，９２８号及び同第１０，１０５，４５３号に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの構築
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ導入遺伝子カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＤＮＡプラスミドｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ａＳＧ－ｎｅｏを使用して、コドン最適化ヒトアルファ－ＳＧ ｃＤＮＡ配列（ヒトｃＤＮＡ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０８８９５）を駆動するｔＭＣＫ発現カセットを自己相補的ベクターバックボーンｐＨｐａ７に挿入することによって作製した。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスＤＮＡの複製とｒＡＡＶベクターゲノムのパッケージングの両方に必要なＡＡＶ２の逆位末端反復である。逆位末端反復（ＩＴＲ）のうちの１つは、このＩＴＲからの複製を制限するための末端分解部位（ＴＲＳ）の標的欠失を有し、自己相補的ベクターパッケージング用の二量体複製型の生成を促進する。ＡＡＶｒｈ７４ウイルスは、マウス、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、及びヒトにおいて、血管関門を越えて筋肉に形質導入するのに安全かつ非常に効率的であることが証明されている。
組換えＡＡＶ、（ｓｃ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡは、トリプルトランスフェクションによって作製した。ｑＰＣＲベースの滴定法を使用して、Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｆａｓｔ Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してカプセル化されたｖｇ力価を決定した。構築物は、高レベルの発現を促進するためのキメライントロンを含む。キメライントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子の最初のイントロンと分岐点からの５’ドナー部位、及び免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダーと本体との間にあるイントロンからの３’スプライスアクセプター部位からなる。ｒＡＡＶは、合成ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルも含み、効率的な転写終結に使用される。発現カセットの概略図を以下の図１に示す。ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に隣接し、ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにキャプシド形成されたヒトアルファ－サクログリカン（アルファ－ＳＧ）遺伝子を使用して産生した。構築物は、ｔＭＣＫ前初期プロモーター／エンハンサー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２１３９０）を含有し、高レベルの発現のためにβ－グロビンイントロンを使用する。
一本鎖ＡＡＶベクター（ｓｓＡＡＶ）は、核に入ると、複製及び転写の準備が整う前に、第２の鎖の細胞媒介性合成を必要とする。例示的な自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）は、図１に示される構造及び図２に提供されるアノテーションが付与された（ａｎｎｏｔｅｄ）ヌクレオチド配列を有し、以下の表に記載される。ｓｃＡＡＶがｓｓＡＡＶにおいて必要とされる第２鎖の細胞合成の律速段階を迂回するので、このｓｃＡＡＶは、遺伝子療法においてｓｓＡＡＶよりも優れている。
Figure 2023081369000001

Claims (65)

  1. 配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド配列。
  2. 前記ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列又は配列番号１を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
  3. ポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、前記ポリヌクレオチド配列が、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を各々コードする、２つの相補的ヌクレオチド配列と、ｉｉ）２つの相補的ポリアデニル化配列と、を含む、組換えＡＡＶ。
  4. 前記２つの相補的ヌクレオチド配列の各々が、筋特異的制御要素に作動可能に連結され、前記２つの筋特異的制御要素が、互いに相補的である、請求項３に記載の組換えＡＡＶ。
  5. 前記筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子結合要素、ステロイド誘発性要素、又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、請求項４に記載の組換えＡＡＶ。
  6. 前記筋特異的制御要素が、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）である、請求項５に記載の組換えＡＡＶ。
  7. ２つの相補的キメライントロンを更に含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
  8. ３つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含み、１つのＩＴＲが、前記２つの相補的な筋特異的制御要素によって隣接される、請求項３～７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
  9. 配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
  10. 前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３ ＡＡＶ ｒｈ．７４、又は合成ＡＡＶ血清型である、請求項３～９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
  11. 請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶを含む、組成物。
  12. 筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記対象に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  13. 筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力及び／又は筋量を増加させる方法であって、前記対象に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  14. 筋ジストロフィーに罹患している対象において線維症を軽減させる方法であって、前記対象に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  15. 筋ジストロフィーに罹患している対象において収縮誘発性損傷を軽減させる方法であって、前記対象に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  16. 対象においてアルファ－サルコグリカン異常症を治療する方法であって、前記対象に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  17. 対象の筋肉組織においてアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる及び／又はＣＫレベルを減少させる方法であって、前記対象に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  18. 前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又は陽性アルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶ投与の前及び後の筋生検において、ウエスタンブロットで、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項１７に記載の方法。
  19. アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又はアルファ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、免疫組織化学によって、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記組換えＡＡＶ又は前記組成物が、筋肉内注射又は静脈内注射によって投与される、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記組換えＡＡＶ又は前記組成物が、全身投与される、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記組換えＡＡＶ又は前記組成物が、注射、注入、又は移植によって非経口投与される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記組換えＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡ又は線状プラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  29. 哺乳動物対象における筋ジストロフィーを治療するための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を含む、組成物。
  30. 筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象における筋力及び／又は筋量を増加させるための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を含む、組成物。
  31. 筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象における線維症を軽減させるための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を含む、組成物。
  32. 筋ジストロフィーに罹患している対象における収縮誘発性損傷を軽減させるための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を含む、組成物。
  33. 治療を必要とする哺乳動物対象におけるβ－サルコグリカン異常症を治療するための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を含む、組成物。
  34. 対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる及び／又はＣＫレベルを減少させるための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物を含む、組成物。
  35. 前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又は陽性アルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、ウエスタンブロットで、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項３４に記載の組成物。
  36. アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又はアルファ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、免疫組織化学によって、アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項３４に記載の組成物。
  37. 前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 全身投与用に製剤化される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記全身投与が、注射、注入、又は移植による非経口投与である、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記組換えＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡ又は線状プラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物の、使用。
  47. 筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象において筋力及び／又は筋量を増加させるための医薬の調製のための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター又は請求項１１に記載の組成物の、使用。
  48. 筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物対象において線維症を軽減させるための医薬の調製のための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター又は請求項１１に記載の組成物の、使用。
  49. 筋ジストロフィーに罹患している対象において収縮誘発性損傷を軽減させるための医薬の調製のための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター又は請求項１１に記載の組成物の、使用。
  50. β－サルコグリカン異常症の治療を必要とする哺乳動物対象においてβ－サルコグリカン異常症を治療するための医薬の調製のための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物の、使用。
  51. 対象の筋肉組織においてアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる及び／又はＣＫレベルを減少させるための医薬の調製のための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ又は請求項１１に記載の組成物の、使用。
  52. 前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又は陽性アルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、ウエスタンブロットで、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項５１に記載の使用。
  53. アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現又はアルファ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与の前及び後の筋生検において、免疫組織化学によって、前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項５１に記載の使用。
  54. 前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の使用。
  55. 前記医薬が、筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の使用。
  56. 前記医薬が、全身投与用に製剤化される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の使用。
  57. 前記全身投与が、注射、注入、又は移植による非経口投与である、請求項５６に記載の使用。
  58. 前記組換えＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又は線状プラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の使用。
  59. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の使用。
  60. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の使用。
  61. 前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の使用。
  62. 前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての線状化されたＤＮＡ又はプラスミドに基づいて、約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
  63. ポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記ポリヌクレオチド配列が、５’から３’方向に、
    （１）ポリアデニル化配列の相補的配列と、
    （２）目的の遺伝子の相補的配列と、
    （３）イントロンの相補的配列と、
    （４）プロモーターの相補的配列と、
    （５）５’ＩＴＲ配列と、
    （６）前記プロモーターと、
    （７）前記イントロンと、
    （８）前記目的の遺伝子と、
    （９）前記ポリアデニル化配列と、を含み、
    前記ポリヌクレオチド配列が、２つの３’ＩＴＲ配列によって隣接され、前記２つの３’ＩＴＲ配列が、互いに相補的である、組換えＡＡＶベクター。
  64. 前記目的の遺伝子が、ヒトサルコグリカン－β（ｈＳＣＧＢ）、ヒトサルコグリカンγ（ｈＳＣＧＧ）、ヒトジスフェルリン、ヒトＡＮＯ５、及びカルパイン－３（Ｃａｐ３）遺伝子を含む、請求項６３に記載のｒＡＡＶベクター。
  65. 前記プロモーターが、筋特異的制御要素であり、前記筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）要素、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、Ｃ５－１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子結合要素、又はステロイド誘発性要素、又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含む、請求項６４に記載のｒＡＡＶベクター。
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