JP2022544627A - アルファ-サルコグリカンのアデノ随伴ウイルスベクター送達、および筋ジストロフィーの治療 - Google Patents
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- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Abstract
Description
本出願は、2019年8月21日に出願された米国仮出願第62/889,749号、2020年4月24日に提出された米国仮出願第No.63/014,934号、および2020年5月11日に提出された米国特許出願第63/022,843号の優先権を主張し、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表(2020年8月17日に作成された、ファイル名:54652_SeqListing.txt、18,768バイト、ASCIIテキストファイル)を含有し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「培養物」への言及は、1つ以上の培養物および当業者に周知されるその同等物への言及を含む、などである。「組換えAAV」への言及は、2つ以上のrAAVビリオンの混合物を含む、などである。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明の組換えAAVゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する1つ以上のAAV ITRを含む。rAAVゲノム内のAAV DNAは、組換えウイルスが由来し得る任意のAAV血清型からであり得、AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、およびAAV rh.74が挙げられるが、これらに限定されない。偽型rAAVの生成は、例えば、WO01/83692に開示される。他のタイプのrAAV変異体、例えば、カプシド変異を有するrAAVも企図される。
材料および方法
動物モデル
すべての手順は、Research Institute at Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。ノックアウト(sgca-/-)マウスは、Research Institute at Nationwide Children’s HospitalのAnimal Resources Coreにおいて標準条件下でホモ接合型動物として繁殖させ、維持した。マウスを、12:12時間の暗所:明所サイクルで、Teklad Global Rodent Diet(3.8%食物線維、18.8%タンパク質、5%脂肪飼料)で維持した。すべての動物を、標準的なマウスケージに入れ、自由に摂食摂水させた。
DNAジェノタイピングを使用して、sgca-/-マウスを特定した。テールクリッピングからのDNAを単離し、OneTaq DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、Ipswich, MA)を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって分析した。一連のプライマーをPCR分析で使用して、α-SGノックアウト状態を決定した。以下のプライマーおよび条件を使用した:Intron1(CAGGGCTGGGAGCTGGGTTCTG;配列番号9)、変異体プライマー-イントロン3(CCCAGGGCCTTGATGCCT;配列番号10)、およびNEOTR(GCTATCAGGACATAGCGTTGGCTA;配列番号11)。以下の条件下で、ゲノムDNAに対して30サイクルの反応を行った:94℃で5分、94℃で1分、64℃で1分、72℃で2.5分、72℃で7分。
scAAVrh74.tMCK.hSGCA導入遺伝子カセットは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターDNAプラスミドpAAV.tMCK.aSG-neoを使用して、コドン最適化ヒトα-SGc DNA配列(ヒトcDNA、Genbankアクセッション番号U08895)を駆動するtMCK発現カセットを自己相補的ベクターバックボーンpHpa7に挿入することによって作製した。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスDNAの複製とrAAVベクターゲノムのパッケージングの両方に必要なAAV2の逆位末端反復である。逆位末端反復(ITR)のうちの1つは、このITRからの複製を制限するための末端分解部位(TRS)の標的欠失を有し、自己相補的ベクターパッケージング用の二量体複製型の生成を促進する。AAVrh74ウイルスは、マウス、非ヒト霊長類(NHP)、およびヒトにおいて、血管関門を越えて筋肉に形質導入するのに安全かつ非常に効率的であることが証明されている。
組換えAAV、(sc)rAAVrh74.tMCK.hSGCAは、トリプルトランスフェクションによって作製した。qPCRベースの滴定法を使用して、Prism 7500 Fast Taqman検出器システム(PE Applied Biosystems)を利用してカプセル化されたvg力価を決定した。構築物は、高レベルの発現を促進するためのキメライントロンを含む。キメライントロンは、ヒトβ-グロビン遺伝子の最初のイントロンと分岐点からの5’ドナー部位、および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダーと本体との間にあるイントロンからの3’スプライスアクセプター部位から成る。rAAVは、合成SV40ポリアデニル化シグナルも含み、効率的な転写終結に使用される。発現カセットの概略図を以下の図1に示す。ベクターは、AAV2 ITR配列に隣接し、AAVrh74ビリオンにキャプシド形成されたヒトアルファ-サクログリカン(α-SG)遺伝子を使用して産生した。構築物は、tMCK前初期プロモーター/エンハンサー(GenBankアクセッション番号M21390)を含有し、高レベルの発現のためにβ-グロビンイントロンを使用する。
全身送達は、sgca-/-マウスの尾静脈へのベクターの注射によって達成した。マウスに、30ゲージの超微細インスリン注射器を使用して200~250μLの容量の乳酸リンガー溶液で希釈したscAAVrh74.tMCK.hSGCAの1×1012vg、3×1012vg、または6×1012vgの総投与量(13~20gの範囲のマウス、それぞれ20gのマウスに基づいて、定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づく投薬量、5×1013vg/kg、1×1014vg/kg、および2×1014vg/kg)を注射した。すべての処置されたマウスは、4~5週齢で注射し、注射の12週後に安楽死させた。別の実施形態では、用量は、定量標準としての線形化されたDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.85×1013vg/kgまたは7.41×1013vg/kgである。
クレアチンキナーゼのレベルは、野生型C57BL/6マウス(n=6)、ビヒクル(乳酸リンガー溶液)で処置されたsgca-/-マウス(n=6)、およびscAAVrh74.tMCK.hSGCAで処置されたsgca-/-マウス(n=1回の用量当たり6)の血清において、クレアチンキナーゼSLアッセイおよび対応する製造業者のプロトコル(Sekisui Diagnostics、Charlottetown,PE,Canada)(カタログ番号326-10)を使用して測定した。簡単に説明すると、25μLの血清を1mLの作業試薬と混合し、キュベットに加えた。分光光度計に速度論的アッセイを設定して、340nmでの吸光度を30秒ごとに180秒間測定した。クレアチンキナーゼレベルを吸光度の読み取り値および以下にリストされる式を使用して計算した。
U/L=[ΔAbs./分)*1.025*1000]/[1*6.22*0.025]=(ΔAbs./分)*6592
マウスを安楽死させ、横隔膜(DIA)を肋骨アタッチメントと中央腱を無傷で切開し、K-Hバッファーに入れた。DIAの2~4mm幅の切片を単離した。DIA条片を腱中心で編組外科用絹糸(6/0、Surgical Specialties、Reading,PA)を用いてしっかり結び、条片の遠位端に取り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、37℃で維持した酸素化K-H溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアルモード力変換器サーボモーター(305C、Aurora Scientific,Aurora,Ontario,Canada)との間で直接結んだ。2つの白金板電極を、筋肉の長さに隣接するように器官浴に位置付けた。筋肉を痙攣収縮の測定のために最適な長さに伸長させ、その後、10分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定した時点で、筋肉を1gの最適な長さに設定し、30秒毎に3回の1Hz攣縮、続いて、1分毎に3回の150Hz攣縮からなるウォームアップに供する。3分間の休止期間後、DIAを、各刺激間に2分間の休止期間を設けて、20、50、80、120、150、180Hzで各々250ミリ秒間刺激して、最大強縮力を決定した。筋肉の長さおよび重量を測定した。力を、筋肉の重量および長さに対して正規化した。
TA評価手順は、Hakim et al.,Methods Mol Biol;709:75-89(2011)にリストされるプロトコルに従った。ケタミン/キシラジン混合物(それぞれ100mg/kgおよび10mg/kg)を使用して腹腔内を介してマウスを麻酔した。解剖スコープの下で、後肢の皮膚を取り除き、TA筋肉および膝蓋骨を露出させた。膝蓋腱の周りに4-0の縫合糸で二重正方形を結んだ。次に、TA遠位腱を切開し、二重正方形を腱の周りに4-0縫合糸で可能な限り筋肉に近づけて結び、次に腱を切断した。露出した筋肉は常に生理食塩水で湿らせた。次いで、マウスを熱制御プラットフォームに移し、37℃に維持した。膝は膝蓋腱縫合で金属ピンに固定し、遠位TA腱縫合で力変換器(Aurora Scientific、Aurora,Canada)のレベルアームに固定した。坐骨神経を刺激するために、電極を坐骨神経の近くに配置した。筋肉が安定したら、安静時の張力を、痙攣収縮が最大になる長さ(最適な長さ)に設定した。3分間の休止期間の後、TAを、各刺激間に1分間の休止期間を設けて、50、100、150、および200Hzで刺激した。5分間の休息の後、筋肉を、10%の伸長再延長手順により1分間隔で生じる、一連の10回の等尺性収縮に供した。遠心性収縮後、マウスを安楽死させ、TA筋肉を切開し、秤量し、分析のために凍結させた。
TA、腓腹筋(GAS)、大腿四頭筋(QD)、大腰筋(PSOAS)、臀筋(GLUT)、上腕三頭筋(TRI)、DIA、および心臓(HRT)の筋肉の凍結切片(厚さ12μm)をhSGCA導入遺伝子のために免疫蛍光染色に供した。切片を、1:100の希釈でウサギモノクローナルα-SG一次抗体(Abcam、Cambridge,UK、カタログ番号ab189254)とインキュベートした。Zeiss(ドイツ)AxioCam MRC5カメラを使用して、筋肉切片の4つの異なる象限をカバーする4つのランダムな20倍画像を撮影した。対照と比較したα-SG染色に対する陽性線維の割合を各画像について決定し、各筋肉について平均した。陽性のα-SG線維発現は、ビヒクルで処置されたsgca-/-対照よりも少なくとも30%線維染色が明るいと定義された。
野生型C57BL/6マウス、ビヒクルで処置されたsgca-/-マウス、およびベクターを投与されたsgca-/-マウスからの試料を、各ウエスタンブロットに使用した。hSGCAブロットには、ウサギモノクローナルα-SG抗体(Abcam、カタログ番号ab189254)の1:10,000希釈液とマウスモノクローナルα-アクチニン抗体(Sigma-Aldrich、カタログ番号A7811)の1:5,000希釈液を使用した。ウサギモノクローナルマウスビンキュリン抗体(Invitrogen、カタログ番号70062)の1:1,000希釈液も使用した。抗マウス(Millipore、カタログ番号AP308P)および抗ウサギ(Life Technologies、カタログ番号656120)の二次西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体を使用して、化学発光免疫検出を強化した。ウエスタンブロットの定量化は、ImageQuantTL 1D 8.1.0(GE Healthcare Life Sciences)を使用したデンシトメトリーによって行った。
ヘマトキシリン&エオシン(H&E)染色は、16~17週齢の野生型C57BL/6マウス(n=6)、ビヒクルで処置されたsgca-/-マウス(n=6)、およびscAAVrh74.tMCK.hSGCAの16~17週齢の処置されたsgca-/-マウス(n=1回の用量当たり6)からの厚さ12μmの筋肉の凍結切片で分析のために行った。TA、GAS、QD、GLUT、PSOAS、およびTRI筋において、中心核を有する筋線維の割合を決定した。さらに、TA、GAS、QD、TRI、およびPSOAS筋において、筋線維直径を測定した。各動物の筋肉当たり4つのランダム20倍画像をZeiss AxioCam MRC5カメラで撮影した。National Institutes of Health’s ImageJソフトウェアを用いて中心核形成線維を定量化し、Zeiss Axiovision LE4ソフトウェアを用いて線維直径を測定した。
Taqman定量的PCRを行って、前述のように、標的および非標的の対側筋、ならびに非標的器官に存在するベクターゲノムコピーの数を定量化した。ベクター特異的プライマープローブセットを使用して、scAAVrh.74.tMCK.hSGCA導入遺伝子カセット内に位置するユニークなtMCKプロモーターのすぐ下流のイントロン領域の配列を増幅した。この研究では、以下のプライマーおよびプローブを使用した:tMCKイントロンフォワードプライマー5’-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3’、tMCKイントロンリバースプライマー5’-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3’、およびtMCKイントロンプローブ5’-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C- IABkFQ-3’(Integrated DNA Technologies)。コピー数は、ゲノムDNAの1マイクログラム当たりのベクターゲノムとして報告される。
筋肉組織におけるコラーゲン沈着のレベルを決定するために、ピクロシリウスレッド染色を行った。染色は、16~17週齢の野生型C57BL/6(n=6)、ビヒクルで処置されたsgca-/-(n=6)、およびscAAVrh74.tMCK.hSGCAの16~17週齢の処置されたsgca-/-マウス(n=1回の用量当たり6)のGLUT、PSOAS、TRI、およびDIA筋からの厚さ12μmの凍結切片で行った。各マウスの筋肉当たり4つの20倍画像を撮影し、ImageJソフトウェアプログラムを使用してコラーゲン沈着量を測定した。各筋肉の平均コラーゲンパーセントを、すべての群について計算した。
オープンフィールド活動チャンバを使用して、実験マウスの全体的な活動を決定した。野生型C57BL/6(n=6)および未処置のsgca-/-(n=6)対照群からの16~17週齢のマウスを、scAAVrh74.tMCK.hSGCAの16~17週齢の処置されたsgca-/-マウス(n=1回の用量当たり6)とともに分析に供した。すべてのマウスを、マウスが最も活動的である早朝からその夜の終わり間近のサイクルで、毎日同じ時間に試験した。全てのマウスを、毎回薄暗い光下で、かつ同じ飼育係により、隔離室で試験した。また、不安を軽減し、マウスの通常の行動、ひいてはアッセイの結果に影響を与える可能性があり得る可変的行動を最小限に抑えるために、個別に収容されていなかったマウスを試験した。マウスの行動を、Photobeam Activity System(San Diego Instruments、San Diego,CA)を使用して監視した。このシステムは、動物チャンバの前後かつ左右を横断する不可視赤外光線のグリッドを使用して、x-y-z平面内のマウスの位置および動きを監視する。活動を、5分間間隔の1時間サイクルで記録した。マウスを、データ取得開始の数日前に1時間セッションで活動試験室に順応させた。マウスを、4匹1組で、個別のチャンバ内で試験した。試験機器を使用毎に掃除して、結果を変化させ得るマウスの反動的な可変的行動を低減した。データをMicrosoft Excelワークシートに変換し、すべての計算をExcelプログラム内で行った。各マウスのx平面およびy平面における動きの個々の光線中断を加算して、合計歩行を表し、z平面における光線中断を加算して、1時間間隔内での垂直活動を得た。
血液学
全血は、血液化学のために心臓穿刺から回収した。血液を血清分離チューブに収集し、15,000rpmで10分間遠心分離した。血清を収集し、凍結し、化学試験のためにCharles River Laboratoriesに送った。血液学分析では、肝酵素およびブドウ糖化学を優先した。
剖検では、筋肉は、液体窒素で冷却されたメチルブタンで新鮮に凍結し、他のすべての臓器は、採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。処理後、組織をH&Eで染色し、スライドおよびすべての組織は、獣医病理学者による正式なレビューのためにGEMPath,Incに送った。
データは、平均±SEM(エラーバー)として表し、特に指定がない限り、GraphPad Prism 5(GraphPad Software、La Jolla, CA)を使用したテューキーの事後分析試験によって評価された群間の多重比較による一元配置分散分析を使用して分析した。
scAAVrh74.tMCK.hSGCAの全身送達の効率
小規模パイロット研究を開始して、1×1012vgの用量(20gのマウスに基づいて5×1013vg/kg、n=4)でsgca-/-マウスの外側尾静脈への静脈内注射による遺伝子送達の有効性を観察した。免疫蛍光分析は、遺伝子移入の4週間後に採取された筋肉で行った。7つの異なる肢骨格筋におけるhSGCA導入遺伝子発現の量:TA、GAS、GLUT、QD、PSOAS、およびTRI、およびDIA。α-SGを欠損したマウスは、蛍光抗体法で分析した場合、タンパク質が完全に欠如していることを示した(図2A;TA、GAS、TRI、およびDIAの代表的な画像)。1×1012vgの総用量の治療用量は、遺伝子送達の4週間後のDIAを含むすべての骨格筋にわたる平均54±23.81%のベクター伝達をもたらした。
最も安全で最も効果的な用量を決定するために、3つの別々の用量のベクターの送達を用量漸増試験で研究し、4週齢のsgca-/-マウスの外側尾静脈をscAAVrh74.tMCK.hSGCAの1×1012vg(5×1013vg/kg)の総用量、3×1012vgの総用量(1×1014vg/kg)、または6×1012vgの総用量(2×1014vg/kg)で処置した。免疫蛍光抗体法を使用して、TA、GAS、QD、GLUT、PSOAS、TRI、DIA、およびHRT筋におけるhSGCA導入遺伝子の発現を評価するために、遺伝子送達の12週間後にマウスを安楽死させた。最低用量の1×1012vgの総用量(5×1013vg/kg)で処置されたマウスにおける平均hSGCA発現は、DIAを含む骨格筋において70.07±3.71%の全体的な発現であった。3×1012vgの総用量(1×1014vg/kg)の中間用量で処置されたマウスの平均hSGCA発現は、すべての骨格筋において85.35±2.36%であった。最高用量の6×1012vgの総用量(2×1014vg/kg)で処置されたマウスの平均hSGCA発現は、すべての骨格筋において93.86±2.02%であった。明確にするために、用量は、定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて計算した。HRT筋におけるhSGCAの発現は、用量に依存せず75%のままであった。組織の代表的な画像を図2Aに示す。強力なhSGCA発現は、3つの用量すべてで遺伝子送達の有効性を示す。遺伝子送達は、前肢と後肢の両方の複数の筋肉を標的とし、3つの用量すべてでマウスにおける例外的なα-SG発現を示した。最も重要なことは、横隔膜の重要な筋肉も送達後にα-SG遺伝子の発現を示したことである。図2Bに示されるウエスタンブロットにより、処置されたマウスの3つすべての投薬コホートのすべての筋肉におけるタンパク質発現が確認される。マウスの心筋も処置後にα-SG発現を示した。
scAAVrh74.tMCK.hSGCA rAAVは、横隔膜および前脛骨筋の機能を改善し、運動能力を高める
近位筋の衰弱および機能喪失は、LGMD2Dの主要な症状であり、呼吸不全は、LGMD2Dの主な死因であるため、TAおよびDIAの機能および強度を改善することは、LGMD2Dを有する対照の生活の長さおよび質を高めるために不可欠である。DIAの条片およびTA筋肉の全体を使用して、hSGCAの発現と筋力との相関関係を確認した。図5Aおよび5Bに示されるように、野生型マウスと比較して、sgca-/-未処置のマウスのTAおよびDIA筋肉の比力において、比力および収縮誘発性損傷に対する抵抗性の欠損が認識された。
安全対策として、血液化学および血液学の研究を、ベクターを投与されたsgca-/-および野生型マウスで行った。すべての値は、マウスの通常の基準範囲内であった(図6)。さらに、scAAVrh74.tMCK.hSGCAを投与されたsgca-/-および野生型マウスからのH&Eで染色されたすべての筋肉および臓器の組織切片を正式なレビューのために獣医病理学者に送った。scAAVrh74.tMCK.hSGCAを投与されたsgca-/-および野生型マウスのうちのいずれからの試料にも有害作用は認められなかった。有効性に加えて、これらのデータは、scAAVrh74.tMCK.hSGCAの3つの用量すべての全身送達が、忍容性が高く、安全で、sgca-/-および野生型マウスに対して無毒であることを実証した。
高齢患者および持続性
rAAVrh74.tMCK.hSGCAを介する遺伝子置換は、LGMD-2Dおよび他の関連疾患の治療において肯定的な結果を示している。この研究は、rAAVrh74.tMCK.hSGCAが、より重大な影響を受けた古い筋肉を治療する能力を試験し、AAVウイルスベクターの長期間持続性を決定するように設計された。
配列番号1
SGCA cDNAコドン最適化配列:
ATGGCCGAGACACTGTTCTGGACTCCTCTGCTGGTGGTGCTGCTGGCTGGACTGGGAGATACCGAGGCTCAGCAGACCACACTGCACCCACTGGTGGGCCGGGTGTTCGTGCACACCCTGGACCATGAGACATTTCTGAGTCTGCCAGAACACGTGGCTGTGCCACCTGCTGTGCATATCACTTACCACGCCCATCTGCAGGGCCATCCTGATCTGCCACGGTGGCTGAGATACACCCAGAGATCACCCCACCATCCTGGATTCCTGTATGGAAGCGCTACCCCAGAGGACAGGGGACTGCAGGTGATCGAAGTGACAGCTTACAACCGCGACAGTTTTGATACTACCAGGCAGCGCCTGGTGCTGGAGATTGGGGATCCAGAAGGACCCCTGCTGCCTTATCAGGCCGAGTTCCTGGTGCGGTCACACGACGCTGAGGAAGTGCTGCCATCAACACCCGCCAGCAGATTTCTGTCCGCTCTGGGAGGACTGTGGGAGCCAGGAGAACTGCAGCTGCTGAATGTGACTAGCGCTCTGGATAGGGGAGGAAGGGTGCCACTGCCAATCGAGGGAAGGAAGGAAGGGGTGTACATTAAAGTGGGAAGCGCTTCCCCATTCTCCACCTGCCTGAAGATGGTGGCTTCTCCTGATAGTCACGCTAGGTGCGCTCAGGGACAGCCACCACTGCTGTCCTGTTATGACACACTGGCCCCCCATTTTCGCGTGGACTGGTGCAACGTGACTCTGGTGGATAAATCTGTGCCTGAGCCAGCTGACGAAGTGCCAACCCCTGGAGACGGAATCCTGGAGCACGATCCTTTCTTTTGTCCTCCAACAGAAGCCCCAGACAGGGATTTCCTGGTGGACGCTCTGGTGACTCTGCTGGTGCCTCTGCTGGTGGCTCTGCTGCTGACCCTGCTGCTGGCTTATGTGATGTGCTGTCGGAGAGAGGGACGGCTGAAGAGAGACCTGGCCACATCTGATATCCAGATGGTGCACCATTGTACTATTCACGGCAACACCGAGGAACTGCGCCAGATGGCTGCTTCTAGGGAGGTGCCAAGGCCACTGAGTACACTGCCTATGTTTAATGTGCACACTGGCGAACGGCTGCCCCCTAGAGTGGATAGCGCCCAGGTGCCACTGATTCTGGACCAGCATTGA
配列番号2
ヒトSGCAタンパク質配列:
MAETLFWTPLLVVLLAGLGDTEAQQTTLHPLVGRVFVHTLDHETFLSLPEHVAVPPAVHITYHAHLQGHPDLPRWLRYTQRSPHHPGFLYGSATPEDRGLQVIEVTAYNRDSFDTTRQRLVLEIGDPEGPLLPYQAEFLVRSHDAEEVLPSTPASRFLSALGGLWEPGELQLLNVTSALDRGGRVPLPIEGRKEGVYIKVGSASPFSTCLKMVASPDSHARCAQGQPPLLSCYDTLAPHFRVDWCNVTLVDKSVPEPADEVPTPGDGILEHDPFFCPPTEAPDRDFLVDALVTLLVPLLVALLLTLLLAYVMCCRREGRLKRDLATSDIQMVHHCTIHGNTEELRQMAASREVPRPLSTLPMFNVHTGERLPPRVDSAQVPLILDQH*
配列番号3
tMCKプロモーター配列:
CCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCACTACGGGTCTATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGACCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCCCGGGTCAC
配列番号4
AAVrh74-tMCK-SGCA:
5’ITR
3’ITR
ポリA
GGCCGCAAT AAAAGATCTT TATTTTCATT AGATCTGTGT GTTGGTTTTT TGTG
配列番号8
Claims (126)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGAを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記rAAVが、全身投与経路を使用して、定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.0×1012vg/kg~約5.0×1015vg/kgの用量で投与される、方法。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.0×1012vg/kg~約2.0×1015vg/kg、約5×1012vg/kg~約1.0×1015vg/kg、約1.0×1013vg/kg~約5.0×1014vg/kg、約2.0×1013vg/kg~約3.0×1014vg/kg、または約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量で投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量で投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg、約1×1014vg/kg、または約2×1014vg/kgの用量で投与される、請求項1に記載の方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGAを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記rAAVが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.85×1013vg/kg~約7.41×1013vg/kgの用量で投与される、方法。
- 前記対象の細胞におけるアルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記rAAVの投与前の前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記rAAVの投与後に増加し、前記対象における血清CKレベルが、前記rAAVの投与前の血清CKレベルと比較して、前記rAAVの投与後に減少し、自発運動および比力の生成が、増加し、線維症が、軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性が、増加し、かつ/または、前記対象の筋肉組織におけるアルファ-サルコグリカン陽性線維の数が、前記rAAVの投与前の前記アルファ-サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記rAAVの投与後に増加する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記全身投与経路が、静脈内経路である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、注射、注入または移植によって投与される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、注入によって投与される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、末梢四肢静脈を介する静脈内経路によって投与される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号1に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号2に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号2に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号4に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、前記配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記rAAVが、tMCKプロモーターを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記tMCKプロモーターが、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号5の5’逆位末端反復配列を含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号6の3’逆位末端反復配列を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、配列番号7のポリA配列を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVが、血清型AAVrh.74のものである、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー2D型(LGMD2D)である、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量で静脈内注入によって投与され、前記rAAVが、前記配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記rAAVの投与前の前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記rAAVの投与後に増加する、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。
- 線維症が、前記rAAVの投与前と比較して、前記rAAVの投与後の前記対象において軽減する、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象における前記線維症、中心核形成、前記CKレベル、および/またはコラーゲン沈着が、前記rAAVの投与前と比較して、前記rAAVの投与後に減少する、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の前記筋肉における比力、線維直径サイズ、および/または偏心収縮が、前記rAAVの投与前と比較して、前記rAAVの投与後に増加する、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現が、ウエスタンブロットおよび/または免疫組織化学によってアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項26に記載の方法。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含む前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物を対象に投与することを含む、細胞においてアルファ-サルコグリカン遺伝子を発現する、方法。
- 前記対象の前記細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検における免疫組織化学によってアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項31に記載の方法。
- 前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、ゲノムDNAの1マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって前記対象において測定される、請求項31に記載の方法。
- 血清CKレベルの減少を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
- 対象の筋肉組織におけるアルファ-サルコグリカン陽性線維を増加させる方法であって、配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
- アルファ-サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記組成物が、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGAを、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.0×1012vg/kg~約5.0×1015vgの用量で含み、前記組成物が、全身投与経路用に製剤化される、組成物。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記組成物が、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGAを、前記定量標準としての線形化されたDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.85×1013vg/kgまたは7.41×1013vg/の用量で含み、前記組成物が、全身投与経路用に製剤化される、組成物。
- 組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含み、前記rAAVが、配列番号4に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量にある、請求項38または40に記載の組成物。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg、約1×1014vg/kg、または約2×1014vg/kgの用量にある、請求項38または40に記載の組成物。
- 前記対象の細胞におけるアルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記組成物の投与前の前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記組成物の投与後に増加するか、または前記組成対象における血清CKレベルが、前記組成物の投与前の血清CKレベルと比較して、前記組成物の投与後に減少するか、または前記対象の筋肉組織におけるアルファ-サルコグリカン陽性線維の数が、前記組成物の投与前の前記アルファ-サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記組成物の投与後に増加する、請求項38~42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記全身投与経路が、静脈内経路である、請求項38~43のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、注射、注入、または移植によって投与される、請求項38~44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、注入による投与用に製剤化される、請求項38~45のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、末梢四肢静脈を介する静脈内経路による投与用に製剤化される、請求項38~46のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号1に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項38~47のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項48に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号2に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項38~49のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号2に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項38~49のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号4に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項38~49のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号4の前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項52に記載の組成物。
- 前記rAAVが、tMCKプロモーターを含む、請求項38~53のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記tMCKプロモーターが、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項54に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号5の5’逆位末端反復配列を含む、請求項38~55のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号6の3’逆位末端反復配列を含む、請求項38~56のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、配列番号7のポリA配列を含む、請求項38~57のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rAAVが、血清型AAVrh.74のものである、請求項38~58のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯筋ジストロフィーである、請求項38~59のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー2D型(LGMD2D)である、請求項38~60のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記組成物が、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量での静脈内注入による投与用に製剤化され、前記rAAVが、配列番号4の前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項38~61のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象の細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記組成物の投与前の前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記組成物の投与後に増加する、請求項38~62のいずれか一項に記載の組成物。
- 線維症が、前記組成物の投与前と比較して、前記組成物の投与後の前記対象において軽減する、請求項38~63のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象における線維症、中心核形成、前記CKレベル、および/またはコラーゲン沈着が、前記組成物の投与前と比較して、前記組成物の投与後に減少する、請求項38~63のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象の前記筋肉における比力、線維直径サイズ、および/または偏心収縮が、前記組成物の投与前と比較して、前記組成物の投与後に増加する、請求項38~65のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現が、ウエスタンブロットおよび/または免疫組織化学によってアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項63に記載の組成物。
- 細胞においてアルファ-サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物であって、前記組成物が、配列番号4の前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物。
- 前記対象の前記細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項68に記載の組成物。
- 前記細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検における免疫組織化学によってアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項68に記載の組成物。
- 前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、ゲノムDNAの1マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって前記対象において測定される、請求項68に記載の組成物。
- 血清CKレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記配列番号4のヌクレオチド配列を含む前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物を含む、組成物。
- 前記配列番号4のヌクレオチド配列を含むscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物を含む、対象の筋肉組織におけるアルファ-サルコグリカン陽性線維を増加させるための、組成物。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含むscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物を含む、アルファ-サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための、組成物。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA Aの使用であって、前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.0×1012vg/kg~約5.0×1015vg/kgの用量にあり、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化される、使用。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.0×1012vg/kg~約2.0×1015vg/kg、約5×1012vg/kg~約1.0×1015vg/kg、約1.0×1013vg/kg~約5.0×1014vg/kg、約2.0×1013vg/kg~約3.0×1014vg/kg、または約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量にある、請求項75に記載の使用。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量にある、請求項75に記載の使用。
- 前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg、約1×1014vg/kg、または約2×1014vg/kgの用量にある、請求項75に記載の使用。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA Aの使用であって、前記rAAVが、前記定量標準としての線形化されたDNAまたはプラスミドに基づいて、約1.85×1013vg/kgまたは7.41×1013vg/kgの用量にあり、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化される、使用。
- 前記対象の細胞におけるアルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記医薬の投与前の前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記医薬の投与後に増加するか、または前記対象における血清CKレベルが、前記医薬の投与前の血清CKレベルと比較して、前記医薬の投与後に減少するか、または前記対象の筋肉組織におけるアルファ-サルコグリカン陽性線維の数が、前記医薬の投与前の前記アルファ-サルコグリカン陽性線維の数と比較して、rAAVの投与後に増加する、請求項75~79のいずれか一項に記載の使用。
- 前記全身投与経路が、静脈内経路である、請求項75~80のいずれか一項に記載の使用。
- 前記医薬が、注射、注入、または移植による投与用に製剤化される、請求項75~81のいずれか一項に記載の使用。
- 前記医薬が、注入による投与用に製剤化される、請求項75~82のいずれか一項に記載の使用。
- 前記医薬が、末梢四肢静脈を介する静脈内経路による投与用に製剤化される、請求項75~83のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号1に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項75~84のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項85に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号2に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項75~86のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号2に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項75~86のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号4に対する少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項75~86のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項89に記載の使用。
- 前記rAAVが、tMCKプロモーターを含む、請求項75~90のいずれか一項に記載の使用。
- 前記tMCKプロモーターが、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項91に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号5の5’逆位末端反復配列を含む、請求項75~92のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号6の3’逆位末端反復配列を含む、請求項75~93のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、配列番号7ポリA配列を含む、請求項73~94のいずれか一項に記載の使用。
- 前記rAAVが、血清型AAVrh.74のものである、請求項73~95のいずれか一項に記載の使用。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、請求項73~96のいずれか一項に記載の使用。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー2D型(LGMD2D)である、請求項73~97のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記医薬が、静脈内注入用に製剤化され、前記rAAVが、前記定量標準としての超らせんDNAまたはプラスミドに基づいて、約5×1013vg/kg~約2×1014vg/kgの用量にあり、前記rAAVが、前記配列番号4のscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項73~98のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象の細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記医薬の投与前の前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記医薬の投与後に増加する、請求項73~99のいずれか一項に記載の使用。
- 線維症が、前記医薬の投与前と比較して、前記医薬の投与後の前記対象において軽減する、請求項73~100のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象における線維症、中心核形成、CKレベル、および/またはコラーゲン沈着が、前記医薬の投与前の前記線維症と比較して、前記医薬の投与後に減少する、請求項73~100のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象の前記筋肉における比力、線維直径サイズ、および/または偏心収縮が、前記医薬の投与前と比較して、前記医薬の投与後に増加する、請求項72~102のいずれか一項に記載の使用。
- 前記アルファ-サルコグリカン遺伝子発現が、ウエスタンブロットおよび/または免疫組織化学によってアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項100に記載の使用。
- 細胞においてアルファ-サルコグリカン遺伝子を発現するための医薬の調製のためのscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物の使用であって、前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物が、配列番号4のヌクレオチド配列を含む、使用。
- 前記対象の前記細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項105に記載の使用。
- 前記細胞における前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検における免疫組織化学によってアルファ-サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項105に記載の使用。
- 前記アルファ-サルコグリカン遺伝子の発現が、ゲノムDNAの1マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって前記対象において測定される、請求項105に記載の使用。
- 血清CKレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物の使用であって、前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物が、配列番号4のヌクレオチド配列を含む、使用。
- 対象の筋肉組織におけるアルファ-サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のためのscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物の使用であって、前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物が、配列番号4のヌクレオチド配列を含む、使用。
- アルファ-サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのscAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物の使用であって、前記scAAVrh74.tMCK.hSGCA構築物が、配列番号4のヌクレオチド配列を含む、使用。
- 前記対象が、4~15歳であるヒト対象である、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
- 前記対象が、小児対象、青年対象、または若年成人対象である、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
- 前記対象が、4~15歳であり、両方の対立遺伝子において確認されたアルファ-サルコグリカン(SGCA)変異を有し、AAVrh74抗体に対して陰性であり、かつ/または40%超もしくは通常の100メートルの歩行試験を有した、ヒト対象である、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
- 前記対象が、中年成人または高齢対象である、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
- 前記対象が、25~55歳であるヒト対象である、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
- 前記対象が、50歳以上であるヒト対象である、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
- AAVベクタープラスミドを宿主細胞に移入することを含む、請求項1~117のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用において投与された前記rAAVを生成する方法であって、前記AAVベクタープラスミドが、配列番号8に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
- 前記AAVベクタープラスミドが、配列番号8のヌクレオチド配列を含む、請求項118に記載の方法。
- 前記ベクタープラスミドが、配列番号1、4、または8に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項118または119に記載の方法。
- 前記ベクタープラスミドが、配列番号1、4、または8のヌクレオチド配列を含む、請求項118または119に記載の方法。
- パッケージングプラスミドおよび/またはヘルパーウイルスを前記宿主細胞に移入することをさらに含む、請求項118~121のいずれか一項に記載の方法。
- パッケージング細胞が、安定に組み込まれたAAVcap遺伝子を含む、請求項118~122のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パッケージング細胞が、安定に組み込まれたAAVrep遺伝子を含む、請求項118~123のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号1、4、または8に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列を含むAAVベクタープラスミドを含む、宿主細胞。
- 前記AAVベクタープラスミドが、配列番号1、4、または8のヌクレオチド配列を含む、請求項125に記載の宿主細胞。
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