CN114945583A - Α-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗 - Google Patents

Α-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗 Download PDF

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Abstract

本文描述了治疗受试者的肌营养不良症的方法，其包括使用全身性施用途径并以约1.0×1012vg/kg至约5.0×1015vg/kg的剂量施用重组AAV载体AAVrh74.tMCK.hSCGA。还公开了表达细胞或有需要的受试者中的α‑肌聚糖基因、降低血清CK水平和增加受试者的肌肉组织中的α‑肌聚糖阳性纤维的方法。

Description

Α-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗
相关申请
本申请要求2019年8月21日提交的美国临时申请第62/889,749号、2020年4月24日提交的美国临时申请第63/014,934号和2020年5月11日提交的美国临时申请第63/022,843号的优先权，所有都通过引用整体并入本文。
技术领域
本文描述了治疗载体，例如表达α-肌聚糖的AAV载体，以及使用这些载体治疗肢带型肌营养不良症，例如LGMD2D的方法。
通过引用并入序列表
本申请含有作为公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名： 54652_SeqListing.txt；18,768字节-ASCII文本文件；2020年8月17日创建)，所述申请通过引用整体并入本文。
背景技术
肌营养不良症(MD)是一组遗传疾病。所述组的特征在于控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化。某些形式的MD在婴儿期或儿童期发展，而其它形式的MD直到中年或以后才可出现。病症在肌肉无力的分布和程度(某些形式的MD也影响心肌)、发病年龄、进展速度和遗传模式方面不同。
一组MD是肢带型肌营养不良症(LGMD)。LGMD是一种罕见的病状，并且不同的人在发病年龄、肌肉无力区域、心脏和呼吸系统受累、进展速度和严重程度方面表现不同。LGMD可能始于儿童期、青春期、青年期或甚至更晚。两性都受到同等的影响。LGMD导致肩部和骨盆带无力，大腿和手臂附近的肌肉有时也会随着时间的推移而减弱。腿部无力通常先于手臂出现。面部肌肉通常不受影响。随着病状的进展，人们可能会出现行走问题，并且随着时间的推移可能需要使用轮椅。肩部和手臂肌肉的受累可能导致难以将手臂举过头顶和举起物体。在某些类型的LGMD中，心脏和呼吸肌可能受累。
针对LGMD的专门测试现在可以通过国家诊断计划，国家诊断计划国家委员会(National Commissioning Group；NCG)获得。
2D亚型LGMD(LGMD2D)(通常被称为α-肌聚糖病)是一种常染色体隐性遗传病，由α-肌聚糖基因(SGCA；α-肌聚糖)突变引起，从而导致功能性蛋白质的完全或减少的缺失以及肌营养不良蛋白相关蛋白复合物的其他结构组分的缺失。值得注意的是，α-肌聚糖蛋白的缺失导致进行性肌营养不良症，伴以肌肉功能恶化，发病年龄为3至8岁。症状包括：行走延迟、由脂肪替代和纤维化引起的近端肌肉无力、肌酸激酶升高、脊柱侧弯和关节挛缩。这种使人衰弱的疾病常常导致依赖轮椅并因呼吸衰竭而死亡。因此，仍然存在对用于 LGMD2D的治疗的需求。
发明内容
本文描述治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒 (rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径并基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约1.0×1012至约5.0×1015的剂量施用。在一个方面中，本公开涉及表达α-肌聚糖基因的rAAV，和将α-肌聚糖递送至肌肉以减少和/或预防纤维化；和/或增加肌肉力量，和/或治疗患有肌营养不良症的受试者的α-肌聚糖病的方法。
在一个方面中，本文描述重组AAV(rAAV)，其包含编码α-肌聚糖蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1中示出的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列并编码保留α-肌聚糖活性的蛋白质。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1中示出的核苷酸序列。在另一实施方案中，多核苷酸编码与SEQ ID NO:2中示出的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或99.5％相同的蛋白质。在另一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列的蛋白质。
在一些实施方案中，rAAV包含含有tMCK启动子的核苷酸序列。例如，tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列。此外，rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列和/或SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。在一些实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO: 7的poly A序列。在一个实施方案中，所公开的rAAV是血清型AAVrh.74。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:4至少65％、70％、75％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或99.5％相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含SEQID NO: 4中示出的核苷酸序列。
本公开提供治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用本文公开的rAAV 中的任一种的步骤，其中rAAV通过全身途径施用。特别地，在所公开方法中的任一种中， rAAV是AAVrh74.tMCK.hSCGA，其中rAAV使用全身性施用途径施用。
在所公开方法中的任一种中，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV以约1.0×1012vg/kg至约5.0×1015vg/kg的剂量施用。例如，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV以约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg或约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用，或rAAV以约5×1013vg/kg、约6×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约8×1013vg/kg、约9×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约2×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、约4×1014 vg/kg或约5×1014vg/kg的剂量施用。
在另一实施方案中，在所公开方法中的任一种中，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，rAAV以约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg的剂量施用。例如，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，rAAV以约1.0×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.5×1013vg/kg至约 8.0×1013vg/kg、约1.6×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.2×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.4×1013vg/kg 至约7.4×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg或约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013 vg/kg的剂量施用。
此外，在所公开方法中的任一种中，全身性施用途径是静脉内途径。例如，在所公开方法中的任一种中，rAAV通过注射、输注或植入来施用。在一些实施方案中，rAAV通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。
在所公开方法中的任一种中，肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。例如，肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
在一示例性实施方案中，治疗肌营养不良症的方法包括向患有肢带型肌营养不良症的受试者施用rAAV，并且rAAV通过静脉输注基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5×1013 vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用，并且其中rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
在示例性实施方案中，本公开提供治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括向受试者施用rAAV的步骤，其中受试者患有肢带型肌营养不良症，并且rAAV通过静脉输注基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用，并且其中rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。例如，在这些方法中，与施用rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用rAAV之后增加。
在所公开方法中的任一种中，与施用rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用rAAV之后增加；和/或其中与施用rAAV之前的血清 CK水平相比，受试者中的血清CK水平在施用rAAV之后降低；和/或其中自主活动和比力产生增加；其中纤维化减少；其中胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力增加；和/或其中与施用rAAV之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量在施用rAAV之后增加；或其中与施用rAAV之前相比，纤维化在受试者中在施用rAAV 之后减少；和/或其中与施用rAAV之前相比，纤维化在受试者中在施用rAAV之后减少；和 /或其中与施用rAAV之前相比，受试者肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩在施用 rAAV之后增加。
在一些实施方案中，通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α- 肌聚糖基因表达。
在另一方面，本公开提供了表达细胞中的α-肌聚糖基因的方法，其包括向受试者施用所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了表达细胞中的α-肌聚糖基因的方法，其包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。另外，在方法中的任一种中，通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的表达。或者，在方法中的任一种中，通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测细胞中的α-肌聚糖基因的表达。在其它实施方案中，在受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
本公开提供了降低有需要的受试者的血清CK水平的方法，所述方法包括向受试者施用所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了降低有需要的受试者的血清CK水平的方法，所述方法包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
在另一方面，本公开提供了增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的方法，其包括向受试者施用所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了增加有需要的受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的方法，所述方法包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
本公开还提供了增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的方法，其包括向受试者施用所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的方法，所述方法包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。此外，在所公开方法中的任一种中，通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的表达。或者，在方法中的任一种中，通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测细胞中的α-肌聚糖基因的表达。在其它实施方案中，在受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
本公开提供了用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包含本文公开的rAAV中的任一种，其中所述组合物被配制用于通过全身途径施用。特别地，在组合物中的任一种中，rAAV是AAVrh74.tMCK.hSCGA。
所公开组合物中的任一种包含基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒剂量为约1.0×1012 vg/kg至约5.0×1015vg/kg的rAAV。例如，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV 的剂量为约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013 vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg或约5×1013vg/kg至约2×1014 vg/kg，或rAAV的剂量为约5×1013vg/kg、约6×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约8×1013vg/kg、约9×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约2×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、约4×1014vg/kg或约5×1014 vg/kg。
在另一实施方案中，在所公开组合物中的任一种，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，rAAV以约1.85×1013vg/kg或约7.41×1013vg/kg的剂量施用。例如，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，rAAV以约1.0×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.5×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.6×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.2×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.4×1013vg/kg 至约7.4×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg或约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013 vg/kg的剂量施用。
此外，所公开组合物中的任一种被配制用于通过静脉内途径施用，例如被配制用于通过注射、输注或植入施用的组合物。在一些实施方案中，所公开组合物被配制用于通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。
所公开组合物中的任一种用于治疗肢带型肌营养不良症，例如2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
在一示例性实施方案中，本公开提供了用于治疗患有肢带型肌营养不良症的受试者的组合物，其中所述组合物包含基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒剂量为约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的rAAV，并且其中所述组合物被配制用于通过静脉输注施用，并且其中rAAV 包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
此外，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的肢带型肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包含基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒剂量为约5×1013vg/kg至约2×1014 vg/kg的rAAV，并且所述组合物被配制用于通过静脉输注施用，其中rAAV包含SEQ IDNO: 4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。例如，与施用rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，施用组合物增加了受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平。
此外，与施用组合物之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，施用所公开组合物中的任一种增加了受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平；和/或其中与施用组合物之前的血清CK水平相比，施用所公开组合物降低了受试者的血清CK水平；和/或其中自主活动和比力产生增加；其中纤维化减少；其中胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力增加；和/或其中与施用组合物之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，施用组合物增加了受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量；和/或其中与施用rAAV之前相比，施用组合物减少了受试者的纤维化；和/或其中与施用所述组合物之前相比，组合物减少了纤维化；或其中与施用组合物之前相比，施用组合物增加了受试者肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩。在一些实施方案中，通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖基因表达。
在另一个方面，本公开提供了用于表达细胞中的α-肌聚糖基因的组合物，其中所述组合物包含所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了用于表达细胞中的α-肌聚糖基因的组合物，其包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。另外，在组合物中的任一种中，通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的表达。或者，在方法中的任一种中，通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测细胞中的α-肌聚糖基因的表达。在其它实施方案中，在受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
本公开提供了用于降低有需要的受试者的血清CK水平的组合物，所述组合物包含所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了用于降低有需要的受试者的血清CK水平的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
在另一方面，本公开提供了用于增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的组合物，其中所述组合物包含所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了用于增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的组合物，其中所述组合物包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
本公开还提供了用于增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的组合物，其中所述组合物包含所公开rAAV中的任一种。例如，本公开提供了用于增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的组合物，其中所述组合物包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。此外，在施用所公开组合物中的任一种之后，通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的表达。或者，在施用所公开组合物中的任一种之后，通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测细胞中的α-肌聚糖基因的表达。在其它实施方案中，在施用所公开组合物中的任一种之后，在受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
本公开提供了所公开rAAV中的任一种用于制备用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的药物的用途，其中所述药物被配制用于通过全身途径施用。特别地，本公开提供了AAVrh74.tMCK.hSCGA用于制备用于治疗肌营养不良症的药物的用途，其中所述药物被配制用于通过全身性施用途径施用。
在所公开用途中的任一种中，药物包含基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒剂量为约1.0×1012vg/kg至约5.0×1015vg/kg的rAAV。例如，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV的剂量为约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg或约5×1013vg/kg 至约2×1014vg/kg，或rAAV的剂量为约5×1013vg/kg、约6×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约 8×1013vg/kg、约9×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约2×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、约4×1014 vg/kg或约5×1014vg/kg。
在另一实施方案中，在所公开用途中的任一种中，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，药物包含剂量为约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg的rAAV。例如，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，药物包含剂量为约1.0×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.5×1013 vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.6×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013 vg/kg、约1.2×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.4×1013 vg/kg至约7.4×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg或约1.8×1013vg/kg至约 8.0×1013vg/kg的rAAV。
此外，在所公开用途中的任一种中，药物被配制用于通过静脉内途径施用。例如，在所公开用途中的任一种中，药物被配制用于通过注射、输注或植入施用。在一些实施方案中，药物被配制用于通过经外周肢体静脉的静脉内途径施用。
在所公开用途中的任一种中，药物用于治疗肢带型肌营养不良症，例如2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
在一示例性实施方案中，本公开提供了rAAV用于制备用于治疗肢带型肌营养不良症的药物的用途，其中所述药物被配制用于通过静脉输注施用，并且基于作为定量标准的超螺旋 DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg，并且其中rAAV包含 SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。例如，与施用rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，向有需要的受试者施用药物导致受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达增加。
在所公开用途中的任一种中，与施用药物之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，向有需要的受试者施用药物导致受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平增加；和/或与施用药物之前的血清CK水平相比，向受试者施用药物导致受试者的血清CK水平降低；和/或其中自主活动和比力产生增加；其中纤维化减少；其中胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力增加；和/或与施用药物之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，向受试者施用药物导致受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量增加，和/或与施用药物之前相比，向有需要的受试者施用药物导致受试者中的纤维化减少；和/或与施用药物之前相比，施用药物导致受试者的肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩增加。在一些实施方案中，通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖基因表达。
在另一方面，本公开提供了所公开rAAV中的任一种用于制备用于表达有需要的受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的药物的用途。例如，本公开提供了scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于表达有需要的受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的药物的用途，其中scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。另外，在用途中的任一种中，通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的表达。或者，在用途中的任一种中，通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测细胞中的α-肌聚糖基因的表达。在其它实施方案中，在受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
本公开提供了所公开rAAV中的任一种用于制备用于降低有需要的受试者的血清CK水平的药物的用途。例如，本公开提供了scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于降低有需要的受试者的血清CK水平的药物的用途，其中scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列.
在另一方面，本公开提供了所公开rAAV中的任一种用于制备用于增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的药物的用途。例如，本公开提供了scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的药物的用途，其中scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
本公开还提供了所公开rAAV中的任一种用于制备用于增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的药物的用途。例如，本公开提供了scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的药物的用途，其中scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。此外，在所公开用途中的任一种中，通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测受试者的细胞中的α-肌聚糖基因的表达。或者，在所公开用途中的任一种中，通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测细胞中的α-肌聚糖基因的表达。在其它实施方案中，在受试者中通过检测每微克基因组 DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
在所公开方法、组合物或用途中的任一种中，受试者是4至15岁的人类受试者，或25 至55岁的人类受试者或50岁以上的人类受试者。
在所公开方法、组合物或用途中的任一种中，受试者是小儿受试者、青少年受试者或年轻成人受试者。或者，受试者是中年成人或老年受试者。
例如，在所公开方法、组合物或用途中的任一种中，受试者是4-15岁的人类受试者，已确认两个等位基因中的α-肌聚糖(SGCA)突变，其对AAVrh74抗体呈阴性和/或具有>40％或正常的100米步行测试。
在另一方面，本公开提供了产生在所公开方法、组合物或用途中的任一种的方法中施用的rAAV的方法，所述方法包括将AAV载体质粒转移至宿主细胞，其中所述AAV载体质粒包含与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。例如，AAV载体质粒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体质粒包含与SEQ ID NO:1、4或8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％相同的核苷酸序列，或载体质粒包含SEQ ID NO:1、4或8的核苷酸序列。
在产生rAAV的所公开方法中的任一种中，所述方法还包括将包装质粒和/或辅助病毒转移至宿主细胞。此外，在产生rAAV的所公开方法中的任一种中，包装细胞包含稳定整合的 AAV cap基因和/或包含包装细胞包含稳定整合的AAV rep基因。
在另一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含与SEQ ID NO:1、4或8至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的AAV载体质粒。例如，宿主细胞包含AAV载体质粒，其包含SEQ ID NO:1、4或8的核苷酸序列。
附图说明
图1显示了scAAVrh74.tMCK.hSGCA基因盒。
图2显示了在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA全身治疗之后剂量递增研究中的转基因表达。 (A)来自用1×1012vg、3×1012vg和6×1012vg(或分别5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和2×1014 vg/kg，基于20-g小鼠)全身(静脉内)治疗的小鼠的多种肌肉的α-肌聚糖免疫荧光染色(n ＝6只/组)。与未治疗的对照相比，治疗后12周表达α-肌聚糖的肌肉纤维范围介于70％-93％。 (B)来自经治疗sgca-/-小鼠的肌肉的蛋白质印迹证实hSGCA蛋白质表达。缩写：TA，胫骨前肌；GAS，腓肠肌；QD，四头肌；TRI，三头肌；GLUT，臀肌；PSO，腰大肌；DIA，隔膜；HRT，心脏；WT，野生型。
图3显示在sgca-/-小鼠中，scAAVrh74.tMCK.hSGCA对肌肉形态的改善与剂量无关。 (A)来自用1×1012vg、3×1012vg和6×1012vg(或分别5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和2×1014 vg/kg，基于20-g小鼠)scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的sgca-/-小鼠的各种肌肉的苏木精和伊红图像。代表性20x图像显示集中的核显著减少并且纤维尺寸总体标准化，与治疗剂量无关。(B)与媒介物治疗的小鼠和野生型对照相比，对确认治疗组中各种肌肉的肌纤维直径正常化的定量(n＝6只/组)。(C)与未治疗小鼠和野生型对照相比，对治疗小鼠的肌肉中位于中央的核的定量(n＝6只/组)。缩写：TA，胫骨前肌；GAS，腓肠肌；QD，四头肌； GLUT，臀肌；PSO，腰大肌；TRI，三头肌；DIA，隔膜；WT，野生型。
图4显示了用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的sgca-/-小鼠的纤维化减少。(A)天狼猩红(Picrosirius red)染色显示scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的小鼠的纤维化减少，这通过与媒介物治疗的sgca-/-小鼠相比在各种肌肉代表性20x图像显示中胶原沉积的减少来指示。(B) 各种肌肉中胶原蛋白水平的定量证实与未治疗的小鼠和野生型对照相比，所有三个治疗组中的胶原蛋白水平的降低(n＝6只/组)。缩写：PSO，腰大肌；DIA，隔膜；TRI，三头肌； GLUT，臀肌。
图5显示了用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗之后对骨骼肌的功能益处。(A)治疗3个月后，采集胫骨前肌(TA)肌肉(左侧和右侧)以测量比力和对收缩诱导损伤的抵抗力(标准化为TA重量)。与未治疗的对照相比，比力和离心收缩之定量在所有治疗组(剂量之间的差异最小)中增加(n＝6只/组)。(B)采集隔膜肌肉条以测量特定的力。治疗12周后，与未治疗的sgca-/-小鼠相比，力在经治疗小鼠中显著增加。(C)治疗12周后，与未治疗的sgca-/-对照相比，通过开放场分析，治疗小鼠的行走和垂直活动得到改善(n＝6只/组)。(D)与未治疗的sgca-/-对照相比，血清中肌酸激酶水平在所有治疗组中都降低。通过单向ANOVA分析数据，然后进行图基氏事后分析(Tukey’s post hoc analysis)以进行多重比较。除非另有说明，否则与与媒介物治疗的sgca-/-小鼠相比，*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，****＝p<0.0001。缩写：TA，胫骨前肌；DIA，隔膜；WT，野生型。
图6显示在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗后没有通过血液化学显示毒性的证据。分析肝酶(ALT、AST和ALP/K)和血糖(GLU)水平的毒性(n＝6只/组)。如由虚线所指示，治疗小鼠的所有化学值都在小鼠的正常/健康限度内。
图7A显示了全身性scAAVrh74.tMCK.hSGCA递送的生物分布分析——在以3×1012vg 和6×1012vg(或分别1×1014vg/kg及2×1014vg/kg，基于20-g小鼠)静脉内递送scAAVrh74.tMCK.hSGCA之后，在来自sgca-/-小鼠的各种组织中添加到定量聚合酶链反应中的每微克DNA的转录物的平均vg拷贝的分布直方图。图7B显示用媒介物(sgca-/-LR(乳酸林格(lactate ringer)))或1.0×1012vg(左蛋白质印迹)或6×1012vg(右蛋白质印迹)的scAArh74.tMCK.hSGCA治疗的WT和sgca-/-小鼠肝脏中α-肌聚糖蛋白表达的蛋白质印迹。每个泳道代表一只独立的小鼠(M1：小鼠1；M2：小鼠2；M3：小鼠3)。下图代表用作加载对照的纽蛋白。缩写：DIA，隔膜；TA，胫骨前肌；TRI，三头肌。
图8通过免疫荧光染色(图8A)和蛋白质印迹(图8B)显示了scAAVrh74.tMCK.hSGCA在12个月大的sgca-/-小鼠的骨骼肌中的表达。图8C中的图表提供了scAAVrh74.tMCK.hSGCAsgca-/-小鼠中的阳性肌纤维百分比。缩写：TA，胫骨前肌；GAS，腓肠肌；QD，四头肌；GLUT，臀肌；TRI，三头肌；PSOAS，腰大肌；膈膜；WT，野生型；LRS，乳酸林格溶液(lactated ringerssolution)。
图9显示了在12个月大的SGCA-/-小鼠中施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA的组织学结果。图9a显示了改善的肌肉病理学。图9b显示了腓肠肌(GAS)和三头肌(TRI)肌肉中中央成核的减少和平均纤维尺寸的增加。图9c显示了与未治疗的对照相比纤维化水平的降低。缩写： TA，胫骨前肌；GAS，腓肠肌；QD，四头肌；GLUT，臀肌；PSO，腰大肌；TRI，三头肌；隔膜；WT，野生型。
图10显示了在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA之后老年小鼠的功能改善。
具体实施方式
本公开基于以下发现：施用包含表达α-肌聚糖的多核苷酸的rAAV引起肢带型肌营养不良症动物模型中肌肉纤维化的减少或完全逆转。如本文在实施例中所证实，施用本文所述的 rAAV引起营养不良特征的逆转，包括降低的CK水平、增加的肌肉力量、改善的行走和垂直活动以及其它运动功能。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在文献中进行充分解释。参见，例如，Sambrook 等人《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(现行版)；《DNA 克隆：一种实用的方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》，第I&II卷(D.Glover编)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编，现行版)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames&S.Higgins编，现行版)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.Hames&S.Higgins编，现行版)；《CRC细小病毒手册(CRC Handbook of Parvoviruses)》，第I&II卷(P.Tijssen编)；《基础病毒学(FundamentalVirology)》, 第2版,第I&II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《动物细胞的新鲜培养，基本技术手册(Freshney Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique)》(Wiley-Liss，第三版)；和Ausubel等人(1991)《分子生物学的当前协议(CurrentProtocols in Molecular Biology)》 (纽约威利跨学科出版社(Wiley Interscience,N.Y))。
无论是在上文还是在下文中，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体全部并入。
定义
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括多个此类细胞并且提及“培养物”包括提及一种或多种培养物及本领域技术人员已知的其等价物，等等。提及“重组 AAV”包括两种或更多种rAAV病毒粒子的混合物等。除非另外清楚地指示，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
除非明确地指示，否则在权利要求书中使用术语“或”用于表示“和/或”，以仅指替代方案，或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代方案的定义和“和/或”。
在整个本申请中，术语“约”用于指示一值包括用于确定所述值的装置或方法的统计实验误差(误差的标准偏差)。
术语“载体”或“表达载体”是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且其可以在细胞之间转移基因序列。在一个实施方案中，载体是病毒载体。表达载体可以含有多种控制序列、结构基因(例如，感兴趣的基因)和也起到其它功能的核酸序列。
如本文所使用的，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种仅在细胞中生成的单链DNA细小病毒，其中某些功能由共感染辅助病毒提供。目前已经表征了十三种 AAV血清型。AAV的基本信息和综述可以在例如Carter，1989，《细小病毒手册》，第1卷，第169到228页和Berns，1990，《病毒学(Virology)》，第1743到1764页，Raven出版社，(纽约)中找到。然而，完全可以预期这些相同的原理将可应用于额外AAV血清型，这是由于众所周知的是，各种血清型在结构和功能上均紧密相关，甚至在基因水平下亦是如此。 (参见例如，Blacklowe,1988,《细小病毒和人类疾病(Parvoviruses and Human Disease)》，第165至174页，J.R.Pattison编；和Rose,《综合病毒学(Comprehensive Virology)》3:1- 61(1974))。例如，所有AAV血清型均明显地展现出非常类似的由同源rep基因介导的复制特性；并且全部具有三种相关的衣壳蛋白，如在AAV2中表达的那些蛋白。相关性程度还进一步由异源双链体分析所表明，所述异源双链体分析显示血清型之间沿基因组长度具有广泛的交叉杂交；并且在末端处存在相似的自退火片段，所述自退火片段对应于“反向末端重复序列”(ITR)。类似的感染性模式还表明每种血清型的复制功能处于类似的调节控制下。
如本文所用的“AAV载体”是指包含一个或多个感兴趣的多核苷酸(或转基因)的载体，所述感兴趣的多核苷酸的侧翼是AAV末端重复序列(ITR)。当存在于已被对rep和cap基因产物进行编码和表达的载体转染的宿主细胞中时，这种AAV载体可以被复制并包装成感染性病毒颗粒。在一个实施方案中，AAV载体是来源于腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV- 10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh10及AAV rh74。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一种或多种AAV野生型基因，优选为rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列对于AAV病毒粒子的拯救、复制和包装是必需的。因此，AAV载体在本文中被定义为至少包括以顺式用于病毒复制和包装(例如，功能性ITR)所需的那些序列。 ITR不必是野生型核苷酸序列，并且可以改变，例如，通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要所述序列提供功能性拯救、复制和包装。
术语“AAV辅助功能”是指AAV衍生的编码序列，其可以被表达以提供AAV基因产物，所述AAV基因产物进而以反式用于生产性AAV复制。因此，AAV辅助功能包括主要的AAV 开放阅读框(ORF)、rep和cap。已示出Rep表达产物具有许多功能，其中包括：DNA复制的AAV起源的识别、结合和切口；DNA解旋酶活性；和来自AAV(或其它异源)启动子的转录调节。Cap表达产物提供必要的包装功能。本文使用AAV辅助功能来补充AAV载体中缺失的反式AAV功能。
“重组病毒”是指已经遗传改变的病毒，例如，通过将异源核酸序列添加或插入病毒颗粒中。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。在一个实施方案中，AAV病毒粒子包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)。在一些实施方案中，AAV载体颗粒的产生包括AAV载体的产生，因为此载体含于AAV 载体颗粒内。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，那么其通常被称为“rAAV载体”或简单地“rAAV颗粒”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括rAAV的产生，因为此rAAV基因组含于rAAV载体颗粒内。
例如，野生型(wt)AAV病毒颗粒包含与AAV衣壳蛋白包衣相关的线性单链AAV核酸基因组。AAV病毒粒子可以是单链(ss)AAV或自互补(SC)AAV。在一个实施方案中，可将具有互补意义的单链AAV核酸分子(例如“有义”或“反义”链)包装到AAV病毒粒子中并且两条链具有同等的感染性。
术语“重组AAV”或“rAAV”在本文中定义为由AAV蛋白壳构成的感染性复制缺陷型病毒，其衣壳化两侧侧接AAV ITR的感兴趣的异源核苷酸序列。在一个实施方案中，rAAV在合适的宿主细胞中产生，其中引入了AAV载体、AAV辅助功能和辅助功能。以这种方式，宿主细胞能够编码将AAV载体(含有感兴趣的重组核苷酸序列)包装成感染性重组病毒粒子颗粒以进行后续基因递送所需的AAV多肽。
术语“转染”是指细胞吸收外源DNA，并且当将外源DNA引入细胞膜内时，细胞被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)《病毒学》，52:456，Sambrook等人(1989)《分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,a laboratorymanual)》，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratories)，纽约，Davis等人(1986)《分子生物学的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》，Elsevier和Chu等人(1981)《基因(Gene)》 13:197。此类技术可以用于将一种或多种外源DNA部分如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入到合适的宿主细胞中。
术语“转导”表示通过复制缺陷型病毒载体，例如通过重组AAV病毒粒子，在体内或体外将DNA分子递送至受体细胞。
术语“宿主细胞”表示例如可以或已经用作AAV辅助构建体、AAV载体质粒、辅助功能载体或其它转移DNA的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。所述术语包括已转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然的、偶然的或故意的突变，单一亲本细胞的后代在形态学或基因组或总DNA互补上不一定与原始亲本完全相同。
术语“异源”在其涉及核酸序列(如编码序列和控制序列)时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或附着于其上的核酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，核酸构建体的异源区域可以包括编码序列，其两侧是未在自然界中发现与编码序列相关的序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞视为异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不会产生异源DNA。
编码序列或编码特定蛋白质的序列是核酸序列，当置于适当的调节序列的控制下时其体外或体内转录(在DNA的情况下)且翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，并且甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3'。
“核酸”序列是指DNA或RNA序列。核酸包括DNA和RNA的碱基类似物，包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β- D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧基丁氧基胸苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其共同提供受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译，并非所有这些控制序列都需要一直存在。
术语“启动子”在本文中以其通常含义用于指包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3′-方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可包括“诱导型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻抑型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)以及“组成型启动子”。在一个实施方案中，所述启动子是肌肉特异性启动子，其包括但不限于人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌间线蛋白启动子、骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短MCK(tMCK) 启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子 (MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快收缩肌钙蛋白c基因元件、慢收缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢收缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子(HIF) 反应元件(HRE)、类固醇诱导元件和糖皮质激素反应元件(gre)。在另一实施方案中，启动子是MCK启动子、tMCK启动子或MHCK7启动子。
术语“可操作地连接”指的是元件的布置，其中如此描述的组分被配置为执行其的通常功能。因此，与编码序列可操作连接的控制序列能够影响编码序列的表达。控制序列不必与编码序列相邻，只要其起到指导其表达的作用。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在插入的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。
当RNA聚合酶将结合启动子序列并将编码序列转录为mRNA时，启动子“指导转录”细胞中的编码序列，然后将其翻译成由编码序列编码的多肽。
“表达盒”或“表达构建体”是指能够指导感兴趣的序列或基因的表达的装配体。如上所述，表达盒包括控制元件，例如与感兴趣的序列或基因可操作地连接(以便指导转录)的启动子，并且通常也包括多聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方案中，本文所述的表达盒可以含于质粒构建体中。除了表达盒的组分之外，质粒构建体还可以包括一种或多种选择标记物、允许质粒构建体作为单链DNA存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如，SV40或腺病毒复制起点)。
当提及核苷酸序列时，“分离的”是指所指示的分子在基本上不存在其它生物大分子，例如其它核苷酸序列、染色质材料等的情况下存在。因此，“编码特定多肽的分离的核酸分子”是指基本上不含不编码主题多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可以包括一些不会有害地影响组合物的基本特征的额外碱基或部分。
为了在整个本申请中描述特定核酸分子中核苷酸序列的相对位置，例如当特定核苷酸序列被描述为相对于另一序列位于“上游”、“下游”、“3”或“5”时，应理解其是DNA分子的“有义”或“编码”链中的序列位置，这在本领域中被称为是常规的。
在核酸序列或氨基酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指两个序列中的残基，其在比对以获得最大对应时是相同的。序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长，期望至少约500至5000个核苷酸的基因编码序列或片段的全长。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到24 个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。可以通过本领域中已知的技术来确定序列的同一性百分比。例如，可以通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序(例如ALIGN、ClustalW2和BLAST)直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。在一个实施方案中，当使用BLAST作为比对工具时，默认参数如下：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+瑞士蛋白质 +Spupdate+PIR。
术语“受试者”是指动物界的任何成员，包括但不限于人类和非人类灵长类动物，例如黑猩猩和其它猿类和猴类物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠等。在一些实施方案中，受试者是受试者是年龄范围从出生到2岁、从1岁到10岁、或从4岁到15岁、或从10岁到19岁、或从20岁到40岁、或从15岁到29岁、或从25岁到55岁、或从40岁到60岁、或50岁以上或60岁以上、或65岁以上或70岁以上的人类。例如，受试者是人类儿童(2至12岁)、人类青少年(10至19岁)。在一些实施方案中，受试者是成年人(18岁或以上)。特别地，受试者是年轻成人(15至29岁)、中年人(25至55岁)或老年人(50岁以上)或老年人受试者(65岁以上)或老年人类受试者(70岁以上)。
“治疗作用”是指由本文所述的治疗赋予的任何治疗益处。例如，这种作用可以是在适当的靶组织中持续表达在感兴趣的肌营养不良症中缺乏或缺失的蛋白质或酶。此外，治疗作用可以是感兴趣的疾病或病症的一种或多种临床或亚临床表现的任何减少或消除。例如，CK水平的降低、纤维化的减少、胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力的增加和/肌肉中比力的增加和改善的运动功能为接受LGMD-2D治疗的受试者提供了治疗益处。
在另一方面，本文所述的重组AAV载体包含编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的α-肌聚糖的多核苷酸序列，并且蛋白质保留α-肌聚糖活性。在另一实施方案中，α-肌聚糖包含SEQ ID NO:2中示出的多肽序列。
在另一方面，本文描述一种包含编码功能性α-肌聚糖的多核苷酸序列的重组AAV载体，所述多核苷酸序列包含在严格条件下与和SEQ ID NO:1或其互补物至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列杂交的核苷酸序列。在另一实施方案中，rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列.在另一实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:4的核苷酸序列。
术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交的严格性主要由温度、离子强度以及如甲酰胺的变性剂的浓度确定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是0.015M氯化钠、 65-68℃下0.0015M柠檬酸钠，或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和42℃下50％甲酰胺。参见Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室，(纽约冷泉港，1989)。还可以使用更严格的条件(例如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其它变性剂)，然而，杂交速率将受到影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14碱基寡聚物)、48℃(对于17碱基寡聚物)、55℃ (对于20碱基寡聚物)和60℃(对于23碱基寡聚物)下在6x SSC 0.05％焦磷酸钠中洗涤。
当本文使用范围用于物理特性，例如分子量、浓度或剂量时，旨在包括范围的所有组合和子组合以及其中的具体实施方案。当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所指的数字或数值范围是实验变异性(或统计实验误差)内的近似值，因此所述数字或数值范围可能从例如所述数量或数值范围的1％至15％变化。
为了减少非特异性和/或背景杂交，可以在杂交和洗涤缓冲液中包括其它试剂。实例是 0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、 (SDS)、ficoll、登哈特氏溶液(Denhardt’s solution)、超声处理鲑鱼精子DNA(或其它非互补DNA)和葡聚糖硫酸盐，尽管也可以使用其它合适的试剂。可以改变这些添加剂的浓度和类型，而基本上不影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在pH 6.8-7.4下进行，然而，在典型的离子强度条件下，杂交速率几乎与pH无关。参见Anderson等人《核酸杂交：实 用方法(Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach)》第4章，IRL出版有限公司(IRL Press Limited)(英国牛津)。本领域技术人员可以调节杂交条件以适应这些变量并允许不同序列相关性的DNA形成杂交体。
2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)是一种进行性肌营养不良症，表现为肌肉无力、呼吸异常，在极少数情况下会出现心肌病。LGMD2D是由α-肌聚糖基因突变引起的，导致蛋白质丢失以及肌聚糖和肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物的伴随丢失。Sgca-null(sgca-/-)小鼠概括了患有LGMD2D患者的临床表型，包括营养不良特征，例如肌肉坏死和纤维化、血清肌酸激酶(CK)升高以及绝对肌肉力和自主活动的产生减少。因此，sgca-/-小鼠提供了一个相关模型来测试基因替换的安全性和功效。因此，本公开提供了一种自身互补的AAVrh74载体，所述载体含有由肌肉特异性启动子截短的肌肉肌酸激酶(tMCK)驱动的密码子优化的全长人类SGCA(hSGCA)转基因。使用剂量递增设计测试scAAVrh74.tMCK.hSGCA在sgca-/-小鼠中的功效和安全性，以评估与媒介物治疗和野生型小鼠相比，1×1012、3×1012和6×1012vg的单次全身注射。在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的sgca-/-小鼠中，在所有测试剂量下，骨骼肌的肌膜上的α-SG的蛋白表达稳定。此外，scAAVrh74.tMCK.hSGCA可有效改善sgca-/-小鼠的肢体和隔膜肌肉的组织病理学，如纤维化和中央成核减少以及肌纤维尺寸正常化所指示。这些分子变化伴随着隔膜和胫骨前肌的比力产生的显著增加、防止离心力损失以及血清CK 的降低。与媒介物治疗的sgca-/-小鼠相比，所有剂量的载体治疗的自主活动都得到改善。最后，在血清化学小组和大体尸检中检测到缺乏与载体相关的毒性。总的来说，所述研究为在临床环境中全身递送scAAVrh74.tMCK.hSGCA以用于治疗LGMD2D提供了支持。
在另一方面，本文所述的重组AAV载体可以与肌肉特异性控制元件可操作地连接。例如，肌肉特异性启动子包含以下中的一种或多种：人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌间线蛋白启动子、骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2) 启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短 MCK(tMCK)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a-肌球蛋白重链增强子-/MCK 增强子-启动子(MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快收缩肌钙蛋白c基因元件、慢收缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢收缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子(HIF)反应元件(HRE)、类固醇诱导元件和糖皮质激素反应元件(gre)。
在一个实施方案中，肌肉特异性启动子是tMCK启动子，其包含SEQ ID NO:3的序列。本文所述的示例性rAAV是AAVrh74.tMCK.hSCGA，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码AAVrh74.tMCK.hSCGA的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4中示出的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的序列，或与SEQID NO:1至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的核苷酸序列。
在另一实施方案中，编码AAVrh74.tMCK.hSCGA的多核苷酸序列包含编码与SEQ IDNO: 1中示出的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的多核苷酸序列的核苷酸序列。在另一实施方案中，多核苷酸序列编码保留α-肌聚糖活性的蛋白质。
在一个实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。在另一实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。在一些实施方案中，rAAV包含SEQ IDNO:7的poly A序列。
AAV可以是任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.10、AAV rh.74或其变体或衍生物。在一个实施方案中，rAAV是血清型AAVrh.74。假型rAAV的产生在例如WO 2001/083692中公开，其通过引用整体并入。还考虑了其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如，Marsic等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》,22(11):1900-1909 (2014)。
还考虑了包含本文所述的任何rAAV载体的组合物。
提供了治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA的步骤，其中rAAV使用全身性施用途径并以约1.0×1012vg/kg至约5.0×1015vg/kg的剂量来施用。例如，在所提供方法中的任一种中，施用的rAAV的剂量在约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg 至约5.0×1014vg/kg、约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg或约2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg 之间。在另一实施方案中，剂量为约5.0×1013vg/kg、1.0×1014vg/kg或2.0×1014vg/kg。在一个实施方案中，rAAV通过全身途径施用，其包括静脉内途径。在另一实施方案中，rAAV以约 5.0×1013vg/kg、1.0×1014vg/kg或2.0×1014vg/kg的剂量静脉内施用。在一个实施方案中，肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。
另外，施用的rAAV的剂量为约1.5×1013vg至约3.5×1016vg、或3×1013vg至1×1016vg、或约1.5×1013vg至约2×1015vg、或约1.5×1013vg至约1×1015vg。另外，在方法中的任一种中，rAAV的剂量以约10mL/kg的浓度施用。在一个实施方案中，肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。在一个实施方案中，肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症。本公开中以 vg或vg/kg表示的剂量基于利用定量PCR(qPCR)的滴定鉴定方法。基于qPCR的滴定方法是本领域中已知的。
另外，提供了治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒 (rAAV)scAAVrh74.tMCK.hSGCA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径以约1.0×1012 vg/kg至约2.0×1015vg/kg的剂量施用；其中与施用rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用rAAV之后增加；其中与施用rAAV之前的血清CK水平相比，受试者中的血清CK水平在施用rAAV之后降低；和/或其中自主活动和比力产生增加；其中纤维化减少；其中胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力增加；和/其中与施用rAAV之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量在施用rAAV之后增加；其中与施用rAAV之前的纤维直径数量相比，受试者的肌肉组织中的纤维直径尺寸在施用rAAV之后增加；或其中与施用rAAV之前的中央成核相比，受试者的肌肉组织中的中央成核在施用rAAV之后减少。肌肉组织包括但不限于三头肌、胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、臀肌、腰大肌、三角肌、四头肌和隔膜。在一个实施方案中，肌肉组织包括胫骨前肌、腓肠肌、臀肌、腰大肌和三头肌。通过本领域普通技术人员已知的方法确定α-肌聚糖的表达。在一个实施方案中，通过蛋白质印迹、肌肉活检中的免疫化学和/或通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来确定表达。
在一些实施方案中，本公开包括一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV)scAAVrh74.tMCK.hSGCA的步骤，其中与施用rAAV之前所述人类受试者的运动功能相比，所述人类受试者的运动功能得到明显改善。
提供了增加有需要的患者中的α-肌聚糖的方法，其包括向患者施用SEQ ID NO:4的 scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
在所提供的治疗肌营养不良症的方法、用途和组合物中的任一种中，受试者的年龄为4- 15岁，已确认两个等位基因中的α-肌聚糖(SGCA)突变，其对AAVrh74抗体呈阴性和/或具有>40％或正常的100米步行测试。在所提供的治疗肌营养不良症的方法、用途和组合物中的任一种中，受试者是小儿受试者。在一些实施方案中，受试者是小儿受试者，例如年龄范围为1至21岁的受试者。在一些实施方案中，受试者为1至10岁、或2至12岁、4至15 岁、或10至19岁。在一个实施方案中，受试者是青少年受试者，例如年龄范围为12至21 岁的受试者。此外，在一个实施方案中，受试者是年轻的成年受试者，例如年龄范围为15至 29岁或18至39岁的受试者。在一些实施方案中，受试者是中年成人或老年受试者，使得中年成人的年龄范围可以是25至55岁，老年受试者的年龄范围可以是50岁以上，并且老年受试者的年龄范围可以是65岁以上。在一些实施方案中，rAAV通过注射、输注或植入来施用。例如，rAAV通过在大约1至2小时内的输注来施用。另外，rAAV通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。
在治疗有需要的人类受试者的肌营养不良症的方法中，包括施用重组腺相关病毒(rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA的步骤，其中rAAV使用全身性施用途径并以约1.0×1012vg/kg至约5.0×1014vg/kg的剂量施用，并且rAAV包含与SEQ ID NO:1至少65％、70％、75％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％相同的的核苷酸序列。在另一实施方案中，rAAV包含SEQ IDNO:1 中示出的核苷酸序列。在一个实施方案中，rAAV编码包含与SEQ ID NO:2至少65％、70％、 75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的蛋白质。在另一实施方案中，rAAV包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2中示出的多肽序列。此外，所公开rAAV中的任一种包含启动子，例如SEQ ID NO:3的tMCK启动子序列。在一些实施方案中，rAAV是血清型AAVrh.74。另外，rAAV包含SEQ ID NO:3的scAAVrh74.tMCK.hSGCA 构建体核苷酸序列。在一个实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。在另一实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。在另一实施方案中， rAAV包含SEQ ID NO:7的poly A序列。
AAV剂量可以通过多种方法来确定，包括但不限于LISA、逆转录酶活性评估、FACS、转导测定northern印迹(例如，半定量northern)、斑点印迹分析或PCR(例如，qPCR)。众所周知，可以通过使用定量实时PCR(qPCR)测量AAV载体基因组来确定AAV剂量。这种qPCR方法克服了传统转导测定的不一致或任意结果。在PCR剂量确定的一个实施方案中，质粒DNA用作校准标准。质粒的形式可能影响qPCR方法的剂量结果。在一个实施方案中，环状或超螺旋DNA或质粒用作定量标准。在另一实施方案中，线性化DNA或质粒用作定量标准。
术语“超螺旋DNA”或“超螺旋质粒”是指不包含自由末端的DNA或质粒。术语“线性化 DNA”或线性化质粒“是指包含彼此不连接的游离5'端和游离3'端的DNA或质粒。在一个实施方案中，通过环状DNA(例如质粒DNA)的限制性消化或通过dbDNA的限制性消化来获得线性化DNA或质粒。在另一实施方案中，使用产生至少一个平端的酶进行限制性消化。
在一示例性实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV)scAAVrh74.tMCK7.hSGCA的步骤，其中rAAV使用全身性施用途径并以约1.0×1012vg/kg至约5.0×1014vg/kg的剂量来施用。在一个实施方案中，rAAV通过静脉输注在约1至2小时内以基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒约5.0×1013vg/kg、1.0×1014vg/kg或2.0×1014vg/kg的剂量施用，其中rAAV包含SEQ ID NO:3的scAAVrh74.tMCK7.hSGCA构建体核苷酸序列。在另一实施方案中，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，剂量为约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg。
本公开内容还提供了增加受试者的肌肉组织中的肌聚糖表达的方法，其包括向受试者施用包含与SEQ ID NO:1和/或4至少90％相同、至少95％相同或99％相同的核苷酸序列的 scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体。
本公开进一步提供了一种改善受试者的肌肉功能的方法，其包括向受试者施用包含与 SEQ ID NO:1和/或4至少90％相同、至少95％相同或99％相同的核苷酸序列的构建体。
在一些方面，受试者患有编码肌聚糖蛋白的基因中的基因突变或肌营养不良症。在一些方面，受试者患有编码α-肌聚糖蛋白的基因中的基因突变。
在所提供方法中的任一种中，与施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，受试者细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用scAAVrh74.tMCK7.hSGCA构建体之后增加。
另外，在所提供方法中的任一种中，通过在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前和之后在肌肉活检中以蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖基因在细胞中的表达。
在所提供方法中的任一种中，α-肌聚糖蛋白的水平在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之后增加。例如，α-肌聚糖蛋白的水平增加了至少33％，如通过在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前和之后在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平所检测，或通过肌肉活检中的免疫组织化学和/或通过在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前和之后检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖蛋白的水平。
在所提供方法中的任一种中，与施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前的血清CK水平相比，受试者的血清CK水平在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之后降低。
在所提供方法中的任一种中，与施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之后增加。例如，通过在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前和之后在肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖阳性纤维的数量。例如，在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体后，α-肌聚糖阳性纤维的数量在受试者的肌肉组织中增加。
在所提供方法中的任一种中，与施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前的α-肌聚糖水平相比，受试者中的α-肌聚糖水平在施用rAAV之后增加。通过在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前和之后在肌肉活检上通过免疫组织化学或蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖水平。
另一实施方案提供了表达患者细胞中的α-肌聚糖基因的方法，其包括向患者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。在表达患者细胞中的α-肌聚糖基因的所提供方法中的任一种中，通过在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体之前和之后在肌肉活检中以蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖基因在患者细胞中的表达。在一个实施方案中，在患者中通过检测每个核大于一个rAAV载体基因组拷贝来测量α-肌聚糖基因。在另一实施方案中，在受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量α-肌聚糖基因的表达。
还提供了降低有需要的患者的血清CK水平的方法，所述方法包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
提供了增加患者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的方法，其包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。在这些方法中的任一种中，通过在施用rAAV之前和之后在肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖阳性纤维的数量。
另一实施方案提供了增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的方法，其包括向受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。在这些方法中的任一种中，通过在施用rAAV之前和之后在肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖的水平。
还提供了产生重组AAV载体颗粒的方法，其包括培养用本文所述的任何重组AAV载体转移的宿主细胞并从转染细胞的上清液中回收重组AAV颗粒。还考虑了包含本文所述的重组AAV载体中的任一种的病毒颗粒。在一个实施方案中，产生rAAV的方法包括将AAV载体质粒转移至宿主细胞。在另一实施方案中，重组AAV载体颗粒和/或AAV载体质粒包含与 SEQID NO:8至少约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％或约89％，更通常约90％、约91％、约92％、约93％、约 94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更多相同的核苷酸序列。在另一方面，本公开提供了包含AAV载体质粒的细胞，所述AAV载体质粒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。在一些实施方案中，AAV载体质粒在宿主细胞中稳定表达。稳定携带AAV载体质粒的宿主细胞可以用于产生rAAV。在一个实施方案中，AAV载体质粒是 pAAV.tMCK.hSGCA.KAN质粒(SEQ ID NO:8)。
还提供了减少有需要的哺乳动物受试者中的纤维化的方法。在这方面，所述方法包向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文所述的AAV载体(或包含本文所述的AAV载体的组合物)。在一些实施方案中，哺乳动物受试者患有肌营养不良症。在一个实施方案中，肌营养不良症是LGMD2D。在一些实施方案中，施用本文所述的AAV载体(或包含本文所述的AAV载体的组合物)减少了受试者的肌肉组织中的纤维化。在一个实施方案中，肌肉组织包括腰大肌、隔膜、三头肌和/或臀肌。
如本文所用的术语“肌营养不良症”是指其中力量和肌肉体积逐渐下降的病症。肌营养不良症疾病的非限制性实例可以包括贝克尔肌营养不良症(Becker musculardystrophy)、胫骨肌营养不良症、杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)、埃默里-德赖弗斯肌营养不良症(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)、面肩肱型肌营养不良症、肌聚糖病、先天性肌营养不良症(例如由于部分LAMA2缺乏引起的先天性肌营养不良症)、分区蛋白缺陷型先天性肌营养不良症、1D型先天性肌营养不良症、福山氏先天性肌营养不良症(Fukuyama congenital muscular dystrophy)、肢带型1A型肌营养不良症、肢带型2A型肌营养不良症、肢带型2B型肌营养不良症、肢带型2C型肌营养不良症、肢带型2D型肌营养不良症、肢带型 2E型肌营养不良症、肢带型2F型肌营养不良症、肢带型2G型肌营养不良症、肢带型2H型肌营养不良症、肢带型2I型肌营养不良症、肢带型2I型肌营养不良症、肢带型2J型肌营养不良症、肢带型2K型肌营养不良症、肢带型IC型肌营养不良症、伴单纯大疱性表皮松解的强直脊柱肌营养不良症、眼咽肌营养不良症、乌尔里奇先天性肌营养不良症(Ullrich congenital muscular dystrophy)以及乌尔里奇硬化性肌营养不良症(Ullrichscleroatonic muscular dystrophy)。在一些实施方案中，受试者患有肢带型肌营养不良症。在一些实施方案中，受试者患有2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
如本文所用的术语“纤维化”是指损伤后组织(包括骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾和胰腺) 中细胞外基质(ECM)组分的过度或未调节的沉积和异常修复过程。被沉积的ECM组分包括胶原蛋白，例如胶原蛋白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3，以及纤连蛋白。
在另一方面，本文描述了一种增加哺乳动物受试者的肌肉组织中α-肌聚糖阳性纤维、纤维直径尺寸、肌肉离心收缩、肌肉力量和/或α-肌聚糖的表达的方法，其包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文所述的AAV载体(或包含本文所述的AAV载体的组合物)。本文还描述了减少受试者中的纤维化、中央成核、CK水平和/或胶原沉积的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的AAV载体(或包含本文所述的AAV载体的组合物)。
在本发明方法中的任一种中，受试者可能患有肌营养不良症，例如肢带型肌营养不良症或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症。在一个实施方案中，肌营养不良症是 LGMD-2D。
还提供了一种治疗哺乳动物受试者的肌营养不良症的方法，其包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文所述的AAV载体(或包含本文所述的AAV载体的组合物)。在一些实施方案中，肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。
在本发明方法中的任一种中，通过肌内注射或静脉注射施用rAAV。另外，在本发明方法中的任一种中，rAAV是全身施用的，例如通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。
配制本发明的组合物以用于肌内注射或静脉注射。另外，将本发明的组合物配制用于全身性施用，例如通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。
另外，将组合物中的任一种配制用于施用至患有肌营养不良症(例如肢带型肌营养不良症或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症)的受试者。在一些实施方案中，所述组合物还可以包含表达α-肌聚糖的第二重组AAV载体或包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:4 中示出的多核苷酸序列的第二重组AAV载体。
在本发明用途中的任一种中，将药物配制用于肌内注射或静脉注射。另外，在本发明用途中的任一种中，将药物配制用于全身性施用，例如通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。另外，可以将药物中的任一种制备用于施用至患有肌营养不良症(例如肢带型肌营养不良症或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症)的受试者。在一些实施方案中，所述药物还可以表达α-肌聚糖的第二重组AAV载体或包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中的多核苷酸序列的第二重组AAV载体。
前述段落并非旨在定义本发明的每个方面，并且在其它部分，例如具体实施方式中对额外方面进行了描述。整个文档旨在作为统一的公开而相关，并且应当理解，即使没有在本文档的同一句子或段落或部分中一起发现特征的组合，也考虑本文所述的特征的所有组合。作为额外方面，本发明包括本发明的范围在任何方面都比上述特定段落所定义的变型更窄的所有实施方式。例如，在本发明的某些方面被描述为类别的情况下，应理解，类别的每个成员单独地是本发明的方面。
AAV
本发明的重组AAV基因组包含本发明的核酸分子和侧接核酸分子的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、 AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh.74。在例如WO 01/83692中公开了假型rAAV的产生。还考虑了其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。
本发明的DNA质粒包含rAAV基因组。将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配成感染性病毒颗粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域中的标准，其中将待包装的AAV基因组、rep和cap 基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap 基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV- 1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV- 11、AAV-12、AAV-13、AAV rh10和AAVrh.74。假型rAAV的产生在例如WO 2001/083692 中公开，其通过引用整体并入本文。
产生包装细胞的方法是创建稳定表达AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因以及可选择的标记物(例如新霉素抗性基因)整合到细胞的基因组中。已经通过如GC拖尾等程序将AAV基因组引入细菌质粒中(Samulski等人,1982,《美国国家科学院院刊S6(Proc.Natl.Acad.S6.USA)》79：2077-2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(Laughlin等人,1983,《基因》,23:65-73)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter,1984,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,259:4661-4666)。然后用例如腺病毒的等辅助病毒感染包装细胞系。这种方法的优点在于细胞为可选择的并且适合于大规模产生rAAV。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而非质体将rAAV基因组及/或 rep及cap基因引入包装细胞。
rAAV产生的一般原理评论于例如Carter，1992，《生物技术当前述评(CurrentOpinions in Biotechnology)》，1533-539；及Muzyczka，1992，《微生物学及免疫学的当前课题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》,158:97-129)中评论。各种方法描述于Ratschin等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》,81:6466(1984)；Tratschin等人,《分子与细胞生物学》5:3251(1985)；McLaughlin等人, 《病毒学杂志(J.Virol.)》,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,1988《分子与细胞生物学》, 7:349(1988)。Samulski等人，(1989,《病毒学杂志》,63:3822-3828)；美国专利第5,173,414 号；WO 95/13365和对应美国专利第5,658.776号；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人 (1995)《疫苗(Vaccine)》13:1244-1250；Paul等人(1993)《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》 4:609-615；Clark等人(1996)《基因疗法(Gene Therapy)》3:1124-1132；美国专利第5,786,211 号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利6,258,595中。前述文献在此通过引用整体并入本文，特别强调与rAAV产生有关的文献的那些部分。
因此，本发明提供产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞可为稳定转化的癌细胞，例如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一实施方案中，包装细胞是不为转化的癌细胞的细胞，例如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人胚肾细胞)、MRC-5细胞(人胚成纤维细胞)、WI-38细胞(人胚成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
本发明的重组AAV(即，感染性衣壳化rAAV颗粒)包含rAAV基因组。实施方案包括但不限于名为pAAV.tMCK.hSCGA的rAAV，其包含SEQ ID NO:3中示出的多核苷酸序列。
rAAV可以通过本领域标准方法纯化，如通过柱色谱法或氯化铯梯度。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包含在例如Clark等人,《人类基因疗法》，10(6): 1031-1039(1999)；Schenpp和Clark，《分子医学方法(Methods Mol.Med.)》，69:427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657。
在另一个实施方案中，本发明考虑包含本发明的rAAV的组合物。本文所述的组合物包含在药学上可接受的载体中的rAAV。组合物还可包含其它成分，例如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对受体无毒，并且优选地在采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如Tween、普朗尼克(pluronic)或聚乙二醇(PEG)。
在本发明的方法中待施用的rAAV的滴度将根据例如特定rAAV、施用方式、医治目标、个体和靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可通过本领域标准的方法确定。rAAV的滴度范围可为每毫升约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013至约1×1014或更多DNase抗性颗粒(DRP)。剂量也可以如通过qPCR所测量以病毒基因组(vg)为单位表达。
本发明考虑了在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。在体内的方法包含向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多剂量的包含本发明rAAV的组合物的步骤。如果在病症/疾病发展之前施用剂量，那么施用是预防性的。如果在病症/疾病发展之后施用剂量，那么施用是治疗性的。在本发明的实施方案中，有效剂量是减轻(消除或降低)与正在医治的病症/疾病状态相关的至少一种症状，减缓或预防进展至病症/疾病状态，减缓或预防病症/疾病状态的进展，减少疾病的程度，引起疾病的缓解(部分或全部)和/或延长存活的剂量。考虑用本发明的方法预防或治疗的疾病的实例是肌营养不良症，例如肢带型肌营养不良症。因此，提供了一种用rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA转导靶细胞的方法，所述rAAVscAAVrh74.tMCK.hSGCA包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在另一实施方案中，本公开提供了一种产生rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA的方法，其包括将AAV载体质粒转移至宿主细胞。将DNA转移至宿主细胞的方法是本领域中熟知的，包括但不限于转染、感染、转化、电穿孔和转导。在一个实施方案中，载体质粒包含与SEQ IDNO:8至少约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约 85％、约86％、约87％、约88％或约89％，更通常约90％、约91％、约92％、约93％、约 94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更多相同的核苷酸序列。在另一实施方案中，载体质粒包含与SEQ ID NO:8至少90％、95％或99％相同的核苷酸序列。在另一实施方案中，载体质粒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。在另一方面，本公开提供了包含AAV 载体质粒的细胞，所述AAV载体质粒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。在一些实施方案中， AAV载体质粒在宿主细胞中稳定表达。稳定携带AAV载体质粒的宿主细胞可以用于产生 rAAV。在一个实施方案中，AAV载体质粒是pAAV.tMCK.hSGCA.KAN质粒。
在一个实施方案中，载体质粒包含与SEQ ID NO:1、4或8至少约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％或约89％，更通常约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约 99％或更多相同的核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体质粒包含与SEQ ID NO:1、4或8至少约90％、95％或99％相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，载体质粒包含SEQ ID NO:1、4或8的核苷酸序列。在一个实施方案中，产生rAAV的方法还包括将包装质粒和/或辅助病毒转移至宿主细胞。在一些实施方案中，包装质粒包含与启动子可操作地连接的AAV rep和/或cap基因。在一个实施方案中，启动子是AAV转录启动子。在一个实施方案中，宿主细胞是包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞包含稳定整合的AAV cap基因。在另一实施方案中，包装细胞包含稳定整合的AAV rep基因。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可用于表达外源DNA序列的细胞。宿主细胞的非限制性实例包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、包装质粒、AAV载体质粒、辅助功能载体或其它DNA的受体。如这里使用的术语包括在原始宿主细胞中表达外源DNA序列之后原始细胞的后代。用于AAV生产的宿主细胞的非限制性实例包括Sf9昆虫细胞和HEK 293T细胞。AAV载体质粒可以通过感染(病毒或杆状病毒)、使用试剂(例如，脂质体、磷酸钙)的瞬时转染或物理方式(例如，电穿孔)或本领域已知的其它方式引入宿主细胞，例如Sf9或293T。在另一实施方案中，宿主细胞系与 rAAV质粒稳定整合到其的基因组中。此类稳定的细胞系可以通过将选择标记物掺入载体质粒来建立。
在一个实施方案中，宿主细胞是用于产生AAV病毒颗粒的包装细胞。因此，在另一方面，本公开提供了一种包含AAV载体质粒的宿主细胞，所述AAV载体质粒包含与 SEQ IDNO:8至少90％、95％或99％相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，AAV载体质粒包含SEQID NO:8的核苷酸序列。在另一实施方案中，宿主细胞包含SEQ ID NO:1、4或8 的核苷酸序列。
本发明还考虑组合疗法。如本文所用的组合包括同时治疗和顺序治疗两者。特别考虑本发明的方法与标准医学治疗(例如，类固醇、皮质类固醇和/或糖皮质激素，包括但不限于泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)和地夫可特(deflazacort)中的一种或多种)的组合，作为与新疗法的组合。在这方面，所述组合包括在向受试者施用本发明方法的rAAV之前、与向受试者施用rAAV的同时，或在向受试者施用rAAV之后，向受试者施用一种或多种类固醇、皮质类固醇和/或糖皮质激素，包括但不限于泼尼松、泼尼松龙和地夫可特中的一种或多种。
在本发明所考虑的组合疗法的相关实施方案中，糖皮质激素包括但不限于倍氯米松 (beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone) 或曲安西龙(triamcinolone)。
已认识到抗原特异性T细胞反应可能发生在施用有rAAV载体的受试者中。这是基因转移后2至4周之间的预期反应。此类抗原特异性T细胞反应的一种可能后果是转导细胞的清除和转基因表达的丧失。为了抑制宿主对基于rAAV的治疗的免疫反应，在治疗之前，例如在治疗程序前二十四小时，受试者可以开始口服大约1mg/kg/天的预防性泼尼松或类似的糖皮质激素，其中最大剂量为60mg/天。如果需要，也允许以大约1mg/kg/天的剂量IV施用类似的糖皮质激素。治疗将持续大约一个月。可以基于个体受试者对基因转移的免疫反应，通过ELISpot测定评估以及通过用GGT监测肝功能来实施泼尼松或类似糖皮质激素的逐渐减量方案。
rAAV载体的治疗有效量是约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约 1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg或约 2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg的rAAV剂量。在另一实施方案中，剂量为约5.0×1013vg/kg、约1.0×1014vg/kg或约2.0×1014vg/kg。在另一实施方案中，剂量是5.0×1013vg/kg、1.0×1014 vg/kg或2.0×1014vg/kg。本发明还考虑包括包含这些范围的rAAV载体的组合物。
剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表达。可以通过超螺旋DNA或质粒定量标准或线性化DNA或质粒定量标准来确定rAAV的滴度。AAV载体的滴度或剂量可以基于作为定量标准的质粒DNA的物理形式而变化。例如，滴度或剂量的值可能因超螺旋标准qPCR滴定方法或线性标准qPCR滴定方法而变化。在一个实施方案中，本公开中的剂量基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒。在另一实施方案中，本公开中的剂量基于作为定量标准的线性化DNA 或质粒。因此，在一个实施方案中，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV载体的治疗有效量是范围为约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg或约2.0×1013vg/kg 至约3.0×1014vg/kg的rAAV剂量。在另一实施方案中，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，剂量为约5.0×1013vg/kg、约1.0×1014vg/kg或约2.0×1014vg/kg。在另一实施方案中，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，剂量为5.0×1013vg/kg、1.0×1014vg/kg或2.0×1014 vg/kg。
在另一实施方案中，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，rAAV载体的治疗有效量是范围为约1.0×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.5×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约 1.6×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg、约1.2×1013vg/kg 至约7.5×1013vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg、约1.4×1013vg/kg至约7.4×1013 vg/kg、约1.9×1013vg/kg至约7.5×1013vg/kg或约1.8×1013vg/kg至约8.0×1013vg/kg的rAAV 剂量。例如，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，rAAV载体的治疗有效量是约1.85×1013 vg/kg或7.41×1013vg/kg的剂量。
在一个实施方案中，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒5.0×1013vg/kg的剂量等效于基于作为定量标准的线性化DNA或质粒1.85×1013vg/kg的剂量。在另一实施方案中，基于超螺旋DNA或质粒2.0×1014vg/kg的剂量等效于基于作为定量标准的线性化DNA或质粒 7.41×1013vg/kg的剂量。因此，在另一实施方案中，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg。
施用有效剂量的组合物可通过本领域标准的途径，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、口服、口腔、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到感染和/或正在医治的疾病状态和要表达α-肌聚糖的一个或多个靶细胞/组织，本领域技术人员可选择和/或匹配本发明的 rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的一种或多种施用途径和一种或多种血清型。
本发明提供有效剂量的rAAV和本发明组合物的局部施用和全身性施用。举例来说，全身性施用是施用到循环系统，使得整个身体受到影响。全身性施用包括肠内施用，例如通过肠道吸收和通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。
特别地，本发明的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来实现。根据本发明，施用包括但不限于注射到肌肉、血流和/或直接注射到肝脏中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲溶液中已经被证明足以提供用于肌肉组织表达的媒介物，并且对可以与rAAV共同施用的载体或其它组分没有已知的限制(尽管通常应该避免降解DNA的组合物与rAAV使用)。可修饰rAAV的衣壳蛋白，使得rAAV靶向感兴趣的特定靶组织，例如肌肉。参见，例如，WO 02/053703，其公开内容以引用的方式并入本文中。
药物组合物可制备成可通过透皮转运递送至肌肉的注射配方或局部配方。许多用于肌内注射和透皮转运两者的配方先前已经被开发，并且可用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载剂一起使用，以便于施用和处理。因此，在另一方面，本申请涉及一种配方，其包含含有AAVrh74衍生衣壳的rAAV、缓冲剂、离子强度剂和表面活性剂。在一个实施方案中，rAAV的浓度为约1.0×1012vg/kg至约5.0×1014vg/kg。在一个实施方案中，rAAV 的浓度为约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg。在另一个实施方案中，rAAV的浓度为约5×1013 vg/kg、约1×1014vg/kg和/或约2×1014vg/kg。在一个实施方案中，剂量基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒。在一个实施方案中，rAAV是scAAVrh74.tMCK.hSGCA载体。在一个实施方案中，缓冲剂包含tris、tricine、Bis-tricine、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和 CAPS中的一种或多种。在另一实施方案中，缓冲剂包含浓度为约5mM至约40mM的具有 pH8.0的tris。在一个实施方案中，缓冲剂包含为约20mM的具有pH 8.0的tris。在一个实施方案中，离子强度剂包含氯化钾(KCl)、乙酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵(NH4Cl)、乙酸铵、氯化镁(MgCl2)、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰(MnCl2)、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠 (NaCl)、乙酸钠、氯化锂(LiCl)和乙酸锂中的一种或多种。在一个实施方案中，离子强度剂包含浓度为约0.2mM至约4mM的MgCl2。在另一实施方案中，离子强度剂包含浓度为约 50mM至约500mM的NaCl。在另一实施方案中，离子强度剂包含浓度为约0.2mM至约4 mM的MgCl2和浓度为约50mM至约500mM的NaCl。在另一实施方案中，离子强度剂包含浓度为约1mM的MgCl2和浓度为约200mM的NaCl。在一个实施方案中，表面活性剂包含磺酸盐、硫酸盐、膦酸盐、磷酸盐、泊洛沙姆(Poloxamer)和阳离子表面活性剂中的一种或多种。在一个实施方案中，泊洛沙姆包括泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407中的一种或多种。在一个实施方案中，表面活性剂包含浓度为约0.00001％至约1％的泊洛沙姆。在另一实施方案中，表面活性剂包含浓度为约0.001％的泊洛沙姆188。为了肌内注射的目的，可采用佐剂，例如芝麻油或花生油或丙二醇水溶液，以及无菌水溶液。如果期望，那么可缓冲这类水溶液，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。作为游离酸的rAAV溶液(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐可在适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合的水中制备。还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备rAAV的分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。在这方面，采用的无菌含水介质都可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，以便存在易于注射的程度。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。举例来说，通过使用例如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。
根据需要，通过将rAAV以所需量掺入带有上面列举的各种其它成分的适当溶剂中来制备无菌可注射溶液，然后过滤灭菌。通常，通过将灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。
用rAAV转导也可在体外进行。在一个实施方案中，从受试者中取出期望的靶肌肉细胞，用rAAV转导并且重新引入受试者。或者，可使用同基因或异基因肌肉细胞，其中这些细胞将不在受试者中产生不适当的免疫应答。
用于将转导细胞转导和重新引入受试者的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，可通过将rAAV与肌肉细胞组合(例如在适当的培养基中)体外转导细胞，并且使用常规技术(例如Southern印迹和/或PCR)，或通过使用选择标记物来筛选具有感兴趣的DNA的那些细胞。然后可将转导的细胞配制成药物组合物，并且通过各种技术将组合物引入受试者，例如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，或通过使用例如导管来注射到平滑肌和心肌中。
用本发明的rAAV转导细胞引起α-肌聚糖的持续表达。因此，本发明提供了向哺乳动物受试者(优选人类)施用/递送表达α-肌聚糖的rAAV的方法。这些方法包括用一种或多种本发明的rAAV转导组织(包括但不限于例如肌肉的组织、例如肝脏和脑的器官，以及例如唾液腺的腺体)。转导可用包含组织特异性控制元件的基因盒进行。例如，本发明的一个实施方案提供了转导由肌特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述控制元件包括但不限于衍生自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族，例如衍生自myoD基因家族的控制元件[参见 Weintraub等人,《科学(Science)，251:761-766(1991)]；肌细胞特异性增强子结合因子MEF- 2[Cserjesi和Olson,《分子细胞生物学》11:4854-4862(1991)]；衍生自人类骨骼肌动蛋白基因[Muscat等人,《分子细胞生物学》,7:4089-4099(1987)]；心肌肌动蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人，《分子细胞生物学》,9:3393-3399(1989)]和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件；衍生自骨骼快速颤搐肌钙蛋白C基因、慢速颤搐心肌肌钙蛋白 C基因和慢速颤搐肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导的核因子(Semenza等人，《美国国家科学院院刊》，88:5680-5684(1991))；类固醇诱导的包括糖皮质激素应答元件(GRE) 的元件和启动子(参见Mader和White,《美国国家科学院院刊》90:5603-5607(1993))；以及其它控制元件。
肌肉组织是体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为其不是至关重要的器官并且易于接近。本发明考虑了从转导的肌纤维中持续表达miRNA。
“肌肉细胞”或“肌肉组织”是指源自任何种类的肌肉的细胞或细胞群(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)。这类肌肉细胞可为分化的或未分化的，例如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。
术语“转导”用于指经由所述复制缺陷型rAAV将目的多核苷酸(例如，编码α-肌聚糖的多核苷酸序列)体内或体外施用/递送至受体细胞，从而导致受体细胞表达α-肌聚糖。
因此，本文还描述了向有需要的哺乳动物受试者施用有效剂量(或基本上同时施用的多个剂量或间隔给予的多个剂量)的编码α-肌聚糖的rAAV的方法。
本文提及的所有出版物和专利均特此通过引用整体并入，就好像每个单独的出版物或专利被明确地和单独地指示为通过引用并入一样。在发生冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。所描述的数值范围包括每个范围内的每个整数值，并且包括最低和最高的所述整数。
在以下实施例中进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
使用AAVrh74.tMCK.hSCGA的临床前研究在国际专利公开第WO 2013/078316号和美国专利第9,434,928号和第10,105,453号中进行了描述，其通过引用整体并入本文。
实施例1
材料与方法
动物模型
所有程序均由全国儿童医院机构动物护理和使用委员会的研究机构批准。在全国儿童医院研究所的动物资源核心的标准化条件下，将基因敲除(sgca-/-)小鼠作为纯合动物饲养和维持。将小鼠在Teklad Global Rodent Diet(3.8％纤维、18.8％蛋白质、5％脂肪饲料)中维持12:12 小时的暗:光循环。将所有动物均饲养在标准小鼠笼中，随意进食和饮水。
基因分型
DNA基因分型用于鉴定sgca-/-小鼠。使用OneTaq DNA聚合酶(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Ipswich,MA))通过聚合酶链式反应(PCR)分离和分析来自剪尾的DNA。在PCR分析中使用一系列引物来确定α-SG基因敲除状态。使用以下引物和条件：内含子1(CAGGGCTGGGAGCTGGGTTCTG；SEQ ID NO:9)；突变引物 -内含子3(CCCAGGGCCTTGATGCCT；SEQ ID NO:10)；和NEOTR (GCTATCAGGACATAGCGTTGGCTA；SEQ IDNO:11)。在以下条件下对基因组DNA进行30个循环的反应：94℃，5min；94℃，1min；64℃，1min；72℃，2.5min；和72℃，7 min。
α-SG基因构建
使用腺相关病毒(AAV)载体DNA质粒pAAV.tMCK.aSG-neo通过将驱动密码子优化的人类α-SG cDNA序列(人类cDNA，基因库登录号U08895)的tMCK表达盒插入自互补载体主链pHpa7中制成scAAVrh74.tMCK.hSGCA转基因盒。包括于载体中的唯一病毒序列是 AAV2的反向末端重复序列，其是rAAV载体基因组的病毒DNA复制和包装所必需的。反向末端重复序列(ITR)中的一个具有末端解析位点(TRS)的靶向缺少，以限制来自这个IT的 R复制，从而促进产生用于自互补载体包装的二聚体复制形式。AAVrh74病毒已在小鼠、非人类灵长类动物(NHP)和人类中被证明在跨血管屏障转导肌肉方面是安全和高效的。
载体生产
通过三重转染制备重组AAV，(sc)rAAVrh74.tMCK.hSGCA。利用Prism 7500FastTaqman 检测器系统(PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems))使用基于qPCR的滴定方法来确定囊封的vg滴度。构建体包含促进高水平表达的嵌合内含子。嵌合内含子由人类β-珠蛋白基因的第一个内含子的5'供体位点和免疫球蛋白基因重链可变区的前导序列与主体之间的内含子的分支点和3'剪接受体位点构成。rAAV还包含用于有效转录终止的合成的SV40多腺苷酸化信号，。表达盒的示意图示于以下图1中。载体使用人类α-肌聚糖(α-SG)基因产生，所述基因两侧是AAV2 ITR序列并囊封在AAVrh74病毒粒子中。构建体含有tMCK立即早期启动子/增强子(基因库登录号M21390)，并使用β-珠蛋白内含子进行高水平表达。
基因递送
通过将载体注射到sgca-/-小鼠的尾静脉中来实现小鼠的全身性递送。使用30号超细胰岛素注射器使小鼠注射有1×1012vg、3×1012vg或6×1012vg总剂量(小鼠范围为13-20g；5×1013 vg/kg、1×1014vg/kg和2×1014vg/kg——剂量基于在作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，分别基于20-g小鼠)的稀释在200至250μL体积的乳酸林格溶液中的scAAVrh74.tMCK.hSGCA。所有治疗的小鼠在4至5周龄时注射，并且在注射后12周实施安乐死。在另一实施方案中，基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，剂量为约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg。
血清肌酸激酶测量
在野生型C57BL/6小鼠(n＝6)、媒介物(乳酸林格溶液)治疗的sgca-/-小鼠(n＝6)和scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗sgca-/-的小鼠(n＝6只/剂)的血清中，使用肌酸激酶SL分析和相应制造商的方案(积水诊断(Sekisui Diagnostics)；加拿大安大略省夏洛特敦)(目录号326-10)测量肌酸激酶的水平。简而言之，将25μL血清与1mL工作试剂混合并添加到比色皿中。在分光光度计上设置动力学测定，在180秒内每30秒测量340nm处的吸光度。使用吸光度读数和下列公式计算肌酸激酶水平：
U/L＝[ΔAbs./min)*1.025*1000]/[1*6.22*0.025]＝(ΔAbs./min)*6592。
用于功能评估的隔膜强直收缩
将小鼠安乐死，解剖隔膜(DIA)，肋骨附件和中央肌腱保持完整，并置于K-H缓冲液中。分离出2-4mm宽的DIA切片。在中央肌腱处用编织的手术丝(6/0；舜科医疗器械(Surgical Specialties)，宾夕法尼亚州雷丁)牢固地系住DIA条带，并且通过固定在条带远端的一部分肋骨缝合。将每块肌肉转移到充满氧合KH溶液的水浴中，水浴温度保持处于37℃。将肌肉水平排列并直接系在固定销和双模式力传感器-伺服电机(305C；奥罗拉科学公司(Aurora Scientific)，加拿大安大略省奥罗拉市奥罗拉)之间。将两个铂板电极放置在器官浴中，以便侧接肌肉长度的侧面。将肌肉拉伸到最佳长度以测量抽搐收缩，然后在开始强直方案之前让其休息10分钟。一旦肌肉稳定，将其设置为1g的最佳长度并进行热身，其由每30秒3次 1-Hz抽搐，然后每分钟3次150-Hz抽搐组成。在休息3-min之后，以20、50、80、120、150、 180Hz的频率刺激DIA，每次刺激之间有2-min的休息时间，每次刺激的持续时间为250ms，以确定最大强直力。测量肌肉长度和重量。力针对肌肉重量和长度进行标准化。
用于功能评估的胫骨前肌(TA)强直收缩
TA评估程序遵循列于Hakim等人,《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》；709:75–89 (2011)中的方案。使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(分别为100mg/kg和10mg/kg)通过腹腔麻醉小鼠。在解剖镜下，去除后肢皮肤以暴露TA肌肉和髌骨。用4-0缝合线在髌腱周围系一个双平结。然后解剖出TA远端肌腱，并用4-0缝合线在肌腱周围系一个双平结，尽可能靠近肌肉，然后切断肌腱。暴露的肌肉不断用盐水沾湿。然后将小鼠转移到热控平台并保持处于37℃。用髌腱缝合线将膝盖固定到金属销上，并且将远端TA肌腱缝合到力传感器的水平臂(奥罗拉科学公司(Aurora Scientific)，加拿大奥罗拉)。在坐骨神经附近放置一个电极以对其进行刺激。一旦肌肉稳定，将静息张力设置为抽动收缩最大的长度(最佳长度)。在休息3-min之后，以50、100、150和200Hz的频率刺激TA，在每次刺激之间休息1-min。在休息5分钟后，肌肉会进行一系列10次等长收缩，以1-min间隔进行10％的拉伸-再延长程序。学在离心收缩之后，然后使小鼠安乐死，并且将TA肌肉解剖、称重并冷冻用于组织学。
免疫荧光
对来自TA、腓肠肌(GAS)、四头肌(QD)、腰大肌(PSOAS)、臀肌(GLUT)、三头肌(TRI)、DIA和心脏(HRT)肌肉的冷冻切片(12-μm厚)进行用于hSGCA转基因的免疫荧光染色。将切片以1:100的稀释度与兔单克隆α-SG一抗(艾博抗(Abcam)；英国剑桥；目录号ab189254)一起孵育。使用Zeiss(德国)AxioCam MRC5相机拍摄覆盖肌肉切片的四个不同象限的四张随机20x图像。确定每幅图像对α-SG染色呈阳性的纤维与对照相比的百分比，并且对每块肌肉取平均值。阳性α-SG纤维表达被定义为具有比媒介物治疗的sgca- /-对照更亮的至少30％的纤维染色。
蛋白质印迹分析
来自野生型C57BL/6小鼠、媒介物治疗的sgca-/-小鼠和载体给药的sgca-/-小鼠的样品用于每个蛋白质印迹。1:10,000稀释的兔单克隆α-SG抗体(艾博抗，目录号ab189254)和1:5,000 稀释的小鼠单克隆α-肌动蛋白抗体(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，目录号A7811)用于hSGCA印迹。还使用了1:1,000稀释的兔单克隆小鼠纽蛋白抗体(英杰公司(Invitrogen)，目录号70062)。抗小鼠(密理博(Millipore)，目录号AP308P)和抗兔(生命科技(Life Technologies)，目录号656120)二级辣根过氧化物酶抗体用于增强的化学发光免疫检测。使用ImageQuantTL 1D 8.1.0(通用电气医疗生命科学公司(GEHealthcare Life Sciences))通过光密度测定法进行蛋白质印迹定量。
形态分析
对来自16至17周大的野生型C57BL/6小鼠(n＝6)、媒介物治疗的sgca-/-小鼠(n＝6) 和scAAVrh74.tMCK.hSGCA 16至17周大的治疗的sgca-/-小鼠(n＝6只/剂)的肌肉的12-μm 厚冷冻切片进行苏木精和伊红(H&E)染色以用于分析。在TA、GAS、QD、GLUT、PSOAS 和TRI中测定具有中央核的肌纤维的百分比。此外，还测量了TA、GAS、QD、TRI和PSOAS 肌肉中的肌纤维直径。使用Zeiss AxioCam MRC5相机拍摄每只动物每块肌肉的四张随机20x 图像。使用国立卫生研究院的Health’s ImageJ软件定量中央成核纤维，并且使用ZeissAxiovision LE4软件测量纤维直径。
生物分布定量聚合酶链反应(PCR)分析
如前所述，进行Taqman定量PCR以定量存在于靶向和非靶向对侧肌肉以及非靶向器官中的载体基因组拷贝数。载体特异性引物探针组用于扩增直接位于tMCK启动子下游的内含子区域的序列，所述tMCK启动子是独特的并且位于scAAVrh.74.tMCK.hSGCA转基因盒内。本研究中使用了以下引物和探针：tMCK内含子正向引物5′-ACC CGA GAT GCC TGG TTATAA TT-3′；tMCK内含子反向引物5′-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3′；和tMCK 内含子探针5′-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C-IABkFQ-3’(集成DNA技术(Integrated DNA Technologies))。拷贝数报告为每微克基因组DNA的载体基因组。
天狼星红染色和胶原蛋白定量
进行天狼星红染色以确定肌肉组织中胶原蛋白沉积的水平。对来自16至17周大的野生型C57BL/6(n＝6)、媒介物治疗的sgca-/-(n＝6)和scAAVrh74.tMCK.hSGCA 16至17周大的治疗的sgca-/-(n＝6只/剂)GLUT、PSOAS、TRI和DIA肌肉的12-μm冷冻切片进行染色。每只小鼠每块肌肉拍摄四张20x图像，并且使用ImageJ软件程序确定胶原蛋白沉积的量。计算所有组的每块肌肉的平均胶原蛋白百分比。
开放场笼活动的激光监测
使用开放场活动室来确定实验小鼠的整体活动。对来自野生型C57BL/6(n＝6)和未治疗的sgca-/-(n＝6)对照的16至17周大的小鼠以及scAAVrh74.tMCK.hSGCA 16至17周大的治疗的sgca-/-小鼠(n＝6只/剂)进行分析。在临近小鼠最活跃的夜间周期结束时的清晨，在一天的同一时间对所有小鼠进行测试。所有小鼠均在隔离的房间里，在昏暗的灯光下进行测试，其中每次使用相同的处理程序。此外，为了减少焦虑并将可能影响小鼠正常活动并因此影响测定结果的行为变量保持在最低限度，我们测试未单独饲养的小鼠。使用Photobeam活动系统(圣地亚哥仪器公司(San Diego Instruments)，加利福尼亚州圣地亚哥)监测小鼠活动。此系统使用不可见的红外光束的网格，所述光束从前到后且从左到右穿过动物室，以监测小鼠在x-y-z平面内的位置和移动。以5-min间隔记录活动持续1小时周期。在开始数据采集前几天，使小鼠适应活动测试室最初的1小时训练。在单个室中测试小鼠，每组四只。在每次使用之间清洁测试设备，以减少可能改变结果的小鼠反动行为变量。将数据转换成Microsoft Excel工作表，并且在Excel程序中完成所有计算。将每只小鼠在x和y平面中移动的单个波束中断相加以表示1小时时间间隔内的总行走，并且将z平面中的波束中断相加以获得垂直活动。
安全性研究
血液学
从心脏穿刺中取出全血以用于血液化学。将血液收集在血清分离管中并以15,000rpm离心10min。将血清收集、冷冻并送到查尔斯河实验室(Charles River Laboratory)以进行化学测试。在血液学分析中优先考虑肝酶和葡萄糖化学。
组织病理学
尸检时，将肌肉新鲜冷冻在液氮冷却的甲基丁烷中；收获所有其它器官并用福尔马林固定并包埋在石蜡中。治疗后，组织用H&E染色，载玻片和所有组织都被送到GEMPath公司以供由兽医病理学家进行正式审查。
统计分析
除非另有说明，否则数据表示为平均值±SEM(误差条)，并且使用单向ANOVA与使用GraphPad Prism 5(格拉夫帕徳软件(GraphPad Software)，加利福尼亚州拉由拉市)通过图基氏事后分析测试评估的组之间的多重比较进行分析。
实施例2
全身性递送scAAVrh74.tMCK.hSGCA的效率
开始了一项小型试点研究，以观察通过以1×1012vg总剂量(5×1013vg/kg，基于20-g小鼠，n＝4)静脉注射到sgca-/-小鼠的侧尾静脉中进行基因递送的功效。在基因转移后4周对收获的肌肉进行免疫荧光分析。七种不同肢体骨骼肌中hSGCA转基因的表达量：TA、GAS、GLUT、QD、PSOAS和TRI和DIA。当通过免疫荧光分析时，缺乏α-SG的小鼠显示完全不存在蛋白质(图2A；TA、GAS、TRI和DIA的代表性图像)。1×1012vg总剂量的治疗剂量导致在基因递送后4周，所有骨骼肌(包括DIA)中平均54±23.81％的载体转导。
全身性递送至sgca-/-小鼠的scAAVrh74.tMCK.hSGCA的剂量递增研究
为了确定最安全和最有效的剂量，在剂量递增研究中研究了三种不同剂量载体的递送，其中4周大的sgca-/-小鼠的侧尾静脉用1×1012vg总剂量(5×1013vg/kg)、3×1012vg总剂量 (1×1014vg/kg)或6×1012vg总剂量(2×1014vg/kg)的scAAVrh74.tMCK.hSGCA进行治疗。在基因递送后12周对将小鼠安乐死，以使用免疫荧光评估TA、GAS、QD、GLUT、PSOAS、TRI、DIA和HRT肌肉中的hSGCA转基因表达。用1×1012vg总剂量(5×1013vg/kg)的最低剂量治疗的小鼠中的平均hSGCA表达在骨骼肌(包括DIA)中为70.07±3.71％。用3×1012vg总剂量(1×1014vg/kg)的中间剂量治疗的小鼠中的平均hSGCA表达在所有骨骼肌中为 85.35±2.36％。用6×1012vg总剂量(2×1014vg/kg)的最高剂量治疗的小鼠中的平均hSGCA表达在所有骨骼肌中为93.86±2.02％。为清楚起见，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒计算剂量。HRT肌肉中的hSGCA表达保持在75％，与剂量无关。组织的代表性图像显示在图 2A中。稳定的hSGCA表达显示了所有三种剂量的基因递送效果。基因递送靶向前肢和后肢的多块肌肉，在所有三种剂量下在小鼠中显示异常的α-SG表达。最重要的是，重要的隔膜肌肉在递送之后也显示α-SG基因表达。图2B中所示的蛋白质印迹证实了治疗小鼠的所有三个给药组的所有肌肉中的蛋白质表达。小鼠心肌在治疗之后也显示α-SG表达。
缺乏α-SG蛋白的人类和小鼠的组织病理学特征包括中央成核、纤维尺寸分布不规则、坏死和纤维化。H&E染色用于观察肌肉形态，包括纤维尺寸和中央成核(图3)。如图3A和3B所示，与媒介物治疗的sgca-/-对照相比，在scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的sgca-/-小鼠的TA、QD和TRI中观察到纤维尺寸分布的正常化，类似于在野生型对照中所观察到的。与媒介物治疗的sgca-/-对照小鼠相比，纤维平均直径尺寸在所有剂量下在TA、QD和TRI肌肉中均显著增加(表1)。
表1
Figure BDA0003608237030000391
*＝p<0.05,****＝p<0,0。缩写：TA，胫骨前肌，AD：四头肌；和TRI，三头肌。最低剂量： 1.0×1012vg；中间剂量：3.0×1012vg；最高剂量：6.0×1012vg。
在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的sgca-/-小鼠中，也观察到中央成核的减少。媒介物治疗的sgca-/-小鼠的骨骼肌具有68.72±3.01％的纤维，其核位于中央。在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗后，所有肌肉组织的中央成核的总体值在最低剂量的scAAVrh74.tMCK.hSGCA下降低，导致55.60±3.25％的骨骼肌纤维显示位于中央的核(表2)。
表2
Figure BDA0003608237030000401
****＝p<0.0001。缩写：TA，胫骨前肌；GAS，腓肠肌；QD，四头肌；GLUT，臀肌；PSO，腰大肌；AVG，平均值；和TRI，三头肌。
用中等剂量治疗的小鼠具有61.85±4.00％的具有集中的核的肌纤维，而用最高剂量治疗的肌纤维的成核降低至37.93±12.46％(图3C)。
其中组织由胶原蛋白克服的纤维化通常发生在LGMD患者的肌肉中，导致疤痕组织的形成。使用天狼星红染色评估纤维化，以检测胶原蛋白I和III含量，作为纤维化的标记物。如图4中所示，在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗之后，在sgca-/-小鼠中观察到红色染色的稳定减少。定量显示，与媒介物治疗的sgca-/-对照小鼠相比，scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗的 sgca-/-小鼠中所有肌肉的胶原蛋白含量显著降低(图4B)。总之，这些数据证明了hSGCA转基因的成功全身性递送，如肌肉组织中的稳定表达和sgca-/-小鼠中与α-SG蛋白缺乏相关的组织病理学特征的改善所指示。
实施例3
scAAVrh74.tMCK.hSGCA rAAV改善隔膜和胫骨前肌功能并增加运动能力
由于近端肌肉无力和功能丧失是LGMD2D的主要症状，而呼吸衰竭是LGMD2D死亡的主要原因，因此改善TA和DIA的功能和强度对于增加LGMD2D受试者的寿命和生活质量至关重要。DIA和整个TA肌肉的条带用于确认hSGCA表达与肌肉力量之间的相关性。如图 5A和5B所示，与野生型小鼠相比，在未治疗的sgca-/-小鼠的TA和DIA肌肉中的比力中鉴定出比力和对收缩诱导损伤的抵抗力的不足。
与野生型小鼠相比，sgca-/-小鼠的TA肌肉在比力输出减少方面表现出44％的显著功能缺陷(分别161.6±8.20mN/mm2与291.7±6.17mN/mm2；p<0.0001)；以及在严格的离心收缩方案后产生的力损失更大(sgca-/-小鼠损失44.0±6.0％；野生型小鼠损失18.0±1.0％；p<0.0001) (图5A)。尾静脉递送后十二周，申请人注意到在用低、中等和高剂量的scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗之后，比力输出的显著提高，其分别增加到218±11.94mN/mm2、227±11.7mN/mm2和255±11.7mN/mm2。与媒介物治疗的sgca-/-小鼠相比，离心收缩方案后对损伤的抵抗力也得到提高，其中低、中等和高剂量治疗的小鼠分别仅损失22.0±4.0％、22.0±3.0％和12.0为±1.0％(与媒介物治疗的sgca-/-小鼠相比，p<0.0001)(图5A)。
在媒介物治疗的sgca-/-小鼠的DIA中，与野生型小鼠相比，产生的比力显示出41％的强度降低(131.5±12.07mN/mm2与223.8±15.85mN/mm2)。在所有三个剂量下在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗后观察到力的改善，其中低剂量小鼠的DIA的比力增加到179.2±21.03mN/mm2，在中等剂量小鼠中增加到201.2±22.94mN/mm2并且在高剂量小鼠中增加到261.46±9.73mN/mm2(图65B)。这些数据显示，sgca-/--小鼠中的TA和DIA肌肉的力量不足，并且比野生型小鼠更快地耗尽。然而，在递送scAAVrh74.tMCK.hSGCA之后，实现了功能恢复。
LGMD2D的其它症状包括运动不耐受以及活动和行走减少，可能是由于肌肉损伤，导致疼痛和肌肉疲劳。为了评估身体活动的水平，sgca-/-和野生型C57BL/6小鼠接受了类似于以前报告中使用的开放场活动方案。监测小鼠的行走相关活动以确定与野生型小鼠相比，sgca-/-小鼠中缺乏α-SG是否导致行走减少。图5C中的图表描绘了与野生型对照相比，sgca-/-小鼠模型中的行走和垂直直立的减少。在sgca-/-小鼠中记录的平均水平移动束断裂为2000±159束断裂/小时，与野生型对照中的8911±1193束断裂/小时相比，移动减少了77.5％。在sgca-/-小鼠中记录的平均垂直直立束断裂为24.75±11.47束断裂/小时，与野生型小鼠的803.3±55.03束断裂/小时相比，垂直直立减少了97％。在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗之后，小鼠的行走和垂直直立活动在基因递送后12周增加。平均水平行走在用1×1012vg总剂量治疗的小鼠中增加至3595±55.03束断裂/小时，在用3×1012vg总剂量治疗的小鼠中增加至5238±861.9束断裂/小时，在用6×1012vg总剂量治疗的小鼠中增加至6487±467.9束断裂/小时。平均垂直直立活动在用1×1012vg总剂量治疗的小鼠中增加至377±146.1束断裂/小时，在用3×1012vg总剂量治疗的小鼠中增加至321±126.1束断裂/小时，在用6×1012vg总剂量治疗的小鼠中增加至 448.8±53.43束断裂/小时(图5C)。与媒介物治疗的sgca-/-小鼠相比，治疗小鼠的身体活动表现出44％-69％的步行和92％-94％的垂直直立的改善。此外，与未治疗的小鼠相比，血清肌酸激酶水平在所有治疗组中显著降低(图5D)。总之，这些数据显示，α-SG的递送恢复身体活动并防止sgca-/-小鼠的肌肉分解。
scAAVrh74.tMCK.hSGCA的安全性和生物分布分析
作为安全措施，对载体给药的sgca-/-和野生型小鼠进行血液化学和血液学研究。所有值均在小鼠的正常参考范围内(图6)。此外，将来自scAAVrh74.tMCK.hSGCA给药的sgca-/-和野生型小鼠的用H&E染色的所有肌肉和器官的组织切片送至兽医病理学家以进行正式审查。在来自scAAVrh74.tMCK.hSGCA给药的sgca-/-和野生型小鼠中的任一种中的任何样品中均未发现不良作用。除了功效之外，这些数据证明，所有三种剂量的scAAVrh74.tMCK.hSGCA 的全身性递送对sgca-/-和野生型小鼠良好耐受、安全并无毒。
为了测试递送scAAVrh74.tMCK.hSGCA的潜在毒性或安全性问题，进行载体生物分布定量PCR以定量载体基因组存在(图7A)。载体特异性tMCK.hSGCA引物探针组用于检测从scAAVrh74.tMCK/hSGCA给药的sgca-/-小鼠测试的所有肌肉和器官中的载体基因组。如所预期，载体基因组存在于所测试的组织中，肝脏中的拷贝数最高，其次是肌肉。WT和用媒介物(sgca-/-LR)或scAArh74.tMCK.hSGCA治疗的sgca-/-小鼠肝脏中α-肌聚糖蛋白的蛋白质印迹显示于图7B中。
为了提高α-SG表达的效率，在一个实施方案中，将hSGCA cDNA序列包装到自互补载体中。自互补AAV载体包含可促进dsDNA形成的反向重复基因组，从而允许复制和转录发生，而不需要多个载体基因组来促进这些过程。因此，使用自互补载体消除了限速步骤，以允许更快速地表达转基因。申请人已表明，在LGMD2D患者中血管内递送scAAVrh74.tMCK.hSGCA与1×1012和3×1012剂量的基因转移后180天的α-SG表达增加相关。
与媒介物治疗的对照相比，scAAVrh74.tMCK.hSGCA的静脉内递送在所有三个载体治疗组中为肌肉提供了增强的力量和对收缩诱导的胫骨前肌和隔膜肌肉中的损伤的抵抗力。此外，用scAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗导致CK显著降低。此外，在用scAAVrh74.tMCK.hSGCA 治疗之后，与媒介物治疗的小鼠相比，小鼠能够更频繁地走动并靠在后肢上。
通常通过对患有LGMD2D的患者进行肌肉活检观察到包括位于中央的核、纤维尺寸的广泛可变性、炎症、坏死和纤维化的显著的组织病理学。在hSGCA递送之后，小鼠的CN减少，肌纤维尺寸分布更均匀，并且胶原蛋白含量减少，以及与媒介物治疗的小鼠相比，肌肉具有整体更健康的外观。组织病理学和瘢痕组织的总体减少伴随着载体治疗的小鼠的肌肉的总体正常功能和生理学的改善。
最后，通过定量PCR、血清化学分析和组织病理学进行的安全性研究没有审查毒性迹象。 tMCK启动子仅在靶向组织(所有肌肉)中检测到并在除肝脏以外的其它(非肌肉)器官中不存在。肝脏中的tMCK检测并不少见或令人担忧，因为其是一种清除器官。由经过认证的兽医病理学家对所有组织(包括肝脏)进行组织病理学审查得出结论，scAAVrh74.tMCK.hSGCA 的全身递送不仅在所有组织中都是安全的，而且基因递送明显减少了在媒介物治疗的sgca-/-小鼠的骨骼肌中发现的营养不良病理学的量。对载体治疗的小鼠的血液样本进行的化学分析也支持缺乏毒性。
如在本公开中，剂量递增研究提供临床前数据，以支持此处系统测试的最低剂量，即1×10 12vg总量(5×1013vg/kg)足以减少与α-SG蛋白损失相关的体征和症状。在测试的最低剂量下，在载体治疗的小鼠中观察到所有肌肉的功能改善，如力量和运动行为(行走和直立)的增加所证明。即使在6×1012vg总量(2×1014vg/kg)的最高递送剂量下，安全性研究显示没有毒性迹象。
实施例4
老年患者和耐久性
rAAVrh74.tMCK.hSGCA介导的基因置换在治疗LGMD-2D和其它相关疾病方面显示出积极的结果。本研究被设计用于测试rAAVrh74.tMCK.hSGCA治疗老年的更严重受影响的肌肉的能力，并且确定AAV病毒载体的长期耐久性。
所有程序都按照全国儿童医院机构动物护理和使用委员会的研究机构(ResearchInstitute at the Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care andUse Committee)的批准进行。将小鼠在标准条件下维持12:12小时的光照:黑暗循环，随意提供食物和水。首先，将 rAAVrh74.tMCK.hSGCA通过尾静脉注射以三种剂量(1.0×1012、3.0×1012和6.0×1012vg)全身施用于表现出严重肌肉组织病理学的12个月大的sgca-/-小鼠(n＝5)。对照包括注射乳酸林格溶液(LRS)的sgca-/-小鼠(n＝5)和注射LRS的BL6野生型小鼠(n＝4)。在治疗后 6个月的终点，评估来自治疗小鼠的肌肉的SCGA蛋白表达、组织学拯救和功能改善。与对照相比，所有三种剂量均显示肌膜处α-SG的稳定蛋白表达、增加的组织病理学、增加的自主活动和比力产生、防止离心力损失以及降低的血清CK。未检测到载体毒性。在老年小鼠中，治疗导致肌肉中广泛的高水平蛋白质表达，减少纤维化，并且增加胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力。
特别是，对12个月大的sgca-/-小鼠IV注射rAAVrh74.tMCK.hSGCA导致整个下肢、上肢和躯干近端肌肉(包括隔膜和心脏)的肌肉中广泛的高水平蛋白质表达(图8)。
在施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA之后观察到肌肉病理学的总体改善(图9a)和中央成核的减少。此外，在施用后，平均纤维尺寸增加到与腓肠肌(GAS)和三头肌(TRI)肌肉中WT纤维水平相似的水平(图9b)。
胶原蛋白沉积的水平被定量作为纤维化的量度。与未治疗的对照相比，施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA导致纤维化水平降低(图9c)。施用scAAVrh74.tMCK.hSGCA之后的功能改善通过改善胫骨前肌(TA)和隔膜(DIA)肌肉中的力输出(比力)以及增加对 TA肌肉中收缩诱导损伤的抵抗力来证明(图10)。
为了进一步研究基因治疗的长期耐久性，对4周大的sgca-/-小鼠进行全身性施用rAAVrh74.tMCK.hSGCA。治疗后超过24个月，通过qPCR在所有测试的转导肌肉(TA、TRI、DIA、GLUT、PSOAS、GAS和QUAD)中检测载体基因组拷贝数。通过治疗肌肉的免疫荧光染色来研究蛋白质表达和定位。
虽然已根据具体实施方案描述了本公开，但应理解，所属领域的技术人员将想到变化和修改。因此，只有在权利要求中出现的这些限定对本公开进行限定。
本申请中提及的所有文献均特此通过引用整体并入。
SEQ ID NO:1
SGCA cDNA密码子优化序列：
ATGGCCGAGACACTGTTCTGGACTCCTCTGCTGGTGGTGCTGCTGGCTGGACTGGGA GATACCGAGGCTCAGCAGACCACACTGCACCCACTGGTGGGCCGGGTGTTCGTGCA CACCCTGGACCATGAGACATTTCTGAGTCTGCCAGAACACGTGGCTGTGCCACCTG CTGTGCATATCACTTACCACGCCCATCTGCAGGGCCATCCTGATCTGCCACGGTGGC TGAGATACACCCAGAGATCACCCCACCATCCTGGATTCCTGTATGGAAGCGCTACC CCAGAGGACAGGGGACTGCAGGTGATCGAAGTGACAGCTTACAACCGCGACAGTTT TGATACTACCAGGCAGCGCCTGGTGCTGGAGATTGGGGATCCAGAAGGACCCCTGC TGCCTTATCAGGCCGAGTTCCTGGTGCGGTCACACGACGCTGAGGAAGTGCTGCCA TCAACACCCGCCAGCAGATTTCTGTCCGCTCTGGGAGGACTGTGGGAGCCAGGAGA ACTGCAGCTGCTGAATGTGACTAGCGCTCTGGATAGGGGAGGAAGGGTGCCACTGC CAATCGAGGGAAGGAAGGAAGGGGTGTACATTAAAGTGGGAAGCGCTTCCCCATT CTCCACCTGCCTGAAGATGGTGGCTTCTCCTGATAGTCACGCTAGGTGCGCTCAGGG ACAGCCACCACTGCTGTCCTGTTATGACACACTGGCCCCCCATTTTCGCGTGGACTG GTGCAACGTGACTCTGGTGGATAAATCTGTGCCTGAGCCAGCTGACGAAGTGCCAA CCCCTGGAGACGGAATCCTGGAGCACGATCCTTTCTTTTGTCCTCCAACAGAAGCCC CAGACAGGGATTTCCTGGTGGACGCTCTGGTGACTCTGCTGGTGCCTCTGCTGGTGG CTCTGCTGCTGACCCTGCTGCTGGCTTATGTGATGTGCTGTCGGAGAGAGGGACGGC TGAAGAGAGACCTGGCCACATCTGATATCCAGATGGTGCACCATTGTACTATTCAC GGCAACACCGAGGAACTGCGCCAGATGGCTGCTTCTAGGGAGGTGCCAAGGCCACT GAGTACACTGCCTATGTTTAATGTGCACACTGGCGAACGGCTGCCCCCTAGAGTGG ATAGCGCCCAGGTGCCACTGATTCTGGACCAGCATTGA
SEQ ID NO:2
人类SGCA蛋白序列：
MAETLFWTPLLVVLLAGLGDTEAQQTTLHPLVGRVFVHTLDHETFLSLPEHVAVPPAV HITYHAHLQGHPDLPRWLRYTQRSPHHPGFLYGSATPEDRGLQVIEVTAYNRDSFDTTR QRLVLEIGDPEGPLLPYQAEFLVRSHDAEEVLPSTPASRFLSALGGLWEPGELQLLNVTS ALDRGGRVPLPIEGRKEGVYIKVGSASPFSTCLKMVASPDSHARCAQGQPPLLSCYDTL APHFRVDWCNVTLVDKSVPEPADEVPTPGDGILEHDPFFCPPTEAPDRDFLVDALVTLL VPLLVALLLTLLLAYVMCCRREGRLKRDLATSDIQMVHHCTIHGNTEELRQMAASREV PRPLSTLPMFNVHTGERLPPRVDSAQVPLILDQH*
SEQ ID NO:3
tMCK启动子序列：
CCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGAT GCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCC TGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGG AGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCACTACGGGTCTAT GCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTA ACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTT ACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCT CTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGACCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGG AGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCT GCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCC TGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGT CCCTGGTCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCT ATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCCCGGGTCAC
SEQ ID NO:4
AAVrh74-tMCK-SGCA：
Figure BDA0003608237030000461
Figure BDA0003608237030000471
SEQ ID NO:5
5’ITR
CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC CCGGGCGTCG GGCGACCTTTGGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG GAGTGGGGTT
SEQ ID NO:6
3’ITR
CCACTCCCTC TCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGG GCGACCAAAG GTCGCCCGACGCCCGGGCTT TGCCCGGGCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGC
SEQ ID NO:7
PolyA
GGCCGCAAT AAAAGATCTT TATTTTCATT AGATCTGTGT GTTGGTTTTT TGTG
SEQ ID NO:8
Figure BDA0003608237030000481
Figure BDA0003608237030000491
Figure BDA0003608237030000501
Figure BDA0003608237030000511
Figure BDA0003608237030000521
Figure BDA0003608237030000531
<110> 全国儿童医院研究所（Research Institute at Nationwide Children'sHospital）
<120> α-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和
肌营养不良症的治疗
<130> 28335/54625
<150> US 62/889,749
<151> 2019-08-21
<150> US 63/014,934
<151> 2020-04-24
<150> US 63/022,843
<151> 2020-05-11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atggccgaga cactgttctg gactcctctg ctggtggtgc tgctggctgg actgggagat 60
accgaggctc agcagaccac actgcaccca ctggtgggcc gggtgttcgt gcacaccctg 120
gaccatgaga catttctgag tctgccagaa cacgtggctg tgccacctgc tgtgcatatc 180
acttaccacg cccatctgca gggccatcct gatctgccac ggtggctgag atacacccag 240
agatcacccc accatcctgg attcctgtat ggaagcgcta ccccagagga caggggactg 300
caggtgatcg aagtgacagc ttacaaccgc gacagttttg atactaccag gcagcgcctg 360
gtgctggaga ttggggatcc agaaggaccc ctgctgcctt atcaggccga gttcctggtg 420
cggtcacacg acgctgagga agtgctgcca tcaacacccg ccagcagatt tctgtccgct 480
ctgggaggac tgtgggagcc aggagaactg cagctgctga atgtgactag cgctctggat 540
aggggaggaa gggtgccact gccaatcgag ggaaggaagg aaggggtgta cattaaagtg 600
ggaagcgctt ccccattctc cacctgcctg aagatggtgg cttctcctga tagtcacgct 660
aggtgcgctc agggacagcc accactgctg tcctgttatg acacactggc cccccatttt 720
cgcgtggact ggtgcaacgt gactctggtg gataaatctg tgcctgagcc agctgacgaa 780
gtgccaaccc ctggagacgg aatcctggag cacgatcctt tcttttgtcc tccaacagaa 840
gccccagaca gggatttcct ggtggacgct ctggtgactc tgctggtgcc tctgctggtg 900
gctctgctgc tgaccctgct gctggcttat gtgatgtgct gtcggagaga gggacggctg 960
aagagagacc tggccacatc tgatatccag atggtgcacc attgtactat tcacggcaac 1020
accgaggaac tgcgccagat ggctgcttct agggaggtgc caaggccact gagtacactg 1080
cctatgttta atgtgcacac tggcgaacgg ctgcccccta gagtggatag cgcccaggtg 1140
ccactgattc tggaccagca ttga 1164
<210> 2
<211> 387
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Glu Thr Leu Phe Trp Thr Pro Leu Leu Val Val Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly Asp Thr Glu Ala Gln Gln Thr Thr Leu His Pro Leu Val
20 25 30
Gly Arg Val Phe Val His Thr Leu Asp His Glu Thr Phe Leu Ser Leu
35 40 45
Pro Glu His Val Ala Val Pro Pro Ala Val His Ile Thr Tyr His Ala
50 55 60
His Leu Gln Gly His Pro Asp Leu Pro Arg Trp Leu Arg Tyr Thr Gln
65 70 75 80
Arg Ser Pro His His Pro Gly Phe Leu Tyr Gly Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Asp Arg Gly Leu Gln Val Ile Glu Val Thr Ala Tyr Asn Arg Asp Ser
100 105 110
Phe Asp Thr Thr Arg Gln Arg Leu Val Leu Glu Ile Gly Asp Pro Glu
115 120 125
Gly Pro Leu Leu Pro Tyr Gln Ala Glu Phe Leu Val Arg Ser His Asp
130 135 140
Ala Glu Glu Val Leu Pro Ser Thr Pro Ala Ser Arg Phe Leu Ser Ala
145 150 155 160
Leu Gly Gly Leu Trp Glu Pro Gly Glu Leu Gln Leu Leu Asn Val Thr
165 170 175
Ser Ala Leu Asp Arg Gly Gly Arg Val Pro Leu Pro Ile Glu Gly Arg
180 185 190
Lys Glu Gly Val Tyr Ile Lys Val Gly Ser Ala Ser Pro Phe Ser Thr
195 200 205
Cys Leu Lys Met Val Ala Ser Pro Asp Ser His Ala Arg Cys Ala Gln
210 215 220
Gly Gln Pro Pro Leu Leu Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Ala Pro His Phe
225 230 235 240
Arg Val Asp Trp Cys Asn Val Thr Leu Val Asp Lys Ser Val Pro Glu
245 250 255
Pro Ala Asp Glu Val Pro Thr Pro Gly Asp Gly Ile Leu Glu His Asp
260 265 270
Pro Phe Phe Cys Pro Pro Thr Glu Ala Pro Asp Arg Asp Phe Leu Val
275 280 285
Asp Ala Leu Val Thr Leu Leu Val Pro Leu Leu Val Ala Leu Leu Leu
290 295 300
Thr Leu Leu Leu Ala Tyr Val Met Cys Cys Arg Arg Glu Gly Arg Leu
305 310 315 320
Lys Arg Asp Leu Ala Thr Ser Asp Ile Gln Met Val His His Cys Thr
325 330 335
Ile His Gly Asn Thr Glu Glu Leu Arg Gln Met Ala Ala Ser Arg Glu
340 345 350
Val Pro Arg Pro Leu Ser Thr Leu Pro Met Phe Asn Val His Thr Gly
355 360 365
Glu Arg Leu Pro Pro Arg Val Asp Ser Ala Gln Val Pro Leu Ile Leu
370 375 380
Asp Gln His
385
<210> 3
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120
gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 180
cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg gtctatgctg cccatgtaag 240
gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc 300
cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta ccccaccccg gtgcctgggt 360
cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg 420
accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc 480
tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 540
gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 600
cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac 660
accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc tgcccccggg tcac 714
<210> 4
<211> 2476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg 120
cggccgcaaa cttgcatgcc ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc 180
tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc 240
aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 300
tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg 360
gtctatgctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 420
taaccccaac acctgctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta 480
ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa 540
aataaccctg tccctggtgg accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc 600
ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc 660
aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 720
tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac 780
agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc 840
tgcccccggg tcacctgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt 900
acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg 960
cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggt 1020
gtccactccc agttcaatta cagcgcgtgg taccaccatg gccgagacac tgttctggac 1080
tcctctgctg gtggtgctgc tggctggact gggagatacc gaggctcagc agaccacact 1140
gcacccactg gtgggccggg tgttcgtgca caccctggac catgagacat ttctgagtct 1200
gccagaacac gtggctgtgc cacctgctgt gcatatcact taccacgccc atctgcaggg 1260
ccatcctgat ctgccacggt ggctgagata cacccagaga tcaccccacc atcctggatt 1320
cctgtatgga agcgctaccc cagaggacag gggactgcag gtgatcgaag tgacagctta 1380
caaccgcgac agttttgata ctaccaggca gcgcctggtg ctggagattg gggatccaga 1440
aggacccctg ctgccttatc aggccgagtt cctggtgcgg tcacacgacg ctgaggaagt 1500
gctgccatca acacccgcca gcagatttct gtccgctctg ggaggactgt gggagccagg 1560
agaactgcag ctgctgaatg tgactagcgc tctggatagg ggaggaaggg tgccactgcc 1620
aatcgaggga aggaaggaag gggtgtacat taaagtggga agcgcttccc cattctccac 1680
ctgcctgaag atggtggctt ctcctgatag tcacgctagg tgcgctcagg gacagccacc 1740
actgctgtcc tgttatgaca cactggcccc ccattttcgc gtggactggt gcaacgtgac 1800
tctggtggat aaatctgtgc ctgagccagc tgacgaagtg ccaacccctg gagacggaat 1860
cctggagcac gatcctttct tttgtcctcc aacagaagcc ccagacaggg atttcctggt 1920
ggacgctctg gtgactctgc tggtgcctct gctggtggct ctgctgctga ccctgctgct 1980
ggcttatgtg atgtgctgtc ggagagaggg acggctgaag agagacctgg ccacatctga 2040
tatccagatg gtgcaccatt gtactattca cggcaacacc gaggaactgc gccagatggc 2100
tgcttctagg gaggtgccaa ggccactgag tacactgcct atgtttaatg tgcacactgg 2160
cgaacggctg ccccctagag tggatagcgc ccaggtgcca ctgattctgg accagcattg 2220
aggccgcaat aaaagatctt tattttcatt agatctgtgt gttggttttt tgtgtgtcct 2280
gcaggggcgc gcctctagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta 2340
actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 2400
ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 2460
gcgagcgagc gcgcag 2476
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt 110
<210> 6
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgc 104
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
ggccgcaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt gtg 53
<210> 8
<211> 5749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
atgcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60
acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggggttaacc 120
aattggcggc cgcaaacttg catgccccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc 180
aaggcctggg gacacccgag atgcctggtt ataattaacc ccaacacctg ctgccccccc 240
ccccccaaca cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag 300
gctctgtaca ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatcca 360
ctacgggtct atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 420
tataattaac cccaacacct gctgcccccc cccccccaac acctgctgcc tgagcctgag 480
cggttacccc accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac accatggagg agaagctcgc 540
tctaaaaata accctgtccc tggtggacca ctacgggtct aggctgccca tgtaaggagg 600
caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt tataattaac cccaacacct gctgcccccc 660
ccccccaaca cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag 720
gctctgtaca ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtcctccct 780
ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac ccaggggcac 840
aggggctgcc cccgggtcac ctgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc 900
aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga 960
ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc 1020
acaggtgtcc actcccagtt caattacagc gcgtggtacc accatggccg agacactgtt 1080
ctggactcct ctgctggtgg tgctgctggc tggactggga gataccgagg ctcagcagac 1140
cacactgcac ccactggtgg gccgggtgtt cgtgcacacc ctggaccatg agacatttct 1200
gagtctgcca gaacacgtgg ctgtgccacc tgctgtgcat atcacttacc acgcccatct 1260
gcagggccat cctgatctgc cacggtggct gagatacacc cagagatcac cccaccatcc 1320
tggattcctg tatggaagcg ctaccccaga ggacagggga ctgcaggtga tcgaagtgac 1380
agcttacaac cgcgacagtt ttgatactac caggcagcgc ctggtgctgg agattgggga 1440
tccagaagga cccctgctgc cttatcaggc cgagttcctg gtgcggtcac acgacgctga 1500
ggaagtgctg ccatcaacac ccgccagcag atttctgtcc gctctgggag gactgtggga 1560
gccaggagaa ctgcagctgc tgaatgtgac tagcgctctg gataggggag gaagggtgcc 1620
actgccaatc gagggaagga aggaaggggt gtacattaaa gtgggaagcg cttccccatt 1680
ctccacctgc ctgaagatgg tggcttctcc tgatagtcac gctaggtgcg ctcagggaca 1740
gccaccactg ctgtcctgtt atgacacact ggccccccat tttcgcgtgg actggtgcaa 1800
cgtgactctg gtggataaat ctgtgcctga gccagctgac gaagtgccaa cccctggaga 1860
cggaatcctg gagcacgatc ctttcttttg tcctccaaca gaagccccag acagggattt 1920
cctggtggac gctctggtga ctctgctggt gcctctgctg gtggctctgc tgctgaccct 1980
gctgctggct tatgtgatgt gctgtcggag agagggacgg ctgaagagag acctggccac 2040
atctgatatc cagatggtgc accattgtac tattcacggc aacaccgagg aactgcgcca 2100
gatggctgct tctagggagg tgccaaggcc actgagtaca ctgcctatgt ttaatgtgca 2160
cactggcgaa cggctgcccc ctagagtgga tagcgcccag gtgccactga ttctggacca 2220
gcattgaggc cgcaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 2280
tgtcctgcag gggcgcgcct ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 2340
tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 2400
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 2460
cagtgagcga gcgagcgcgc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 2520
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat 2580
attgttctgg atattaccag caaggccgat agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat 2640
gttattacta atcaaagaag tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt 2700
ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac acttctcagg attctggcgt accgttcctg 2760
tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc 2820
acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 2880
ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 2940
tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc atcttcaaat atgtatccgc 3000
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtcctgagg 3060
cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc 3120
agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc 3180
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat 3240
agtcccgccc ctaactccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 3300
ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 3360
cttttgcaaa gatcgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 3420
gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 3480
aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 3540
ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 3600
ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 3660
aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 3720
accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 3780
ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 3840
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 3900
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 3960
tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 4020
tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 4080
gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 4140
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag 4200
cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt 4260
cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 4320
ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ctagggggag 4380
gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa 4440
aagacagaat aaaaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 4500
ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 4560
cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 4620
gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 4680
cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 4740
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 4800
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 4860
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 4920
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 4980
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 5040
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 5100
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 5160
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 5220
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 5280
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 5340
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 5400
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 5460
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 5520
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 5580
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 5640
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 5700
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatg 5749
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 9
cagggctggg agctgggttc tg 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 10
cccagggcct tgatgcct 18
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 11
gctatcagga catagcgttg gcta 24

Claims (126)

1.一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径并基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约1.0×1012至约5.0×1015的剂量施用。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg或约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5×1013vg/kg、约1×1014vg/kg或约2×1014vg/kg的剂量施用。
5.一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径施用并基于作为定量标准的线性化DNA或质粒以约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg的剂量施用。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用所述rAAV之后增加；其中与施用所述rAAV之前的血清CK水平相比，所述受试者的血清CK水平在施用所述rAAV之后降低；其中自主活动和比力产生增加；其中纤维化减少；其中胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力增加；和/或其中与施用所述rAAV之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，所述受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量在施用所述rAAV之后增加。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述全身性施用途径是静脉内途径。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过注射、输注或植入来施用。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过输注来施用。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码多肽序列的核苷酸序列。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:2中所示的编码多肽序列的核苷酸序列。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含tMCK启动子。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的polyA序列。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肢带型肌营养不良症，并且所述rAAV通过静脉输注基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用，并且其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用所述rAAV之后增加。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前相比，纤维化在所述受试者中在施用所述rAAV之后减少。
28.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前相比，所述受试者中的纤维化、中央成核、CK水平和/或胶原沉积在施用所述rAAV之后减少。
29.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前相比，所述受试者的肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩在施用所述rAAV之后增加。
30.如权利要求26所述的方法，其中通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测所述α-肌聚糖基因表达。
31.一种表达细胞中的α-肌聚糖基因的方法，其包括向受试者施用包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体。
32.如权利要求31所述的方法，其中通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测所述受试者的细胞中的所述α-肌聚糖基因的表达。
33.如权利要求31所述的方法，其中通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量所述α-肌聚糖蛋白水平来检测所述细胞中的所述α-肌聚糖基因的表达。
34.如权利要求31所述的方法，其中在所述受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量所述α-肌聚糖基因的表达。
35.一种降低有需要的受试者的血清CK水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
36.一种增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的方法，其包括向所述受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
37.一种增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的方法，其包括向所述受试者施用有效量的SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
38.一种用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包含基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒剂量为约1.0×1012vg/kg至约5.0×1015vg/kg的重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA，并且其中所述组合物被配制用于全身性施用途径。
39.用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包含基于作为定量标准的线性化DNA或质粒剂量约为1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg的重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA，并且其中所述组合物被配制用于全身性施用途径。
40.一种组合物，其包含重组腺相关病毒(rAAV)，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
41.如权利要求38或40所述的组合物，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg。
42.如权利要求38或40所述的组合物，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5×1013vg/kg、约1×1014vg/kg或约2×1014vg/kg。
43.如权利要求38至42中任一项所述的组合物，其中与施用所述组合物之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用所述组合物之后增加；或其中与施用所述组合物之前的血清CK水平相比，所述受试者的血清CK水平在施用所述组合物之后降低；或其中与施用所述组合物之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，所述受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量在施用所述组合物之后增加。
44.如权利要求38至43中任一项所述的组合物，其中所述全身性施用途径是静脉内途径。
45.如权利要求38至44中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过注射、输注或植入来施用。
46.如权利要求38至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过输注来施用。
47.如权利要求38至46中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。
48.如权利要求38至47中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
50.如权利要求38至49中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码多肽序列的核苷酸序列。
51.如权利要求38至49中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:2中所示的编码多肽序列的核苷酸序列。
52.如权利要求38至49中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
54.如权利要求38至53中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含tMCK启动子。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。
56.如权利要求38至55中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。
57.如权利要求38至56中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。
58.如权利要求38至57中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的polyA序列。
59.如权利要求38至58中任一项所述的组合物，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74。
60.如权利要求38至59中任一项所述的组合物，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。
61.如权利要求38至60中任一项所述的组合物，其中所述肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
62.如权利要求38至61中任一项所述的组合物，其中所述受试者患有肢带型肌营养不良症，并且所述组合物被配制用于通过静脉输注基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg的剂量施用，并且其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
63.如权利要求38至62中任一项所述的组合物，其中与施用所述组合物之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用所述组合物之后增加。
64.如权利要求38至63中任一项所述的组合物，其中与施用所述组合物之前相比，纤维化在所述受试者中在施用所述组合物之后减少。
65.如权利要求38至63中任一项所述的组合物，其中与施用所述组合物之前相比，所述受试者中的纤维化、中央成核、CK水平和/或胶原沉积在施用所述组合物之后减少。
66.如权利要求38至65中任一项所述的组合物，其中与施用所述组合物之前相比，所述受试者的肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩在施用所述组合物之后增加。
67.如权利要求63所述的组合物，其中通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测所述α-肌聚糖基因表达。
68.一种用于表达细胞中的α-肌聚糖基因的组合物，其中所述组合物包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
69.如权利要求68所述的组合物，其中通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测所述受试者的细胞中的所述α-肌聚糖基因的表达。
70.如权利要求68所述的组合物，其中通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量所述α-肌聚糖蛋白水平来检测所述细胞中的所述α-肌聚糖基因的表达。
71.如权利要求68所述的组合物，其中在所述受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量所述α-肌聚糖基因的表达。
72.一种用于降低有需要的受试者的血清CK水平的组合物，所述组合物包含含有SEQID NO:4的核苷酸序列的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体。
73.一种用于增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的组合物，其包含含有SEQID NO:4的核苷酸序列的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体。
74.一种用于增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的组合物，其包含含有SEQ IDNO:4的核苷酸序列的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体。
75.重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA A用于制备用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的药物的用途，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约1.0×1012vg/kg至约5.0×1015vg/kg，并且其中所述药物被配制用于全身性施用途径。
76.如权利要求75所述的用途，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约1.0×1012vg/kg至约2.0×1015vg/kg、约5×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg、约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、约2.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg或约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg。
77.如权利要求75所述的用途，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg。
78.如权利要求75所述的用途，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5×1013vg/kg、约1×1014vg/kg或约2×1014vg/kg。
79.重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA A用于制备用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的药物的用途，其中基于作为定量标准的线性化DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg，并且其中所述药物配制用于全身性施用途径。
80.如权利要求75至79中任一项所述的用途，其中与施用所述药物之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用所述药物之后增加；或其中与施用所述药物之前的血清CK水平相比，所述受试者的血清CK水平在施用所述药物之后降低；或其中与施用所述药物之前的α-肌聚糖阳性纤维的数量相比，所述受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的数量在施用所述药物之后增加。
81.如权利要求75至80中任一项所述的用途，其中所述全身性施用途径是静脉内途径。
82.如权利要求75至81中任一项所述的用途，其中所述药物被配制用于通过注射、输注或植入来施用。
83.如权利要求75至82中任一项所述的用途，其中所述药物被配制用于通过输注来施用。
84.如权利要求75至83中任一项所述的用途，其中所述组合物被配制用于通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。
85.如权利要求75至84中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
86.如权利要求85所述的用途，其其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
87.如权利要求75至86中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码多肽序列的核苷酸序列。
88.如权利要求75至86中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:2中所示的编码多肽序列的核苷酸序列。
89.如权利要求75至86中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
90.如权利要求89所述的用途，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
91.如权利要求75至90中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含tMCK启动子。
92.如权利要求91所述的用途，其中所述tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。
93.如权利要求75至92中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。
94.如权利要求75至93中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。
95.如权利要求73至94中任一项所述的用途，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的polyA序列。
96.如权利要求73至95中任一项所述的用途，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74。
97.如权利要求73至96中任一项所述的用途，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。
98.如权利要求73至97中任一项所述的用途，其中所述肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。
99.如权利要求73至98中任一项所述的用途，其中所述受试者患有肢带型肌营养不良症，并且所述药物被配制用于静脉输注，并且基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5×1013vg/kg至约2×1014vg/kg，并且其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
100.如权利要求73至99中任一项所述的用途，其中与施用所述药物之前的α-肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α-肌聚糖基因表达水平在施用所述药物之后增加。
101.如权利要求73至100中任一项所述的用途，其中与施用所述药物之前相比，纤维化在所述受试者中在施用所述药物之后减少。
102.如权利要求73至100中任一项所述的用途，其中与施用所述药物之前的纤维化相比，所述受试者中的纤维化、中央成核、CK水平和/或胶原沉积在施用所述药物之后减少。
103.如权利要求72至102中任一项所述的用途，其中与施用所述药物之前相比，所述受试者的肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩在施用所述药物之后增加。
104.如权利要求100所述的用途，其中通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α-肌聚糖蛋白水平来检测所述α-肌聚糖基因表达。
105.scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于表达细胞中的α-肌聚糖基因的药物的用途，其中所述scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
106.如权利要求105所述的用途，其中通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α-肌聚糖蛋白水平来检测所述受试者的细胞中的所述α-肌聚糖基因的表达。
107.如权利要求105所述的用途，其中通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量所述α-肌聚糖蛋白水平来检测所述细胞中的所述α-肌聚糖基因的表达。
108.如权利要求105所述的用途，其中在所述受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量所述α-肌聚糖基因的表达。
109.scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于降低有需要的受试者的血清CK水平的药物的用途，其中所述scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
110.scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于增加受试者的肌肉组织中的α-肌聚糖阳性纤维的药物的用途，其中所述scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
111.scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体用于制备用于增加有需要的受试者中的α-肌聚糖的表达的药物的用途，所述scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
112.如权利要求1至111中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述受试者是4至15岁的人类受试者。
113.如权利要求1至111中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述受试者是小儿受试者、青少年受试者或年轻成人受试者。
114.如权利要求1至111中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述受试者是4-15岁的人类受试者，已确认两个等位基因中的α-肌聚糖(SGCA)突变，其对AAVrh74抗体呈阴性和/或具有>40％或正常的100米步行测试。
115.如权利要求1至111中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述受试者是中年成人或老年受试者。
116.如权利要求1至111中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述受试者是25至55岁的人类受试者。
117.如权利要求1至111中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述受试者是50岁以上的人类受试者。
118.一种产生在如权利要求1至117中任一项所述的方法、组合物或用途中施用的rAAV的方法，其包括将AAV载体质粒转移至宿主细胞，其中所述AAV载体质粒包含与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述AAV载体质粒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
120.如权利要求118或119所述的方法，其中所述载体质粒包含与SEQ ID NO:1、4或8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
121.如权利要求118或119中任一项所述的方法，其中所述载体质粒包含SEQ ID NO:1、4或8的核苷酸序列。
122.如权利要求118至121中任一项所述的方法，其还包括将包装质粒和/或辅助病毒转移至所述宿主细胞。
123.如权利要求118至122中任一项所述的方法，其中所述包装细胞包含稳定整合的AAV cap基因。
124.如权利要求118至123中任一项所述的方法，其中所述包装细胞包含稳定整合的AAV rep基因。
125.一种宿主细胞，其包含与SEQ ID NO:1、4或8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的AAV载体质粒。
126.如权利要求125所述的宿主细胞，其中所述AAV载体质粒包含SEQ ID NO:1、4或8的核苷酸序列。
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