KR20240012480A - Kcnv2 변이체 및 그것들의 사용 - Google Patents

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KR20240012480A
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마리아 술타노바
닥터. 리비아 카르발로
데이비드 헌트
라바브 라쉬완
파벨 와이. 볼치코프
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아르테마 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

예를 들어, 망막 장애, 예컨대 CDSRR을 가진 대상체를 치료하는 방법에서 KCVN2의 신규한 변이체 및 그것들의 용도가 본원에서 개시된다.

Description

KCNV2 변이체 및 그것들의 사용
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 5월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 63/191,106에 대한 우선권을 주장하며, 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록
본 개시내용의 분야
본 발명은 대상체에서 망막 장애, 예컨대 원추체 이영양증을 치료하기 위한 신규한 뉴클레오타이드 및 단백질 서열, 예컨대 KCNV2 서열, 뿐만 아니라 재조합 핵산 분자 및 벡터, 및 관련된 사용 방법에 관한 것이다.
원추체 이영양증, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 초정상 간상체 반응을 동반한 원추체 이영양증 [cone dystrophy with supernormal rod response: CDSRR]은 그 중에서도, 예를 들어, 나쁜 시력, 시력 손실, 빛에 대한 민감성, 나쁜 색각, 안구진탕증(nystagmus) 및 사시증(strabismus)을 특징으로 할 수 있는 상염색체 열성 장애이다. 시각적 어려움은 유아기에 시작하며 20대까지, 예를 들어, 20/100 또는 그 이하의 시력을 갖는다. 환자들은 나중에 야맹증이 발생할 수 있고 다수의 또는 대부분의 환자들이 또한 근시가 발생할 수 있다. 시각 손실의 진행을 줄이거나 예방하기 위해 이용 가능한 특정한 치료가 없어서, 환자들은 나이가 들수록 불량한 예후를 갖게 되고 삶의 질이 저하된다. 따라서, 요법들을 확인할 필요가 있다.
발명자들은 초정상 간상체 반응을 동반한 원추체 이영양증 [CDSRR] (망막 원추체 이영양증 3B, OMIM 610356) 및 KCVN2로 표시되는 관련 병리상태를 치료하기 위한 신규한 재조합 핵산 분자, 단백질, 벡터, 및 관련된 사용 방법을 개시한다. CDSRR은 불량한 시력 (중심 암점(central scotoma)으로 인해), 광선공포증(photophobia), 심각한 색각 결함을 특징으로 하는 희귀하고, 열성이고, 유전적인 망막병증이고, 때때로, 안구진탕증 및 사시증이 또한 존재한다. 일부 환자에서, 안저는 정상으로 보이지만 중심와 또는 중심와 주위 위축증, 황반성 표적(macular bull's eye), 초형광 이상(hyperfluorescence anomalies), 및 전신성 미세 색소성 망막병증(generalized fine pigmentary retinopathy)이 보고되었다. 시신경에 약간의 일시적인 창백이 있을 수 있다.
제한되는 것은 아니지만, 원추 광수용체 및/또는 간상 광수용체를 포함하는, 망막 세포에서 유전자를 발현하기 위한 핵산, 전사 제어 유닛 (TCU), 최적화된 유전자 서열, 발현 작제물, 및 벡터가 본원에서 개시된다.
비변형된 KCVN2 유전자에서 핵산 대체를 포함하는 변형된 KCVN2 유전자가 본원에서 개시되며, 핵산 대체는 인간 KCVN2 유전자와 서열 번호: 2로 표시되는 코돈-최적화된 버전의 정렬에 의해 입증된 것들 중 하나 이상일 수 있다.
또한 광수용체, 예를 들어, 원추 광수용체 및/또는 간상 광수용체에서 유전자를 발현하기 위한 핵산, 전사 제어 유닛 (TCU), 최적화된 유전자 서열, 발현 작제물, 및 벡터가 제공된다.
또한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예컨대 아데노 연관 바이러스 (adeno-associated virus: AAV) 벡터, 뿐만 아니라 핵산 분자에 의해 암호화되는 단리된 Kv8.2 단백질이 제공된다.
또한 TCU의 제어 하에 변이체 인간 KCVN2 유전자를 포함하는 발현 작제물이 제공된다. 변형으로, KCVN2는 광수용체, 예를 들어, 원추 광수용체 또는 간상 광수용체에서 유전자를 발현하는데 최적화된 프로모터의 제어 하에 있다. 변형으로, 변이체 인간 KCVN2 유전자는 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
따라서, 한 변형으로 발명자들은 다음을 제공한다:
KCVN2 유전자의 발현을 지시할 수 있는 프로모터. 변형으로, 프로모터는 광수용체에 대한 전이유전자 발현을 표적으로 한다. 또 다른 변형으로, 프로모터는 광수용체에 대한 발현만을 제한한다. 또 다른 변형으로, 프로모터는 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터이다.
광수용체에서 발현되는 서열. 변형으로 본 발명은 광수용체-특이적 방식으로 발현되는 서열을 포함하는 발현 작제물을 제공한다. 추가의 변형으로, 발현되는 서열은 Kv8.2를 암호화하는 유전자를 포함한다. 추가의 변형으로, 발현되는 서열은 서열 번호: 2를 포함한다.
본 개시내용의 상기 언급된 및 다른 특징 및 이점들은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 여러 구체예의 다음 상세한 설명으로부터 더 분명해질 것이다.
도 1은 제1 작제물의 개략적인 지도를 보여준다.
도 2는 제2 작제물의 개략적인 지도를 보여준다.
도 3은 제3 작제물의 개략적인 지도를 보여준다.
도 4는 제4 작제물의 개략적인 지도를 보여준다.
도 5는 망막 기능을 회복하는 예시의 방법을 나타낸다.
도 6은 I기 및 II기 조사 과정을 제공한다.
도 7은 III기 개념 증명 연구를 제공한다.
도 8은 개시된 방법, 시스템, 및 핵산 서열을 사용하여 처리된 마우스 및 미처리 마우스 간의 비교를 제공한다.
도 9는 야생형 (WT) 망막, 비주사 망막 대 처리된 망막에서 원추체 (a, 원추체 아레스틴) 및 간상체 (B, 로돕신) 표시의 상대적인 유전자 발현을 보여준다. *P<0.05; *P<0.01.
도 10은 처리 후 12주에 서열 번호: 3에 의해 전달된 것처럼 서열 번호: 2로 주사된 Kv8.2 KO 마우스의 망막에서 인간 Kv8.2 서브유닛의 망막 발현의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 11은 마우스 예비 연구를 위한 프로토콜을 입증하는 표이다.
도 12는 처리된 마우스 대 미처리 마우스의 a-파 진폭을 표시하는 데이터를 나타낸다.
도 13은 처리된 마우스 대 미처리 마우스의 양성 b-파 진폭을 표시하는 데이터를 나타낸다.
도 14는 처리된 마우스 및 미처리 마우스의 OCT 데이터를 나타낸다.
도 15는 야생형 (WT) 눈, Kv8.2 KO 미처리 (비주사) 눈 및 Kv8.2 KO 눈의 c-파의 정량화를 입증한다.
도 16 및 도 17은 처리 후 12주에 처리된 Kv8.2 KO 마우스의 개선된 명소시 및 암소시 시력과 암소시 대비 민감도를 입증한다.
도 18은 망막하로 주사된 눈의 망막 절편의 개요이며 처리된 영역은 인간 Kv8.2 서브유닛의 발현 (초록색)을 나타내고 미처리된 영역은 Kv8.2 발현을 나타내지 않는다.
도 19는 Kv8.2 발현 (초록색), Kv2.1 발현 (빨간색) 및 세포핵 (파란색)을 나타내는 처리된 영역 및 미처리 영역의 고배율 이미지를 제공한다. 스케일 막대 = 50μm.
도 20은 야생형에 대해 표준화된 처리된 눈에서 인간 KCNV2 유전자의 발현을 나타내는 실시간 정량 PCR의 데이터를 제공한다.
도 21 및 도 22는, 종합해보면, 인간 KCVN2 (서열 번호: 11) 및 그것의 코돈-최적화된 변이체 (서열 번호: 2)의 서열 정렬을 보여준다.
서열 목록
첨부된 서열 목록에서 나열된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에서 정의된 바와 같이 뉴클레오타이드 염기에 대해 표준 문자 축약형, 및 아미노산에 대해 3문자 코드를 사용하여 나타나있다. 각각의 핵산 서열의 하나의 가닥만이 나타나있지만, 표시된 가닥에 대한 참조를 통해 상보적 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 서열 목록은 2022년 5월 18일에 생성된 "Sequence.txt"라는 명칭의 파일 형태의 ASCII 텍스트 파일 (~40 kb)로 제출되며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.
상세한 설명
발명자들은 초정상 간상체 반응을 동반한 원추체 이영양증 [CDSRR] (망막 원추체 이영양증 3B, OMIM 610356) 및 및 KCVN2로 표시되는 관련 병리상태를 치료하기 위한 신규한 재조합 핵산 분자, 단백질, 벡터, 및 관련된 사용 방법을 개시한다. CDSRR은 불량한 시력 (중심 암점으로 인해), 광선공포증, 심각한 색각 결함을 특징으로 하는 희귀하고, 열성이고, 유전적인 망막병증이고, 때때로, 안구진탕증 및 사시증이 또한 존재한다. 일부 환자에서, 안저는 정상으로 보이지만 중심와 또는 중심와 주위 위축증, 황반성 표적, 초형광 이상, 및 전신성 미세 색소성 망막병증이 보고되었다. 시신경에 약간의 일시적인 창백이 있을 수 있다.
임상 증상은 시각 손실로 제한될 수 있으며 다른 조직 또는 장기가 영향을 받지 않는다. 대부분의 정부 기관은 법적맹(legal blindness)을 가장 잘 보이는 눈에서 20/200 또는 그 이하의 교정 시력 (중심 시력)으로 규정한다. 이것은 법적 맹인이 20 피트에서 볼 수 있는 것을 보통 사람은 200 피트에서 또렷하게 볼 수 있다는 것을 의미한다. CDSRR 연구에서 시력은 사람마다 다를 수 있지만 평균적으로 대략 20/160이지만 결국 법적맹 수준으로 진행할 수 있는 것으로 나타났다. 시각 손실의 진행을 줄이거나 예방하기 위해 이용 가능한 특정한 치료가 없어서, 환자들은 나이가 들수록 불량한 예후를 갖게 되고 삶의 질이 저하된다. 예후는 병태를 치유하거나(heal), 치료하거나, 또는 치유할(cure) 가능성과 관련이 있기 때문에, CDSRR 및 다른 KCVN2 연관된 병리상태에 대한 불량한 예후는 현재 이용 가능한 치유 또는 치료가 없으므로 회복 가능성이 거의 없다는 것을 의미한다. 저시력 보조기 및 착색 렌즈가 환자가 시력 손실 증상을 개선하도록 노력하는데 이용 가능한 유일한 자원이다. 여러 연구에서 CDSRR 환자에서 중심 시력 손실의 진행성인 성질이 나타났지만, 질환 진행의 전체 범위를 평가하기 위한 대규모 자연사 연구는 아직 완료되지 않았다.
이 질환의 희귀성 (전세계적으로 영향을 받은 개체의 추정 수치는 1,000,000명 중의 1명이다)은 희귀 질환 정의에 적합하며, 그것이 제약 업계에 의해 해결되는 것을 방지하는데 민간 부문이 그것을 치료하거나 예방하기 위해 신약을 제조하고 판매하는데 경제적 장려책을 거의 제공하지 않기 때문이다. 하지만, 망막전위도검사 (electroretinography: ERG) 및 유전자 검사의 이용 가능성이 정확한 초기 CDSRR 진단을 가능하게 하고 이 장애에 대한 치료의 개발을 지원한다. CDSRR에 대한 열성 유전 방식 및 느린 진행 성질로 인해 1회성 바이러스-기반 유전자 요법 (유전자 보충) 치료에 대한 좋은 후보가 된다.
CDSRR의 원인 인자 중에는 칼륨 채널, 전압 개폐식, 서브패밀리 V, 구성원 2 유전자 (KCVN2)의 돌연변이가 있다. 일부 CDSRR 환자에서, Kv8.2 전압 개폐식 칼륨 (K+) 채널 서브유닛을 암호화하는 KCNV2 유전자의 돌연변이가 존재한다. 현재 전세계적으로 KCNV2에서 95개가 넘는 다양한 CDSRR-유발 변이체가 확인되었고 다른 변이체들 중에서도 미스센스(missense), 넌센스(nonsense), 유전자 내 결실, 프레임 밖(out-of-frame) 삽입을 포함한다. 다양한 변이체는 Kv8.2에 다르게 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 일부 돌연변이는 비-전도성 채널을 생성하는 반면에, 다른 돌연변이는 채널 형성을 완전히 방지하였다. 이는 질환 병리상태와 관련된 별개의 메커니즘의 존재를 시사하지만 또한 모든 변이체가 비-기능적 단백질을 생성하여, CDSRR을 유전자 대체 요법에 대한 양호한 후보로 만든다는 것을 시사한다.
Kv8.2는 스스로 채널을 형성하지 않지만 동족 파트너를 필요로 하는 "변경자/침묵" 채널 단백질의 군의 구성원이며; Kv8.2의 경우, 이것은 활동 전위의 재분극(repolarization)의 속도를 조절하는 지연된 정류기 전류를 생성하는 서브유닛의 Shab 패밀리의 구성원인 Kv2.1 (KCNB1에 의해 암호화됨)이다. 눈에서, Kv8.2 및 Kv2.1 서브유닛은 둘 다 시각 반응의 광 변환 캐스케이드(cascade)를 시작하는 역할을 하는 원추체 및 간상 광수용체 세포의 내절의 세포질막에만 위치한다. 하지만, KCNV2의 미스센스 돌연변이가 또한 인간에서 뇌전증(epilepsy)을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 그것이 뇌에서도 발현될 수 있다는 것을 나타낸다. 망막전위도 (electroretinogram: ERG) 질환 표현형은 KCNV2의 돌연변이가 Kv2.1/Kv8.2 헤테로머(heteromer)의 기능적 폐지로 이어지는 Kv8.2 서브유닛의 기능 상실을 초래한다는 것을 나타낸다. 궁극적으로, 이것은 빛에 대한 망막의 민감도를 변화시키고 이로 인해 시야의 동적 범위가 다양한 수준의 조명 하에서 조절되는 근본적인 생리학적 과정을 변화시킨다.
증거에 따르면 KCNV2의 돌연변이가 원추체 및 간상 광수용체 둘 다에 영향을 미치며, 이것은 두 광수용체 모두에 대한 비정상적인 ERG 기록에 반영되고 망막 전반에 걸쳐 널리 퍼져있지만, 일부 환자에서는 관찰된 형태학적 변화가 원추체에서 더 두드러지는 것으로 보인다. CDSRR 환자의 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영 (spectral domain optical coherence tomography: SD-OCT)을 사용한 망막의 고해상도 이미지화는 보통 중심 망막에서 심한 형태학적 이상을 나타냈다. 이것들은 내절/외절 (IS/OS) 접합부, 엄청난 중심와 깊이 감소, 부재의 원추체 패치로 원추 광수용체 모자이크 붕괴 및 전체적인 원추체 밀도 감소를 포함한다. 하지만, CDSRR 망막 내 광수용체 세포 손실의 메커니즘은 아직 알려져 있지 않다. 게다가, 어떻게 질환이 원추체 및 간상체에 차등적으로 영향을 미치는지는 분명하지 않다. 동공측정법(pupillometry)으로 측정될 때 CDSRR 환자의 이상에 대한 최근의 연구는 망막 내부의 기능이 보존될 수 있다는 것을 나타낸다. 변형으로, 망막 외부 기능을 회복시키도록 설계된 요법이 성공적일 수 있다.
제한되는 것은 아니지만, 원추 광수용체 및/또는 간상 광수용체를 포함하는 망막 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 핵산, 전사 제어 유닛 (TCU), 최적화된 유전자 서열, 발현 작제물, 및 벡터가 본원에서 개시된다.
비변형된 KCVN2 유전자 (서열 번호: 12)에서 핵산 대체를 포함하는 변형된 KCVN2 유전자가 본원에서 개시되며, 핵산 대체는 인간 KCVN2 유전자와 서열 번호: 2로 표시되는 코돈-최적화된 버전의 정렬에 의해 입증된 것들 중 하나 이상일 수 있다.
광수용체, 예를 들어, 원추 광수용체 및/또는 간상 광수용체에서 유전자를 발현시키기 위한 핵산, 전사 제어 유닛 (TCU), 최적화된 유전자 서열, 발현 작제물, 및 벡터가 또한 제공된다.
핵산 분자를 포함하는 벡터, 예컨대 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터, 뿐만 아니라 핵산 분자에 의해 암호화된 단리된 Kv8.2 단백질이 또한 제공된다.
TCU의 제어 하에 변이체 인간 KCVN2 유전자 (서열 번호: 2)를 포함하는 발현 작제물이 또한 제공된다. 변형으로, KCVN2는 광수용체, 예를 들어, 원추 광수용체 또는 간상 광수용체에서 유전자를 발현시키기 위해 최적화된 프로모터의 제어 하에 있다. 변형으로, 변이체 인간 KCVN2 유전자는 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)의 제어 하에 있을 수 있다.
상응하는 고유한 인간 KCVN2 유전자 (서열 번호: 12)에 비해 유전자 발현이 증가된 KCVN2 유전자의 변이체, 예를 들어 서열 번호: 2가 또한 제공된다. KCVN2 유전자의 변이체는 야생형과 비교하여 최대 평균 대략 8배 유전자 발현 증가를 포함하는 개선된 발현, 미처리된 눈과 비교하여 ERG 양성 b-파 데이터의 더 큰 차이 및 유의한 감소, 및 다른 제품들에 의해 얻어진 것과 비교하여 ERG 양성 b-파 데이터의 더 큰 차이 및 유의한 감소를 포함하는 개선된 치료 성질을 갖는다. 개시된 KCVN2 변이체 (예를 들어, 서열 번호: 2)의 개선된 성질은 상응하는 고유한 인간 KCVN2 유전자 (서열 번호: 12)와 비교하여 증가된 발현, 상응하는 야생형 KCVN2 유전자 (서열 번호: 12)와 비교하여 증가된 발현, 및/또는 상응하는 고유한 인간 KCVN2 유전자 (서열 번호: 12)와 비교하여 개선된 약물동역학적 성질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 개선된 성질은 개선된 전사물 안정성 및 최소화된 비정상적인 전사물 스플라이싱(splicing)을 포함할 수 있다.
망막 장애 또는, 제한되는 것은 아니지만, CDSRR을 포함하는, 이영양증의 치료 및/또는 예방을 위해 핵산, 전사 제어 유닛 (TCU), 최적화된 유전자 서열, 발현 작제물, 및 벡터 중 하나 이상을 사용하는 방법이 또한 개시된다.
초정상 간상체 반응을 동반한 KCNV2 연관 원추체 이영양증에 대한 AAV-매개된 유전자 강화(gene augmentation) 요법이 또한 개시된다.
따라서, 한 변형으로 발명자들은 다음을 제공한다:
KCVN2 유전자의 발현을 지시할 수 있는 프로모터. 변형으로, 프로모터는 광수용체에 대한 전이유전자 발현을 표적으로 한다. 또 다른 변형으로, 프로모터는 광수용체에 대한 발현만을 제한한다. 또 다른 변형으로, 프로모터는 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)이다.
광수용체에서 발현되는 서열. 변형으로 본 발명은 광수용체-특이적 방식으로 발현되는 서열을 포함하는 발현 작제물을 제공한다. 추가의 변형으로, 발현되는 서열은 Kv8.2를 암호화하는 유전자를 포함한다. 추가의 변형으로, 발현되는 서열은 서열 번호: 2를 포함한다.
본 개시내용의 상기 언급된 및 다른 특징 및 이점들은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 여러 구체예의 다음 상세한 설명으로부터 더 분명해질 것이다.
용어
달리 언급되지 않는 한, 기술적인 용어들은 통상적인 용법에 따라 사용된다. 분자생물학의 일반적인 용어들의 정의는 Krebs et al. (eds.), Lewin's genes XII, Jones & Bartlett Learning에 의해 발표됨, 2017; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.에 의해 발표됨, 2009 (ISBN 9780632021826)에서 발견될 수 있다. 단수형 "하나", "하나", 및 "그"는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. "A 또는 B를 포함하는" 것은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용을 실시하거나 테스트하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래 기재된다. 이에 더하여, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시일 뿐이고 제한하려는 의도는 없다. 분쟁의 경우에, 용어의 설명을 포함한 본 명세가 통제할 것이다. 본 개시내용의 다양한 구체예의 검토를 용이하게 하기 위해서, 특정 용어들의 다음 설명이 제공된다:
5' 및/또는 3': 핵산 분자 (예컨대 DNA 및 RNA)는 모노뉴클레오타이드가 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트가 포스포다이에스터 연결을 통해 한 방향으로 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로 폴리뉴클레오타이드를 제조하도록 반응되기 때문에 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 갖는다고 한다. 그러므로, 선형 폴리뉴클레오타이드의 한 단부는 그것의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 3' 산소에 연결되지 않을 때 "5' 단부"라고 불린다. 폴리뉴클레오타이드의 다른 단부는 그것의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않을 때 "3' 단부"라고 불린다. 그럼에도 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트는 이웃의 3' 산소에 부착되며, 내부의 핵산 서열은 또한 5' 및 5' 단부를 갖는다고 할 수 있다.
선형 또는 원형 핵산 분자에서, 별개의 내부 요소는 "다운스트림(downstream)" 또는 3' 요소의 "업스트림(upstream)" 또는 5'이라고 불린다. DNA에 관하여, 이 전문용어는 전사가 DNA 가닥을 따라 5'에서 3' 방향으로 진행되고있다는 것을 반영한다. 연결된 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소는 일반적으로 암호화 영역의 5' 또는 업스트림에 위치한다. 하지만, 인핸서 요소는 프로모터 요소 및 암호화 영역의 3'에 위치할 때에도 효과를 발휘할 수 있다. 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호는 암호화 영역의 3' 또는 다운스트림에 위치한다.
아데노 연관 바이러스 (AAV): 인간과 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 복제 결함 비-외피성 바이러스. AAV는 질환을 유발하지 않는 것으로 알려져 있으며 매우 가벼운 면역 반응을 유도한다. AAV를 활용하는 유전자 요법 벡터는 분화 세포 및 정지(quiescent) 세포 둘 다를 감염시킬 수 있고 숙주 세포의 게놈으로 통합되지 않고 염색체 외 상태를 지속할 수 있다. 이 특징들은 AAV를 유전자 요법에 매력적인 바이러스 벡터로 만든다. 현재 11개의 AAV의 혈청형이 인정되고 있다.
투여/투여하다: 임의의 효과적인 경로에 의해 대상체에게 작용제, 예컨대 치료제 (예를 들어, 재조합 AAV)를 제공하거나 주는 것. 예시의 투여 경로는 주사 (예컨대 피하, 근육내, 피내, 복강내, 및 정맥내), 경구, 관내, 설하, 직장, 경피, 비강내, 질 및 흡입 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
cDNA (상보적 DNA): 내부의 비-암호화 분절 (인트론(intron)) 및 전사를 결정하는 조절 서열이 결여된 DNA 조각. cDNA는 세포로부터 추출된 메신저(messenger) RNA로부터 역전사에 의해 실험실에서 합성된다. cDNA는 또한 상응하는 RNA 분자에서 번역 제어의 역할을 하는 비번역 영역 (UTR)을 포함할 수 있다.
KCNV2: 인간 KCNV2 유전자 (NCBI 참조 서열: NM_133497.4; Ensembl 유전자 ENSG00000168263.9 및 전사물 KCNV2-201 ENST00000382082.4)(서열 번호: 1)는 선택된 전이유전자이다. KCNV2 전사물은 단 하나의 스플라이스(splice) 변이체를 갖고 2개의 엑손(exon)으로 구성된다. 전체 전사물 길이는 2178개 염기쌍 염기쌍 길이이고, 발명자들의 연구에 염기로 사용된 암호화 서열 (CDS)은 1638개 염기쌍 길이이다.
코돈-최적화된: "코돈-최적화된" 핵산은 코돈이 특정 시스템 (예컨대 특정 종 또는 종의 군)에서 발현에 최적이 되도록 변화된 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 핵산 서열은 포유류 세포 또는 특정 포유류 종 (예컨대 인간 세포)에서 발현에 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다.
대조군: 참조 표준. 일부 구체예에서, 대조군은 건강한 환자로부터 얻은 음성 대조군 샘플이다. 다른 구체예에서, 대조군은 CDSRR로 진단된 환자로부터 얻은 양성 대조군 샘플이다. 다른 구체예에서, 대조군은 과거 대조군(historical control) 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위이다 (예컨대 이전에 테스트된 대조군 샘플, 예컨대 공지된 예후 또는 결과를 가진 환자의 군, 또는 베이스라인 또는 정상 값을 나타ㅏ내는 샘플의 군).
테스트 샘플과 대조군의 차이는 증가 또는 반대로 감소일 수 있다. 차이는 질적인 차이 또는 양적인 차이, 예를 들어, 통계적으로 유의한 차이일 수 있다. 일부 예에서, 차이는 대조군에 관하여 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 또는 500% 초과의 증가 또는 감소이다.
DNA (데옥시리보핵산): DNA는 대부분의 살아있는 유기체의 유전 물질을 포함하는 긴 사슬 폴리머이다 (일부 바이러스는 리보핵산 (RNA)을 포함하는 유전자를 갖는다). DNA 폴리머의 반복 유닛은 4개의 상이한 뉴클레오타이드이며, 이것들 각각은 포스페이트 기가 부착된 데옥시리보오스 당에 결합된 4개의 염기, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 및 티민 (T) 중 하나를 포함한다. 뉴클레오타이드의 트리플릿(triplet) (코돈이라고 불림)은 폴리펩타이드의 각각의 아미노산, 또는 종결 신호를 암호화한다. 용어 코돈은 DNA 서열이 전사되는 mRNA에서 3개의 뉴클레오타이드의 상응하는 (및 상보적) 서열에도 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, DNA 분자에 대한 언급은 상기 DNA 분자의 역보체(reverse complement)를 포함하도록 의도된다. 단일 가닥이 본원의 본문에서 요구되는 경우를 제외하면, DNA 분자는, 단일 가닥만을 묘사하도록 작성되었음에도, 이중 가닥 DNA 분자의 두 가닥 모두를 포함한다. 따라서, 특정 단백질, 또는 그 단편을 암호화하는 핵산 분자에 대한 언급은 센스(sense) 가닥 및 그것의 역보체 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 개시된 핵산 분자의 역보체 서열로부터 프로브 또는 프라이머를 생성하는 것이 적절하다.
발현: 핵산 서열의 전사 또는 번역. 예를 들어, 암호화 핵산 서열 (예컨대 유전자)은 그것의 DNA가 RNA 또는 RNA 단편으로 전사될 때 발현될 수 있으며, 그것은 일부 예에서 mRNA가 되도록 처리된다. 암호화 핵산 서열 (예컨대 유전자)은 또한 그것의 mRNA가 아미노산 서열, 예컨대 단백질 또는 단백질 단편으로 번역될 때 발현될 수 있다. 특정 예에서, 이종성 유전자는 그것의 RNA로 전사될 때 발현된다. 또 다른 예에서, 이종성 유전자는 그것의 RNA가 아미노산 서열로 번역될 때 발현된다. 발현의 조절은 전사, 번역, RNA 수송 및 처리, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 대한 제어, 또는 특정 단백질 분자가 생성된 후 그것들의 활성화, 비활성화, 구획화 또는 분해를 통한 제어를 포함한다.
발현 제어 서열: 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열. 발현 제어 서열이 전사 및, 적절하게는, 핵산 서열의 번역을 제어하고 조절할 때 발현 제어 서열은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질-암호화 유전자 앞에 개시 코돈 (ATG), 인트론에 대한 스플라이스 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위해 상기 유전자의 올바른 리딩 프레임(reading frame)의 유지, 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 용어 "대조군 서열"은 최소한 그 존재가 발현에 영향을 미칠 수 있는 구성요소를 포함하도록 의도되고, 또한 그 존재가 이로운 추가적인 구성요소, 예를 들어, 선도 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 프로모터를 포함할 수 있다.
유전자: mRNA든 그렇지 않든, RNA의 전사에 필요한 제어 및 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열, 전형적으로는 DNA 서열. 예를 들어, 유전자는 프로모터, 하나 이상의 인핸서 또는 사일런서(silencer), RNA 및/또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 다운스트림 조절 서열 및, 가능한 대로, mRNA의 발현의 조절에 관련된 다른 핵산 서열을 포함할 수 있다.
해당 분야에 공지된 바와 같이, 대부분의 진핵 유전자는 엑손과 인트론 둘 다를 포함한다. 용어 "엑손"은 인접한 서열을 성숙한 mRNA 전사물에 제공하는 것으로 생물정보학적으로 예상되고 및/또는 실험적으로 확인된 게놈 DNA에서 발견된 핵산 서열을 나타낸다. 용어 "인트론"은 성숙한 mRNA 전사물에 기여하지 않지만 대신에 전사물의 처리 중에 "스플라이싱"되는 것으로 예상되고 및/또는 확인된 게놈 DNA에서 발견된 핵산 서열을 나타낸다.
유전자 요법: 하나 이상의 수용 세포로의 이종성 핵산 분자의 도입으로서, 수용 세포에서 이종성 핵산의 발현은 세포의 기능에 영향을 미치고 대상체에서 치료 효과를 초래한다. 예를 들어, 이종성 핵산 분자는 수용 세포의 기능에 영향을 미치는 단백질을 암호화할 수 있다.
혼성체화: 본원에서 제공된 핵산 서열에 대해 특정 수준의 동일성을 가진 핵산의 특성화를 위한 혼성체화 검정이 해당 분야에 널리 공지되어 있으며; 예를 들어, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)를 참조하면 된다. 용어 "혼성체화" 또는 "혼성체화하다"는 본원에서 사용된 바와 같이 엄중 또는 비-엄중 조건 하에서의 혼성체화와 관련이 있을 수 있다. 상기 혼성체화 조건은, 예를 들어, Sambrook (2001) loc. cit.; Ausubel (1989) loc. cit., 또는 Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington D.C., (1985)에서 기재된 통상적인 프로토콜에 따라 확립될 수 있다. 조건의 설정은 당업자의 기술범위 내에 있고 해당 분야에서 기재된 프로토콜에 따라 결정될 수있다. 따라서, 혼성체화 서열의 검출은 보통 엄중 혼성체화 및 세척 조건, 예를 들어, 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS 또는 2×SSC, 60℃, 0.1% SDS에서, 예를 들어, 65℃에서 6×SSC, 1% SDS까지의 범위에 있는 조건을 필요로 할 것이다. 널리 공지된 바와 같이, 결정되어야 하는 프로브의 길이 및 핵산의 조성이 혼성체화 조건의 추가의 파라미터를 구성한다.
단리된: "단리된" 생물학적 구성요소 (예컨대 핵산 분자, 단백질, 바이러스 또는 세포)는 구성요소가 자연 발생하는 유기체의 세포 또는 조직, 또는 유기체 그 자체의 다른 생물학적 구성요소, 예컨대 다른 염색체 및 염색체 외의 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포로부터 실질적으로 분리되거나 정제되었다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 것들을 포함한다. 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질을 포괄한다.
핵산 분자: RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 가닥 및 안티센스(antisense) 가닥 둘 다를 포함할 수 있는 뉴클레오타이드의 폴리머 형태, 및 합성 형태 및 상기의 혼합된 폴리머. 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 각각의 유형의 변형된 형태를 나타낸다. 용어 "핵산 분자"는 본원에서 사용된 바와 같이 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 동의어이다. 핵산 분자는 보통 달리 명시되지 않는 한 길이가 적어도 10개의 염기이다. 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오타이드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. "cDNA"는 mRNA와 상보적이거나 동일한, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 DNA를 나타낸다. "암호화"는 생물학적 과정에서 뉴클레오타이드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 및 그것에 기인하는 생물학적 성질을 가진 다른 폴리머 및 거대분자의 합성에 대한 주형의 역할을 하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특정 서열의 내재된 성질을 나타낸다.
작동 가능하게 연결된: 제1 핵산 서열이 기능적인 관계로 제2 핵산 서열과 함께 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요한 경우 동일한 리딩 프레임에서 2개의 단백질-암호화 영역을 결합시킨다.
약학적으로 허용 가능한 담체: 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적이다. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 nd ed., London, UK: Pharmaceutical Press, 2013에서 개시된 벡터의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제제가 기재되어 있다.
일반적으로, 담체의 성질은 이용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제제는 보통 비히클(vehicle)로서 약학적으로 및 생리학적으로 허용 가능한 유체, 예컨대 물, 생리식염수, 평형염액(balanced salt solution), 수성 덱스트로오스, 글리세롤, 등을 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물 (예를 들어, 분말, 알약, 타블렛, 또는 캡슐 형태)에 대해, 통상적인 비-독성 고체 담체는, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체에 더하여, 투여되는 약학적 조성물 (예컨대 벡터 조성물)은 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, 방부제, 및 pH 완충제 등, 예를 들어, 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 대상체에게 투여하기에 적합하도록, 담체는 멸균되고, 및/또는 원하는 면역 반응을 유도하기에 적합한 조성물의 1회 이상의 측정 용량을 포함하는 단위 투약 형태로 현탁되거나 그렇지 않으면 포함될 수 있다. 그것은 또한 치료 목적으로 사용하기 위해 약을 동반할 수 있다. 단위 투약 형태는, 예를 들어, 멸균 내용물을 포함하는 밀봉된 바이알 또는 대상체로의 주사를 위한 주사기 내에 있을 수 있거나, 또는 이후의 가용화 및 투여를 위해 동결건조될 수 있거나 또는 고체 또는 제어된 방출 투약량으로 되어있을 수 있다.
정제된: 용어 정제된은 절대 순도를 요구하지 않고; 대신에, 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 단백질 조제물은 단백질 (예컨대 KCVN2 단백질)이 펩타이드 또는 단백질이 세포 내의 천연 환경에 있는 것보다 더 풍부한 것이다. 한 구체예에서, 조제물은 단백질이 조제물의 총 단백질 포함량의 적어도 50%를 나타내도록 정제된다.
폴리펩타이드: 길이 또는 번역 후 변형 (예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)에 관계없는 아미노산의 임의의 사슬. "폴리펩타이드"는 자연 발생 아미노산 폴리머 및 비-자연 발생 아미노산 폴리머를 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연 아미노산, 예를 들어, 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공의 화학적 모방체인 아미노산 폴리머에 적용된다. "잔기"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방체에 의해 폴리펩타이드에 포함되는 아미노산 또는 아미노산 모방체를 나타낸다. 폴리펩타이드는 아미노 말단 (N-말단) 단부 및 카르복시 말단 (C-말단) 단부를 갖는다. "폴리펩타이드"는 펩타이드 또는 단백질과 교체 가능하게 사용되며, 본원에서 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내는데 사용된다.
질환의 예방, 치료 또는 개선: 질환 (예컨대 망막 장애)의 "예방"은 질환의 완전한 발병을 억제하는 것을 나타낸다. "치료"는 질환 또는 병리학적 상태가 발병하기 시작한 후 질환 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 나타낸다. "개선"은 질환의 징후 또는 증상의 횟수 또는 심각도의 감소를 나타낸다.
프로모터: 핵산 (예를 들어 유전자)의 전사를 지시/시작하는 DNA의 영역. 프로모터는 전사의 시작 부위 근처의 필요한 핵산 서열을 포함한다. 전형적으로, 프로모터는 그것들이 전사시키는 유전자 근처에 위치한다. 프로모터는 또한 선택적으로 전사의 시작 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 떨어저 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 억제자 요소를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 주로 단일 유형의 조직 또는 세포에서 전사를 지시/시작하는 프로모터이다. 예를 들어, 광수용체-특이적 프로모터는 다른 세포 유형 보다 실질적으로 더 큰 정도로 광수용체 세포에서 전사를 지시/시작하는 프로모터이다.
단백질: 유전자 또는 다른 암호화 핵산 (예를 들어, cDNA)에 의해 발현되고 아미노산으로 구성된 생물학적 분자.
정제된: 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않고; 대신에, 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 펩타이드, 단백질, 바이러스, 또는 다른 활성 화합물은 자연적으로 회합된 단백질 및 다른 오염물질로부터 전체적으로 또는 부분적으로 단리된 것이다. 특정 구체예에서, 용어 "실질적으로 정제된 것"은 세포, 세포 배양 배지, 또는 다른 미가공 조제물로부터 단리되고 초기 조제물의 다양한 구성요소, 예컨대 단백질, 세포 데브리(debris), 및 다른 구성요소를 제거하기 위해 분획화된 펩타이드, 단백질, 바이러스 또는 다른 활성 화합물을 나타낸다.
재조합: 재조합 핵산 분자는 자연 발생하지 않은, 예를 들어, 하나 이상의 핵산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 서열을 갖고, 및/또는 서열의 2개의 분리된 분절의 인공적인 조합에 의해 제조된 서열을 갖는 것이다. 이 인공적인 조합은 화학적 합성 또는, 더 일반적으로는, 핵산의 단리된 분절의 인공적인 조작에 의해, 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 달성될 수 있다.
재조합 바이러스는 재조합 핵산 분자를 포함하는 게놈을 포함하는 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 AAV"는 재조합 핵산 분자 (예컨대 Kv8.2를 암호화하는 재조합 핵산 분자)가 패키징된(packaged) AAV 입자를 나타낸다.
재조합 단백질은 자연 발생하지 않은 서열을 갖거나 또는 서열의 2개의 분리된 분절의 인공적인 조합에 의해 제조되는 서열을 갖는 것이다. 여러 구체예에서, 재조합 단백질은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 또는 진핵 세포로, 또는 재조합 바이러스의 게놈으로 도입된 이종성 (예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 암호화된다.
망막: 망막은 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelium: RPE) 세포층 및 3개의 감각 신경 세포층; 즉 (외부에서 내부로), 외핵층 (간상체 및 15개의 원추 광수용체 세포를 포함함), 내핵층 (양극성 세포를 포함함), 및 신경절 세포층으로 구성된다. 망막 장애 또는 이영양증은 광수용체 세포의 진행성 상실 및 수반되는 시력 상실을 특징으로 하는 망막의 질환으로 정의될 수 있다. 망막 장애 또는 이영양증은 유전적 망막 장애 또는 이영양증일 수 있다.
서열 동일성: 2개 이상의 핵산 서열, 또는 2개 이상의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 유사성은 서열 사이의 동일성 또는 유사성에 관하여 표현된다. 서열 동일성은 퍼센트 동일성에 관하여 측정될 수 있으며; 퍼센트가 높을수록, 서열은 더 동일하다. 서열 유사성은 퍼센트 유사성에 관하여 측정될 수 있으며 (보존적 아미노산 치환을 고려한다); 퍼센트가 높을수록, 서열은 더 유사하다. 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체 또는 이종상동체는 표준 방법을 사용하여 정렬될 때 상대적으로 높은 정도의 서열 동일성/유사성을 가지고 있다. 이 상동성은, 더 멀게 관련된 종 (예컨대 인간과 과 예쁜 꼬마 선충(C. elegans) 서열)과 비교하여, 이종상동성 단백질 또는 cDNA가 더 밀접하게 관련된 종 (예컨대 인간과 마우스 서열)으로부터 유래될 때 더 유의하다.
비교용 서열의 정렬 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990에 기재되어 있으며, 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고려사항을 제공한다.
NCBI 기본 로컬 정렬 검색 도구 (Basic Local Alignment Search Tool: BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)은 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해 미국 국립 생물정보 센터 (National Center for Biological Information: NCBI) 및 인터넷을 포함하는 다양한 공급처로부터 이용 가능하다. 추가적인 정보는 NCBI 웹사이트에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "적어도 90% 동일성"에 대한 언급은 명시된 참조 서열에 대한 "적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100% 동일성"을 나타낸다.
대상체: 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하는 범주인, 살아있는 다세포 척추동물 유기체.
치료적 유효량:
장애 또는 질환의 증상 및/또는 근본적인 원인을 예방하고, 치료하고 (예방을 포함함), 감소시키고 및/또는 개선하며, 예를 들어, 망막 장애를 예방하고, 억제하고, 및/또는 치료하기에 충분한 작용제, 예컨대 KCVN2를 암호화하는 개시된 재조합 AAV 벡터의 양. 예를 들어, 이것은 광수용체 기능을 회복시키기에 충분한 양의 KCVN2를 생성하는, 본원에서 기재된 바와 같이 신규한 KCVN2 유전자를 암호화하는 재조합 AAV 벡터의 양일 수 있다.
한 예에서, 원하는 반응은, 예를 들어, 망막전위도 (ERG) 기록에 의해 측정될 때, 대상체 (예컨대 CDSRR을 가진 대상체)에서 광수용체 기능을 회복시키는 것이다. ERG 기록 (a-파, b-파, c-파)은 방법이 효과적이도록 CDSRR이 없는 정상적인 건강한 대상체의 기록까지 완전히 회복될 필요는 없다. 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이 벡터 (예컨대 KCVN2 암호화 벡터)의 치료적 유효량의 투여는 적합한 대조군과 비교하여, 원하는 양만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 100% 또는 그 이상만큼 명소시 또는 암소시 ERG b-파를 증가시킬 수 있다.
질환 또는 병태에 대한 치료 반응을 얻기 위해서는 치료제의 다회수 투여를 필요로 할 수 있다는 것이 이해된다. 따라서, 치료적 유효량은 이전 또는 이후의 투여와 조합하여 환자에서 치료 결과를 획득하는데 기여하는 분할 용량을 포함한다. 예를 들어, 작용제의 치료적 유효량은 치료 과정 중에, 예를 들어, 매일 단일 용량으로, 또는 다회수 용량으로 투여될 수 있다. 하지만, 치료적 유효량은 치료되는 대상체, 치료되는 병태의 심각도 및 유형, 그리고 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 작용제의 단위 투약 형태는 치료량으로, 또는 치료량의 배수로, 예를 들어, 바이알 (예를 들어, 뚫을 수 있는 뚜껑이 있음) 또는 멸균 구성요소를 가진 주사기에 패키징될 수 있다.
벡터: 벡터는 숙주 세포에서 벡터가 복제하고 및/또는 통합하는 능력을 방해하지 않고 외래의 핵산의 삽입을 허용하는 핵산 분자이다. 벡터는 숙주 세포에서 복제하는 것을 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제의 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 유전자 또는 유전자의 전사 및 번역을 허용하기 위해 필요한 조절 서열을 포함하는 벡터이다. 본원의 일부 구체예에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터이다.
신규한 KCVN2 유전자
서열 번호: 2로 제시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 Kv8.2 활성을 가진 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
혼성체화하다 엄중 조건 하에서 서열 번호: 2로 제시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열의 상보적 가닥에 혼성체화하는 핵산 분자가 제공된다.
서열 번호: 2로 제시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 퇴화된 핵산 분자가 제공된다.
실시예 1에서 논의된 바와 같이, Kv8.2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 개선된 발현에 대해 코돈-최적화되었다. 예시의 최적화된 KCVN2 서열이 서열 번호: 2로 제공된다.
상응하는 고유한 인간 KCVN2에 비해 발현이 증가된 KCVN2 유전자의 변이체가 본원에서 개시된다. 서열 번호: 2는 서열 번호: 1로 개시된 인간 야생형 KCVN2 유전자, 서열 번호: 12에 개시된 암호화 영역을 포함하는 비변형된 KCVN2 유전자와 비교하여 개선된 광수용체 치료 성질을 포함하는 개선된 치료 성질을 갖는다. 개시된 KCVN2 변이체의 개선된 성질은 단백질 합성의 증가, 더 안정한 mRNA, 번역 신장 속도의 증가, 및/또는 개선된 약물동역학적 성질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 개선된 성질은 안정한 전이유전자 및 단백질 발현, 회복의 향상 및 시각 기능의 개선을 포함할 수 있다.
KCVN2 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 핵산 서열의 자연 발생 변이체를 포함하는 서열 번호: 2의 임의의 변이체로 정의될 수 있다. 변이체는 서열 번호: 2에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것으로 정의될 수 있으며, 변이체 서열로부터 번역된 폴리펩타이드는 그 기능성을 유지한다. 변이체는 서열 번호: 2에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것으로 정의될 수 있으며, 변이체 서열, 서열 번호: 11로부터 번역된 폴리펩타이드는 광수용체 기능을 구제할 수 있는 능력을 갖는다. 특정 변형으로, 변이체는 암호화 서열의 코돈 최적화된 버전이다.
본 개시내용에 의해 고려되는 발현 작제물은 원추 광수용체 기능을 구제할 수 있다. 원추 광수용체 기능을 구제하는 것은 원추 광수용체 기능의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 회복하는 것으로 정의될 수 있다. 원추 광수용체 기능은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 표준 기술에 의해, 예를 들어, 망막 반응의 망막전위도 (ERG) 분석에 의해 분석될 수 있다. 간상 광수용체 기능은 당업자에게 공지된 임의의 표준 기술에 의해, 예를 들어, 망막 반응의 ERG 분석에 의해 분석될 수 있다.
광수용체 기능을 구제하는 것은 또한 광수용체 생존을 연장시키는 것으로 정의될 수 있다. 광수용체 생존을 연장시키는 것은 광수용체 (예를 들어, 원추 광수용체 및/또는 간상 광수용체)가 기능적이거나 또는 이영양증에 의해 영향을 받은 광수용체와 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 100% 이상만큼 존재하는 시간을 연장시키는 것으로 정의될 수 있다. 광수용체 생존 연장의 예는 또한 ERG 활성의 개선 또는 ERG 활성 손실의 둔화, 망막 민감도 개선 또는 망막 민감도의 진행성 손실의 둔화/중단 또는 광수용체 세포 손실의 둔화 또는 중단, 망막 외부층의 얇아짐의 둔화 또는 중단, 시력 개선 또는 시력 손실의 둔화/중단을 포함한다.
발현 작제물은 KCVN2 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 전사 제어 유닛을 포함할 수 있다. 변형으로, KCVN2 유전자는 서열 번호: 2이다. 일부 변형으로, KCVN2 유전자는 코돈 최적화된다.
따라서, Kv8.2, 뿐만 아니라 Kv8.2의 정제된 형태를 암호화하는 핵산 분자 (예를 들어, cDNA 또는 RNA 분자)가 제공된다. 여러 구체예에서, 핵산 분자는 숙주 세포 (예컨대 포유류 세포)에서 발현되어 Kv8.2를 생성할 수 있다.
유전 암호는 기능적으로 동등한 다양한 핵산 서열, 예컨대 서열은 다르지만 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 구성하는데 사용될 수 있다.
본원에서 개시된 핵산 분자는, 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 또는 표준 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 생성한다. 이것은 이것은 상보적 서열과의 혼성체화에 의해 또는 주형으로 단일 가닥을 사용하여 DNA 폴리머라아제와의 폴리머화에 의해 이중 가닥 DNA로 반전될 수 있다.
예시의 핵산은 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 적절한 클로닝 및 시퀀싱 기술의 예는, 예를 들어, Green and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) 및 Ausubel et al. (Eds.) (Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, including supplements, 2017)에서 발견될 수 있다.
핵산은 또한 증폭 방법에 의해 제조될 수 있다. 증폭 방법은 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 전사-기반 증폭 시스템 (TAS), 및 자가-지속 서열 복제 시스템 (3SR)을 포함한다.
핵산 분자는 재조합에 의해 조작된 세포, 예컨대 박테리아, 식물, 효모, 곤충 및 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 본원에서 개시된 DNA 서열은 적합한 숙주 세포로의 DNA 전달에 의해 시험관 내에서(in vitro) 발현될 수 있다. 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 대장균(E. coli), 다른 박테리아 숙주, 효모, 및 다양한 고등 진핵 세포, 예컨대 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 포함하는, 단백질 발현에 이용 가능한 많은 발현 시스템이 개시된 신규한 뉴클레오타이드 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 외래의 DNA가 숙주에서 지속적으로 유지된다는 것을 의미하는, 안정한 전달 방법은 해당 분야에 공지되어 있다.
개시된 핵산의 발현은 DNA 또는 cDNA를 프로모터 (구성성 또는 유도성)에 작동 가능하게 연결한 후 이어서, 발현 카세트로 통합시킴으로써 달성될 수 있다. 프로모터는 관심있는 어떠한 프로모터도 될 수 있으며, 광수용체-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)를 포함한다. 다른 예시의 프로모터는 CAG (하이브리드(hybrid) CMV 초기 인핸서/닭 b-액틴 프로모터), CBA (닭 b-액틴 프로모터), CBh (CBA 프로모터의 하이브리드 형태), CMV (인간 시토메갈로바이러스 프로모터), CB (시토메갈로바이러스 (CMV) 급초기 인핸서, 제1 인트론/엑손 접합부를 가진 닭 b-액틴 프로모터, 하이브리드 닭 b-액틴 및 토끼 b-글로불린 인트론/엑손 접합부로 구성된 조절 요소), CBSB (CB 프로모터보다 더 짧은 CMV 즉시 인핸서 서열을 포함함), GRK1 (인간 G 단백질-결합된 수용체 키나아제 1 프로모터), pRLBP1 (단축된 인간 레틴알데하이드 결합 단백질 1 (RLBP1) 프로모터), hCAR (인간 원추체 아레스틴 프로모터, PRI.7 및 PR2.1 (인간 L-옵신 프로모터의 버전)), IRBP (인간 광수용체 간 레티노이드-결합 단백질 인핸서), RS/IRBP (인간 레티노스키신 근위 프로모터와 인간 광수용체 간 레티노이드-결합 단백질 인핸서의 조합), pRHO (로돕신 프로모터), 및 hPDE6b (짧은 인간 포스포다이에스터라아제 6b 프로모터)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
선택적으로, 코자크 공통 서열(KOZAK consensus sequence) (서열 번호: 8), a 우드척 간염 바이러스 (Woodchuck Hepatitis virus: WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)(서열 번호: 9); 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A))(서열 번호: 10) 중 하나 이상과 같은 조절 요소가 작제물에 포함된다. 카세트는 원핵생물 또는 진핵생물에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 암호화하는 DNA의 발현을 조절하는데 유용한 특이적인 서열을 포함한다. 예를 들어, 발현 카세트는 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 종결자, 시작 서열, 단백질-암호화 유전자 앞에 개시 코돈 (즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 절적한 번역을 허용하도록 상기 유전자의 올바른 리딩 프레임의 유지를 유한 서열, 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 벡터는 선택 가능한 마커, 예컨대 약물 저항성 (예를 들어, 앰피실린 또는 테트라사이클린 저항성)을 암호화하는 마커를 암호화할 수 있다.
클로닝된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해서, 예를 들어, 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 번역 시작을 위한 리보솜 결합 부위 (예를 들어, 내부 리보솜 결합 서열), 및 전사/번역 종결자를 포함하는 발현 카세트를 구성하는 것이 바람직하다. 대장균에 대해, 이것은 프로모터, 예컨대 T7, trp, lac, 또는 람다(lambda) 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 바람직하게는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다. 진핵 세포에 대해, 제어 서열은, 예를 들어, 면역글로불린 유전자, HTLV, SV40 또는 시토메갈로바이러스, 및 폴리아데닐화 서열로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있고, 스플라이스 공여체(donor) 및/또는 수령체(acceptor) 서열 (예를 들어, CMV 및/또는 HTLV 스플라이스 수령체 및 공여체 서열)을 더 포함할 수 있다. 카세트는 널리 공지된 방법, 예컨대 대장균에 대해 형질전환 또는 전기천공 및 포유류 세포에 대해 칼슘 포스페이트 처리, 전기천공 또는 리포펙션에 의해 선택된 숙주 세포로 전달될 수 있다. 카세트에 의해 형질전환된 세포는 카세트에 포함된 유전자, 예컨대 amp, GPt, neo, 및 hyg 유전자에 의해 부여되는 항생제에 대한 저항성에 의해 선택될 수 있다.
생물학적 활성을 약화시키지 않으면서 본원에서 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대한 변형이 이루어질 수 있다. 클로닝, 발현, 또는 융합 단백질로의 표적화 분자의 통합을 용이하게 하기 위해 약간의 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 종결 코돈, 편리하게 위치한 제한 부위를 생성하기 위한 서열, 및 시작 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에 메티오닌을 추가하기 위한 서열, 또는 정제 단계를 돕기 위한 추가적인 아미노산 (예컨대 폴리 His)을 포함한다.
발현되면, 개시된 Kv8.2는 암모늄 설페이트 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 등을 포함하는 해당 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로, Simpson et al. (Eds.), Basic methods in Protein Purification and Analysis: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009를 참조하면 된다). 개시된 폴리펩타이드는 100% 순수할 필요는 없다. 부분적으로 또는 원하는 만큼 균질하게 정제되면, 치료적으로 사용되어야 하는 경우, 폴리펩타이드는 내독소가 실질적으로 없어야 한다.
재조합 벡터 및 유전자 요법 적용
현재 실시에서, 유전자 요법은 기능을 회복시키는 야생형 카피(copy)로의 기능적 단백질이 생성되지 않는 기능 장애 유전자의 기능적 대체를 나타낸다. 유전자 요법은 망막의 유전적 및 일반적 복합 장애의 치료에서 유망한 접근법이고 전임상 및 임상 연구에서는 안전하고 효율적인 유전자 전달 비히클로서 아데노 연관된 바이러스 벡터 (AAV)의 사용이 검증되었다. AAV-매개된 유전자 대체 요법은 간, 근육, 혈액 세포 및 망막을 포함한 다양한 조직 및 계통에서 달성될 수 있다.
유전적인 광수용체 퇴화의 여러 동물 모델은 유전자 보충 요법에 의한 성곡적인 치료를 겪었고, 지금까지 형태학, 기능, 및 행동 수준에서 시각 구제가 달성되었다. 다양한 유형의 유전적 망막 장애에 대한 유전적 결점을 교정하는 수단으로서 AAV 전달 시스템을 사용하고 있거나 사용한 43개의 임상 시험이 진행 중이거나 완료되었다 (clinicaltrials.gov, 2020년 11월 16일에 검색 완료됨). 또 다른 5개의 임상 시험 (3개는 진행 중이고 2개는 완료됨)이 또한 연령-관련된 황반 변성에 대한 치료제를 전달하기 위해 AAV를 사용하고 있거나 사용하였다.
AAV 벡터는 효율성 및 특이성 모두에서 광수용체 세포 표적화를 위한 허용 가능한 전달 방법인 것으로 입증되었다. AAV 벡터는 광수용체 세포에 대한 높은 친화도를 갖는 한편 비-독성, 비-병원성 및 저면역원성 프로파일을 제공하는 것으로 나타났다. 이것은 망막 장애 및 시력 손실 모델에 유전자 요법의 성공적인 적용을 입증하였다. 현재이용 가능한 다양한 AAV 혈청형 중에서 망막 세포를 표적화하는데 가장 일반적으로 이용되는 것은 AAV2/2, AAV2/8, AAV2/9, AAV2/5, AAV2/7m8, AAV2/Anc80_L065 혈청형이었다.
상기 논의된 재조합 핵산 분자 중 어느 것도 숙주 또는 대상체에서 발현을 위한 벡터 (예컨대 AAV 벡터)에 포함될 수 있다.
본원에서 개시된 핵산 서열은 벡터 (예컨대 rAAV 벡터)의 생산에 유용하고, 안티센스 전달 벡터, 유전자 요법 벡터, 또는 백신 벡터에서도 유용하다. 특정 구체예에서, 본 개시내용은 유전자 전달 벡터, 및 본원에서 개시된 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 선택된 벡터는 전이유전자를 대상체로 도입시키기 위해 정맥내 주사, 생체 외(ex-vivo) 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅된 펠릿, 바이러스 감염, 또는 원형질 융합을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 대상체에게 전달될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 개시내용은 본원에서 개시된 KCVN2 핵산 서열 서열 번호: 2를 포함하는 바이러스 입자, 예를 들어, 캡시드(capsid)와 관련이 있다. 바이러스 입자, 캡시드, 및 재조합 벡터는 표적 세포로의 핵산 서열의 전달에 유용하다. 핵산은 다양한 벡터 시스템, 캡시드, 및 숙주 세포에서 쉽게 활용될 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산은 cap 단백질을 포함하는 캡시드, 예컨대 AAV 캡시드 단백질 vp1, vp2, vp3 및 초가변 영역 내에 포함된 벡터 내에 있다.
특정 구체예에서, KCVN2 핵산 서열은 숙주 세포에 전달될 수 있는 임의의 유전 요소 (벡터)의 일부, 예를 들어, 운반된 서열을 전달하는 네이키드(naked) DNA, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 에피솜, 비-바이러스 전달 비히클 (예를 들어, 지질-기반 담체) 내 단백질, 바이러스, 등일 수 있다.
특정 구체예에서, 벡터는, 예를 들어, VSVG 또는 GP64 위형 또는 둘 다로부터 유래된 핵산 서열을 갖는 렌티바이러스 기반 (렌티바이러스 유전자 또는 서열을 포함하는) 벡터일 수 있다. 특정 구체예에서, VSVG 또는 GP64 위형으로부터 유래된 핵산 서열은 유전자 또는 단편에 대해 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99 % 초과의 동일성을 갖는 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 또는 25개 초과의 연속적인 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나 또는 둘 또는 그 이상의 유전자 또는 유전자 단편일 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 핵산 및 프로모터 서열은 AAV 벡터의 생산에 유용하다. AAV는 파르보비리대(Parvoviridae) 과 및 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속한다. AAV는 작은 선형 단일 가닥 DNA 게놈을 패키징하는 비-외피성 바이러스이다. AAV의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 동일한 빈도로 AAV 캡시드로 패키징된다. AAV 게놈은 2개의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame: ORF)에 측접하는 2개의 역위 말단 반복부위 (inverted terminal repeat: ITR)를 특징으로 한다. AAV2 게놈에서, 예를 들어, ITR의 처음 125개의 뉴클레오타이드는 팔린드롬(palindrome)이며, 이것은 그 자체로 폴딩되어 염기쌍 형성을 극대화하고 T-형상 헤파린 구조를 형성한다. D 서열이라고 불리는 ITR의 다른 20개의 염기는 쌍 형성되지 않은 채로 유지된다. ITR은 AAV DNA 복제에 중요한 cis-작용 서열이며; ITR은 복지 기원이고 DNA 폴리머라아제에 의한 제2 가닥 합성에 대한 프라이머의 역할을 한다. 복제 형태 모노머라고 불리는, 이 합성 중이 형성된 이중 가닥 DNA가 자가-프라이밍(priming) 복제의 제2 라운드에 사용되고 복제 형태 다이머를 형성한다. 이들 이중 가닥 중간물은 가닥 대체 메커니즘을 통해 가공되어, 패키징에 사용되는 단일 가닥 DNA 및 전사에 사용되는 이중 가닥 DNA를 발생시킨다. Rep 결합 요소 말단 분해 부위 (terminal resolution site: TRS)가 ITR 내에 위치한다. 이러한 특징들은 이중 가닥 중간물을 가공하기 위한 AAV 복제 중에 바이러스 조절 단백질 Rep에 의해 사용된다. AAV 복제에서의 그것들의 역할에 더하여, ITR은 또한 AAV 게놈 패키징, 전사, 비-허용 조건 하에서의 음성 조절, 및 부위-특이적 통합에 필수적이다 (Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
AAV 벡터는 전형적으로 ITR 사이에 rep 및 cap 유전자를 대체하는 전이유전자 발현 카세트를 포함한다. 벡터 입자는 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드 및 트랜스(trans)로 rep 및 cap 단백질을 발현하는 패키징/헬퍼(helper) 작제물로 세포를 동시-트랜스펙션함으로써 생성된다. 감염 중에, AAV 벡터 게놈은 세포 핵으로 들어가서 다수의 분자 상태로 지속될 수 있다. 하나의 일반적인 결과는 제2-가닥 합성 또는 상보적 가닥 쌍 형성에 의한 이중 가닥 원형 에피솜으로의 AAV 게놈의 반전이다.
AAV 벡터의 맥락에서, 개시된 벡터는 전형적으로 다음 구조를 포함하는 재조합 게놈을 갖는다:
(5'AAV ITR) - (프로모터) - (전이유전자) - (3'AAV ITR)
상기 논의된 바와 같이, 이들 재조합 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자를 대체하는 ITR 사이에 전이유전자 발현 카세트를 포함한다. 벡터 입자는, 예를 들어, 재조합 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드 및 트랜스로 rep 및 cap 단백질을 발현하는 패키징/헬퍼 작제물로 세포를 동시-트랜스펙션함으로써 생성된다.
전이유전자는 조절 서열, 예컨대 5' 코자크 서열 및/또는 3' 폴리아데닐화 신호에 의해 플랭킹될 수 있다.
본원에서 기재된 AAV ITR, 및 다른 선택된 AAV 구성요소는, 제한되는 것은 아니지만, AAV1, AAV2, AAV2-QuadyF, AAV2.7m8, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, Anc80, AAV7m8, AAVrh10, AAV-PHP.eB, AAV-PHP.S, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV2.GL, AAV2.NN, AAVAnc80_L065 및 이것들의 기능적 변이체를 포함하는 임의의 AAV 혈청형 중에서 쉽게 선택될 수 있다. 이들 ITR 또는 다른 AAV 구성요소는 당업자에게 이용 가능한 기술을 사용하여 AAV 혈청형으로부터 쉽게 단리될 수 있다. 이러한 AAV는 학교, 상업용, 또는 공용 공급처 (예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, Va.)로부터 단리되거나 얻어질 수 있다. 대안으로, AAV 서열은 공개되 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적합한 수단을 통해 얻어질 수 있으며, 예컨대 문헌 또는 예를 들어, GenBank, PubMed, 등과 같은 데이터베이스에서 이용 가능하다. 본 개시내용은 아직 확인되거나 특성화되지 않았을 수 있는 다른 혈청형의 AAV 게놈의 사용을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
일부 구체예에서, 재조합 AAV 벡터 게놈은 광수용체-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신 키나아제 (RK) 또는 그것의 임의의 변형을 가질 수 있다. 재조합 AAV 벡터 게놈은 해당 분야에 공지된 임의의 프로모터를 가질 수 있으며 본원에서 개시된 것 및/또는 Kaneshiro, K., Wu, Z., Li, T., Sieving, P., & Colosi, P. (2011). Evaluation of Viral and Human Retinal Promoters in AAV8 Vectors. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 52(14), 491에 개시된 것들을 포함한다.
AAV는 현재 유전자 요법에 가장 빈번하게 사용되는 바이러스 중 하나이다. AAV는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키지만, 질환을 유발하지 않는 것으로 알려져 있고 매우 가벼운 면역 반응을 유도한다. AAV를 활용하는 유전자 요법 벡터는 AAV를 활용하는 유전자 요법 벡터는 분화 세포 및 정지 세포 둘 다를 감염시킬 수 있고 숙주 세포의 게놈으로 통합되지 않고 염색체 외 상태를 지속할 수 있다. AAV의 이로운 특징 때문에, 본 개시내용은 본원에서 개시된 재조합 핵산 분자 및 방법에 AAV의 사용을 고려한다.
AAV는 표적 세포에 결합하여 표적 세포로 들어가고, 핵에 들어가는 능력, 연장된 기간 동안 핵에서 발현되는 능력, 및 저독성을 포함한, 유전자 요법 벡터에 대한 여러 바람직한 특징들을 가지고 있다. 하지만, AAV 게놈의 작은 크기는 통합될 수 있는 이종성 DNA의 크기를 제한한다. 이 문제를 최소화하기 위해, Rep 및 통합 효율 요소 (integration efficiency element: IEE)를 암호화하지 않는 AAV 벡터가 구성되었다. ITR은 패키징에 필요한 cis 신호이기 때문에 유지된다 (Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
유전자 요법에 적합한 rAAV를 생성하기 위한 방법이 공지되어 있으며 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; 및 2013/0072548; 및 Ghosh et al., Gene Ther 13(4):321-329, 2006을 참조하면 된다), 본원에서 개시된 재조합 핵산 분자 및 방법과 함께 활용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 핵산은 발현 카세트 또는 전이유전자의 일부이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 20150139953을 참조하면 된다. 발현 카세트는 전이유전자 및 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 및 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부위 (ITR)로 구성된다. 한 바람직한 구체예에서, AAV 혈청형 2 또는 8의 ITR이 사용된다. 하지만, 다른 적합한 혈청형의 ITR이 선택될 수도 있다. 발현 카세트는 전형적으로 캡시드 단백질로 패키징되고 선택된 숙주 세포에 전달된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용은 AAV 혈청형 캡시드, 또는 이것의 일부를 가진 재조합 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 아데노 연관 바이러스 (AAV) 혈청형 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; AAV 역위 말단 반복부위 (ITR) 및 전이유전자로 구성된 발현 카세트; 및 AAV 캡시드 단백질로의 발현 카세트의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 20150139953을 참조하면 된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용은 전이유전자와 작동 가능한 조합으로 광수용체 특이적 프로모터 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터와 관련이 있다. 전이유전자는 본원에서 개시된 바와 같이 Kv8.2, 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 관심있는 단백질을 암호화하는, 전이유전자에 측접한 벡터 서열에 이종성인, 핵산 서열이다. 핵산 암호화 서열은 숙주 세포에서 전이유전자 전사, 번역, 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다.
발현 카세트는 숙주 세포에 전달되는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어, 플라스미드에서 운반될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 플라스미드는 원핵 세포, 포유류 세포, 또는 둘 다에서의 복제 및, 선택적으로는, 통합에 적합한 방식으로 조작될 수 있다. 이들 플라스미드 (또는 5' AAV ITR-이종성 분자-3' ITR을 가지고 있는 다른 벡터)는 진핵세포 및/또는 원핵세포에서 발현 카세트의 복제를 허용하는 서열 및 이들 시스템을 위한 선택 마커를 포함한다. 바람직하게는, 발현 카세트를 가지고 있는 분자가 세포로 트랜스펙션되며, 그것은 일과성으로 존재할 수 있다. 대안으로, 발현 카세트 (5' AAV ITR-이종성 분자-3' ITR을 가지고 있음)는 염색체로 또는 에피솜으로서 숙주 세포의 게놈으로 안정하게 통합될 수 있다. 특정 구체예에서, 발현 카세트는 다수의 카피로, 선택적으로 머리 대 머리(head-to-head), 머리 대 꼬리(head-to-tail), 또는 꼬리 대 꼬리(tail-to-tail) 연쇄체로 존재할 수 있다. 적합한 트랜스펙션 기술이 공지되어 있으며 발현 카세트를 숙주 세포로 전달하는데 쉽게 활용될 수 있다.
일반적으로, 트랜스펙션에 의해 발현 카세트를 포함하는 벡터를 전달할 때, 벡터 및 숙주 세포에 대한 벡터 DNA의 상대적인 양은 선택된 벡터, 전달 방법 및 선택된 숙주 세포와 같은 요인들을 고려하여 조정될 수 있다. 발현 카세트에 더하여, 숙주 세포는 숙주 세포에서 AAV 캡시드 단백질의 발현을 구동시키는 서열 및 발현 카세트에서 발견되는 AAV ITR의 혈청형, 또는 교차 보충 혈청형과 같은 혈청형의 rep 서열을 포함한다. rep 및 cap을 제공하는 분자(들)은 숙주 세포 내에 일과성으로 존재할 수 있지만 (즉, 트랜스펙션을 통해), rep 및 cap 단백질 중 하나 또는 둘 다 및 그것들의 발현을 제어하는 프로모터(들)이, 예를 들어, 에피솜으로서 또는 숙주 세포의 염색체로의 통합에 의해 안정하게 발현되는 것이 바람직하다.
숙주 세포로의 벡터의 도입은, 다른 것들 중에서도, 트랜스펙션, 감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅된 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질 융합을 포함하는, 해당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 또는 상기 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 아데노바이러스 유전자 중 하나 이상은 숙주 세포의 게놈으로 안정하게 통합되거나, 에피솜으로서 안정하게 발현되거나, 또는 일과성으로 발현될 수 있다. 유전자 생성물은 모두 에피솜에서 일과성으로 발현되거나 안정하게 통합될 수 있거나, 또는 유전자 생성물 중 일부는 안정하게 발현될 수 있지만 다른 것들은 일과성으로 발현된다. 게다가, 아데노바이러스 유전자 각각에 대한 프로모터는 구성성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 고유한 아데노바이러스 프로모터로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 프로모터는 유기체 또는 세포의 특이적인 생리학적 상태에 의해 (즉, 분화 상태에 의해 또는 복제 세포나 정지 세포에서) 또는, 예를 들어, 외인성으로 추가된 인자에 의해 조절될 수 있다.
AAV 기술은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내(in vivo) 유전자 전달을 위한 이들 및 다른 바이러스 벡터 시스템에서의 사용을 위해 조정될 수 있다. 특정 구체예에서 본 개시내용은 다양한 rAAV 및 비-rAAV 벡터 시스템에서 본원에서 개시된 핵산 및 벡터의 사용을 고려한다. 이러한 벡터 시스템은, 다른 것들 중에서도, 예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 수두바이러스, 우두바이러스, 및 아데노바이러스 시스템을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 기재된 바이러스 입자, 핵산 및 벡터가 다양한 목적을 위해, 예컨대 치료 단백질의 유전자 발현을 위한 치료 분자의 전달을 위해 유용하다는 것이 고려된다.
본원에서 보고된 핵산 (예를 들어, 프로모터와 작동 가능하게 조합된)에 의해 암호화된 치료 단백질은 망막 장애의 치료에 사용된 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, CDSRR을 가진 대상체에서 망막 기능을 회복시키는 방법이 개시된다. 방법은 본원에서 기재된 KCVN2 핵산 서열을 포함하는 벡터 (예컨대 AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 망막 장애, 예컨대 CDSRR을 가진 대상체이다.
변형으로, 발명자들은 일부 다른 공지된 캡시드와 비교하여 최대 100배 더 높은 형질도입 용량을 갖는 것으로 나타난 AAV2/8 혈청형에서 신규한 KCVN2 유전자의 전달을 나타냈다. 망막에서, AAV2/8은 AAV2/2 및 AAV2/5와 비교하여 더 효율적인 벡터인 것으로 나타났으며; 그것은 특히 광수용체에서 더 빠른 발병 및 더 강력하고 더 높은 전이유전자 발현 둘 다를 제공하였다.
일부 구체예에서, 본 개시내용은 코돈-최적화된 인간 KCVN2 (칼륨 전압 개폐식 채널 변경자 서브패밀리 V 구성원 2)를 가지고 있는 아데노 연관된 바이러스 혈청형 8 (AAV2/8) 벡터를 사용하여 CDSRR을 치료하기 위한 유전자 전달 방법과 관련이 있다. 추가의 변형으로, 본 개시내용은 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터의 발현 하에 코돈-최적화된 인간 KCVN2를 가지고 있는 아데노 연관된 바이러스 혈청형 8 (AAV2/8) 벡터를 사용하여 CDSRR을 치료하기 위한 유전자 전달 방법과 관련이 있다. 이 벡터는 본원에서 AAV2/8.RK.hKCVN2라고 언급될 수 있다.
전이유전자를 암호화하는 벡터의 전달은, 예를 들어, 대상체로의 직접적인 투여에 의해, 예를 들어, 벡터의 망막하 주사에 의해 이루어질 수있다. 추가의 예에서, 벡터의 전달은, 예를 들어, 황반 및/또는 중심와 영역에서 임의의 질환 상태의 환자의 하나 또는 두 눈에 벡터를 주사함으로써 이루어질 수 있다.
추가의 변형으로, 전이유전자를 암호화하는 벡터의 전달은, 예를 들어, 대상체로의 직접적인 투여에 의해, 예를 들어, 벡터의 망막하 주사에 의해 이루어질 수 있다. 추가의 예에서, 벡터의 전달은, 예를 들어, 황반 및/또는 중심와 영역에서 임의의 질환 상태의 환자의 하나 또는 두 눈에 벡터를 주사함으로써 이루어질 수 있다. 이 변형으로, AAV2/8.RK.hKCVN2는 Pluronic F68 (0.001%), 0.10 ml, 5E9 내지 5E11 벡터 게놈의 용량 범위를 갖는 중성 포스페이트 완충된 식염수에서 전달될 수 있다.
일반적으로, 전달은 주사에 의한 핵산, 예컨대 본원에서 개시된 벡터의 직접적인 망막, 망막하 또는 유리체내 전달에 의해 이루어질 수 있다. 예에서, 전달은 망막, 망막하 공간 또는 유리체내 공간으로으 주사에 의해 이루어질 수 있다.
그러므로 발명자들은 또한 필요로 하는 환자에서 이영양증, 특히 CDSRR을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 직접적인 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 핵산, 예컨대 본원에서 개시된 벡터의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
관련된 양태에서, 본 발명은 직접적인 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 본원에서 개시된 핵산, 예컨대 벡터를 환자에게 투여함으로써 망막 장애, 예컨대 이영양증, 특히 CDSRR을 치료하거나 예방하는 방법에서 상기 벡터의 사용을 제공한다.
추가적으로, 발명자들은 직접적인 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 망막 장애, 예컨대 이영양증, 특히 CDSRR을 치료하거나 예방하기 위한 의약의 제조에서 본원에서 개시된 핵산, 예컨대 벡터의 사용을 제공한다.
본 발명은 또한 망막 장애, 이영양증, 특히 CDSRR의 치료에 사용하기 위해 본원에서 개시된 핵산, 예컨대 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 망막, 망막하 공간 또는 유리체내 공간으로 직접적으로 투여된다.
본원에서 개시된 핵산, 예컨대 벡터의 투여는 전형적으로 직접적인 망막 또는 망막하 주사에 의해 이루어진다. 이것은 원추 광수용체 세포 및/또는 간상 광수용체 세포로의 직접적인 전달을 포함한다.
선택적으로, 본 개시내용의 조성물은 다른 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 방부제, 또는 화학적 안정화제를 포함할 수 있다. 적합한 예시의 방부제는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
재조합 바이러스 입자, 캡시드, 또는 벡터는 세포를 트랜스펙션하고 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하여 과도한 역효과 없이, 또는 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있는 의학적으로 허용 가능한 생리학적 효과와 함께 치료적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로는 원하는 장기 (예를 들어, 눈)로의 직접적인 전달, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여 경로는, 원하는 경우, 조합될 수 있다.
재조합 바이러스 입자, 캡시드, 또는 벡터의 투약량은 주로 치료되는 병태, 환자의 연령, 체중 및 건강 상태와 같은 요인들에 따라 달라질 것이고, 따라서 환자들마다 다를 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 치료적으로 유효한 인간 투약량은 일반적으로 약 1x109 내지 1x1016개 게놈 바이러스 벡터의 농도를 포함하는 용액의 약 0.1 ml 내지 약 100 ml의 범위에 있다.
본 개시내용의 재조합 바이러스 벡터는 유기체가 단백질에 대한 중화 항체를 갖는 경우에도 생체 내에서 또는 생체 외에서 선택된 숙주 세포에게 선택된 단백질을 전달할 수 있는 효율적인 유전자 전달 비히클을 제공한다. 한 구체예에서, 본원에서 개시된 벡터와 세포는 생체 외에서 혼합되며; 감염된 세포는 통상적인 방법론을 사용하여 배양되고; 형질도입된 세포는 환자에게 재주입된다.
도 1로 돌아가서, 개시된 벡터. 서열 번호: 2의 개시된 코돈 최적화된 KCVN2 유전자를 전달하기 위한 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 가질 수 있다:
혈청형 AAV2/8의 벡터
로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)
서열 번호: 2의 코돈 최적화된 KCVN2 유전자
프로모터와 KCNV2 유전자 사이에 코자크 공통 서열 (서열 번호: 8), KCNV2 유전자 다음에 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE) (서열 번호: 9) 및 WPRE의 다운스트림에 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A)) (서열 번호: 10) 신호를 포함하는 조절 요소. 개시된 벡터는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
도 2로 돌아가서, 제2의 개시된 벡터. 서열 번호: 2의 개시된 코돈 최적화된 KCVN2 유전자를 전달하기 위한 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 가질 수 있다:
AAV 벡터
로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)
서열 번호: 2의 코돈 최적화된 KCVN2 유전자
EGFP 강화된 녹색 형광 단백질
프로모터와 KCNV2 유전자 (서열 번호: 2) 사이에 코자크 공통 서열 (서열 번호: 8), KCNV2 유전자 (서열 번호:2) 다음에 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE) (서열 번호: 9) 및 WPRE (서열 번호: 9)의 다운스트림에 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A))(서열 번호: 10) 신호를 포함하는 조절 요소.
도 3으로 돌아가서, 제3의 개시된 벡터. 서열 번호: 2의 개시된 코돈 최적화된 KCVN2 유전자를 전달하기 위한 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 가질 수 있다:
AAV 벡터
로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)
서열 번호: 2의 코돈 최적화된 KCVN2 유전자
EGFP 강화된 녹색 형광 단백질
프로모터와 KCNV2 유전자 (서열 번호: 2) 사이에 코자크 공통 서열 (서열 번호: 8), CMV 프로모터 (서열 번호: 7), KCNV2 유전자 다음에 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)(서열 번호: 9) 및 WPRE (서열 번호: 9)의 다운스트림에 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A)) 신호 (서열 번호: 10)를 포함하는 조절 요소.
도 4로 돌아가서, 제4의 개시된 벡터.
서열 번호: 2의 개시된 코돈 최적화된 KCVN2 유전자를 전달하기 위한 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 가질 수 있다:
AAV 벡터
로돕신 키나아제 (RK) 프로모터 (서열 번호: 6)
서열 번호: 2의 코돈 최적화된 KCVN2 유전자
EGFP 강화된 녹색 형광 단백질
프로모터와 KCNV2 유전자(서열 번호: 2) 사이에 코자크 공통 서열 (서열 번호: 8), CMV 프로모터 (서열 번호: 7), lac 프로모터, KCNV2 유전자 다음에 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)(서열 번호: 9) 및 WPRE (서열 번호: 9)의 다운스트림에 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A)) 신호 (서열 번호: 10)를 포함하는 조절 요소.
AAV 혈청형 선택
발명자들의 예시의 개시내용에서, 발명자들은 일부 다른 공지된 캡시드와 비교하여 최대 100배 더 높은 형질도입 용량을 갖는 것으로 나타난 AAV2/8 혈청형을 선택하였다. 발명자들은 또한 Anc80 혈청형을 선택하였다. 망막에서, AAV2/8은 AAV2/2 및 AAV2/5과 비교하여 더 효율적인 벡터인 것으로 나타났으며; 그것은 특히 광수용체에서 더 빠른 발병 및 더 강력하고 더 높은 전이유전자 발현 둘 다를 제공하였다. 하지만, Anc80 혈청형이 또한 AAV2/8을 대신해서 사용된다.
프로모터
망막 기능의 구제를 제공하는데 필요한 KCNV2 유전자 발현의 필요한 수준이 알려져 있지 않지만, KCVN2의 발현은 원추 광수용체 세포 및 간상 광수용체 세포 둘 다에 대해 제한될 수 있다고 생각된다. KCNV2 유전자가 채널 단백질을 암호화하기 때문에, 다양한 망막 세포에서의 편재한 발현은 의도되지 않은 결과일 수 있다. 발명자들의 치료 작제물에 대해 발명자들은 이미 공개된 로돕신 키나아제 (RK) 프로모터를 사용하기로 결정하였는데 광수용체에 대해서만 전이유전자 발현을 제한하기 때문이다.
KCNV2 유전자
인간 KCNV2 유전자 (NCBI 참조 서열: NM_133497.4; 앙상블(Ensemble) 유전자 ENSG00000168263.9 및 전사물 KCNV2-201 ENST00000382082.4) (서열 번호: 1)가 발명자들의 작제물에 대해 선택된 전이유전자였다. KCNV2 전사물은 단 하나의 스플라이스 변이체를 갖고 2개의 엑손으로 구성된다. 전체 전사물 길이는 2178개 염기쌍 길이이고, 발명자들의 연구에 대한 기초로 사용된 암호화 서열 (CDS)은 1638개 염기쌍 길이이다 (서열 번호: 12).
작제물 설계 전에, 인간 KCNV2 CDS의 코돈 최적화된 버전이 Integrated DNA Technologies (IDT)의 코돈 최적화 도구 (https://sg.idtdna.com)를 사용하여 생성되었다. 이것에 대한 근거는 코돈 사용을 tRNA 생성게 연결시키는 것, 전사물 안정성을 개선하는 것 및 비정상적인 전사물 스플라이싱에 대해 보호하는 것이다. 사용된 IDT 알고리즘은 복잡성을 낮추고 2차 구조를 최소화하기 위해 스크리닝 및 필터링에 의해 최고의 서열 옵션을 제공한다.
조절 요소
모든 발명자들의 전이유전자 작제물은 또한 프로모터와 KCNV2 유전자 (서열 번호: 2) 사이에 코자크 공통 서열 (서열 번호: 8), KCNV2 유전자 (서열 번호: 2) 다음에 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE)(서열 번호: 9) 및 WPRE (서열 번호: 9)의 다운스트림에 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A))(서열 번호: 10) 신호를 포함하였다. 코자크 서열 (서열 번호: 8)은 진핵 mRNA 전사물에서 단백질 번역의 시작에 대해 기능한다. WPRE (서열 번호: 9)는, 전사될 때, 발현을 향상시키는 3차 구조를 생성하는 DNA 서열이다. 그것은 바이러스 벡터에 의해 전달된 유전자의 발현을 증가시키는데 사용된다. BGH 폴리(A) (서열 번호: 10)는 mRNA의 3' 단부에서 폴리(A) 꼬리의 형성을 초래하는, 진핵 세포내 단백질 발현을 위한 특수한 종결 서열이다. 이에 더하여, 핵에서 복제되는 포유류 DNA 바이러스는 세포의 폴리아데닐화 메커니즘을 활용한다. 폴리(A) 꼬리는 대부분의 mRNA의 안정성, 수송, 및 번역을 지지한다.
벡터의 제조
개시된 벡터는 요법을 위한 벡터의 공급을 위해 해당 분야에 공지된 표준 수단에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 잘 확립된 공유 트랜스펙션, 패키징 및 정제 방법이 적합한 벡터 조제물을 제조하는데 사용될 수 있다.
작제물은 다음 단계에 의해 개발되었다:
1. 작제물 설계
원하는 발현 수준을 달성하기 위해 어떤 프로모터가 사용되어야 하는지, 유전자가 코돈 최적화되어야 하는지, 어떤 폴리A 부위가 사용되는지 및 임의의 다른 공지된 조절 서열이 사용되어야 하는지 여부를 고려하여 치료 작제물의 설계가 실시되었다.
2. 작제물 조립
최종 작제물의 DNA 단편은 Genewiz에 의해 합성된 다음 pAAV 백본(backbone) 플라스미드로 클로닝되었다.
3. AAV로의 패키징
발명자들의 작제물이 pAAV 백본으로 클로닝되면, 그것은 정제되고 Qiagen의 상업적 키트를 사용하여 더 많은 양의 플라스미드가 제조되었다. 정제된 플라스미드는 AAV로 패키징되도록 보내졌다. AAV의 생성은 표준 프로토콜을 따른다. AAV2/8의 배치(batch)는 발명자들의 치료 플라스미드를 사용하여 제조되었고 드라이아이스에 저장되었다.
실시예
다음 실시예는 특정한 특징 및/또는 구체예를 보여주기 위해 제공된다. 이들 예는 기재된 특정한 특징 또는 구체예로 본 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
선택된 치료제에 대한 개념 증명(Proof-of-concept) 연구 (PC) - AAV8.RK.hKCNV2 유전자 요법은 초정상 b-파 진폭을 감소시킨다
발명자들의 기초 연구의 데이터를 테스트된 3개의 잠재적인 치료 생성물 중 어느 것이 발명자들의 선택된 생성물이 될 것인지에 대한 발명자들의 결정을 안내하는데 사용하였다. 야생형과 비교하여 평균 8배의 유전자 발현 증가를 나타내는 유전자 발현 데이터, 및 다른 생성물과 비교하여 미처리된 눈에 비해 더 큰 차이 및 유의한 감소를 나타낸 ERG 양성 b-파 데이터에 기초하여, 발명자들은 하기 실시예에 대한 발명자들의 치료 생성물로서 AAV8.RK.hKCNV2 벡터를 선택하였다. 하지만, 제한되는 것은 아니지만, AAV Anc80을 포함하는 다른 AAV 혈청형이 또한 의도된다는 것을 이해해야 한다. 하기에서 발명자들은 검증 데이터를 제공한다.
하기 마우스 예비 연구에 대한 프로토콜. 도 11 참조
1. 바이러스 입자 희석 및 저장
원래의 스톡(stock) 벡터를 -80℃에 저장하였다. 작용 스톡을 멸균 PBS에서 1x1012개 벡터 게놈 (vg) / ml로 희석하고, 0.2 ml 멸균 PCR 튜브 (SSIbo UltraFlux Flat 캡 PCR 튜브, Cat# 3220-00)에 20 μl 앨리쿼트로 앨리쿼트하였고, -80℃에 저장하였다. 주사일에, 희석된 앨리쿼트(들)를 주사 전에 얼음 위에서 (4℃)에서 해동시켰다. 하루에 주사액의 각각의 배치마다 새로운 앨리쿼트를 사용하였다. 주사 중에 앨리쿼트를 얼음 위에서 유지하였다. 해동된 앨리쿼트의 임의의 잔류 벡터 현탁액을 본 연구에서 사용으로부터 폐기하였다.
2. 망막하 주사
두 성별 모두의 P28-35 K8.2 KO 마우스를 케타민 (100mg/kg) 및 자일라진 (20 mg/kg)의 복강내 주사를 이용한 전신 마취 하에 배치하였다. 국부적인(topical) 1% 트로피카미드 (MYDRIACYL; Alcon)를 이용하여 동공을 확장시켰다.
수술 현미경 하에서, 30 게이지 바늘의 끝을 사용하여 눈의 측두 공막을 통해 작은 절개부를 만들었다. NanoFil 주사기에 적합한 35 게이지 스테인레스 강 비스듬한(beveled) 또는 뭉툭한(blunt) 바늘을 절개부를 통해 삽입하고 Ultra-Micro-Pump (World Precision Instrument) (SOP #1.06.08)를 사용하여 바이러스 현탁액/PBS를 망막하 공간으로 주사하였다.
각각의 처리된 동물은 한쪽 눈에 (n=10, 왼쪽 또는 오른쪽 눈으로 무작위로 할당됨) rAAV2/8-hGRK1-hKCNV2 (1x1012 GC/mL) 벡터 (서열 번호: 3) 1μl 망막하 주사를 받았다. 다른 눈은 주사되지 않은 채로 유지되었다. 대조군 동물은 한쪽 눈에 (n=10, 왼쪽 또는 오른쪽 눈으로 무작위로 할당됨) 멸균 1X 포스페이트 완충 용액 (PBS) 1μl의 망막하 주사를 받았지만 다른 눈은 주사되지 않은 채로 유지되어 내부 대조군의 역할을 한다 (n=20).
수포성 (수포) 망막 망막 박리로 표시되는 주사의 위치 및 범위를 체크하기 위해 OCT 검증을 나중에 실행하였다.
3. 망막전위도검사 (ERG)
처리 후 a-파 및 b-파 진폭이 개선되었는지를 결정하기 위해 KCNV2 KO 마우스에서 특정 시간 간격 (주사 후 4, 8 및 12 wk)으로 암소시 ERG 테스트를 수행하였다.
마우스를 ERG 실험 전에 밤새도록 (적어도 8 h) 암 적응시키고, 이후에는 희미한 적색광 하에서만 처리하였다. ERG를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 [6]. 마우스를 아이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마취하고, 국부적인 1% 트로피카미드 (MYDRIACYL; Alcon)를 이용하여 동공을 확장시켰다. 각각의 눈에 ERG 전극을 배치하기 전에 탈수를 방지하고 접촉을 용이하게 하기 위해 인공 윤활제 (하이드록시 프로필 메틸셀룰로오스)를 각막에 도포하였다. 참고로, 피하 바늘 전극을 마우스의 각각의 볼에 또는 턱 윤곽을 따라 배치하고, 접지전극을 꼬리 밑부분 위에 피하로 배치하였다.
다음 강도 (모두 cd·s m-2 단위)에서 1-ms 플래시의 제공에 의한 암 적응된 단일 플래시 강도 시리즈를 사용하여 ERG 기록을 얻었다: 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 및 25. 연이은 플래시 사이의 시간 간격 및 자극 강도에 따라 자극이 반복되고 (이후의 평균화를 위해) 달라지는 횟수; 0.1 내지 3 cd·s m-2에 대해 10 s 및 4회 반복, 및 10 내지 25 cd·s m-2에 대해 60 s 및 1회 반복. 일련의 광 플래시 사이에 60 sec의 공백이 있었다.
30 cd.s m-2의 배경 휘도에서 광 적응 후 주사 후 제4 주 및 제12 주에 명소시 ERG를 기록하였다. 다음 강도 (모두 cd·s m-2 단위)에서 1-ms 플래시의 제공에 의한 단일 플래시 강도 시리즈를 사용하여 ERG 기록을 얻었다: 0.3, 1, 3, 10, 및 25. 각각의 자극은 32회 반복되었으며 (이후의 평균화를 위해), 플래시 사이의 시간 간격은 0.5 s였다. 일련의 광 플래시 사이에 60 sec의 공백이 있었다. 그 전문이 본원에 참고로 포함된 (Collison, F.T., J.C. Park, G.A. Fishman, E.M. Stone, and J.J. McAnany, Two-color pupillometry in KCNV2 retinopathy. Doc Ophthalmol, 2019, 139(1), p. 11-20. doi:10.1007/s10633-019-09691-w)에서 상세히 설명된 바와 같이 ERG 반응으로부터 a-파 및 b-파에 대한 최대 진폭 및 암시적 시간(implicit time)을 추출하였다.
4. 광 간섭 단층 촬영 (OCT)
처리에 의해 미처리 또는 가처리된(sham treated) 눈과 비교하여 전체적인 망막층의 두께가 개선되었는지를 평가하기 위해 주사 후 0 내지 3일, 주사 후 2주 및 주사 후 12주에 OCT 이미지화를 수행하였다.
마우스를 마취시키고 앞서 기재된 바와 같이 동공을 확장시켰다. 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영 시스템 (Bioptigen Envisu R2200 SD-OCT 시스템)으로 OCT를 수행하였다. Bioptigen 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 망막층 두께를 측정하였다.
5. 조직병리학
5.1 절편화
주사 후 12주에 처리된 마우스와 PBS 주사된 마우스로부터 눈을 수거하였다. 간략히 말하면, 눈을 4% PFA에서 얼음 위에서 1h 동안 고정하였다. 각막 및 수정체를 절개하고 눈을 20% 수크로오스에서 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 다음 날 눈을 최적의 절단 온도의 화합물에서 냉동시키고 절편화 전에 -20℃에서 저장하였다. 망막 절편을 슈퍼 프로스트(super-frost) 슬라이드 (Hurst)에 수거하고 Leica Cryostat CM3050을 사용하여 14 μm로 절단하였다. 눈을 시상면(sagittal plane)으로 절편화하고 절편을 10개의 슬라이드에 걸쳐 순차적으로 수거하였다. 절편화 이후 추가의 분석 전에 슬라이드를 -20℃에서 저장하였다.
5.2 면역조직화학법
상응하는 연령의 처리군, 가주사, 비주사 KCNV2-/- 및 비주사 야생형 망막의 냉동 망막 절편에서 Kv8.2 단백질의 존재를 (Skarnes, W.C., B. Rosen, A.P. West, M. Koutsourakis, W. Bushell, V. Iyer, A.O. Mujica, M. Thomas, J. Harrow, T. Cox, D. Jackson, J. Severin, P. Biggs, J. Fu, M. Nefedov, P.J. de Jong, A.F. Stewart, and A. Bradley, A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature, 2011, 474(7351), p. 337-42. doi:10.1038/nature10163)에서 공개된 프로토콜에 따라 Kv8.2 항체 (Antibodies Inc, USA, Cat 75-435/73-435)를 사용하여 제자리에서(in situ) 평가하였다. 발명자들은 또한 로돕신 (Rho) (Abcam, Cat# Ab3424) 및 원추체 아레스틴 (Arr3) (Millipore, Cat# AB15282)의 제자리 발현을 평가하였다.
6.0 질적인 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 통한 유전자 발현
처리된 마우스 및 가처리된 마우스의 망막의 전체 RNA를 Trizol 시약을 사용하여 그리고 공개된 프로토콜에 따라 주사 후 12주에 추출하였다. RNA 샘플을 제조사의 권장된 프로토콜에 따라 ProtoScript® II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB, Cat #E6560S) 또는 QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen Cat #205311)를 사용하여 역전사효소에 의해 상보적 DNA (cDNA)로 전사시켰다. cDNA를 qRT-PCR 반응에 대한 주형으로 사용하였다.
KCNV2, 원추체 아레스틴 및 로돕신 발현 수준을 Taqman 기반 검정 (Thermo Fisher) 및 Real-Time PCR 검출기 (Bio-Rad CFX Connect Real-Time System)를 사용하여 평가하였다.
데이터의 통계 분석
OCT 이미지화로부터의 망막층 두께, ERG 반응으로부터의 a-파 및 b-파에 대한 최대 진폭 및 암시적 시간, 조직학으로부터의 망막층 두께, 및 처리된 눈, PBS 처리된 눈 및 미처리된 눈으로부터의 qRT-PCR로부터 KCNV2, 원추체 아레스틴 및 로돕신의 mRNA 발현 수준을 평균 및 표준편차 값을 얻어서 비교하였다. 표준 t-테스트/일원(one way) ANOVA를 적용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
실시예 2
도 5로 돌아가서, 발명자들은 망막 기능을 회복시키기 위한 예시의 방법을 보여준다. 예를 들어, KCVN2 유전자의 돌연변이로 인해, 초정상 간상체 반응을 동반한 원추체 이영양증이 표적 병태이다. 한 예에서, 치료적 개입은 AAV8.RK.hKCVN2 (서열 번호: 3)이며, 이 경우에는 서열 번호: 2로 개시된 코돈 최적화된 KCVN2일 것이다. 예시의 주입 양생법은 1회 이상의 망막하 주사로 전달되는 0.10ml 중의 5E9-5E11vg로 나타난다. 본원에서 논의된 바와 같이, 벡터의 설계는 구체적으로 광수용체 세포에 대한 유전자 발현 및 더 구체적으로는 망막의 황반 및/또는 중심와 영역에서의 발현을 표적으로 한다. 예상되는 결과는 양성 b-파 진폭의 감소이며 이는 시각 기능의 개선과 연관성이 있다.
실시예 3
도 6으로 돌아가서, 발명자들은 개념 증명 연구의 개요를 제공한다. 1기는 야생형 동물에 대한 기초 연구이다. 이것은 전달 접근법을 먼저 테스트하고 망막하 주사의 유용성을 검정하는 것을 포함한다 (FS1로 지정됨). 망막하 공간으로 액체를 주사하면 그것을 지지하는 망막 색소 상피 (RPE)의 광수용체의 일시적 및 중심적 분리인 수포가 생성된다. 수포 분해 시기는 광수용체 기능의 지표이다. 주사일, 뿐만 아니라 주사 후 2주 및 12주에 OCT 이미지화를 사용하여 결과를 측정한다. 광 간섭 단층 촬영 (OCT)은 비-침습성 이미지화 테스트이다. OCT 이미지화는 광 파(light wave)를 사용하여 망막의 단면도 사진을 촬영한다. 이것은 망막의 독특한 층의 시각화를 허용하고, 층의 맵핑(map)을 허용하고 층 두께를 측정하는 것을 허용한다.
전달 접근법의 검증 후, 광수용체를 표적으로 하는 원하는 프로모터가 확인된다 (FS2로 지정됨). RK 및 CMV 프로모터를 비교하여 광수용체를 표적으로 하는 각각의 능력을 결정하였다. 이 경우에 결과는 주사 후 12주에 망막의 조직학적 분석에 의해 측정된다.
기능적 안전성에 대한 평가를 수행하여 망막 기능에 대한 망막하 주사의 효과를 평가하였다 (FS3으로 지정됨). 결과는 주사 후 4, 8 및 12주에 망막전위도 (ERG) 기록에 의해 측정된다.
II기는 Kv8.2 KO 동물에서 조사 제품 선택 연구를 포함한다. 이 단계에서, 각각 상이한 AAV 혈청형 및 프로모터를 가진 3개의 치료 제품을 비교하였다. 3개의 치료 제품은, 예를 들어, AAV8.RK.hJCVN2, Anc80.RK.hKCVN2, 및 AAV8.CMV.hKCVN2이다. 주사 안전성에 관한 결과는 주사일, 주사 후 2 및 12주에 OCT 이미지화에 의해 측정된다. 기능적 평가에 관한 결과는 주사 후 4, 8, 및 12주에 ERG 기록에 의해 측정된다. 유전자 발현에 관한 결과는 주사 후 12주에 망막 KCVN2 유전자 발현 분석에 의해 측정된다.
도 7로 돌아가서, 발명자들은 III기, 개념 증명 연구를 요약한다. PC1에서 발명자들은 서열 번호: 2의 최적화된 KCVN2 유전자를 발현하는 벡터의 효능을 확립한다. 상기 실시예 1에 요약된 처리 프로토콜. 대조군은 비주사 마우스, 제품이 망막하로 주사된 야생형 마우스를 포함한다. 이것들을 AAV8.RK.hKCVN2 (예를 들어, 서열 번호: 3)의 처리로 주사된 Kv8.2 KO 동물과 비교한다. 결과는 OCT (주사 후 0, 3, 및 12주에), ERG (주사 후 4, 8, 및 12주에) 및 KCVN2 유전자 발현 데이터 (주사 후 12주에)에 의해 측정된다. PC2에, 시각 기능의 회복을 평가하여 더 높은 용량으로 처리를 전달하는 효과를 살펴보았다. 본원에서, AAV8.RK.hKCVN2 (예를 들어, 서열 번호: 3) 처리를 2회 투약 양생법으로 망막하로 주사한다: 2x10^9 vg 및 5x10^9 vg. 대조군은 비주사 마우스이다. 결과는 OCT (주사 후 0, 3, 및 12주에), ERG (주사 후 4, 8, 및 12주에) 및 KCVN2 유전자 발현 데이터 (주사 후 12주에)에 의해 측정된다. PC3에서, 안전성 및 생물학적 분배를 평가한다. 발명자들은 Kv8.2 KO 동물에서 AAV8.RK.hKCVN2 (예를 들어, 서열 번호: 3)의 일방적 망막하 주사의 안전성 및 생물학적 분배를 평가한다. 3개의 처리군이 망막하 주사에 의해 처리를 받는다: PBS인 비히클만을 받는 군 1; 1x10^9 vg/눈의 용량으로 처리를 받는 군 2; 및 5x10^9 vg/눈의 용량으로 처리를 받는 군 3. 모든 동물은 동형접합성 Kv8.2 KO이다. 결과는 안구 검사, ERG, 혈액학 및 임상화학, 안구 조직병리학, 및 주요 장기에서 vg의 생물학적 분배에 의해 측정된다. 동물을 주사 후 4 및 12주에 검사한다.
전체적으로, 이들 기초 연구의 데이터를 사용하여 3개의 잠재적인 치료 제품 중 어떤 것을 사용할지 결정하였다. 유전자 발현 데이터에 기초하여, 개시된 서열 번호: 2는 야생형 KCVN2와 비교하여 평균 8배의 유전자 발현 증가를 나타냈다. ERG 양성 b-파 데이터는 테스트된 다른 제품과 비교하여 미처리된 눈에 비해 더 큰 차이 및 유의한 감소를 나타냈다. 그러므로, AAV8.RK.hKCVN2 벡터 (서열 번호: 3)를 치료적 처리 제품으로 선택하였다.
선택된 결과
야생형과 비교하여 처리된 눈의 기능적 ERG 분석
도 8로 돌아가서, 논의된 바와 같이 도 8은 개시된 방법, 시스템, 및 핵산 서열을 사용하여 처리된 마우스와 미처리 마우스 간의 비교를 제공한다. 대상체 (예컨대 CDSRR을 가진 대상체)에서 광수용체 기능을 회복시키기 위한 서열 번호: 2 및 추가로 벡터 서열 번호: 3로의 처리의 효능을 평가하기 위해서, 양성 b-파 ERG 진폭을 처리된 눈 (Kv8.2 동물로 표시되는 CDSRR 동물), 미처리 눈 (Kv8.2 동물로 표시되는 CDSRR 동물), 및 야생형 눈 (야생형 동물) 사이에서 비교하였다. 주사 후 4, 8 및 12주에 AAV8.Rk.hKCNV2로 처리된 Kv8.2 KO 마우스 (Kv8.2 KO Tx), 미처리된 Kv8.2 KO 마우스 (Kv8.2 KO UTx) 및 미처리된 야생형 간의 평균 양성 b-파 진폭 비교. 데이터는 2개의 상이한 자극 강도 (10 및 25 cd.s/m2)로 나타난다. 데이터는 평균 ± SD로 나타나고 통계적 유의성은 터키 보정(Turkey's correction)과 함께 이원(two-way) ANOVA에 의해 실행된다. *P<0.024; **P<0.003, ***P<0.0003 및 P<0.0001. 이 도 8에서 나타난 바와 같이, 서열 번호: 2, 및 추가로, 서열 번호: 3의 1회의 망막하 주사는 미처리 눈과 비교하여 초정상 양성 b-파를 크게 감소시키에 충분하였다. b-파는 플래시와 반응 피크 사이의 시간 또는 광 자극에 반응하는 망막의 전기적 활성을 측정한다. Kc8.2 미처리 동물과 비교하여 처리된 Kv8.2 KO 동물에서 시간이 흐름에 따라 망막 반응 시간이 감소하기 때문에 이 데이터는 서열 번호: 2 및 추가로 서열 번호: 3에 의한 광수용체 기능의 회복을 지지한다.
처리 후 망막 유전자 발현
도 9는 처리된 망막에 대한 야생형 (WT), 비주사에서의 원추체 (a, 원추체 아레스틴) 및 간상체 (B, 로돕신) 표시의 상대적인 유전자 발현을 보여준다. *P<0.05; *P<0.01. 대상체 (예컨대 CDSRR을 가진 대상체)에서 광수용체 기능을 회복시키기 위한, 간상체 및 원추체 건강 상태에 대한 서열 번호: 2 및 추가로 벡터 서열 번호: 3으로의 처리의 효능을 추가로 평가하기 위해서, 로돕신 및 원추체 아레스틴에 대한 유전자 발현 수준을 평가하였다. 로돕신은 간상체 건강 상태에 대한 마커이다. 아레스틴은 원추체 건강 상태에 대한 마커이다. 도 9는 야생형, 비주사 Kv8.2 동물 및 주사된 Kv8.2 동물에서 로돕신 및 원추체 아레스틴의 발현 수준을 나타낸다. 이 데이터는 서열 번호: 2 및 추가로 서열 번호: 3으로의 처리가 원추체 아레스틴의 유전자 발현을 초래한다는 것을 입증한다. 원추체 아레스틴은 미처리 망막과 비교하여 처리 후 유전자 발현 수준의 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다. 로돕신 수준은 처리된 망막 및 미처리 망막 둘 다에서 WT와 비교하여 감소되는 것으로 보였지만, 이것은 통계적으로 유의하지 않았다.
도 10으로 돌아가서, 인간 KCVN2 펩타이드에 대한 항체를 사용하는 Kv8.2 서브유닛의 조직학적 분석 및 면역조직화학적 표지는 망막의 주사된 부분 내에서의 발현을 나타냈지만 미처리 영역에서는 Kv8.2 단백질의 발현이 나타나지 않았다. 구체적으로, 도 10은 처리 후 12주에 서열 번호: 3에 의해 전달되는 것처럼 서열 번호: 2로 주사된 Kv8.2 KO 마우스의 망막에서 인간 Kv8.2 서브유닛의 망막 발현의 대표적인 이미지를 나타낸다. (A) 왼쪽에 처리된 영역 및 오른족에 미처리된 영역을 나타내는 망막 절편의 광시야도. 스케일 막대 = 200μM. (i) 인간 Kv8.2의 발현을 나타내는 처리된 영역의 고배율 삽도. (ii) Kv8.2 발현을 나타내지 않는 미처리 영역의 삽도. (i) 및 (ii)에 대한 스케일 막대 = 25μM.
야생형과 비교하여 처리된 눈의 기능적 ERG 분석
도 12 및 도 13은 개시된 방법, 시스템, 및 핵산 서열을 사용하여 처리된 마우스과 미처리 마우스 간의 비교를 제공한다. 대상체 (예컨대 CDSRR을 가진 대상체)에서 광수용체 기능을 회복시키기 위해 서열 번호: 2로의 처리 및 및 서열 번호: 3의 벡터에서 전달된 바와 같은 처리의 효능을 평가하기 위해, a-파 진폭 및 양성 b-파 ERG 진폭을 처리된 (Kv8.2 동물로 표시되는 CDSRR 동물), 미처리된 (Kv8.2 동물로 표시되는 CDSRR 동물), 및 야생형 눈 (야생형 동물) 사이에서 비교하였다. 야생형 (WT), Kv8.2 KO 미처리 (비주사) 눈 및 치료 제품 AAV8.RK.hKCNV2 (서열 번호: 3)의 5e9 바이러스 게놈이 망막하로 처리된 Kv8.2 KO 눈의 암소시 (간상체-매개됨) 망막전위도 (ERG) 기록의 정량화. 처리 후 4주 또는 동등한 연령-일치 대조군에서 기록을 얻었다. WT, n=12; 비주사, n=11; AAV8.RK.hKCNV2, n=12. 터키 다중 비교 테스트(Tukey's multiple comparison test)와 함께 이원 ANOVA, *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005, ****p<0.0001. 데이터는 서열 번호: 3의 벡터에서 전달된 것처럼 서열 번호: 2로의 처리가 대상체, 예컨대 Kv8.2 KO 동물로 표시되는 CDSRR을 가진 대상체에서 광수용체 기능을 회복시킨다는 것을 입증한다.
도 14는 야생형 (WT), Kv8.2 KO 미처리 (비주사) 및 치료 제품 AAV8.RK.hKCNV2의 3e9 바이러스 게놈으로 망막하로 처리된 Kv8.2 KO 눈으로부터의 25 cd.s/m2에서 암소시 진동소파전위 1 (oscillatory potential 1: OP1)의 정량화를 입증한다. 처리 후 12주 또는 동등한 연령-일치 대조군에서 기록을 얻었다. WT, n=10; 비주사, n=6; AAV8.RK.hKCNV2, n=6. 터키 다중 비교 테스트와 함께 이원 ANOVA, ****p<0.0001. 데이터는 서열 번호: 3의 벡터에서 전달된 것처럼 서열 번호: 2로의 처리가 대상체, 예컨대 Kv8.2 KO 동물로 표시되는 CDSRR을 가진 대상체에서 광수용체 기능을 회복시킨다는 것을 입증한다.
도 15는 야생형 (WT), Kv8.2 KO 미처리 (비주사) 및 치료 제품 AAV8.RK.hKCNV2의 5e9 바이러스 게놈으로 망막하로 처리된 Kv8.2 KO 눈으로부터의 c-파의 정량화를 입증한다. 처리 후 4주에 또는 동등한 연령-일치 대조군에서 기록을 얻었다. WT, n=12; 비주사, n=9; AAV8.RK.hKCNV2, n=15. 터키 다중 비교 테스트와 함께 이원 ANOVA, ****p<0.0001. 데이터는 서열 번호: 3의 벡터에서 전달된 것처럼 서열 번호: 2로의 처리가 대상체, 예컨대 Kv8.2 KO 동물로 표시되는 CDSRR을 가진 대상체에서 광수용체 기능을 회복시킨다는 것을 입증한다.
시운동 행동 반응
도 16 및 도 17은 처리 후 12주에 처리된 Kv8.2 KO 마우스의 명소시 및 암소시 시력과 암소시 대비 민감도의 개선을 입증한다. 처리된 동물에 AAV8.RK.hKCNV2의 3e9 바이러스 게놈 용량을 망막하로 제공하였고 (n=3-6) 연령-일치 미처리 (비주사, n=3-5) 및 WT (n=8) 동물과 비교하였다. 이원 ANOVA, 시닥 사후 다중 비교(Sidak's multiple comparison post-hoc), **p=0.0015, ****p<0.0001. 처리된 AAV8.RK.hKCNV2에 대한 WT는 유의하지 않았다.
유전자 및 단백질 발현 데이터
도 18, 도 19, 및 도 20은 처리 후 12주에 처리된 Kv8.2 KO 눈에서 Kv8.2 단백질 및 KCNV2 유전자 발현을 나타내는 조직학 데이터이다. 도 18은 망막하로 주사된 눈의 망막 절편의 개요이며 처리된 영역은 인간 Kv8.2 서브유닛 (초록색)의 발현을 나타내고 미처리된 영역은 Kv8.2 발현을 나타내지 않는다. 도 19는 처리된 영역 및 미처리 영역의 고배율 이미지를 제공하며 Kv8.2 발현 (초록색), Kv2.1 발현 (빨간색) 및 세포핵 (파란색)을 나타낸다. 스케일 막대 = 50μm. 도 20은 야생형에 대해 표준화된 처리된 눈에서의 인간 KCNV2 유전자의 발현을 나타내는 실시간 정량 PCR의 데이터를 제공한다. N = 3 눈.
도 21 및 도 22는 본원에서 개서된 인간 KCVN2 암호화 영역 (서열 번호: 12) 및 최적화된 KCVN2 (서열 번호: 2)의 비교를 입증하는 서열 정렬을 제공한다. 윗줄은 인간 KCVN2 (서열 번호: 12)의 핵산을 포함한다. 아랫줄은 서열 번호: 2의 핵산을 포함한다. 서열 번호: 2는 인간 서열 번호: 12와 대략 76% 동일성을 공유한다.
기재된 방법 또는 조성물의 정확한 상세한 설명은 기재된 구체예의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 달라지거나 변형될 수 있다는 것은 분명하다. 발명자들은 하기 청구항의 범위 및 사상 내에 있는 이러한 모든 변형 및 변화를 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> ARTEMA THERAPEUTICS INC. <120> KCNV2 VARIANTS AND THEIR USE <130> 209-301PCT <150> US 63/191,106 <151> 2021-05-20 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13728 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13728) <223> Human KCVN2 (full nucleotide sequence) <400> 1 gccctaaaaa cgtcttccta ccattcctgg aattctacct tgaaacatgt ctctatcctt 60 taagagaaag ggaggagata aaaaggagag agagaagctg aagctgactc aaagatccga 120 ctggacctga acagtgcccc agggagaatc catttgaaaa aaaaaaaaaa atgtgatcat 180 gtgaatggac aagaaggaga tggctttaga tcttatatgc tctaaacgaa gagttacgct 240 gagagggaaa ctgacttgtc atgaagtcag ctttgttccg ttgctatgtg tcatccctgc 300 taatggtgag tttacctagg gcagaggcta ccatctcaac catgaagctg aagacacagg 360 catccgtatt ctatagctaa ttcagttgat ttcatctcag cacacataca ctgagcgctt 420 cctaagagcg aggttgaccg acatttttat tagcaataat ctctgccttc ttctgattac 480 ctagagattt aagaccacat aatcatcctc tacctcacag ggtcaaggga gtgggggagg 540 aaatgggcta agaggttcta aatccctcct aacacttgct tcttccaaat cagcaagatt 600 agagcagtca acagctgact gcgttcagac cctgcaggct gggctggcct gcccaggacc 660 tgagaagggg cagctccggt ggcaatgtct gagcccctag ctgtgctggt ccgggctggc 720 ctctctaaga cagtgcaggc cacgtgatcc atcctcctag aggcagtgag caggtgaggg 780 acccctacca cagccaggag gaaaaagcta ggcgtccact ttccgcagcc atgctcaaac 840 agagtgagag gagacggtcc tggagctaca ggccctggaa cacgacggag aatgagggca 900 gccaacaccg caggagcatt tgctccctgg gtgcccgttc cggctcccag gccagcatcc 960 acggctggac agagggcaac tataactact acatcgagga agacgaagac ggcgaggagg 1020 aggaccagtg gaaggacgac ctggcagaag aggaccagca ggcaggggag gtcaccaccg 1080 ccaagcccga gggccccagc gaccctccgg ccctgctgtc cacgctgaat gtgaacgtgg 1140 gtggccacag ctaccagctg gactactgcg agctggccgg cttccccaag acgcgcctag 1200 gtcgcctggc cacctccacc agccgcagcc gccagctaag cctgtgcgac gactacgagg 1260 agcagacaga cgaatacttc ttcgaccgcg acccggccgt cttccagctg gtctacaatt 1320 tctacctgtc cggggtgctg ctggtgctcg acgggctgtg tccgcgccgc ttcctggagg 1380 agctgggcta ctggggcgtg cggctcaagt acacgccacg ctgctgccgc 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ataaaacaca 3960 taaagaataa tgttactcag gttgtatttt taccagtaaa tttttttgaa ctgaataccc 4020 attgatctca cttaaatttc tgatctgttc aatgtacaat gaagtctaaa cctttcaaat 4080 tatctctttt tatgttaact ggcactatgt aactcaaaat caatgttttt cataaatttt 4140 acaaaaattg aatcaccagt ttttgccaat cataaatgtt accaattatt gctcttatct 4200 gtatgaattt ccttttgaag ccattatctc tatcagccac tattttcata ggcccaattt 4260 tgcacattcc aaccatccca tttacaaacc ttacccttta tcaatggtct ttgtccattt 4320 tattctgaaa attatttata ccagtaaaat tcgttacaaa ttagataaaa gactgatcat 4380 ctgtatttat ttctaaacta atctatgaaa acaatgggag caattgccct tgaatattct 4440 aagaccgctc tgttccccag gactgctatg ttattaatcc agttcttctc tgtacttcta 4500 actacactcc ataatacaga ctaaaggttc atattctcaa tagagcaaag agaaaagaac 4560 acattgaatt gatgtggaca aaatgtcttg tttccggtat gtagatgcaa agtgaaaaga 4620 aacaaaacat taggaccaat ttgtcatata acccacaaaa attcacctta ttcattcatt 4680 gaacagtaag tttttgagca cctccaatgt gcccagtagt attcttaaca ctagggatac 4740 agggtaggag aagaaaaaac aatcaagttt tttctcttct ggagcttaca 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297 <210> 7 <211> 583 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(583) <223> CMV Promoter nucleotide sequence <400> 7 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgt 583 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KOZAK nucleotide seq <400> 8 gccgccacc 9 <210> 9 <211> 542 <212> DNA <213> Woodchuck Hepatitis Virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(542) <223> Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) <400> 9 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cg 542 <210> 10 <211> 215 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(215) <223> Bovine growth hormone polyadenylation (BGH) poly(A) <400> 10 gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180 gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 215 <210> 11 <211> 545 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(545) <223> KCVN2 Amino Acid Sequence <400> 11 Met Leu Lys Gln Ser Glu Arg Arg Arg Ser Trp Ser Tyr Arg Pro Trp 1 5 10 15 Asn Thr Thr Glu Asn Glu Gly Ser Gln His Arg Arg Ser Ile Cys Ser 20 25 30 Leu Gly Ala Arg Ser Gly Ser Gln Ala Ser Ile His Gly Trp Thr Glu 35 40 45 Gly Asn Tyr Asn Tyr Tyr Ile Glu Glu Asp Glu Asp Gly Glu Glu Glu 50 55 60 Asp Gln Trp Lys Asp Asp Leu Ala Glu Glu Asp Gln Gln Ala Gly Glu 65 70 75 80 Val Thr Thr Ala Lys Pro Glu Gly Pro Ser Asp Pro Pro Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Thr Leu Asn Val Asn Val Gly Gly His Ser Tyr Gln Leu Asp Tyr 100 105 110 Cys Glu Leu Ala Gly Phe Pro Lys Thr Arg Leu Gly Arg Leu Ala Thr 115 120 125 Ser Thr Ser Arg Ser Arg Gln Leu Ser Leu Cys Asp Asp Tyr Glu Glu 130 135 140 Gln Thr Asp Glu Tyr Phe Phe Asp Arg Asp Pro Ala Val Phe Gln Leu 145 150 155 160 Val Tyr Asn Phe Tyr Leu Ser Gly Val Leu Leu Val Leu Asp Gly Leu 165 170 175 Cys Pro Arg Arg Phe Leu Glu Glu Leu Gly Tyr Trp Gly Val Arg Leu 180 185 190 Lys Tyr Thr Pro Arg Cys Cys Arg Ile Cys Phe Glu Glu Arg Arg Asp 195 200 205 Glu Leu Ser Glu Arg Leu Lys Ile Gln His Glu Leu Arg Ala Gln Ala 210 215 220 Gln Val Glu Glu Ala Glu Glu Leu Phe Arg Asp Met Arg Phe Tyr Gly 225 230 235 240 Pro Gln Arg Arg Arg Leu Trp Asn Leu Met Glu Lys Pro Phe Ser Ser 245 250 255 Val Ala Ala Lys Ala Ile Gly Val Ala Ser Ser Thr Phe Val Leu Val 260 265 270 Ser Val Val Ala Leu Ala Leu Asn Thr Val Glu Glu Met Gln Gln His 275 280 285 Ser Gly Gln Gly Glu Gly Gly Pro Asp Leu Arg Pro Ile Leu Glu His 290 295 300 Val Glu Met Leu Cys Met Gly Phe Phe Thr Leu Glu Tyr Leu Leu Arg 305 310 315 320 Leu Ala Ser Thr Pro Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Ser Ala Leu Asn 325 330 335 Leu Val Asp Leu Val Ala Ile Leu Pro Leu Tyr Leu Gln Leu Leu Leu 340 345 350 Glu Cys Phe Thr Gly Glu Gly His Gln Arg Gly Gln Thr Val Gly Ser 355 360 365 Val Gly Lys Val Gly Gln Val Leu Arg Val Met Arg Leu Met Arg Ile 370 375 380 Phe Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Thr Gly Leu Arg Ala Phe 385 390 395 400 Gly Phe Thr Leu Arg Gln Cys Tyr Gln Gln Val Gly Cys Leu Leu Leu 405 410 415 Phe Ile Ala Met Gly Ile Phe Thr Phe Ser Ala Ala Val Tyr Ser Val 420 425 430 Glu His Asp Val Pro Ser Thr Asn Phe Thr Thr Ile Pro His Ser Trp 435 440 445 Trp Trp Ala Ala Val Ser Ile Ser Thr Val Gly Tyr Gly Asp Met Tyr 450 455 460 Pro Glu Thr His Leu Gly Arg Phe Phe Ala Phe Leu Cys Ile Ala Phe 465 470 475 480 Gly Ile Ile Leu Asn Gly Met Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Asn Lys Phe 485 490 495 Ser Asp Tyr Tyr Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Glu Tyr Thr Thr Ile Arg 500 505 510 Arg Glu Arg Gly Glu Val Asn Phe Met Gln Arg Ala Arg Lys Lys Ile 515 520 525 Ala Glu Cys Leu Leu Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Pro Arg Gln Glu 530 535 540 Asn 545 <210> 12 <211> 1638 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1638) <223> Human KCVN2 (coding region nucleotide sequence) <400> 12 atgctcaaac agagtgagag gagacggtcc tggagctaca ggccctggaa cacgacggag 60 aatgagggca gccaacaccg caggagcatt tgctccctgg gtgcccgttc cggctcccag 120 gccagcatcc acggctggac agagggcaac tataactact acatcgagga agacgaagac 180 ggcgaggagg aggaccagtg gaaggacgac ctggcagaag aggaccagca ggcaggggag 240 gtcaccaccg ccaagcccga gggccccagc gaccctccgg ccctgctgtc cacgctgaat 300 gtgaacgtgg gtggccacag ctaccagctg gactactgcg agctggccgg cttccccaag 360 acgcgcctag gtcgcctggc cacctccacc agccgcagcc gccagctaag cctgtgcgac 420 gactacgagg agcagacaga cgaatacttc ttcgaccgcg acccggccgt cttccagctg 480 gtctacaatt tctacctgtc cggggtgctg ctggtgctcg acgggctgtg tccgcgccgc 540 ttcctggagg agctgggcta ctggggcgtg cggctcaagt acacgccacg ctgctgccgc 600 atctgcttcg aggagcggcg cgacgagctg agcgaacggc tcaagatcca gcacgagctg 660 cgcgcgcagg cgcaggtcga ggaggcggag gaactcttcc gcgacatgcg cttctacggc 720 ccgcagcggc gccgcctctg gaacctcatg gagaagccat tctcctcggt ggccgccaag 780 gccatcgggg tggcctccag caccttcgtg ctcgtctccg tggtggcgct ggcgctcaac 840 accgtggagg agatgcagca gcactcgggg cagggcgagg gcggcccaga cctgcggccc 900 atcctggagc acgtggagat gctgtgcatg ggcttcttca cgctcgagta cctgctgcgc 960 ctagcctcca cgcccgacct gaggcgcttc gcgcgcagcg ccctcaacct ggtggacctg 1020 gtggccatcc tgccgctcta ccttcagctg ctgctcgagt gcttcacggg cgagggccac 1080 caacgcggcc agacggtggg cagcgtgggt aaggtgggtc aggtgttgcg cgtcatgcgc 1140 ctcatgcgca tcttccgcat cctcaagctg gcgcgccact ccaccggact gcgtgccttc 1200 ggcttcacgc tgcgccagtg ctaccagcag gtgggctgcc tgctgctctt catcgccatg 1260 ggcatcttca ctttctctgc ggctgtctac tctgtggagc acgatgtgcc cagcaccaac 1320 ttcactacca tcccccactc ctggtggtgg gccgcggtga gcatctccac cgtgggctac 1380 ggagacatgt acccagagac ccacctgggc aggttttttg ccttcctctg cattgctttt 1440 gggatcattc tcaacgggat gcccatttcc atcctctaca acaagttttc tgattactac 1500 agcaagctga aggcttatga gtataccacc atacgcaggg agaggggaga ggtgaacttc 1560 atgcagagag ccagaaagaa gatagctgag tgtttgcttg gaagcaaccc acagctcacc 1620 ccaagacaag agaattag 1638

Claims (14)

  1. 서열 번호: 2에 제시된 변형된 KCVN2 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호:2에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호: 2에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로서, 상기 서열은 서열 번호: 11의 펩타이드를 암호화하며, 상기 서열은 광수용체 활성을 회복시킬 수 있는, 변형된 KCVN2 뉴클레오타이드 서열.
  2. 제1 항의 변형된 KCVN2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  3. 제2 항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제3 항에 있어서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제2 항에 있어서, 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제4 항에 있어서, 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제4 항에 있어서, 서열 번호: 2에 작동 가능하게 연결된 RK 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제6 항에 있어서, 코자크 공통 서열, 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리(A)) 신호 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제7 항에 있어서, 요소들은 다음 순서로 5'에서 3'으로 배열되는 것을 특징으로 하는 벡터: RK 프로모터, 이어서 코자크 서열, 이어서 서열 번호: 2, 이어서 WPRE, 이어서 BGH 폴리(A) 신호.
  10. 엄중 조건 하에서, 서열 번호: 2에 혼성체화하고 광수용체 활성을 갖는 서열 번호: 11의 단백질을 암호화하는, KCVN2 뉴클레오타이드 서열.
  11. 제9 항에 있어서, RK 프로모터, 코자크 서열, WPRE, 및 BGH 폴리(A) 신호에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 KCVN2 뉴클레오타이드 서열.
  12. 약학적으로 허용 가능한 비히클에서 제2 항의 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제11 항에 있어서, 국소적, 전신적, 또는 국부적 투여를 위해 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제12 항에 있어서, 경구, 비강, 폐, 볼, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥내, 또는 근육내 투여를 위해 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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US6727353B2 (en) * 2000-04-14 2004-04-27 Icagen, Inc. Nucleic acid encoding Kv10.1, a voltage-gated potassium channel from human brain
EP2283038A1 (en) * 2008-04-30 2011-02-16 Dublin City University Compositions and methods for expressing in-frame multimeric proteins
WO2013016418A2 (en) * 2011-07-27 2013-01-31 The Regents Of The University Of Michigan Ion channel probes and methods of use thereof
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