CN111138549A

CN111138549A - 一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113

Info

Publication number: CN111138549A
Application number: CN202010003448.4A
Authority: CN
Inventors: 宋亚锋
Original assignee: Beijing Huirun Hezhong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Huirun Hezhong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2020-05-12

Abstract

本公开是关于一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113，编码所述融合蛋白的核酸，包含所述核酸的载体、细胞，上述融合蛋白、核酸、载体、细胞在制备治疗肌萎缩的药物的用途，以及包含上述核酸、载体或细胞的药物组合物。本发明采用生物信息学和蛋白组学模型重建Up113，保持了螺旋之间的相互作用和固有的稳定的蛋白结构；改变抗肌肉萎缩蛋白的内在的结构，从而降低其与T细胞表面第二类组织相容性复合物(MHCII)的结合力，使T细胞无法激发相应的B细胞进一步分裂分化产生对应于外源蛋白的抗体来达到抑制免疫反应的目的,通过改造抗肌肉萎缩蛋白的免疫原性将大大提高其稳定性；设计的Up113基因疗法可以提高肌肉的功能，对杜氏型肌营养不良症起到治疗作用。

Description

一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113

技术领域

本公开涉及融合蛋白技术领域，尤其涉及一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113。

背景技术

杜氏型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是最常见的致命性儿童基因疾病之一，DMD疾病源于人类最大的基因(2.3百万碱基，79外显子)的变异[1,2]，其中大多数突变是散发性多个外显子移码缺失(frameshifting deletions)，导致DMD抗肌肉萎缩蛋白(抗肌肉萎缩相关蛋白)缺失；或者外显子缺失发生在框内(in frame deletion)导致短片的抗肌肉萎缩蛋白[3,4]。抗肌萎缩蛋白在细胞骨架肌动蛋白和跨膜肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)之间形成重要的机械连接，这些蛋白质共同保护肌纤维膜免受肌肉收缩期间产生的应力[5,6]。在缺乏抗肌肉萎缩蛋白的情况下，DGC不稳定，肌纤维膜变得非常脆弱，导致肌纤维坏死，炎性细胞浸润，肌纤维再生以及最终肌纤维被结缔组织取代并伴有进行性肌硬化和收缩性丧失，肌肉随着年龄的增长会逐渐退化消失，包括呼吸肌，常因呼吸肌的退化导致呼吸功能的减退，产生肺部并发症或呼吸衰竭而导致死亡，平均寿命大约20-30岁[7,8]。虽然使用糖皮质激素，ACE抑制剂和机械通气支持联合治疗可暂时减缓进展速度，但最终的临床过程是不可阻挡的，疾病的最后阶段在护理等方面支付巨额的费用[9]。

近年来，由于DMD的病理生理复杂性和广泛性，促使针对DMD分子和细胞靶标的研究日益深入。其中包括干扰NFkappaB信号传导[10,11]，外显子跳跃和终止密码子抑制[12]，以及基因编辑DMD基因[13-15]，但这些方法只能有限缓解病理生理发展速度或针对有限数量的具有特定突变的患者。只有解决原发病因，才有可能“结束杜氏”。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。DMD的基因治疗提供持久的治愈性治疗的可能性，早在20年前，Clemens[16]等人利用腺病毒为载体和肌肉注射引入全长的抗肌肉萎缩蛋白基因(12kb)，但由于复合载体衣壳产生强烈的免疫应答和有限的抗肌肉萎缩蛋白分布，这种方法已被放弃。之后研发衍生重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated viral,rAAVs)的多种载体，由于其种类多样、免疫原低、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等特点，rAAVs被广泛应用于基因研究和基因治疗载体之一[17-20]，科学家先后利用衍生的腺病毒为载体生成“迷你抗肌肉萎缩蛋白”在小鼠[21-24]和狗[25,26]实验结果显示DMD的病理、生理学和肌肉功能方面不同程度的改善，然而，使用该技术的I期临床试验发现了在具有DMD基因缺失的研究受试者的注射肌肉中靶向的细胞介导的免疫应答的证据，其结果导致迷你抗肌萎缩蛋白在短时间内消失[27]，同样，在使用相同人转基因进行全身性基因转移的预临床前研究中，抗肌营养不良蛋白缺陷型狗(GRMD)引起临床上严重的广泛性肌炎，对迷你抗肌萎缩蛋白的免疫反应，加剧了DMD病情的恶化[25]。其它DMD狗模型和非人类灵长类动物的研究揭示了诱导的外周对载体编码抗原的耐受性的局限性，尤其是在DMD肌肉中，迷你抗肌肉萎缩蛋白表达有助于改善DMD恶化进程，但是自身的免疫系统视为“异己”，因此，解决迷你抗肌肉萎缩蛋白的免疫应答难题是基因治疗DMD未来试验的设计首要考虑的问题[28]。

尽管绝大部分的DMD体内不表达抗肌营养不良蛋白,它的同源蛋白，Utrophin[29-31]抗肌肉萎缩相关蛋白结构与抗肌肉萎缩蛋白比约50％相同，正常仅在年幼的儿童的肌肉中高度表达，随着年龄增大抗肌肉萎缩相关蛋白表达逐渐减少，在成人仅在一些部位有少量的表达，如肌肉神经接点等。Tinsley等首先在mdx小鼠动物模型上证明，抗肌肉萎缩相关蛋白可代偿抗肌肉萎缩蛋白的功能，明显延缓肌营养不良病程的进展。上调的具体手段多种多样：直接导入完整或经剪裁的抗肌肉萎缩相关蛋白；病毒载体导入经剪裁的抗肌肉萎缩相关蛋白；激活抗肌肉萎缩相关蛋白的转录；在转录后稳定其mRNA，增加蛋白翻译等。其中筛选出的一些小分子已准备进入临床试验阶段。英国VASTox公司用于上调抗肌肉萎缩相关蛋白的小分子药物VOX C1100在2007年就取得欧洲药监局的孤药认证，并准备在2008年进入临床试验阶段，但并未真正实施。2010年美国BioMarin公司的BMN195开始健康志愿者的I期临床试验，但试验结果显示药物口服吸收不理想，无法达到治疗所需药物浓度，从而终止了进一步试验。虽然初期临床试验结果不理想，但上调抗肌肉萎缩相关蛋白仍是治疗DMD/BMD的一条重要途径，筛选合适药物成为关键。与与迷你抗肌肉萎缩蛋白基因治疗方法比较，这一治疗策略的优势在于利用体内已存在的蛋白，避免了针对新蛋白的免疫反应，但缺点是上调的迷你抗肌肉萎缩相关蛋白表达量太低，不足于募集跨膜肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)，从而大大降低的效果。利用衍生的腺病毒为载体生成“迷你抗肌肉萎缩相关蛋白”被科学家研究证实迷你抗肌肉萎缩相关蛋白能够替代抗肌萎缩蛋白的作用，恢复杜氏肌营养不良患者的肌肉功能[32-34]，2019年10月Song等人利用AVV9携带短链的迷你抗肌肉萎缩相关蛋白基因，迷你抗肌肉萎缩相关蛋白的表达在DMD小鼠和狗模型上成功提高了肌肉的功能和大大降低了CK,而迷你抗肌肉萎缩蛋白引起了强烈的免疫应答。

综上所述，现有文献中设计的迷你抗肌肉萎缩相关蛋白/抗肌萎缩蛋白的大多是简单的螺旋拼接，螺旋之间的相互作用丧失，导致蛋白结构发生改变，治疗效果不理想。此外，目前使用基因治疗人工导入剪切后的短抗肌萎缩蛋白可以较好的起到对此肌肉病的治疗效果，然而遇到的一个很大的问题就是无法去除抗肌萎缩蛋白的免疫原性。因此大大降低了抗肌萎缩蛋白的未来应用潜力。因此，仍需要一种具有保留蛋白结构、降低免疫原性的抗肌萎缩蛋白。

参考文献：

1.Hoffman,E.P.,R.H.Brown,Jr.,and L.M.Kunkel,Dystrophin:the proteinproduct of the Duchenne muscular dystrophy locus.Cell,1987.51(6):p.919-28.

2.Koenig,M.,A.P.Monaco,and L.M.Kunkel,The complete sequence ofdystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein.Cell,1988.53(2):p.219-28.

3.Monaco,A.P.,et al.,An explanation for the phenotypic differencesbetween patients bearing partial deletions ofthe DMD locus.Genomics,1988.2(1):p.90-5.

4.Koenig,M.,et al.,The molecular basis for Duchenne versus Beckermuscular dystrophy:correlation ofseverity with type of deletion.Am J HumGenet,1989.45(4):p.498-506.

5.Ibraghimov-Beskrovnaya,O.,et al.,Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellularmatrix.Nature,1992.355(6362):p.696-702.

6.Petrof,B.J.,et al.,Dystrophin protects the sarcolemma from stressesdeveloped during muscle contraction.Proc Natl Acad Sci U S A,1993.90(8):p.3710-4.

7.Birnkrant,D.J.,The American College of Chest Physicians consensusstatement on the respiratory and related management of patients with Duchennemuscular dystrophy undergoing anesthesia or sedation.Pediatrics,2009.123Suppl 4:p.S242-4.

8.McDonald,C.M.,et al.,The cooperative international neuromuscularresearch group Duchenne natural history study--a longitudinal investigationin the era of glucocorticoid therapy:design of protocol and the methodsused.Muscle Nerve,2013.48(1):p.32-54.

9.Ryder,S.,et al.,The burden,epidemiology,costs and treatment forDuchenne muscular dystrophy:an evidence review.Orphanet J Rare Dis,2017.12(1):p.79.

10.Monici,M.C.,et al.,Activation of nuclear factor-kappaB ininflammatory myopathies and Duchenne muscular dystrophy.Neurology,2003.60(6):p.993-7.

11.Messina,S.,et al.,Nuclear factor kappa-B blockade reduces skeletalmuscle degeneration and enhances muscle function in Mdx mice.Exp Neurol,2006.198(1):p.234-41.

12.Wood,M.J.,Toward an oligonucleotide therapy for Duchenne musculardystrophy:a complex development challenge.Sci Transl Med,2010.2(25):p.25ps15.

13.Long,C.,et al.,Postnatal genome editing partially restoresdystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.Science,2016.351(6271):p.400-3.

14.Nelson,C.E.,et al.,In vivo genome editing improves muscle functionin a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.Science,2016.351(6271):p.403-7.

15.Tabebordbar,M.,et al.,In vivo gene editing in dystrophic mousemuscle and muscle stem cells.Science,2016.351(6271):p.407-11.

16.Clemens,P.R.,et al.,In vivo muscle gene transfer of full-lengthdystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes.Gene Ther,1996.3(11):p.965-72.

17.Nichols,T.,et al.,Translational Data from AAV-Mediated GeneTherapy of Hemophilia B in Dogs.Hum Gene Ther Clin Dev,2014.

18.Arruda,V.R.,et al.,Regional intravascular delivery of AAV-2-F.IXto skeletal muscle achieves long-term correction of hemophilia B in a largeanimal model.Blood,2005.105(9):p.3458-64.

19.Chao,H.,et al.,Sustained and complete phenotype correction ofhemophilia B mice following intramuscular injection of AAV1 serotypevectors.Mol Ther,2001.4(3):p.217-22.

20.Rivera,V.M.,et al.,Long-term pharmacologically regulatedexpression of erythropoietin in primates following AAV-mediated genetransfer.Blood,2005.105(4):p.1424-30.

21.Wang,B.,J.Li,and X.Xiao,Adeno-associated virus vector carryinghuman minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdxmouse model.Proc Natl Acad Sci U S A,2000.97(25):p.13714-9.

22.Harper,S.Q.,et al.,Modular flexibility of dystrophin:implicationsfor gene therapy of Duchenne muscular dystrophy.Nat Med,2002.8(3):p.253-61.

23.Gregorevic,P.,et al.,Systemic delivery of genes to striatedmuscles using adeno-associated viral vectors.Nat Med,2004.10(8):p.828-34.

24.Gregorevic,P.,et al.,rAAV6-microdystrophin preserves musclefunction and extends lifespan in severely dystrophic mice.Nat Med,2006.12(7):p.787-9.

25.Kornegay,J.N.,et al.,Widespread muscle expression of an AAV9 humanmini-dystrophin vector after intravenous injection in neonatal dystrophin-deficient dogs.Mol Ther,2010.18(8):p.1501-8.

26.Yue,Y.,et al.,Safe and bodywide muscle transduction in young adultDuchenne muscular dystrophy dogs with adeno-associated virus.Hum Mol Genet,2015.24(20):p.5880-90.

27.Mendell,J.R.,et al.,Dystrophin immunity in Duchenne's musculardystrophy.N Engl J Med,2010.363(15):p.1429-37.

28.Greelish,J.P.,et al.,Stable restoration of the sarcoglycan complexin dystrophic muscle perfused with histamine and a recombinant adeno-associated viral vector.Nat Med,1999.5(4):p.439-43.

29.Tinsley,J.M.,et al.,Primary structure of dystrophin-relatedprotein.Nature,1992.360(6404):p.591-3.

30.Mead,A.F.,et al.,Comparative Phylogenomics of the Dystrophin/Utrophin Supergene Family:Implications for Gene Therapy in DMD ASGCT,2017.

31.Tinsley,J.M.,et al.,Amelioration of the dystrophic phenotype ofmdx mice using a truncated utrophin transgene.Nature,1996.384(6607):p.349-53.

32.Odom,G.L.,et al.,Microutrophin delivery through rAAV6 increaseslifespan and improves muscle function in dystrophic dystrophin/utrophin-deficient mice.Mol Ther,2008.16(9):p.1539-45.

33.Sonnemann,K.J.,et al.,Functional substitution by TAT-utrophin indystrophin-deficient mice.PLoS Med,2009.6(5):p.e1000083.

34.Kennedy,T.L.,et al.,Micro-utrophin Improves Cardiac and SkeletalMuscle Function ofSeverely Affected D2/mdx Mice.Mol Ther Methods Clin Dev,2018.11:p.92-105.

发明内容

为克服相关技术中存在的问题，本公开提供一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113。

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明采用生物信息学和蛋白组学模型重建Up113，提供了一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

优选地，所述融合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列按照从N端到C端的顺序，依次包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。

优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种核酸分子，其编码所述的融合蛋白。所述核酸分子可以是DNA也可以是RNA。所述核酸分子的核苷酸序列可以通过所述融合蛋白的氨基酸序列经常规的生物信息学运算得到，也可进一步根据宿主细胞的种类进行密码子优化。

另一方面，本发明还提供了一种核酸载体，其包含所述的核酸分子。

优选地，所述核酸载体为腺病毒载体。

另一方面，本发明还提供了一种细胞，其包含所述的核酸分子，和/或表达有所述的融合蛋白。所述细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，也可以是真核细胞，例如酵母、Hela、HEK293T。所述细胞可以是用于扩增所述核酸分子的细胞，也可以是用于产生所述融合蛋白的细胞。

另一方面，本发明还提供了所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞用于制备治疗杜氏型肌营养不良症和/或改善患者认知功能的药物的用途。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白、和/或所述的核酸分子、和/或所述的核酸载体、和/或所述的细胞，以及药学上可接受的载体或辅料。

本发明基于体内存在的Up113抗肌萎缩相互蛋白的亚型，结合抗肌萎缩的功能区的优化设计的重组短链的抗肌萎缩蛋白mUp113，在结构和功能上较之前都大大提高了稳定性，同时很大程度上规避了体内的免疫应答，同时比之前Utro_sp22_H4还要短(图1)体内的表达效率更高，且弹性柔型更好的设计，将能有效的保护肌细胞的损伤，提高肌肉的功能，从而达到治疗DMD的效果，是一个安全有效的治疗方案。与现有技术相比，本发明主要取得了如下的有益效果：

1)采用生物信息学和蛋白组学模型重建Up113，保持了螺旋之间的相互作用，和固有稳定的蛋白结构；

2)通过体内固有Up113编码序列，改变对抗肌肉萎缩蛋白的内在的结构，从而降低其与T细胞表面第二类组织相容性复合物(MHCII)的结合力，使T细胞无法激发相应的B细胞进一步分裂分化产生对应于外源蛋白的抗体来达到抑制免疫反应的目的,通过改造抗肌肉萎缩蛋白的免疫原性将大大提高其稳定性。

3)设计的Up113基因疗法不仅可以提高肌肉的功能，还可以改善DMD患者的认知功能。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1为全长的抗肌萎缩蛋白结构及经重组的融合蛋白mUp113的结构图。

图2为抗肌萎缩蛋白H1和H3的氨基酸序列7种连接方式组合示意图。

图3为抗肌萎缩蛋白H1和H3不同组合的柔性及免疫原性。

图4为两周龄mdx小鼠注射rAAV9-CMV-GFP一周后观察到心脏有高表达的GFP蛋白。

图5为新生mdx小鼠注射rAAV-CMV-MUp113四周后在心脏和膈肌上mUp113明显表达。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是对所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面进行说明性，不应当理解成限制本发明的范围。

一、mUp113迷你抗肌肉萎缩蛋白设计方案

抗肌肉萎缩相关蛋白在结构上可分为四个区。它的一端通过N端区与F－肌动蛋白结合，另一端通过半胱氨酸富含区、C端区和DGC相互作用与肌膜结合在一起，在肌组织中起到机械性的稳定细胞膜的作用。抗肌萎缩蛋白目前已经发现至少存在有8种同源蛋白，这些同源蛋白广泛分布于神经系统和肌肉组织中，并在其它组织中发现有Up395、Up140、Up113等表达。虽然目前对这些同源蛋白的功能知之不多，但这些抗肌萎缩蛋白亚型的存在为我们设计有功能性，稳定的迷你抗肌肉萎缩蛋白提供了理论依据。mUp113迷你抗肌肉萎缩相关保留N端区ABD(如SEQ ID NO:2所示)和H1区，C端H3连接SP21/22(如SEQ ID NO:3所示)、H4(如SEQ ID NO:4所示)和CH(如SEQ ID NO:5所示)部分(图1)，为进一步保持迷你抗肌肉萎缩相关蛋白的柔性，同时保持结构的稳定性，对H1/H3进行柔性预测，H1远离细胞膜一侧每减少一个氨基酸，连接H3靠近肌丝端增加一个氨基酸，设计了7种连接方式(图2)，利用pep-fold3在线预测其柔性，其中在7组不同组合的中，柔性排序及IEDB进行免疫原性的分析(图3)，综上连接的稳定性、柔型及免疫应答分析，重组蛋白设计5(如SEQ ID NO:1所示)确定为最佳选择，MUp113迷你抗肌肉萎缩蛋白在结构稳定性、功能和免疫应答等方面较其他都有着明显的优势，其重组蛋白MUp113的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

二、高滴度rAAV-CMV-mUp113制备的过程和方法

1.人工合成mUp113的基因表达框

因为AAV通常能够包装的基因长度在5Kb以内，DMD修复基因采用了功能性截短体。为了达到更好的基因表达活性，我们利用人工合成的方法合成了密码子优化的(3402bp，889aa)mUp113的基因表达框，启动子使用的是高效的CMV启动子，RNA稳定元件采用了具有WPRE和SV40PA功能的缩小版的CW3L序列(Choi et al.Molecular Brain 2014,7:17)，该基因表达框置于pBluescript SK(+)载体的Not1酶切位点之间，得到pBlue-CMV-mUp113-CW3L质粒载体。这样预期获得的rAAV-CMV-mUp113-CW3L实际包装的基因片段长度约为5020bp。

2.构建穿梭载体质粒pFD-Rep-Cap9-(ITR-CMV-mUp113-CW3L)

接下来，通过Not1酶切位点将携带有rAAV-CMV-OptimUTRO基因组的pBlue-CMV-OptimUTRO-CW3L质粒中的OptimUTRO基因表达框置换到穿梭载体质粒pFD-Rep-Cap9-(ITR-GOI)中，得到pFD-Rep-Cap9-(ITR-CMV-mUp113-CW3L)，该穿梭质粒携带的是9型AAV的衣壳蛋白基因Cap9，所以包装得到的将是9型rAAV。

3.利用新型OneBac系统大规模制备rAAV-CMV-mUp113-CW3L

为了制备大量、高滴度、高质量的rAAV，我们采用了杆状病毒感染昆虫Sf9细胞制备rAAV的新型高效OneBac系统(Wu et al.Mol Ther Methods Clin Dev.2018Jul4；10:38-47.)，按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备重组杆状病毒(BEV)，首先将重组穿梭质粒pFD-Rep-Cap9-(ITR-CMV-OptimUTRO-CW3L)转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac进行Tn7转座酶介导的同源重组，获得含有rAAV-CMV-OptimUTRO-CW3L基因组的重组杆粒BacmidDNA。然后，将Bacmid DNA转染到昆虫Sf9细胞中，继续培养直到产生明显的BEV感染导致的细胞病变现象(CPE)，收集细胞培养上清液，其中含有大量BEV/Rep-Cap9-(ITR-CMV-mUp113-CW3L)。然后用该BEV接毒感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72h后，收集Sf9细胞沉淀进行后续rAAV的纯化。

4.rAAV-CMV-mUp113-CW3L的纯化和滴度测定

感染后收集的Sf9细胞以2×107cells/mL的密度重新悬浮于裂解液中(50mM Trisand 2mM MgCl2[pH 7.5])。细胞在液氮和37℃水浴中反复冻融3次，裂解液中加入50U/mL的核酸酶(benzonase，Sigma)和150mM的NaCl在37℃处理1小时。然后2,500×g离心15min，上清液继续用碘克沙醇(iodixanol)密度梯度离心纯化(Strobel et al.Hum.GeneTher.Methods.2015；26:147-157)。主要步骤是：先将60％iodixanol(OptiPrep；Sigma)以缓冲PBS-MK Buffer(1×PBS,1mM MgCl2,2.5mM KCl)液配置15％,25％,40％,and 58％浓度的iodixanol梯度液，依次加入到39mL Quick-Seal tubes(Beckman Coulter)超速离心管中，然后再加入含有处理后的rAAV的裂解液上清，用Backman超速离心机的70Ti转子以63,000rpm在18℃离心2小时。离心后，吸取40％梯度相的溶液，用PBS缓存液透析处理，再用Amicon Ultra-15(MWCO,100kDa；Merck Millipore)超滤管离心超滤浓缩得到纯化的rAAV，分装后再-80度冻存。纯化后的rAAV病毒用荧光定量PCR进行滴度的测定，使用iQ SYBRGreen Supermix kit(Bio-Rad)，以10倍稀释的含有CMV序列的质粒做标准曲线，定量引物选取CMV启动子特异性定量引物CMV-F和CMV-R，病毒的滴度用vector genome(VG)/ml表示(Grieger et al.Nat.Protoc.2006；1:1412-1428)。

三、高滴度rAAV-CMV-mUp113功能评定

1.载体处理和组织储存

我们对新生MDX小鼠(第7天)和野生型(C57小鼠，Jackson实验室)随机盲选并使用Aramis Micro tattoo kit(Ketchum Manufacturing Inc,Canada)标记，随后进行腹腔注射(Hamilton,Model 1710SN syringe,Lot No.81008)，注射剂量为2.5x1012 rAAV-CMV-mUp113。以此为基础，，C57BL/10SNJ和MDX幼崽使用32号胰岛素注射器或是注射50-250μLPBS作为阴性对照，或是注射PBS稀释的rAAV-CMV-mUp113。注射前，对每只小鼠进行称重。给药后，所有小鼠回到窝中，断奶后分离。在大约8周龄时，MDX和C57BL/10SNJ小鼠根据机构政策进行CO2安乐死。取下心脏、胫骨前肌、腓肠肌、股四头肌、三头肌、腹部、膈肌、颞肌和肝脏，用于接下来的研究；根据研究显示，AAV9在小鼠体内的非靶基因表达低于100倍，因而其他部分被储存但未被利用。将指定的组织样本放入含有包埋模具(Richard AllanScientific)的OCT(组织-TEK)中，并在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻。将其他的指定生物组织样本放入组织容器中，并在液氮中快速冷冻。所有样本均在-80℃下保存。5-7μm厚的冷冻切片在-25℃下在低温恒温器(Microm^TM HM550，Thermo Scientific,美国)上切割并安装在玻片(Superfrost Plus，Fisher Scientific,美国)上，所有样本均保存在“6周注射的样本数据库”中。两周龄mdx小鼠腹腔注射1.1e1014 vg/kg rAAV9-CMV-GFP，一周后观察到心脏有高表达的GFP蛋白(图4)。

2.抗肌萎缩相关蛋白N-末端和C-末端双重染色

所有肌肉标本的切片均采用n末端多克隆和c末端单克隆抗体(不与原有蛋白结合与Utrophin进行结合)对Utrophin进行免疫染色。首先，在Triton X-100(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)1％溶液中孵育20分钟，再在0.01M PBS(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)中稀释，试样在PBS中冲洗三次，每次5分钟(3x 5分钟)。切片在5％正常驴血清中孵育15分钟，然后在37℃下与N-末端抗肌萎缩相关蛋白抗体(N-19，SC-7460，山羊多克隆IgG，Santa Cruz，CA，USA，稀释度1:50)孵育60分钟。在第二个循环3x5分钟PBS洗涤后，在室温下与5％正常驴血清孵育15分钟。制备的切片在37℃下含山羊多克隆二抗(sc-2024，Santa Cruz，CA，美国，稀释度1:300)的驴血清中孵育30分钟。在第三次pbs洗涤3×5分钟后，切片首先与10％正常山羊血清(invitrogen，Scotland，UK)孵育15分钟，然后与c-末端utrophin抗体(mancho7，小鼠单克隆蛋白igG2a，圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国，37℃下稀释1:25)60分钟。在PBS清洗3x5分钟并与10％正常山羊血清孵育后，将切片在37℃下含抗小鼠IgG2A的荧光粉594(A-21140，美国Life Technologies，稀释度1:300)的山羊血清中中孵育30分钟。再次在PBS中清洗3x5分钟并固定在Vectashield封固剂(H-1000)(载体实验室，加利福尼亚州，美国)或带有DAPI(H-1500)的封固剂(兽医实验室)上。使用徕卡DM6000B显微镜(莱卡，德国)进行照片拍摄。新生mdx小鼠注射rAAV-CMV-MUp113，4周后在心脏和膈肌上MUp113明显表达(图5)。

3.γ-跨膜/层粘连蛋白、MuRF-1/层粘连蛋白和MyHC-胚胎/层粘连蛋白的双重免疫荧光染色，MYH16

蛋白质的染色程序与前面描述的相同。兔抗γ-跨膜蛋白(NBP1-59744，NovusBiologicals，Littleton，Co)和MURF1(NBP1-31207，Novus Biologicals，Littleton，Co)多克隆抗体在PBS中与牛血清白蛋白(BSA)稀释1:50。MyHC-胚胎单克隆抗体(f1.652)(Developmental studies,Hybridoma Bank,Iowa，美国)在pbs中以1:50-1:100稀释使用。采用以1:500-1:1000稀释都得鸡层粘连蛋白多克隆抗体(ab14055-50，Abcam,Cambridge,MA，美国)和并使用抗鸡IgY(TR)抗体(ab7116，Abcam,Cambridge,MA，美国，稀释度1:300)作为二抗鉴定肌纤维。MYH16兔多克隆抗体肽序列是利用人和犬的MYH16“2环”区序列产生的。通过在犬颞肌中表达的显性肌球蛋白亚型的敏感和完全特异性结合得到验证。肽序列：LLALLFKEEEAPAGS。

4.苏木精-伊红染色(H&E)

厚度为7m的切片室温下风干15分钟。然后用Harris’苏木精染色2.5分钟，在蒸馏水中漂洗，在0.1％乙酸中浸泡15秒，然后在自来水中重复冲洗4分钟，用1％伊红复染1分钟。最后一步，在乙醇中脱水三次，每次2分钟。高倍视野(HPF)下对具有代表性的、不重叠的部分拍照记录。

5.免疫印迹分析

10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔加载20-40μg的全细胞或全肌肉裂解液。蛋白质被转移到聚二氟乙烯膜(PVDF膜)上。一抗是一种山羊多克隆抗体，N端定位检测μUtrophin，稀释液1∶500倍稀释(N-19，SC-760，圣克鲁斯，美国)，二抗是一种驴的与辣根过氧化物酶(Sigma Aldrich)偶联的抗山羊抗体，1:5000稀释。采用奥德赛红外成像系统(LI-COR)进行蛋白质检测和定量。用小鼠单克隆抗体(载体实验室VP-G803)和驴抗鼠偶联HRP二级抗体((Santa Cruz Biotechnology)检测γ-跨膜蛋白。

6.原位末端标记分析

切片最初固定在10％福尔马林磷酸盐缓冲液(Fisher Scientific，USA)中20分钟。然后使用TACS 2TdT荧光素凋亡检测试剂盒(Trevigen，Gaithersburg，MD，USA)如制造商说明所述对DNA片段进行原位缺口末端标记。

7.血清肌酸激酶(CK)测定

使用5mm动物手术刀(Goldenrod Animal Lancet，Braintree Scientific，Inc，Braintree，MA)经下颌下静脉穿刺采集血清。在肝素化采血管(Terumo，目录号：TMLH)中共采集150μl。在抽血后30分钟内对小鼠进行监控以观察潜在的窘迫迹象。临床病理实验室测定。

8.肌肉收缩性能的体外评价

采用Aurora Mouse 1200A系统，利用动态肌肉控制v.5.3软件，对2月龄mdx小鼠新鲜分离的肌肉进行等长收缩力、等长强直舒张力和ECCs后的力降等生理指标的测定。所有这些小鼠在安乐死和离体试验前24小时都进行了体内握力试验。在24℃下，EDL肌肉保持在持续氧合的Ringer溶液中(100mM NaCl,4.7mM KCl,3.4mM CaCl2,1.2mM KH2PO4,1.2mMMgSO4,25mM HEPES和5.5mM D-葡萄糖)。采用的抽搐刺激方案为单次刺激，持续时间为0.2毫秒。为了测量舒张力最大值，在120赫兹的频率下重复相同的刺激500毫秒。两次强直性收缩之间间隔5分钟，以确保肌肉恢复。调整肌肉长度，以获得最大的抽搐反应。这个长度是在肌腱连接的最外可见端之间测量的，并记录为最佳长度(L0)。在测试EDL的等距特性之后，一系列的六个偏心收缩(ECCS-每五分钟一次)被应用于周期中，重复的500毫秒等长收缩，然后在最后200毫秒将肌肉拉伸10％的L0，同时给予最大强直刺激。每个ECC报告的绝对力量对应于ECC等距阶段的峰值力。

9.mdx小鼠体内生理试验

为了减少偏差确保盲选实验的一致性和稳健性，我们使用了IACUC批准的协议。在24小时内，测量自发转轮距离。5分钟测定基线垂直运动，然后在原笼中休息3分钟。采用轴向力传感器测量力。测量下坡行驶距离时，跑步机坡度+15o，速度从10m/min(10min)、11m/min(1min)增加到12m/min(6min)。连续三次电击或17分钟的测定完成时实验结束。

序列表

<110> 北京辉润合众生物科技有限公司

<120> 一种抗肌萎缩融合蛋白mUp113

<141> 2020-01-02

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gln Gln Val Thr Ile Asp Gln Glu Pro Ser Ser Val Ser Gln Thr Arg

1 5 10 15

Ile Ala Ala His Pro Asn Val Gln Lys Val Val Leu Val Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Asp Ile Pro Val Gln Ser His Arg Thr Ser Glu Ile Ser Ile Pro

35 40 45

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Lys Tyr Gly Glu His Glu Ala Ser Pro Asp Asn Gly Gln Asn

1 5 10 15

Glu Phe Ser Asp Ile Ile Lys Ser Arg Ser Asp Glu His Asn Asp Val

20 25 30

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Ile Asn Ala Arg Phe Ser Lys Ser

35 40 45

Gly Lys Pro Pro Ile Asn Asp Met Phe Thr Asp Leu Lys Asp Gly Arg

50 55 60

Lys Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Thr Ser Leu Pro Lys

65 70 75 80

Glu Arg Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Arg Val

85 90 95

Leu Gln Val Leu His Gln Asn Asn Val Glu Leu Val Asn Ile Gly Gly

100 105 110

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Leu Trp

115 120 125

Ser Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asp Val Met Lys Asp Val Met

130 135 140

Ser Asp Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Thr Thr Arg Pro Tyr Ser Gln Val Asn Val Leu Asn Phe Thr

165 170 175

Thr Ser Trp Thr Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Val Leu His Arg His

180 185 190

Lys Pro Asp Leu Phe Ser Trp Asp Lys Val Val Lys Met Ser Pro Ile

195 200 205

Glu Arg Leu Glu His Ala Phe Ser Lys Ala Gln Thr Tyr Leu Gly Ile

210 215 220

Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Val Gln Leu Pro Asp Lys

225 230 235 240

Lys Ser Ile Ile Met Tyr Leu Thr Ser Leu Phe Glu Val Leu Pro

245 250 255

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Asn Arg Leu Leu Met Ser Leu Glu Glu Leu Ile Lys Trp Leu Asn Met

1 5 10 15

Lys Asp Glu Glu Leu Lys Lys Gln Met Pro Ile Gly Gly Asp Val Pro

20 25 30

Ala Leu Gln Leu Gln Tyr Asp His Cys Lys Ala Leu Arg Arg Glu Leu

35 40 45

Lys Glu Lys Glu Tyr Ser Val Leu Asn Ala Val Asp Gln Ala Arg Val

50 55 60

Phe Leu Ala Asp Gln Pro Ile Glu Ala Pro Glu Glu Pro Arg Arg Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ser Lys Thr Glu Leu Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Lys Ile

85 90 95

Ala Lys Ala Met Arg Lys Gln Ser Ser Glu Val Lys Glu Lys Trp Glu

100 105 110

Ser Leu Asn Ala Val Thr Ser Asn Trp Gln Lys Gln Val Asp Lys Ala

115 120 125

Leu Glu Lys Leu Arg Asp Leu Gln Gly Ala Met Asp Asp Leu Asp Ala

130 135 140

Asp Met Lys Glu Ala Glu Ser Val Arg Asn Gly Trp Lys Pro Val Gly

145 150 155 160

Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Ile Glu Lys Ile Met Ala

165 170 175

Phe Arg Glu Glu Ile Ala Pro Ile Asn Phe Lys Val Lys Thr Val Asn

180 185 190

Asp Leu Ser Ser Gln Leu Ser Pro Leu Asp Leu His Pro Ser Leu Lys

195 200 205

Met Ser Arg Gln Leu Asp Asp Leu Asn Met Arg Trp Lys Leu Leu Gln

210 215 220

Val Ser Val Asp Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gln

225 230 235

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ser Ser Gln His Phe Leu Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 300

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Thr Ser Val Gln Leu Pro Trp Gln Arg Ser Ile Ser His Asn Lys Val

1 5 10 15

Pro Tyr Tyr Ile Asn His Gln Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro

20 25 30

Lys Met Thr Glu Leu Phe Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg

35 40 45

Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Ile Lys Ile Arg Arg Leu Gln Lys Ala

50 55 60

Leu Cys Leu Asp Leu Leu Glu Leu Ser Thr Thr Asn Glu Ile Phe Lys

65 70 75 80

Gln His Lys Leu Asn Gln Asn Asp Gln Leu Leu Ser Val Pro Asp Val

85 90 95

Ile Asn Cys Leu Thr Thr Thr Tyr Asp Gly Leu Glu Gln Met His Lys

100 105 110

Asp Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu

115 120 125

Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Lys Ile Arg Val Gln Ser

130 135 140

Leu Lys Ile Gly Leu Met Ser Leu Ser Lys Gly Leu Leu Glu Glu Lys

145 150 155 160

Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Glu Val Ala Gly Pro Thr Glu Met Cys Asp

165 170 175

Gln Arg Gln Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ala Ile Gln Ile Pro Arg

180 185 190

Gln Leu Gly Glu Val Ala Ala Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser

195 200 205

Val Arg Ser Cys Phe Gln Gln Asn Asn Asn Lys Pro Glu Ile Ser Val

210 215 220

Lys Glu Phe Ile Asp Trp Met His Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp

225 230 235 240

Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln

245 250 255

Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Val Gly Phe Arg Tyr

260 265 270

Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Val Cys Gln Ser Cys Phe Phe

275 280 285

Ser Gly Arg Thr Ala Lys Gly His Lys Leu His Tyr

290 295 300

<210> 6

<211> 853

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Ala Lys Tyr Gly Glu His Glu Ala Ser Pro Asp Asn Gly Gln Asn

1 5 10 15

Glu Phe Ser Asp Ile Ile Lys Ser Arg Ser Asp Glu His Asn Asp Val

20 25 30

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Ile Asn Ala Arg Phe Ser Lys Ser

35 40 45

Gly Lys Pro Pro Ile Asn Asp Met Phe Thr Asp Leu Lys Asp Gly Arg

50 55 60

Lys Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Thr Ser Leu Pro Lys

65 70 75 80

Glu Arg Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Arg Val

85 90 95

Leu Gln Val Leu His Gln Asn Asn Val Glu Leu Val Asn Ile Gly Gly

100 105 110

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Leu Trp

115 120 125

Ser Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asp Val Met Lys Asp Val Met

130 135 140

Ser Asp Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Thr Thr Arg Pro Tyr Ser Gln Val Asn Val Leu Asn Phe Thr

165 170 175

Thr Ser Trp Thr Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Val Leu His Arg His

180 185 190

Lys Pro Asp Leu Phe Ser Trp Asp Lys Val Val Lys Met Ser Pro Ile

195 200 205

Glu Arg Leu Glu His Ala Phe Ser Lys Ala Gln Thr Tyr Leu Gly Ile

210 215 220

Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Val Gln Leu Pro Asp Lys

225 230 235 240

Lys Ser Ile Ile Met Tyr Leu Thr Ser Leu Phe Glu Val Leu Pro Gln

245 250 255

Gln Val Thr Ile Asp Gln Glu Pro Ser Ser Val Ser Gln Thr Arg Ile

260 265 270

Ala Ala His Pro Asn Val Gln Lys Val Val Leu Val Ser Ser Ala Ser

275 280 285

Asp Ile Pro Val Gln Ser His Arg Thr Ser Glu Ile Ser Ile Pro Asn

290 295 300

Arg Leu Leu Met Ser Leu Glu Glu Leu Ile Lys Trp Leu Asn Met Lys

305 310 315 320

Asp Glu Glu Leu Lys Lys Gln Met Pro Ile Gly Gly Asp Val Pro Ala

325 330 335

Leu Gln Leu Gln Tyr Asp His Cys Lys Ala Leu Arg Arg Glu Leu Lys

340 345 350

Glu Lys Glu Tyr Ser Val Leu Asn Ala Val Asp Gln Ala Arg Val Phe

355 360 365

Leu Ala Asp Gln Pro Ile Glu Ala Pro Glu Glu Pro Arg Arg Asn Leu

370 375 380

Gln Ser Lys Thr Glu Leu Thr Pro Glu Glu Arg Ala Gln Lys Ile Ala

385 390 395 400

Lys Ala Met Arg Lys Gln Ser Ser Glu Val Lys Glu Lys Trp Glu Ser

405 410 415

Leu Asn Ala Val Thr Ser Asn Trp Gln Lys Gln Val Asp Lys Ala Leu

420 425 430

Glu Lys Leu Arg Asp Leu Gln Gly Ala Met Asp Asp Leu Asp Ala Asp

435 440 445

Met Lys Glu Ala Glu Ser Val Arg Asn Gly Trp Lys Pro Val Gly Asp

450 455 460

Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Ile Glu Lys Ile Met Ala Phe

465 470 475 480

Arg Glu Glu Ile Ala Pro Ile Asn Phe Lys Val Lys Thr Val Asn Asp

485 490 495

Leu Ser Ser Gln Leu Ser Pro Leu Asp Leu His Pro Ser Leu Lys Met

500 505 510

Ser Arg Gln Leu Asp Asp Leu Asn Met Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val

515 520 525

Ser Val Asp Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gln Glu Ala His Arg Asp Phe

530 535 540

Gly Pro Ser Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Leu Pro Trp

545 550 555 560

Gln Arg Ser Ile Ser His Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Gln

565 570 575

Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Phe Gln

580 585 590

Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala

595 600 605

Ile Lys Ile Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Glu

610 615 620

Leu Ser Thr Thr Asn Glu Ile Phe Lys Gln His Lys Leu Asn Gln Asn

625 630 635 640

Asp Gln Leu Leu Ser Val Pro Asp Val Ile Asn Cys Leu Thr Thr Thr

645 650 655

Tyr Asp Gly Leu Glu Gln Met His Lys Asp Leu Val Asn Val Pro Leu

660 665 670

Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly

675 680 685

Arg Thr Gly Lys Ile Arg Val Gln Ser Leu Lys Ile Gly Leu Met Ser

690 695 700

Leu Ser Lys Gly Leu Leu Glu Glu Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Glu

705 710 715 720

Val Ala Gly Pro Thr Glu Met Cys Asp Gln Arg Gln Leu Gly Leu Leu

725 730 735

Leu His Asp Ala Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ala

740 745 750

Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Gln

755 760 765

Asn Asn Asn Lys Pro Glu Ile Ser Val Lys Glu Phe Ile Asp Trp Met

770 775 780

His Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val

785 790 795 800

Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys

805 810 815

Glu Cys Pro Ile Val Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn

820 825 830

Tyr Asp Val Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Thr Ala Lys Gly

835 840 845

His Lys Leu His Tyr

850

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中：所述融合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中：所述融合蛋白的氨基酸序列按照从N端到C端的顺序，依次包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中：所述融合蛋白包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

5.一种核酸分子，其编码如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。

6.一种核酸载体，其包含如权利要求5所述的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的核酸载体，其中：所述核酸载体为腺病毒载体。

8.一种细胞，其包含如权利要求5所述的核酸分子，和/或表达有权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。

9.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的核酸载体、权利要求8所述的细胞用于制备治疗杜氏型肌营养不良症和/或改善患者认知功能的药物的用途。

10.一种药物组合物，其包含如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白、和/或权利要求5所述的核酸分子、和/或权利要求6所述的核酸载体、和/或权利要求8所述的细胞，以及药学上可接受的载体或辅料。