WO2023124741A1

WO2023124741A1 - 用于治疗肌营养不良症的转基因表达盒

Info

Publication number: WO2023124741A1
Application number: PCT/CN2022/135805
Authority: WO
Inventors: 闫梦迪; 吴侠; 肖啸; 郑静; 杜增民; 蒋威; 陈慧; 王利群; 王慧
Original assignee: 上海勉亦生物科技有限公司
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2023-07-06
Also published as: CN114316070A; CN114316070B

Abstract

一种可用于治疗肌营养不良症的重组杂合蛋白、编码该重组杂合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的转基因表达盒以及包含该转基因表达盒的基因递送系统。所述核酸分子、转基因表达盒和基因递送系统可以在肌肉组织中稳定表达治疗性蛋白，由此实现对肌营养不良症的良好治疗效果。

Description

用于治疗肌营养不良症的转基因表达盒

技术领域

本公开涉及可用于治疗肌营养不良症的重组杂合蛋白、编码该重组杂合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的转基因表达盒以及包含该转基因表达盒的基因递送系统。

背景技术

肌营养不良症(Muscular dystrophy，MD)是一种广泛的肌肉退行性疾病，主要表现为不同部位的肌肉功能缺陷，例如肌肉不同程度的进行性萎缩和无力。其中，最常见且进展最迅速的是杜氏型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)。杜氏型肌营养不良症是一种严重的X连锁隐性遗传的进行性神经肌肉疾病。由于缺乏肌营养不良蛋白(Dystrophin)，DMD患者的骨骼肌、心脏和呼吸肌肉会逐渐退化。据统计，全球大约每3600个男孩中就有1人患有这种疾病。DMD患者在12至15岁时逐渐无法独立行走，必须使用轮椅，进而出现呼吸困难、呼吸道感染和吞咽问题，最终发展成心肌病，导致死亡。X连锁隐性遗传的肌营养不良症还包括贝克型肌营养不良症((Becker muscular dystrophy，BMD)，其特征为肌肉活检样本中，肌营养不良蛋白的数量或质量下降。

肌营养不良蛋白基因是已知最大的人类基因，大约2.5Mb，主要在骨骼肌和心肌中表达。该基因位于X染色体的Xp21位置，包含79个外显子。DMD由肌营养不良蛋白基因突变导致。DMD最常见的突变类型包括一个或多个外显子的大片段的缺失突变(60-70％)、重复突变(5-10％)、单核苷酸变异(包括小删除或插入，单碱基变化和剪切位点变化)。肌营养不良蛋白的基本功能是在收缩过程中通过N端结构域与F-肌动蛋白结合，同时通过C端结构域与β-肌营养不良蛋白聚糖结合，起到桥接和锚定蛋白的作用来稳定肌纤维。肌营养不良蛋白表达的缺失会导致严重的肌肉萎缩、呼吸和心力衰竭，原因是肌营养不良蛋白功能的丧失，破坏了其相关糖蛋白复合物(DGC)的形成，导致肌膜不稳定，对损伤的敏感性增加，以及纤维坏死(Findlay A R,Wein N,Kaminoh Y等，Clinical phenotypes as predictors of the outcome of skipping around DMD exon 45[J].Ann Neurol,2015,77(4):668-74)。因此，增加肌营养不良蛋白的表达对于肌营养不良的治疗十分关键。

对于肌营养不良症的治疗，目前还没有有效药物。糖皮质激素治疗是主要的保守治疗方法，但只能延缓一两年的疾病进展。因此，亟需获得用于治疗肌营养不良症的有效药物。

目前，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体介导的基因导入在治疗单基因遗传罕见病方面发挥着巨大作用。AAV具有低致病性以及在各种器官组织中长期稳定表达蛋白的能力，这些特性使AAV在基因治疗领域具有明显的优势，适用于递送治疗性基因。AAV给肌营养不良症的治疗带来巨大希望。然而，AAV载体包装基因的大小限制在4.7kb，难以装载巨大的Dystrophin蛋白基因。对于研究者而言，将巨大的Dystrophin蛋白基因缩小后装载入AAV表达盒内是一种挑战。因此，期望获得截短的Dystrophin蛋白基因，其可稳定表达具有治疗活性的小型Dystrophin蛋白。

肌营养不良蛋白相关蛋白(Utrophin)作为Dystrophin的同源蛋白，也在肌肉中普遍表达，其具有与Dystrophin类似的功能和结构(Miura P,Jasmin B J.Utrophin upregulation for treating Duchenne or Becker muscular dystrophy:how close are we？[J].Trends Mol Med,2006,12(3):122-9；Fairclough R J,Wood M J,Davies K E.Therapy for Duchenne muscular dystrophy:renewed optimism from genetic approaches[J].Nat Rev Genet,2013,14(6):373-8)。研究表明，Utrophin表达的上调也对于肌营养不良症的治疗有重要作用，也可能作为肌营养不良症的一个治疗靶点(Guiraud S,Chen H,Burns D T等，Advances in genetic therapeutic strategies for Duchenne muscular dystrophy[J].Exp Physiol,2015,100(12):1458-67；Moorwood C,Khurana T S.Duchenne muscular dystrophy drug discovery-the application of utrophin promoter activation screening[J].Expert Opin Drug Discov,2013,8(5):569-81；Ricotti V,Spinty S,Roper H等，Safety,Tolerability,and Pharmacokinetics of SMT C1100,a 2-Arylbenzoxazole Utrophin Modulator,following Single-and Multiple-Dose Administration to Pediatric Patients with Duchenne Muscular Dystrophy[J].PLoS One,2016,11(4):e0152840)。此外，有研究显示，通过小分子化合物或者microRNA对肌营养不良蛋白相关蛋白Utrophin的表达进行上调，可以缓解肌营养不良疾病的症状。

发明内容

为了解决上述技术问题，在第一方面，本公开提供一种重组杂合蛋白，其包括：全长人肌营养不良蛋白相关蛋白(Utrophin)的N端结构域、铰链H1、膜收缩蛋白样重复序列R1、膜收缩蛋白样重复序列R2、膜收缩蛋白样重复序列R3和铰链H2的前半部分；以及，全长人肌营养不良蛋白(Dystrophin)的膜收缩蛋白样重复序列R23、膜收缩蛋白样重复序列R24、铰链H4和CR结构域。

在一个实施方式中，上述重组杂合蛋白包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，上述重组杂合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本公开的重组杂合蛋白可以有效地改善肌肉功能，缓解肌营养不良疾病的症状，对肌营养不良症具有良好的治疗效果。

在第二方面，本公开提供一种编码根据第一方面所述的重组杂合蛋白的核酸分子。

在一个实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列具有至少50％的同一性，优选具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

在一个实施方式中，上述核酸分子包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示。

在第三方面，本公开提供一种转基因表达盒，其包括：启动子、根据第二方面所述的核酸分子、mini polyA。

在一个实施方式中，启动子选自：CB启动子、CAG启动子、肌肉肌酸激酶MCK启动子、人肌酸激酶hCK启动子、截短的人肌酸激酶CK(Shortened CK，简称shCK)启动子、骨骼肌α-actin启动子、心肌α-actin启动子、肌球蛋白重链(MyHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子、肌球蛋白轻链3F启动子、结蛋白(desmin)基因启动子和生肌调控因子家族(MyoG、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子。在一个优选实施方式中，启动子为hCK启动子或shCK启动子。在一个更优选实施方式中，启动子为shCK启动子。与hCK相比，使用shCK可获得更高的蛋白表达水平。

在一个实施方式中，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在一个实施方式中，转基因表达盒还包括调控元件，例如位于两端的两个ITR，所述ITR为正常ITR或缩短ITR，例如145bp的正常ITR或100bp的缩短ITR。在一个优选实施方式中，所述两个ITR均为145bp的正常ITR。

在一个实施方式中，转基因表达盒还包括复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A信号，例如P2A、T2A和F2A。

在一个实施方式中，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示。

在第四方面，本公开提供一种基因递送系统，其包括：根据第三方面所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。

在一个实施方式中，上述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白。在一个优选实施方式中，上述AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、 AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV32.33、AAV3B、AAVv66、AAVXL32和AAV.PHP.B。

本公开的核酸分子、转基因表达盒和基因递送系统可以在肌肉组织中稳定表达上述重组杂合蛋白，由此改善肌肉功能，实现对肌营养不良症的良好治疗效果。

在第五方面，本公开提供根据第三方面所述的转基因表达盒或根据第四方面所述的基因递送系统在制备用于治疗肌营养不良症的药物中的应用。

在一个实施方式中，肌营养不良症包括：杜氏型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症，以及其他肌肉退行性疾病。

在一个优选实施方式中，肌营养不良症为杜氏型肌营养不良症。

在第六方面，本公开提供一种药物，其包含：根据第一方面所述的重组杂合蛋白、根据第二方面所述的核酸分子、根据第三方面所述的转基因表达盒和根据第四方面所述的基因递送系统中的一种，以及赋形剂。

在一个实施方式中，上述药物用于治疗肌营养不良症，所述肌营养不良症包括：杜氏型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症，以及其他肌肉退行性疾病。在一个优选实施方式中，肌营养不良症为杜氏型肌营养不良症。

在第七方面，本公开提供一种治疗肌营养不良症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第六方面所述的药物。

在一个实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。

在一个优选实施方式中，药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。

在一个优选实施方式中，药物通过局部途径施用于肌肉，例如注射至肱二头肌或腓肠肌。

附图说明

图1A示出了全长人肌营养不良蛋白、全长人肌营养不良蛋白相关蛋白以及本发明人构建的M6构建体编码的重组杂合蛋白的结构(亚结构域)。

图1B示出了根据一个实施方式的hCK-opti-M6、hCK-M6、hCK-B84、shCK-opti-M6以及shCK-M6表达盒的示意图。

图2A是AAV9-hCK-opti-M6、AAV9-hCK-M6、AAV9-shCK-opti-M6、AAV9-shCK-M6注射小鼠6周后心脏中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及治疗组小鼠心脏的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图2B是AAV9-hCK-opti-M6、AAV9-hCK-M6、AAV9-shCK-opti-M6、AAV9-shCK-M6注射小鼠6周后腓肠肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及治疗组小鼠腓肠肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图2C是AAV9-hCK-opti-M6、AAV9-hCK-M6、AAV9-shCK-opti-M6、AAV9-shCK-M6注射小鼠6周后肱二头肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及治疗组小鼠肱二头肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图2D是AAV9-hCK-opti-M6、AAV9-hCK-M6、AAV9-shCK-opti-M6、AAV9-shCK-M6注射小鼠6周后横膈膜中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及治疗组小鼠横膈膜的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图3显示了opti-M6序列与现有B84序列在小鼠体内表达的对比。WT小鼠、Mdx小鼠、hCK-opti-M6及hCK-B84治疗组小鼠的心脏、腓肠肌和横膈膜的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4A是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后心脏中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠心脏的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4B是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后腓肠肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠腓肠肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4C是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后股四头肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠股四头肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4D是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后肱二头肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠肱二头肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4E是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后胫骨前肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠胫骨前肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4F是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后横膈膜中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠横膈膜的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4G是AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84注射小鼠4周后肋间肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析。WT小鼠、Mdx小鼠及两个治疗组小鼠肋间肌的冰冻切片用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图4H显示了shCK-opti-M6表达盒与hCK-B84表达盒的表达水平。WT小鼠、Mdx小鼠、AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗4周后小鼠(a)心脏、(b)腓肠肌和(c)横膈膜的蛋白质印迹分析。GAPDH作为内参。

图5显示了雄性和雌性小鼠的血清CK水平。(A)是雄性WT小鼠、Mdx小鼠、AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗8-9周后血清CK水平，(B)是雌性WT小鼠、Mdx小鼠、AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗8-9周后血清CK水平。n＝4，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，t检验。

图6显示了小鼠肌肉功能和行为学改善的情况。WT小鼠、Mdx小鼠、AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗8周后小鼠的(A)转棒仪运动能力测试和(B)抓力测试。n＝4，*p<0.05，**p<0.01，t检验。

图7A是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠心脏中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠心脏中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7B是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠腓肠肌中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠腓肠肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7C是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠股四头肌中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠股四头肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7D是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠肱二头肌中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠肱二头肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7E是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠胫骨前肌中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠胫骨前肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7F是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠横膈膜中的长期表达。注射后的不同时间点(4 周、6周、9周和12周)小鼠横膈膜中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7G是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠肋间肌中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠肋间肌中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7H是AAV9-shCK-opti-M6在小鼠舌中的长期表达。注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)小鼠舌中治疗性蛋白的免疫荧光分析，用抗体进行免疫荧光染色，用DAPI复染细胞核，比例尺：200μm。

图7I显示了shCK-opti-M6表达盒在小鼠体内的长期表达水平。AAV9-shCK-opti-M6治疗4、6、9、12周后小鼠的(a)心脏、(b)腓肠肌、(c)股四头肌、(d)肱二头肌、(e)胫骨前肌、(f)横膈膜、(g)肋间肌和(h)舌的蛋白质印迹分析。GAPDH作为内参。

图8显示了重组杂合蛋白(即M6和opti-M6构建体蛋白产物)的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图9显示密码子优化的M6(opti-M6)构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。

图10显示shCK启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

图11显示未经密码子优化的M6构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

除非另有说明，否则本文列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'，从左至右。本文提供的核苷酸和氨基酸采用IUPACIUB生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。

除非另有说明，“多核苷酸”是“核酸”的同义词，指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的混合序列或类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或限制的核苷酸和核苷酸类似物。

在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。

在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。

在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。

在本文中，术语“治疗有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗肌营养不良症的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该肌营养不良症相关的一种或多种症状的量。

在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。

在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。

在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。

在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指将外源核酸递送到宿主细胞中，然后多核苷酸产物的转录和翻译的过程，该过程包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。

在本文中，术语“基因送递”指的是将外源多核苷酸引入细胞来进行基因传递，包括靶向、结合、摄取、转运、复制子整合和表达。

在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。

在本文中，术语“靶向”是指病毒优先进入一些细胞或组织，然后进一步在细胞中表达病毒基因组或重组转基因携带的序列。

在本文中，术语“载体”指封装多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送至靶细胞。载体的种类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“表达盒”或“转基因盒”，其可以包含但不限于某些蛋白质或合成多肽(其可以增强、抑制、削弱、保护、触发或预防某些生物学和生理功能)的编码序列、疫苗开发中感兴趣的编码序列(例如表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)、RNAi材料的编码序列(例如，shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)或可选的生物标记。

在本文中，术语“表达盒”、“转基因盒”和“转基因表达盒”可互换地使用，指编码特定蛋白质、多肽或RNAi元件的多核苷酸片段，其可以克隆到质粒载体中。

在一些实施方式中，“盒”也可以包装到AAV颗粒中并用作病毒基因组以将转基因产物递送到靶细胞中。“盒”还可以包括其他调控元件，例如特异性启动子/增强子、polyA、调控内含子等，以增强或减弱转基因产物的表达。

在一个实施方式中，除了编码蛋白质产物的序列外，转基因盒还包含许多调控元件以使转基因包装到病毒中，例如145bp的正常ITR、长度大约100bp的缩短ITR。在一些实施方式中，转基因盒还包含用于控制蛋白质产物表达的多核苷酸元件，例如复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)或2A信号(例如P2A、T2A、F2A)、启动子和增强子，例如，具有脊椎动物β-肌动蛋白、β-球蛋白或β-球蛋白调节元件的CMV启动子或其他杂种CMV启动子(称为CB和CAG启动子)、肌肉肌酸激酶MCK启动子、人肌酸激酶hCK启动子、截短的肌酸激酶shCK启动子、骨骼肌α-actin启动子、心肌α-actin启动子、肌球蛋白重链(MyHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子、肌球蛋白轻链3F启动子、结蛋白(desmin)基因启动子和生肌调控因子家族(MyoG、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子。启动子和增强子可以被化学药品或激素(例如强力霉素或他莫昔芬)激活，以确保在特定时间点的进行基因表达。此外，启动子和增强子可以是天然或人工或嵌合序列，即原核或真核序列。

在一些优选实施方式中，用于基因表达的诱导型调控元件可以是组织或器官特异性启动子或增强子，其包括但不限于：对各种类型的肌肉细胞具有特异性的启动子，例如，肌肉肌酸激酶MCK启动子、人肌酸激酶hCK启动子、截短的肌酸激酶shCK启动子、骨骼肌α-actin启动子、心肌α-actin启动子、肌球蛋白重链(MyHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子、肌球蛋白轻链3F启动子、结蛋白(Desmin)基因启动子和生肌调控因子家族(MyoG、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子；以及成骨细胞谱系的特异性启动子(例如骨钙蛋白启动子)。

在本文中，术语“反向末端重复(ITR)”包括形成发夹结构并用作顺式元件以介导病毒复制、包装和整合的任何AAV病毒末端重复或合成序列。本文的ITR包括但不限于来自1-12型AAV(禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的末端重复序列)。此外，AAV末端重复序列不必具有天然末端重复序列，只要该末端重复序列可用于病毒复制、包装和整合即可。

在本文中，术语“顺式元件”是指包装在AAV颗粒中并在靶细胞中表达以产生具有治疗作用的蛋白质产物的转基因盒。

如图1A所示，全长人肌营养不良蛋白包括四个结构域：N端结构域、中心杆结构域、CR结构域和C端(CT)结构域，其中，中心杆结构域包括24个膜收缩蛋白样重复序列(R1-R24)和4个铰链(H1-H4)。全长人肌营养不良蛋白相关蛋白同样包括四个结构域：N端结构域、中心杆结构域、CR结构域和C端(CT)结构域，其中，中心杆结构域包括22个膜收缩蛋白样重复序列(R1-R22)和4个铰链(H1-H4)。它们的具体氨基酸序列在本领域内是已知的，可以在文献或在公共数据库查找，例如UniProt蛋白质数据库。

本公开的M6构建体包含两种形式：未经密码子优化的M6构建体以及经密码子优化的M6(opti-M6)构建体。

在本文中，术语“密码子优化”是指从其天然形式修饰的多核苷酸序列。这样的修饰导致一个或多个碱基对的差异，其相应的氨基酸序列中有或没有改变，可能增强或抑制基因的表达和/或对修饰的多核苷酸序列的细胞应答。

在一个实施方式中，AAV衣壳蛋白可以为任何AAV血清型衣壳蛋白，包括天然AAV衣壳蛋白(例如，天然的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)和其他人工改造的AAV衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)。不同AAV血清型的基因组序列、ITR序列、Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank数据库和/或WO 2021050970A1；US 2019/036676A1；Choudhury SR等，In Vivo Selection Yields AAV-B1Capsid for Central Nervous System and Muscle Gene Therapy.Mol Ther.，2016，24(7):1247-57；Hsu HL.等，Structural characterization of a novel human adeno-associated virus capsid with neurotropic properties.Nat Commun 11,3279(2020)。

在一个实施方式中，本公开提供了具有改善肌肉功能作用的治疗工具，可以用于治疗具有相关病理机制的多种疾病，包括但不限于：杜氏型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症，以及其他肌肉退行性疾病。

在一个实施方式中，肌肉退行性疾病的临床表现包括肌肉萎缩和/或运动能力降低或丧失。

在一个实施方式中，治疗工具(例如转基因表达盒)的蛋白产物包括具有改善肌肉功能作用的蛋白质，例如但不限于，Dystrophin(全长的或截短的)、Utrophin(全长的或截短的)及两者的杂合组合。

在一个实施方式中，治疗工具为蛋白质，例如但不限于，Dystrophin(全长的或截短的)、Utrophin(全长的或截短的)及两者的重组杂合蛋白。

在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒包括：hCK启动子序列(SEQ ID NO：1)、mini聚腺苷酸化(polyA)序列(SEQ ID NO：2)和密码子优化的M6(opti-M6)构建体(SEQ ID NO：8)，如此形成hCK-opti-M6表达盒(SEQ ID NO：3)。hCK-opti-M6表达盒的两侧是145bp的正常ITR，其可使表达盒作为单链AAV载体包装到AAV病毒颗粒中。

在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒包括：hCK启动子序列(SEQ ID NO：1)、mini聚腺苷酸化(polyA)序列(SEQ ID NO：2)和未经密码子优化的M6构建体(SEQ ID NO：10)，如此形成hCK-M6表达盒(SEQ ID NO：5)。hCK-M6表达盒的两侧是145bp的正常ITR，其可使表达盒作为单链AAV载体包装到AAV病毒颗粒中。

在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒包括：shCK启动子序列(SEQ ID NO：9)、mini聚腺苷酸化(polyA)序列(SEQ ID NO：2)和密码子优化的M6(opti-M6)构建体(SEQ ID NO：8)，如此形成shCK-opti-M6表达盒(SEQ ID NO：6)。shCK-opti-M6表达盒的两侧是145bp的正常ITR，其可使表达盒作为单链AAV载体包装到AAV病毒颗粒中。

在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒包括：shCK启动子序列(SEQ ID NO：9)、mini聚腺苷酸化(polyA)序列(SEQ ID NO：2)和未经密码子优化的M6构建体(SEQ ID NO：10)，如此形成shCK-M6表达盒(SEQ ID NO：7)。shCK-M6表达盒的两侧是145bp的正常ITR，其可使表达盒作为单链AAV载体包装到AAV病毒颗粒中。

在一些实施方式中，通过HEK293细胞的三质粒(质粒1：顺式元件质粒；质粒2：AAV Rep/Cap质粒；质粒3：辅助质粒)转染来生产肌营养不良蛋白及相关蛋白AAV颗粒。

在一个实施方式中，为了产生具有治疗功能的AAV颗粒，按如下进行HEK293细胞的三质粒转染：质粒1：具有ITR的顺式元件质粒(例如，hCK-opti-M6、hCK-M6、shCK-opti-M6和shCK-M6表达盒)；质粒2：具有衣壳蛋白(例如，AAV9衣壳蛋白)编码序列的AAV Rep/Cap质粒；质粒3：具有腺病毒成分的辅助质粒，其能够促进AAV病毒体的复制、组装和包装。在一个实施方式中，将HEK293细胞产生的AAV颗粒通过氯化铯(CsCl)密度梯度离心进行纯化(例如本公开实施例2所述的方法)。

本领域技术人员可以使用已知的标准方法来生产重组和合成的多肽或蛋白质、设计核酸序列、生产转化细胞、构建重组AAV突变体、改造衣壳蛋白质、包装表达AAV Rep和/或Cap序列的载体，以及瞬时或稳定转染包装细胞。这些技术是本领域技术人员已知的。参见例如，分子克隆(MOLECULAR CLONING)：实验室手册(A LABORATORY MANUAL)，第二版，(冷泉港，纽约州，1989年)。

在一些实施方式中，本公开的基因递送系统用于辅助细胞移植治疗。具体地，具有转基因的AAV颗粒可用于体外转导各种类型的细胞以产生表达蛋白质产物的稳定细胞系，然后可将其体内引入以用于治疗目的。细胞的类型包括但不限于内皮细胞、成肌细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞、Müller细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、杆状细胞和视锥细胞、神经元、造血干细胞、单核细胞、粒细胞、淋巴细胞、破骨细胞和巨噬细胞。

在一个实施方式中，用于移植的细胞是受试者的自体细胞，其允许体外培养。将细胞引入或移植到受试者中的原理和技术是本领域技术人员已知的。

在一个实施方式中，从HEK293细胞的培养基和裂解物中收获AAV颗粒。纯化方法例如亲和色谱、离子交换色谱、氯化铯和碘克沙醇梯度超速离心。与AAV生产和纯化有关的化学物质或试剂包括但不限于：用于细胞培养的化学物质或试剂(例如，细胞培养基的成分，包括牛、马、山羊、鸡或其他脊椎动物血清、谷氨酰胺、葡萄糖、蔗糖、丙酮酸纳、酚红；抗生素，例如青霉素、卡那霉素、链霉素、四环素)；用于细胞裂解、多核苷酸沉淀或超速离心的化学物质或试剂(例如Triton X-100、NP-40、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化多米芬、钠十二烷基水杨酸酯、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钡、硝酸盐、氯化钾、氯化铵、过硫酸铵、硫酸铵、PEG-20、PEG-40、PEG-400、PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-20000、Tris-HCl、Tris-乙酸盐、氯化锰、磷酸盐、碳酸氢盐、氯化铯、甲醇、乙醇、甘油、碘克沙醇、异丙醇、丁醇、安息香酶、DNase I、RNase)；亲和柱材料(例如AAVX亲和树脂、硫酸肝素蛋白聚糖和粘蛋白树脂、与AAV特异性抗体相关的其他材料)；离子交换色谱材料和洗涤缓冲液中包含的酸、碱和有机物(例如盐酸、硫酸、乙酸、甲酸、硝酸、尿素、丙酮、氯仿、乙腈、三氟乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化铵、Tris碱或其他有机胺、泊洛沙姆188、吐温20、吐温40、吐温80、盐酸胍)。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的外源多核苷酸编码用于治疗用途的天然蛋白质，所述天然蛋白质经密码子优化或未经密码子优化。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的外源多核苷酸编码合成多肽。

在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒或基因递送系统被制成药物制剂(例如，注射剂、片剂、胶囊剂、散剂、滴眼剂)施用于人或其他哺乳动物。该药物制剂还包含其他成分，例如药物辅料、水溶性或有机溶剂(例如水、甘油、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、苯酚或聚乙二醇)、盐(例如氯化钠、氯化钾、磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl和Tris-乙酸盐)、延缓溶解试剂(例如石蜡)、表面活性剂、抗微生物剂、脂质体、脂质复合物、免疫抑制剂(例如可的松、泼尼松、环孢霉素)、非甾体抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚)微球、硬质基质、半固体载体、纳米球或纳米颗粒。此外，药物制剂可以通过吸入、全身或局部(例如，静脉内、皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、脉络膜上、肠胃外、肌内、脑室内、口服、腹膜内和鞘内)的给药方式以单剂量或多剂量递送。

在一个实施方式中，本公开提供了一种药物，其包含本公开的重组杂合蛋白、核酸分子、转基因表达盒或基因递送系统；以及赋形剂。本公开的药物可用于体外转导细胞或体内转导哺乳动物(例如啮齿动物、灵长类动物和人类)，从而治疗各种与肌肉功能缺陷相关的疾病，例如肌营养不良症，包括：杜氏型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症，以及其他肌肉退行性疾病。在一个实施方式中，肌营养不良症为杜氏肌营养不良症。

在一个实施方式中，治疗肌营养不良症是指改善接受治疗的患者的肌肉损伤程度、肌酸激酶水平以及NASS(The North American Spine Society)肌肉功能得分。

下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例

实施例1：M6和opti-M6构建体以及AAV载体的设计及构建

利用人肌营养不良蛋白的cDNA作为模板通过PCR克隆方法得到B84(Mini-dystrophin)构建体(SEQ ID NO：11)。B84构建体及其编码的小型人肌营养不良蛋白质可参见例如CN 109641944A(分别对应于Hopti-Dys3978和Dys3978)或Wang B,Li J,Xiao X.Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(25):13714-9。

通过大量实验研究以及合理设计，本发明人还基于全长人肌营养不良蛋白和全长人肌营养不良蛋白相关蛋白构建了高度截短的M6构建体(SEQ ID NO：10)，并在该M6构建体的基础上进行密码子优化得到了opti-M6构建体(SEQ ID NO：8)。如图1A所示，M6构建体或opti-M6构建体编码的重组杂合蛋白包含：全长人肌营养不良蛋白相关蛋白的N端结构域、铰链1(H1)、膜收缩蛋白样重复序列1(R1)、膜收缩蛋白样重复序列2(R2)、膜收缩蛋白样重复序列3(R3)和铰链2(H2)的前半部分；以及，全长人肌营养不良蛋白的膜收缩蛋白样重复序列23(R23)、膜收缩蛋白样重复序列24(R24)、铰链4(H4)和CR结构域。

此外，为了提高目标蛋白质的表达，本发明人还基于人肌酸激酶hCK启动子(SEQ ID NO：1)构建了截短的人肌酸激酶CK(shCK)启动子。

然后，将上述M6及opti-M6基因亚克隆到AAV载体质粒中，分别采用hCK启动子以及shCK启动子，产生载体AAV-hCK-M6-polyA、AAV-hCK-opti-M6-polyA、AAV-shCK-M6-polyA和AAV-shCK-opti-M6-polyA。同样地，将B84基因克隆到含有hCK启动子和mini polyA信号序列的AAV载体质粒中，产生载体AAV-hCK-B84。

实施例2：M6和opti-M6构建体在Mdx小鼠体内的表达

为了研究M6和opti-M6构建体在小鼠体内的表达，本实施例中设置4个治疗组：hCK-opti-M6、hCK-M6、shCK-opti-M6和shCK-M6。

将实施例1中构建的载体AAV-hCK-M6-polyA、AAV-hCK-opti-M6-polyA、AAV-shCK-M6-polyA和AAV-shCK-opti-M6-polyA包装成AAV9病毒颗粒。AAV病毒是根据三质粒共转染方法生产的(如Xiao X,Li J,Samulski R J.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus[J].J Virol,1998,72(3):2224-32所述)，通过三质粒转染上述4个新型载体顺式元件质粒、AAV9衣壳质粒和腺病毒辅助质粒。转染40-80小时后裂解HEK293细胞，然后除去多核苷酸。随后使用Snyder R,Xiao S,Samulski R J.Production of recombinant adeno-associated viral vectors[J],1996所述的方案，通过CsCl密度梯度超速离心对AAV病毒载体进行了两次纯化。通过qPCR方法测定的病毒滴度约为2×10 ¹³～1×10 ¹⁴vg/ml。通过SDS-PAGE检测衣壳蛋白纯度。通过凝胶法检测内毒素，结果为合格。

然后，通过尾静脉向Mdx小鼠体内分别注射3×10 ¹³vg/kg的上述AAV颗粒。以同龄WT小鼠和同窝Mdx小鼠作为对照。注射后6周，将小鼠解剖。收集心脏、腓肠肌、肱二头肌和横膈膜组织，进行冰冻切片和免疫荧光染色。免疫荧光染色使用的兔源多克隆抗体购自Abcam公司(货号ab251754)，其可识别人肌营养不良蛋白第2800-3000位的氨基酸片段(膜收缩蛋白样重复序列R23和R24)。因此，B84和M6构建体表达的蛋白质均可被该抗体识别。

心脏、腓肠肌、肱二头肌和横膈膜组织的免疫荧光染色可分别反映与Mdx小鼠心脏功能、下肢运动功能、上肢运动功能及呼吸功能相关的肌肉病理改善情况。Mdx小鼠的病理表型开始于3周龄左右，伴随着肌纤维的变性再生，细胞核位于肌纤维的中央是这一过程的特征表现，也是主要的病理表现。

结果显示，在治疗后6周的Mdx小鼠的心脏中，4个治疗组的蛋白表达水平均显著高于未治疗的Mdx对照组，其中，hCK-opti-M6和shCK-opti-M6表达盒的表达水平高于hCK-M6和shCK-M6表达盒(图2A)。同样，治疗后小鼠的腓肠肌中也观察到杂合的治疗性蛋白的表达，opti-M6表达水平显著高于未优化的M6(图2B)。在肱二头肌中，4个治疗组的蛋白表达水平均显著高于未治疗的Mdx对照组，且shCK-opti-M6显著优于其他3个治疗组，表达水平接近WT小鼠，明显纠正了Mdx小鼠骨骼肌中央成核现象(图2C)。在横膈膜中的表达情况与肱二头肌相似，shCK-opti-M6在视野中广泛表达，强于其他3个表达盒(图2D)。

上述结果表明，M6和opti-M6构建体可在心脏、腓肠肌等4个代表性的肌肉组织中广泛表达杂合的治疗性蛋白，产生治疗效果。与M6构建体相比，优化后的opti-M6构建体的表达水平更高。并且，与hCK相比，使用shCK可获得更高的蛋白表达水平。综上，shCK-opti-M6表达盒的体内活性最佳。

实施例3：opti-M6构建体与B84构建体在Mdx小鼠体内的表达

在本实施例中，发明人比较了opti-M6构建体与B84构建体在模型小鼠体内的表达水平。分别将opti-M6与B84构建到原有hCK启动子的载体中并包装成病毒，得到AAV9-hCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84病毒颗粒。通过尾静脉注射病毒颗粒治疗Mdx小鼠，注射剂量为3×10 ¹³vg/kg。以同龄WT小鼠和同窝Mdx小鼠作为对照。治疗6周后解剖小鼠，收集心脏、腓肠肌和横膈膜等组织。通过组织免疫荧光法检测不同组织中治疗性蛋白的表达。

结果显示，AAV9-hCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗后小鼠的心脏、腓肠肌和横膈膜中治疗性蛋白的表达水平均显著高于未治疗的mdx对照组(图3)。

如图3所示，在心脏中，AAV9-hCK-opti-M6治疗组达到与AAV9-hCK-B84治疗组相近的荧光强度，且AAV9-hCK-opti-M6治疗组的阳性细胞数更多；在腓肠肌中，AAV9-hCK-opti-M6治疗组的荧光强度明显强于AAV9-hCK-B84治疗组；在横膈膜中，与 AAV9-hCK-B84治疗组相比，AAV9-hCK-opti-M6治疗组的荧光更强，且阳性细胞数明显更多。

综合来看，opti-M6构建体与B84构建体相比可产生更好的治疗效果。

实施例4：shCK-opti-M6载体与hCK-B84载体在Mdx小鼠体内的表达

在本实施例中，发明人比较了shCK-opti-M6载体与hCK-B84载体在模型小鼠体内的表达能力。

如实施例2中所述，将AAV-shCK-opti-M6和AAV-hCK-B84载体分别包装成AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84病毒颗粒。通过尾静脉注射病毒颗粒以治疗Mdx小鼠，注射剂量为3×10 ¹³vg/kg。以同龄WT小鼠和同窝Mdx小鼠作为对照。治疗4周后解剖小鼠，收集心脏、腓肠肌、股四头肌、横膈膜等组织。然后，用免疫荧光法和蛋白质印迹法检测不同组织中的蛋白表达。

如图4A所示，AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗后小鼠心脏的治疗性蛋白表达水平显著高于未治疗的Mdx对照组，其中AAV9-shCK-opti-M6的荧光更强。

如图4B-4E所示，在四肢肌肉组织(腓肠肌、胫骨前肌、肱二头肌和股四头肌)中，AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84治疗后也可观察到广泛的治疗性蛋白的表达。shCK-opti-M6治疗组在四肢肌肉组织中的表达水平显著高于hCK-B84治疗组。在shCK-opti-M6治疗组小鼠中，发明人在蛋白广泛表达的区域中观察到了肌纤维的外周成核，在一定程度上纠正了中央成核的病理表型，防止肌肉变性和再生，表明该载体治疗后可以改善肌肉病理表型。

如图4F-4H所示，在呼吸功能相关的横膈膜和肋间肌组织中，shCK-opti-M6和hCK-B84治疗组均观察到了广泛的治疗性蛋白的表达，两者的荧光强度没有显著差异。

用可识别人肌营养不良蛋白的膜收缩蛋白样重复序列R23和R24片段的抗体同时检测shCK-opti-M6和hCK-B84在体内的蛋白表达。蛋白质印迹结果显示，shCK-opti-M6在小鼠心脏中表达高于hCK-B84，shCK-opti-M6在腓肠肌和横膈膜中的表达水平与hCK-B84接近(图4G)。

综合上述结果表明，shCK-opti-M6与hCK-B84相比在表达上具有显著优势。

实施例5：shCK-opti-M6载体与hCK-B84载体治疗后Mdx小鼠的肌酸激酶水平

在本实施例中，为了验证shCK-opti-M6和hCK-B84载体在Mdx小鼠体内的治疗效果，发明人检测了血清肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)水平，这是Mdx小鼠肌肉损伤的重要指标。

本实施例中共设置2个治疗组，分别为AAV9-shCK-opti-M6和AAV9-hCK-B84。通过尾静脉注射治疗Mdx小鼠，注射剂量为3×10 ¹³vg/kg。以同龄WT小鼠和同窝Mdx小鼠作为对照。每组8只，雌雄各4只。治疗8-9周后通过眼眶采血，收集血清，检测小鼠血清中的CK水平。

如图5所示，未经治疗的Mdx小鼠在4月龄时，血清CK水平较WT小鼠明显升高(雄性，**p<0.01；雌性，***p<0.001)，而在经过AAV治疗的Mdx小鼠中显著降低，其中shCK-opti-M6治疗组的血清CK值显著下降(雄性，*p<0.05；雌性，***p<0.001)。

由此可见，shCK-opti-M6载体治疗后Mdx小鼠的肌酸激酶水平与hCK-B84载体相比更低，表明其具有更好的治疗效果。

实施例6：shCK-opti-M6和hCK-B84载体对Mdx小鼠运动能力和肌肉力量的影响

在本实施例中，为了评估shCK-opti-M6和hCK-B84载体对Mdx小鼠运动能力和肌肉力量的影响，对小鼠进行了转棒测试(运动)和抓力测试(力量)。

在WT小鼠、未治疗的Mdx小鼠、shCK-opti-M6和hCK-B84治疗8周后的Mdx小鼠(n＝4)中进行了三次重复转棒试验。结果如图6A所示，未治疗Mdx小鼠与WT小鼠在转棒上的运动时间存在显著差异(*p<0.05)。与未治疗的Mdx小鼠相比，shCK-opti-M6载体治疗的Mdx小鼠的运动表现有显著改善(*p<0.05)，hCK-B84载体治疗的Mdx小鼠无统计学差异。值得注意的是，shCK-opti-M6载体治疗的Mdx小鼠显示出接近WT小鼠的运动时间。

同时，小鼠抓力测试的结果显示，与未治疗的Mdx小鼠相比，shCK-opti-M6载体治疗的Mdx小鼠四肢的抓力有显著改善(**p<0.01)，接近WT水平(图6B)。

上述结果表明，与hCK-B84载体相比，shCK-opti-M6载体能更有效地改善小鼠的肌肉功能和行为学表现。

实施例7：shCK-opti-M6载体在Mdx小鼠体内的长期表达

在本实施例中，发明人研究了shCK-opti-M6载体在Mdx小鼠体内的长期表达。通过尾静脉注射4组Mdx小鼠，注射剂量为3×10 ¹³vg/kg。分别在载体注射后的不同时间点(4周、6周、9周和12周)收集肌肉样本用于免疫荧光和蛋白质免疫印迹检测。以同龄WT小鼠和同窝Mdx小鼠作为对照。

结果显示，shCK-opti-M6载体治疗4周后，在心脏中就可以观察到蛋白的表达。在注射后6-9周，表达进入高峰期，阳性细胞数和荧光强度显著提高(图7A)。在shCK-opti-M6载体治疗6周后，在mdx小鼠的腓肠肌中观察到了广泛的蛋白表达(图7B)。在shCK-opti-M6载体治疗4周后，在股四头肌中观察到了较弱的荧光强度，荧光表达在注射后6-9周进入高峰期，且一直稳定持续到注射后12周(图7C)。肱二头肌免疫荧光染色结果与股四头肌类似(图7D)。在Mdx小鼠的胫骨前肌中，在注射后4周已显示出高水平的蛋白表达，在注射后6-9周表达水平进一步升高，且可持续到注射后12周(图7E)。横膈膜免疫荧光的染色结果与胫骨前肌类似(图7F)。肋间肌的免疫荧光染色结果显示，在shCK-opti-M6载体治疗后第4至9周均检测到了蛋白的高水平表达，在注射后12周表达略有下降(图7G)。舌的免疫荧光结果与肋间肌类似(图7H)。

用可识别人肌营养不良蛋白的膜收缩蛋白样重复序列R23和R24片段的抗体检测蛋白的表达，蛋白质印迹分析结果如图7I所示。心脏中，在注射后4周即可检测到蛋白表达，在6-9周表达水平最高，且一直持续到注射后12周。腓肠肌中，在注射后6周有较高的表达，在注射后12周表达达到高峰。股四头肌中，在注射后9周蛋白表达进入高峰期，且在注射后12周仍然保持高水平表达。肱二头肌中，在注射后6周蛋白的表达水平最高，注射后12周仍可检测到较高水平的表达。胫骨前肌中，在注射后4周即可检测到一定水平的蛋白表达，注射后6-9周表达一直保持在较高水平。横膈膜中，在注射后12周仍可检测到蛋白的表达。肋间肌蛋白质印迹分析的结果与舌头类似，均在注射后4-9周检测到了不同程度的蛋白表达，注射后12周表达水平有所下降。

上述免疫荧光和蛋白质免疫印迹结果表明，shCK-opti-M6可以实现在Mdx模型小鼠体内的长期稳定表达。

虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

Claims

重组杂合蛋白，其包括：

全长人Utrophin的N端结构域、铰链H1、膜收缩蛋白样重复序列R1、膜收缩蛋白样重复序列R2、膜收缩蛋白样重复序列R3和铰链H2的前半部分，以及

全长人Dystrophin的膜收缩蛋白样重复序列R23、膜收缩蛋白样重复序列R24、铰链H4和CR结构域。
根据权利要求1所述的重组杂合蛋白，其中，所述重组杂合蛋白包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；优选地，所述重组杂合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
编码权利要求1或2所述的重组杂合蛋白的核酸分子。
根据权利要求3所述的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列具有至少50％的同一性，优选具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
根据权利要求4所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示。
转基因表达盒，其包括：启动子、权利要求3至5中任一项所述的核酸分子、mini polyA。
根据权利要求6所述的转基因表达盒，其中，所述启动子选自：CB启动子、CAG启动子、肌肉肌酸激酶MCK启动子、人肌酸激酶hCK启动子、截短的人肌酸激酶CK(shCK)启动子、骨骼肌α-actin启动子、心肌α-actin启动子、肌球蛋白重链(MyHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子、肌球蛋白轻链3F启动子、结蛋白(desmin)基因启动子和生肌调控因子家族(MyoG、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子；优选地，所述启动子为hCK启动子或shCK启动子；更优选地，所述启动子为shCK启动子。
根据权利要求6或7所述的转基因表达盒，其中，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
根据权利要求6至8中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包括调控元件，例如位于两端的两个ITR，所述ITR为正常ITR或缩短ITR；优选地，所述两个ITR均为145bp的正常ITR。
根据权利要求6至9中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包括复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A信号，例如P2A、T2A和F2A。
根据权利要求6至10中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示。
基因递送系统，其包括：权利要求6至11中任一项所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。
根据权利要求12所述的基因递送系统，其中，所述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白；优选地，所述AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV32.33、AAV3B、AAVv66、AAVXL32和AAV.PHP.B。
权利要求6至11中任一项所述的转基因表达盒或权利要求12或13所述的基因递送系统在制备用于治疗肌营养不良症的药物中的应用。
根据权利要求14所述的应用，其中，所述肌营养不良症包括：杜氏型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症，以及其他肌肉退行性疾病；优选地，所述肌营养不良症为杜氏型肌营养不良症。
药物，其包含：权利要求1或2所述的重组杂合蛋白、权利要求3至5中任一项所述的核酸分子、权利要求6至11中任一项所述的转基因表达盒和权利要求12或13所述的基因递送系统中的一种，以及赋形剂。
一种治疗肌营养不良症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求16所述的药物。
根据权利要求17所述的方法，其中，所述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用；优选地，所述药物通过全身途径施用，例如静脉内施用；还优选地，所述药物通过局部途径施用于肌肉，例如注射至肱二头肌或腓肠肌。