KR20210084459A - 표적화된 유전자 요법을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 - Google Patents

표적화된 유전자 요법을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 Download PDF

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비비아나 그라디나루
니콜라스 씨. 플리트자니스
니콜라스 에스. 괴덴
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캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

표적화된 세포-유형, 예를 들어, 뇌 및 폐에서 바이러스 형질도입의 증가된 특이성 및 효율을 나타내는 향성을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 포함하는 조성물 및 키트가 본원에 기재된다. 본원에 기재된 rAAV 조성물은 또한 오프-타겟 세포 유형, 예를 들어 간에서 바이러스 형질도입의 감소된 특이성 및 감소된 효율을 나타내는 향성을 갖는다. 본원에 기재된 rAAV 조성물은 트랜스진, 예컨대 치료 핵산을 캡시드화한다. 대상체에게 전신 전달되면, rAAV는 모 또는 참조 AAV와 비교하여 표적 세포-유형에서 트랜스진의 증가된 특이성 및 증가된 형질도입을 가능하게 한다.

Description

표적화된 유전자 요법을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물
상호-참조
본 출원은 2018년 9월 26일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/736,904 및 2019년 4월 11일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/832,812의 이익을 주장하며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 NS087949 및 DARPA에 의해 수여된 승인 번호 W911NF-17-2-0036 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 9월 20일에 생성된 상기 ASCII 카피는 38075-733_601_SL.txt로 명명되고, 10,656,833 바이트 크기이다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 형질도입시키는 그의 능력, 감염된 세포에서 에피솜 DNA로서의 그의 장기간 지속성, 및 그의 낮은 면역원성으로 인해 기초 과학 연구 및 치료 용도에서 유전자 전달을 위해 점점 더 사용되고 있다. 이들 특징은 이들을 기초 과학 및 유전자 요법과 같은 클리닉 둘 다에 적용하는데 흥미를 끌게 한다. 많은 장애를 위한 현재의 유전자 요법 접근법은 형질도입 효율을 증가시키고 이환된 세포 유형으로만 발현을 제한하기 위해 직접 전달에 초점을 맞춰왔다. 그러나, 이러한 투여 경로는 국부 전달의 제한된 적용범위로 인해 많은 임상 시험 및 질환에 걸쳐 제한된 성공으로 이어졌다.
정맥내 투여는 이들 제한을 다루고, 비-침습적 방식으로 신체 전반에 걸쳐 조직 및 기관으로의 광범위하고 효율적인 접근을 가능하게 한다. 불행하게도, 자연 발생 혈청형은 특정 세포 유형 및 기관의 제한된 형질도입, 및 다른 것에서의 비-특이적 중첩 향성을 갖는다. 이는 비영향 기관 및 세포 유형 (특히, 간)의 형질도입으로 인한 오프-타겟 효과, 및 관심 조직 또는 기관에서 충분한 치료 수준을 달성하기 위한 보다 큰 바이러스 로드의 필요성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 유전자 요법 적용에서의 여러 복합문제로 이어진다. 또한, 심지어 전신 전달에 의해서도, 현재의 rAAV-매개된 유전자 요법은 혈액 뇌 장벽 (BBB) 또는 상피를 횡단하는 특이성이 결여되어 있어, 뇌 또는 기관 (예를 들어, 폐)의 질환 및 상태에 대한 치료적 개입으로서 그의 도달을 제한한다.
따라서, 대상체에게 전신으로 (예를 들어, 정맥내로, 비강내로) 전달되는 경우 대상체에서 특이적 세포 유형 또는 기관을 표적화하는 높은 특이성 및 비영향 (오프-타겟) 기관 및 세포 유형에 대한 낮은 특이성을 달성할 수 있는 rAAV에 대한 필요가 존재한다.
양성 및 음성 선택의 반복 라운드를 통해 캡시드 구조 내로 조작된 특이성을 갖는 캡시드를 포함하는 재조합 AAV (rAAV)가 본원에 개시된다. 이러한 조작은 이들이 유래된 비변형된 모 캡시드에 비해 특정 조직 또는 기관에 대해 변경된 특이성을 갖는 rAAV 변이체를 생성한다. 일부 실시양태에서, rAAV 변이체는 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 452-458에 상응하는 잔기에서 7량체 펩티드 치환을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치환은 AAV9 VP1의 아미노산 452-458의 치환이다. 특정 다른 실시양태에서, 치환은 AAV-PHP.B VP1의 아미노산 452-458의 치환이다. 또 다른 실시양태에서, 치환은 AAV-PHP.eB VP1의 아미노산 452-458의 치환이다. 일부 실시양태에서, 치환은 rAAV 캡시드의 세포 또는 조직에 대한 향성을 감소시키고, rAAV 변이체가 치료 바이러스 형질도입의 오프-타겟 효과를 감소시키게 하여, 이에 의해 보다 큰 바이러스 투여량에 대한 필요를 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환은 세포 또는 조직에 대한 rAAV 캡시드의 향성을 증가시켜, rAAV 변이체가 전신 전달 (예를 들어, 정맥내 주사) 시 대상체에서 표적 환경 (예를 들어, 표적 세포 유형 또는 조직)으로 광범위한 형질도입을 달성하는 것을 가능하게 한다. 전형적으로, 7량체 펩티드 치환은 ILGTGTS (서열식별번호(SEQ ID NO): 45479), QSSQTPR (서열식별번호: 45479), 또는 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)가 아니다.
본원에 기재된 rAAV는 Cre 재조합-기반 AAV 표적화된 진화 (CREATE) 방법의 변형된 버전을 사용하여 확인된다. 멀티플렉스화-CREATE (M-CREATE) 방법은 캡시드 단백질 서열 내에 변이를 도입함으로써 증진된 형질도입 효율 및/또는 특이성을 생성하고, 규정된 세포 집단으로 이동하고, 세포막을 횡단하고, 핵으로 이동하고, 그의 유전자 페이로드의 패키지를 풀고, 발현하는 변이체만의 비편향된 생체내 선택 및 회수를 생성한다. 가장 바람직한 향성 (예를 들어, 특정한 생체내 환경에 대한 증진된 효율 및 특이성)을 나타내는 변이체 캡시드는 심층 서열분석에 의해 회수되고 확인된다. 비편향된 선택 및 분석을 위한 전략은 변이체의 풍부화 점수 (표적 조직 라이브러리를 출발 바이러스 라이브러리에 대해 정규화하는 것에 의함) 및 합성 라이브러리 구축을 통한 선택 라운드 사이의 비편향된 증식 (여기서 각각의 변이체는 동등하게 나타내어짐)을 결정하는 것을 포함한다. 생성된 라이브러리의 서열분석 데이터로부터의 상세한 특징화가 또한 본원에 기재되며, 이는 표적에 대한 변이체의 선택에 대한 유용한 통찰을 제공한다.
또한 AAV9 VP1의 아미노산 452-458에 상응하는 잔기에서 7량체 펩티드 치환을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 라이브러리가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 AAV9 변이체 AAV-PHP.eB 또는 AAV-PHP.B의 아미노산 452-458에서 7량체 펩티드 치환을 포함하는 캡시드의 라이브러리이다. 이러한 라이브러리는 상이한 뇌 세포 유형 (예를 들어, 내피 세포, 뉴런, 및 성상세포)에 걸친 생체내 양성 선택 및 간에 걸친 음성 선택에서 특정한 용도가 발견되고, 이러한 라이브러리는 BBB를 횡단하고, 중추 신경계 (CNS)를 광범위하게 형질도입시키고, 생체내 환경, 예를 들어, 간에서의 오프-타겟을 탈표적화하는 증진된 능력을 갖는 AAV9 변이체의 대형 풀을 생성하는 것으로 본원에 제시되었다. 다른 실시양태에서, 라이브러리는 AAV9의 아미노산 452-458에서 7량체 펩티드 치환을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 라이브러리이다. 이러한 라이브러리는 상이한 기관, 예컨대 척수, 뇌, 간, 위, 장, 폐, 심장, 고환, 비장, 지방 (지방조직), 및 근육에 걸친 생체내 선택에서 특정한 용도가 발견된다.
또한, 치료 재조합 AAV (rAAV) 입자를 생산하기 위한 방법 및 키트, 뿐만 아니라 예를 들어 CNS, PNS, 또는 표적 생체내 환경에 영향을 미치는 질환 또는 상태 (예를 들어, 폐)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 방법 및 이를 치료하기 위한 rAAV 입자를 포함하는 제약 조성물 또는 제제가 본원에 개시된다.
본원에 개시된 측면은 (a) 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질의 3-폴드 대칭 축에서 7량체 펩티드 서열 내에 3개 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 7량체 펩티드 서열은 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 여기서 아미노산 치환은 ILGTGTS (서열식별번호: 45479), QSSQTPR (서열식별번호: 45479), 또는 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)가 아닌 것인 변이체 AAV 캡시드; 및 (b) 유전자 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드는, 대상체에서 측정 시, 상응하는 모 AAV 캡시드의 향성에 비해 표적 조직 또는 표적 세포에 대해 증가된 향성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 조직 또는 표적 세포는 중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS)의 조직 또는 세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드는, 대상체에서 측정 시, 상응하는 모 AAV 캡시드의 향성에 비해 간 조직을 포함한 오프-타겟 조직 또는 간 세포를 포함한 오프-타겟 세포에 대해 감소된 향성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 3개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 4개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-455, 453-456, 454-457, 또는 455-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 적어도 5개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-456, 453-457, 또는 454-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 (a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V; (b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 453에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V; (c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 454에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V; (d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 455에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T; (e) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 456에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, H, K, N, P, Q, S, 또는 T; (f) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 457에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, P, S, T, 또는 V; 및 (g) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 458에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, E, G, H, K, L, N, Q, S, T, 또는 V 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 (a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, S, T, 또는 V; (b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 453에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, G, H, M, N, P, Q, S, T, 또는 V; (c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 454에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V; (d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 455에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T; (e) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 456에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, G, K, N, P, Q, S, 또는 T; (f) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 457에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, G, H, L, M, N, P, Q, S, T, 또는 V; 및 (g) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 458에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, 또는 V 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 DGAATKN (서열식별번호: 3943), 및 DGQSSKS (서열식별번호: 2764)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 (a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T; (b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 453에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, N, P, Q, R, S; (c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 454에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, D, G, N, S, 또는 T; (d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 455에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, D, G, K, N, P, Q, S, 또는 T; (e) AAV9 VP (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 456에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T; (f) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 457에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, K, N, P, R, S, T, 또는 V; 및 (g) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 458에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, K, L, R, S, T, 또는 V 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 LQTSSPG (서열식별번호: 2933), QQGKQSV (서열식별번호: 79), SINTKTN (서열식별번호: 45475), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), NQSGTKG (서열식별번호: 780), KGPGQMG (서열식별번호: 45476), 및 GTPSKAG (서열식별번호: 2741)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 조직 또는 조직 내의 표적 세포는 폐, 장, 신장, 심장, 및 위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 AAV9 VP1의 아미노산 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 아미노산 위치에서 3개의 인접 아미노산을 포함하며, 여기서: (a) 452는 N, K, R, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 453은 L, N, P, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; (c) 454는 A, D, G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (d) 455는 L, P, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (e) 456은 P, R, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; (f) 457은 G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (g) 458은 I, L, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 (a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-455, 453-456, 454-457, 또는 455-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 4개의 인접 아미노산; (b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-456, 453-457, 또는 453-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 5개의 인접 아미노산; (c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-457 또는 453-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 6개의 인접 아미노산; 및 (d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 7개의 인접 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 폐이고, 3개 이상의 아미노산은 KDNTPGR (서열식별번호: 32538), NNLPRNL (서열식별번호: 32867), 또는 도 13에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 장이고, 3개 이상의 아미노산은 RESSPSL (서열식별번호: 26474), KDNTPGR (서열식별번호: 26584), 또는 도 5에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조직은 신장이고, 3개 이상의 아미노산은 RVPLSTI (서열식별번호: 26933), NNLPRNL (서열식별번호: 27530), KDNTPGR (서열식별번호: 28509), 또는 도 6에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조직은 심장이고, 3개 이상의 아미노산은 KDNTPGR (서열식별번호: 25633), 또는 도 4에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조직은 위이고, 3개 이상의 아미노산은 RESSPSL (서열식별번호: 31904) 또는 도 12의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, AAV9 VP1 변이체는 서열식별번호: 1에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV9 VP1 변이체는 서열식별번호: 1에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 588_589에 상응하는 아미노산 위치에서 TLAXPFK (서열식별번호: 46424), TLAX (서열식별번호: 46425), LAVX (서열식별번호: 46426), AVPX (서열식별번호: 46427), 및 VPFX (서열식별번호: 46428)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 추가로 포함하며, 여기서 X는 V 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV-PHP.B 또는 AAV-PHP.eB로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 단리 및 정제된다.
본원에 개시된 측면은 본 개시내용의 rAAV 및 제약 부형제를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 정맥내, 동맥내, 비강내, 척수강내, 거대 수조내, 또는 피하 주사용으로 제제화된다.
본원에 개시된 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 rAAV, 또는 본 개시내용의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 생성물은 치료 유전자 생성물이다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내, 동맥내, 비강내, 척수강내, 거대 수조내, 또는 피하 주사에 의한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 폐 섬유증, 계면활성제 단백질 장애, 퍼옥시솜 생물발생 장애, 또는 COPD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 중추 신경계 (CNS) 말초 신경계 (PNS) 장애이다.
(a) (i) 5' 및 3' 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 둘러싸인 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 제1 핵산 서열; (ii) 5' ITR 서열, 복제 (Rep) 유전자, 캡시드 (Cap) 유전자, 및 3' ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 코딩하며, 여기서 Cap 유전자는 rAAV 캡시드 단백질을 코딩하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (iii) E4orf6, E2a, 및 VA RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 헬퍼 바이러스 단백질, 및 임의로, E1a 또는 E1b55k를 포함하는 제2 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하고; (b) 세포에서 AAV 캡시드 단백질을 발현시키고; (c) 본 개시내용의 rAAV를 어셈블리시키고; (d) rAAV 내에 제1 핵산 서열을 패키징하는 것을 포함하는, 본 개시내용의 rAAV를 제조하는 방법. 본원에 개시된 측면은 (a) 서열식별번호: 1의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 갖는 상응하는 모 AAV 캡시드에 비해, 영장류 대상체에게 정맥내로 전달된 경우 영장류 대상체의 간에서 측정된 바와 같이, 감소된 특이성 및 감소된 형질도입 효율 중 적어도 1개; 및 (b) 상응하는 모 AAV 캡시드에 비해, 영장류 대상체에게 정맥내로 전달된 경우 영장류 대상체의 중추 신경계 (CNS)에서 측정된 바와 같이, 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 포함하는 변이체 AAV 캡시드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드는 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서 7량체 펩티드 서열 내에 3개 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 3개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 7량체 펩티드 서열은 DGAATKN (서열식별번호: 3943)이다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 217 내지 아미노산 736 사이의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 ILGTGTS (서열식별번호: 45479), QSSQTPR (서열식별번호: 45479), 또는 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)가 아니다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 588_589에 상응하는 아미노산 위치에서 TLAXPFK (서열식별번호: 46424), TLAX (서열식별번호: 46425), LAVX (서열식별번호: 46426), AVPX (서열식별번호: 46427), 및 VPFX (서열식별번호: 46428)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 추가로 포함하며, 여기서 X는 V 이외의 임의의 아미노산이다. 본원에 개시된 측면은 (a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서 7량체 펩티드 서열 내에 3개 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질; 및 (b) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해, 비강내로 또는 정맥내로 대상체에게 전달된 경우 대상체의 표적 조직에서 측정된 바와 같이, 표적 조직에서 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 포함하는 변이체 AAV 캡시드를 제공하며, 여기서 표적 조직은 폐, 장, 신장, 심장, 및 위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 AAV9 VP1의 아미노산 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 아미노산 위치에서 3개의 인접 아미노산을 포함하며, 여기서: (a) 452는 N, K, R, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 453은 L, N, P, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; (c) 454는 A, D, G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (d) 455는 L, P, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (e) 456은 P, R, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; (f) 457은 G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (g) 458은 I, L, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 폐이고, 3개 이상의 아미노산은 KDNTPGR (서열식별번호: 32538), NNLPRNL (서열식별번호: 32867), 또는 도 13에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 장이고, 3개 이상의 아미노산은 RESSPSL (서열식별번호: 26474), KDNTPGR (서열식별번호: 26584), 또는 도 5에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조직은 신장이고, 3개 이상의 아미노산은 RVPLSTI (서열식별번호: 26933), NNLPRNL (서열식별번호: 27530), KDNTPGR (서열식별번호: 28509), 또는 도 6에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조직은 심장이고, 3개 이상의 아미노산은 KDNTPGR (서열식별번호: 25633), 또는 도 4에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조직은 위이고, 3개 이상의 아미노산은 RESSPSL (서열식별번호: 31904) 또는 도 12의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 217 내지 아미노산 736 사이의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 AAV 캡시드는 단리 및 정제된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 AAV 캡시드는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 비강내 또는 정맥내 투여용으로 제제화된다.
개시된 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 rAAV 또는 본 개시내용의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 폐 섬유증, 계면활성제 단백질 장애, 퍼옥시솜 생물발생 장애, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), CNS 질환 또는 상태, 및 PNS 질환 또는 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 측면은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 캡시드를 제공하며, rAAV 캡시드는 상응하는 모 AAV 캡시드에 비해 영장류 대상체의 표적 조직에서 측정 시 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개, 및 상응하는 모 AAV 캡시드에 비해 영장류 대상체의 오프-타겟 조직에서 측정 시 감소된 특이성 및 감소된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 갖는다. 일부 경우에, 특이성 또는 형질도입 효율은 대상체에게 rAAV 캡시드를 정맥내로, 동맥내로, 척수강내로, 또는 피하로 투여한 후에 측정된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드는 키메라이다. 일부 경우에, rAAV 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 단백질은, 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 표적 조직 내 rAAV의 국재화의 증가를 부여한다.
일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질 (및 rAAV 캡시드)은 서열식별번호: 1에 제공된 AAV9 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내의 잔기 452-458 중 1개 이상에 상응하는 1개 이상의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 내의 아미노산 217-736으로 제공된다. 일부 경우에, 표적 조직은 중추 신경계 (CNS)이다. 일부 경우에, CNS는 신피질, 기저 신경절, 해마, 시상, 소뇌, 뇌간, 및 척수로부터 선택된 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 말초 신경계 (PNS)이다. 일부 경우에, PNS는 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 신경절은 삼차신경 또는 후근 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 표적 조직은 비-분열 세포이다. 일부 경우에, 비-분열 세포는 뉴런, 성상세포, 소교 세포, 핍지교세포, 및 슈반 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이다. 일부 경우에, AAV 캡시드의 VP1, VP2, 및 VP3은 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질의 3-폴드 대칭 축에 있다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 적어도 3개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 적어도 4개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 잔기 452-455, 453-456, 454-457, 또는 455-458에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 적어도 5개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 잔기 452-456, 453-457, 또는 454-458에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드 (또는 AAV 캡시드 단백질)는 천연 AAV9 캡시드이다. 일부 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드는 서열식별번호: 3-6 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 AAV9의 변이체이다.
일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 452에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 N452A, N452D, N452E, N452G, N452H, N452M, N452N, N452Q, N452S, N452T, 및 N452V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 453에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 G453A, G453D, G453E, G453G, G453K, G453N, G453Q, G453S, G453T, 및 G453V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 454에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 S454A, S454D, S454E, S454G, S454K, S454N, S454Q, S454S, S454T, 및 S454V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 455에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 G455A, G455D, G455E, G455G, G455K, G455N, G455P, G455Q, G455S, 및 G455T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 456에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 Q456A, Q456D, Q456E, Q456G, Q456H, Q456K, Q456N, Q456P, Q456Q, Q456S, 및 Q456T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 457에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 N457A, N457D, N457E, N457G, N457K, N457N, N457P, N457S, N457T, 및 N457V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 458에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 Q458A, Q458E, Q458G, Q458H, Q458K, Q458L, Q458N, Q458Q, Q458S, Q458T, 및 Q458V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 DGAATKN (서열식별번호: 3943)이다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 도 3 또는 표 1로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1의 아미노산 서열 내의 잔기 588에 상응하는 위치의 아미노산 다음에, TLAXPFK (서열식별번호: 46424), TLAX (서열식별번호: 46425), LAVX (서열식별번호: 46426), AVPX (서열식별번호: 46427), 및 VPFX (서열식별번호: 46428)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 X는 V 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, 치환은 도 3에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적 조직은 뇌이고, rAAV 캡시드 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질 (예를 들어, AAV9)과 비교하여 뇌에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질 (예를 들어, AAV9)과 비교하여 간에 대해 감소된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 중추 신경계 (CNS)이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질 (예를 들어, AAV9)과 비교하여 중추 신경계 (CNS)에서 적어도 12-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 척수이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 척수에서 적어도 20-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 뉴런이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 뉴런에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 간에서 적어도 50-배의 감소된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 푸르킨예 세포이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 푸르킨예 세포에서 적어도 4-배의 감소된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 간에서 적어도 100-배의 감소된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, AAV는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, AAV 캡시드는 단리 및 정제된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 AAV 캡시드는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 경우에, 제약 제제는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 제약 부형제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 CNS 또는 PNS의 질환 또는 상태를 치료하기 위해 정맥내, 동맥내, 척수강내, 또는 피하 투여용으로 제제화된다.
본원에 개시된 측면은 AAV9 VP1의 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로의 아미노산 치환을 갖는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드를 제공하며, rAAV 캡시드 및 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질에 비해 대상체에서 오프-타겟 조직에 대해 감소된 특이성 및 감소된 형질도입 효율 중 적어도 1개, 및 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질에 비해 대상체에서 표적 조직에 대해 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 갖는다. 일부 경우에, rAAV 캡시드는 키메라이다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 rAAV 캡시드의 3-폴드 대칭 축에 있다. 일부 경우에, rAAV 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 단백질은, 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 표적 조직 내 rAAV의 국재화의 증가를 부여한다.
일부 경우에, 표적 조직은 중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS)이다. 일부 경우에, CNS는 신피질, 기저 신경절, 해마, 시상, 소뇌, 뇌간, 및 척수로부터 선택된 영역을 포함한다. 일부 경우에, PNS는 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 신경절은 삼차신경 또는 후근 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 표적 조직은 비-분열 세포이다. 일부 경우에, CNS는 뉴런, 척수, 성상세포, 핍지교세포, 및 슈반 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이다.
일부 경우에, 아미노산 치환은 적어도 3개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 적어도 4개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 잔기 452-455, 453-456, 454-457, 또는 455-458에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 적어도 5개의 인접 아미노산을 포함하고, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 잔기 452-456, 453-457, 또는 454-458에 상응하는 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다.
일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 452에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 N452A, N452D, N452E, N452G, N452H, N452M, N452N, N452Q, N452S, N452T, 및 N452V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 453에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 G453A, G453D, G453E, G453G, G453K, G453N, G453Q, G453S, G453T, 및 G453V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 454에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 S454A, S454D, S454E, S454G, S454K, S454N, S454Q, S454S, S454T, 및 S454V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 455에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 G455A, G455D, G455E, G455G, G455K, G455N, G455P, G455Q, G455S, 및 G455T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 456에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 Q456A, Q456D, Q456E, Q456H, Q456H, Q456K, Q456N, Q456P, Q456Q, Q456S, 및 Q456T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 457에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 N457A, N457D, N457E, N457G, N457K, N457N, N457P, N457S, N457T, 및 N457V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV9 VP1에서 잔기 458에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 Q458A, Q458E, Q458G, Q458H, Q458K, Q458L, Q458N, Q458Q, Q458S, Q458T, 및 Q458V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 DGAATKN (서열식별번호: 3943), DGQSSKS (서열식별번호: 2764), 및 표 1에 제공된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서의 적어도 3개의 인접 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, AAV9 VP1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공된다. 일부 경우에, AAV9 VP1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 내의 아미노산 217-736에 제공된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질의 VP1, VP2, 및 VP3은 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질은 천연 AAV9 VP1 캡시드이다. 일부 경우에, 천연 AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 제공된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질은 서열식별번호: 3-6 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 AAV9의 변이체이다.
일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내의 아미노산 위치 588_589에서 TLAXPFK (서열식별번호: 46424), TLAX (서열식별번호: 46425), LAVX (서열식별번호: 46426), AVPX (서열식별번호: 46427), 및 VPFX (서열식별번호: 46428)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 X는 V 이외의 임의의 아미노산이다.
일부 경우에, 표적 조직은 뇌이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 뇌에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 간에 대해 감소된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 중추 신경계 (CNS)이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 CNS에서 적어도 12-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 척수이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 척수에서 적어도 20-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 뉴런이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 뉴런에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 간에서 적어도 50-배의 감소된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 푸르킨예 세포이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 푸르킨예 세포에서 적어도 4-배의 감소된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 조직은 간이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 간에서 적어도 100-배의 감소된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 변이체 AVV 캡시드 단백질은 단리 및 정제된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 캡시드 단백질은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 경우에, 제약 제제는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 제약 부형제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 CNS 또는 PNS의 질환 또는 상태를 치료하기 위해 정맥내, 동맥내, 척수강내, 또는 피하 투여용으로 제제화된다.
본원에 개시된 측면은 대상체에서 표적 조직에 대한 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 부여하는, VP1 넘버링에 따른 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 452-455, 453-456, 454-457, 및 455-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 적어도 4개의 인접 아미노산을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 캡시드를 제공하며, 여기서: (a) 잔기 452에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, D, G, L, N, Q, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 잔기 453에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, G, N, P, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (c) 잔기 454에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, D, G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (d) 잔기 455에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, D, G, K, N, P, Q, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (e) 잔기 456에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, G, K, N, P, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (f) 잔기 457에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, G, K, N, P, R, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; (g) 잔기 458에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산은 A, G, K, L, R, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1의 452-455, 453-456, 454-457, 및 455-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 서열 ILGTGTS (서열식별번호: 45479), QSSQTPR (서열식별번호: 45479), 또는 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 rAAV 캡시드의 3-폴드 대칭 축에 있다. 일부 경우에, 특이성 또는 형질도입 효율은 대상체에게 rAAV 캡시드를 전신 투여한 후에 측정된다. 일부 경우에, 전신 투여는 동맥내, 정맥내, 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 그 안의 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV9로부터의 것이다. 일부 경우에, rAAV 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 단백질은, 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 표적 조직 내 rAAV의 국재화의 증가를 부여한다.
일부 경우에, 치환은 도 3에 제공된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 경우에, 적어도 4개의 인접 아미노산은 LQTSSPG (서열식별번호: 2933), SINTKTN (서열식별번호: 45475), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), 및 GTPSKAG (서열식별번호: 2741)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 경우에, 치환은 도 2에 제공된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 경우에, 적어도 4개의 인접 아미노산은 QQGKQSV (서열식별번호: 79), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), 및 NQSGTKG (서열식별번호: 780)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 경우에, 적어도 4개의 인접 아미노산은 LQTSSPG (서열식별번호: 2933), QQGKQSV (서열식별번호: 79), SINTKTN (서열식별번호: 45475), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), NQSGTKG (서열식별번호: 780), 및 GTPSKAG (서열식별번호: 2741)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 경우에, 적어도 4개의 인접 아미노산은 표 2에 제공된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 경우에, 표적 조직은 중추 신경계 (CNS)이다. 일부 경우에, CNS는 신피질, 기저 신경절, 해마, 시상, 소뇌, 뇌간, 및 척수로부터 선택된 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 말초 신경계 (PNS)이다. 일부 경우에, PNS는 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 신경절은 삼차신경 또는 후근 신경절이다. 일부 경우에, 표적 조직은 비-분열 세포이다. 일부 경우에, CNS는 뉴런, 성상세포, 소교 세포, 핍지교세포, 및 슈반 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 일부 경우에, 표적 조직은 CNS이고, AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 CNS에서 적어도 12-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 뇌이고, AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 뇌에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 척수이고, AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 척수에서 적어도 20-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 뉴런이고, AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 뉴런에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 단리 및 정제된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 단백질은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 경우에, 제약 제제는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 제약 부형제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 CNS 또는 PNS의 질환 또는 상태를 치료하기 위해 정맥내, 동맥내, 척수강내, 또는 피하 투여용으로 제제화된다.
본원에 개시된 측면은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 대상체의 표적 조직에서 측정 시 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 부여하는, AAV9 VP1의 452-455, 453-456, 454-457, 및 455-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 도 2 또는 표 2에 제공된 아미노산 서열로부터의 적어도 4개의 인접 아미노산을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드를 제공한다. 일부 경우에, 적어도 4개의 인접 아미노산은 rAAV 캡시드의 3-폴드 대칭 축에 있다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1의 452-455, 453-456, 454-457, 및 455-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 서열 ILGTGTS (서열식별번호: 45479), QSSQTPR (서열식별번호: 45479), 또는 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 특이성 또는 형질도입 효율은 대상체에게 AAV 캡시드를 전신 투여한 후에 측정된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드는 키메라이다. 일부 경우에, rAAV 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 단백질은, 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 표적 조직 내 rAAV의 국재화의 증가를 부여한다.
일부 경우에, 적어도 4개의 인접 아미노산은 LQTSSPG (서열식별번호: 2933), QQGKQSV (서열식별번호: 79), SINTKTN (서열식별번호: 45475), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), NQSGTKG (서열식별번호: 780), 및 GTPSKAG (서열식별번호: 2741)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 내의 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 인접 아미노산을 포함한다.
일부 경우에, 표적 조직은 중추 신경계 (CNS)이다. 일부 경우에, CNS는 신피질, 기저 신경절, 해마, 시상, 소뇌, 뇌간, 및 척수로부터 선택된 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 말초 신경계 (PNS)이다. 일부 경우에, PNS는 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 신경절은 삼차신경 또는 후근 신경절이다. 일부 경우에, 표적 조직은 비-분열 세포이다. 일부 경우에, CNS는 뉴런, 성상세포, 소교 세포, 핍지교세포, 및 슈반 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다.
일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1의 아미노산 서열 내의 잔기 588_589에 상응하는 아미노산 위치에서 TLAXPFK (서열식별번호: 46424), TLAX (서열식별번호: 46425), LAVX (서열식별번호: 46426), AVPX (서열식별번호: 46427), 및 VPFX (서열식별번호: 46428)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 X는 V 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질은 AAV9이다. 일부 경우에, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공된다. 일부 경우에, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 내의 아미노산 217-736에 제공된다.
일부 경우에, 표적 조직은 뇌이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 뇌에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 CNS이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 CNS에서 적어도 12-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 척수이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 척수에서 적어도 20-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 뉴런이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 뉴런에 대해 증가된 특이성을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 단리 및 정제된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 경우에, 제약 제제는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 제약 부형제를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 측면은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드를 제공하며, rAAV 캡시드는 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질에 비해 대상체의 표적 조직에서 측정 시 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 갖고, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1의 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 및 456-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 3개의 아미노산 (X1-X2-X3)을 포함하고, 여기서: (a) X1은 N, K, R, L, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) X2는 N, S, L, E, D, 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되고; (c) X3은 N, S, A, D, G, L, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 표적 조직은 폐, 심장, 장, 신장, 및 위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 표적 조직은 비-분열 세포이다. 일부 경우에, 조직은 폐이고, 아미노산 서열은 KDNTPGR (서열식별번호: 32538), 또는 도 13에 제공된 임의의 아미노산 서열이다. 일부 경우에, 조직은 폐이고, 아미노산 서열은 NNLPRNL (서열식별번호: 32867), 또는 도 13에 제공된 임의의 아미노산 서열이다. 일부 경우에, 조직은 장이고, 아미노산 서열은 RESSPSL (서열식별번호: 29065), 또는 도 5에 제공된 임의의 아미노산 서열이다. 일부 경우에, 조직은 신장이고, 아미노산 서열은 RVPLSTI (서열식별번호: 26933), 또는 도 6에 제공된 임의의 아미노산 서열이다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다. 일부 경우에, AAV9 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 제공된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 452-455, 453-456, 454-457, 및 455-458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 4개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 X4는 T, S, P, 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 452-456, 453-457, 및 453-458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 5개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 X5는 P, R, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 아미노산 위치 452-457 또는 453-458에 6개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 X6은 N, G, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 아미노산 위치 452-458에 7개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 X7은 R, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질의 VP1, VP2, 및 VP3은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 상응하는 모 AAV 캡시드는 천연 AAV9 캡시드이다. 일부 경우에, 천연 AAV9 캡시드의 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공된다. 일부 경우에, 상응하는 모 AAV는 천연 AAV5 캡시드이다. 일부 경우에, 천연 AAV5 캡시드의 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제공된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 대상체에서 측정 시 표적 조직에 대한 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 폐포 유형 II 상피 (ATII) 세포인 폐 세포-유형이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 ATII 세포에서 적어도 60-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 ATII 세포인 폐 세포-유형이고, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 ATII 세포에서 적어도 60-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 폐에서 적어도 15-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드는 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 폐에서 적어도 30-배의 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다. 또한, 이들 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드가 고려된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드는 단리 및 정제된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 경우에, 제약 제제는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 제약 부형제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 표적 조직의 질환 또는 상태를 치료하기 위해 정맥내, 동맥내, 피하, 또는 비강내 투여용으로 제제화된다.
본원에 개시된 측면은 AAV9 VP1의 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 및 456-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서 3개의 아미노산을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드를 제공하며, 여기서 3개의 아미노산은 도 4-도 14 중 1개 이상에 제공된 아미노산 서열에서 제공된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 대상체의 표적 조직에서 측정 시 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 갖는다. 일부 경우에, 표적 조직은 폐, 장, 간, 위, 심장, 근육, 지방 조직, 비장, 신장, 또는 생식 기관 (예를 들어, 고환, 난소)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 표적 조직은 비-분열 세포이다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 4에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 5에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 6에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 7에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 8에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 9에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 10에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 11에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 12에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 13에 제공된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 도 14에 제공된다. 일부 경우에, rAAV 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 표적 조직 내 rAAV의 국재화의 증가를 부여한다.
일부 경우에, 모 AAV 캡시드는 천연 AAV9의 것이다. 일부 경우에, 천연 AAV9 캡시드 단백질의 VP1 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공된다.
일부 경우에, 3개의 아미노산은 AAV9 VP1의 452-455, 453-456, 454-457, 및 455-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서의 4개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 도 4-도 14 중 1개 이상에 제공된다. 일부 경우에, 3개의 아미노산은 AAV9 VP1의 452-456, 453-457, 및 453-458로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 상응하는 아미노산 위치에서의 5개의 아미노산을 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 도 4-도 14 중 1개 이상에 제공된다. 일부 경우에, 3개의 아미노산은 잔기 452-457 또는 453-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 6개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 도 4-도 14 중 1개 이상에 제공된다. 일부 경우에, 3개의 아미노산은 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 7개의 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 도 4-도 14 중 1개 이상에 제공된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드의 VP1, VP2, 및 VP3은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 rAAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 단리 및 정제된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 AAV 캡시드 또는 변이체 AAV 캡시드 단백질은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로서 제제화된다. 일부 경우에, 제약 제제는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 제약 부형제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제약 제제는 표적 조직의 질환 또는 상태를 치료하기 위해 정맥내, 동맥내, 피하, 또는 비강내 투여용으로 제제화된다.
본원에 개시된 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 rAAV 캡시드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 캡시드는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 캡시드화한다. 일부 경우에, 포유동물 대상체는 영장류이다. 일부 경우에, 포유동물 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 경우에, 포유동물 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 생성물은 단백질이다. 다른 경우에, 치료 유전자 발현 생성물은 RNA, 예를 들어 소형 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA)이다. 일부 경우에, 투여는 정맥내 또는 비강내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 질환 또는 상태는 중추 신경계 또는 말초 신경계의 질환 또는 상태이다. 일부 경우에, 질환 또는 상태는 CNS 또는 PNS의 질환 또는 상태이다. 일부 경우에, 질환 또는 상태는 부신백질이영양증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 안젤만 증후근, 모세혈관확장성 운동실조, 샤르코-마리-투스 증후군, 전형적 근형부 점상 연골이형성증 (RCDP), 코케인 증후군, 난청, 드라베 증후군, 뒤시엔느 근육 이영양증, 간질, 본태성 진전, 유약 X 증후군, 프리드라이히 운동실조, 전두측두엽 치매 (FTD), 고셔병, 교모세포종, 헌팅톤병, 영아 레프숨병 (IRD), 레쉬-니한 증후군, 메이플 시럽뇨 질환, 멘케스 증후군, 근긴장성 이영양증, 기면증, 신경섬유종증, 니만-픽병, 파킨슨병, 페닐케톤뇨, 프라더-윌리 증후군, 레프숨병, 레트 증후군, 척수성 근육 위축, 척수소뇌성 운동실조, 탄지에르병, 테이-삭스병, 결절성 경화증, 폰 히펠-린다우 증후군, 윌리암스 증후군, 윌슨병, 및 젤베거 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 생성물은 사르코글리칸 알파 (SGCA), 글루탐산 데카르복실라제65 (GAD65), 글루탐산 데카르복실라제67 (GAD67), CLN2, 신경 성장 인자 (NGF), 생존 운동 뉴런 1, 텔로미어 (SMN1), 인자 X (FIX), 레티노이드 이소머로히드롤라제 (RPE65), 근형질/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a), β-글루코세레브로시다제 (GCase), 프라탁신 (FXN), 헌팅틴 (HTN), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2), 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX), 프로그래뉼린 (GRN), 항튜불린제, 구리-아연 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 글루코실세라미다제 베타 (GBA), NPC 세포내 콜레스테롤 수송체 1 (NPC1), 및 NLRP3 인플라마솜으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 활성 또는 발현을 조정하는데 효과적이다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 생성물은 유전자 편집 성분을 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집 성분은 인공 부위-특이적 RNA 엔도뉴클레아제 (ASRE), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)/Cas 효소, 및 CRISPR)/Cas 가이드 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 측면은 본원에 기재된 AAV 캡시드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터는 박테리아의 것이다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유래된다. 일부 경우에, 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 (1) 5' 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, (2) 복제 (Rep) 유전자, (3) 캡시드 (Cap) 유전자, 및 (4) 3' ITR을 포함하며, 여기서 Cap 유전자는 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 코딩한다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터는 유사형화 AAV 캡시드 단백질을 코딩한다. 일부 경우에, Cap 유전자는 서열식별번호: 6-10 중 어느 하나에 제공된 데옥시리보스 핵산 (DNA)으로부터 유래된다. 일부 경우에, Cap 유전자를 포함하는 핵산 서열은 서열식별번호: 46364-46383에 제공된 DNA 서열 중 어느 1개와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV2 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV5 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV9 혈청형으로부터 유래된다.
본원에 개시된 측면은 (a) (i) 그의 5' 및 3' 말단에서 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열과 플랭킹된, 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 제1 핵산 서열; (ii) 5' ITR 서열, 복제 (Rep) 유전자, 캡시드 (Cap) 유전자, 및 3' ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 코딩하며, 여기서 Cap 유전자는 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (iii) E4orf6, E2a, 및 VA RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 헬퍼 바이러스 단백질, 및 임의로, E1a 또는 E1b55k를 포함하는 제2 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하고; (b) 세포에서 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 발현시키고; (c) 본원에 개시된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 어셈블리시키고; (d) AAV 입자 내에 제1 핵산 서열을 패키징하는 것을 포함하는, 제조 방법을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 플라스미드에 포함되고, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 경우에, 세포는 불멸화된다. 일부 경우에, 불멸화된 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 특정 경우에, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배아 신장 293 (HEK-293) 세포이다. 다른 경우에, 핵산은 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스에 포함된다. 일부 이러한 경우에, 세포는 곤충 세포이다. 특정의 이러한 경우에, 세포는 SF9 세포이다. 일부 경우에, Cap 유전자는 서열식별번호: 6-10 중 어느 하나에 제공된 데옥시리보스 핵산 (DNA)으로부터 유래된다. 일부 경우에, Cap 유전자를 포함하는 핵산 서열은 서열식별번호: 46364-46383에 제공된 DNA 서열 중 어느 1개와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV2 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV5 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV9 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열 (치료 유전자 발현 생성물을 코딩함) 및 제2 핵산 서열 (cap 유전자를 코딩함)은 트랜스로 존재한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 시스로 존재한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열 (헬퍼 바이러스를 코딩함)은 트랜스로 존재한다.
본원에 개시된 측면은 (a) 5'에서 3' 방향으로 (i) 5' 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열; (ii) 복제 (Rep) 유전자; (iii) 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 캡시드 (Cap) 유전자, 및 (iv) 3' ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및 (b) 임의로, E4orf6, E2a, VA RNA, E1a 및 E1b55k 중 적어도 1개를 포함하는 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 경우에, 키트는 세포를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 경우에, 세포는 불멸화된다. 일부 경우에, 불멸화된 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배아 신장 293 (HEK-293) 세포이다. 일부 경우에, 키트는 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 에피솜이다.
참조로 포함
본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 명시된 바와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
실시양태는 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특색 및 이점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조함으로써 얻어질 수 있을 것이다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 1개의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)이 있는 이러한 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 납부 시에 관청에 의해 제공될 것이다. 관례에 따르면, 도면의 다양한 특색은 일정한 비율이 아니라는 것이 강조된다. 반대로, 다양한 특색의 치수는 명확성을 위해 임의적으로 확대 또는 축소된다. 하기 도면이 도면에 포함된다:
도 1a-1d는 본 발명의 실시양태에 따른 바이러스 조작 개관을 보여준다. 도 1a는 AAV9 (원형)의 3-폴드 대칭을 포함하는 3개의 단량체의 표면 모델을 보여주며, 아미노산 452-458에서의 이러한 라이브러리에 도입된 7개의 아미노산 치환 (적색), 및 아미노산 588-589에서의 이전에 AAV-PHP.eB에 의해 도입된 2개의 아미노산 치환 및 7개의 아미노산 삽입 (녹색)의 위치를 예시한다. 도 1b는 루프의 근접성 및 캡시드 표면에 대한 그의 관계를 나타낸, 단일 AAV9 단량체 내의 2개의 루프의 위치를 보여준다 (AAV 내부가 아래이고, 외부가 위임). 도 1c는 제2 단량체의 495 (중간) 루프와 상호작용하는 하나의 AAV9 단량체의 588 (좌측) 및 455 (우측) 루프에 의해 생성된 스파이크를 보여준다. 도 1d는 조작 공정의 개략도를 보여준다 ("TATT NNKNNK...NNKNNK CAAC"는 서열식별번호: 45492-45493으로 개시되고, "TATT AACGGT...AATCAA CAAC"는 서열식별번호: 45494-45495로 개시됨). PCR을 사용하여, 폴리아데닐화 서열 주위에 Cre 유도성 스위치를 보유하는 rAAV9 게놈 내에 9-아미노산 치환/삽입 (AAV-PHP.eB; 녹색 밴드) 및/또는 치환 (AA 452-458; 적색 밴드)의 형태로 다양성을 도입한다. DNA 캡시드 라이브러리로 HEK-293T 세포를 형질감염시키고, 60시간 후에 다양한 바이러스 캡시드 라이브러리를 수거한다. 바이러스 라이브러리를 한 패널의 Cre-트랜스제닉 동물 내로 전신 주사한다. 3주 발현 후, 조직을 수거하고, 모든 기관으로부터 DNA를 추출한다. PCR을 사용하여, Cre+ 세포를 형질도입시킨 캡시드로부터만 서열을 선택적으로 회수하여, 그의 폴리아데닐화 서열을 플리핑한다. 후속적으로, 회수된 서열은 PCR에 의한 차세대 서열분석 (NGS)을 위해 준비되며, 각각의 특정 Cre- 조직 조합에 대해 특유한 이중-지수 바코드가 부가된다. NGS 후, 풍부화 (다른 서열과 비교하여 특정 조직 내에서의 증가된 출현율, 주사된 바이러스 라이브러리 내의 그의 존재에 대해 정규화됨) 및 특이성 (다른 조직 또는 세포 유형과 비교하여 특정 조직 또는 세포 유형 내에서의 증가된 출현율)에 대해 양성 및 음성 선택을 사용하여 데이터를 채굴한다. 1 내지 2 라운드의 선택 후에, 개별 변이체를 그의 풍부화 및 특이성 점수에 기초하여 시험하였다. 이탤릭체의 서열은 AAV9를 나타내며, 이는 간에서 고도로 풍부화되지만 (우측), 뇌에서는 그렇지 않다 (좌측).
도 2는 2 라운드의 생체내 선택 후에 중추 신경계 (CNS)에서 양성 풍부화된 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 3은 2 라운드의 생체내 선택 후에 CNS에 특이적인 향성을 갖고 간을 탈표적화하는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. "풍부화"는 트랜스제닉 동물에게 투여된 바이러스 라이브러리에서의 그의 출현율과 비교하여 조직에서의 주어진 변이체의 출현율이다. 1 초과의 풍부화 점수는 양성 풍부화를 나타내고; 0 미만의 풍부화 점수는 음성 풍부화를 나타낸다. 풍부화 점수 0은 변이체가 조직에서 검출될 수 없었음을 나타낸다.
도 4는 2 라운드의 생체내 선택 후에 심장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 5는 2 라운드의 생체내 선택 후에 장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 6은 2 라운드의 생체내 선택 후에 신장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 7은 2 라운드의 생체내 선택 후에 간에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 8은 2 라운드의 생체내 선택 후에 근육에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 9는 2 라운드의 생체내 선택 후에 췌장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 10은 2 라운드의 생체내 선택 후에 비장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 11은 2 라운드의 생체내 선택 후에 위에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 12는 2 라운드의 생체내 선택 후에 고환에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 13은 2 라운드의 생체내 선택 후에 폐에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 14는 2 라운드의 생체내 선택 후에 지방 조직에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 15a-15b는 후보 변이체의 차세대 서열분석 데이터 및 생체내 형질도입 효율을 보여준다. 도 15a는 2개의 후보 변이체인 AAV.CAP-A4 및 AAV.CAP-A14, 및 무작위로 선택된 변이체의 로그 풍부화에서의 상대 존재비를 보여준다. NGS 데이터는 폐에서의 AAV.CAP-A4의 유의한 풍부화를, 여러 말초 기관에서의 음성 풍부화와 함께 보여준다. 반대로, AAV.CAP-A14는 위 및 장 내의 뉴런에서 풍부화되고, 폐와 같은 다른 기관에서는 음성 풍부화된다. 도 15b는 5 x 1011개 vg의 rAAV:CAG-m네온그린의 전신 투여 2주 후의 생체내 형질도입이 2A에서의 NGS 데이터를 확인시켜 주며, AAV.CAP-A4는 AAV9와 비교하여 폐를 강하게 형질도입시키고, AAV.CAP-A14는 위 및 장 내의 뉴런을 보다 강하게 형질도입시킨다는 것을 보여준다. 의심을 피하기 위해, AAV.CAP-A4는 서열식별번호: 32538 (폐에서 풍부화), 서열식별번호: 25633 (심장에서 풍부화), 서열식별번호: 26584 (장에서 풍부화), 및 서열식별번호: 28509 (신장에서 풍부화)에 제공된 KDNTPGR이다. AAV.CAP-A14는 서열식별번호: 26474 (장에서 풍부화), 서열식별번호: 29065 (신장에서 풍부화), 및 서열식별번호: 31904 (위에서 풍부화)에 제공된 RESSPSL이다.
도 16a-16d는 AAV.CAP-A4의 향성이 폐 내의 점막하 세포에서 강하게 풍부화된다는 것을 보여준다. ssAAV9:CAG-NLSx2-EGFP, ssAAV5:CAG-NLSx2-EGFP 또는 ssAAV.CAP-A4:CAG-NLSx2-EGFP를 수컷 성체 마우스 내로 1 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하였다. GFP 형광을 3주 발현 후에 평가하였다. 도 16a는 그의 모 캡시드 AAV9와 비교하여 AAV.CAP-A4에 의해 형질도입된 세포의 총수의 비교를 제공한다. 도 16b는 EGFP 발현에 의해 평가된 바와 같은 전체 형질도입이 AAV5 및 AAV9와 비교하여 15-30배 증가된다는 것을 보여준다. 도 16c는 EGFP 신호와 항체 염색의 공동국재화에 의해 평가된 바와 같은 세포-유형 특이적 정량화를 제공하고, ATII 세포의 AAV.CAP-A4 형질도입이 (각각) AAV5 및 AAV9와 비교하여 30-60배 증가된다는 것을 보여준다. AAV.CAP-A4에 의해 형질도입된 유의한 수의 세포는 폐포 유형 II 폐포세포이다. 도 16d는 세포-유형 특이성의 정량화를 보여주며, 폐에서 형질도입된 세포의 60%는 ATII 세포로 확인된다. 정량화: AAV9, AAV5 및 AAV.CAP-A4에 대해 군당 n = 3마리의 마우스, 평균 ± SE, 일원 ANOVA (*P ≤ 0.05; n.s., P ≥ 0.05). 축척 막대는 50 μm이다.
도 17a-17e는 AAV-PHP.eB에서의 7개의 아미노산 (AA) 치환 라이브러리의 특징화를 보여준다. 도 17a는 AAV-PHP.eB에서의 7개의 아미노산 치환에 걸친 분포를 보여주며, 이는 DNA 라이브러리의 PCR 생성 및 바이러스 캡시드 라이브러리의 패키징 후 비교적 균일한 분포 (몇몇 주목할 만한 예외 존재), 정지 코돈의 낮은 출현율, 및 야생형 (WT) AAV9 서열 (NGSGQNQ (서열식별번호: 545))로의 편향 부재를 보여준다. 도 17b는 2 라운드의 양성 및 음성 선택으로부터 수득된 상위 수행 변이체의 하위세트 (출현 순서대로 각각 서열식별번호: 45496-45513)를 보여주며, WT AAV9 서열과의 강한 차이를 보여준다. TI: 위치 450-451에 존재하는 트레오닌 및 이소류신 잔기; QT: 위치 459-460에 존재하는 글루타민 및 트레오닌 잔기. 도 17c는 상위 수행자의 하위세트의 로그-풍부화 점수를 플롯팅한 열 지도를 보여주며, 이는 AAV-PHP.eB가 이미 편향되어 있는 표적인 뉴런 집단에 대한 특이성 및 뉴런 집단에서의 풍부화를 입증한다. 도 17d는 ssAAV9:CAG-m네온그린, ssAAV-PHP.eB:CAG-m네온그린, ssAAV.CAP-B1:CAG-m네온그린 (LQTSSPG; 서열식별번호: 2933), ssAAV.CAP-B2:CAG-m네온그린 (QQGKQSV; 서열식별번호: 79), ssAAV.CAP-B4:CAG-m네온그린 (SINTKTN; 서열식별번호: 45475), 및 ssAAV.CAP-B7:CAG-m네온그린 (SNGTKQT; 서열식별번호: 442)을 수컷 성체 마우스 내로 5 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하고 2주 후에 m네온그린 형광을 평가한 것을 보여준다. 도 17e는 ssAAV.CAP-B8:CAG-m네온그린 (GSGKTAA; 서열식별번호: 88), ssAAV.CAP-B9:CAG-m네온그린 (MGDKPTR; 서열식별번호: 2466), ssAAV.CAP-B10:CAG-m네온그린 (DGAATKN; 서열식별번호: 3943), ssAAV.CAP-B11:CAG-m네온그린 (QPSGGNT; 서열식별번호: 2672), ssAAV.CAP-B14:CAG-m네온그린 (ERGANTK; 서열식별번호: 5192), ssAAV.CAP-B16:CAG-m네온그린 (TTGGHSS; 서열식별번호: 2743), ssAAV.CAP-B17:CAG-m네온그린 (GTTKTSE; 서열식별번호: 3064), ssAAV.CAP-B18:CAG-m네온그린 (GTGTSVL; 서열식별번호: 11958), ssAAV.CAP-B19:CAG-m네온그린 (NQSGTKG; 서열식별번호: 780), ssAAV.CAP-B22:CAG-m네온그린 (DGQSSKS; 서열식별번호: 2764), ssAAV.CAP-B23:CAG-m네온그린 (KGPGQMG; 서열식별번호: 45476), 또는 ssAAV.CAP-B25:CAG-m네온그린 (GTPSKAG; 서열식별번호: 2741)을 수컷 성체 마우스 내로 5 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하고 2주 후에 m네온그린 형광을 평가한 것을 보여준다. 도 17d 및 도 17e에서, 상위 수행 변이체의 형질도입 프로파일의 직접 비교는 검증된 향성 및 NGS 데이터에 의해 예측된 것 사이의 강한 상관관계를 보여준다. 축척 막대는 2 mm이다.
도 18a-18d는 AAV.CAP-B10의 향성이 뇌로 강하게 편향되며, 유의한 간 탈표적화가 존재함을 보여준다. ssAAV9:CAG-NLSx2-EGFP, ssAAV-PHP.eB:CAG-NLSx2-EGFP 또는 ssAAV.CAP-B10:CAG-NLSx2-EGFP를 수컷 성체 마우스 내로 1 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하였다. GFP 형광을 3주 발현 후에 평가하였다. 도 18a는 AAV9, AAV-PHP.eB, 및 AAV.CAP-B10의 BBB 횡단 및 뇌 형질도입의 비교를 보여주며, 이는 WT 캡시드의 반복 조작 후 뇌에서의 형질도입 효율의 점진적 증가를 보여준다. 도 18b는 간에서 동일한 비교를 보여주며, 이는 형질도입 효율의 점진적 감소를 보여준다. 도 18c는 뇌에 형질도입된 세포의 총 수의 정량화를 제공하며, 이는 AAV-PHP.eB와 비교하여 AAV.CAP-B10에 대한 총 형질도입의 비-유의한 증가를 보여주고, 이들 둘 다는 AAV9와 비교하여 유의하게 증가된다. 세포당 평균 밝기의 비교는 AAV9에 비해 AAV.CAP-B10의 유의한 증가를 보여주지만 AAV-PHP.eB에 비해서는 그렇지 않음을 보여준다. 도 18d는 간에 형질도입된 세포의 총 수의 정량화를 제공하며, AAV.CAP-B10을 AAV9 및 AAV-PHP.eB 둘 다와 비교한 경우의 유의한 감소를 보여준다. AAV.CAP-B10 및 AAV9를 비교한 경우 세포당 밝기도 또한 유의하게 감소되었고, AAV-PHP.eB와 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 정량화: 군당 n = 6마리의 마우스, 평균 ± SE, 형질도입의 경우 브라운-포사이드(Brown-Forsythe) 및 웰치(Welch) ANOVA 검정 및 밝기의 경우 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 (*P ≤ 0.05; n.s., P ≥ 0.05). 축척 막대는 1 mm이다.
도 19a-f는 뇌 내에서, AAV.CAP-B10이 뉴런으로 강하게 편향된다는 것을 보여준다. ssAAV-PHP.eB:CAG-NLSx2-EGFP 또는 ssAAV.CAP-BB10:CAG-NLSx2-EGFP를 수컷 성체 마우스 내로 1 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하였다. GFP 형광을 3주 발현 후에 평가하였다. 도 19a-19b는 다중 뇌 영역에 걸쳐, AAV.CAP-B10이 AAV-PHP.eB와 비교하여 형질도입된 뉴런의 총 수의 비-유의한 증가를 보여주었음을 보여준다. 도 19c-19d는 AAV.CAP-B10이 AAV-PHP.eB와 비교하여 정량화된 모든 뇌 영역에 걸쳐 성상세포의 유의하게 감소된 형질도입을 보여준다는 것을 보여준다. 도 19e-19f는 AAV.CAP-B10이 AAV-PHP.eB와 비교하여 정량화된 모든 뇌 영역에 걸쳐 핍지교세포의 유의하게 감소된 형질도입을 보여준다는 것을 보여준다. 정량화: 군당 n = 6마리의 마우스, 평균 ± SE, 만-휘트니 검정 (*P ≤ 0.05; n.s., P ≥ 0.05). 축척 막대는 200 μm이다.
도 20a-20c는 뇌에서 풍부화되고 간으로부터 탈표적화된 변이체에 대한 7량체 치환에 걸친 아미노산 기여를 보여준다. 도 20a는 뇌에서 풍부화된 변이체에 대한 7량체 치환에 걸친 아미노산 기여를 보여준다. 도 20b는 간으로부터 음성 풍부화된 (탈-표적화된) 변이체에 대한 7량체 치환에 걸친 아미노산 기여를 보여준다. 도 20c는 뇌에서 풍부화되고 간으로부터 음성 풍부화된 (탈-표적화된) 변이체에 대한 7량체 치환에 걸친 아미노산 기여를 보여준다. hSyn-Cre 동물의 뇌에서 가장 높게 풍부화된 1000개의 변이체, Tek-Cre 동물의 간에서 가장 낮게 풍부화된 1000개의 변이체, 및 뇌에서 양성 풍부화되고 간에서 음성 풍부화된 모든 변이체를 분석하였다. 각각의 위치에서의 모든 아미노산의 z-점수가 플롯팅된다.
도 21은 AAV.CAP-B10이 말초 기관으로부터 탈표적화됨을 보여준다. ssAAV9:CAG-NLSx2-EGFP, ssAAV-PHP.eB:CAG-NLSx2-EGFP 또는 ssAAV.CAP-B10:CAG-NLSx2-EGFP를 수컷 성체 마우스 내로 1 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하였다. GFP 형광을 3주 발현 후에 평가하였다. 말초 조직에서의 형질도입 효율은 각각 AAV9 또는 AAV-PHP.eB와 비교하였을 때 AAV.CAP-B10의 경우 척수 형질도입에서의 유의한 증가 및 감소를 보여준다. DRG에서, AAV.CAP-B10은 AAV9와 비교하였을 때 유의하게 감소되고, AAV-PHP.eB와 비교하였을 때 비-유의하게 감소된다. 장의 장근 신경총 및 점막하 신경총에서, AAV.CAP-B10은 AAV9와 비교하였을 때 유의하게 감소되고, AAV-PHP.eB와 비교하였을 때 비-유의하게 감소된다. 폐에서, AAV.CAP-B10은 AAV-PHP.eB와 비교하였을 때 유의하게 감소되고, AAV9와 비교하였을 때 비-유의하게 감소된다. 신장, 비장, 췌장 및 고환에서, AAV.CAP-B10은 AAV9와 비교하였을 때 유의하게 감소되고, AAV-PHP.eB와 비교하였을 때 비-유의하게 감소된다. 정량화: 군당 n = 6마리의 마우스, 예외로 척수 및 DRG의 경우 AAV9 및 AAV-PHP.eB는 n = 3마리의 마우스 및 AAV.CAP-B10은 n = 5마리의 마우스, 평균 ± SE, 척수의 경우 ANOVA, 장근 신경총 및 췌장의 경우 브라운-포사이드 및 웰치 ANOVA 검정, DRG, 점막하 신경총, 폐, 신장, 비장 및 고환의 경우 크루스칼-왈리스 검정 (*P ≤ 0.05; n.s., P ≥ 0.05).
도 22a-22b는 AAV.CAP-B10이 소뇌의 푸르킨예 세포로부터 유의하게 탈표적화됨을 보여준다. ssAAV-PHP.eB:CAG-NLSx2-EGFP 또는 ssAAVCAP-B10:CAG-NLSx2-EGFP를 수컷 성체 마우스 내로 1 x 1011개 vg/마우스로 정맥내로 주사하였다. GFP 형광을 3주 발현 후에 평가하였다. 도 22a는 소뇌 절편에서의 면역형광을 보여준다. 도 22b는 소뇌에서의 푸르킨예 세포 형질도입의 정량화를 보여주고, AAV-PHP.eB와 비교하였을 때 AAV.CAP-B10에 의해 형질도입된 유의하게 더 적은 푸르킨예 세포를 보여준다. 정량화: 군당 n = 6마리의 마우스, 평균 ± SE, 만-휘트니 검정 (*P ≤ 0.05; n.s., P ≥ 0.05). 축척 막대는 200 μm이다.
도 23a-23f는 비-인간 영장류에서의 풀링된 발현의 특징화를 보여준다. 도 23a는 신규 변이체 AAV.CAP-B1, AAV.CAP-B2, AAV.CAP-B8, AAV.CAP-B10, AAV.CAP-B18 및 AAV.CAP-B22 및 대조군 AAV9 및 AAV-PHP.eB의 풀링된 주사를 위한 실험 패러다임을 보여준다. HA 태그에 융합된 인간 FXN은 편재성 CAG 프로모터의 제어 하에 각각의 변이체 내에 패키징되며, 5' UTR에서의 특유한 12bp RNA 바코드가 각각의 변이체를 구별시켜준다. 2마리의 마모셋에 1.2 x 10^14개 vg/kg의 용량으로 주사하였고, 이 중 1/8은 풀 내의 각각의 변이체가 기여하였다. 도 23b는 마모셋 뇌의 전방-후방 축 및 소뇌를 통해 분포된 6개의 절편을 보여준다. FXN 트랜스진 상의 HA 태그에 대한 대조-염색은 변이체의 풀의 IV 투여 후 뇌 전반에 걸쳐 분포된 강건한 발현을 보여준다. 도 23c는 풀 내의 8개의 변이체 각각에 대한 2마리의 마모셋으로부터의 RNA 바코드 발현의 NGS 정량화를 보여주며, 이는 AAV9와 비교하여 AAV.CAP-B22의 RNA 수준에서의 >12-배 증가 및 AAV.CAP-B10의 경우의 >5-배 증가를 포함한 여러 변이체의 경우의 현저한 증가를 보여준다. 도 23d는 피질, 해마, 및 소뇌를 포함한 대부분의 뇌 영역에 걸쳐 유의하고 광범위한 형질도입을 보여주는 다양한 피질 및 피질하 영역으로부터의 줌-인 프레임을 보여준다. 도 23e는 간에서의 HA 태그에 대한 대조-염색을 보여주며, 이는 바이러스 풀로부터의 낮은 전체 형질도입을 밝혀내었다. NGS 정량화는 간으로부터의 상대적인 탈표적화를 보여주며, AAV.CAP-B22는 AAV9와 유사한 RNA 수준을 기여하고, AAV.CAP-B10은 >5-배 더 적게 기여한다. 도 23f는 심장의 형질도입이 여러 변이체의 경우에 AAV9로부터 증가되며, 비교 시 AAV.CAP-B22가 거의 5-배 더 많은 RNA에 기여한다는 것을 보여준다. 변이체에 의한 부신 피질의 형질도입은 AAV9와 비교하여 다양하였다. 간 형질도입의 분석의 경우 2마리의 동물로부터, 및 심장 및 부신 형질도입의 경우 1마리의 동물로부터 RNA를 수집하였다.
대상체에게 투여 시 대상체에서 표적 세포 또는 환경 (예를 들어, 세포-유형 또는 조직) 내로 트랜스진을 통합시키는데 유용한 변형된 아데노-연관 (AAV) 바이러스 캡시드 단백질 조성물이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질은 참조 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 상응하는 비변형된 모 캡시드 단백질과 비교하여 목적하는 향성 예컨대 증가 또는 감소된 특이성, 또는 참조 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 상응하는 비변형된 모 캡시드 단백질과 비교하여 증가 또는 감소된 트랜스진 형질도입 효율을 부여하는, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산의 적어도 1개의 삽입 또는 치환을 포함한다.
AAV에서 가장 통상적으로 조작되는 루프는 588 루프이며, 이는 AAV2의 헤파란 술페이트 결합 부위이고 펩티드 디스플레이에 적용가능한 부위이기 때문이다. AAV9에 대해 유일하게 공지된 수용체는 N-연결된 말단 갈락토스이지만, 많은 적응증은 다른 것을 암시한다. AAV9 588 루프에 대한 변형은 설치류 모델에서 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 표적 생체내 환경에서의 증가된 특이성 및 트랜스진 형질도입 효율을 부여하는 것으로 제시되었지만, 이들 목적하는 향성은 비-인간 영장류 모델에서 번역되지 않았고, 이는 이것이 인간 질환을 치료하는데 있어서 제한된 가치를 갖게 한다. 변형된 AAV 캡시드 단백질의 비제한적 예는 AAV-PHP.B, AAV-PHP.eB, AAV-PHP.S, 및 AAV-PHP를 포함한다.
상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 적어도 1개의 아미노산의 삽입 또는 치환을 포함하며, 그러한 삽입 또는 치환이 AAV9의 아미노산 455 루프 (AA455 루프)에 상응하는 루프에 존재하는 것인, 인간 질환의 설치류 및 비-인간 영장류 모델 둘 다에서 관찰되는 목적하는 향성을 갖는 변형된 AAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. AA455 루프는 캡시드의 표면으로부터 가장 멀리 돌출되어 있고, 중화 항체 결합에 연루된다. AA455 루프는 그 자체로 또는 588 루프와의 상호작용에 의해 세포-표면 수용체 결합에서 유의한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV5, AAV9, 또는 이전에 변형된 AAV5 또는 AAV9 (예를 들어, AAV-PHP.eB, AAV-PHP.B 등)이다.
AAV-매개된 트랜스진 전달의 가장 통상적인 방법은 표적 생체내 환경으로의 직접 주사에 의하는 것이며, 이는 보다 덜 침습적인 방법과 비교하여 손상 또는 사망의 위험, 통증, 및 보다 높은 비용을 포함한 많은 이유로 인해 불리하다. 정맥내 투여에 의한 이전의 AAV-매개된 전달은 직접 주사에 대한 필요는 피하지만, 표적 생체내 환경에 대한 감소된 특이성 및 형질도입 효율로 인해 오프-타겟 형질도입 사건을 발생시키고, 표적 생체내 환경에서 충분한 치료 수준을 달성하기 위해 보다 많은 바이러스 로드를 필요로 한다. 이는 특히 AAV가 표적 생체내 환경에 도달하기 위해, 예컨대 중추 신경계 (CNS) 및 폐의 질환 또는 상태를 치료하기 위해, 혈액 뇌 장벽 (BBB) 또는 상피 내층을 횡단해야 하는 경우에 명백하다.
참조 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 상응하는 모 캡시드 단백질과 비교하여 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율을 갖는 트랜스진 (예를 들어, 치료 핵산)을 포함하는 바이러스 벡터를 캡시드화한 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드를 전신 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질은 BBB를 횡단할 수 있고, 설치류 및 비-인간 영장류 모델 둘 다에서 특정한 표적 세포-유형 (예를 들어, 뉴런) 내에 트랜스진을 형질도입시킬 수 있다. 또한, 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질은 폐의 세포-유형 (예를 들어, 유형 II 상피 (ATII) 세포)을 표적화할 수 있고, 일부 경우에 참조 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 상응하는 모 캡시드 단백질과 비교하여 트랜스진 형질도입 효율을 60-배 증가시킨다. 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질은 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간을, 일부 경우에, 참조 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 상응하는 모 캡시드 단백질에 비해 트랜스진 형질도입 효율의 100-배 감소만큼 탈표적화할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질은 인간 질환을 치료하기 위한 트랜스진 요법에 적합하다.
재조합 AAV (rAAV) 벡터 내에 함유되고 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 트랜스진이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 트랜스진은 다양한 목적을 위해, 예를 들어 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하기 위해 대상체에게 전달된다. 트랜스진은 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 활성 또는 발현을 조정하는 유전자 편집 성분일 수 있다. 대안적으로, 트랜스진은 또 다른 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 그 자체의 활성 또는 발현을 조정하는데 효과적인 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 유전자이다.
변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 및 치료 핵산을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 비리온 또는 rAAV 입자를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 변형된 캡시드 단백질은 세포 (예를 들어, 불멸화된 줄기 세포)에 트랜스진을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 치료 핵산을 함유함), 변형된 AAV 캡시드 단백질과 함께 AAV 게놈을 코딩하는 제1 플라스미드 벡터, 및 변형된 캡시드 구조의 어셈블리 및 변형된 캡시드 내에의 트랜스진의 패키징에 필요한 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제2 플라스미드 벡터를 도입하는 것에 의해 생산된다. 어셈블리된 rAAV 입자는 관련 기술분야에 공지된 적합한 방법을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제될 수 있다.
본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시내용의 벡터는 2개의 AAV 바이러스 유전자인 Rep (복제), Cap (캡시드)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 바이러스 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩하는 Cap 유전자는 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질을 생산하도록 변형된다. 벡터는 1개 이상의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV5, AAV9), 또는 변이체 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV-PHP.eB, AAV-PHP.B 등)으로부터의 바이러스 게놈을 포함할 수 있다.
개관
재조합 AAV (rAAV) 매개된 유전자 전달은 에피솜 이종 핵산 (예를 들어, 트랜스진, 치료 핵산)의 핵 발현을 위해 바이러스 형질도입의 AAV 메카니즘을 활용한다. 숙주 생체내 환경으로 전달되면, rAAV는 (1) 표적 세포 상의 세포 표면 수용체에 결합하거나 부착하고, (2) 세포내이입하고, (3) 핵으로 이동하고, (4) 바이러스를 탈코팅하여 캡시드화된 이종 핵산을 방출하고, (5) 핵에서의 전사를 위한 주형으로서 이종 핵산을 단일-가닥으로부터 이중-가닥 DNA로 전환시키고, (6) 숙주 세포의 핵에서 에피솜 이종 핵산을 전사시킬 것이다 ("형질도입"). 증가된 특이성 (표적 세포 상의 세포 표면 수용체에의 결합) 및 형질도입 효율 (숙주 세포에서의 에피솜 이종 핵산의 전사)을 갖도록 조작된 rAAV가 유전자 요법 용도에 바람직하다.
AAV 캡시드는 3개의 캡시드 단백질 단량체인 VP1, VP2, 및 VP3으로 구성된다. 이들 3개의 VP 단백질의 60개 카피는 1:1:10 비로 상호작용하여 바이러스 캡시드를 형성한다. VP1은 ~137개의 아미노산 N-말단 영역 (VP1u)에 더하여 VP2 단백질 전체를 커버하고, VP2는 ~65개의 아미노산 N-말단 영역 (VP1/2 공통 영역)에 더하여 VP3 전체를 커버한다. 3개의 캡시드 단백질은 VP3의 보존된 아미노산 서열을 공유하며, 이는 일부 경우에 아미노산 위치 217에서 시작하는 영역이다 (예를 들어, AA 217-736).
AAV VP3 구조는 모든 혈청형에 공통인 고도로 보존된 영역, 코어 8-가닥 β-배럴 모티프 (βB-βI) 및 소형 α-나선 (αA)을 함유한다. β-가닥 사이에 삽입된 루프 영역은 β-가닥 H와 I 사이의 특유의 HI 루프, β-가닥 D와 E 사이의 DE 루프, 및 루프의 상부를 형성하는 9개의 가변 영역 (VR)으로 이루어진다. 이들 VR은 캡시드 표면 상에서 발견되고, 수용체 결합, 형질도입 및 항원 특이성을 포함한 AAV 생활 주기에서의 특정 기능적 역할과 연관될 수 있다. 예를 들어, AA455 루프는 캡시드의 표면으로부터 가장 멀리 돌출되어 있고, 중화 항체 결합에 연루되어 있으며, 세포-표면 수용체 결합에서 그 자체로 또는 588 루프와의 상호작용에 의해 유의한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
특정 세포-유형, 예를 들어 뇌 세포 유형에서 형질도입에 대한 보다 높은 효율 및 특이성을 특징으로 하는 목적하는 향성을 부여하는, AA455 루프에서 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드를 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 본원에 개시된다. 특히, 본원에 개시된 변형된 AAV 캡시드는 다른 것은 탈표적화하면서 이종 유전자 (예를 들어, 트랜스진)의 rAAV-매개된 형질도입을 가능하게 함으로써, 말초 기관, 예컨대 간에서의 오프-타겟 형질도입 사건을 방지한다. 또한, 특정한 기관 또는 환경, 예를 들어, 폐, 장, 위, 심장, 근육, 지방 조직, 비장, 신장, 또는 생식 기관 (예를 들어, 고환, 난소)에서의 형질도입에 대한 보다 높은 효율 및 특이성을 특징으로 하는 향성을 부여하는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드를 갖는 rAAV가 본원에 개시된다. 본원에 기재된 rAAV는 질환의 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 광범위한 적용에 유용하다.
조성물
rAAV 캡시드 및 변이체 AAV 캡시드 단백질
변형된 캡시드 단백질 (예를 들어, VP1, VP2, VP3)로 조작된 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV 캡시드 단백질)을 갖는 재조합 AAV (rAAV)가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 본원에 개시된 방법 (예를 들어, M-CREATE)을 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 치료 핵산 (예컨대 트랜스진)을 대상체에게 전달하는 방법에 사용된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 단백질은 이를 특정 치료 용도, 예를 들어, 본원에 개시된 것과 같은 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료에 특히 적합하게 하는 목적하는 AAV 향성을 갖는다.
표 3-4에 제공된 것과 같이 rAAV 캡시드 단백질은 대상체에의 rAAV의 전신 투여시 대상체의 혈액 뇌 장벽 (BBB) 내 및 그를 통한 최적화된 진입을 위해 조작된다. 뇌로 치료 트랜스진을 AAV-매개 전달하는 선행 방법은 두개내 주사를 필요로 하였다. 두개내 주사는 대상체의 불편, 일부 경우에는 통증을 유발하는 침습성 절차이다. 예를 들어, 두개내 주사는 뇌의 출혈을 유발할 수 있다. 추가적으로, 두개내 전달은 제한된 확산을 갖고 고도로 불균질하다. 표 3-4에 제공된 rAAV 캡시드 단백질은, 캡시드화된 트랜스진의 광범위하고 효율적인 형질도입을 또한 달성하면서, 두개내 주사에 대한 필요를 제거하는 향성을 갖도록 조작된다. 특히, 향성은 상응하는 모 AAV 또는 참조 AAV와 비교하여 대상체의 중추 신경계 (CNS) 및/또는 대상체의 말초 신경계 (PNS)에서의 (예를 들어, 바이러스 형질도입의) 증가된 특이성 및 효율 중 적어도 1개를 포함한다. 표 1에 제공된 것과 같이 본원에 개시된 rAAV는 또한 특정 말초 기관 (예를 들어, 간)을 탈-표적화하여, 오프-타겟 바이러스 형질도입을 피할 수 있다.
또한, 대상체 내의 특정 기관 또는 조직을 표적화하기 위해 최적화된 조작된 캡시드 단백질을 갖는 rAAV가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 기관은 심장이다. 일부 실시양태에서, 기관은 폐이다. 일부 실시양태에서, 기관은 간이다. 일부 실시양태에서, 기관은 장이다. 일부 실시양태에서, 기관은 위이다. 일부 실시양태에서, 기관은 비장이다. 일부 실시양태에서, 기관은 신장이다. 일부 실시양태에서, 조직은 지방 조직 (지방)이다. 일부 실시양태에서, 조직은 근육이다. 근육은 심장 근육일 수 있다. 근육은 골격근일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기관은 췌장이다. 일부 실시양태에서, 기관은 생식 기관, 예컨대 고환 또는 난소이다. 추가 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV는 또한 특정 말초 기관을 탈-표적화함으로써, 오프-타겟 바이러스 형질도입을 감소시키거나 피할 수 있다. 비제한적 예에서, 본 실시양태, 표 1의 rAAV는, 참조 AAV (예를 들어, AAV9)와 비교하여, 뇌 (예를 들어, 표적 환경)에서 증가된 특이성 및 형질도입을 갖고, 간 (예를 들어, 오프-타겟 환경)에서 매우 낮은 형질도입 효율을 갖고 특이성은 갖지 않는다.
본원에 기재된 조작된 AAV 캡시드 단백질은 일부 경우에 삽입 또는 치환의 아미노산 위치에서 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 이종인 아미노산의 삽입 또는 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 삽입 또는 치환의 아미노산 위치에서 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 내인성이 아니다. 아미노산은 상이한 AAV 캡시드 단백질 내에서의 삽입 또는 치환과 동일하거나 동등한 아미노산 위치에서의 자연 발생 아미노산일 수 있다.
일반적으로, 삽입 또는 치환은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 455 루프에서 삽입 또는 치환된 5-, 6-, 또는 7-아미노산 중합체 (각각 5량체, 6량체, 또는 7량체)를 포함한다. 본원에 기재된 7량체는 유리하게는 축중성 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 생성되었고, 여기서 7개의 아미노산 각각은 데옥시리보스 핵산 (DNA) 서열 N-N-K에 의해 코딩된다. "N"은 4개의 DNA 뉴클레오티드 중 임의의 것이고, K는 구아닌 (G) 또는 티민 (T)이다. 무작위 7량체 아미노산 서열을 생성하는 이러한 방법은 단백질 수준에서 12억 8천만개의 가능한 조합을 가능하게 한다. 개발된 7량체는 무작위이기 때문에, 7량체 내의 일부 아미노산은 그 아미노산 위치에서 AAC 캡시드 단백질에서의 자연 발생일 수 있고, 다른 아미노산은 상이할 수 있다.
각각 455 루프에 특유한 7량체를 갖고, 각각 다중 트랜스제닉 동물에 전신 투여되었을 때 트랜스제닉 동물의 표적 생체내 환경에서 리포터 유전자를 효과적으로 형질도입시키는 서열의 선택적 증폭 및 회수를 가능하게 하는 리포터 유전자를 캡시드화한 재조합 AAV (rAAV)를 생성하였다. 표적 생체내 환경 (예를 들어, 중추 신경계, 폐)에서 양성 풍부화되고, 오프-타겟 생체내 환경 (예를 들어, 간)에서 음성 풍부화된 것으로 밝혀진 7량체가 본원에 제공된다. "풍부화"는 트랜스제닉 동물에게 투여된 바이러스 라이브러리에서의 그의 출현율과 비교하여 생체내 환경의 조직에서의 주어진 7량체의 출현율이다. 0 초과의 풍부화 점수는 양성 풍부화를 나타낸다. 0 미만의 풍부화 점수는 음성 풍부화를 나타낸다. 풍부화 점수 0은 변이체가 조직에 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 목적하는 풍부화 프로파일을 갖는 rAAV의 하위세트를 생체내에서 개별적으로 시험하여 정확한 전신 발현 (예를 들어, 특이성 및 형질도입 효율)을 결정하였다. 증가된 특이성, 및 일부 경우에 형질도입 효율을 포함하는 목적하는 향성을 나타내는 이러한 하위세트로부터의 rAAV는 매우 다양한 목적 (예를 들어, 치료, 진단, 과학적 발견)에 유용한 표적화된 rAAV-매개 트랜스진 전달에 특유하게 적합한 것으로 간주된다.
본원에 기재된 7량체 삽입 또는 치환을 갖는 rAAV 입자는 표적 생체내 환경 (예를 들어, 조직 또는 세포 유형)에서 증가된 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 참조 AAV, 예를 들어 상응하는 모 캡시드 단백질에 비해 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 20-배, 21-배, 22-배, 23-배, 24-배, 25-배, 26-배, 27-배, 28-배, 29-배, 30-배, 31-배, 32-배, 33-배, 34-배, 35-배, 36-배, 37-배, 38-배, 39-배, 40-배, 41-배, 42-배, 43-배, 44-배, 45-배, 46-배, 47-배, 48-배, 49-배, 50-배, 75-배, 또는 100-배 증가, 또는 그 초과의 증가를 포함한다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 30-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 40-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 50-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 60-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 80-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 90-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 100-배이다.
본원에 기재된 7량체 삽입 또는 치환을 갖는 rAAV 입자는 오프-타겟 생체내 환경 (예를 들어, 조직 또는 세포 유형)에서 감소된 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 참조 AAV, 예를 들어 상응하는 모 캡시드 단백질에 비해 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 20-배, 21-배, 22-배, 23-배, 24-배, 25-배, 26-배, 27-배, 28-배, 29-배, 30-배, 31-배, 32-배, 33-배, 34-배, 35-배, 36-배, 37-배, 38-배, 39-배, 40-배, 41-배, 42-배, 43-배, 44-배, 45-배, 46-배, 47-배, 48-배, 49-배, 50-배, 75-배, 또는 100-배, 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 20-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 30-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 40-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 50-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 60-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 80-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 90-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 100-배 감소된다.
본원에 기재된 7량체 삽입 또는 치환을 갖는 rAAV 입자는 참조 AAV, 예를 들어 상응하는 모 캡시드 단백질과 비교하여 표적 생체내 환경 (예를 들어, 조직 또는 세포 유형)에서 증가 또는 감소된 특이성을 갖는다. rAAV가 참조 AAV보다 표적 생체내 환경에 대해 특이성을 더 또는 덜 보유하는지 검출하는 것은 대상체의 표적 생체내 환경으로부터 수득된 조직 샘플에서 rAAV에 의해 캡시드화된 이종 핵산으로부터 발현된 유전자 발현 생성물 (예를 들어, RNA 또는 단백질)의 수준을 측정하는 것; 및 측정된 수준을 대조군 수준 (예를 들어, 참조 AAV (예를 들어, AAV9)에 의해 캡시드화된 이종 핵산으로부터 발현된 유전자 발현 생성물)과 비교하는 것을 포함한다. 유전자 발현 생성물의 발현을 측정하는데 적합한 방법은 루시페라제 리포터 검정 및 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)이다.
증가된 특이성은 표적 생체내 환경에서의 증가된 풍부화와 상관되고, 이는 일부 경우에 본원의 도 2-14에 제공된 풍부화 점수로 나타내어진다. 비제한적 예로서, 참조 AAV9와 비교하여 뇌에서 양성 풍부화되고 (대략 0.950의 풍부화 점수) 간에서 풍부화되지 않는 (~0의 풍부화 점수) 것으로 본원에 제시된 AAV.CAP-B10 (서열식별번호: 3943; DGAATKN)은 또한, 참조 AAV9와 비교하여 뇌에서 리포터 유전자 발현 (예를 들어, 루시페라제 리포터 검정에 의해 측정됨)의 증가를 나타내었고, 간에서는 그렇지 않음을 나타내었다. 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 개시내용의 발명자들은 본원에 개시된 모든 rAAV에 대해 이러한 상관관계가 관찰될 것으로 예상하며, 추가로, 생체내 환경(들)에서 유전자 발현 생성물의 측정된 수준에 의해 나타내어진 바와 같이 보다 유의한 풍부화 점수 (음성 또는 양성)는 생체내 환경(들)에 대한 보다 유의한 특이성과 상관될 것으로 예상한다.
본원에 개시된 바와 같은 형질도입 효율은 (1) 본원에 개시된 변형된 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 이종 핵산을 발현하는 표적 생체내 또는 오프-타겟 생체내 환경에서의 다수의 세포, 및 (2) 단일 세포에서의 이종 핵산의 발현의 양 중 적어도 1종에 의해 측정될 수 있다. 표적 생체내 환경에 대한 특이성은 참조 AAV와 비교하여 표적 생체내 환경에서 rAAV-매개 형질도입의 존재 또는 수준의 증가가 관찰되는 경우에 추론될 수 있다. 오프-타겟 생체내 환경에 대한 특이성의 결여 또는 감소는 참조 AAV와 비교하여 오프-타겟 생체내 환경에서 rAAV-매개된 형질도입의 부재 또는 수준의 감소가 관찰되는 경우에 추론될 수 있다.
천연 AAV 혈청형은 다양한 조직 및 기관에 대해 별개의 향성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 개시내용의 rAAV 입자는 변형된 (예를 들어, 키메라) AAV9 캡시드를 포함한다. AAV9는 AAV 혈청형 1-8과 비교하여 중추 신경계 (CNS), 폐, 심장, 간, 근육, 및 고환에 대해 강한 향성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내로 투여된 AAV 혈청형 1-9의 직접 비교에서, AAV9는 AAV 혈청형 1-8과 비교하여 간, 폐, 근육, 뇌, 고환 및 심장에 대한 바이러스 형질도입에 대해 증가된 특이성을 나타낸다. 또한, AAV9는 AAV 혈청형 1-8과 비교하여 간, 근육, 뇌 및 심장에서 높은 수준의 형질도입 효율을 나타낸다. 그러나, 본원에 개시된 7량체는 AAV9 이외의 AAV 혈청형, 예컨대 AAV2 또는 AAV8로부터의 캡시드 단백질 내로 조작될 수 있다.
간에 특이적인 향성을 갖는 천연 AAV 혈청형, 예컨대 AAV9로부터의 AAV 캡시드 단백질은 선천성 면역 반응을 활성화시키고, 이는 일부 경우에 대상체에서 중증 염증 반응을 유발하며, 이는 다기관 부전으로 이어질 수 있다. 표적 생체내 조직 (예를 들어, 뇌)에 대한 천연 AAV 혈청형의 형질도입 효율을 개선시키고 간에 대한 AAV 캡시드 단백질의 특이성을 감소시킴으로써, 본 개시내용의 rAAV 입자는 AAV-매개 트랜스진 전달의 면역원성 특성을 감소시키고 선천성 면역 반응의 활성화를 방지한다.
rAAV는 키메라 AAV 캡시드를 포함할 수 있다. "키메라" AAV 캡시드는 외인성 아미노산 또는 아미노산 서열 (예를 들어, 7량체 치환)을 갖는 캡시드를 지칭한다. rAAV는 모자이크 AAV 캡시드를 포함할 수 있다. "모자이크" AAV 캡시드는 각각 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 2개 이상의 캡시드 단백질 또는 폴리펩티드로 구성된 캡시드를 지칭한다. rAAV는, 일부 경우에, 제1 혈청형으로부터의 역전된 말단 반복부 (ITR)의 제2 혈청형의 캡시드 내로의 패키징을 지칭하는 캡시드전이의 결과일 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 혈청형은 동일하지 않다. 일부 경우에, 모 AAV 혈청형의 캡시드 유전자는 유사형화되며, 이는 제1 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV2)으로부터의 ITR이 제2 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV9)으로부터의 캡시드에 사용된다는 것을 의미하고, 여기서 제1 및 제2 AAV 혈청형은 동일하지 않다. 비제한적 예로서, AAV2 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 유사형화된 AAV 혈청형은 AAV2/9로 나타내어질 수 있다. rAAV는 추가적으로 또는 대안적으로, 외인성 리간드 결합 모이어티 (예를 들어, 수용체) 또는 변형된 천연 수용체를 발현하도록 조작된 캡시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 7량체 치환은 모 AAV의 리간드-결합 기능을 변경시켜 특정한 세포-표면 항원에 대한 증가된 특이성을 제공할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 참조 AAV는 AAV9이며, 이는 CNS, 폐, 심장, 간, 근육 및 고환에 대해 강한 향성을 갖는 천연 AAV의 최상의 비교를 제공하기 때문이다. 그러나, 참조 AAV는 임의의 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 참조 AAV는 AAV-PHP.B, AAV-PHP.eB, 및 AAV-PHP.S로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 가질 수 있다. 많은 경우에, 참조 AAV는 모 AAV, 예를 들어 그로부터 변이체 AAV가 조작되는 상응하는 비변형된 AAV이다.
본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내에 1개 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 본 개시내용의 조작된 AAV 캡시드 단백질이 생산되는 AAV 캡시드 단백질은 "모" AAV 캡시드 단백질, 또는 "상응하는 비변형된 캡시드 단백질"로 지칭된다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는다. AAV-1의 완전 게놈은 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NC_002077에 제공되고; AAV-2의 완전 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_001401 및 문헌 [Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제공되고; AAV-3의 완전 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_1829에 제공되고; AAV-4의 완전 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 진뱅크 수탁 번호 AF085716에 제공되고; AAV-6의 완전 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_00 1862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 진뱅크 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 제공되고; AAV-9 게놈은 문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌 [Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌 [Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에 제공되고; AAV-12 게놈의 일부는 진뱅크 수탁 번호 DQ813647에 제공되고; AAV-13 게놈의 일부는 진뱅크 수탁 번호 EU285562에 제공된다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV로부터 유래된다. 다른 방식으로 말하자면, 모 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12의 변이체이다. AAV 변이체란, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12에 대해 70% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12에 대해 80%, 85%, 또는 90% 또는 그 초과; 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 초과, 일부 경우에 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 AAV를 의미한다. 변이체는, 예를 들어, AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내에 이종 아미노산 또는 이종 아미노산 서열을 포함하는 AAV를 포함할 수 있다. 이종 아미노산은 상이한 AAV 캡시드 단백질에서 자연 발생일 수 있다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드는 US2019/0055578, US2018/0230489, US2017/0067908, US2019/0048041, US9585971, 또는 US2017/0166926에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV9이다. 일부 경우에, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1을 포함한다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 1의 일부에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 제공된 전체 VP1 영역 (예를 들어, 아미노산 1-736)을 포함한다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3 AAV9 캡시드 단백질에서 발견되는 공통 영역인 서열식별번호: 1의 아미노산 217-736을 포함한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 VP1 및 VP2에서 발견되는 공통 영역인 서열식별번호: 1의 아미노산 64-736을 포함한다. 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 1로부터의 1-736, 10-736, 20-736, 30-736, 40-736, 50-736, 60-736, 70-736, 80-736, 90-736, 100-736, 110-736, 120-736, 130-736, 140-736, 150-736, 160-736, 170-736, 180-736, 190-736, 200-736, 210-736, 220-736, 230-736, 240-736, 250-736, 260-736, 270-736, 280-736, 290-736, 300-736, 310-736, 320-736, 330-736, 340-736, 350-736, 360-736, 370-736, 380-736, 390-736, 400-736, 410-736, 420-736, 430-736, 440-736, 및 450-736으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV5이다. 일부 경우에, AAV5 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2를 포함한다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 2의 일부에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 2의 1-724, 10-724, 20-724, 30-724, 40-724, 50-724, 60-724, 70-724, 80-724, 90-724, 100-724, 110-724, 120-724, 130-724, 140-724, 150-724, 160-724, 170-724, 180-724, 190-724, 200-724, 210-724, 220-724, 230-724, 240-724, 250-724, 260-724, 270-724, 280-724, 290-724, 300-724, 310-724, 320-724, 330-724, 340-724, 350-724, 360-724, 370-724, 380-724, 390-724, 400-724, 410-724, 420-724, 430-724, 440-724, 및 450-724로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV-PHP.B이다. 일부 경우에, AAV-PHP.B 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3을 포함한다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 3의 일부에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 3의 1-743, 10-743, 20-743, 30-743, 40-743, 50-743, 60-743, 70-743, 80-743, 90-743, 100-743, 110-743, 120-743, 130-743, 140-743, 150-743, 160-743, 170-743, 180-743, 190-743, 200-743, 210-743, 220-743, 230-743, 240-743, 250-743, 260-743, 270-743, 280-743, 290-743, 300-743, 310-743, 320-743, 330-743, 340-743, 350-743, 360-743, 370-743, 380-743, 390-743, 400-743, 410-743, 420-743, 430-743, 440-743, 및 450-743으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV.PHP.S이다. 일부 경우에, AAV-PHP.S 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4를 포함한다. 일부 경우에, 모 캡시드 단백질은 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 4의 일부에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 4의 1-743, 10-743, 20-743, 30-743, 40-743, 50-743, 60-743, 70-743, 80-743, 90-743, 100-743, 110-743, 120-743, 130-743, 140-743, 150-743, 160-743, 170-743, 180-743, 190-743, 200-743, 210-743, 220-743, 230-743, 240-743, 250-743, 260-743, 270-743, 280-743, 290-743, 300-743, 310-743, 320-743, 330-743, 340-743, 350-743, 360-743, 370-743, 380-743, 390-743, 400-743, 410-743, 420-743, 430-743, 440-743, 및 450-743으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV-PHP.eB이다. 일부 경우에, AAV-PHP.eB 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5를 포함한다. 일부 경우에, AAV 모 캡시드 단백질은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 5의 일부에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 5의 1-743, 10-743, 20-743, 30-743, 40-743, 50-743, 60-743, 70-743, 80-743, 90-743, 100-743, 110-743, 120-743, 130-743, 140-743, 150-743, 160-743, 170-743, 180-743, 190-743, 200-743, 210-743, 220-743, 230-743, 240-743, 250-743, 260-743, 270-743, 280-743, 290-743, 300-743, 310-743, 320-743, 330-743, 340-743, 350-743, 360-743, 370-743, 380-743, 390-743, 400-743, 410-743, 420-743, 430-743, 440-743, 및 450-743으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 삽입은 AAV9 내의 452-458 (VP1 넘버링)로부터 선택된 어느 1개의 아미노산 위치 또는 그의 변이체 내의 등가의 아미노산 위치 다음에 도입된다. AAV9 (VP1)의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공된다. 일부 경우에, 치환은 AAV9 내의 452-458 (VP1 넘버링)로부터 선택된 어느 1개의 아미노산 위치 또는 그의 변이체 내의 등가의 아미노산 위치에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 452에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 453에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 454에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 455에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 456에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 457에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 위치 458에서의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 1개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환은 2개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환은 3개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환은 4개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환은 5개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환은 6개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 경우에, 치환은 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 2개 이상의 아미노산의 치환 또는 삽입은 인접할 수 있다. 2개 이상의 아미노산의 치환 또는 삽입은 인접하지 않을 수 있다.
서열식별번호: 1 (AAV9), 서열식별번호: 3 (AAV-PHP.B), 서열식별번호: 4 (AAV-PHP.S) 및 서열식별번호: 5 (AAV-PHP.eB) 내의 VP1 넘버링에 따른 위치 452-458의 아미노산은 "NGSGQNQ" (서열식별번호: 545)로 나타내어진다. 일부 경우에, 서열식별번호: 2 (AAV5) 내의 위치 452-458의 아미노산은 "NLAGRYA" (서열식별번호: 45478)로 나타내어진다. 일부 경우에, 치환은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체의 아미노산 위치 N452, G453, S454, G455, Q456, N457, 또는 Q458, 또는 그의 조합에서 이루어진다. 일부 경우에, 치환은 AAV5 캡시드 단백질 또는 그의 변이체의 아미노산 위치 N452, L453, A454, G455, G455, R456, Y457, 또는 A458, 또는 그의 조합에서 이루어진다. 일부 경우에, 치환된 아미노산(들)은 아미노산 452-453에 위치하며, 위치 452 및 453에서 치환된 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2개의 아미노산은 452-453, 453-455, 455-456, 456-457, 및 457-458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환된다. 일부 경우에, 3개의 아미노산은 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 및 456-458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환된다. 일부 경우에, 4개의 아미노산은 452-455, 452-456, 453-457, 454-458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환된다. 일부 경우에, 5개의 아미노산은 452-456, 453-457, 및 454-458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환된다. 일부 경우에, 6개의 아미노산은 아미노산 위치 452-457 또는 453-458에서 치환된다. 일부 경우에, 7개의 아미노산은 아미노산 위치 452-458에서 치환된다.
본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질은 단리 및 정제될 수 있다. AAV는 관련 기술분야의 표준 방법에 의해, 예컨대 칼럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 AAV를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002)]; 미국 특허 번호 6,566,118 및 WO 98/09657에 개시된 방법을 포함할 수 있다.
rAAV 캡시드 단백질은 나노입자, 제2 분자, 또는 바이러스 캡시드 단백질에 접합될 수 있다. 일부 경우에, 나노입자 또는 바이러스 캡시드 단백질은 본원에 기재된 치료 핵산을 캡시드화할 것이다. 일부 경우에, 제2 분자는 치료제, 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 소분자, 항체, 항원-결합 단편, 펩티드, 또는 단백질이다. 일부 경우에, 제2 분자는 검출가능한 모이어티이다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티에 접합된 변형된 AAV 캡시드 단백질은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 생의학 연구 용도에 사용될 수 있고, 검출가능한 모이어티는 변형된 캡시드 단백질을 시각화하는데 사용된다. 검출가능한 모이어티에 접합된 변형된 AAV 캡시드 단백질은 또한 진단 목적에 사용될 수 있다.
중추 신경계를 표적화하는 rAAV 캡시드 단백질
상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 상기 기재된 아미노산 위치에서의 적어도 1개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 특징으로 하는, 목적하는 향성을 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV (rAAV)가 본원에 개시된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 단백질은 대상체에서 표적 생체내 환경에 대한 증가된 특이성을 포함하는 목적하는 향성을 갖는다. 일부 경우에, 표적 생체내 환경은 중추 신경계 (CNS), 또는 말초 신경계 (PNS)를 포함한다. 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질의 향성의 많은 이점 중 하나는 CNS를 표적화하고 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 침투하는 그의 능력이다. 일부 경우에, 목적하는 향성은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질의 향성에 비해 오프-타겟 생체내 환경에 대한 감소된 특이성을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 오프-타겟 생체내 환경은 말초 기관, 예컨대 간을 포함한다. 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질의 또 다른 이점은 간에서 이종 핵산의 발현을 피함으로써 간 독성을 감소시키고 치료 유효성을 위해 필요한 바이러스 투여량을 감소시키는 그의 능력이다.
생체내 환경은 세포일 수 있다. 세포는 중추 신경계 (CNS) 세포 및 말초 신경계 (PNS) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포-유형일 수 있다. CNS 세포의 비제한적 예는 뉴런 및 신경교 세포를 포함한다. 신경교 세포는 핍지교세포, 상의 세포, 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PNS 세포의 비제한적 예는 뉴런 또는 신경교 세포를 포함한다. 신경교 세포는 슈반 세포, 위성 세포, 및 장 신경교 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생체내 환경은 예컨대 기관 또는 기관계로부터의 조직일 수 있다. 기관은 뇌 또는 척수일 수 있다. 조직은 기관, 예컨대 예를 들어 대뇌, 소뇌, 뇌간, 피질, 선조체, 시상, 측뇌실, 피각, 시상하부, 수질, 교뇌, 해마, 편도체, 운동 피질, 또는 그의 조합의 영역일 수 있다.
참조 AAV와 비교하여 대상체의 CNS 또는 PNS에 대한 증가된 특이성 및/또는 증가된 형질도입 효율을 부여하는 아미노산 서열을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 또한 참조 AAV와 비교하여 말초 기관 (예를 들어, 간)에 대한 감소된 특이성 또는 감소된 형질도입 효율을 부여한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, 모 AAV)의 아미노산 서열 내의 452, 453, 454, 455, 456, 457, 및 458로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 1개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모 AAV는 AAV9 또는 그의 변이체이다.
참조 AAV와 비교하여 CNS 또는 PNS에 대해 증가된 특이성 및/또는 증가된 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 제공되며, rAAV 캡시드 단백질은 아미노산 (X1)을 포함하고, 여기서 X1은 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T이다. rAAV 캡시드 단백질은 적어도 2개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이다. rAAV는 적어도 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이다. rAAV는 적어도 4개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이다. rAAV는 적어도 5개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이고; X5는 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T이다. rAAV는 적어도 6개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이고; X5는 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T이고; X6은 A, G, K, N, P, R, S, T, 또는 V이다. rAAV는 적어도 7개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이고; X5는 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T이고; X6은 A, G, K, N, P, R, S, T, 또는 V이고; X7은 A, G, K, L, R, S, T, 또는 V이다.
참조 AAV와 비교하여 CNS 또는 PNS에 대해 증가된 특이성 및/또는 증가된 형질도입 효율을 갖고, 참조 AAV와 비교하여 말초 기관 (예를 들어, 간)에 대해 감소된 특이성 및/또는 감소된 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 제공된다. rAAV는 일부 경우에 아미노산 (X1)을 포함하고, 여기서 X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이다. rAAV 캡시드 단백질은 적어도 2개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이고; X2는 A, I, T, P, N, R, T, G, S, K, H 또는 Q이다. rAAV는 적어도 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이고; X2는 A, I, T, P, N, R, T, G, S, K, H 또는 Q이고; X3은 S, N, D, A, T, H, K, Q이다. rAAV는 적어도 4개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이고; X2는 A, I, T, P, N, R, T, G, S, K, H, 또는 Q이고; X3은 N, D, A, T, H, K, Q이고; X4는 N, G, T, S, D, P, R, T, 또는 Q이다. rAAV는 적어도 5개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이고; X2는 A, I, T, P, N, R, T, G, S, K, H, 또는 Q이고; X3은 N, D, A, T, H, K, Q이고; X4는 N, G, T, S, D, P, R, T, 또는 Q이고; X5는 S, K, P, T, G, D, P, N, 또는 V이다. rAAV는 적어도 6개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이고; X2는 A, I, T, P, N, R, T, G, S, K, H, 또는 Q이고; X3은 N, D, A, T, H, K, Q이고; X4는 N, G, T, S, D, P, R, T, 또는 Q이고; X5는 S, K, P, T, G, D, P, N, 또는 V이고; X6은 T, A, R, S, N, G, D, P, 또는 V이다. rAAV는 적어도 7개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 G, A, V, N, S, H, L, E 또는 Q이고; X2는 A, I, T, P, N, R, T, G, S, K, H, 또는 Q이고; X3은 N, D, A, T, H, K, Q이고; X4는 N, G, T, S, D, P, R, T, 또는 Q이고; X5는 S, K, P, T, G, D, P, N, 또는 V이고; X6은 T, A, R, S, N, G, D, P, 또는 V이고; X7은 G, N, S, L, A, E, K, 또는 Q이다.
일부 경우에, rAAV는 일부 경우에 아미노산 (X1)을 포함하고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이다. rAAV는 적어도 2개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; X2는 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이다. rAAV는 적어도 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; X2는 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X3은 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이다. rAAV는 적어도 4개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; X2는 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X3은 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X4는 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T이다. rAAV는 적어도 5개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; X2는 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X3은 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X4는 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T이고; X5는 A, D, E, G, H, K, N, P, Q, S, 또는 T이다. rAAV는 적어도 6개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; X2는 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X3은 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X4는 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T이고; X5는 A, D, E, G, H, K, N, P, Q, S, 또는 T이고; X6은 A, D, E, G, K, N, P, S, T, 또는 V이다. rAAV는 적어도 7개의 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; X2는 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X3은 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V이고; X4는 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T이고; X5는 A, D, E, G, H, K, N, P, Q, S, 또는 T이고; X6은 A, D, E, G, K, N, P, S, T, 또는 V이고; X7은 A, E, G, H, K, L, N, Q, S, T, 또는 V이다.
일부 경우에, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 인접한다 (X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7). 대안적으로, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 인접하지 않는다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 2개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 3개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 4개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 5개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 6개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 7개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 452이다. 일부 실시양태에서 X2는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 453이다. 일부 실시양태에서 X3은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 454이다. 일부 실시양태에서 X4는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 455이다. 일부 실시양태에서 X5는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 456이다. 일부 실시양태에서 X6은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 457이다. 일부 실시양태에서 X7은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 458이다. 일부 실시양태에서, rAAV의 아미노산 서열은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 452-458에서 아미노산 서열 ILGTGTS (서열식별번호: 45479) 또는 QSSQTPR (서열식별번호: 45479)을 포함하지 않는다.
서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 2개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 3개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 4개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 5개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 6개의 아미노산의 치환을 포함한다.
중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS)에 대해 증가된 특이성 및/또는 증가된 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 예시적인 치환은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체의 아미노산 서열 내의 N452D, N452A, N452G, N452L, N452Q, N452S, N452T, G453I, G453N, G453S, G453P, G453R, G453T, S454A, S454Q, S454D, S454G, S454N, S454T, G455A, G455S, G455D, G455K, G455N, G455P, G455Q, G455T,Q456T, Q456S, Q456A, Q456G, Q456K, Q456N, Q456R, Q456P, N457K, N457A, N457G, N457P, N457R, N457S, N457T, N457V, Q458N, Q458A, Q458G, Q458K, Q458L, Q458R, Q458S, Q458T, 또는 Q458V를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 아미노산 서열 LQTSSPG (서열식별번호: 2933) 중 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 QQGKQSV (서열식별번호: 79)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 SINTKTN (서열식별번호: 45475)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 SNGTKQT (서열식별번호: 442)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 GSGKTAA (서열식별번호: 88)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 MGDKPTR (서열식별번호: 2466)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 DGAATKN (서열식별번호: 3943)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 QPSGGNT (서열식별번호: 2672)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 ERGANTK (서열식별번호: 5192)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 TTGGHSS (서열식별번호: 2743)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 GTTKTSE (서열식별번호: 3064)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 GTGTSVL (서열식별번호: 11958)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 NQSGTKG (서열식별번호: 780)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 DGQSSKS (서열식별번호: 2764)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 KGPGQMG (서열식별번호: 45476)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 GTPSKAG (서열식별번호: 2741)이다.
또한, CNS 및 PNS에 대한 증가된 특이성 및/또는 증가된 형질도입 효율, 및 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간에 대한 특이성의 감소 및/또는 형질도입 효율의 감소를 갖는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 제공된다. 예시적인 치환은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체의 아미노산 서열 내의 N452D, N452G, N452A, N452V, N452S, N452H, N452L, N452E, N452Q, G452A, G452I, G452T, G452P, G452R, G452T, G452S, G452K, G452H, S454A, S454N, S454D, S454G, S454T, S454H, S454K, S454Q, G455A, G455N, G455T, G455S, G455D, G455P, G455R, G455Q, Q456T, Q456S, Q456K, Q456P, Q456G, Q456D, Q456V, Q456A, Q456N, N457K, N457T, N457A, N457R, N457S, N457G, N457D, N457P, N457V, Q458N, Q458G, Q458S, Q458L, Q458A, Q458E, 및 Q458K를 포함한다. 추가의 예시적인 치환은 N452A, N452D, N452E, N452G, N452H, N452M, N452N, N452Q, N452S, N452T, N452V, G453A, G453D, G453E, G453G, G453K, G453N, G453Q, G453S, G453T, G453V, S454A, S454D, S454E, S454G, S454K, S454N, S454Q, S454S, S454T, S454V, G455A, G455D, G455E, G455G, G455K, G455N, G455P, G455Q, G455S, G455T, Q456A, Q456D, Q456E, Q456H, Q456H, Q456K, Q456N, Q456P, Q456Q, Q456S, Q456T, N457A, N457D, N457E, N457G, N457K, N457N, N457P, N457S, N457T, N457V, Q458A, Q458E, Q458G, Q458H, Q458K, Q458L, Q458N, Q458Q, Q458S, Q458T, 및 Q458V를 포함한다. 추가의 예시적인 치환은 N452A, N452D, N452E, N452G, N452H, N452K, N452L, N452M, N452N, N452Q, N452S, N452T, N452V, G453A, G453D, G453G, G453H, G453M, G453N, G453P, G453Q, G453S, G453T, G453V, S454A, S454D, S454E, S454G, S454K, S454N, S454Q, S454S, S454T, S454V, G455A, G455D, G455E, G455G, G455K, G455N, G455P, G455Q, G455S, G455T, Q456A, Q456D, Q456G, Q456K, Q456N, Q456P, Q456Q, Q456S, Q456T, N457A, N457G, N457H, N457L, N457M, N457N, N457P, N457Q, N457S, N457T, N457V, Q458A, Q458D, Q458E, Q458G, Q458H, Q458I, Q458K, Q458L, Q458N, Q458Q, Q458R, Q458S, Q458T, 및 Q458V를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 아미노산 서열 DGAATKN (서열식별번호: 3943) 중 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환이다. 일부 실시양태에서, 치환은 아미노산 서열 DGQSSKS (서열식별번호: 2764) 중 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환이다.
일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV9 또는 그의 변이체의 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 서열식별번호: 1에 제공된 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV5 또는 그의 변이체의 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 서열식별번호: 2에 제공된 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAVV-PHP.B 캡시드 단백질 서열 (서열식별번호: 3) 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV-PHP.S 캡시드 단백질 서열 (서열식별번호: 4) 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV-PHP.eB 캡시드 단백질 서열 (서열식별번호: 5) 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서의 아미노산의 치환, 및 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 아미노산 또는 아미노산 서열의 삽입을 포함한다.
본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 또한 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 아미노산 서열의 삽입을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1LAVPFK (서열식별번호: 45481)를 포함하며, 여기서 X1은 T, S, 또는 N 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1X2AVPFK (서열식별번호: 45482)를 포함하며, 여기서 X2는 L 또는 V 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1X2X3VPFK (서열식별번호: 45483)를 포함하며, 여기서 X3은 A, S, Q, P, 및 T 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1X2X3X4PFK (서열식별번호: 45484)를 포함하며, 여기서 X4는 V, T, Q, N, L, 및 M 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAX4PFK (서열식별번호: 45485)를 포함하며, 여기서 X는 V, T, Q, N, L, 및 M 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 587에서의 아미노산의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 A587D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D 이외의 다른 아미노산으로의 치환이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588에서의 아미노산의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q588G이다. 일부 실시양태에서, 치환은 G 이외의 다른 아미노산으로의 치환이다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드는 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 LQTSSPG (서열식별번호: 2933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질 (예컨대 rAAV 캡시드 단백질)을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 LQTSSPG (서열식별번호: 2933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 LQTSSPG (서열식별번호: 2933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46386에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 QQGKQSV (서열식별번호: 79) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 QQGKQSV (서열식별번호: 79) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 QQGKQSV (서열식별번호: 79) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46387에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 SINTKTN (서열식별번호: 45475) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 SINTKTN (서열식별번호: 45475) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 SINTKTN (서열식별번호: 45475) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46368에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 의해 나타내어진 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 SNGTKQT (서열식별번호: 442) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 5에 의해 나타내어진 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 SNGTKQT (서열식별번호: 442) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46389에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 의해 나타내어진 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GSGKTAA (서열식별번호: 88) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 5에 의해 나타내어진 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GSGKTAA (서열식별번호: 88) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46390에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 의해 나타내어진 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 MGDKPTR (서열식별번호: 2466) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 5에 의해 나타내어진 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 MGDKPTR (서열식별번호: 2466) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46391에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 의해 나타내어진 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 DGAATKN (서열식별번호: 3943) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 5에 의해 나타내어진 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 DGAATKN (서열식별번호: 3943) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46384에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 QPSGGNT (서열식별번호: 2672) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 QPSGGNT (서열식별번호: 2672) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 QPSGGNT (서열식별번호: 2672) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46392에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 ERGANTK (서열식별번호: 5192) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 ERGANTK (서열식별번호: 5192) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 ERGANTK (서열식별번호: 5192) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46393에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 TTGGHSS (서열식별번호: 2743) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 TTGGHSS (서열식별번호: 2743) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 TTGGHSS (서열식별번호: 2743) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46394에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTTKTSE (서열식별번호: 3064) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTTKTSE (서열식별번호: 3064) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTTKTSE (서열식별번호: 3064) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46395에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTGTSVL (서열식별번호: 11958) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTGTSVL (서열식별번호: 11958) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTGTSVL (서열식별번호: 11958) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46396에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NQSGTKG (서열식별번호: 780) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NQSGTKG (서열식별번호: 780) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NQSGTKG (서열식별번호: 780) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 삽입. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46397에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 DGQSSKS (서열식별번호: 2764) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 DGQSSKS (서열식별번호: 2764) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 DGQSSKS (서열식별번호: 2764) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46385에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KGPGQMG (서열식별번호: 45476) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KGPGQMG (서열식별번호: 45476) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KGPGQMG (서열식별번호: 45476) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46398에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTPSKAG (서열식별번호: 2741) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTPSKAG (서열식별번호: 2741) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 GTPSKAG (서열식별번호: 2741) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 삽입. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46399에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
표 1은 2 라운드의 생체내 선택 후 뇌에서의 양성 풍부화 및 간에서의 음성 풍부화에 기초하여 등급화된 상위 수행 rAAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열, 뿐만 아니라 그를 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 표 2는 2 라운드의 생체내 선택 후 뇌 단독에서의 풍부화에 기초하여 등급화된 상위 수행 rAAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열, 및 상응하는 DNA 서열을 제공한다. 예 3은 풍부화 점수가 어떻게 계산되었는지에 대한 세부사항을 제공한다. AAV 변이체는 그 조직에서의 그의 풍부화 점수가 0 이하인 경우에 조직을 탈표적화하는 것으로 결정되었다.
표 1: CNS를 표적화하고 간을 탈표적화하는 rAAV의 7개의 아미노산 표적화 펩티드의 목록
Figure pct00001
Figure pct00002
표 2: CNS를 표적화하는 rAAV의 7개의 아미노산 표적화 펩티드의 목록
Figure pct00003
Figure pct00004
기관 또는 조직을 표적화하는 변형된 AAV 캡시드 단백질
모 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, AAV5 또는 AAV9) 내의 상기 기재된 아미노산 위치에서의 적어도 1개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 특징으로 하는, 목적하는 향성을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질은 대상체, 예컨대 기관 또는 기관계에서 표적 생체내 환경에 대한 증가된 특이성을 포함하는 목적하는 향성을 갖도록 조작된다. 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질의 향성의 많은 이점 중 하나는 오프-타겟 기관에서의 이종 핵산의 발현을 피하면서 기관 또는 기관계에서 이종 핵산을 선택적으로 및 효율적으로 발현함으로써, 독성을 감소시키고 치료 유효성을 위해 필요한 바이러스 투여량을 감소시키는 그의 능력이다.
생체내 환경은 조직 또는 세포일 수 있다. 생체내 환경은 예컨대 기관 또는 기관계로부터의 조직일 수 있다. 기관 또는 기관계의 비제한적 예는 간, 장, 심장, 폐, 생식 기관, 근육, 지방, 췌장, 뇌, 및 비장을 포함한다. 생식 기관의 비제한적 예는 난소 및 고환을 포함한다. 생체내 환경은 세포일 수 있다. 세포는 중추 신경계 (CNS) 세포, 말초 신경계 (PNS) 세포, 간 세포, 장 세포, 폐 세포, 심장 세포, 지방 세포, 근육 세포, 신장 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 비장 세포, 생식 기관 세포, 및 위 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형일 수 있다. CNS 세포는 뉴런 또는 신경교 세포일 수 있다. 신경교 세포는 핍지교세포, 상의 세포, 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PNS 세포는 뉴런 또는 신경교 세포일 수 있다. 신경교 세포는 슈반 세포, 위성 세포, 및 장 신경교 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 간 세포는 간세포일 수 있다. 장 세포는 장세포, 배상 세포, 장내분비 세포, 컵 세포, 터프트 세포, 및 파네트 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 폐 세포는 폐포 유형 I 상피 세포, 폐포 유형 II 상피 세포, 폐포 유형 I 폐포세포, 폐포 유형 II 폐포세포, 모세관 내피 세포 및 폐포 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 심장 세포는 심근세포일 수 있다. 위 세포는 점액 세포, 벽세포, 주세포, 및 G 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 근육 세포는 근세포일 수 있다.
대상체 내의 특정 기관 또는 조직을 표적화하기 위해 최적화된 본 개시내용의 rAAV는 서열식별번호: 25469-35471에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 심장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 25469-26205에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폐를 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 32537-34198에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 간을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 30720-30923에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 26206-26873에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 위를 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 31873-32060에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 31468-31872에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 신장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 26874-30719에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지방조직 (지방)을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 34199-35471에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 근육을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 30924-31451에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 근육은 심장 근육일 수 있다. 근육은 골격근일 수 있다. 일부 실시양태에서, 췌장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 31452-31467에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 생식 기관, 예컨대 고환을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 32061-32536에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 생식 기관은 난소이다.
모 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서의 적어도 1개의 아미노산의 치환을 특징으로 하는 목적하는 향성을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질 또는 그의 변이체가 본원에 개시된다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 1개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, X1은 K, R, N, 또는 T이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 3개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 4개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; X4는 T, S, P, 또는 L이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 5개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; X4는 T, S, P, 또는 L이고; X5는 P, R, 또는 S이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 6개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; X4는 T, S, P, 또는 L이고; X5는 P, R, 또는 S이고; X6은 G, S, N, 또는 T이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질 내에 적어도 7개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있고, 여기서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; IX4는 T, S, P, 또는 L이고; X5는 P, R, 또는 S이고; X6은 G, S, N, 또는 T이고; X7은 R, L 또는 I이다.
일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 인접한다 (X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7). 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 2개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 3개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 4개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 5개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 6개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 7개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 인접하지 않는다. 일부 실시양태에서, X1은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 452이다. 일부 실시양태에서 X2는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 453이다. 일부 실시양태에서 X3은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 454이다. 일부 실시양태에서 X4는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 455이다. 일부 실시양태에서 X5는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 456이다. 일부 실시양태에서 X6은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 457이다. 일부 실시양태에서 X7은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 458이다.
서열식별번호: 25469-35471 중 어느 하나에 제공된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 25469-26205로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 26206-26873로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 26874-30719로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 30720-30923로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 30924-31451로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 31452-31467로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 31468-31872로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 31873-32060로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 32061-32536로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 32537-34198로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이 서열식별번호: 34199-35471로부터 선택된 아미노산 서열에 제공된다. 일부 실시양태에서, 치환은 N452K, N452R, N452T, G453D, G453L, G453E, G453V, G453N, G453S, G453L, G453P, S454L, S454P, S454A, S454D, S454G, S454T, G455T, G455S, G455P, G455L, Q456P, Q456R, Q456S, N457G, N457S, N457T, Q458R, Q458L 또는 Q458I, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에 제공된 아미노산 서열의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 KDNTPGR (서열식별번호: 32538)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 NNLPRNL (서열식별번호: 32867)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 RESSPSL (서열식별번호: 29065)이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 RVPLSTI (서열식별번호: 26933)이다.
일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV9 또는 그의 변이체의 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 서열식별번호: 1에 제공된 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV5 또는 그의 변이체의 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 서열식별번호: 2에 제공된 캡시드 아미노산 서열 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAVV-PHP.B 캡시드 단백질 서열 (서열식별번호: 3) 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV-PHP.S 캡시드 단백질 서열 (서열식별번호: 4) 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산의 치환은 AAV-PHP.eB 캡시드 단백질 서열 (서열식별번호: 5) 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 452-458로부터 선택된 아미노산 위치에서의 아미노산의 치환, 및 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 아미노산 또는 아미노산 서열의 삽입을 포함한다.
본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 또한 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588에서 아미노산 서열의 삽입을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 AAV5 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1LAVPFK (서열식별번호: 45481)를 포함하며, 여기서 X1은 T, S, 또는 N 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1X2AVPFK (서열식별번호: 45482)를 포함하며, 여기서 X2는 L 또는 V 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1X2X3VPFK (서열식별번호: 45483)를 포함하며, 여기서 X3은 A, S, Q, P, 및 T 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 X1X2X3X4PFK (서열식별번호: 45484)를 포함하며, 여기서 X4는 V, T, Q, N, L, 및 M 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 삽입은 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서의 TLAX4PFK (서열식별번호: 45485)를 포함하며, 여기서 X는 V, T, Q, N, L, 및 M 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 587에서 아미노산의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 A587D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D 이외의 다른 아미노산으로의 치환이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 모 AAV9 또는 AAV5 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588에서의 아미노산의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q588G이다. 일부 실시양태에서, 치환은 G 이외의 다른 아미노산으로의 치환이다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 캡시드 단백질 (서열식별번호: 2) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46400에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NNLPRNL (서열식별번호: 32867) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NNLPRNL (서열식별번호: 32867) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NNLPRNL (서열식별번호: 32867) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 캡시드 단백질 (서열식별번호: 2) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NNLPRNL (서열식별번호: 32867) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 NNLPRNL (서열식별번호: 32867) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46401에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 29065) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 29065) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 29065) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 캡시드 단백질 (서열식별번호: 2) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 29065) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 29065) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46402에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RVPLSTI (서열식별번호: 26933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 3) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RVPLSTI (서열식별번호: 26933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 변이체 캡시드 단백질 (서열식별번호: 5) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RVPLSTI (서열식별번호: 26933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 캡시드 단백질 (서열식별번호: 2) 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RVPLSTI (서열식별번호: 26933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV5 변이체 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RVPLSTI (서열식별번호: 26933) 중 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 588-589에서 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46403에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
이종 핵산
본원에 개시된 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상의 치료 또는 예방에 유용한 치료 핵산을 포함하는 이종 핵산이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 치료 핵산은 치료 유전자 발현 생성물을 코딩한다. 유전자 발현 생성물의 비제한적 예는 질환 또는 장애, 또는 질환 또는 장애의 증상의 치료, 예방, 및/또는 호전에 사용하기 위한 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 효소, 항체, 항원 결합 단편, 핵산 (RNA, DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), 및 유전자 편집 성분을 포함한다. 일부 경우에, 치료 핵산은 본원에 개시된 것과 같은 rAAV에 의해 유기체, 대상체의 세포, 조직 또는 기관 내에 배치된다.
각각 바이러스 게놈 (예를 들어, 단일 가닥 DNA 분자 (ssDNA))을 포함하는 rAAV가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 이종 핵산 또는 트랜스진에 플랭킹된, 각각 약 145개의 염기인 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 치료 핵산, 및 일부 경우에, 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내에 치료 핵산과 시스로 프로모터를 포함한다. 프로모터는 표적 세포의 핵에서 치료 핵산의 전사를 개시할 수 있다. ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형으로부터의 것일 수 있다. AAV 혈청형의 비제한적 예는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12를 포함한다. 일부 경우에, ITR은 AAV2로부터의 것이다. 일부 경우에, ITR은 AAV9로부터의 것이다.
임의의 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 트랜스진이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 트랜스진은 약 100개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 100개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 200개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 300개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 400개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 500개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 1000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 5000개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 10,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 20,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 30,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 40,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 50,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 약 500 내지 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 약 5000 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 경우에, 트랜스진은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 하이브리드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 단일 가닥일 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 이중 가닥일 수 있다.
표적 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 조정하는데 유용한 트랜스진이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 트랜스진은 본원에 기재된 rAAV 입자의 rAAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된다. 일부 경우에, rAAV 입자는 대상체에서 본원에 개시된 질환 또는 상태를 치료하기 위해 대상체에게 전달된다. 일부 경우에, 전달은 전신 (예를 들어, 정맥내, 비강내) 전달이다.
본원에 개시된 트랜스진은 내인성 유전자를 건강한 또는 정상적인 개체의 것과 유사한 수준으로 발현시키는데 유용하다. 이는 유전자 발현 생성물의 과소발현 또는 발현의 결여와 관련된 질환 또는 상태의 치료에 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 트랜스진은 내인성 유전자의 발현 수준이 건강한 또는 정상 개체의 발현 수준을 초과하도록 내인성 유전자를 과다발현시키는데 유용하다. 추가적으로, 트랜스진은 외인성 유전자 (예를 들어, 활성제, 예컨대 항체, 펩티드, 핵산, 또는 유전자 편집 성분)를 발현시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자 발현 생성물은 세포에서 1종 이상의 내인성 생물학적 과정의 활성을 변경, 증진, 증가, 또는 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 트랜스진은 내인성 유전자, 예컨대 예를 들어 우성 음성 유전자의 발현을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자 발현 생성물은 세포에서 1종 이상의 내인성 생물학적 과정의 활성을 변경, 억제, 감소, 예방, 제거, 또는 손상시킬 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 발현의 증가는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 증가를 지칭한다. 한 측면에서, 표적화된 유전자의 단백질 생성물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 증가될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 발현의 감소는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 증가를 지칭한다. 한 측면에서, 표적화된 유전자의 단백질 생성물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 감소될 수 있다.
내인성 서열 (내인성 또는 트랜스진의 일부)이 트랜스진과 함께 발현되는 경우에, 내인성 서열은 전장 서열 (야생형 또는 돌연변이체) 또는 부분 서열일 수 있다. 내인성 서열은 기능성일 수 있다. 이들 전장 또는 부분 서열의 기능의 비제한적 예는 트랜스진 (예를 들어, 치료 유전자)에 의해 발현된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것 및/또는 담체로서 작용하는 것을 포함한다.
트랜스진은 내인성 유전자의 전부가 발현되도록, 일부가 발현되도록, 또는 어느 것도 발현되지 않도록 내인성 유전자 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 트랜스진은, 예를 들어 트랜스진과의 융합물로서 내인성 서열의 일부 (트랜스진에 대해 N-말단 및/또는 C-말단)가 발현되도록 또는 어느 것도 발현되지 않도록 내인성 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 다른 경우에, (예를 들어, 예컨대 내인성 유전자에 대한 추가의 코딩 서열의 존재 또는 부재 하의) 트랜스진은 임의의 내인성 유전자좌, 예를 들어 세이프-하버 유전자좌 내로 통합된다. 예를 들어, 프라탁신 (FXN) 트랜스진은 내인성 FXN 유전자 내로 삽입될 수 있다. 트랜스진은 임의의 유전자, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 유전자 내로 삽입될 수 있다.
본 개시내용의 적어도 1개의 이점은 실질적으로 임의의 치료 핵산이 임의의 치료 유전자 발현 생성물을 발현하는데 사용될 수 있다는 것이다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 생성물은 치료 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체, 항원-결합 단편, 펩티드, 또는 단백질)이다. 한 실시양태에서 치료 핵산에 의해 코딩된 단백질은 50-5000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-2000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-1000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-1500개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-800개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-600개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-400개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-200개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 단백질은 50-100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서 코딩된 펩티드는 4-50개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩된 단백질은 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 또는 데카펩티드이다. 일부 실시양태에서, 코딩된 단백질은 2-30개 아미노산, 예컨대 5-30, 10-30, 2-25, 5-25, 10-25, 또는 10-20개 아미노산의 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코딩된 단백질은 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 또는 30개 아미노산의 펩티드, 또는 50개 이하의 아미노산, 예를 들어 35, 30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 이하의 아미노산인 펩티드를 포함한다.
치료 단백질 또는 펩티드의 비제한적 예는 아드레날린성 효능제, 항아폽토시스 인자, 아폽토시스 억제제, 시토카인 수용체, 시토카인, 세포독소, 적혈구생성제, 글루탐산 데카르복실라제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 키나제, 키나제 억제제, 신경 성장 인자, 네트린, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 신경원성 인자, 신경원성 인자 수용체, 뉴로필린, 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 뉴로트로핀 수용체, N-메틸-D-아스파르테이트 길항제, 플렉신, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 단백질분해 단백질, 단백질분해 단백질 억제제, 세마포린, 세마포린 수용체, 세로토닌 수송 단백질, 세로토닌 흡수 억제제, 세로토닌 수용체, 세르핀, 세르핀 수용체, 및 종양 억제자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질 또는 펩티드는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 대식세포 콜로니-자극 인자 (CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 고나도트로핀, 인터페론-감마 (IFN), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IFG-1), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 색소 상피-유래 인자 (PEDF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-B), 종양 괴사 인자 (TNF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 프로락틴, 소마토트로핀, 아폽토시스 단백질의 X-연관 억제제 1 (XIAP1), 인터류킨 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10, 바이러스 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료 유전자 발현 생성물은 유전자 편집 성분을 포함할 수 있다. 유전자 편집 성분의 비제한적 예는 CRISPR/Cas, 인공 부위-특이적 RNA 엔도뉴클레아제 (ASRE), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 및 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)에 필요한 것을 포함한다. 비제한적 예에서, 헌팅톤병을 갖는 대상체를 확인한다. 이어서, 헌팅틴 (HTT) 유전자의 전사를 억제하도록 조작된 ZFN을 코딩하는 바이러스 벡터를 캡시드화한 rAAV의 제1의 양을 대상체에게 전신 투여한다. 일부 경우에, 투여 경로는 정맥내이다. rAAV는 오프-타겟 기관, 예컨대 간을 재표적화하는 한편, 신경계로의 ZFN의 적절한 표적화를 가능하게 하기 위해, 표 1-2 또는 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함할 것이다. 필요한 경우에, ZFN의 치료 유효량이 대상체의 신경계에서 발현될 때까지, 제2 또는 제3 용량의 rAAV가 대상체에게 투여된다. 또 다른 비제한적 예에서, 낭성 섬유증을 갖는 대상체를 확인한다. 이어서, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR) 유전자의 전사를 억제하도록 조작된 ZFN을 코딩하는 트랜스진을 캡시드화한 rAAV의 제1의 양을 대상체에게 전신 투여한다. 일부 경우에 투여 경로는 비강내 (예를 들어, 비강내 분무)이다. rAAV는 폐로의 ZFN의 적절한 표적화를 가능하게 하기 위해, 서열식별번호: 32537-34198 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함할 것이다. 필요한 경우에, ZFN의 치료 유효량이 대상체의 폐에서 발현될 때까지, 제2 또는 제3 용량의 rAAV가 대상체에게 투여된다.
치료 핵산은 비-단백질 코딩 유전자, 예를 들어 안티센스 RNA, RNAi, shRNA 및 마이크로 RNA (miRNA), miRNA 스폰지 또는 디코이를 코딩하는 서열을 포함할 수 있고, 조건부 유전자 결실, 조건부 (레콤비나제-의존성) 발현을 위한 레콤비나제 전달은 본원에 기재된 유전자 편집 성분에 필요한 것을 포함한다. 비-단백질 코딩 유전자는 또한 tRNA, rRNA, tmRNA, piRNA, 이중 가닥 RNA, snRNA, snoRNA, 및/또는 긴 비-코딩 RNA (IncRNA)를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 비-단백질 코딩 유전자는 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 조정할 수 있다. 비-단백질 코딩 유전자, 예를 들어 본원에 기재된 RNA는 표적 세포, 예를 들어 중추 신경계 (CNS) 또는 말초 기관 (예를 들어, 폐)의 세포에서 유전자 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 유전자 발현의 억제는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%의 억제를 지칭한다. 일부 경우에, 표적화된 유전자의 단백질 생성물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 억제될 수 있다. 유전자는 야생형 유전자 또는 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 유전자일 수 있다. 표적화된 단백질은 야생형 단백질 또는 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 단백질일 수 있다.
치료 핵산은 뇌의 질환 또는 장애에 연루된 유전자 또는 유전자로부터 발현된 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 조정할 수 있다. 예를 들어, 치료 핵산은 일부 경우에 본원에 기재된 유전자 또는 유전자의 변형된 버전이다. 또 다른 예에서, 치료 핵산은 이펙터 유전자 발현 생성물, 예컨대 그 안의 유전자를 표적화하는데 특이적인 유전자 편집 성분을 포함한다. 유전자의 비제한적 예는 사르코글리칸 알파 (SGCA), 글루탐산 데카르복실라제 65 (GAD65), 글루탐산 데카르복실라제 67 (GAD67), CLN2 유전자, 신경 성장 인자 (NGF), 신경교 세포 유도된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린, 생존 운동 뉴런 1, 텔로미어 (SMN1), β-글루코세레브로시다제 (GCase), 프라탁신 (FXN), 헌팅틴 (HTN), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2), 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX), 프로그래뉼린 (GRN), 항튜불린제, 구리-아연 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 글루코실세라미다제 베타 (GBA), NPC 세포내 콜레스테롤 수송체 1 (NPC1), 및 NPS3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX)는 PEX1, PEX2, PEX3, PEX4, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11β, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, 및 PEX26으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 생성물은 억제된다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 생성물은 증진된다.
치료 핵산은 특정한 기관 (예를 들어, 폐, 심장, 간, 근육, 눈)의 질환 또는 장애에 연루된 유전자 또는 유전자로부터 발현된 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 조정한다. 유전자의 비제한적 예는 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR), 인자 X (FIX), RPE65, 레티노이드 이소머로히드롤라제 (RPE65), 사르코글리칸 알파 (SGCA), 및 근형질/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자 발현 생성물은 인간, 뮤린, 조류, 돼지, 소, 양, 고양이, 개, 말, 에핀, 염소, 루핀 또는 영장류 기원의 것이다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 생성물은 억제된다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 생성물은 증진된다.
바이러스 패키징을 통해 rAAV로 어셈블리되는 유전자 정보 (예를 들어, 이종 핵산)를 포함하는 변형된 바이러스 게놈이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 바이러스 게놈은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 것이다. 일부 경우에, 바이러스 게놈은 AAV-PHP.B, AAV-PHP.eB, 및 AAV-PHP.S로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 AAV 혈청형으로부터의 것이다.
바이러스 게놈, 예컨대 본원에 기재된 것은 일부 경우에 이종 유전자 발현 생성물 (예를 들어, 치료 유전자 발현 생성물, 재조합 캡시드 단백질 등)을 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 트랜스진은 트랜스진에 플랭킹된 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR)와 시스로 존재한다. 트랜스진은 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 치료 핵산을 포함할 수 있다. rAAV의 제한된 패키징 용량 (~2.5kB)으로 인해, 일부 경우에, 더 긴 트랜스진은, 제1은 3' 스플라이스 공여자를 갖고 제2는 5' 스플라이스 수용자를 갖는 2개의 AAV 벡터 사이에 분할될 수 있다. 세포가 동시 감염되면, 콘카테머가 형성되고, 이는 함께 스플라이싱되어 전장 트랜스진을 발현한다.
일부 경우에, 바이러스 게놈은 트랜스진을 포함하는 단일 가닥 바이러스 DNA이다. AAV 벡터는 에피솜일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 게놈은 콘카테머이다. 에피솜 바이러스 게놈은 표적 세포의 게놈 내로 통합되지 않는, 표적 세포에서의 염색질-유사 조직화를 발생시킬 수 있다. 비-분열 세포 내로 감염되는 경우에, 표적 세포에서의 에피솜 바이러스 게놈의 안정성은 장기간 트랜스진 발현을 가능하게 한다. 대안적으로, AAV 벡터는 트랜스진을 표적 세포의 게놈 내로 특정 부위 (예를 들어, 인간 염색체 19 상의 AAVS1)에서 우세하게 통합시킨다.
트랜스진은 일반적으로 그의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 트랜스진이 삽입된 내인성 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 의해 구동되도록 삽입된다. 일부 경우에, 트랜스진은 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직/세포 특이적 프로모터를 포함한다. 비제한적 예로서, 프로모터는 CMV 프로모터, CMV-β-액틴-인트론-β-글로빈 하이브리드 프로모터 (CAG), CBA 프로모터, FRDA 또는 FXN 프로모터, UBC 프로모터, GUSB 프로모터, NSE 프로모터, 시냅신 프로모터, MeCP2 프로모터, GFAP 프로모터, H1 프로모터, U6 프로모터, NFL 프로모터, NFH 프로모터, SCN8A 프로모터, 또는 PGK 프로모터일 수 있다. 비제한적 예로서, 프로모터는 인간 신장 인자 1α-서브유닛 (EF1α), 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV), 닭 β-액틴 (CBA) 및 그의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제 (GUSB), 및 유비퀴틴 C (UBC)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 조직-특이적 발현 요소일 수 있다. 트랜스진은 뉴런에 대한 조직-특이적 발현 요소, 예컨대 비제한적으로 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 혈소판-유래 성장 인자 B-쇄 (PDGF-β), 시냅신 (Syn), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKII), 대사성 글루타메이트 수용체 2 (mGluR2), NFL, NFH, np32, PPE, Enk 및 EAAT2 프로모터를 포함할 수 있다. 트랜스진은 성상세포에 대한 조직-특이적 발현 요소, 예컨대 비제한적으로 신경교 원섬유성 산성 단백질 (GFAP) 및 EAAT2 프로모터를 포함할 수 있다. 트랜스진은 핍지교세포에 대한 조직-특이적 발현 요소, 예컨대 비제한적으로 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 프로모터를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 코딩된 치료 핵산의 제1 엑손의 대략 ~5 kb 상류에 위치하는 영역을 포함하고, 보다 구체적으로, FRDA 프로모터에 의한 발현이 가능하도록 하기 위해 코딩된 프라탁신 유전자의 제1 엑손의 대략 4.9 kb 상류에 위치하는 17 bp 영역이 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Puspasari et al., Long Range Regulation of Human FXN Gene Expression, PLOS ONE, 2011] 참조; 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 프로모터는 1 kb 미만이다. 프로모터는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과의 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300-800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 또는 700-800의 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 표적화된 조직, 예컨대 비제한적으로 중추 신경계 및 말초 기관 (예를 들어, 폐)에서 소정 기간 동안 치료 유전자 발현 생성물의 발현을 제공할 수 있다. 치료 유전자 발현 생성물의 발현은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 3주, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년, 55년, 60년, 65년, 또는 65년 초과의 기간 동안 이루어질 수 있다. 페이로드의 발현은 1-5시간, 1-12시간, 1-2일, 1-5일, 1-2주, 1-3주, 1-4주, 1-2개월, 1-4개월, 1-6개월, 2-6개월, 3-6개월, 3-9개월, 4-8개월, 6-12개월, 1-2년, 1-5년, 2-5년, 3-6년, 3-8년, 4-8년 또는 5-10년 또는 10-15년, 또는 15-20년, 또는 20-25년, 또는 25-30년, 또는 30-35년, 또는 35-40년, 또는 40-45년, 또는 45-50년, 또는 50-55년, 또는 55-60년, 또는 60-65년 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시양태의 이종 핵산 및 트랜스진은 또한 플라스미드 벡터를 포함할 수 있다. 플라스미드 벡터는 본원에 기재된 재조합 AAV (rAAV) 입자의 생성에 유용하다. AAV 벡터는 헬퍼 바이러스의 게놈을 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스 단백질은 재조합 rAAV의 어셈블리, 및 이종 핵산을 함유하는 트랜스진의 rAAV 내로의 패키징에 필요하다. 헬퍼 바이러스 유전자는 세포에서 발현되는 경우에 AAV 복제를 보조하는 아데노바이러스 유전자 E4, E2a 및 VA이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 E2를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 E4를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 VA를 포함한다. 일부 경우에, AAV 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질 중 하나, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
플라스미드 벡터는 본원에 기재된 재조합 AAV (rAAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 바이러스 게놈은 Rep 단백질을 코딩하는 복제 (Rep) 유전자, 및 제1 오픈 리딩 프레임 (ORF1) 내의 Aap 단백질 또는 제2 오픈 리딩 프레임 (ORF2) 내의 Cap 단백질을 코딩하는 캡시드 (Cap) 유전자를 포함할 수 있다. Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 Cap 유전자는 변형된다. 야생형 Cap 유전자는 3개의 단백질, VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다. 일부 경우에, VP1은 변형된다. 일부 경우에, VP2는 변형된다. 일부 경우에, VP3은 변형된다. 일부 경우에, 모든 3개의 VP1-VP3은 변형된다. AAV 벡터는 야생형 Rep78, Rep68, Rep52, Rep40 및 Aap 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 플라스미드 벡터는 박테리아의 것이다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유래된다. 일부 경우에, 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 (1) 5' 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, (2) 복제 (Rep) 유전자, (3) 캡시드 (Cap) 유전자, 및 (4) 3' ITR을 포함하며, 여기서 Cap 유전자는 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 코딩한다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터는 유사형화 AAV 캡시드 단백질을 코딩한다. 일부 경우에, Cap 유전자는 서열식별번호: 6-10 중 어느 하나에 제공된 데옥시리보스 핵산 (DNA)으로부터 유래된다.
일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV2 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV5 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV9 혈청형으로부터 유래된다.
본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호: 12740-25468 및 35472-45474 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드 벡터가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터는 서열식별번호: 46404-46423에 제공된 DNA 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Cap 유전자를 포함한다. 본 개시내용의 플라스미드 벡터는 서열식별번호: 6-10 중 어느 하나를 포함하는 VP1 Cap 유전자를 포함할 수 있다. AAV 벡터는 서열식별번호: 6-10 중 어느 하나의 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 포함할 수 있다.
또한, 본 개시내용의 변이체 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV 캡시드 단백질)을 포함하는 rAAV 캡시드를 코딩하는 핵산이 개시된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 단백질은 아미노산 위치 452-458에서 치환된 7량체를 갖는 전장 VP1 단백질을 코딩하는, 서열식별번호: 46404-46423 중 어느 하나에 제공된 DNA 서열을 포함한다. 일부 경우에, 7량체는 서열식별번호: 46364-46383 중 어느 하나에 제공된 DNA 서열에 의해 코딩된다.
(a) 도 2-14 중 어느 하나에 제공된 7량체 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및 (b) 서열식별번호: 6-10 중 어느 하나의 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 핵산 서열을 포함하는 본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터가 본원에 제공된다. 일부 경우에, AAV9 (서열식별번호: 6)는 서열식별번호: 12740-25468 및 35472-45474 중 어느 하나를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에, AAV-PHP.eB (서열식별번호: 10)는 서열식별번호: 12740-25468 및 35472-45474 중 어느 하나를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에, AAV5 (서열식별번호: 7)는 서열식별번호: 35472-45474 중 어느 하나를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에, AAV-PHP.B (서열식별번호: 8)는 서열식별번호: 12740-25468 및 35472-45474 중 어느 하나를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에, AAV-PHP.S VP1 (서열식별번호: 9)은 서열식별번호: 12740-25468 및 35472-45474 중 어느 하나를 포함하도록 변형된다. 본원에 기재된 AAV 벡터는 본원에 기재된 방법에 의해 변이체 AAV 캡시드를 생산하는데 사용될 수 있다.
방법
rAAV의 생산 방법
재조합 AAV (rAAV)를 생산하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에 표적 세포 (예를 들어, HEK293 세포)에서의 AAV 생산에 필요한 모든 요소는 관련 기술분야에 공지된 적합한 방법을 사용하여 표적 세포 내로 일시적으로 형질감염된다. 예를 들어, 본 개시내용의 rAAV는 3개의 플라스미드 벡터, 트랜스진 (예를 들어, 치료 핵산)을 운반하는 ITR-함유 플라스미드를 갖는 제1 벡터, AAV Rep 및 Cap 유전자를 운반하는 제2 벡터; 및 (3) 아데노바이러스로부터 단리된 헬퍼 유전자를 제공하는 제3 벡터를 공동-형질감염시킨 것에 의한 생성물일 수 있다. 본원에 기재된 방법은 아데노바이러스가 없는 고-역가 AAV 벡터를 생성한다. 본원에 개시된 Cap 유전자는 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호: 12740-25468 및 35472-45474 중 어느 하나를 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 rAAV는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Challis, R. C. et al., Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat. Protoc. 14, 379 (2019)]에 기재된 방법을 사용하여 생성된다. 간략하게, 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여 HEK293T 세포 (ATCC)의 삼중 형질감염을 수행하고, 120시간 후에 세포 용해물 및 배지 둘 다로부터 바이러스를 수집하고, 아이오딕사놀 상에서 정제한다.
(a) (i) 5' 및 3' 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 둘러싸인 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 제1 핵산 서열; (ii) 5' ITR 서열, 복제 (Rep) 유전자, 캡시드 (Cap) 유전자, 및 3' ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 코딩하며, 여기서 Cap 유전자는 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 것인 제2 핵산 서열; 및 (iii) E4orf6, E2a, 및 VA RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 헬퍼 바이러스 단백질, 및 임의로, E1a 또는 E1b55k를 포함하는 제2 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하고; (b) 세포에서 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 발현시키고; (c) 본원에 개시된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 어셈블리시키고; (d) AAV 입자 내에 제1 핵산 서열을 패키징하는 것을 포함하는 제조 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, AAV 입자는 참조 AAV 캡시드에 비해 대상체의 표적 조직 (예를 들어, CNS, PNS, 폐)에서 측정 시 증가된 특이성 및 오프-타겟 조직 (예를 들어, 간)에서 측정 시 감소된 특이성을 갖는 rAAV 캡시드이다. 일부 경우에, 방법은 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 제1 핵산 서열을, 그것이 rAAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화되도록 패킹하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 적합한 바이러스 정제 방법, 예컨대 본원에 기재된 방법을 사용하여 단리, 농축, 및 정제된다.
비제한적 예에서, rAAV는 표준 형질감염 프로토콜 (예를 들어, PEI에 의함)을 사용한 전구체 세포 (예를 들어, HEK293T) 세포의 삼중 형질감염에 의해 생성된다. 바이러스 입자는 소정의 기간 (예를 들어, 형질감염 후 72시간) 후에 배지로부터 및 후기 시점 (예를 들어, 형질감염 후 120시간)에 세포 및 배지로부터 수거된다. 배지에 존재하는 바이러스는 8% 폴리(에틸렌 글리콜) 및 500 mM 염화나트륨에 의한 침전에 의해 농축되고, 침전된 바이러스는 수집된 세포로부터 제조된 용해물에 첨가된다. 바이러스를 아이오딕사놀 (옵티프렙, 시그마) 단계 구배 (15%, 25%, 40% 및 60%)를 통해 정제한다. 바이러스를 농축시키고, PBS 중에 제제화한다. 바이러스 역가는 qPCR 및 대조군으로서 선형화된 게놈 플라스미드를 사용하여 DNaseI-저항성 벡터 게놈 카피 (VG)의 수를 측정함으로써 결정된다.
Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. AAV 헬퍼 바이러스의 게놈은 E2, E4, 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 헬퍼 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 트랜스로 존재한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 시스로 존재한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열은 트랜스로 존재한다.
세포는 인간, 영장류, 뮤린, 고양이, 개, 돼지, 양, 소, 말, 에핀, 염소 및 루핀 숙주 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 전구 또는 전구체 세포, 예컨대 줄기 세포이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 중간엽 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 섬유모세포 또는 다른 조직 특이적 줄기 세포이다. 세포는 불멸화될 수 있다. 일부 경우에, 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배아 신장 293 (HEK-293) 세포이다. 일부 경우에, 세포는 분화 세포이다. 제공된 개시내용에 기초하여, 이러한 시스템을 관심 표적 세포 유형에서 레콤비나제를 발현하는 임의의 트랜스제닉 세포주와 함께 사용하여 그러한 표적 세포 집단을 보다 효율적으로 형질도입시키는 AAV 캡시드를 개발할 수 있는 것으로 예상된다.
이종 핵산의 rAAV-매개 전달 방법
이종 핵산 (예를 들어, 본원에 개시된 치료 핵산 또는 트랜스진)의 전달을 필요로 하는 대상체에게 이종 핵산 (예를 들어, 본원에 개시된 치료 핵산 또는 트랜스진)을 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 트랜스진은 재조합 AAV (rAAV) 캡시드 단백질 또는 rAAV 입자 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 캡시드화될 수 있다.
방법은 생체외, 예를 들어 과학 연구 목적 또는 입양 세포 요법을 생성하기 위한 것일 수 있다. 대상체는 인간 1차 세포 또는 성숙 세포, 또는 세포주일 수 있다. 대상체는 원숭이, 햄스터, 또는 마우스로부터의 세포일 수 있다. 어느 경우든, 전달은 조성물을 세포 또는 세포주와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
방법은 생체내, 예를 들어 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 것일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 비-인간 영장류일 수 있고, 이러한 경우에 조성물의 전달은 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산의 전달은 본원에 기재된 투여 경로 중 어느 하나를 사용하여 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 비제한적 예에서, 방향족 L-아미노산 데카르복실라제 결핍 (AADC) 유전자를 캡시드화한 rAAV는 AADC 결핍을 치료하기 위해 대상체에게 정맥내로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 생체내 또는 생체외 조직에서 이종 핵산의 형질도입을 증가시키는 방법은 본원에 기재된, 표적 생체내 환경 (예를 들어, 조직 또는 세포 유형)에서 증가된 형질도입 효율을 갖도록 조작된 rAAV인 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 참조 AAV에 비해 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 20-배, 21-배, 22-배, 23-배, 24-배, 25-배, 26-배, 27-배, 28-배, 29-배, 30-배, 31-배, 32-배, 33-배, 34-배, 35-배, 36-배, 37-배, 38-배, 39-배, 40-배, 41-배, 42-배, 43-배, 44-배, 45-배, 46-배, 47-배, 48-배, 49-배, 50-배, 75-배, 또는 100-배 증가, 또는 그 초과의 증가를 포함한다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 30-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 40-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 50-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 60-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 80-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 90-배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입 효율은 적어도 100-배이다.
일부 실시양태에서, 오프-타겟 생체내 또는 생체외 조직에서 이종 핵산의 형질도입을 감소시키는 방법은 본원에 기재된, 참조 AAV에 비해 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 20-배, 21-배, 22-배, 23-배, 24-배, 25-배, 26-배, 27-배, 28-배, 29-배, 30-배, 31-배, 32-배, 33-배, 34-배, 35-배, 36-배, 37-배, 38-배, 39-배, 40-배, 41-배, 42-배, 43-배, 44-배, 45-배, 46-배, 47-배, 48-배, 49-배, 50-배, 75-배, 또는 100-배, 또는 그 초과의 감소된 형질도입 효율을 갖도록 조작된 rAAV인 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 20-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 30-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 40-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 50-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 60-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 80-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 90-배 감소된다. 일부 경우에, 오프-타겟 유전자 전달은 적어도 100-배 감소된다.
또한, 참조 AAV와 비교하여 표적 생체내 또는 생체외 조직 (예를 들어, 기관 또는 세포 유형)에서 증가된 특이성을 갖도록 조작된 본원에 기재된 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 표적 생체내 환경으로 전달하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 오프-타겟 생체내 또는 생체외 조직에 대해 감소된 특이성을 갖도록 조작되었다. 일부 경우에, 방법은 rAAV가 참조 AAV보다 표적 생체내 또는 생체외 조직에 대해 더 큰 특이성을 보유하는지 검출하는 것을 포함하며, 이는 대상체의 표적 생체내 환경으로부터 수득된 조직 샘플에서 rAAV에 의해 캡시드화된 이종 핵산으로부터 발현된 유전자 발현 생성물 (예를 들어, RNA 또는 단백질)의 수준을 측정하는 것; 및 측정된 수준을 대조군 수준 (예컨대, 예를 들어, 참조 AAV (예를 들어, AAV9)에 의해 캡시드화된 이종 핵산으로부터 발현된 유전자 발현 생성물)과 비교하는 것을 포함한다. 유전자 발현 생성물의 발현을 측정하는데 적합한 방법은 루시페라제 리포터 검정 및 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)이다.
일부 경우에, 참조 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는다. 예를 들어, 참조 AAV는 AAV-PHP.B, AAV-PHP.eB, 및 AAV-PHP.S로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 가질 수 있다.
중추 또는 말초 신경계로의 전달
이종 핵산 (예를 들어, 치료 핵산)을 코딩하는 바이러스 벡터를 캡시드화한 rAAV 캡시드 단백질을 갖는 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 대상체의 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 생체내 환경으로 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 표적 생체내 환경으로 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산을 캡시드화한 rAAV 입자는 참조 AAV와 비교하여 대상체에게 전신 투여된 경우에도 대상체의 CNS 또는 PNS에 대해 증가된 특이성, 및 일부 경우에, 형질도입 효율을 갖도록 조작된 rAAV 캡시드 단백질을 포함한다.
방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체에서 CNS 또는 PNS에 대해 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. rAAV 캡시드 단백질은, 일부 경우에, 말초 기관 (예를 들어, 간)에 대해 감소된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는다. 일부 경우에, 전달은 전신 전달이다. 대안적으로, 전달은 직접 전달이다 (예를 들어, CNS 또는 PNS의 이환 부위 내). rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV의 아미노산 서열 내의 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV의 아미노산 서열에서 적어도 2개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이다. rAAV는 모 AAV의 아미노산 서열에서 적어도 3개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이다. rAAV는 모 AAV의 아미노산 서열에서 적어도 4개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이다. rAAV는 모 AAV의 아미노산 서열에서 적어도 5개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이고; X5는 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T이다. rAAV는 모 AAV의 아미노산 서열에서 적어도 6개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이고; X5는 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T이고; X6은 A, G, K, N, P, R, S, T, 또는 V이다. rAAV는 모 AAV의 아미노산 서열에서 적어도 7개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 A, D, G, L , N, Q, S, 또는 T이고; X2는 A, G, N, P, Q, R, S, 또는 T이고; X3은 A, D, G, N, S, 또는 T이고; X4는 A, D, G, K, N, P Q, S, 또는 T이고; X5는 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T이고; X6은 A, G, K, N, P, R, S, T, 또는 V이고; X7은 A, G, K, L, R, S, T, 또는 V이다.
X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 일부 경우에 인접한다 (X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7). X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개는 인접할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 452이다. 일부 실시양태에서 X2는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 453이다. 일부 실시양태에서 X3은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 454이다. 일부 실시양태에서 X4는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 455이다. 일부 실시양태에서 X5는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 456이다. 일부 실시양태에서 X6은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 457이다. 일부 실시양태에서 X7은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 458이다.
본원에 개시된 방법은 참조 AAV와 비교하여 대상체에서 CNS 또는 PNS에 대해 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 제공하며, 여기서 치환은 AAV9 캡시드 단백질 (VP1 넘버링), 그의 변이체의 아미노산 서열, 또는 상이한 AAV 혈청형의 동등한 아미노산 위치에서의 N452D, N452A, N452G, N452L, N452Q, N452S, N452T, G453I, G453N, G453S, G453P, G453R, G453T, S454A, S454Q, S454D, S454G, S454N, S454T, G455A, G455S, G455D, G455K, G455N, G455P, G455Q, G455T,Q456T, Q456S, Q456A, Q456G, Q456K, Q456N, Q456R, Q456P, N457K, N457A, N457G, N457P, N457R, N457S, N457T, N457V, Q458N, Q458A, Q458G, Q458K, Q458L, Q458R, Q458S, Q458T, 또는 Q458V를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 11-12739 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함하는 방법. 치환은 LQTSSPG (서열식별번호: 2933), QQGKQSV (서열식별번호: 79), SINTKTN (서열식별번호: 45475), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), NQSGTKG (서열식별번호: 780), KGPGQMG (서열식별번호: 45476), GTPSKAG (서열식별번호: 2741), 및 표 1 또는 표 2에 제공된 임의의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS 또는 PNS로의 이종 핵산의 전달에 적합한 rAAV 캡시드 단백질은 또한 아미노산 위치 588 (AAV9 VP1 넘버링)에서 아미노산 서열의 삽입을 가질 수 있다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 단백질은 간에 대해 감소된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는다. 일부 실시양태에서, 치환은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 452-458에서 아미노산 서열 ILGTGTS (서열식별번호: 45479) 또는 QSSQTPR (서열식별번호: 45480)로 이루어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS 또는 PNS로의 이종 핵산의 전달에 적합한 rAAV 캡시드 단백질은 또한 아미노산 위치 588 (AAV9 VP1 넘버링)에서 아미노산 서열의 삽입을 가질 수 있다.
이종 핵산을 캡시드화한 rAAV 입자를 대상체의 CNS 또는 PNS로 전달하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시되며, rAAV 입자는 (i) CNS 또는 PNS에 대한 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율, 및 (ii) 간에 대한 이종 핵산의 감소된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 포함하고, 여기서 rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체의 아미노산 서열, 또는 상이한 AAV 혈청형의 동등한 아미노산 위치에서 N452D, N452G, N452A, N452V, N452S, N452H, N452L, N452E, N452Q, G452A, G452I, G452T, G452P, G452R, G452T, G452S, G452K, G452H, S454A, S454N, S454D, S454G, S454T, S454H, S454K, S454Q, G455A, G455N, G455T, G455S, G455D, G455P, G455R, G455Q, Q456T, Q456S, Q456K, Q456P, Q456G, Q456D, Q456V, Q456A, Q456N, N457K, N457T, N457A, N457R, N457S, N457G, N457D, N457P, N457V, Q458N, Q458G, Q458S, Q458L, Q458A, Q458E, 및 Q458K로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 서열 DGAATKN (서열식별번호: 3943) 중 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 아미노산 서열 DGQSSKS (서열식별번호: 2764) 중 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환이다. 일부 경우에, 치환은 표 1 또는 표 2에 제공된 임의의 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, 전달은 전신 전달이다. 일부 실시양태에서, 전달은 직접 전달이다 (예를 들어, 생체내 환경 내로 주사됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제공됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.B (서열식별번호: 3)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.eB (서열식별번호: 5)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV의 아미노산 서열 (AAV9 VP1 넘버링)의 아미노산 위치 588-589에서 아미노산의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV, 예를 들어 AAV9에 의한 이종 핵산의 전달보다 더 특이적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간으로의 이종 핵산의 전달을 감소 또는 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV의 CNS 또는 PNS에서의 형질도입 효율보다 CNS 또는 PNS에서의 (예를 들어, 이종 핵산의) 형질도입 효율의 증가를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 전달은 전신 (예를 들어, 정맥내) 전달이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다.
표적 기관 또는 조직으로의 전달
일부 경우에, 이종 핵산을 전달하는 방법은 이종 핵산 (예를 들어, 치료 핵산)을 코딩하는 바이러스 벡터를 캡시드화한 rAAV 캡시드 단백질을 갖는 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 대상체의 표적 생체내 환경으로 전달하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 표적 생체내 환경은 간, 장, 심장, 폐, 생식 기관, 근육, 지방, 췌장, 뇌, 또는 비장이다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산을 캡시드화한 rAAV 입자는 대상체에게 전신 투여된 경우에도 대상체의 표적 생체내 환경에 대해 증가된 특이성 및 일부 경우에 형질도입 효율을 갖도록 조작된 rAAV 캡시드 단백질을 포함한다.
참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 심장에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV인, 이종 핵산을 캡시드화한 rAAV 입자를 대상체에게 전달하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 심장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 25469-26205에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 폐에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폐를 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 32537-34198에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 간에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 30720-30923에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 장에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 26206-26873에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 위에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위를 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 31873-32060에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 비장에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 31468-31872에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 신장에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 26874-30719에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 지방조직에서 측정 시 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방조직 (지방)을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 34199-35471에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 근육에 대한 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV인 rAAV 입자를 대상체에게 전달하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 근육을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 30924-31451에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 근육은 심장 근육일 수 있다. 근육은 골격근일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 췌장에 대한 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 췌장을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 31452-31467에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV (예를 들어, AAV9, AAV5)와 비교하여 대상체의 생식 기관(들)에 대한 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생식 기관, 예컨대 고환을 표적화하기 위해 최적화된 rAAV는 서열식별번호: 32061-32536에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 생식 기관은 난소이다.
이종 핵산을 간, 장, 심장, 폐, 생식 기관, 근육, 지방, 췌장, 뇌, 또는 비장으로 전달하는데 적합한 rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 1개의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 3개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 4개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; X4는 T, S, P, 또는 L이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 5개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; X4는 T, S, P, 또는 L이고; X5는 P, R, 또는 S이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 6개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; X4는 T, S, P, 또는 L이고; X5는 P, R, 또는 S이고; X6은 G, S, N, 또는 T이다. rAAV 캡시드 단백질은 모 AAV 캡시드 단백질에서 적어도 7개의 아미노산의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, X1은 K, R, N, 또는 T이고; X2는 D, E, N, 또는 V이고; X3은 N, S, L, 또는 P이고; IX4는 T, S, P, 또는 L이고; X5는 P, R, 또는 S이고; X6은 G, S, N, 또는 T이고; X7은 R, L 또는 I이다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 인접한다 (X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7). 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7 중 임의의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개는 인접한다. 일부 실시양태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7은 인접하지 않는다. 일부 실시양태에서, X1은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 452이다. 일부 실시양태에서 X2는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 453이다. 일부 실시양태에서 X3은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 454이다. 일부 실시양태에서 X4는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 455이다. 일부 실시양태에서 X5는 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 456이다. 일부 실시양태에서 X6은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 457이다. 일부 실시양태에서 X7은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 458이다. 일부 실시양태에서, 치환은 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 452-458에서 아미노산 서열 ILGTGTS (서열식별번호: 45479) 또는 QSSQTPR (서열식별번호: 45480)로 이루어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체의 표적 생체내 환경으로의 이종 핵산의 전달에 적합한 rAAV 캡시드 단백질은 또한 아미노산 위치 588 (AAV9 VP1 넘버링)에서 아미노산 서열의 삽입을 가질 수 있다.
대상체의 간, 장, 심장, 폐, 생식 기관, 근육, 지방, 췌장, 뇌, 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체내 표적 환경으로 이종 핵산을 캡시드화한 rAAV 입자를 전달하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시되며, rAAV 입자는 표적 생체내 환경에 대한 이종 핵산의 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율을 포함하고, 여기서 rAAV 입자는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538), NNLPRNL (서열식별번호: 32867), RESSPSL (서열식별번호: 29065), 또는 RVPLSTI (서열식별번호: 26933)의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제공됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 서열식별번호: 2에 제공됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.B (서열식별번호: 3)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.eB (서열식별번호: 5)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV의 아미노산 서열 (AAV9 VP1 넘버링)의 아미노산 위치 588-589에서 아미노산의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV, 예를 들어 AAV9에 의한 이종 핵산의 전달보다 더 특이적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 참조 AAV와 비교하여, 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간으로의 이종 핵산의 전달을 감소 또는 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV의 표적 생체내 환경에서의 형질도입 효율보다 표적 생체내 환경에서의 (예를 들어, 이종 핵산의) 형질도입 효율의 증가를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 전달은 전신 (예를 들어, 정맥내) 전달이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다.
치료 방법
치료 유효량의 본원에 개시된 1종 이상의 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 제제 및 조성물)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 단리 및 정제된 rAAV 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 트랜스진 (예를 들어, 치료 핵산)을 포함하는 이종 핵산을 캡시드화한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 치료제와 접합된 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 rAAV 입자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 조성물은 단독으로 대상체에게 투여된다 (예를 들어, 독립 요법). 일부 실시양태에서, 1종 이상의 조성물은 추가의 작용제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질환 또는 상태에 대한 1차 요법이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질환 또는 상태에 대한 2차, 3차, 또는 4차 요법이다.
(a) 표적 생체내 환경에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 갖는 대상체를 진단하고; (b) 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)을 투여함으로써 질환 또는 상태를 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은 표적 생체내 환경에 대해 증가된 특이성을 갖도록 조작된다. 일부 경우에, 조성물은 오프-타겟 생체내 환경, 예를 들어 간에 대해 감소된 특이성을 갖도록 조작된다.
(a) 대상체에게 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)을 투여하고; (b) 참조 AAV와 비교하여 증가된 특이성 및/또는 형질도입 효율로 대상체의 표적 생체내 환경에서 치료 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 생체내 환경을 저해시키는 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 참조 AAV는 AAV9 또는 AAV5, 또는 그의 변이체이다.
중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS)에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 치료하는 방법은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 DGAATKN (서열식별번호: 3943) 또는 DGQSSKS (서열식별번호: 2764), LQTSSPG (서열식별번호: 2933), QQGKQSV (서열식별번호: 79), SINTKTN (서열식별번호: 45475), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), NQSGTKG (서열식별번호: 780), KGPGQMG (서열식별번호: 45476), GTPSKAG (서열식별번호: 2741), 및 표 1, 표 2, 도 2, 또는 도 3에 제공된 임의의 아미노산 서열의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46384-46399 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제공됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.B (서열식별번호: 3)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.eB (서열식별번호: 5)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV의 아미노산 서열 (AAV9 VP1 넘버링)의 아미노산 위치 588-589에서 아미노산의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV, 예를 들어 AAV9에 의한 이종 핵산의 전달보다 더 특이적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간으로의 이종 핵산의 전달을 감소 또는 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV의 CNS 또는 PNS에서의 형질도입 효율보다 CNS 또는 PNS에서의 (예를 들어, 이종 핵산의) 형질도입 효율의 증가를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 전달은 전신 (예를 들어, 정맥내) 전달이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다.
간, 장, 심장, 폐, 생식 기관, 근육, 지방, 췌장, 뇌, 또는 비장으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 생체내 환경을 저해시키는 질환 또는 상태를 치료하는 방법은 서열식별번호: 25469-26205 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자인 도 4-14 중 어느 하나에 제공된 아미노산을 포함하는 rAAV 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 KDNTPGR (서열식별번호: 32538) 또는 NNLPRNL (서열식별번호: 32867)을 포함하는 rAAV 입자를 전달함으로써 폐를 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 26474)을 포함하는 rAAV 입자를 전달함으로써 장을 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RVPLSTI (서열식별번호: 26933) 또는 RESSPSL (서열식별번호: 29065)을 포함하는 rAAV 입자를 전달함으로써 신장을 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에서 아미노산 서열 RESSPSL (서열식별번호: 31904)을 포함하는 rAAV 입자를 전달함으로써 위를 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 46400-46403 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제공됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 서열식별번호: 2에 제공됨). 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.B (서열식별번호: 3)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 변이체 캡시드 단백질 AAV-PHP.eB (서열식별번호: 5)이다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 모 AAV의 아미노산 서열 (AAV9 VP1 넘버링)의 아미노산 위치 588-589에서 아미노산의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산의 삽입을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV, 예를 들어 AAV9에 의한 이종 핵산의 전달보다 더 특이적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간으로의 이종 핵산의 전달을 감소 또는 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 참조 AAV의 표적 생체내 환경에서의 형질도입 효율보다 표적 생체내 환경에서의 (예를 들어, 이종 핵산의) 형질도입 효율의 증가를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 전달은 전신 (예를 들어, 정맥내 또는 비강내) 전달이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다.
또한, 표적 유전자 발현 생성물의 조정을 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 표적 유전자 발현 생성물을 조정하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 표적 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 조정하는 이종 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 캡시드화한 rAAV 캡시드 단백질을 갖는 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 정상 개체와 비교하여 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 증가된 또는 증진된 발현 또는 활성을 특징으로 한다. 일부 경우에, 치료 유효량의 조성물을 투여하는 것은 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 정상 개체에서 전형적인 수준으로 회복시킨다. 용어 "정상 개체"는 영향을 받지 않은 개체, 즉 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성의 변동을 특징으로 하는 질환 또는 상태를 앓지 않는 개체를 지칭한다.
중추 신경계 (CNS) 질환 또는 장애에 수반되는 유전자의 비제한적 예는 사르코글리칸 알파 (SGCA), 글루탐산 데카르복실라제 65 (GAD65), 글루탐산 데카르복실라제 67 (GAD67), CLN2 유전자, 신경 성장 인자 (NGF), 신경교 세포 유도된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린, 생존 운동 뉴런 1, 텔로미어 (SMN1), β-글루코세레브로시다제 (GCase), 프라탁신 (FXN), 헌팅틴 (HTN), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2), 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX), 프로그래뉼린 (GRN), 항튜불린제, 구리-아연 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 글루코실세라미다제 베타 (GBA), NPC 세포내 콜레스테롤 수송체 1 (NPC1), 및 NPS3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX)는 PEX1, PEX2, PEX3, PEX4, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11β, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, 및 PEX26으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 기관 (예를 들어, 폐, 심장, 간, 근육, 눈)의 질환 또는 장애에 연루되는 유전자의 비제한적 예는 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR), 인자 X (FIX), RPE65, 레티노이드 이소머로히드롤라제 (RPE65), 사르코글리칸 알파 (SGCA), 및 근형질/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a)를 포함한다. 일부 경우에, 유전자의 발현 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성은 대상체에게 조성물을 투여함으로써 억제된다. 일부 경우에, 유전자의 발현 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성은 대상체에게 조성물을 투여함으로써 증진된다.
일부 경우에, 조성물은 목적하는 치료 효과를 수득하기 위해 1일 1회 이상, 1일에 대상체의 체중의 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.005 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg으로 전달되기에 충분한 투여량 수준으로 투여된다.
일부 경우에, 투여되는 조성물의 바이러스 게놈 (vg) 농도는 킬로그램 (kg)당 1.0 x1011개 vg 내지 1.0 x1016개 vg/kg이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 또는 1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 2x107, 2x108, 2x109, 2x1010, 2x1011, 2x1012, 2x1013, 2x1014, 2x1015, 2x1016, 또는 2x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 3x107, 3x108, 3x109, 3x1010, 3x1011, 3x1012, 3x1013, 3x1014, 3x1015, 3x1016, 또는 3x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 4x107, 4x108, 4x109, 4x1010, 4x1011, 4x1012, 4x1013, 4x1014, 4x1015, 4x1016, 또는 4x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 5x107, 5x108, 5x109, 5x1010, 5x1011, 5x1012, 5x1013, 5x1014, 5x1015, 5x1016, 또는 5x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 6x107, 6x108, 6x109, 6x1010, 6x1011, 6x1012, 6x1013, 6x1014, 6x1015, 6x1016, 또는 6x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 7x107, 7x108, 7x109, 7x1010, 7x1011, 7x1012, 7x1013, 7x1014, 7x1015, 7x1016, 또는 7x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 8x107, 8x108, 8x109, 8x1010, 8x1011, 8x1012, 8x1013, 8x1014, 8x1015, 8x1016, 또는 8x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 9x107, 9x108, 9x109, 9x1010, 9x1011, 9x1012, 9x1013, 9x1014, 9x1015, 9x1016, 또는 9x1017이다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 1회 수행된다. 대안적으로, 투여 단계는 적어도 2회 반복된다. 투여 단계는 1일 1회 수행될 수 있다. 일부 경우에, 투여 단계는 정맥내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 투여는 폐 투여를 포함한다. 일부 경우에, 투여는 비강내 투여 (예컨대 분무)를 포함한다. 일부 경우에, 투여 단계는 조성물을 표적 생체내 환경에 주사하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 투여 단계는 조성물을 표적 생체내 환경으로 주사하는 것을 포함하지 않는다.
대상체
예를 들어 대상체에서 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 AAV 입자 및 바이러스 벡터 중 적어도 1개를 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 대상체는 포유동물이다. 포유동물의 비제한적 예는 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 침팬지 또는 가축을 포함한다. 일부 경우에, 포유동물은 비-인간 영장류이다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 본 개시내용의 대상체는 질환 또는 상태를 갖는 것으로 진단되지 않을 수 있다. 대안적으로, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 진단되거나, 또는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 환자일 수 있다.
질환 또는 상태
본원에 개시된 것과 같은 rAAV를 포함하는 조성물을 투여함으로써 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 rAAV의 적어도 1개의 이점은 rAAV가 척수성 근육 위축 (SMA), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 폼페병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 배튼병, 리소솜 축적 장애, 다형성 교모세포종, 레트 증후군, 레베르 선천성 흑암시, 후기 영아 신경 세로이드 리포푸신증 (LINCL), 만성 통증, 졸중, 척수 손상, 외상성 뇌 손상 및 리소솜 축적 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 트랜스진 요법으로부터 이익을 얻을 실질적으로 임의의 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 정상 개체와 비교하여 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 감소된 또는 제거된 발현 또는 활성을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 정상 개체와 비교하여 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 증가된 또는 증진된 발현 또는 활성을 특징으로 할 수 있다.
일부 경우에, 질환 또는 상태는 대상체 내의 특정한 생체내 환경, 예를 들어 뇌 또는 폐로 국재화된다. 본 개시내용의 조성물은, 이들이 생체내 환경을 특이적으로 표적화하고, 질환 또는 상태의 발병기전 또는 병리상태에 수반되는 표적 유전자 발현 생성물의 활성 또는 발현을 조정하도록 조작된 치료 핵산을 전달하기 때문에, 본원에 기재된 질환 또는 상태의 치료에 특히 유용하다.
일부 예에서, 질환 또는 상태는 중추 신경계 (CNS)의 질환 또는 상태를 포함한다. CNS의 질환의 비제한적 예는 투명 격막 부재, 산 리파제 질환, 산성 말타제 결핍, 후천성 간질양 실어증, 급성 파종성 뇌척수염, 주의력 결핍-과잉행동 장애 (ADHD), 아디 동공, 아디 증후군, 부신백질이영양증, 뇌량의 무발생증, 실인증, 에카르디 증후군, 에카르디-구티에레스 증후군 장애, AIDS -신경계 합병증, 알렉산더병, 알퍼스병, 교대 편마비, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 무뇌증, 동맥류, 안젤만 증후근, 혈관종증, 무산소증, 항인지질 증후군, 실어증, 실행증, 거미막 낭, 지주막염, 아놀드-키아리 기형, 동정맥 기형, 아스퍼거 증후군, 운동실조, 모세혈관확장성 운동실조, 운동실조 및 소뇌 또는 척수소뇌 변성, 심방 세동 및 졸중, 주의력 결핍-과잉행동 장애, 자폐증 스펙트럼 장애, 자율신경성 기능장애, 요통, 바르트 증후군, 배튼병, 베커 근긴장증, 베체트병, 벨 마비, 양성 본태성 안검연축, 양성 초점성 근위축, 양성 두개내 고혈압, 베른하르트-로트 증후군, 빈스방거병, 안검연축, 블로흐-슐츠베르거 증후군, 상완 신경총 출산 손상, 상완 신경총 손상, 브래드버리-에글스톤 증후군, 뇌 및 척추 종양, 뇌 동맥류, 뇌 손상, 브라운-세카르 증후군, 연수척수성 근육 이영양증, 뇌 상염색체 우성 동맥병증 동반 피질하 경색 및 백질뇌병증 (CADASIL), 카나반병, 손목 터널 증후군, 작열통, 해면종, 해면 혈관종, 해면 기형, 중심 경수 증후군, 중심 척수 증후군, 중추성 통증 증후군, 중심 뇌교 수초용해, 두부 장애, 세라미다제 결핍, 소뇌 변성, 소뇌 저형성증, 뇌 동맥류, 뇌 동맥경화증, 뇌 위축, 뇌 각기병, 뇌 해면 기형, 뇌 거대증, 뇌 저산소증, 뇌성 마비, 뇌-안구-안면-골격 증후군 (COFS), 샤르코-마리-투스병, 샤르코-마리-투스 증후군, 전형적 근형부 점상 연골이형성증 (RCDP), 키아리 기형, 콜레스테롤 에스테르 축적 질환, 무도병, 무도병 유극적혈구증가증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 만성 기립성 불내증, 만성 통증, 코케인 증후군 유형 II, 코핀 로우리 증후군, 거대후두각, 혼수, 복합 부위 통증 증후군, 선천성 안면 양측마비, 선천성 근무력증, 선천성 근병증, 선천성 혈관 해면 기형, 피질기저 변성, 두개 동맥염, 두개골유합증, 크리 뇌염, 크로이츠펠트- 야콥병, 누적 외상 장애, 쿠싱 증후군, 거대세포 봉입체 질환, 시토메갈로바이러스 감염, 춤추는 눈-춤추는 발 증후군, 댄디-워커 증후군, 도슨병, 난청, 드 모르시어 증후군, 데제린-클룸프케 마비, 치매, 다발 경색 치매, 의미 치매, 피질하 치매, 루이 소체 치매, 치상 소뇌 운동실조, 치상핵적핵 위축, 피부근염, 발달 행동곤란, 데빅 증후군, 당뇨병성 신경병증, 미만성 경화증, 드라베 증후군, 뒤시엔느 근육 이영양증, 자율신경실조증, 쓰기장애, 난독증, 연하곤란, 행동곤란, 근육협동장애 소뇌 근간대성경련, 진행성 소뇌 근육협동장애, 이상긴장증, 조기 영아 간질성 뇌병증, 빈 안장 증후군, 뇌염, 기면성 뇌염, 뇌탈출증, 뇌병증, 뇌병증 (가족성 영아), 뇌삼차신경 혈관종증, 간질, 간질성 편마비, 에르브 마비, 에르브-뒤시엔느 및 데제린-클룸프케 마비, 본태성 진전, 뇌교외 수초용해, 파브리병, 파르 증후군, 기절, 가족성 자율신경실조증, 가족성 혈관종, 가족성 특발성 기저 신경절 석회화, 가족성 주기성 마비, 가족성 경직성 마비, 파버병, 열성 발작, 섬유근성 이형성증, 피셔 증후군, 저긴장영아 증후군, 족하수, 프리드라이히 운동실조, 전두측두엽 치매, 고셔병, 전신성 강글리오시드증, 게르스트만 증후군, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병, 거대 축삭 신경병증, 거대 세포 동맥염, 거대 세포 봉입체 질환, 교모세포종, 구상 세포 백질이영양증, 설인 신경통, 글리코겐 축적 질환, 길랑-바레 증후군, 할러보르덴-스파츠 질환, 두부 손상, 두통, 지속성 반두통, 편측안면 연축, 안면신경 교대성, 유전성 신경병증, 유전성 경직성 하반신마비, 유전성 다발신경염성 실조, 대상 포진, 이성 대상 포진, 히라야마 증후군, 홀름-아디 증후군, 완전전뇌증, HTLV-1 연관 척수병증, 휴즈 증후군, 헌팅톤병, 무뇌수두증, 수두증, 수두증 - 정상 압력, 수척수증, 고코르티솔증, 과다수면, 고긴장증, 저긴장증, 저산소증, 면역-매개 뇌척수염, 봉입체 근염, 색소실조증, 영아 저긴장증, 영아 신경축삭 이영양증, 영아 피탄산 축적 질환, 영아 레프숨병, 영아 연축, 염증성 근병증, 후두공뇌탈출기형, 장 지방이영양증, 두개내 낭, 두개내 고혈압, 이삭 증후군, 주버트 증후군, 컨스-세이어 증후군, 케네디병, 킨스번 증후군, 클라인-레빈 증후군, 클리펠-페일 증후군, 클리펠-트레노우네이 증후군 (KTS), 클리버-부시 증후군, 코르사코프 기억상실 증후군, 크라베병, 쿠겔베르그-벨란더병, 쿠루병, 램버트-이튼 근무력 증후군, 란다우-클레프너 증후군, 외측 대퇴 피부 신경 포착, 외측 연수 증후군, 학습 불능, 라이병, 레녹스-가스타우트 증후군, 레쉬-니한 증후군, 백질이영양증, 레빈-크리칠리 증후군, 루이 소체 치매, 지질 축적 질환, 지질성 단백증, 활택뇌증, 잠금 증후군, 루게릭병, 루푸스 -신경계 후유증, 라임병 - 신경계 합병증, 마차도-요셉병, 대뇌증, 거대뇌증, 멜커슨-로젠탈 증후군, 수막염, 수막염 및 뇌염, 멘케스병, 대퇴 등통증, 이염성 백질이영양증, 소두증, 편두통, 밀러 피셔 증후군, 미니 졸중, 미토콘드리아 근병증, 뫼비우스 증후군, 단일사지 근위축, 운동 뉴런 질환, 모야모야병, 점액지질증, 뮤코폴리사카라이드증, 다발경색 치매, 다초점성 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다계통 위축, 다계통 위축 동반 기립성 저혈압, 근육 이영양증, 근무력증 -선천성, 중증 근무력증, 수초탈락성 미만성 경화증, 영아 근간대성 뇌병증, 근간대성경련, 근병증, 근병증- 선천성, 근병증 -갑상선중독, 근긴장증, 선천성 근긴장증, 기면증, 신경유극적혈구증가증, 뇌 철 축적을 동반한 신경변성, 신경섬유종증, 신경이완제 악성 증후군, AIDS의 신경계 합병증, 라임병의 신경계 합병증, 시토메갈로바이러스 감염의 신경계 결과, 폼페병의 신경계 징후, 루푸스의 신경계 후유증, 시신경척수염, 신경근긴장증, 신경 세로이드 리포푸신증, 뉴런 이동 장애, 신경병증- 유전성, 신경사르코이드증, 신경매독, 신경독성, 해면상 모반, 니만-픽병, 오설리번-맥레오드 증후군, 후두 신경통, 오타하라 증후군, 올리브교뇌소뇌 위축, 안진전 근간대성경련, 기립성 저혈압, 과사용 증후군, 통증 -만성, 판토테네이트 키나제-연관 신경변성, 부신생물성 증후군, 감각이상, 파킨슨병, 발작성 무도무정위운동증, 발작성 반두통, 패리-롬버그, 펠리제우스-메르츠바허병, 페나 쇼키어 II 증후군, 신경주위 낭, 주기성 마비, 말초 신경병증, 뇌실주위 백질연화증, 지속 식물 상태, 전반적 발달 장애, 피탄산 축적 질환, 픽병, 신경 조임, 이상근 증후군, 뇌하수체 종양, 다발근염, 폼페병, 공뇌증, 소아마비후 증후군, 포진후 신경통, 감염후 뇌척수염, 체위성 저혈압, 체위성 기립성 빈맥 증후군, 체위성 빈맥 증후군, 원발성 치아핵 위축, 원발성 측삭 경화증, 원발성 진행성 실어증, 프리온 질환, 진행성 편측안면 위축, 진행성 보행 운동실조, 진행성 다초점성 백질뇌병증, 진행성 경화성 회백질위축증, 진행성 핵상 마비, 얼굴인식불능증, 슈도-토치 증후군, 가성톡소플라스마증 증후군, 가성 뇌종양, 심인성 운동, 람세이 헌트 증후군 I, 람세이 헌트 증후군 II, 라스무센 뇌염, 반사 교감신경 이영양증 증후군, 레프숨병, 레프숨병 - 영아, 반복 운동 장애, 반복 스트레스 손상, 하지 불안 증후군, 레트로바이러스-연관 척수병증, 레트 증후군, 라이 증후군, 류마티스성 뇌염, 릴리-데이 증후군, 천골 신경근 낭, 세인트 비투스 댄스, 타액선 질환, 샌드호프병, 쉴더병, 분열뇌증, 자이텔버거병, 발작 장애, 의미 치매, 중격-시신경 이형성증, 영아기 중증 근간대성 간질 (SMEI), 흔들린 아기 증후군, 대상포진, 샤이-드래거 증후군, 쇼그렌 증후군, 수면 무호흡, 수면병, 소토스 증후군, 경직, 이분 척추, 척수 경색, 척수 손상, 척수 종양, 척수성 근육 위축, 척수소뇌 위축, 척수소뇌 변성, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군, 강직-인간 증후군, 선조체흑질 변성, 졸중, 스터지-웨버 증후군, 아급성 경화성 범뇌염, 피질하 동맥경화성 뇌병증, 단기-지속, 일측성, 신경통형 (SUNCT) 두통, 삼킴 장애, 시데남 무도병, 실신, 매독성 척수성 경화증, 척수수공동증, 척수공동증, 전신 홍반성 루푸스, 척수로,지연성 이상운동증, 타로프 낭종, 테이-삭스병, 측두 동맥염, 테더링 척수 증후군, 톰슨 근긴장증, 흉곽 출구 증후군, 갑상선중독성 근병증, 동통성 틱, 토드 마비, 투렛 증후군, 일과성 허혈 발작, 전염성 해면상 뇌병증, 횡단성 척수염, 외상성 뇌 손상, 진전, 삼차 신경통, 열대성 경직성 하반신부전마비, 트로이어 증후군, 결절성 경화증, 혈관 발기성 종양, 중추 및 말초 신경계의 혈관염 증후군, 폰 에코노모병, 폰 히펠-린다우병 (VHL), 폰 레클링하우젠병, 발렌버그 증후군, 베르드니히-호프만 질환, 베르니케-코르사코프 증후군, 웨스트 증후군, 편타증, 휘플병, 윌리암스 증후군, 윌슨병, 월만병, 및 X-연관 척수성 및 연수성 근육 위축을 포함한다.
일부 경우에, 질환 또는 상태는 간 질환 또는 장애를 포함하거나, 또는 간 질환 또는 장애와 연관된다. 비제한적 예는 담즙산 합성 장애 (예를 들어, 윌슨병, 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 3), 탄수화물 대사 장애 (예를 들어, 유전성 프룩토스 불내증, 글리코겐 축적 질환 유형 IV), 아미노산 대사 장애 (예를 들어, 티로신혈증 유형 I), 우레아 주기 장애 (예를 들어, 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍, 시트린 결핍 (CTLN2, NICCD)), 지질 대사 장애 (예를 들어, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환), 및 알파-1 항트립신 결핍, 낭성 섬유증, 유전성 혈색소증, 알스트롬 증후군 및 선천성 간 섬유증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 것을 포함한다.
일부 경우에, 질환 또는 상태는 (폐의) 폐 질환 또는 장애인 질환 또는 상태이다. 일부 경우에, 폐 질환 또는 장애는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증 (PF), 및 플라스마로겐 결핍 장애로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 이종 핵산을 캡시드화한 rAAV를 투여함으로써 대상체에서 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 조정하는 것을 포함하는, 표적 유전자 또는 그의 유전자 발현 생성물의 이상 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 투여는 전신 투여이다. 일부 경우에, 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성은 정상 (비-이환) 개체에서의 발현 또는 활성에 비해 감소되고; rAAV를 대상체에게 투여하는 것은 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 정상 개체의 발현 또는 활성으로 증가시키기에 충분하다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성은 정상 개체에서의 발현 또는 활성에 비해 증가되고; rAAV를 대상체에게 투여하는 것은 표적 유전자 또는 유전자 발현 생성물의 발현 또는 활성을 감소시키기에 충분하다. 비제한적 예에서, 일부 경우에 프레세닐린 1 및/또는 프레세닐린 2 (각각 유전자 PSEN1 및 PSEN2에 의해 코딩됨)의 기능-획득에 의해 유발된 알츠하이머병을 갖는 것으로 진단된 대상체에게 침묵 RNA (siRNA), 또는 PSEN1 mRNA에 대한 기능-상실 효과를 갖는 다른 RNAi인 치료 핵산을 캡시드화한 본원에 개시된 rAAV를 투여한다.
제제, 투여량, 및 투여 경로
일반적으로, 본원에 개시된 방법은 치료 rAAV 조성물을 전신 투여에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 치료 rAAV 조성물을 경구 투여에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 치료 rAAV 조성물을 복강내 주사에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 치료 rAAV 조성물을 항문 좌제의 형태로 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 치료 rAAV 조성물을 정맥내 ("i.v.") 투여에 의해 투여하는 것을 포함한다. 또한 본원에 개시된 치료 rAAV 조성물을 다른 경로, 예컨대 피하 주사, 근육내 주사, 피내 주사, 경피 주사 경피 투여, 비강내 투여, 림프내 주사, 직장 투여, 위내 투여, 안내 투여, 뇌실내 투여, 척수강내로, 또는 임의의 다른 적합한 비경구 투여에 의해 투여할 수 있다는 것이 고려될 수 있다. 일부 경우에, 방법은 치료 rAAV 조성물을 국소 투여에 의해, 예컨대 예를 들어 rAAV 조성물을 대상체의 영역 (예를 들어, 고막, 방광)에 브러싱하거나 또는 달리 접촉시키는 것에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 손상 또는 염증 부위에 더 가까운 국부 전달을 위한 경로가 전신 경로보다 바람직하다. 치료제의 투여 경로, 투여량, 시점, 및 지속기간은 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제의 투여는 질환 또는 상태의 급성 및 만성 증상 중 어느 하나 또는 둘 다의 개시 전에 또는 후에 이루어진다.
본원에 개시된 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물의 유효 용량 및 투여량은 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상과 관련된 관찰된 유익한 반응에 의해 규정된다. 유익한 반응은 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 예방, 완화, 정지, 또는 치유하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유익한 반응은 대상체에서 바이오마커, 트랜스크립톰 위험 프로파일, 또는 장 마이크로바이옴의 존재, 수준, 또는 활성의 측정가능한 개선을 검출함으로써 측정될 수 있다. 본원에 사용된 "개선"은 정상 개체 (예를 들어, 질환 또는 상태를 앓지 않는 개체)에서 관찰되는 존재, 수준, 또는 활성으로의 존재, 수준, 또는 활성의 이동을 지칭한다. 치료 rAAV 조성물이 치료상 유효하지 않거나, 또는 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상의 충분한 완화를 제공하지 않는 경우에, 투여량 및/또는 투여 경로는 변화될 수 있거나, 또는 추가의 작용제가 치료 rAAV 조성물과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자가 치료 rAAV 조성물의 요법을 시작함에 따라, 환자는 또한 제2 치료 요법을 마무리한다 (예를 들어, 용량의 단계적 감소).
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 제약 조성물은 목적하는 치료, 진단, 또는 예방 효과를 수득하기 위해 1일 1회 이상, 1일에 대상체의 체중의 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.005 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg으로 전달되기에 충분한 투여량 수준으로 투여될 수 있다. 상기 투여 농도는 kg당 vg 또는 바이러스 게놈으로, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 투여되는 총 바이러스 게놈으로 전환될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
일부 경우에, 제약 조성물의 용량은 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 또는 1017개의 감염성 입자의 농도를 포함할 수 있다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 2x107, 2x108, 2x109, 2x1010, 2x1011, 2x1012, 2x1013, 2x1014, 2x1015, 2x1016, 또는 2x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 3x107, 3x108, 3x109, 3x1010, 3x1011, 3x1012, 3x1013, 3x1014, 3x1015, 3x1016, 또는 3x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 4x107, 4x108, 4x109, 4x1010, 4x1011, 4x1012, 4x1013, 4x1014, 4x1015, 4x1016, 또는 4x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 5x107, 5x108, 5x109, 5x1010, 5x1011, 5x1012, 5x1013, 5x1014, 5x1015, 5x1016, 또는 5x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 6x107, 6x108, 6x109, 6x1010, 6x1011, 6x1012, 6x1013, 6x1014, 6x1015, 6x1016, 또는 6x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 7x107, 7x108, 7x109, 7x1010, 7x1011, 7x1012, 7x1013, 7x1014, 7x1015, 7x1016, 또는 7x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 8x107, 8x108, 8x109, 8x1010, 8x1011, 8x1012, 8x1013, 8x1014, 8x1015, 8x1016, 또는 8x1017이다. 일부 경우에 감염성 입자의 농도는 9x107, 9x108, 9x109, 9x1010, 9x1011, 9x1012, 9x1013, 9x1014, 9x1015, 9x1016, 또는 9x1017이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV 조성물의 전달에 적합한 제약상 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제제, 뿐만 아니라 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 각각의 치료상 유용한 조성물 중 치료 유전자 발현 생성물의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 이러한 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, rAAV 조성물은 안구내로, 유리체내로, 비경구로, 피하로, 정맥내로, 뇌실내로, 근육내로, 척수강내로, 경구로, 복강내로, 경구 또는 비강 흡입에 의해, 또는 직접 주사에 의해 1개 이상의 세포, 조직, 또는 기관으로 전달되도록, 본원에 개시된 제약 조성물로 적합하게 제제화된다.
일부 실시양태에서, 주사가능한 용도에 적합한 AAV-기반 바이러스 조성물의 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
일부 경우에, 주사가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요한 경우에 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스에 의해 등장성으로 될 수 있다. 이들 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 투여량의 일부 변동은 치료될 대상체의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어느 경우에서든 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여를 위해, 제제는 FDA 사무국의 생물학 기준에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 및 일반적 안전성 및 순도 기준을 충족시켜야 한다.
본원에 개시된 rAAV 조성물을 필요에 따라 상기 열거된 여러 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조된, 본원에 개시된 rAAV 조성물을 포함하는 멸균 주사가능한 용액이 본원에 개시된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 주사가능한 용액은, 예를 들어 정맥내 투여에 의한 전신 투여를 위해 유리할 수 있다.
또한, 중성 또는 염 형태의 제제가 또한 본원에 제공된다. 제약상 허용되는 염은 무기 산, 예컨대 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실 기에 의해 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제제화되면, 용액은 투여 제제와 상용성인 방식으로 및 치료상 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 주사가능한 용액, 약물-방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.
폐 투여는 유리하게는 협측 투여를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 활성 성분을 포함하는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 건조 입자는 약 0.5 nm 내지 약 7 nm 또는 약 1 nm 내지 약 6 nm 범위의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 추진제의 스트림을 유도하여 건조 분말을 분산시킬 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 자기-추진 용매/분말 분배 용기가 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 활성 성분은 밀봉된 용기 내에서 저비점 추진제 중에 용해 및/또는 현탁될 수 있다. 이러한 분말은, 중량 기준으로 입자의 적어도 98%가 0.5 nm 초과의 직경을 갖고 수 기준으로 입자의 적어도 95%가 7 nm 미만의 직경을 갖는 입자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 중량 기준으로 입자의 적어도 95%는 1 nm 초과의 직경을 갖고 수 기준으로 입자의 적어도 90%는 6 nm 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 고체 미분 희석제, 예컨대 당을 포함할 수 있고, 편리하게는 단위 투여 형태로 제공된다. 저비점 추진제는 일반적으로 대기압 하에 65℉ 미만의 비점을 갖는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50% 내지 99.9% (w/w)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1% 내지 20% (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 추가의 성분, 예컨대 액체 비-이온성 및/또는 고체 음이온성 계면활성제 및/또는 고체 희석제 (이는 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 정도의 입자 크기를 가질 수 있음)를 추가로 포함할 수 있다.
폐 전달을 위해 제제화된 제약 조성물은 활성 성분을 용액 및/또는 현탁액의 액적 형태로 제공할 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 포함하는, 임의로 멸균된 수성 및/또는 묽은 알콜성 용액 및/또는 현탁액으로서 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있고, 편리하게는 임의의 연무화 및/또는 분무화 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 제제는 향미제 예컨대 사카린 소듐, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제, 및/또는 보존제 예컨대 메틸히드록시벤조에이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로에 의해 제공되는 액적은 약 0.1 nm 내지 약 200 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다. 폐 전달에 유용한 본원에 기재된 제제는 또한 비강내 전달에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비강내 투여를 위한 제제는, 활성 성분을 포함하고 약 0.2 μm 내지 500 μm의 평균 입자 크기를 갖는 조대 분말을 포함한다. 이러한 제제는, 예를 들어 코에 가까이 놓는 분말 용기로부터 비도를 통한 신속한 흡입에 의해 코로 들이쉬는 방식으로 투여된다.
비강 투여에 적합한 제제는, 예를 들어 약 적게는 0.1% (w/w) 및 많게는 100% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있고, 본원에 기재된 추가의 성분 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 협측 투여에 적합한 제제로 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어 통상적인 방법을 사용하여 제조된 정제 및/또는 로젠지 형태일 수 있고, 예를 들어 0.1% 내지 20% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 나머지는 경구로 용해가능하고/거나 분해가능한 조성물, 및 임의로 본원에 기재된 추가의 성분 중 1종 이상을 포함한다. 대안적으로, 협측 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 포함하는 분말 및/또는 에어로졸화 및/또는 분무화 용액 및/또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한 분말화, 에어로졸화, 및/또는 에어로졸화 제제는 분산 시에 약 0.1 nm 내지 약 200 nm 범위의 평균 입자 및/또는 액적 크기를 포함할 수 있고, 본원에 기재된 임의의 추가의 성분 중 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
대상체에게 투여되는 적합한 용량 및 투여량은 특정한 치료 rAAV 조성물, 질환 상태 및 그의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상체의 정체 (예를 들어, 체중, 성별, 연령)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인자에 의해 결정되고, 예를 들어 투여되는 구체적 작용제, 투여 경로, 치료되는 상태, 및 치료되는 대상체 또는 숙주를 포함한, 사례를 둘러싸는 특정한 상황에 따라 결정될 수 있다.
AAV 조성물의 양 및 이러한 조성물의 투여 시간은 본 발명의 교시의 이익을 갖는 통상의 기술자의 이해범위 내에 있을 것이다. 그러나, 치료 유효량의 개시된 조성물의 투여는 단일 투여, 예컨대 예를 들어 이러한 치료를 받는 환자에게 치료 이익을 제공하기에 충분한 수의 감염성 입자의 단일 주사에 의해 달성될 수 있을 수 있다. 이는, 적어도 부분적으로, 특정 표적 세포 (예를 들어, 뉴런)가 분열하지 않는다는 사실에 의해 가능하게 되며, 이는 다중 또는 만성 투여에 대한 필요를 제거한다.
대안적으로, 일부 상황에서, 이러한 조성물의 투여를 감독하는 의료 진료의에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 비교적 짧은, 또는 비교적 장기간에 걸쳐 AAV 벡터 조성물의 다중 또는 연속 투여를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 포유동물에게 투여되는 감염성 입자의 수는 대략적으로 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013개, 또는 심지어 그 초과의 감염성 입자/ml일 수 있고, 이는 치료될 특정한 질환 또는 장애의 요법을 달성하는데 필요할 수 있는 바와 같이 단일 용량으로 주어질 수 있거나 또는 2회 이상의 투여로 분할되어 주어질 수 있다. 실제로, 특정 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 AAV 벡터 조성물을 단독으로, 또는 1종 이상의 다른 치료 약물과 조합하여 투여하여 특정한 치료 요법의 목적하는 효과를 달성하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 1일 및 단위 투여량은 사용되는 치료 rAAV 조성물의 활성, 치료될 질환 또는 상태, 투여 방식, 개별 대상체의 요건, 치료될 질환 또는 상태의 중증도, 및 진료의의 판단을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 변수에 따라 변경된다.
일부 실시양태에서, 치료 rAAV 조성물의 투여는 매시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 또는 10년마다 1회이다. 유효 투여량 범위는 치료에 대한 대상체의 반응에 기초하여 조정될 수 있다. 일부 투여 경로는 다른 경로보다 더 높은 농도의 유효량의 치료제를 필요로 할 것이다.
본 개시내용의 이점을 감안하면 예상되지는 않지만, 환자의 상태가 개선되지 않는 특정 실시양태에서, 의사의 판단에 따라 치료 rAAV 조성물의 투여는 환자의 질환 또는 상태의 증상을 호전시키거나 또는 달리 제어 또는 제한하기 위해 만성적으로, 즉 환자의 삶의 지속기간 전반을 포함한 연장된 기간 동안 투여된다. 환자의 상태가 개선되는 특정 실시양태에서, 투여되는 치료 rAAV 조성물의 용량은 특정 시간 길이 (즉, "휴약기") 동안 일시적으로 감소되거나 또는 일시적으로 중지될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 휴약기의 길이는 2일 내지 1년, 예컨대 단지 예로서 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 또는 28일 초과이다. 휴약기 동안 용량 감소는, 단지 예로서 10%-100%, 예컨대 단지 예로서 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%이다. 특정 실시양태에서, 투여되는 약물의 용량은 특정 시간 길이 (즉, "약물 전환기") 동안 일시적으로 감소되거나 또는 일시적으로 중지될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 약물 전환기의 길이는 2일 내지 1년, 예컨대 단지 예로서 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 또는 28일 초과이다. 약물 전환기 동안 용량 감소는, 단지 예로서 10%-100%, 예컨대 단지 예로서 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%이다. 적합한 시간 길이 후에, 정상 투여 스케줄이 임의로 복원된다.
일부 실시양태에서, 환자 상태의 개선이 발생하면, 필요한 경우에 유지 용량이 투여된다. 후속적으로, 구체적 실시양태에서, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 다는 증상의 함수로서 개선된 질환, 장애 또는 상태가 유지되는 수준으로 감소된다. 그러나, 특정 실시양태에서, 환자는 증상의 임의의 재발 시 장기적인 간헐적 치료를 필요로 한다.
이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50 및 ED50의 결정을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 결정된다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 LD50과 ED50 사이의 비로 표현된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간을 포함한 포유동물에서 사용하기 위한 치료상 유효한 1일 투여량 범위 및/또는 치료상 유효한 단위 투여량을 제제화하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 rAAV 조성물의 투여량은 최소 독성을 갖는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 특정 실시양태에서, 1일 투여량 범위 및/또는 단위 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라진다.
키트
본원에 개시된 조성물을 포함하는 키트가 본원에 개시된다. 또한 중추 신경계 (CNS), 말초 신경계 (PNS), 또는 표적 기관 또는 환경 (예를 들어, 폐, 심장, 간)의 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 키트가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 질환 또는 상태는 암, 병원체 감염, 폐 질환 또는 상태, 신경계 질환, 근육 질환, 또는 면역 장애, 예컨대 본원에 기재된 것이다. 한 실시양태에서, 키트는 치료 핵산 (예를 들어, 치료 핵산)을 포함한 이종 핵산을 캡시드화한 rAAV 입자 및 본 개시내용의 재조합 AAV (rAAV) 캡시드 단백질의 조성물의 유효량을 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 rAAV에 의해 변형된 세포 ("변형된 세포")의 유효량을, 치료 핵산을 발현하는 단위 투여 형태로 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 치료 조성물을 함유할 수 있는 멸균 용기를 포함하고; 이러한 용기는 박스, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 합지, 금속 호일, 또는 의약을 수용하기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.
일부 경우에, rAAV는 질환 또는 상태 (예를 들어, CNS, PNS, 간 등의 질환)를 갖거나 또는 발생할 위험이 있는 대상체에게 rAAV를 투여하는 것에 대한 지침서와 함께 제공된다. 지침서는 일반적으로 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 관한 정보를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 키트는 동종 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 게놈 변형을 포함할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 "기성" 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 임상 용도를 위해 확장될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 연구 목적을 위한 내용물을 함유할 수 있다.
일부 경우에, 지침서는 치료 rAAV 조성물의 설명; 본원에 개시된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 투여량 스케줄 및 투여; 예방조치; 경고; 적응증; 반대-적응증; 과다투여 정보; 유해 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고사항 중 적어도 1개를 포함한다. 지침서는 (존재하는 경우) 용기 상에 직접적으로, 또는 용기에 도포된 라벨로서, 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급된 개별 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다. 일부 경우에, 지침서는 rAAV를 대상체에게 단독으로 투여하는 절차를 제공한다. 일부 경우에, 지침서는 본원에 개시된 추가의 치료제를 투여하기 적어도 약 1시간 (hr), 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 또는 최대 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후 또는 그 전에 rAAV를 대상체에게 투여하는 절차를 제공한다. 일부 경우에, 지침서는 rAAV가 정맥내 주사용으로 제제화되었음을 제공한다. 일부 경우에, 지침서는 rAAV가 비강내 투여용으로 제제화되었음을 제공한다.
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 경우를 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "비롯한", "비롯하다", "갖는", "갖다", "함께" 또는 그의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 경우에, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 주어진 값의 실시당 1 또는 1 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재된 경우에, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 특정한 값에 대한 허용 오차 범위를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 사용된 "로 본질적으로 이루어진"은, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용된 경우에, 언급된 목적을 위해 조합물에 대해 임의의 본질적으로 유의한 다른 요소는 배제한다는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 청구된 개시내용의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계, 예컨대 여드름, 습진, 건선 및 장미증과 같은 피부 장애를 치료하기 위한 조성물은 배제하지 않을 것이다.
용어 "상동", "상동성" 또는 "퍼센트 상동성"은 일반적으로 참조 서열과 동일하거나 유사한 서열을 갖는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 서열의 퍼센트 상동성은 본 출원의 출원일 현재 가장 최근의 BLAST 버전을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "증가된" 또는 "증가"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양의 증가를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "증가된" 또는 "증가"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준, 표준물, 또는 대조군과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가 또는 최대 및 100%를 포함한 증가 또는 10-100%의 임의의 증가를 의미한다. "증가"의 다른 예는 참조 수준과 비교하여 적어도 2-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배 또는 그 초과의 증가를 포함한다.
용어 "감소된" 또는 "감소"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양의 감소를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, "감소된" 또는 "감소"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 감소, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 감소 또는 최대 및 100%를 포함한 감소 (예를 들어, 참조 수준과 비교하여 부재 수준 또는 비-검출가능한 수준), 또는 10-100%의 임의의 감소를 의미한다. 마커 또는 증상과 관련하여, 이들 용어는 이러한 수준의 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들어 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 초과일 수 있고, 바람직하게는 주어진 질환을 갖지 않는 개체에 대한 정상 범위 내로서 허용되는 수준까지이다.
용어 "대상체"는 임의의 유기체이다. 일부 경우에, 유기체는 포유동물이다. 포유동물의 비제한적 예는 포유동물 부류의 임의의 구성원: 인간, 비-인간 영장류 예컨대 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 가축 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가정용 동물 예컨대 토끼, 개, 및 고양이; 설치류, 예컨대 래트, 마우스 및 기니 피그를 포함한 실험 동물 등을 포함한다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다. 본원에 사용된 용어 "동물"은 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 한 실시양태에서, "비-인간 동물"은 포유동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스이다. 일부 경우에, 대상체는 환자이고, 이는 본원에 사용된 바와 같이 특정한 질환 또는 장애를 갖는 것으로 진단된 대상체를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는, 임의로 코딩 서열의 상류 또는 하류에 위치할 수 있는 연관된 조절 영역, 예컨대 프로모터, 오퍼레이터, 종결인자 등과 함께, 개별 단백질을 코딩하는 핵산 또는 RNA (또한 "코딩 서열" 또는 "코딩 영역"으로도 지칭됨)의 절편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 아데노-연관 바이러스 또는 그의 유도체를 지칭한다. AAV의 비제한적 예는 AAV 유형 1 (AAV1), AAV 유형 2 (AAV2), AAV 유형 3 (AAV3), AAV 유형 4 (AAV4), AAV 유형 5 (AAV5), AAV 유형 6 (AAV6), AAV 유형 7 (AAV7), AAV 유형 8 (AAV8), AAV 유형 9 (AAV9), AAV 유형 10 (AAV10), AAV 유형 11 (AAV11), AAV 유형 12 (AAV12), 새 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. 일부 경우에, AAV는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하는 "영장류 AAV"로서 기재된다. 마찬가지로, AAV는 소 동물을 감염시킬 수 있다 (예를 들어, "소 AAV" 등). 일부 경우에, AAV는 야생형 또는 자연 발생 AAV이다. 일부 경우에 AAV는 재조합 AAV이다.
본원에 사용된 용어 "AAV 캡시드"는 아데노-연관 바이러스의 캡시드 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 유전자 정보 (예를 들어, 트랜스진, 치료 핵산, 바이러스 게놈)를 캡시드화하도록 구성된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 AAV 캡시드는 변이체 AAV 캡시드이고, 이는 일부 경우에 모 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 변형된 모 AAV 캡시드임을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "향성"은 캡시드화된 유전자 정보를 제2 생체내 환경에 비해 한 생체내 환경 내에서 발현하는 것에 대한 특이성 및/또는 그의 효율의 증가 또는 감소를 포함할 수 있는 AAV 캡시드의 품질 또는 특징을 지칭한다. 생체내 환경은 일부 경우에 세포-유형이다. 생체내 환경은 일부 경우에 조직, 기관, 또는 기관계이다.
본원에 사용된 용어 "AAV 게놈"은 바이러스와 관련된 유전자 정보를 코딩하는 핵산 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 경우에, 게놈은 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 플랭킹된 핵산 서열을 포함한다. AAV 게놈은 재조합 유전학 방법을 사용하여 생성된 재조합 AAV 게놈일 수 있고, 이는 ITR 서열에 플랭킹된 이종 핵산 (예를 들어, 트랜스진)을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "AAV 입자" 또는 "AAV 벡터"는 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 플랭킹된 핵산 서열을 포함하는 이종 DNA 폴리뉴클레오티드, 또는 "게놈"이 내부에 패키징된 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 바이러스 또는 비리온을 지칭한다. 일부 경우에, AAV 입자는 모 AAV 입자에 비해 변형된다.
용어 "유전자 생성물" 또는 "유전자 발현 생성물"은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 생성물 예컨대 예를 들어 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 또는 간섭 RNA (예를 들어, siRNA, miRNA, shRNA) 및 메신저 RNA (mRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RNA를 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 2개 이상의 요소 사이의 기능적 관계를 가능하게 하는, 서로 시스로, 및 일부 경우에, 서로 옆에 존재하는 2개 이상의 요소 (예를 들어, 유전 요소 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결 신호 서열, 폴리아데닐화 서열 등)의 위치를 지칭한다. 하나의 비제한적 예에서, 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 전사의 개시를 가능하게 한다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 비교되는 나머지 엔티티의 것과 유전자형상 구별되는 엔티티로부터 유래된 유전 요소 (예를 들어, 코딩 영역) 또는 유전자 발현 생성물 (예를 들어, RNA, 단백질)을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "내인성"은 유기체 또는 유기체 내의 특정한 세포에서 자연 발생하거나 또는 그와 연관된 유전 요소 (예를 들어, 코딩 영역) 또는 유전자 발현 생성물 (예를 들어, RNA, 단백질)을 지칭한다.
본원에 사용된 "검출가능한 모이어티"는, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 검출될 수 있는 화합물 또는 생체분자에 공유 또는 비공유 부착될 수 있는 모이어티를 지칭한다. 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 공유 부착된다. 검출가능한 모이어티는 부착된 화합물 또는 생체분자의 영상화를 제공할 수 있다. 검출가능한 모이어티는 2개의 화합물 사이의 접촉을 나타낼 수 있다. 예시적인 검출가능한 모이어티는 형광단, 항체, 반응성 염료, 방사성-표지된 모이어티, 자기 조영제, 및 양자점이다. 예시적인 형광단은 플루오레세인, 로다민, GFP, 쿠마린, FITC, 알렉사 플루오르, Cy3, Cy5, 바디피, 및 시아닌 염료를 포함한다. 예시적인 방사성핵종은 플루오린-18, 갈륨-68 및 구리-64를 포함한다. 예시적인 자기 조영제는 가돌리늄, 산화철 및 철 백금, 및 망가니즈를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 장애, 질환, 또는 상태; 또는 장애, 질환, 또는 상태와 연관된 증상 중 1종 이상의 완화 또는 제거; 또는 장애, 질환, 또는 상태 자체의 원인의 완화 또는 근절을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감 및 진정 또는 개선된 예후를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료 유효량"은 투여된 경우, 장애, 질환, 또는 질환의 상태의 증상 중 1종 이상의 발생을 예방하거나 또는 어느 정도까지 완화시키기에 충분한 화합물 또는 요법의 양; 또는 연구원, 수의사, 의사, 또는 임상의에 의해 추구되는 세포, 조직, 계, 동물, 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 담체", "제약상 허용되는 부형제", "생리학상 허용되는 담체" 또는 "생리학상 허용되는 부형제"는 제약상 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 성분은 제약 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미로 "제약상 허용될" 수 있다. 이는 또한 합리적인 이익/위험 비에 상응하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합할 수 있다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition; Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005; and Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition; Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004)]을 참조한다.
용어 "제약 조성물"은 본원에 개시된 화합물과 다른 화학적 성분, 예컨대 희석제 또는 담체의 혼합물을 지칭한다. 제약 조성물은 유기체에의 화합물의 투여를 용이하게 할 수 있다. 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는 화합물 투여의 다수의 기술이 관련 기술분야에 존재한다.
"샘플"의 비제한적 예는 핵산 및/또는 단백질이 수득될 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 비제한적 예로서, 이는 전혈, 말초 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 점액, 소변, 정액, 림프, 분변 추출물, 협부 스왑, 세포 또는 다른 체액, 또는 외과적 생검 또는 외과적 절제를 통해 수득된 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조직을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 환자로부터 직접 수득된다. 대안적으로, 샘플은 1차 환자 유래 세포주, 또는 보존된 샘플 형태의 보관된 환자 샘플, 또는 신선한 동결 샘플을 통해 수득될 수 있다.
실시예
실시예 1. rAAV의 생산 방법
재조합 AAV (rAAV)를 생산한다. 3개의 플라스미드 벡터를 표준 형질감염 프로토콜 (예를 들어, PEI에 의함)을 사용하여 불멸화된 HEK293 세포 내로 삼중-형질감염시킨다. 제1 벡터는 모 AAV 바이러스로부터의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 플랭킹된 트랜스진 카세트를 함유한다. 트랜스진 카세트는 프로모터 서열을 갖고, 이는 표적 세포의 핵에서 이종 핵산의 전사를 구동한다. 제2 벡터는 AAV Rep 유전자, 뿐만 아니라 변형된 Cap 유전자, 예를 들어 AAV2/9 REP-AAP-ΔCap)를 코딩하는 핵산을 함유한다. 변형된 Cap 유전자는 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호: 12740-25468, 35472-45474, 및 46364-46383 중 어느 하나를 포함한다. 변형된 Cap 유전자는, 일부 경우에, 아미노산 위치 452-458에서 7량체 치환체를 갖는 전장 VP1 단백질을 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호: 46404-46423 중 어느 하나를 포함한다. 제3 벡터는 바이러스 어셈블리 및 변형된 캡시드 구조 내로의 이종 핵산의 패키징에 필요한 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산을 함유한다.
바이러스 입자를 형질감염 후 72시간 후에 배지로부터, 및 형질감염 후 120시간째에 세포 및 배지로부터 수거한다. 배지에 존재하는 바이러스를 8% 폴리(에틸렌 글리콜) 및 500 mM 염화나트륨에 의한 침전에 의해 농축시키고, 침전된 바이러스를 수집된 세포로부터 제조된 용해물에 첨가한다. 바이러스를 아이오딕사놀 (옵티프렙, 시그마) 단계 구배 (15%, 25%, 40% 및 60%)를 통해 정제한다. 바이러스를 농축시키고, PBS 중에 제제화한다. 바이러스 역가를, qPCR 및 대조군으로서 선형화된 게놈 플라스미드를 사용하여 DNaseI-저항성 벡터 게놈 카피 (VG)의 수를 측정함으로써 결정한다.
실시예 2. 변형된 캡시드 단백질의 확인 방법
플라스미드.
아미노산 452-458을 모든 가능한 변이로 치환시키기 위해 NNK 변성 프라이머 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.), IDT)를 사용하여 아미노산 450-599 사이의 AAV9-PHP.eB 캡시드 게놈 절편의 증폭에 의해 제1 라운드 바이러스 DNA 라이브러리를 생성하였다. 이어서, 생성된 라이브러리 삽입물을 이전에 기재된 바와 같은 깁슨 어셈블리를 통해 rAAV-ΔCap-인-시스-Lox 플라스미드 내로 도입하였다. 생성된 캡시드 DNA 라이브러리, rAAV-Cap-인-시스-Lox는 아미노산 수준에서 ~12억 8천만개의 다양한 변이체를 함유하였다. 제2 라운드 바이러스 DNA 라이브러리를 제1 라운드와 유사하게 생성하되, 452-458 위치에서 NNK 축중성 프라이머 대신, 합성된 올리고 풀 (트위스트 바이오사이언스(Twist Bioscience))을 사용하여 선택된 변이체만을 생성하였다. 이러한 제2 라운드 DNA 라이브러리는 아미노산 수준에서 ~82,000개의 다양한 변이체를 함유하였다.
라이브러리 바이러스 생산을 위해 HEK293T 세포 내로 형질감염시킨 AAV2/9 REP-AAP-ΔCap 플라스미드는 이전에 사용된 AAV2/9 REP-AAP 플라스미드로부터 450-592 사이의 아미노산의 결실에 의해 변형시켰다. 이러한 변형은 바이러스 라이브러리 생산 동안 라이브러리 삽입물을 함유하는 rAAV-ΔCap-인-시스-Lox로 공동-형질감염된 이러한 플라스미드 사이에서의 가능한 재조합 사건 후에 AAV9 캡시드의 생산을 방지한다.
2개의 rAAV 게놈을 본 연구에 사용하였다. 제1, pAAV-CAG-m네온그린은 편재성 CMV-β-액틴-인트론-β-글로빈 하이브리드 프로모터 (CAG)의 제어 하에 형광 단백질 m네온그린을 함유하는 단일-가닥 (ss) rAAV 게놈을 사용한다. 제2, pAAV-CAG-NLS-GFP (애드진(Addgene) #104061)는 CAG 프로모터의 제어 하에 2개의 핵 국재화 부위, PKKKRKV (서열식별번호: 45486)에 플랭킹된 형광 단백질 EGFP를 함유하는 ssAAV 게놈을 사용한다.
바이러스 생산
재조합 AAV는 문헌 [Challis, R. C. et al., Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat. Protoc. 14, 379 (2019)]에 기재되어 있다. 간략하게, 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여 HEK293T 세포 (ATCC)의 삼중 형질감염을 수행하고, 120시간 후에 세포 용해물 및 배지 둘 다로부터 바이러스를 수집하고, 아이오딕사놀 (옵티프렙, 시그마) 상에서 정제하였다.
바이러스 라이브러리의 형질감염 및 정제에 변형된 프로토콜을 사용하였다. 먼저, 모자이크 캡시드 형성을 방지하기 위해, 오직 10ng의 rAAV-Cap-인-시스-Lox 라이브러리 DNA만을 형질감염시켜 (150mm 플레이트당) 다중 라이브러리 DNA가 동일한 세포에 진입할 가능성을 감소시켰다. 두번째로, 생산자 세포의 2차 형질도입을 제한하기 위해 바이러스를 120시간 대신 60시간 후에 수집하였다. 마지막으로, 표준 프로토콜에서 수행된 바와 같이 배지로부터 바이러스 입자를 PEG 침전시키는 대신, 아이오딕사놀 상에 로딩하기 위해 배지를 >60-배 농축시켰다. 이러한 단계를 수행하여 PEG 침전 동안 얼마간 관찰되는 응집 및 바이러스 다양성의 손실을 방지하였다.
동물
모든 설치류 절차는 캘리포니아 공과대학교의 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 다양한 세포-유형 특이적 프로모터의 제어 하에 Cre를 발현하는 트랜스제닉 동물, 뿐만 아니라 C57Bl/6J WT 마우스 (000664)를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory) (JAX)로부터 구입하였다. 트랜스제닉 마우스는 Syn1-Cre (3966), GFAP-Cre (012886) 및 Tek-Cre (8863)를 포함하였다. 바이러스 라이브러리의 라운드 1 및 라운드 2 선택을 위해, 각각의 트랜스제닉 계통의 8-12주령의 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷 마우스, 뿐만 아니라 단일 수컷 C57Bl/6J를 사용하였다. 개별 바이러스 변이체의 검증을 위해, 6-8주령의 수컷 C57Bl/6J 마우스를 사용하였다. rAAV 벡터의 정맥내 투여를 안와후 부비동 내로의 주사를 통해 수행하였다.
바이러스 라이브러리 회수 및 서열분석
라운드 1 및 라운드 2 바이러스 라이브러리를 C57Bl/6J 및 Cre-트랜스제닉 동물 내로 8x1010개 vg/동물의 용량으로 주사하였고, rAAV 게놈을 주사 2주 후에 회수하였다. 마우스를 안락사시키고, 대부분의 주요 기관을 회수하고, 드라이 아이스 상에서 순간 동결시키고, -80℃의 장기간 저장소에 넣었다. 조직은 뇌, 척수, DRG, 간, 폐, 심장, 위, 장, 신장, 비장, 췌장, 골격근 및 지방 조직을 포함하였다. 각각의 조직 100mg (뇌 반구의 경우 ~250mg, DRG의 경우 <100mg)을 비드버그(BeadBug) (벤치마크 사이언티픽(Benchmark Scientific), D1036)를 사용하여 트리졸(Trizol) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 15596) 중에 균질화하고, 바이러스 DNA를 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 단리하였다. 회수된 바이러스 DNA를 RNase로 처리하고, SmaI (ITR 내에서 발견됨)로 제한 소화시켜 PCR에 의한 추후 rAAV 게놈 회수를 개선시키고, 자이모 DNA 클린 및 콘센트레이터 키트 (D4033)를 사용하여 정제하였다. 선택 트랜스제닉 계통에서 Cre-레콤비나제에 의해 플리핑된 (또는 WT 동물에서 사전-플리핑된) 바이러스 게놈을 하기 프라이머: 5'-CTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAAC-3' (서열식별번호: 45487) 및 5'-CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG-3' (서열식별번호: 45488)를 사용하여, 주형으로서 총 추출된 바이러스 DNA의 50%를 함유하는 5개의 25μl 반응물 중에서 Q5 DNA 폴리머라제를 사용하여, 10s 동안 98℃, 15s 동안 60℃ 및 40s 동안 72℃의 25회 주기 후에 선택적으로 회수하였다.
자이모 DNA 정제 후에, WT C57Bl/6J 동물로부터의 샘플을 1:10-1:10,000으로 연속 희석하고, 각각의 희석물을 라이브러리 가변 영역 주위에서 추가로 증폭시켰다. 이러한 증폭은 프라이머: 5'- ACGCTCTTCCGATCTAATACTTGTACTATCTCTCTAGAACTATT-3' (서열식별번호: 45489) 및 5'-TGTGCTCTTCCGATCTCACACTGAATTTTAGCGTTTG-3' (서열식별번호: 45490) 및 10s 동안 98℃, 15s 동안 61℃ 및 20s 동안 72℃의 10회 주기를 사용하여 수행하여 21bp 가변 영역 주위 및 이를 포함한 바이러스 게놈 73bp를 회수하였고, 일루미나 차세대 서열분석을 위한 어댑터를 부가하였다. PCR 세정 후에, 이들 생성물을 일루미나 서열분석을 위한 NEBNext 듀얼 인덱스 프라이머 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), E7600)를 사용하여, 10초 동안 98℃, 15초 동안 60℃ 및 20초 동안 72℃의 10 주기 후에 추가로 증폭시켰다. 증폭 생성물을 210bp 밴드의 보다 우수한 분리 및 회수를 위해 2% 저-융점 아가로스 겔 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 162050) 상에서 전개시켰다. 일련의 희석물을 각각의 WT 조직에 대해 분석하고, 트랜스제닉 동물 조직으로부터 바이러스 DNA의 추가의 증폭을 위해 어떠한 생성물도 생성하지 않은 최고 농도 희석물을 선택하였다. 이 과정을 수행하여 동물에서 패키징 전에 플리핑된 바이러스 게놈 또는 Cre로 인해 플리핑된 바이러스 게놈 사이를 구별하였다. NGS 서열분석 결과에서 가양성을 최소화하기 위해 사전-플리핑된 바이러스 게놈은 회피되어야 한다.
사전-플리핑된 바이러스 게놈을 함유하지 않는 생성물을 생성하는 희석물을 사용하여, 트랜스제닉 동물 조직으로부터의 모든 Cre-플리핑된 바이러스 게놈을 유사하게 증폭시켜 일루미나 서열분석 어댑터를 부가하고, 후속적으로 지수 표지화하였다. 이제 각각의 동물로부터 각각의 조직에 대해 특유한 지수를 함유하는 증폭된 생성물을 저융점 아가로스 겔 상에서 전개시키고, 지모클린(Zymoclean) 겔 DNA 회수 키트를 사용하여 정확한 밴드를 추출하고 정제하였다.
바이러스 캡시드의 소화 및 함유된 ssDNA의 정제에 의해 주사된 바이러스 라이브러리로부터 패키징된 바이러스 라이브러리 DNA를 단리하였다. 이들 바이러스 게놈을 조직으로부터 추출된 바이러스 DNA와 같이 2개의 PCR 증폭 단계에 의해 증폭시켜 일루미나 어댑터에 이어서 지수를 부가한 다음, 겔 전기영동 후에 추출 및 정제하였다. 이러한 바이러스 라이브러리 DNA를 조직으로부터 추출된 바이러스 DNA와 함께 일루미나 HiSeq 2500 시스템 (밀라드 앤드 뮤리엘 야콥스 제네틱스 앤드 게노믹스 래보러토리(Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory), 칼텍)을 사용하는 심층 서열분석을 위해 전송하였다.
NGS 데이터 정렬 및 프로세싱
NGS 실행으로부터의 미가공 fastq 파일을 맞춤 제작물로 프로세싱하였고, 이는 데이터를 AA 452-458 사이에 21bp 다양화된 영역을 함유하는 AAV9 주형 DNA 단편과 정렬시켰다. 이들 데이터세트를 프로세싱하기 위한 파이프라인은 저-품질의 판독을 제거하기 위한 필터링, 각각의 서열에 대한 품질 점수의 이용 및 PCR-유도된 돌연변이 또는 높은 GC-함량으로부터의 편향 제거를 수반하였다. 이어서, 필터링된 데이터세트를 완벽한 스트링 매치 알고리즘에 의해 정렬하고 트리밍하여 정렬 품질을 개선시켰다. 그 후, 각각의 서열에 대한 판독 카운트를 추출하고, 특정 조직 내에서 발견된 서열의 상대 존재비/주사된 바이러스 라이브러리 내에서의 그러한 서열의 상대 존재비로 정의되는 그의 풍부화 점수와 함께 디스플레이하였다.
풍부화 정량화. 표적 조직에서의 특정 변이체의 풍부화를 그 조직 내에서의 전체 라이브러리를 참조하여 계산하고, 이를 주사된 바이러스 라이브러리 내의 변이체의 출현율에 대해 정규화된 표적 조직 내의 변이체의 출현율로 정의하였다.
Figure pct00005
양성 풍부화 점수는 AAV 변이체가 주사된 바이러스 라이브러리에서보다 조직에서 더 보편적으로 발견되는 경우에 달성되고, 음성 풍부화 점수는 AAV 변이체가 덜 보편적으로 발견되는 경우에 달성된다. 풍부화 점수 0은 변이체가 조직 및 주사된 바이러스 라이브러리에서 정확하게 동일한 출현율로 발견되었음, 또는 표적 조직에서 특정 변이체의 판독 카운트가 없었음, 즉 변이체를 조직에서 검출할 수 없음을 의미한다. 전자는 가능성이 없기 때문에, 풍부화 점수 0은 변이체가 조직에 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 해석된다. 따라서, AAV 변이체는 그 조직에서의 그의 풍부화 점수가 0 이하인 경우에 조직을 탈표적화하는 것으로 결정되었다. 그의 모 AAV 벡터 AAV9에 비해 풍부화 점수 0을 갖는 다수의 AAV 변이체로부터의 간 형질도입의 생체내 특징화는 이러한 해석이 정확하였음을 입증하였다 (예를 들어, 도 17d, e 참조).
조직 제조 및 면역조직화학
마우스를 유타솔로 안락사시키고, 빙냉 1x PBS 및 이어서 새로이 제조한 1x PBS 중 빙냉 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 경심 관류시켰다. 모든 기관을 절제하고 48시간 동안 4℃에서 4% PFA 중에 후-고정시킨 다음, 바이브라톰으로 절편화하였다. 10% 당나귀 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중에서 1차 및 2차 항체를 사용하여 부유 절편에 대한 IHC를 수행하였다. 사용된 1차 항체는 토끼 항-NeuN (1:200, 압캠(Abcam), 177487), 토끼 항-S100 (1:200, 압캠, 868), 토끼 항-Olig2 (1:200, 압캠, 109186) 및 토끼 항-칼빈딘 (1:200, 압캠, 25085)이었다. 1차 항체 인큐베이션을 실온 (RT)에서 16-20시간 동안 수행하였다. 이어서, 절편을 세척하고, 2차 알렉사-647 접합된 항-토끼 FAB 단편 항체 (1:200, 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 711-607-003)와 함께 RT에서 6-8시간 동안 인큐베이션하였다. 핵 염색을 위해, 부유 절편을 0.2% 트리톤 X-100 및 DAPI (1:1000, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 10236276001)를 함유하는 PBS 중에서 6-8시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척하였다. 이어서, 염색된 절편을 프로롱 다이아몬드 안티페이드 마운탄트(ProLong Diamond Antifade Mountant) (써모피셔 사이언티픽, P36970)로 마운팅하였다.
영상화 및 정량화
모든 CAG-m네온그린 발현 조직을 자이스 LSM 880 공초점 현미경 상에서 플루어 5x 0.25 M27 대물렌즈를 사용하여, 동일한 조직의 모든 샘플에 걸쳐 매칭시킨 레이저 출력, 이득 및 감마로 영상화하였다. 획득된 영상을 젠 블랙 2.3 SP1 (자이스(Zeiss))에서 프로세싱하였다.
모든 CAG-NLS-GFP 발현 조직을 키엔스(Keyence) BZ-X 올인원 형광 현미경 상에서 48-비트 해상도로 하기 대물렌즈: 플랜아포(PlanApo)-λ 20x/0/75 (1mm 작업 거리) 또는 플랜아포-λ 10x/0.45 (4mm 작업 거리)를 사용하여 영상화하였다. 항체 염색에 대한 GFP 발현의 공동국재화를 위해, 일부 경우에 녹색 (GFP) 채널에 대한 노출 시간을 조정하여 과다포화를 피하면서 고발현 및 저발현 세포의 영상화를 용이하게 하였다. 샘플 사이에서 형광 강도를 비교하는 모든 경우에, 노출 설정 및 감마 또는 대조에 대한 변화를 영상에 걸쳐 유지시켰다. 편향을 최소화하기 위해, 뇌 영역 및 말초 기관당 다수의 영상 영역을 각각의 샘플에 대해 획득하였다. 뇌 영역의 경우, 영상 영역을 샘플 사이에 매칭시키고, GFP 신호가 아닌 항체 염색에 기초하여 선택하였다. 말초 조직의 경우, 관찰자 편향을 배제하기 위해 DAPI 또는 항체 염색에 기초하여 영상 영역을 선택하였다.
모든 영상 프로세싱은 키엔스 BZ-X 분석기를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석은 마이크로소프트 엑셀 2018 및 그래프패드 프리즘 7을 사용하여 수행하였다. GFP 신호와 항체 또는 DAPI 염색 사이의 공동국재화는 하이브리드 세포 카운트 자동화 플러그인이 장착된 키엔스 BZ-X 분석기를 사용하여 수행하였다. 자동화 카운트를 확인하고, 수동 핸드-카운트와의 비교에 의해 상용적으로 모니터링하였고, 수동 카운트에 대해 오차 한계 미만인 것으로 확인되었다.
샘플 사이에서 뇌 전반에 걸친 총 세포 카운트 및 형광 강도를 비교하기 위해, 정중선으로부터 1200 μM에 위치하는 전체 시상면 절편을 매칭된 노출 조건을 사용하여 키엔스 BZ-X 자동화 XY 스티칭 모듈로 영상화하였다. 이어서, 스티칭 영상을 키엔스 BZ-X 분석기 스위트에서 탈구축하고, 하이브리드 세포 카운트 자동화 플러그인을 통해 실행시켜 전체 시상면 절편 내의 총 세포 수를 카운팅하였다. 시상면 절편 전체에 걸쳐 모든 GFP 양성 세포의 마스크를 생성하고 그 마스크의 통합 픽셀 강도를 측정함으로써 평균 형광 강도를 계산하였다. 총 통합 픽셀 강도를 총 세포 카운트로 나누어 세포 측정당 형광 강도를 수득하였다. 형광 강도에 대한 직접 비교가 이루어진 모든 경우에, 노출 설정 및 후가공 대조 조정을 샘플 사이에 매칭시켰다.
통계
마이크로소프트 엑셀 2018 및 그래프패드 프리즘 7을 통계 분석 및 데이터 표시에 사용하였다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 실험군은 n = 6이었고, 예비 데이터 및 실험 검정력 분석을 사용하여 결정하였다. 통계적 분석 및 그의 그래프화를 위해, 단일 데이터 포인트를 동물당 2개의 조직 절편으로 정의하였고, 가능한 경우 절편당 다수의 기술적 반복이 존재하였다. 기술적 반복은 각각의 관심 영역 또는 조직에 대한 하기의 수로의, 절편당 다수의 영상 영역으로 정의된다: 소뇌 = 3, 피질 = 4, 해마 = 3, 중뇌 = 1, 선조체 = 3, 시상 = 4, 간 = 4, 비장 = 2, 고환 = 2, 신장 = 2, 폐 = 2, 척추 = 1, DRG = 1, 전체 시상 = 1.
실시예 2. 바이러스 라이브러리의 Cre-의존성 양성 및 음성 선택의 개관
전신 투여 후 다른 기관을 제외하고 특정 기관에 대해 높은 효율을 갖는 AAV를 조작하기 위한 분명한 목적을 위해, 생체내 바이러스 변이체의 대형 라이브러리의 선택을 가능하게 하는 CREATE 스크리닝 방법의 업데이트된 버전 (M-CREATE)을 사용하였다. 도 1은 사용된 M-CREATE 방법의 개략도를 보여준다. CREATE를 사용하여, 특정 위치에서 돌연변이를 갖는 AAV 캡시드의 라이브러리를 PCR에 의해 축중성 프라이머를 사용하여 생성하고, Cre/Lox 부위에 플랭킹된 폴리아데닐화 부위를 갖는 그 자신의 게놈의 복제-부적격 버전을 패키징한 바이러스를 HEK293 세포에서 생산하고, 바이러스 라이브러리를 특정 세포 집단에서 Cre를 발현하는 트랜스제닉 동물 내로 주사하였다. 라이브러리의 변이체가 Cre를 발현하는 세포를 성공적으로 형질도입시키면, 그의 게놈은 플리핑되고, 이들 변이체의 서열은 Cre-의존성 방식으로 회수될 수 있다.
상이한 세포 집단에서 Cre를 발현하는 다수의 트랜스제닉 마우스 계통에서의 변이체의 선택을 수행하였다: 신체 전체에 걸쳐 내피 세포의 경우 Tek-Cre, CNS 및 PNS의 뉴런의 경우 hSyn1-Cre, 및 성상세포의 경우 GFAP-Cre. 선택을 다수의 트랜스제닉 계통에서 병행 수행함으로써, 양성 및 음성 선택 둘 다를 적용할 수 있고, 이에 의해 다른 것으로부터는 회수되지 않는, 특정 관심 조직으로부터의 표적 서열을 회수할 수 있다. 다음으로, 관심 조직으로부터 회수된 바이러스 DNA를 서열분석하고 지수화하였다. 이어서, 표적 환경 또는 관심 세포 유형에서의 출현율에 기초하여 서열을 등급화하였다. 라운드 1로부터의 상위 수행 서열만을 함유하는 제2-라운드 라이브러리를 합성하였다.
AAV9의 AA455 루프는 캡시드의 표면으로부터 가장 멀리 돌출되어 있고, 이전에 중화 항체 결합에 연루되었다. AAV에서 가장 통상적으로 조작되는 루프는 AA588 루프이며, 이는 AAV2의 헤파란 술페이트 결합 부위이고 펩티드 디스플레이에 적용가능한 부위이기 때문이다. AAV9에 대해 유일하게 공지된 수용체는 N-연결된 말단 갈락토스이지만, 많은 적응증은 다른 것을 암시한다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, AA455 루프는 또한 그 자체로 또는 AA588 루프와의 상호작용에 의해 세포-표면 수용체 결합에서 역할을 할 수 있다. AA455 루프에서의 변이체 아미노산 서열이 목적하는 AAV 향성에 기여하는지 결정하기 위해, rAAV를 조작하고, BBB를 횡단하는데 있어서의 증가된 효율을 위해 AA588 루프에서 이전에 조작된 AAV9의 변이체인 AAV-PHP.eB 내의 AA452-458 (도 1a-1b) 사이의 455 루프의 7개 아미노산 치환 라이브러리의 M-CREATE 방법을 사용하여 선택 라운드를 수행하였다.
실시예 3. 설치류에서 간 대신 폐에 대한 향성 편향을 갖는 AAV 캡시드 변이체
AAV.CAP-A4는 강한 폐-특이적 형질도입을 나타낸다
2 라운드의 생체내 선택 후에 다수의 표적에 대해 고도로 풍부화된 변이체를 발견하였다. 폐 풍부화에 대한 제2 라운드의 선택으로부터의 결과는 여러 후보 변이체를 생성하였고, 그 중 하나는 폐에서 유의한 풍부화를 나타내었고, 여러 말초 기관을 탈표적화하였다.
무작위로 선택된 변이체 (도 15a), 뿐만 아니라 장 뉴런에서 특이적으로 풍부화되는 것으로 발견된 이러한 스크린으로부터 대두된 제2 신규 캡시드를 비교로서 제공한다. 형질도입 효율을 직접 평가하기 위해, 후보 변이체에 대한 캡시드 서열을 AAV9 백본 내로 클로닝하고, 편재성 합성 프로모터 CAG에 의해 구동되는 형광 리포터 m네온그린을 패키징한 각각의 변이체에 대해 바이러스를 생산하였다. 이러한 구축물은 벡터에 의해 형질도입된 모든 세포 유형에서 형광 프로모터의 강한 발현을 구동시킬 것이고, 이에 의해 세포 및 조직 유형에 걸친 각각의 변이체의 형질도입의 시각적 판독을 제공할 것이다. 정제 후에, 대조군으로서 AAV9를 포함하는 각각의 변이체의 5 x 1011개 벡터 게놈 (vg)을 2마리의 수컷 c57bl/6 마우스 내로 주사하였다. 발현 2주 후에, 동물을 희생시키고, 관류 고정시키고, 기관 패널을 절편화하고, 형광에 대해 영상화하였다 (도 15b). 발현 패턴은 차세대 서열분석 (NGS) 결과를 확인시켜 주며, AAV.CAP-A4 (AACAACCTCCCCAGAAACCTC (서열식별번호: 46429)에 의해 코딩된 KDNTPGR (서열식별번호: 32538))는 폐 전체에 걸쳐 증가된 형질도입을 보여준다. 비교로서, AAV.CAP-A14는, NGS 결과에 따르면, 장 및 위 내의 뉴런에서의 증가된 발현을 보여준다.
AAV.CAP-A4가 폐의 증가된 형질도입을 나타내었음을 확인한 후, 대조군으로서 AAV9 및 AAV5와 함께 AAV.CAP-A4의 형질도입 효율을 저-용량 전신 주사 후 임상적으로 관련된 세포 유형에서 시간 경과에 따라 정량화하였다. 이들 실험을 위해, AAV.CAP-A4, AAV5, 및 AAV9를 연령-매칭된 수컷 마우스 내로 주사하고, 3주 (n=3) 또는 6개월 (n=3) 동안 발현되도록 하였다. 또한, 핵 국재화 서열 (NLS)을 CAG-GFP 발현 카세트 내로 클로닝하여 형광 리포터의 발현을 핵으로 국한시켰고, 이는 특정 항체 염색과의 공동-국재화를 보조하였다. 조직 제조 후, 각각의 변이체로부터의 폐의 연속 절편을 섬모 기도 상피 세포, 클라라 세포, 및 폐포 상피 유형 II (ATII) 세포에 대한 항체로 염색하였다 (도 16a). 정량화는 전신 주사된 AAV.CAP-A4가 점막하 세포를 AAV9보다 ~15배 더 큰 효율 및 AAV5보다 ~30배 더 큰 효율로 형질도입시킨다는 것을 보여준다 (도 16b). 유사하게, ATII 세포의 형질도입은 AAV9보다 ~30배 더 크고, AAV5보다 ~60배 더 크다 (도 16c). AAV.CAP-A4에 의해 형질도입된 총 세포 수 중에서, 이들 중 대략 60%는 ATII 세포이고, 다른 40%는 미지의 점막하 세포 유형이다 (도 3d). 이들 결과는 AAV.CAP-A4가 전신 투여 후 폐의 점막하 세포로의 전례없는, 비-침습적 유전적 접근을 제공하며, 이는 단독으로 또는 기도로의 직접 전달과 함께, CF 질환 진행을 감소시키기에 충분한 CFTR 기능을 제공할 수 있음을 입증한다.
도 4는 심장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 5는 장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 6은 신장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 7은 간에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 8은 근육에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 9는 췌장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 10은 비장에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 11은 위에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 12는 고환에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 13은 폐에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 14는 지방 조직에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
실시예 4. 설치류에서 간 대신 중추 및 말초 신경계에 대한 향성 편향을 갖는 AAV 캡시드 변이체
말초 발현으로부터 떨어진 AAV-PHP.eB 조작
제1 라운드의 선택 후에, 회수된 서열을 분석하였다. 제2 라운드를 합성하였고, 이는 말초 기관과 비교하여 뇌에서 풍부화된 대략 82,000개의 특유한 변이체를 함유하였다. 상위 수행 변이체를 두 자릿수만큼 좁히는 제2 라운드의 선택 후에, 뇌에 대해 높은 수준의 풍부화, 및 간 및 다른 말초 기관에 대해 음성 풍부화를 나타낸 (도 17c) 시험을 위한 작은 하위세트의 서열을 선택하였다 (도 4b). 이 하위세트를 야생형 마우스에서 개별적으로 시험하였고, CAG-m네온그린을 패키징한 5x1011개의 바이러스 게놈을 주사하고 2주 동안 발현되게 하였다. 뇌 및 간에서의 생성된 발현 (도 17d)은 차세대 서열분석 (NGS) 풍부화와 매우 밀접하게 상관되었고, 변이체 AAV.CAP-B10은 PHP.eB보다 뇌에서 더 높은 형광 및 무시가능한 간 형질도입을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
상기 결과는 뇌 및 말초 둘 다에 대한 NGS 풍부화 발견과 매칭된다. 이러한 경우에, PHP.eB를 제조하기 위한 AA588 루프에서의 삽입/치환은 뇌 표현형을 부여하는 것으로 보이며, 한편 AA455에서의 치환은 간 및 다른 말초 기관으로부터 이러한 표현형을 탈표적화한다. 제2 라운드의 선택을 포함하는 82,000개의 변이체 중에서, 대략 39,000개가 뇌에서 양성 풍부화 및 간에서 음성 풍부화를 나타내었다. 이들 결과는 NGS 결과가 생체내 성능의 정확한 프록시로서 사용될 수 있음을 입증하는 역할을 한다.
뇌 풍부화 및 간 탈표적화를 나타낸 ~39,000개 서열에 대해, 이러한 표현형을 발생시킨 아미노산 구성을 분석하였다. 7량체 치환 전반에 걸쳐 아미노산이 선택된 빈도를 분석하고, 특정 위치에서 풍부화된 아미노산의 히트 맵으로서 평균으로부터 그의 편차를 플롯팅하였다. 이들 양으로 풍부화된 아미노산은 CNS 풍부화를 보유하면서 간으로부터 캡시드를 탈-표적화한다.
AAV.CAP-B10은 CNS-특이적 형질도입을 나타낸다
AAV9 및 PHP.eB와 비교하여 AAV.CAP-B10의 성능을 완전히 특징화하기 위해, 핵 국재화된 CAG-EGFP를 패키징하고, 1x1011개 바이러스 게놈을 동물 내로 주사하였다. 3주 후에 발현을 측정하였다. 이 용량은 뇌로의 전신 전달을 사용한 이전 실험을 위한 평균 용량으로서 선택되었다. 결과는 AAV.CAP-B10과 PHP.eB 사이의 뇌에 형질도입된 세포의 평균 수, 뿐만 아니라 세포당 발현의 평균 수준의 증가를 보여주며, 둘 다 AAV9보다 매우 유의하게 더 높다 (도 18a-5c). 척수에서, AAV.CAP-B10은 PHP.eB의 효율의 대략 60%에서 수행하지만, 여전히 AAV9보다 거의 20-배 더 높다. 반대로, AAV.CAP-B10은 PHP.eB (~50-배) 및 AAV9 (>100-배) 둘 다와 비교하여 간에서 매우 유의하게 감소되며, PHP.eB와 비교하여 밝기/세포에서 약간, 그러나 유의하지는 않게 더 어둡고, 둘 다 AAV9보다 유의하게 더 어둡다 (~10-배) (도 18b-18d). 나머지 말초에서, 결과는 동일한 경향을 따르며, PHP.eB는 AAV9보다 더 낮고, AAV.CAP-B10은 PHP.eB의 분율이다 (도 18d).
AAV.CAP-B10은 강한 뉴런 편향을 나타낸다
PHP.eB와 비교하여 AAV.CAP-B10에 대해 뇌 내에서의 발현이 어떠한지 추가로 특징화하기 위해, 뉴런, 성상세포 및 핍지교세포를 염색하고, 뇌의 다양한 영역에서 그러한 세포-유형을 표적화하는 것에 대한 바이러스의 효율을 정량화하였다. AAV.CAP-B10 및 PHP.eB는 뇌 영역에 걸쳐 유사한 효율로 뉴런을 형질도입시켰지만 (도 19a-19b), 성상세포 및 핍지교세포는 PHP.eB와 비교하여 AAV.CAP-B10에 의해 전체 뇌에 걸쳐 대략 4-5-배 더 낮은 수준으로 표적화되었다 (도 19c, 19d, 19e, 19f). 이러한 결과는 AAV.CAP-B10 돌연변이에 의해 부여되는 다른 세포-유형과 비교하여 뉴런에 대한 편향을 나타내고, 이는 대부분 뇌 내의 성상세포를 표적화하는 AAV9로부터의 흥미로운 편차이다. AAV.CAP-B10에 대한 NGS 데이터 (도 15c)로부터의 흥미로운 표시는 소뇌에서의 변이체의 음성 풍부화였다. 소뇌에서 AAV.CAP-B10의 발현을 PHP.eB와 비교하여 특징화하면, 푸르킨예 세포의 형질도입에서 실제로 유의한, 대략 4-배 감소가 존재하였다 (도 22).
도 3은 중추 신경계 (CNS)에 특이적인 향성을 갖고 간을 탈표적화하는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다. 도 2는 CNS에 특이적인 향성을 갖는 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열, 및 7량체 변이체 AAV 캡시드 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
실시예 5. 비-인간 영장류에서 간 대신 중추 및 말초 신경계에 대한 향성 편향을 갖는 AAV 캡시드 변이체
설치류에서의 조작된 변이체의 치료 용도에 대한 주요 우려는 그의 형질도입 프로파일이 비-인간 영장류 (NHP)로 얼마나 잘 번역되는지이다. 따라서, 설치류에서 검증된 변이체의 하위세트의 NHP 형질도입 프로파일을 대조군으로서 AAV9 및 AAV-PHP.eB와 함께 특징화하였다. 8종의 바이러스, AAV9, AAV-PHP.eB, AAV.CAP-B1, AAV.CAP-B2, AAV.CAP-B8, AAV.CAP-B10, AAV.CAP-B18 및 AAV.CAP-B22의 풀을 생산하였고, 이는 각각 편재성 CAG 프로모터의 제어 하의 HA 태그부착된 프라탁신을 패키징하였다. 프라탁신의 사용은 그것이 신체 전반에 걸쳐 발현되는 내인성 단백질이기 때문에 선택되었고, 자연 발생 및 조작된 혈청형의 NHP 형질도입을 특징화하기 위한 이전의 노력은 GFP와 같은 외인성 트랜스진의 패키징으로 인한 잠재적으로 유해한 결과를 발견하였다. 각각 패키징된 FXN은 서열분석 후 하나의 바이러스의 기여를 나머지 것들과 구별하기 위한 별개의 12-염기 RNA 바코드를 함유하였다. 8종의 바이러스를 동등한 비로 풀링하고, 2마리의 성체 마모셋 내로 총 1.2 x 1014개 vg/kg으로 주사하였다. 6주 발현 후, 뇌 및 간을 회수하고, RNA 서열분석 및 면역조직화학을 위해 관상 절편을 채취하였다.
AAV.CAP-B10은 AAV9와 비교하여, 뇌에서 RNA 수준의 6-배 초과의 증가 및 간 RNA 수준의 5-배 초과의 감소를 보였다. 또 다른 선택된 변이체, AAV.CAP-B22는 뇌 RNA 수준의 12-배 초과의 증가를 보였고, 간 RNA 수준에서의 유의한 차이가 존재하지 않았다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이들 결과는 AAV.CAP-B22 및 AAV.CAP-B10이 뇌의 인간 질환의 치료를 위한 유망한 변이체 캡시드라는 것을 보여준다. 본 실시예에서는 선택된 수의 변이체를 시험하였지만, 이들 발견은 또한 임의의 표적 생체내 환경에서 AAV.CAP-B22 및 AAV.CAP-B10과 동등하거나 또는 더 큰 풍부화 점수를 갖는 본원에 기재된 다른 변형된 AAV 캡시드 단백질이 또한 인간 질환에 대한 유망한 치료 해결책을 제공할 것임을 시사한다.
실시예 6. 1A상 임상 시험 (헌팅톤병)
말기 헌팅톤병 (HD)을 갖는 대상체에서 서열식별번호: 2933, 88, 2466, 3943, 2672, 2743, 3064, 11958, 780, 2764, 및 2741 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열, 또는 표 3-4, 또는 도 2-3에 제공된 아미노산 서열 중 임의의 것을 갖는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 시험 조성물의 1-회 정맥내 주사의 안전성, 내약성, 약동학, 및 약역학을 평가하기 위해 1A상 임상 시험을 수행하였다. 적격 대상체는 21세 내지 65세의 남성 및 여성이다.
포함 기준: 적격 대상체는 21세 내지 65세의 남성 및 여성이다. (1) 국제 기능 장애 건강 분류 (ICF)에 서명 및 날짜기입; (2) ≥ 21 및 ≤ 65세의 남성 또는 여성 참가자; (3) 4번 염색체 상에 40개 이상 및 50개 이하의 다수의 CAG 반복부를 갖는 헌팅톤병임을 증명하는 의학 보고서 (PCR)를 제출한 참가자 (참가자가 검사를 수행하지 않은 경우 및/또는 이용가능한 보고서를 갖지 않은 경우, 새로운 검사가 수행되어야 함); (4) 등록 시 운동 평가 UHDRS 척도 (통합 헌팅톤병 등급화 척도)에서 5점 이상의 점수; (5) 등록 시 UHDRS 척도의 기능 능력에서 8 내지 11점의 점수를 갖는 대상체.
배제 기준: (1) 연구에의 등록 시 의학적 연구가 대상체에게 위험한 것으로 판단되는 임의의 의학적 관찰 데이터 (임상 및 물리적); (2) 연구에의 등록 시 의학적 연구가 대상체에게 위험한 것으로 판단되는 임의의 실험실 검사 데이터; (3) 간질 병력; (4) 주요 인지 장애의 진단; (5) 활성 대상부전성 정신 질환; (6) 현재 또는 이전의 신생물 병력; (7) 위장, 간, 신장, 내분비, 폐, 혈액, 면역, 대사 병리상태 또는 중증 및 비제어 심혈관 질환의 현재 병력; (8) 바이러스성, 박테리아성, 진균성이거나, 또는 또 다른 병원체에 의해 유발된 임의의 활성 감염의 진단; (9) 이 연구에서 수행되는 시험 중 임의의 것을 수행하는데 금기를 갖는, 예를 들어 박동조율기 또는 외과용 클립을 갖는 참가자; (10) 알콜 또는 불법 약물 오용의 이력; (11) 방문 V-4 전 2년 내에 1회 이상의 자살 에피소드 이력; (12) 적극적 흡연자 또는 등록 6개월 미만 전에 금연함; (13) 혈청학 시험: HIV 1 및 2 (항-HIV-1,2), HTLV I 및 II, HBV (HBsAg, 항-HBc), HCV (항-HCV-Ab) 및 VDRL (트레포네마 팔리둠) 중 적어도 1개에서 양성 시험; (14) 영상화를 위한 조영제, 또는 소 생성물을 포함한 약물 알레르기의 병력; (15) 임상시험용 제품의 제1 투여 후 최초 3개월 동안 면역억제 약물 또는 금지된 의약의 사용 또는 사용 예상; (16) 의료 연구자에 의해 참가자의 등록이 위험한 것으로 해석되는 임의의 임상 변화.
실험:
위약. 제0주에 위약의 1-회 주사.
고용량 시험. 제0주에 시험 조성물 2 x 10^10개 vg의 1-회 주사.
중간 용량 시험. 제0주에 시험 조성물 6 x 10^9개 vg의 1-회 주사.
저용량 시험. 제0주에 시험 조성물 2x 10^9개 vg의 1-회 주사.
최저 용량 시험. 제0주에 시험 조성물 2 x 10^8개 vg의 1-회 주사.
1차 결과 측정: 유해 사건, 활력 징후, 실험실 시험, ECG, 및 양성 및 악성 신생물의 발생에서의 변화를 주기적으로 모니터링하는 것에 의한 시험 조성물의 안전성 [시간 프레임: 5년]. 임상시험용 제품의 안전성은 (1) 임상시험용 제품 연구와 관련하여 측정된 유해 사건, 예컨대 유형, 빈도, 강도, 심각성, 중증도, 및 작용; (2) 활력 징후 (BP, HR, 액와 온도), 신체 및 의학적 검사 (BMI, 체중, 신장, 의학적 상태 - 심혈관, 폐, 소화기, 근골격 및 말초, 신경계 평가 등이 강조됨); (3) 혈액, 생화학, 비뇨기 및 혈청학 분석을 포함한 실험실 시험; (4) 12 유도 심전도 (ECG); (5) 및 실험실 시험, 자기 공명 영상화, 컴퓨터 단층촬영 및 초음파검사를 통한 하기 기관/계: CNS, 폐, 간, 비장, 췌장, 전립선, 고환, 비뇨기, 혈액 및 골격계에서의 양성 및 악성 신생물의 발생 및 분류의 모니터링 변화를 고려한 주기적 평가로부터 상세하게 평가할 것이다.
2차 결과 측정: 전반적 임상 반응에 의한 셀라비타 HD의 예비 효능 (CIBIS) 및 UHDRS 개선 [시간 프레임: 5년]을 각각의 UHDRS 척도 성분: 운동, 인지 및 행동의 결과의 통계적 비교에 의해 평가할 것이다. 전반적 임상 반응은 셀라비타 HD 치료 전 및 후에 조사자에 의해 관찰된 기준선 점수 사이의 통계적 비교에 의해 평가할 것이다. 염증 마커의 비교에 의한 셀라비타 HD의 예비 효능 [시간 프레임: 1년]을 IL-4, IL-6, IL-10 (인터류킨 IL) 및 TNF-알파 (종양 괴사 인자 알파)를 포함하는 염증 마커의 통계적 비교에 의해 평가할 것이다. 셀라비타 HD의 면역학적 반응 [시간 프레임: 1년]. 셀라비타 HD에 의해 유도되는 면역학적 반응은 CD4+ 및 CD8+ 증식의 기준선 결과 및 다른 평가된 시간 사이의 통계적 비교에 의해 평가할 것이다. CNS 평가의 비교에 의한 셀라비타 HD의 예비 효능 [시간 프레임: 1년]. 양성자 분광분석법에서 확인된 미상 및 대사 변화에 특히 주의를 기울이면서, 피질 두께 측정, 상이한 뇌 구조, 특히 기저 신경절의 부피에서의 자기 공명 영상을 통한 CNS 평가의 통계적 비교에 의해 평가할 것이다. 해밀턴 우울증 등급화 척도 (HDRS)에 의한 자살 관념의 위험 [시간 프레임: 5년]은 자살 도메인에 의해 평가할 것이다. 분류상 구두점은 경도 우울증 (점수: 8 내지 13), 중등도 우울증 (점수: 19 - 22) 및 중증 우울증 (점수: > 23)에 상응할 수 있다.
본 실시예의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 수많은 변경, 변화 및 치환이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 개시내용의 범주를 규정하고, 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그의 등가물은 그에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (34)

  1. a) 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질의 3-폴드 대칭 축에서 7량체 펩티드 서열 내에 3개 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 7량체 펩티드 서열은 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 여기서 아미노산 치환은 ILGTGTS (서열식별번호: 45479), QSSQTPR (서열식별번호: 45479), 또는 TLAVPFK (서열식별번호: 45477)가 아닌 것인 변이체 AAV 캡시드; 및
    b) 유전자 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 재조합 AAV (rAAV).
  2. 제1항에 있어서, 변이체 AAV 캡시드가, 대상체에서 측정 시, 상응하는 모 AAV 캡시드의 향성에 비해 표적 조직 또는 표적 세포에 대해 증가된 향성을 갖는 것인 rAAV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 조직 또는 표적 세포가 중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS)의 조직 또는 세포, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 rAAV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 AAV 캡시드가, 대상체에서 측정 시, 상응하는 모 AAV 캡시드의 향성에 비해 간 조직을 포함한 오프-타겟 조직 또는 간 세포를 포함한 오프-타겟 세포에 대해 감소된 향성을 갖는 것인 rAAV.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이 3개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 rAAV.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이 4개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-455, 453-456, 454-457, 또는 455-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 rAAV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이 적어도 5개의 인접 아미노산을 포함하며, 각각의 아미노산은 독립적으로 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-456, 453-457, 또는 454-458에 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치에서 A, D, E, G, K, H, M, N, P, L Q, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 rAAV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이
    a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, H, M, N, Q, S, T, 또는 V;
    b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 453에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V;
    c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 454에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, Q, S, T, 또는 V;
    d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 455에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, P, Q, S, 또는 T;
    e) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 456에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, H, K, N, P, Q, S, 또는 T;
    f) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 457에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, D, E, G, K, N, P, S, T, 또는 V; 및
    g) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 458에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 A, E, G, H, K, L, N, Q, S, T, 또는 V
    중 3개 이상을 포함하는 것인 rAAV.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 DGAATKN (서열식별번호: 3943), 및 DGQSSKS (서열식별번호: 2764)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAAV.
  10. 제4항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이
    a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, D, G, L, N, Q, S, 또는 T;
    b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 453에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, N, P, Q, R, S;
    c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 454에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, D, G, N, S, 또는 T;
    d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 455에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, D, G, K, N, P, Q, S, 또는 T;
    e) AAV9 VP (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 456에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, K, N, P, R, S, 또는 T;
    f) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 457에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, K, N, P, R, S, T, 또는 V; 및
    g) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 458에 상응하는 위치의 아미노산에서 치환된 A, G, K, L, R, S, T, 또는 V
    중 3개 이상을 포함하는 것인 rAAV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 LQTSSPG (서열식별번호: 2933), QQGKQSV (서열식별번호: 79), SINTKTN (서열식별번호: 45475), SNGTKQT (서열식별번호: 442), GSGKTAA (서열식별번호: 88), MGDKPTR (서열식별번호: 2466), QPSGGNT (서열식별번호: 2672), ERGANTK (서열식별번호: 5192), TTGGHSS (서열식별번호: 2743), GTTKTSE (서열식별번호: 3064), GTGTSVL (서열식별번호: 11958), NQSGTKG (서열식별번호: 780), KGPGQMG (서열식별번호: 45476), 및 GTPSKAG (서열식별번호: 2741)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAAV.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 조직 또는 조직 내의 표적 세포가 폐, 장, 신장, 심장, 및 위로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 rAAV.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이 AAV9 VP1의 아미노산 잔기 452-454, 453-455, 454-456, 455-457, 또는 456-458에 상응하는 아미노산 위치에서 3개의 인접 아미노산을 포함하고, 여기서
    a) 452는 N, K, R, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    b) 453은 L, N, P, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    c) 454는 A, D, G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    d) 455는 L, P, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    e) 456은 P, R, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    f) 457은 G, N, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고
    g) 458은 I, L, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 것
    인 rAAV.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 아미노산이
    a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-455, 453-456, 454-457, 또는 455-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 4개의 인접 아미노산;
    b) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-456, 453-457, 또는 453-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 5개의 인접 아미노산;
    c) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-457 또는 453-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 6개의 인접 아미노산; 및
    d) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서의 7개의 인접 아미노산
    을 포함하는 것인 rAAV.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 조직이 폐이고, 3개 이상의 아미노산이 KDNTPGR (서열식별번호: 32538), NNLPRNL (서열식별번호: 32867)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 13에 제공된 임의의 아미노산 서열에 제공된 것인 rAAV.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 조직이 장이고, 3개 이상의 아미노산이 RESSPSL (서열식별번호: 26474), KDNTPGR (서열식별번호: 26584)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 5에 제공된 임의의 아미노산 서열에 제공된 것인 rAAV.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 신장이고, 3개 이상의 아미노산이 RVPLSTI (서열식별번호: 26933), NNLPRNL (서열식별번호: 27530), KDNTPGR (서열식별번호: 28509)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 6에 제공된 임의의 아미노산 서열에 제공된 것인 rAAV.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 심장이고, 3개 이상의 아미노산이 KDNTPGR (서열식별번호: 25633)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 4에 제공된 임의의 아미노산 서열에 제공된 것인 rAAV.
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 위이고, 3개 이상의 아미노산이 RESSPSL (서열식별번호: 31904)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 12의 임의의 아미노산 서열에 제공된 것인 rAAV.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질이 AAV9 VP1 또는 그의 변이체인 rAAV.
  21. 제20항에 있어서, AAV9 VP1 변이체가 서열식별번호: 1에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 rAAV.
  22. 제20항에 있어서, AAV9 VP1 변이체가 서열식별번호: 1에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 rAAV.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질이 AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 588_589에 상응하는 아미노산 위치에서 TLAXPFK (서열식별번호: 46424), TLAX (서열식별번호: 46425), LAVX (서열식별번호: 46426), AVPX (서열식별번호: 46427), 및 VPFX (서열식별번호: 46428)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 추가로 포함하며, 여기서 X는 V 이외의 임의의 아미노산인 rAAV.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 모 AAV 캡시드 단백질이 AAV-PHP.B 또는 AAV-PHP.eB로부터의 것인 rAAV.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단리 및 정제된 rAAV.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV 및 제약 부형제를 포함하는 제약 제제.
  27. 제26항에 있어서, 정맥내, 동맥내, 비강내, 척수강내, 거대 수조내, 또는 피하 주사용으로 제제화된 제약 제제.
  28. 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV, 또는 제26항 또는 제27항의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자 생성물은 치료 유전자 생성물인, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 투여가 정맥내, 동맥내, 비강내, 척수강내, 거대 수조내, 또는 피하 주사에 의한 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 질환 또는 상태가 폐 섬유증, 계면활성제 단백질 장애, 퍼옥시솜 생물발생 장애, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 질환 또는 상태가 중추 신경계 (CNS) 또는 말초 신경계 (PNS) 장애인 방법.
  32. a)
    a) 5' 및 3' 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 둘러싸인 치료 유전자 발현 생성물을 코딩하는 제1 핵산 서열;
    b) 5' ITR 서열, 복제 (Rep) 유전자, 캡시드 (Cap) 유전자, 및 3' ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 코딩하며, 여기서 Cap 유전자는 rAAV 캡시드 단백질을 코딩하는 것인 제2 핵산 서열; 및
    c) E4orf6, E2a, 및 VA RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 헬퍼 바이러스 단백질, 및 임의로, E1a 또는 E1b55k를 포함하는 제2 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열
    을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하고;
    b) 세포에서 AAV 캡시드 단백질을 발현시키고;
    c) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 rAAV를 어셈블리시키고;
    d) rAAV 내에 제1 핵산 서열을 패키징하는 것
    을 포함하는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV를 제조하는 방법.
  33. a) 서열식별번호: 1의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 갖는 상응하는 모 AAV 캡시드에 비해, 영장류 대상체에게 정맥내로 전달된 경우 영장류 대상체의 간에서 측정된 바와 같이, 감소된 특이성 및 감소된 형질도입 효율 중 적어도 1개; 및
    b) 상응하는 모 AAV 캡시드에 비해, 영장류 대상체에게 정맥내로 전달된 경우 영장류 대상체의 중추 신경계 (CNS)에서 측정된 바와 같이, 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개
    를 포함하는 변이체 AAV 캡시드.
  34. a) AAV9 VP1 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 452-458에 상응하는 아미노산 위치에서 7량체 펩티드 서열 내에 3개 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질; 및
    b) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해, 비강내로 또는 정맥내로 대상체에게 전달된 경우 대상체의 표적 조직에서 측정된 바와 같이, 표적 조직에서 증가된 특이성 및 증가된 형질도입 효율 중 적어도 1개를 포함하며, 여기서 표적 조직은 폐, 장, 신장, 심장, 및 위로 이루어진 군으로부터 선택된 것인
    변이체 AAV 캡시드.
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