KR102258348B1 - 개선된 아데노바이러스 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약제학적 아데노바이러스 제형, 특히 아데노바이러스를 포함하는 액체 약제학적 제형을 제공한다.

Description

개선된 아데노바이러스 제형{IMPROVED ADENOVIRUS FORMULATIONS}
본 발명은 예를 들어, 유전자 요법 및/또는 백신 응용에 사용하기 위한 아데노바이러스 제형 및 관련 약제학적 제품에 관한 것이다. 특히, 약 2 내지 8℃ 범위 또는 그 이상에서 보관되는 경우 함유된 아데노바이러스의 양, 효력(감염성) 및 질을 유지함으로써 아데노바이러스 안정성을 개선시킴과 동시에 비경구 투여와 양립가능한 아데노바이러스를 위한 액체 제형이 본 명세서에 개시되어 있다.
아데노바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 가장 효율적이며 널리 사용되는 비히클로 여겨진다. 유전자 요법 및 백신 연구의 분야에서 진행 중인 도전은 약제학적 제품에 대한 현실적인 보관 온도 범위, 예를 들어, 약 2℃ 내지 약 8에서 더 긴 기간 동안 이들 바이러스를 안정화시킬 수 있는 액체 아데노바이러스 제형을 생성하는 것이다.
아데노바이러스의 생물학적 활성은 캡시드 단백질로 이루어진 20면체 캡시드 구조에 의해 둘러싸인 뉴클레오티드의 적어도 하나의 코어 서열의 입체형태 무결성에 좌우된다. 통상적인 유기 및 무기 약물과 달리, 이들은 매우 복잡한 생물학적 구조이며, 미소한 화학적 또는 물리적 응력 요인(stressor)이 아데노바이러스 입자의 분해에 기여할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스 제제의 우수한 제형은 합당한 보관 수명을 보장하는 것이 결정적으로 중요하나, 이들 벡터의 안정화는 특별한 난제를 안고 있다. 아데노바이러스는 변성, 응집(가용성 및 불용성 응집체 형성 둘 모두), 침전 및 흡수를 포함하는 물리적 불안정성 및 가수분해, 탈아미드화 및 산화를 포함하는 화학적 불안정성의 결과로서 효력을 소실할 수 있다. 이들 분해 경로 중 임의의 것은 생물학적 활성을 저하시킬 수 있을 뿐 아니라, 잠재적으로 증가된 독성 및/또는 변경된 면역원성을 갖는 부산물 또는 유도체의 형성으로 이어질 수 있다.
따라서, 넓은 범위의 조건에 걸쳐 안정성을 보장하는 아데노바이러스를 위한 강력한 제형을 찾기 위한 맞춤화된 방법이 필요하다. 완충제 유형, pH 및 특수 부형제는 아데노바이러스를 화학적으로, 물리적으로 그리고 생물학적으로 안정하게 유지하기 위해 세심하게 최적화될 필요가 있을 것이다. 달라질 수 있는 모든 인자를 고려하여, 아데노바이러스를 제형화하기 위한 최적의 조건을 찾는 것은 시도하는데 부담이 되고, 우수한 제형의 조성은 선험적으로 예측가능하지 않다.
동결건조된 제형이 존재하며, 안정하다. 그러나 그들은 상대적으로 고가인 경향이 있고, 투여 전에 시간이 걸리는 처리를 요하며, 동결건조 과정에서 효력이 특정 정도로 소실될 수 있다. 동결 조건(-80℃) 하에 안정한 액체 제형이 존재하지만, 이들은 특수 수송과 고가의 보관 시설을 필요로 하여, 특히 유통망의 주변부에서, 신뢰성 있는 저온 유통이 거의 불가능하게 된다. 따라서, 아데노바이러스에 바람직한 제형은 2 내지 8℃ 온도 범위 또는 그 이상에서 아데노바이러스 안정성을 제공하는 액체 제형이다. 그러한 제형은 보통의 냉장고에 보관될 수 있으며, 신속하고 용이하게 투여될 수 있다.
아데노바이러스를 위한 액체 제형은 이전에, 예를 들어, 문헌[Evans et al. 2004]에서 설명되어 있다. 상기 출원에서 예시된 최적의 제형은 7.5 내지 8.5 범위의 pH를 갖는 트리스(Tris) 완충된 제형이다. 본 발명자들은 본 명세서에서 상기 제형이 아데노바이러스를 위하여 준최적임을 발견하였다. 또한, 아데노바이러스를 위한 제형은 WO 00/29024호에 개시되어 있으며, 이는 주로 동결건조 기술에 관한 것이다. 폴리올을 포함하는 아데노바이러스를 위한 다른 제형은 WO 00/29024호에 언급되어 있다.
따라서, 연장된 기간에 걸친 보관 동안 함유된 아데노바이러스의 양과 효력을 보존함으로써 아데노바이러스 안정성을 개선시키는 제형을 찾는 것이 해당 분야에 필요하다. 또한, 아데노바이러스 안정성은 수송 동안의 교반 응력 또는 생성 또는 임상 이용 동안의 전단력의 경우에, 그리고 광범위 기후 조건하에, 특히 승온에서 또는 반복된 동결/해동 사이클 후에 유지되어야 한다. 또한, 제형은 의도된 투여 경로에 적합해야 하고, 잘 용인되어야 하며, 바람직하게는 가능한 적은 성분이 있는 조성을 가져야 한다. 아데노바이러스를 위한 그러한 제형을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
발명의 요약
본 발명자들은 이전에 개시된 제형에 비하여 아데노바이러스의 양 및 효력(감염성) 및 질을 유지함으로써 아데노바이러스-안정성을 개선시키는 아데노바이러스를 위한 제형을 발견하고, 본 명세서에 기재한다. 현저하게, 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD)과, 5.5 내지 6.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 완충제의 조합은 해당 분야에 알려져 있는 다른 제형에 비하여 전반적인 아데노바이러스-안정성을 개선시킴과 함께, 아데노바이러스의 양, 효력(감염성) 및 질의 보존에 뛰어난 제형을 야기하였다.
제형 개발에 사용되는 모든 부형제와 마찬가지로, 본 발명에 따른 제형에 존재하는 성분의 일부는 개별적으로 종래 기술에 언급되어 있다. 그러나 그것은 본 발명의 제형에 그의 뛰어난 특성 및 안정화 능력을 제공하는 몇몇의 성분의 매우 특이한 조합이다. 본 발명에 따른 정확한 제형은 종래 기술에 개시되지 않았다. 또한, 상기 제형이 이러한 본질적으로 예측불가능한 분야에서 종래 기술에 기초하여 아데노바이러스에 그러한 개선된 안정성을 제공할 것임이 예견될 수 없다.
따라서, 본 발명은 예를 들어, 유전자 요법 및/또는 백신 응용에 사용될 수 있는 안정화된 아데노바이러스 제형 및 관련 약제학적 제품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제형은 5.5 내지 6.5 범위의 pH의 시트르산염 완충제를 포함하며, 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD)을 더 포함한다. 제형은 또한, 염 및 비-이온성 세제를 포함한다. 임의로, 본 발명에 따른 제형은 2 또는 4-탄소 알코올을 추가로 포함한다. 본 발명의 아데노바이러스 제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 -65℃ 이하에서 6개월, 1년, 1.5년, 2년 이상 동안 보관이 연장될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 제형은 c) 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD); d) 염; 및 e) 비이온성 세제를 추가로 포함하는 b) 시트르산염 완충 용액 중에 a) 재조합 아데노바이러스를 포함한다. 아데노바이러스의 안정성을 보존하기 위하여, 이러한 제형의 pH가 5.5 내지 6.5 범위인 것이 필수적이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제형은 약 1×107 vp/㎖ 내지 1×1013 vp/㎖ 범위의 역가로 아데노바이러스를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 제형 중 시트르산염 농도는 약 5 mM 내지 30 mM 범위이다.
하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD)은 바람직한 동결보호제이다. HBCD는 바람직하게는 약 1%(w/w) 내지 10%(w/w) 범위의 농도로 존재한다.
염화나트륨(NaCl)은 바람직하게는 약 20 mM 내지 200 mM 범위의 농도로 존재하는 바람직한 염이다.
폴리소르베이트-80은 바람직하게는 약 0.005%(w/w) 내지 0.5%(w/w) 범위의 농도를 갖는 바람직한 비이온성 세제이다.
본 발명에 따른 더욱 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.7 내지 6.3 범위의 pH를 가지며, 약 5 내지 30 mM 범위의 농도의 시트르산염; 1%(w/w) 내지 10%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 20 mM 내지 200 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80을 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.8 내지 6.2 범위의 pH를 가지며, 약 15 내지 25 mM 범위의 농도의 시트르산염; 3%(w/w) 내지 8%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 50 mM 내지 100 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.01%(w/w) 내지 0.03%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80을 포함한다.
더더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 약 6의 pH를 가지며, 약 20 mM의 농도의 시트르산염; 약 5%(w/w)의 농도의 HBCD; 약 75 mM의 농도의 NaCl; 약 0.02%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80을 포함한다.
2 또는 4-탄소 알코올, 특히 에탄올을 본 발명의 제형에 첨가하면, 예상치 않게 동결/해동 손상에 대하여 아데노바이러스를 강력하게 보호하고, 결과적으로, 동결보호제로서 작용하는 것이 본 명세서에서 입증되었다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 2 또는 4-탄소 알코올을 추가로 포함한다. 더더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 에탄올을 포함한다. 에탄올 농도는 바람직하게는 약 0.1%(w/w) 내지 1%(w/w) 범위이다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.7 내지 6.3 범위의 pH를 가지며, 약 5 내지 30 mM 범위의 농도의 시트르산염; 1%(w/w) 내지 10%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 20 mM 내지 200 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.2%(w/w) 내지 0.6%(w/w) 범위의 농도의 에탄올을 포함한다.
본 발명에 따른 더욱 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.8 내지 6.2 범위의 pH를 가지며, 약 15 내지 25 mM 범위의 농도의 시트르산염; 3%(w/w) 내지 8%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 50 mM 내지 100 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.01%(w/w) 내지 0.03%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.2%(w/w) 내지 0.6%(w/w) 범위의 농도의 에탄올을 포함한다.
더더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 약 6의 pH를 가지며, 약 20 mM의 농도의 시트르산염; 약 5%(w/w)의 농도의 HBCD; 약 75 mM의 농도의 NaCl; 약 0.02%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.4%(w/w)의 농도의 에탄올을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 약 6의 pH를 가지며, 약 20 mM의 농도의 시트르산염; 약 5%(w/w)의 농도의 HBCD; 약 80 mM의 농도의 NaCl; 약 0.025%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.4%(w/w)의 농도의 에탄올을 포함한다.
더더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 약 6의 pH를 가지며, 약 20 mM의 농도의 시트르산염; 약 5%(w/w)의 농도의 HBCD; 약 80 mM의 농도의 NaCl; 약 0.025%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.4%(w/w)의 농도의 에탄올을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 (동결된) 액체 제형이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 비경구 용도에 적합하다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 바이얼(vial)에 수용된다. 다른 구현예에서, 제형은 백(bag) 또는 병에 수용된다. 또 다른 구현예에서, 제형은 주사기 또는 카트리지에 수용된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제형을 제조하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 보존 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 제형을 제조하는 단계 및 상기 제형을 2℃ 내지 8℃ 범위의 온도에서 보관하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 보존 방법에 관한 것이다.
넓은 온도 범위에 걸친 향상된 장기간 안정성은 본 명세서에 개시된 바이러스 제형의 보관 수명을 연장시켜, 허용가능한 바이러스 효력의 소실(즉, 2 내지 8℃에서 2년마다 0.3log 이하)과 함께, 바람직하게는 약 1 내지 2년 이상의 기간에 걸쳐 이들 제형의 보관 및 궁극적인 숙주 투여를 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 제형은 승온에 대한 노출, 연장된 동결/해동 사이클 및 교반 동안 안정성을 보인다.
도 1. 제형 B(백색 마름모) 및 대조군 제형(흑색 원)에서 25℃에서의 가속된 온도 동안의 Ad26의 효력(log IU/㎖) 소실(Δ). 효력응력이 가해진 시료 - 효력대조군 시료를 반영하는 평균 Δ효력(n=4)이 나타나 있다. 효력은 QPA에 의해 측정된다.
도 2. 제형 B(백색 마름모) 및 대조군 제형(흑색 원)에서 25℃에서의 가속된 온도 동안의 Ad35의 효력(log IU/㎖) 소실(Δ). 효력응력이 가해진 시료 - 효력대조군 시료를 반영하는 평균 Δ효력(n=4)이 나타나 있다. 효력은 QPA에 의해 측정된다.
도 3. 제형 B 및 대조군 제형에서의 Ad26의 열융점. Ad26에 대한 TMA(열 용융 검정) 분석(n=3)을 t=0 시료에 대하여 수행하였다.
도 4. 제형 B 및 대조군 제형에서의 Ad35의 열융점. Ad35에 대한 TMA(열 용융 검정) 분석(n=3)을 t=0 시료에 대하여 수행하였다.
도 5. 25℃에서 69일 후의 NaCl, EDTA, 에탄올 및 그들의 조합이 존재하는 및 존재하지 않는 제형 B에서의 Ad26의 델타 Ct(ΔCt) 값. ΔCt 값은 효력의 소실과 직접적인 상호관련이 있으며, 여기서, 더 큰 수는 더 많은 효력 소실을 의미한다.
도 6. 35℃에서 16일 후의 NaCl, EDTA, 에탄올 및 그들의 조합이 존재하는 및 존재하지 않는 제형 B에서의 Ad26의 델타 Ct(ΔCt) 값. ΔCt 값은 효력의 소실과 직접적인 상호관련이 있으며, 여기서, 더 큰 수는 더 많은 효력 소실을 의미한다.
도 7. 30 사이클의 동결/해동에 이어서, 1일의 교반 후의 NaCl, EDTA, 에탄올 및 그들의 조합이 존재하는 및 존재하지 않는 제형 B에서의 Ad26의 델타 Ct(ΔCt) 값. ΔCt 값은 효력의 소실과 직접적인 상호관련이 있으며, 여기서, 더 큰 수는 더 많은 효력 소실을 의미한다.
도 8. t=0(흑색 원), 69일 동안 25℃(백색 마름모), 16일 동안 35℃(흑색 삼각형) 및 30 사이클의 동결/해동에 이어서 교반(백색 직사각형)의, NaCl, EDTA, 에탄올 및 그들의 조합이 존재하는 및 존재하지 않는 제형 B에서의 Ad26의 350 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정되는 비탁법.
도 9. t=0(흑색 원), 69일 동안 25℃(백색 마름모), 16일 동안 35℃(흑색 삼각형) 및 30 사이클의 동결/해동에 이어서 교반(백색 직사각형)의, NaCl, EDTA, 에탄올 및 그들의 조합이 존재하는 및 존재하지 않는 제형 B에서의 Ad26의 고유 형광.
도 10. 제형 F 및 대조군 제형에서의 Ad26의 열융점. Ad26에 대한 TMA 분석(n=3)을 t=0 시료에서 수행하였다.
도 11. 응력 조건 동결/해동(FT) + 교반(AG) + 35℃에서의 보관을 사용한 CQA 효력(Δ효력 한계 ≥ -0.30 log IU/㎖)에 대한 성공 확률에 대한 페어 플롯(pair plot). 성공 확률 스케일은 0.4(연회색) 내지 1(흑색)이다. 완전 실험 도메인을 연구한다. 백색 사각형에서, 플롯에 기초하여 설계 공간이 제안된다.
상세한 설명
이전에 언급된 바와 같이, 함유된 아데노바이러스의 양과 효력을 연장된 기간에 걸친 보관 동안 보존함으로써 아데노바이러스 안정성을 개선시키는 제형을 발견하는 것이 해당 분야에 필요하다.
몇몇의 참고문헌은 아데노바이러스의 제형을 위한 특정 성분의 이용을 개시한다. Altaras 등은 자유 라디칼 산화의 가능한 억제제의 큰 목록의 부분으로서 시트르산염을 개시한다. 또한, 상기 목록은 자유 라디칼 산화의 추가의 억제제로 확인된 EDTA 및 에탄올의 조합(EDTA/에탄올)을 포함한다. 본 발명의 제형은 항산화제로서가 아니라, 완충제로서 시트르산염을 이용한다.
Renteria 등은 특정 단백질의 안정성을 증진시키고, 비강 투여 동안 응집을 피하기 위해 사용되는 첨가제 중 하나로서 하이록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD)을 확인하였다. Renteria 등은 점막 흡수를 향상시키는 비강 투여에 적절한 제형의 맥락에서 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린의 이용을 개시한다. 모든 단백질은 구조, 전하 및 크기에 관하여, 아데노바이러스와 같은 생 바이러스와 비교하여 매우 상이하다. 결과적으로, 아데노바이러스에 대한 안정화 메카니즘은 완전히 상이하며, 단백질에 대한 안정화 메카니즘을 고려하여 예측가능하지 않다.
WO 029024호는 동결 건조된 제형을 제조하기 위해 사용되는 가능한 동결보호제의 큰 목록의 부분으로서 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린을 개시한다. WO 029024호는 본 발명에 개시된 바와 같은 액체 조성물이 아니라 동결 건조된 조성물에 관한 것이다. 액체 제형의 이점은 그것이 덜 고가이고, 투여 이전의 처리가 시간이 덜 걸리고, 임상 투여량 또는 재구성 실수의 경향이 더 적다는 점이다. 또한, 동결건조 과정의 대량화는 번거로운 시도일 수 있다.
본 발명자들은 이전에 개시된 제형에 비하여 아데노바이러스의 양 및 효력(감염성) 및 질을 보존함으로써 아데노바이러스-안정성을 개선시키는 아데노바이러스를 위한 제형을 발견하였고, 본 명세서에 기재한다.
본 발명의 제형은 적어도 하나의 재조합 아데노바이러스를 포함한다. 아데노바이러스 벡터의 작제는 해당 분야에서 널리 알려져 있으며, 표준 분자 생물학적 기술, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], 문헌[Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995)] 및 본 명세서에 언급된 다른 참고문헌에 기재된 것들의 이용을 포함한다. 약술하면, 아데노바이러스 벡터는 바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, 예를 들어, E1a 영역 및/또는 E1b 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능에 결함이 있을 수 있다. 아데노바이러스를 생성하기 위해 숙련자에게 알려져 있는 바와 같이, 아데노바이러스 게놈으로부터 필수 영역이 결실된 경우에, 이들 영역에 의해 인코딩된 기능은 트랜스로, 바람직하게는 생산자 세포에 의해, 예를 들어, 게놈에 통합되어 또는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 경우, 소위 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라스미드의 형태로 제공되어야 한다.
재조합 아데노바이러스의 증식은 미국 특허 제6,492,169호 또는 WO 03/104467호, 미국 특허 제5,559,099호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,994,106호, 제5,994,128호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제6,040,174호, 제6,020,191호 및 제6,113,913호 및 문헌[Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", Chapters 67 and 68, respectively, in Virology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)]에 상세하게 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 포함되어 있다. 복제-결함 아데노바이러스 벡터는 벡터 DNA의 공급원으로서 아데노바이러스 또는 키메라 아데노바이러스의 임의의 종, 균주, 하위유형 또는 종, 균주 또는 하위유형의 혼합물을 사용함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, WO 96/26281호, WO 00/03029호 참조). 본 발명의 특정 구현예에서, 인간 아데노바이러스의 혈청형은 혈청형 2, 4, 5, 7, 11, 26, 34, 35, 36, 48, 49 또는 50 중 임의의 것, 또는 임의의 하이브리드 또는 돌연변이된 아데노바이러스 혈청형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 26 또는 35 유래의 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 원숭이 아데노바이러스, 바람직하게는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스이다. 이들 아데노바이러스는 일반적으로, 인간 집단에서 낮은 혈청학적 유병률(seroprevalence) 및/또는 낮은 사전-존재 중화 항체 역가를 갖는다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 적합한 이종 핵산은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 트랜스유전자(transgene) 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 예를 들어, 벡터가 백신접종 목적을 위해 사용되는 경우, 면역 반응이 요망되는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 예를 들어, 모두 당업자에게 널리 알려져 있는 말라리아(예를 들어, WO 2004/055187호 참조), HIV, 결핵(예를 들어, WO 2006/053871호 참조), 특정 바이러스 등에 대한 면역 반응을 생성하기에 적합한 트랜스유전자를 포함할 수 있다. 사실상, 트랜스유전자의 성질은 본 발명에 결정적이지 않으며, 그것은 임의의 이종 핵산 서열일 수 있으며, 이에 따라, 본 명세서에서 추가의 상술이 필요 없다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "안정성"은 그의 예상되는 유용성의 기간에 그의 효력을 유지하는 제형 중 아데노바이러스 입자의 분해에 대한 상대적인 저항성을 말한다. 바람직하게는, 효력은 2 내지 8℃에서 2년마다 0.3log 이하의 감소를 보인다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "효력"은 하기에 기재된 세포-기반의 효력 분석에서 측정되는 감염 단위에 관하여 표현되는 아데노바이러스 활성의 척도를 말한다.
본 발명에 따른 조성물은 가속화된 안정성 연구에서 60일마다 0.4log 이하의 효력의 감소 및 60일마다 0.3log 이하의 역가의 감소를 보이며, 이 연구는 1 내지 3개월 동안 25℃ ± 2℃에서의 제형의 인큐베이션에 의해 수행된다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 바이얼을 반복 동결/해동 사이클 후에 200 rpm에서 실온에서의 수평 배향의 24시간의 교반으로 처리하는 연구에서 10 사이클마다 0.2log 이하의 효력의 감소를 보인다.
"약제학적으로 허용되는 부형제"는 알맞은 또는 편리한 투여형을 제조하기 위하여 활성 분자, 예를 들어, 바이러스와 조합되는 임의의 비활성 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용되는 부형제"는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이며, 바이러스 제제를 포함하는 제형의 다른 성분과 상용성인 부형제이다. 부형제의 예는 동결보호제, 비이온성 세제, 완충제, 염 및 자유 라디칼 산화의 억제제이다.
용어 "부산물"은 주어진 제형 중 치료적/예방적 아데노바이러스의 비를 줄이거나 감소시키는 요망되지 않는 산물을 포함한다. 전형적인 부산물은 예를 들어, 단백질 변성, 탈아미드화, 가수분해 또는 그들의 조합으로부터 야기되는 아데노바이러스 및 아데노바이러스의 단편의 응집체를 포함한다. 전형적으로, 응집체는 분리된 바이러스 입자보다 더 큰 분자량을 갖는 복합체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "안정한 제형"으로도 명명되는 아데노바이러스 안정성을 개선시킨 제형은 아데노바이러스가 보관시에 그 안에서 본질적으로 그의 물리적 및/또는 화학적 온전성 및/또는 생물학적 활성을 보존하는 제형이다. 안정성은 소정의 기간에 걸쳐 그리고 특정 보관 조건하에서 상이한 특징, 예를 들어, (제형 중 아데노바이러스의) 양, 효력 및/또는 제형 중 아데노바이러스의 다른 질 양태를 결정함으로써 평가될 수 있다. 아데노바이러스 제형의 이들 특징은 승온에서(실시간 온도에 대한 예측) 또는 다른 응력 조건하에서 측정될 수 있으며, 예를 들어, 제형은 보관 수명을 최대화하는 상이한 제형의 영향을 연구하기 위하여 25℃에서의 인큐베이션으로 처리되거나 동결/해동 사이클 및 교반으로 처리될 수 있다. 안정성을 결정하는 상기 특징은 육안의 검사, 바이러스 입자 정량적 중합효소 연쇄 반응(vp-QPCR), QPCR-기반의 효력 검정(QPA), 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 시차 원심 침강(DCS), 열 용융 검정(TMA), 비탁법 및 고유 형광으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법 중 적어도 하나에 의해 결정될 수 있다.
바이러스 입자 정량적 중합효소 연쇄 반응(vp- QPCR )
vp-QPCR은 아데노바이러스 벡터 내에 존재하는 트랜스유전자 카세트의 CMV 프로모터의 100 bp 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 아데노바이러스 입자를 정량화하기 위해 개발되었다. 약술하면, 이러한 QPCR 방법은 Taq 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의존하며, 이는 100 bp 앰플리콘의 중간에 어닐링되는 특이적인 형광 프로브의 분해를 야기한다. 프로브는 발광체 및 켄처(quencher)에 공유 결합되며, 그의 분해는 발광체를 켄처로부터 유리시키며, 결과적인 형광 방출은 주형의 양에 비례한다. 정량적 값은 형광 신호의 증가가 역치 값을 초과하는 역치 사이클(Ct)로부터 수득된다. DNA-기반의 형광의 검출을 위한 역치는 백그라운드를 약간 초과하여 설정된다. 형광이 역치를 초과하는 사이클의 수는 역치 사이클(Ct), 또는 MIQE 지침에 따르면, 정량화 사이클(Cq)로 지칭된다(문헌[Bustin et al, 2009]). 지수적 증폭 단계 동안, 표적 DNA 서열은 매 사이클마다 배가된다. 예를 들어, Ct가 다른 시료의 Ct를 초과하는 DNA 시료는 3 사이클에 의해 23 = 8배 더 많은 주형을 함유하였다. 결과적으로, 더 높은 Ct 값은 더 적은 양의 표적 DNA를 나타내며, 더 낮은 Ct 값은 표적 DNA의 높은 이용가능성을 나타낸다. 절대적 정량화는 농도가 260 nm에서의 광학 밀도(OD260)에 의해 결정되는 원액 아데노바이러스의 단계적 희석에 의해 생성되는 표준 곡선을 비교함으로써 수행될 수 있다. 시험 물질의 Ct 값은 정확하고 정밀한 수의 벡터 입자를 생성하는 표준 곡선의 Ct 값에 대하여 플롯팅된다.
E1 컴피턴트 세포에서의 인큐베이션 후에 판독치로 사용되는 경우(QPA, 하기 참조), 더욱 분해된 시료는 더 큰 델타(t=0을 뺀) Ct 값으로 이어질 것이며, 더욱 안정한 제형은 더 낮은 Ct 값으로 이어질 것이다.
QPCR -기반의 효력 검정( QPA )
아데노바이러스 효력을 정량화하기 위하여, QPA는 조직 배양-기반의 감염성 검정과 QPCR을 결합시킨다. 검정은 새로 합성된 바이러스 DNA의 출현이 세포 단층의 접종 후에 매우 신속하고, 큰 범위의 감염 다중도(MOI)에 걸쳐 바이러스 투입 농도에 비례한다는 실험적 관찰에 기초한다. 시료의 희석물(희석된 비-종점)을 96-웰 플레이트에서 HEK293 세포 단층에 접종한다. 감염을 35℃에서 3시간 동안 진행되게 한다. 웰을 흡인시키고, 아데노바이러스를 함유하지 않는 배지를 재보충한다. 플레이트를 아데노바이러스 DNA를 방출시키기 위한 트리톤 X-100 용액의 수단 및 단일의 동결/해동 단계에 의한 세포 용해 이전에 추가 42시간 동안 인큐베이션시킨다. QPCR을 상기 기재된 방법에 따라 희석된 세포 용해물에서 수행한다. 종점 적정에 의해 결정되는 감염성이 알려져 있는 시료의 Ct 값에 의해 생성되는 표준 곡선과 비교함으로써 감염성 역가를 계산한다. 대안적으로, 감염성 역가 또는 효력이 Ct 값과 직접적인 상호관련이 있기 때문에, 델타 효력은 직접 Ct 값으로 표현될 수 있다. 특히, 제형간의 효력의 상대적 차이를 비교함에 있어서, 이것은 신속하고 믿을 수 있는 방법이다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP- HPLC )
아데노바이러스의 일부 질 양태를 결정하기 위하여, 아데노바이러스 단백질 프로파일을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 분석할 수 있다. HPLC는 시료, 이동상(완충제 또는 용매) 및 정지상(컬럼에서의 크로마토그래피 팩킹 물질) 간의 다양한 화학적 상호작용을 사용함으로써 혼합물의 성분을 분리한다. 고압 펌프는 컬럼을 통해 이동상을 이동시키며, 검출기는 280 nm에서의 UV 흡광 검출을 사용하여 분자의 머무름 시간(tR; 시료 주입과 최대 피크의 출현 간의 시간)을 보여준다. RP-HPLC의 분리는 소수성의 차이에 기초한다. 비극성 정지상은 소수성 알킬쇄(쇄 길이: C4, C8 및 C18)로 구성된다. 극성 이동상은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이 있는 물이다. 컬럼에 결합하는 화합물을 0.1% TFA가 있는 증가하는 농도의 아세토니트릴을 사용하여 용리시킨다. 일반적으로, 더 큰 소수성 표면적이 있는 분석물은 더 긴 머무름 시간을 갖는 한편, 극성 기의 존재는 머무름 시간을 감소시킨다. 전형적인 아데노바이러스 RP-HPLC 프로파일은 코어 단백질(VII), 펜톤 베이스(III) 및 헥손(II)을 포함하는 10 또는 14개의 단백질로 이루어진다.
시차 원심 침강(DCS)
DCS는 침강에 의한 입자 크기 분포(응집)를 측정하기 위한 방법이다. 디스크 원심분리기에서, 스톡스 법칙에 따라 높은 중력하에 (점도 및 밀도가 알려져 있는) 수크로스 기울기에서 입자가 침강한다. 침강 속도는 입자 직경의 제곱과 함께 증가하기 때문에, 오직 수 백분율만큼 크기가 상이한 입자는 유의미하게 상이한 속도로 침강한다. 검출기에 도달하는데 필요한 시간을 사용하여 입자의 크기를 계산한다. 이러한 방법을 위한 측정 범위는 약 0.02 내지 30 미크론이다.
열 용융 검정( TMA )
열 용융 검정(TMA)을 사용하여, 바이러스 캡시드가 변성하는 온도인 실험적 제형에서의 아데노바이러스의 융점(Tm)을 결정할 수 있다. 이러한 바이러스 붕해는 dsDNA 개재 형광 염료를 사용하여 실시간으로 측정될 수 있다. 이러한 형광 염료는 바이러스 입자가 붕해되는 경우에 방출되는 DNA에 결합되는 경우에만 형광 신호를 제공한다. 캡시드 용융 시의 지수적 형광 증가는 온도의 단계적인 증가 동안 통상의 QPCR 장치를 사용하여 측정될 수 있다. 시료를 특정 제형에서 동일한 농도로 희석하고(범위는 4×109 내지 1×1012 vp/㎖임), 50 ㎕의 부피에서 SYBRGreen 염료(1× 최종 농도)와 혼합한다. 온도를 30℃에서 시작하여 79℃까지 30초마다 0.5℃ 증가시켰다. 미가공 형광 데이터로부터, 제1 및 제2 도함수를 계산하고, 융점을 제2 도함수와 x-축의 교점에서 판독한다. 더 높은 융점(Tm)은 더욱 안정한 제형을 나타낼 수 있다.
탁도 검정
비탁법은 시료 중 분자가 광을 흡수하지 않는 파장(예를 들어, 단백질이 주요 발색단인 시료에 대하여 350 nm)에서 검출되는, 시료 중 입자의 산란으로 인한 투과광의 세기(겉보기 흡광도)의 소실을 측정한다. 분자가 응집하거나 초분자 복합체를 형성하는 경우, 개별 입자로부터 비롯되는 경우 무작위였던 광 산란은 이제 일관됨으로써 측정되는 세기가 증가한다. 이는 광 산란 및 비탁법이 응집 및 복합체 형성 또는 해리를 검출하기에 유용한 기술이 되게 한다.
탁도 검정에서, 시료를 3중으로 UV-투과, 평면-바닥 마이크로플레이트로 옮긴다. 플레이트를 UV-투과 밀봉재로 덮는다. 230 내지 500 ㎚에서 마이크로플레이트 판독기에 의해 흡광 스펙트럼을 기록하고, 975 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 광로 길이를 결정하고, 가능하게는 그의 차이에 대하여 조정할 것이다. 아데노바이러스 없이 제형으로 이루어진 대조군 시료를 필요에 따라 매트릭스 성분의 산란 또는 흡수에 대하여 조정하기 위한 검정에 포함시킨다. 350 ㎚에서의 겉보기 흡광도를 탁도에 대한 정량적 척도로 사용한다.
탁도 검정은 아데노바이러스 시료에 대한 안정성을 나타낸다. 바이러스 응집은 탁도의 증가를 야기하고, 캡시드 해리를 감소시킨다. 분석 정밀도는 1 NTU 초과의 탁도 값에서 5%(CV%) 미만이다.
응력이 가해진 시료에 대하여 수득되는 탁도를 항상 대조군 시료와 비교해야 한다. 인가되는 응력 이후의 증가 또는 감소는 분해 경로에 좌우되고, 각각의 활성 약제학적 성분(API)에 대하여 특이적이기 때문에, 그것은 예측될 수 없다. t=0 시료에 비한 (더 높은 또는 더 낮은) 변화는 안정성이 더 낮은 제형을 나타낸다. t=0 시료와 유사한 응력이 가해진 시료가 더욱 안정적인 것으로 예상된다.
고유 형광 검정
아데노바이러스 캡시드 단백질은 여기 후에 재발광하는 방향족 아미노산, 특히 트립토판 및 더 적은 정도로 티로신 및 페닐알라닌을 함유한다. 트립토판의 방출 최대치 및 양자 수율은 강력하게 그의 환경의 극성에 좌우된다. 극성, 수성 환경(예를 들어, 구형 단백질의 표면)에서, 양자 수율은 상대적으로 낮은 한편, 비극성 환경(예를 들어, 응집체의 내부)에서, 양자 수율은 증가한다. 이러한 특징은 트립토판 형광을 단백질 입체형태 변화, 응집 및 분자 상호작용을 연구하기에 유용한 도구가 되게 한다.
고유 형광 검정에서, 시료를 3중으로 UV-투과, 평면-바닥 마이크로플레이트로 옮긴다. 플레이트를 UV-투과 밀봉재로 덮는다. 트립토판 형광을 280 ㎚의 중심 파장 및 10 ㎚의 대역폭을 갖는 여기 필터 및 340 ㎚의 중심 파장 및 10 ㎚의 대역폭을 갖는 방출 필터를 사용하여 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정한다. 저부 광학을 사용하여, 밀봉재 및 메니스커스 형상의 영향을 최소화시킨다.
형광 세기는 아데노바이러스 안정성의 민감한 척도인 것으로 당업계에 알려져 있다. 증가 또는 감소 중 어느 하나가 시료에 발생하는 변화의 성질에 따라, 응력시에 관찰될 수 있다. 단백질 언폴딩(unfolding) 및 캡시드 해리는 고유 형광의 감소를 야기하는 것으로 예상되며, 응집은 증가를 야기하는 것으로 예상된다. 검정의 정밀도는 사용되는 범위에서 5%(CV%) 미만이다.
응력이 가해진 시료에 대하여 수득되는 형광은 항상 대조군 시료와 비교해야 한다. 인가되는 응력 이후의 증가 또는 감소는 분해 경로에 좌우되고, 각각의 활성 약제학적 성분(API)에 대하여 특이적이기 때문에, 그것은 예측될 수 없다. t=0 시료에 비한 (더 높은 또는 더 낮은) 변화는 안정성이 더 낮은 제형을 나타낸다. t=0 시료 값과 가깝게 유지되는 응력이 가해진 시료가 더욱 안정적이다.
아데노바이러스는 그것이 다른 것들 중 특히, 양과 효력에 관하여 최소의 소실(즉, 0.3log/2년)을 보이고, 주요 단백질 변형을 나타내지 않는다면, 약제학적 제형에서 "그의 물리적 안정성을 유지한다". 또한, 육안의 검사시에 응집, 침전, 색상 및/또는 투명도의 변화의 징후가 관찰되지 않아야 한다.
본 출원에 사용되는 바와 같은 "약"은 달리 언급되지 않는 한 ±10%를 의미한다.
본 발명은 바람직하게는 유전자 요법 및/또는 백신 응용에 사용하기 위한 아데노바이러스를 안정화시키는 제형 및 관련 약제학적 제품에 관한 것이다. 바람직한 안정화된 바이러스를 함유하는 본 명세서에 개시된 제형은 액체 아데노바이러스 제형이며, 이는 약 2 내지 8℃ 범위에 보관되는 경우 개선된 아데노바이러스-안정성을 보이는 한편, 비경구 투여와 상용성이다. 그러나 이들 제형은 또한 더 낮은 온도, 예를 들어, -20℃ 이하, -40℃ 이하, -65℃ 이하, -80℃ 이하에서도 보관될 수 있다. 그들은 또한 8℃ 초과, 예를 들어, 25℃ 또는 심지어 더 높은 온도에서도 더욱 안정적일 수 있다.
아데노바이러스를 안정화시킬 수 있는 이들 제형은 시트르산염 완충제, 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD), 염 및 비이온성 세제, 및 첨가되는 바이러스에 대한 안정성을 증진시키는 임의의 추가의 성분을 포함한다. 상기 완충제의 pH는 5.5 내지 6.5이다.
본 발명의 제형은 다양한 바이러스 농도, 1- 또는 다가에서 아데노바이러스에 안정성을 제공하며, 다양한 척추동물 유기체, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간에 투여될 수 있다. 본 발명의 안정화된 바이러스 제형은 예를 들어, 이전에 감염되지 않은 개체에 예방적 이점을 제공하고/거나 치료적 효과를 제공할 수 있는 백신으로 투여될 수 있는 아데노바이러스-기반의 조성물이다.
본 발명의 바람직한 양태는 약 1×107 vp/㎖(바이러스 입자/㎖) 내지 약 1×1013 vp/㎖ 범위의 바이러스 농도를 갖는 본 명세서에 기재된 증진된 안정성 특징을 보이는 재조합 아데노바이러스(즉, 예를 들어, 당업자에게 이용가능한 임의의 포유류/인간 유전자 요법- 또는 유전자 백신접종-기반의 방법에서, 숙주 투여 이후에 표적 숙주 내에서 발현되는 트랜스유전자의 전체 또는 일부를 함유하는 아데노바이러스)를 위한 제형이다. 더욱 바람직한 범위는 약 1×109 내지 1×1013 vp/㎖이며, 특히 바람직한 바이러스 농도는 약 1×1010 내지 5×1012 vp/㎖이다. 본 발명의 제형의 치료적 또는 예방적 조성물은 각각의 장애를 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 개체에게 투여될 수 있다. 인간 투여를 위한 유효량은 물론 다양한 인자, 예를 들어, 개체의 질환, 체중, 연령 및 성별에 따라 달라질 수 있다. 다른 인자는 투여 방식을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 비경구 이용에 적합하다.
본 발명의 제형은 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD)을 추가로 포함하며 임의로 2- 또는 4-탄소 알코올을 포함하는 5.5 내지 6.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 완충 용액이다. 예상치 않게, 상기 조합은 본 명세서에 입증된 바와 같이 아데노바이러스의 양, 효력(감염성) 및 질의 보존에 뛰어난 제형인 것으로 입증되었다.
바람직한 구현예에서, 시트르산염의 농도는 약 5 mM 내지 30 mM, 예를 들어, 약 5 mM 내지 25 mM, 예를 들어, 약 10 mM 내지 25 mM 범위, 예를 들어, 약 20 mM이다.
큰 온도 범위에 걸쳐 연장된 보관 기간 동안에 바이러스 안정화에 기여하는 이들 제형 중 다른 필수 성분은 동결보호제로 사용되는 HBCD이다. 바람직한 구현예에서, HBCD의 농도는 약 1%(w/w) 내지 10%(w/w), 예를 들어, 약 3%(w/w) 내지 8%(w/w), 예를 들어, 약 4%(w/w) 내지 6%(w/w) 범위, 예를 들어, 약 5%(w/w)이다. 본 발명의 제형의 추가의 성분은 염이다. 염은 바이러스 안정성을 증진시킨다. 제형에 염을 포함하는 목적은 요망되는 이온 세기 또는 삼투압몰농도를 유지하고 추가로 정전기 상호작용을 최적화시키는 것이다. 염은 숙주에 생리학적으로 허용되는 삼투압몰농도로 존재한다. 이온 세기에 대한 기여는 완충 화합물에 의해 생성되는 이온으로부터 및 비완충 염의 이온으로부터 비롯될 수 있다. 본 발명의 제형에 적절한 염은 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl2) 또는 염화망간(MnCl2)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 종래 기술과 대조적으로, 염화마그네슘(MgCl2)은 아데노바이러스 안정성에 유해한 것으로 나타났다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 제형에는 염화마그네슘이 존재하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 제형은 염화나트륨(NaCl)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 염화나트륨의 농도는 약 10 mM 내지 250 mM, 예를 들어, 약 20 mM 내지 200 mM, 예를 들어, 약 30 mM 내지 150 mM, 예를 들어, 약 50 mM 내지 100 mM 범위, 예를 들어, 약 80 mM이다.
본 발명의 제형은 용기 표면으로의 흡수를 줄이기 위해 첨가되고, (예를 들어, 응집을 감소시킴으로써) 아마도 증가된 바이러스 안정성을 제공하는 적어도 하나의 비이온성 세제(비이온성 계면활성제로도 지칭)를 포함한다. 본 발명의 제형에 사용하기 위한 비이온성 세제는 폴리소르베이트-80(트윈 80®), 폴리소르베이트-60(트윈 60®), 폴리소르베이트-40(트윈 40®) 및 폴리소르베이트-20(트윈 20®) 및 비이온성 계면활성제의 플루로닉(Pluronic) 시리즈(예를 들어, 플루로닉 121)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.001%(w/w) 내지 1%(w/w), 예를 들어, 약 0.005%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 예를 들어, 약 0.01%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 예를 들어, 약 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 예를 들어, 약 0.015%(w/w) 내지 0.03%(w/w) 범위, 예를 들어, 약 0.025%(w/w)이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 제형은 폴리소르베이트-80을 포함한다. 폴리소르베이트-80의 농도는 바람직하게는 약 0.001%(w/w) 내지 1%(w/w), 예를 들어, 약 0.005%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 예를 들어, 약 0.01%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 예를 들어, 약 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 예를 들어, 약 0.015%(w/w) 내지 0.03%(w/w) 범위, 예를 들어, 약 0.025%(w/w)이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 제형은 EDTA를 추가로 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, EDTA의 농도는 약 0.05 mM 내지 0.2 mM, 예를 들어, 약 0.05 mM 내지 0.15 mM, 예를 들어, 약 0.08 mM 내지 0.12 mM 범위, 예를 들어, 약 0.1 mM이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 제형은 에탄올을 추가로 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 에탄올의 농도는 약 0.1%(w/w) 내지 1%(w/w), 예를 들어, 약 0.2%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 예를 들어, 약 0.2%(w/w) 내지 0.6%(w/w) 범위, 예를 들어, 약 0.4%(w/w)이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 제형이 에탄올을 포함하는 경우, 그것은 본질적으로 동시에 EDTA를 포함하지 않아야 한다.
상기 논의를 고려하여, 본 발명은 해당 분야에 알려져 있는 최적으로 수행되는 제형(문헌[Evans et al. 2004]에 개시)에 비하여 개선된 안정성 특성을 보이며, 적어도 시트르산염 완충제, 동결보호제로서 HBCD, 염 및 계면활성제를 함유하는, 예를 들어, 유전자 요법 및/또는 유전자 백신접종 응용에 사용될 수 있는 아데노바이러스, 예를 들어, 재조합 Ad5, Ad26 또는 Ad35를 함유하는 제형에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예는 시트르산염으로 5.5 내지 6.5 범위의 pH로 완충되고, 하이드록시프로필-베타 사이클로덱스트린(HBCD), 염, 비이온성 세제 및 2 또는 4-탄소 알코올을 추가로 포함하는 그러한 재조합 아데노바이러스 제형에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 pH 5.5 내지 pH 6.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 완충제를 포함하며, 동결보호제로서 HBCD, 염으로서 NaCl, 계면활성제로서 폴리소르베이트-80, 그리고 추가의 이례적인 동결보호제로서 2- 또는 4-탄소 알코올을 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 pH 5.5 내지 pH 6.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 완충제를 포함하며, 동결보호제로서 HBCD, 염으로서 NaCl, 계면활성제로서 폴리소르베이트-80, 그리고 EDTA를 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 pH 5.5 내지 pH 6.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 완충제를 포함하며, 동결보호제로서 HBCD, 염으로서 NaCl, 계면활성제로서 폴리소르베이트-80, 그리고 추가의 이례적인 동결보호제로서 에탄올을 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 pH 5.5 내지 pH 6.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 완충제를 포함하며, 동결보호제로서 HBCD, 염으로서 NaCl, 계면활성제로서 폴리소르베이트-80을 포함한다. 이러한 제형은 에탄올을 추가로 포함하며, EDTA가 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.9 내지 6.2 범위의 pH를 가지며, 약 10 내지 25 mM 범위의 농도의 시트르산염; 4%(w/w) 내지 6%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 70 mM 내지 100 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.018%(w/w) 내지 0.035%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.3%(w/w) 내지 0.45%(w/w) 범위의 농도의 에탄올을 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.8 내지 6.2 범위의 pH를 가지며, 약 15 내지 25 mM 범위의 농도의 시트르산염; 3%(w/w) 내지 8%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 50 mM 내지 100 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.01%(w/w) 내지 0.03%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.05 mM 내지 0.15 mM 범위의 농도의 EDTA를 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 구현예에서, 제형은 약 5.9 내지 6.2 범위의 pH를 가지며, 약 10 내지 25 mM 범위의 농도의 시트르산염; 4%(w/w) 내지 6%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 70 mM 내지 100 mM 범위의 농도의 NaCl; 약 0.018%(w/w) 내지 0.035%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 약 0.05 mM 내지 0.15 mM 범위의 농도의 EDTA를 포함한다.
본 발명의 더더욱 바람직한 구현예에서, 제형은 약 20 mM 시트르산염을 사용하여 약 6의 pH로 완충되고; HBCD는 약 5%(w/w)의 농도로 존재하며; NaCl은 약 80 mM의 농도로 존재하고; 계면활성제는 약 0.025%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80이며; EDTA는 약 0.1 mM의 농도로 존재한다.
본 발명의 더더욱 바람직한 구현예에서, 제형은 약 20 mM 시트르산염을 사용하여 약 6의 pH로 완충되고; HBCD는 약 5%(w/w)의 농도로 존재하며; NaCl은 약 80 mM의 농도로 존재하고; 계면활성제는 약 0.025%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80이며; 에탄올은 약 0.4%(w/w)의 농도로 존재한다. 추가로, 상기 언급된 인자의 조합이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 제형은 바이얼, 예를 들어, DIN 2R I형 보로실리케이트 유리 바이얼에 수용된다. 다른 구현예에서, 제형은 백에 수용된다. 본 발명의 제형을 함유하는 백은 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트 코폴리머(EVA) 또는 에틸 비닐 알코올(EVOH)로 구성된 층을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 제형은 주사기에 수용된다.
본 명세서에 기재된 재조합 바이러스 제형은 해당 분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 척추동물 숙주(바람직하게는 포유동물 숙주, 특히 인간 수여자)에게 투여될 수 있다. 이들 전달 경로는 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 흡입 또는 비강내 전달, 경구 전달, 설하 투여, 피하 투여, 경피 투여, 피내 투여, 관내 침샘 투여, 피부통과(transcutaneous) 투여 또는 피부경유(percutaneous) 투여를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 비경구 투여와 상용성이다.
본 명세서에 개시된 제형에 따라, 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 바이러스 함유 제형을 제조하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 보존 방법에 관한 것이며, 그러한 제형은 -65℃ 미만, 약 2 내지 8℃ 범위 및 아마도 더 높은 온도에서 보관되는 경우, 개선된 바이러스 안정성을 야기하는 한편, 비경구 투여, 특히 인간으로의 비경구 투여와 상용성이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 제형을 제조하는 단계 및 상기 제형을 2℃ 내지 8℃ 범위의 온도에 보관하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 보존 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되나, 본 발명은 여기에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1.
실험 설계 및 방법
몇몇의 상이한 제형을 시험한 후에, 하나의 제형이 다른 것들을 능가하였다. 이러한 새로운 제형을 "제형 B"로 명명하였으며, 6.0의 pH에서 5%(w/w) HBCD, 20 mM 시트르산염, 0.02%(w/w) PS-80 및 75 mM NaCl을 포함한다.
2개의 아데노바이러스(Ad35.TB-S 및 Ad26.Mos1.Gag-Pol) 제제(혈청형 35 아데노바이러스(Ad35)를 포함하는 것 및 혈청형 26 아데노바이러스(Ad26)를 포함하는 것)를 PD-10 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 제형 B로 완충제-교환하였다.
둘 모두의 아데노바이러스 제제를 또한, "대조군 제형"에서 제형화하였으며, 이는 문헌[Evans et al. 2004]에 기재되어 있고, 지금까지 이용가능한 최적의 제형이었다. 상기 "대조군 제형"은 7.4의 pH에서 10 mM 트리스, 10 mM 히스티딘, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5%(w/w) 수크로스, 0.02%(w/w) PS-80, 0.1 mM EDTA, 0.4%(w/w) EtOH를 포함한다.
제형마다, 12개의 컬럼을 사용하고; 용리액을 풀링하고, 살균 여과하고, 유리 병에서 2 내지 8℃에 보관하였다. vp-QPCR에 의한 바이러스 역가 결정을 위하여 시료를 취하고, 모든 역가를 적절한 완충제 제형을 사용하여 1.7×1011 vp/㎖로 조정하였다. 이후에, 제형을 유리 바이얼에 채우고(바이얼마다 0.7 ㎖), 마개로 막고, 캡핑시켰다.
t=0 시료(대조군, 그룹마다 6개 바이얼)를 바로 -65℃ 이하에 보관하였다. 그 후에, 그룹마다 6개의 바이얼(n=6)을 25℃에서 인큐베이션시키고, QPA에 의한 시료 분석을 시료마다 3중으로 수행할 때까지 t=10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80 및 90일에 -65℃ 이하에서 동결시켰다.
또한, 둘 모두의 제형에서 벡터에 대한 t=0 시료를 TMA(열 용융 검정)에 의해 분석하여, 캡시드 융점을 결정하였다. 더 높은 융점은 더 높은 바이러스 캡시드의 열 안정성과 상호관련이 있다. 또한, 종점 시료(t=90일)를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 시차 원심 침강(DCS)에 의해 분석하고, t=0 대조군과 비교하였다.
결과 및 결론
연구의 완료 후에, 모든 시료를 QPA에 의해 분석하고, 효력의 소실은 t=0 값을 제함으로써 델타로 표현하였다. 본 발명에 따른 제형 B(백색 마름모)는 둘 모두의 아데노바이러스에 대하여 시간에 따라 더 적은 분해 및 더 긴 예측되는 보관 수명(표 1)을 야기하여, 대조군 제형(흑색 원)을 유의미하게(p=1.44E-05) 능가하였다(도 1 및 도 2). 통계적 분석 시스템(SAS 소프트웨어)을 사용하여, 선형(Ad26) 및 이차(Ad35) 모델을 고정된 효과로서 시간 및 시간의 제곱을 사용하여 효력 데이터에 핏팅시켰다. 고정된 '시간' 효과는 효력의 선형 감소를 나타내며, 고정된 '시간*시간' 효과는 이러한 감소의 곡률을 나타낸다. 둘 모두의 효과를 그들의 유의성을 평가하기 위해 모델에서 사용하였다. 아카이케 정보 기준(Akaike Information Criterion; AIC)은 모델의 복잡성 및 그의 핏팅 정확도를 고려한, 통계적 모델의 상대적 질에 대한 척도이다. AIC가 더 작을수록, 모델 핏팅이 더 낫다. 선형 모델에서, 기울기는 효력 저하 속도를 나타낸다. 기울기를 비교함으로써, 최적의 완충제(가장 낮은 기울기)를 확인할 수 있다.
보관 수명은 이러한 구간의 하한이 주어진 규격(즉, 효력의 감소) 아래로 지나는 시점과 일치한다. 이차 모델에 대하여, 보관 수명을 계산하기 위하여, 평균 주변의 양측 95% 신뢰 구간을 취하였다. 보관 수명 평가를 위해 오직 하계만을 유지하여, 단변량 하한 신뢰 구간에 대하여 97.5% 신뢰 수준을 야기한다. 절편(t=0에서의 효력 반영)을 평균을 내고, 미가공 데이터 및 모델로부터 없앴다. 보관 수명을 둘 모두의 제형에 대하여 계산하였다.
[표 1]
Figure 112016031491346-pct00001

RP-HPLC는 아데노 단백질 변형 또는 산화의 어떠한 징후도 보이지 않았다. DCS는 어떠한 응집의 징후도 드러내지 않았다. 추가로, 본 발명에 따른 제형은 Ad26(도 3) 및 Ad35(도 4) 둘 모두에 대하여 대조군 제형에 비하여 유의미하게 증가된 융점을 야기하였으며, 이는 제형 B에서의 아데노바이러스의 증가된 안정성을 나타낸다.
실시예 2
실험 설계 및 방법
실시예 1에 기재된 실험 이후에, 하나의 또는 몇몇의 성분(NaCl, 에탄올, EDTA 또는 그들의 조합)을 부가하거나 생략함으로써 제형 B를 변형시켜, 8개의 실험적 제형(A 내지 H, 표 2 참조)을 생성하여, 대조군 제형(문헌[Evans et al.]에 기재되고, 본 명세서에서 상기에 상세화됨)과 비교하였다. 모든 제형은 5% HBCD, 20 mM 시트르산염 및 0.02% PS-80을 함유한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 제형은 추가로 75 mM NaCl, 0.1 mM EDTA 및/또는 0.5% 에탄올(EtOH)을 포함한다. 아데노바이러스(Ad26)를 이들 9개의 제형에서 25℃에서 69일 동안 또는 35℃에서 16일 동안 인큐베이션시키거나, 30 사이클의 동결/해동 후에 교반(실온에서 1일)에 노출시켰다. 효력 소실을 QPA에 의해 평가하고, 델타(t=0을 뺀) Ct(역치 사이클) 값으로 표현하였다. 또한, 350 ㎚에서의 흡광도를 탁도에 대한 척도로서 판독하고, 고유 형광을 측정하여, 입체형태적 단백질 변화 및 응집을 검출하였다. 마지막으로, TMA 및 vp-QPCR을 수행하여, 융점 및 vp/IU 비를 결정하였다.
[표 2]
Figure 112016031491346-pct00002

결과 및 결론
도 5에 나타낸 25℃ 안정성 결과에 기초하여, EDTA(C 및 D) 또는 에탄올(E 및 F)과 조합하여 NaCl의 첨가가 바이러스 안정성에 명백하게 유리한 것으로 결론을 지을 수 있으며, 여기서, 에탄올은 명백하게 EDTA를 능가한다. 예상치 않게, NaCl과 함께 또는 이것 없이, EDTA 및 에탄올의 조합은 더욱 안정한 제형을 야기하지 않는다(G 및 H). 이것은 EDTA/EtOH의 특정 조합이 통상적으로 자유 라디칼 산화의 억제제이고, 그와 함께 아데노바이러스 안정성의 뛰어난 증진제인 것으로 언급되는 종래 기술, 예를 들어, 문헌[Altaras et al, 2005] 및 문헌[Evans et al. 2004]으로부터 예상되는 것과 반대이다.
더 가혹한 모델, 16일 동안 35℃로 옮겨, 도 6에서 관찰될 수 있는 바와 같이 식별력이 더욱 확연하게 되었다. 명백하게, NaCl의 첨가는 안정성을 개선시키고, 에탄올의 유리한 효과가 도 6에서 확인된다. 놀랍게도, NaCl과 함께 또는 이것 없이 에탄올과 EDTA의 조합은 바이러스 안정성에 명백한 부정적인 영향을 갖는다. 이것은 EDTA/EtOH의 조합이 자유 라디칼 산화의 억제제로서 잘 작용한다는 통상의 인식(예를 들어, 문헌[Altaras et al. 2005] 및 문헌[Evans et al. 2004])에 맞지 않는다. 함께 취하여, 둘 모두의 열 응력 요인은 이러한 특정 제형에서 EDTA 또는 에탄올과 조합되는 NaCl의 유리한 효과를 보여준다.
상이한 분해 경로를 갖는 제형의 성능을 조사하기 위하여, 상기 제형(A 내지 H)을 동결/해동 사이클 및 교반 응력에 노출시켰다(도 7). 관찰된 효과는 확연하고, 예상치 못한 것이다. 명백하게, EDTA(C 및 D)는 어떠한 효과도 갖지 않았다. 반면, 에탄올은 동결/해동 손상에 대하여 강력하게 보호하였으며, 결과적으로 동결보호제로서 작용하였다(E 내지 H).
이들 예측가능하지 않은 결과를 비탁법 검정에서 350 ㎚에서의 흡광도 판독에 의해 확인하였다(도 8). 동결/해동(도 8에서 백색 사각형)은 에탄올이 없는 제형에서 t=0에 비하여 탁도의 감소를 야기하였다. 이러한 감소는 아마도 바이러스 입자의 붕해로 인한 것이었을 것이다. 이들 관찰과 함께, 가속화된 온도 응력(도 8에서 흑색 삼각형)은 또한 에탄올-부재 제형에서 탁도의 감소를 야기하는 한편, 에탄올이 있는 제형, 특히 제형 F는 t=0(도 8에서 흑색 원) 시료와 비교하여 유의미한 변화를 나타내지 않는다.
또한, 고유 형광(도 9)은 이전의 관찰을 추가로 확인시켜준다. 에탄올이 없는 제형은 t=0에 비하여 동결/해동 응력 후에 트립토판 형광의 실질적인 감소를 야기하였으며(도 9에서 백색 사각형), 이는 바이러스 캡시드의 심각한 입체형태 변화를 나타낸다. 현저하게 대조적으로, 에탄올이 있는 제형은 이러한 응력 요인으로부터 바이러스를 보호한다. 열 응력은 에탄올을 함유하는 제형에 미소한 영향만을 가졌다.
TMA 데이터에 의해, 대조군 제형에 비하여 유의미하게 증가된 제형 F의 융점이 드러났으며(도 10), 이는 제형 F에서 더욱 안정한 바이러스 캡시드를 나타낸다.
중요한 것은, 바이러스 제제의 감염비(바이러스 입자의 질을 나타냄)를 반영하는 vp/IU 비가 가속 온도(25℃)에 대한 노출 후에 제형 F에 비하여 대조군 제형에서 더 큰 값(입자의 총량마다 더 적은 감염 입자)을 드러냈다는 것이며, 표 3을 참조한다. 이것은 제형 F가 대조군 제형에 비하여 훨씬 더 큰 방식으로 아데노바이러스의 감염성을 보존할 수 있음을 보여준다.
[표 3]
Figure 112016031491346-pct00003

실시예 3.
실험적 설계 및 방법
제형 완충제 설계 공간을 한정하기 위하여, 각각의 부형제에 대한 강건성 범위를 평가하였다. 인자를 선택한 후에, 실험 범위를 표 4에 기록된 바와 같이 각 성분에 대하여 한정하였다.
실험 설계(DOE)을 따라, 실험 공간을 맵핑하였다. 6가지 인자의 각각에 대하여 낮은 수준 및 높은 수준을 갖는 설계를 사용하여(표 4), 3개의 중심점을 포함하는 15개의 제형을 제조하여, 높은 통계적 검증력으로 각 인자의 효과 및 인자 간의 가능한 상호작용(표 5)을 연구하였다.
[표 4]
Figure 112016031491346-pct00004

[표 5]
Figure 112016031491346-pct00005

각각의 부형제 및 pH에 대한 적절한 수준(제형 강건성)을 평가하기 위하여, 각 그룹을 유리 바이얼에 채우고, 10 사이클의 동결/해동(F/T)으로 처리한 후, 실온(RT)에서 200 rpm에서 1일 교반하고, 35℃에서 7일 동안 보관하였다(가속화 분해 모델). 그 다음, QPA(n=3)에 의한 효력을 판독치로 사용하였다.
Ad26 제제를 PD-10 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 표 5에 열거된 각각의 제형으로 완충제-교환하였다. 각 제형의 용리액을 풀링하고, 살균 여과하고, 유리 병에서 2 내지 8℃에 보관하였다. vp-QPCR에 의한 바이러스 역가 결정을 위하여 시료를 취하고, 모든 역가를 적절한 제형을 사용하여 1×1011 vp/㎖로 조정하였다. 이후에, 제형을 유리 바이얼에 채우고(바이얼마다 0.75 ㎖), 마개로 막고, 캡핑시켰다. t=0 시료(대조군, 그룹마다 6개 바이얼)를 바로 -65℃ 이하에 보관하였다. 그 후에, QPA에 의한 시료 분석을 시료마다 3중으로 수행할 때까지 그룹마다 4개의 바이얼(n=4)을 동결/해동 인큐베이션시키고, 교반시키고, 35℃에서 7일 동안 보관하였다(표 6).
결과 및 결론
연구의 완료 후에, 모든 시료를 QPA에 의해 분석하고, 효력의 소실을 t=0 값을 제함으로써 델타로 표현하였다. 이러한 데이터를 통계적 분석을 위해 사용하였다.
통계적 분석의 산출물은 성공 확률이었으며, 여기서, 성공은 선택된 중요 품질 특성(CQA):효력에 대하여 설정된 규격을 만족시키는 안정한 제형으로 정의된다. T0 내지 응력 후에 동등성 시험을 수행하였고: 동등성을 비교하기 위하여 허용 기준을 용인될 수 있는 효력의 최대 소실(IU/㎖)에 대하여 정의하였고: 이러한 실험에서 허용된 효력 소실을 -0.30 log IU/㎖ 이상의 Δ효력 제한으로 정의하였다.
수득된 실험적 데이터는 표 6에 나타나 있으며, 이를 사용하여, 실험 도메인을 줄이고, 효력에 기초하여 설계 공간을 산출하였다.
데이터는 45회의 관찰을 포함한다. 12가지의 상이한 완충제를 3중으로 시험하였으며, 추가의 것은 따로 3회 제조하고, 각각의 독립적인 제제를 3중으로 시험하였다(중심점).
[표 6]
Figure 112016031491346-pct00006

Figure 112016031491346-pct00007

하기의 모델을 데이터에 핏팅시켰다:
delta_log_potency[i] ~ normal(mu[i], sigma);
for(i in 1:Nobs){
mu[i] <- alpha_0 +
alpha_pH * pH[i] +
alpha_citrate * citrate[i] +
alpha_HBCD * HBCD[i] +
alpha_EtOH * EtOH[i] +
alpha_PS_80 * PS_80[i] +
alpha_NaCl * NaCl[i] +
alpha_HBCD2 * HBCD[i] * HBCD[i] +
alpha_PS_802 * PS_80[i] * PS_80[i] +
alpha_pH_HBCD * pH[i] * HBCD[i] +
alpha_pH_NaCl * pH[i] * NaCl[i] +
alpha_r_batch[batch[i]];
여기서, alpha_r_batch는 무작위 뱃치 및 시그마 잔차 오차를 나타낸다.
모델로부터 예측을 얻어, 위험 기반의 설계 공간 방법을 얻기 위하여, 베이지안(Bayesian) 프레임워크를 채용하였는데, 이는 제형 파라미터를 고려하여 CQA의 예측 결합 분포가 용이하게 유래될 수 있기 때문이다(문헌[Peterson et al.] 및 문헌[Lebrun et al.] 참조). 위험-기반의 설계 공간은 하기의 확률 서술을 사용하여 정의된다:
Figure 112016031491346-pct00008

다시 말하면, 설계 공간은 실험 도메인 χ의 영역(종종 지식 공간으로 지칭)이며, 여기서, CQA가 규격(Λ) 내에 있는 사후 확률은 관찰된 데이터를 고려하여 특정 품질 수준 π보다 더 높다. 이러한 표기는 통계 모델에서 포함되는 불확실성의 포함을 암시하게 한다. 확률은 공동으로 규격의 충족을 보장하는 직접적인 척도이다. 이러한 확률을 계산하기 위하여, 통계 모델은 하기의 일반 1차 방정식으로 표기될 수 있다. jth CQA에 대하여, 모델이 조정된다:
Figure 112016031491346-pct00009

여기서, yi는 우수한 통계적 특성(예를 들어, 아이덴티티, 로그 또는 로짓 변환)을 얻기 위하여 ith CQA에 적용되는 임의의 변환이며, i는 1,…,7이다. 모델 파라미터 bi 및 σi 2가 추정되어야 한다(상기 조항 참조).
식 (1)의 사후 확률을 하기의 스튜던츠(Student's) 분포로 확인된 신규한 반응의 예측 분포로부터 계산한다(첨자 i는 단순화를 위하여 생략됨):
Figure 112016031491346-pct00010

이러한 3-파라미터 스튜던츠 분포는 (n회 관찰 및 p개 모델 파라미터에 대하여) n - p 자유도를 가지며,
Figure 112016031491346-pct00011
의 최소 제곱법으로부터 계산된 평균 회귀선
Figure 112016031491346-pct00012
에 집중된다.
Figure 112016031491346-pct00013
, 여기서, 파라미터 a는 잔차 제곱합이며, 다시 말하면,
Figure 112016031491346-pct00014
이다. 따라서, S는 스튜던츠 분포의 스케일을 정의한다. 분산 추정량은 S/(n-p)로 계산된다.
실험 도메인을 탐구하기 위하여, 5가지 인자에 대하여 그리드(grid)를 생성하는 것이 권고되지 않는다(차원수 문제 때문에: 인자당 2가지 수준을 평가한다면, 그것은 25-크기의 그리드를 야기할 것이며; 인자당 10가지 수준이면, 그것은 105-크기의 그리드를 야기하는 등일 것이다). 대신에, 무작위 시료의 수를 생성하고, 하기와 같이 조사하였다:
a) 실험 도메인 내에서 높은 수의 무작위(χ에 대하여 균일하게 분포) 작동 조건(인자 설정)
Figure 112016031491346-pct00015
을 선택한다.
b) 각각의 작동 조건에 대하여: 다수의 모의실험을 수행한다:
각 CQA에 대하여 식 (3)에서와 같이 예측 분포로부터 n* 시료
Figure 112016031491346-pct00016
를 도출한다.
c) CQA 예측의 상이한 모의실험으로부터 규격 내의 시료의 비를 계산한다.
이러한 비는 중요 품질 특성 및 그들의 규격을 고려하여 품질 출력을 수득하기 위한 사후 확률 추정치이다. 마지막으로, 2차원 공간에서 결과의 예상의 페어 플롯에 대한 무작위 작동 분포를 육안으로 평가하여, 설계 공간을 확인하는 것이 제안된다(도 11).
그 다음, 계산을 조정하고, 인자 범위를 감소시켜, 소위 정상 작동 범위(NOR) 및 설계 공간을 반영하는 이들 범위에서 CQA 효력에 대한 성공 확률을 최대화시켰다(표 7). 표 7에 나타낸 범위는 가장 높은 성공 확률이 안정적인 제형을 갖게 보장한다. 이에 따라, 이들 범위는 최적의 제품 안정성을 보장한다.
[표 7]
Figure 112016031491346-pct00017

참고 문헌
Figure 112016031491346-pct00018

Claims (18)

  1. a) 재조합 아데노바이러스;
    b) 시트르산염 완충제;
    c) 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD);
    d) 염;
    e) 비이온성 세제를 포함하는 아데노바이러스를 위한 제형으로서,
    상기 제형이 5.5 내지 6.5 범위의 pH를 갖는 액체 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시트르산염 농도가 5 mM 내지 30 mM 범위인 제형.
  3. 제1항에 있어서, HBCD의 농도가 1%(w/w) 내지 10%(w/w) 범위인 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염이 염화나트륨인 제형.
  5. 제4항에 있어서, 상기 염화나트륨 농도가 20 mM 내지 약 200 mM 범위인 제형.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 세제가 폴리소르베이트(Polysorbate)-80인 제형.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리소르베이트-80 농도가 0.005%(w/w) 내지 0.5%(w/w) 범위인 제형.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제형이 5.7 내지 6.3 범위의 pH를 가지며, 5 내지 30 mM 범위의 농도의 시트르산염; 1%(w/w) 내지 10%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 20 mM 내지 200 mM 범위의 농도의 NaCl; 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80을 포함하는 제형.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제형이 2 또는 4-탄소 알코올을 추가로 포함하는 제형.
  10. 제9항에 있어서, 상기 2 또는 4-탄소 알코올이 에탄올인 제형.
  11. 제10항에 있어서, 상기 에탄올 농도가 0.1%(w/w) 내지 1%(w/w) 범위인 제형.
  12. 제9항에 있어서, 상기 제형이 5.7 내지 6.3 범위의 pH를 가지며, 5 내지 30 mM 범위의 농도의 시트르산염; 1%(w/w) 내지 10%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 20 mM 내지 200 mM 범위의 농도의 NaCl; 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 0.2%(w/w) 내지 0.6%(w/w) 범위의 농도의 에탄올을 포함하는 제형.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제형이 6의 pH를 가지며, 20 mM의 농도의 시트르산염; 5%(w/w)의 농도의 HBCD; 80 mM의 농도의 NaCl; 0.025%(w/w)의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 0.4%(w/w)의 농도의 에탄올을 포함하는 제형.
  14. 제10항에 있어서, 상기 제형이 5.9 내지 6.2 범위의 pH를 가지며, 10 내지 25 mM 범위의 농도의 시트르산염; 4%(w/w) 내지 6%(w/w) 범위의 농도의 HBCD; 70 mM 내지 100 mM 범위의 농도의 NaCl; 0.018%(w/w) 내지 0.035%(w/w) 범위의 농도의 폴리소르베이트-80; 및 0.3%(w/w) 내지 0.45%(w/w) 범위의 농도의 에탄올을 포함하는 제형.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제형이 동결된 액체 제형인 제형.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제형이 비경구 이용에 적합한 제형.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제형을 제조하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 보존 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제형을 제조하는 단계 및 상기 제형을 2℃ 내지 8℃ 범위의 온도에 보관하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 보존 방법.
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