WO2005085427A1

WO2005085427A1 - ラット胚性幹細胞

Info

Publication number: WO2005085427A1
Application number: PCT/JP2005/003841
Authority: WO
Inventors: Takumi Teratani; Takahiro Ochiya
Original assignee: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-04
Filing date: 2005-03-01
Publication date: 2005-09-15
Also published as: US8137966B2; KR20120091471A; EP1726640A4; US8628957B2; KR20070007120A; JP2012024088A; JP4862119B2; JP5588405B2; US20170311578A1; EP1726640A1; US10561122B2; US20070186293A1; EP1726640B1; US20120142092A1; US20140109247A1; US9700023B2; JPWO2005085427A1; KR101386690B1

Abstract

　(a) Oct3/4遺伝子およびNanog遺伝子を発現する、(b) アルカリホスファターゼ活性陽性である、(c) 胚様体形成能を有する、(d) SSEA(胎児ステージ特異的抗原)-1およびSSEA-4を発現する、(e) 正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、(f) 未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、(g) インビトロで多分化能を有する、(h) 三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、(i) 奇形腫形成能を有する、及び(j) キメララット作製能を有する、という性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞、および前記ラット胚性幹細胞の樹立方法等を提供する。

Description

明細書

ラット胚性幹細胞技術分野

本楽明は、ラット胚性幹細胞（以下 ES細胞）に関する。より詳細には、本発明は、ラット ES細胞、ラット ES細胞の製造方法、ラット ES細胞の継代培養方法、ラット ES細胞を用いた分化誘導関連物質のスクリ一ユング方法、および遺伝子改変ラットの作製における前記ラット ES細胞の使用などに関する。背景技術

ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊より樹立された細胞株で、白血病阻害因子（leukemi a inhibitory factor； LIF)の存在下で自己複製することができる細胞である。培養条件を変えることにより、 ES細胞をあらゆる種類の細胞（神経細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、赤血球、白血球、血小板、骨、軟骨、腎臓、腸、肝臓、膝臓、肺など）に分化させることができる。ゲノムプロジェクトにより多くの動物種のゲノムが解読され、ヒトとの相同性に関する情報が蓄積されてきた。これらの情報に基づき ES細胞の段階で特定の遺伝子を破壌し、その遺伝子が細胞の分化あるいは個体の成育、恒常性の維持などに果たす役割（機能）を知ることができる。具体的には特定の遺伝子を破壊した ES細胞を正常な宿主の胚盤胞に注入して宿主胚の細胞と混ぜ子宮に戻すとキメラ動物を作ることができ、得られたキメラ動物を交配させることにより特定の遺伝子が破壌された動物（ノックアウト動物）を作製することができる。また、 ES細胞に化合物を作用させることで、様々な細胞（臓器）中の遺伝子に与える影響を評価することができる。一方、 ES細胞を分化させて得られた正常な細胞を用いることで、細胞療法、再生医療が可能となる。以上のように ES細胞は生理学、薬理学や再生医療等の研究において幅広く応用することができる。しかしながら、実験動物においてはこれまでマウス（Evans M. J. et al.， Nature 1981, 292 ： 154-156) 、ァカゲザル (Thomson J. A. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995 ， 92： 7844-7848) 、マーモセット（Thomson J. A. , et al. , Cur. Top. Dev. Biol . 1998， 38 : 133—165) および力-クイザノレ (Suemori H, et al.， Methods Enzymo 1. 2003, 365： 419-429) の ES細胞が樹立されたのみであり、ラット ES細胞は未だ樹立されていない。

ラットはマウスに比べて約 10倍という実験上適当な大きさを有する哺乳動物であり、 ①細部の血管に容易に薬物投与可能である、 ②外科，移植実験が可能である、そして③組織を大量に採取可能である、といった利点を有する。これまで多くのヒト疾患モデルラットが開発 ·発見されており、ラットは医学をはじめとする各分野で広範に利用される最も有用な実験動物の一つである。ラットは過去 100年以来、現在も、がん、脳神経系、移植おょぴヒト多因子疾患などのモデルとして機能研究等に利用され、機能に関する膨大な研究資産の蓄積がある。特に脳地図の解析が進んでおり、かつ心理生理学における行動の研究においても情報が豊富である。マウスに比べて最大の弱点であった遺伝子解析についても、ラットゲノムの解析が進んでいることから、ヒトとの遺伝子レベルでの比較が可能となり、ポストゲノムを担う格好の実験動物として着目されている。実際、平成 1 4年 3月に開催された科学技術 ·学術審議会研究計画 ·評価分科会ライフサイエンス委員会バイオリソース領域小委員会も、ラットが今後我が国で充実すべきバイオリソースの一つであり、ノックアウトラットの産生を目的とした ES細胞の樹立が必要であると報告されている。

このようなラットの有用性とその周辺の遺伝子情報などの充実にもかかわらず、遺伝子改変ラット作製に欠くことの出来ないラット ES細胞の樹立は困難を極めていた。例えば Iannaccone PM et al.， Developmental Biology 1994, 163： 288-292 およびその対応の特許出願である W0 95/06716号公報には、ラット PVG株より ES細胞を樹立し、キメララットを作製したことが記載されている。しかしながらその後、 Brenin D.， et al. , Developmental Biology 1997, 185： 124-125 において、前記 Developmental Biology 1994, 163 : 288- 292で作製したキメララットはマウス ES 細胞の混入により作製されたとの記載がなされている。すなわちラット ES細胞の樹立およびキメララットの作製には成功しなかったことが示されている。また、他にもラット ES細胞の樹立を試みた例はあるが（TO 99/27076号公報及び特開 2002- 1769 73号公報を参照）、いずれもその樹立には到っていない。

このように、これまでに複数の研究グループがラット ES細胞株の樹立を試みているが、樹立には到っておらず、 2004年 1月に米国キーストンにて開催された STEM CE LL国際会議においてもラット ES細胞の樹立は世界中で報告は無いとの認識であった。ラット ES細胞の樹立の成功の鍵を握るのは ES細胞作製の培養条件の設定である。これまでマウス ES細胞の樹立および培養条件を基本にして樹立が試みられてきたが、ラット ES細胞の樹立には到っていない。このような背景から、ラット ES細胞の作出には培養条件の工夫が必要不可欠であると考えられている。発明の開示

本発明の目的は、従来得ることのできなかったラット ES細胞を提供することにある。またラット ES細胞の樹立方法、製造方法、ラット ES細胞の継代培養方法、ラット ES細胞を用いた分化誘導関連物質のスクリーニング方法、および遺伝子改変ラットの作製における前記ラット ES細胞の使用などを提供することにある。

本発明者らは、種々の系統のラットに由来する胚盤胞からラット ES細胞の樹立を試みた結果、マゥス ES細胞とは全く異なる培養条件 ·継代条件を確立することにより、ラット ES細胞株を樹立することに成功した。具体的には、実質的に血清を含有しない培養液を用い、内部細胞塊の単離及び ES細胞の継代において物理的手法により樹立を試みるなど種々の工夫をこらすことにより、安定的かつ ES細胞の条件を全て満たしたラット ES細胞を樹立 ·供給することに初めて成功した。

本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったも、のである。

すなわち本発明は、下記に掲げるものである：

( 1 ) 以下の ( 〜 G)の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞：

(a) 0ct3/4遺伝子および Nanog遺伝子を発現する、

(b) アルカリホスファターゼ活~生陽性である、

(c) 胚様体形成能を有する、

(d) SSEA (胎児ステージ特異的抗原) -1および SSEA- 4を発現する、

(e) 正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、

(f) 未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、

(g) インビトロで多分化能を有する、

(h) 三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、 (i) 奇形腫形成能を有する、

(j) キメララット作製能を有する、

(2) さらに (k) 20%血清存在下での培養により分化する、という性質を有する、前記（1) 記載のラット胚性幹細胞、

(3) 実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（A)〜(D) の工程を含むプロセスを行うことにより得られる、ラット胚性幹細胞：

(A) ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、

(B) 解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、

(C) 継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代 •培養する工程、

(D) さらに継代 ·培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、

(4) 培養液が血清代替試薬を含有する、前記（3) 記載の胚性幹細胞、 (5) 工程 (A)が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、前記（3) または

(4) 記載の胚性幹細胞、

(6) 工程 (C)が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、前記（3) 〜（5 ) いずれか記載の胚性幹細胞、

(7) 工程 (A)においてラット由来白血病阻害因子（rLIF) を含有しない培養液を用いる、前記（3) 〜（6) いずれ力記載の性幹細胞、

(8) 工程 (B)〜(D)において rLIFを含有する培養液を用いる、前記（3) 〜（7 ) いずれ力記載の胚性幹細胞、

(9) 培養においてフィーダ一細胞を用いる、前記（3) 〜（8) いずれか記載の胚性幹細胞、

(10) フィーダ一細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記（9) 記載の胚性幹細胞、

(1 1) ウィスターキヨゥト株（WKY)、ウィスターハノーバーギヤラス株（WHG) 及びブラウンノルウェー株（BN)のいずれかの系統に由来する、前記（1) 〜（1 0) いずれか記載の胚性幹細胞、 (12) 実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（A)〜(D )の工程を含むプロセスを行うことを特徴とする、マウス以外の胚性幹細胞の製造方法：

(13) マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（12) 記載の製造方法、

(14) 培養液が血清代替試薬を含有する、前記（1 2) または（13) 記載の製造方法、

(15) 工程 (A)が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、前記（12) 〜

(14) いずれか記載の製造方法、

(16) 工程 (C)が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、前記（12) ~

(15) いずれか記載の製造方法、

(17) 工程 (A)において rLIFを含有しない培養液を用いる、前記（12) 〜（ 16) いずれか記載の製造方法、

(18) 工程 (B)〜(D)において rLIFを含有する培養液を用いる、前記（12) 〜 (17) いずれか記載の製造方法、

(19) 培養においてフィーダ一細胞を用いる、前記（1 2) 〜（18) いずれ力記載の製造方法、

(20) フィーダ一細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記（19) 記載の製造方法、

(21) ラット胚性幹細胞がウィスターキヨゥト株 (WKY)、ウィスターハノーバ一ギヤラス株 (WHG) 及ぴブラウンノルウェー株（BN)のいずれかの系統に由来する、前記（13) ~ (20) いずれか記載の製造方法、 (22) 細胞集塊を保持した状態で解離し継代することを特徴とする、マウス以外の胚性幹細胞の継代培養方法、

(23) マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（22) 記載の継代培養方法、

(24) 物理的に細胞を解離する工程を含む、前記（22) または（23) 記载の継代培養方法、

(25) 実質的に血清を含有しない培養液を用いて培養することを特徴とする、前記（22) 〜（24) いずれ力記載の継代培養方法、

(26) 培養液が血清代替試薬を含有するものである、前記（25) 記載の継代培養方法、

(27) 培養液が rLIFを含有するものである、前記（25) または（26) 記載の継代培養方法、

(28) 血清代替試薬および rLIFを含有する、マウス以外の胚性幹細胞用培養液 (29) マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（28) 記載の培養液、

(30) 血清代替試薬および rLIFを成分として含有する、マウス以外の胚性幹細胞培養キット、

(31) マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記（30) 記載の培養キット、

(32) さらに前記 (1) 〜（1 1) いずれ力、記載のラット胚性幹細胞を成分として含有する、前記 (31) 記載の培養キット、

(33) さらにフィーダ一細胞を含有する、前記（30) 〜（32) いずれか記載の培養キット、

(34) フィーダ一細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記（33) 記載の培養キット、

(35) 前記（1) 〜（1 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導剤で刺激することを特徴とする、ラット胚性幹細胞の分化誘導方法、

(36) 分化誘導剤がレチノイン酸、増殖因子、ダルココルチコィドまたは細胞外基質である、前記（35) 記載の分化誘導方法、

(3 7) 前記（1) 〜（1 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞、

(3 8) 前記（1) 〜（： L 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞に由来する c D NAライブラリー、ゲノムライプラリーまたは細胞抽出物、

(3 9) 以下の（i)〜（iii)の工程を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリーユング方法：

(i) 被験物質を前記（1) 〜（1 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、

(ii) ラット胚性幹細胞の分化の有無や程度を評価する工程、

(iii) 上記 (ii)の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程、

(40) 以下の（I)〜（III)の工程を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法：

(I) 被験物質を前記（1) 〜（1 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、 '

(II) 胚性幹細胞の分化誘導条件下で前記（I)のラット胚性幹細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、

(III) 上記 (II)の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程、

(4 1) 前記（1) 〜（1 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞の、遺伝子改変ラットの作製における使用、

(4 2) 遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジエニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、前記（4 1) 記載の使用、

(4 3) 以下の（X)〜(Z)の工程を含むプロセスを行うことによる遺伝子改変ラットの製造方法：

(X) 前記（1) 〜（1 1) いずれか記載のラット胚性幹細胞に所望の遺伝子を導入する工程、 (Y) 遺伝子導入されたラット胚性幹細胞を含有する移植用卵を調製する工程、

(Ζ) 移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程、 ( 4 4 ) 前記（4 3 ) 記載の製造方法により製造された遺伝子改変ラット、 ( 4 5 ) 遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェ-ックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、前記（4 4 ) 記載のラット、 '

( 4 6 ) 実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（A)〜(D

) ：

(0 継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代 •培養する工程、

の工程を含むプロセスを行うことにより得られ、かつ以下の（a)〜（j) ：

(a) 0ct3/4遺伝子および Nanog遺伝子を発現する、

(b) アルカリホスファターゼ活性陽性である、

(c) 胚様体形成能を有する、、

(d) SSEA (胎児ステージ特異的抗原) - 1および SSEA-4を発現する、

(e) 正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、

(f) 未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、

(g) インビトロで多分化能を有する、

(h) 三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、

(i) 奇形腫形成能を有する、

(j) キメララット作製能を有する、

の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞、

( 4 7 ) さらに (k) 20%血清存在下での培養により分化する、という性質を有する、前記（4 6 ) 記載のラット胚性幹細胞、ならびに ( 4 8 ) ウィスターキヨゥト株（WKY)、ウィスターハノーバーギヤラス株（WHG) 及びブラウンノルウェー株（BN) のいずれかの系統に由来する、前記（4 6 ) または（4 7 ) 記載の胚性幹細胞。図面の簡単な説明

図 1は、ラット ES細胞樹立に用いたラット盤胞（後期）の写真である。

図 2は、ラット ES細胞樹立に用いたマイトマイシン C処理を施した正常マウス胎児繊維芽細胞（フィーダ一細胞）の写真である。

図 3は、ラット ES細胞樹立後におけるラット LIFの添加の必要性について検討した結果を示す図である。開始時は継代 5代目で、同一培養皿から各濃度の rLIFを添加した培養液にて 3回継代した時のアル力リホスファターゼ活性陽性率を調べた結果を示している。

図 4は、培養液における血清の有無の検討結果を示す写真である。それぞれ、（ A) 20%血清代替試薬 (KSR) を用いたラット由来内部細胞塊の形成写真、 (B) 20% ゥシ胎仔血清を用いたラット由来内部細胞塊の形成写真、（C) 20%血清代替試薬 (K SR) を用いて作製したラット由来内部細胞塊を、 20%血清代替試薬 (KSR) を添カロしたラット ES細胞用培養液とフィーダー細胞とを用いて培養した場合の形態写真、 (D) 20% ゥシ胎仔血清を用いて作製したラット由来内部細胞塊を、 20% ゥシ胎仔血清を添加したラット ES細胞用培養液とフィーダ一細胞とを用いて培養した場合の形態写真である。

図 5は、 5〜²0個の細胞集塊状態でラット ES細胞を継代した場合（a) )と、トリプシン · EDTA溶液で完全に単一細胞化して継代した場合 (b) )とを比較した結果を示す写真である。単一細胞化することにより自発的分化が発生する。

図 6は、ラット ES細胞樹立法の概略を示す図である。

図 7は、フィーダ一細胞とラット ES細胞樹立用培養液とを用いて、透明帯を除去したラット胚盤胞を培養し、内部細胞塊を形成させた写真である。矢印は形成させた内部細胞塊を示している。

図 8は、ラット由来内部細胞塊をラット ES細胞用培養液とフィーダ一細胞を用いて培養し、出現した初代ラット ES細胞の写真である。図 9は、 ES細胞コ口-一出現から 7日目の、継代可能となった状態のラット ES細胞の写真である。

図 1 0は、ラット ES細胞用培養液とフィーダ一細胞を用いて、安定的に増殖およぴ継代可能となったラット ES細胞（樹立ラット ES細胞）の細胞群を示す写真である。図中矢印はラット ES細胞塊を示す。

図 1 1は、樹立したラット ES細胞の形態を示した写真である。 a)は 100倍、 b)は 2 00倍、 c)は 400倍の写真である。

図 1 2は、樹立したラット ES細胞が未分化マーカー遺伝子を発現していることを示す RT-PCRの写真である。 ES細胞の代表的な未分化マーカー遺伝子である Oct 3/4 遺伝子および Nanog遺伝子の発現の有無を調べた。コントロールとして βァクチンの遺伝子発現も分析した。

図 1 3は、樹立したラット ES細胞が未分化能を有していることを証明する代表的な指標の一つであるアル力リホスファターゼ活性を示す写真である。

図 1 4は、樹立したラット ES細胞の胚様体形成能を分析した結果を示す写真である。約 20日目に心筋様に鼓動（矢印）する胚様体が多数確認された。

図 1 5は、樹立した細胞が ES細胞であることを示す指標マーカー抗体 4種類 ( (Α)： SSEA- 1、 (Β)： SSEA- 4、 (C)： TRA-ト 60、 (D)： TRA- 1-81)を用いて免疫染色を行つた結果を示す写真である。

図 1 6は、樹立したラット ES細胞を Gバンド法にて染色体数を解析した写真である。正常ラット細胞の染色体数 (2η=42) を示している。

図 1 7は、樹立したラット ES細胞の継代回数と未分化維持能力（アルカリホスファターゼ活性）の関係を示すグラフである。開始は継代回数 5代目からで、以後、 5 代目毎にアル力リホスファターゼ活性染色を行つた。縦軸は陽性 ES細胞コ口ニー数を全 ES細胞コ口ニー数で割った値を百分率にして示しており、横軸は継代回数を示している。

図 1 8は、樹立したラット ES細胞がインビトロ系において多分化能を有していることを示す写真である。胚様体形成開始 7日後に、ゼラチンコート培養皿に胚様体を移し、自発的分ィ匕誘導を行った。（a)ラット ES細胞由来神経様細胞の写真、（b)図 (a)の四角で囲った領域を拡大した写真、（c)ラット ES細胞由来脂肪様細胞の写真、 (d)ラット ES細胞由来上皮様細胞の写真。

図 1 9は、樹立したラット ES細胞に対する血清■ LIF添加の影響を調べた結果を示す写真である。図中「ラット LIF+20%FBS」はラット LIF(rLIF)含有、 ²0%血清含有条件下で培養した結果を、「無血清」は LIF無添加、無血清（20%KSR含有）条件下で培養した結果を、「マウス LIF+無血清」はマウス LIF (mLIF) 含有、無血清（20 %KSR含有）条件下で培養した結果を、また「ラット LIF+無血清」はラット LIF (rLI F)含有、無血清（20%KSR含有）条件下で培養した結果を、それぞれ示す。

図 2 0は、各ラット（WKY、 WHG及び BN)から ES細胞を樹立した結果を示す写真である。上図：各ラットの胚盤胞から形成させた内部細胞塊の写真。図中、矢印は形成させた内部細胞塊を示している。下図：継代 5代目の樹立 ES細胞の写真。図中、 WKY rESは WKYラットから樹立した ES細胞を、 WHGrESは WHGラットから樹立した ES細胞を、また BNrESは BNラットカゝら樹立した ES細胞を、それぞれ示す。

図 2 1は、樹立したラット ES細胞（WKYラット ES細胞）が ES細胞マーカー遺伝子を発現していることを示す RT-PCRの写真である。 ES細胞の代表的なマーカー遺伝子である 0ct3/4、 Rex_l、 Nanogおよび ERasの各因子の遺伝子発現を解析した。コントロールとして ]3ァクチン遺伝子の発現も解析した。レーン 1 : 未分化ラット ES細胞、レーン 2:マウス繊維芽細胞、レーン 3:铸型 DNA無添加（コントロール）。各々から R Aを抽出し、 RT - PCRを行った。

図 2 2は、樹立したラット ES細胞 (WHGラット ES細胞）から形成させた胚様体が三胚葉系列の細胞へ分化していることを示す RT-PCRの写真である。図中、左側は各マ一力一遺伝子の名称を示しており、 TUJ1は beta3-tublinを、 MSI- 1は musashi- 1を、 GFAPは glial fibrillary acidic proteins alphaを、 CCCは cardiac dihydropy ridine - sensitive calcium channel proteinを、 ANFは atrial natriuretic facto rを、 ALBは albuminを、 TDOは tryptophan 2， 3 dioxygenaseを、 TATは tyrosine a minot進 sferaseを、 G6Pは glucose - 6 - phospataseを、そして ACTは ]3ァクチンを、それぞれ示す。レーン 1：未分化ラット ES細胞、レーン 2：ラット ES細胞由来胚様体、レーン³ :コントロール (铸型 DNA無添加）、レーン 4:WHG個体由来の各臓器（脳、心臓、肝臓）。各々から藤を抽出し、 RT - PCRを行った。

図 2 3は、樹立したラット ES細胞 (WHGラット ES細胞）のマウス皮下への移植によりテラトーマが形成されたこと、及びこのテラトーマが三胚葉構造を有することを示した写真である。 _a) ： WHGラット ES細胞を免疫不全マウス皮下に移植し、テラト一マが形成されたマウスの写真。首元のコプがテラトーマである。 b) ：摘出したテラトーマの写真。図中サイズバーは l_cmである。 _c) ：テラトーマを切片化し、へマトキシリン 'ェォジン染色した組織像。左上は腺構造、右上は血管内皮様構造、左下は腸管様構造、右下は骨細胞様構造を、それぞれ示す。

図 2 4は、樹立した遺伝子導入ラット ES細胞 (pCAG- EGFP/WHGrES細胞）を用いて作製したキメララットにおいて、殆どの組織で EGFPが発現していることを示したゲノム PCRの写真である。上図は pCAG- EGFP/WHGrES細胞を用いて作製したキメララットの結果を示し、下図は野生型ラットの結果を示す。レーン 1：脳、レーン 2：胸腺、レーン 3：心臓、レーン 4 :食道、レーン 5 :肺、レーン 6 :胃、レーン 7 :膝臓、レーン 8 :小腸、レーン 9 :大腸、レーン 10 :肝臓、レーン 11 :脾臓、レーン 12 :腎臓、レーン 1 ³：精巣、レーン 14:血管、レーン 15 :筋肉。各々の組織から染色体 DNAを抽出し、ゲノム PCRを行った。

図 2 5は、 GFPキメララットの各組織（腎臓、骨格筋および胃）を切片化し、 GFP 抗体を用いて免疫染色を行った写真である。 ' 発明を実施するための最良の形態

本発明は、従来の手法では得ることのできなかったヲット ES細胞を初めて提供するものである。

本発明のラット ES細胞は、実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下において、以下の（A)〜（D)の工程：

(B) 解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代 ES細胞を、継代可能となるまで培養する工程、

(C) 継代可能となった初代 ES細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代-培養する工程、

(D) さらに継代 '培養を行うことにより ES細胞を樹立する工程、を含むプロセスを行うことにより、樹立、製造することができる。

本発明のラット ES細胞の樹立方法の特徴は、（1) 胚盤胞、内部細胞塊および ES細胞の培養全般において実質的に血清を含有しない培養液を用いる点と、（2)内部細胞塊ゃ ES細胞の解離（剥離）を行うステップにおいて、細胞を単一化することなく、ある程度の細胞集塊を保持した状態で解離 (剥離）を行う点である。

以下、本発明のラット ES細胞の樹立方法、樹立ラット ES細胞の性質分析法、ならびにラット ES細胞の継代培養方法等につき説明する。

1.ラット

本発明のラット ES細胞の由来となるラットは、前記本発明の樹立方法の特徴に基づき ES細胞を樹立できるものであれば、如何なる系統のラットであっても良い。例えば Wistar Kyoto株（WKY)、 Brown Norway株（BN)、 Goto- Kakizaki株（GK)、 SD株、 F344/Du株（Fischer)、 Wister株， Wister Hannover株、 ACI株などの系統のラットから選択される。

2.フィーダ一細胞

本発明のラット ES細胞の樹立および樹立後の培養においてはフィーダ一細胞を用いることが好ましい。フィーダ一細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダ一細胞であっても良いが、ライン化されたフーダー細胞よりも正常繊維芽細胞を用いることが好ましい。具体的にはマウス胎児の正常繊維芽細胞が挙げられる。より具体的には、妊娠 12 B〜16日目のマウス胎児繊維芽細胞の初代培養細胞（正常繊維芽細胞）が挙げられ、当該正常繊維芽細胞としては、例えばマウス IC Rの胎児 12. 5日目の正常繊維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、市販品（マウス繊維芽細胞、旭テクノグラス株式会社等）を利用することもできる。当該フィーダ一細胞は、マイトマイシン C等で処理して不活性化して用いることが好ましい。

3.培養液

本発明のラット ES細胞の製造 (樹立 ·培養）においては、実質的に血清を含有しない培養液を用いる。'ここで「実質的に血清を含有しない」とは、血清の影響によりラット ES細胞が ES細胞としての性質を示さなくなる（例えばアル力リホスファターゼ活性が陰性となる）程の血清を含有しないことを意味し、具体的には血清濃度が 10%以下であること、好ましくは 5%以下であること、より好ましくは ²%以下であることを意味する。さらに好ましくは血清を含有しない無血清培地を用いる。この場合、血清の代わりとなる試薬を添加する必要があり、具体的には、血清代替試薬（KSR :ギブコ BRL) などが用いられる。当該血清代替試薬は 20%程度の濃度で用いることが好ましい。

またラット由来白血病阻害因子（rLIF) に関しては、胚盤胞から内部細胞塊を形成 ·分離するまでの段階では、ラット LIF (rLIF) を含有しない培養液を用いることが好ましい。一方；内部細胞塊形成以降の段階（樹立したラット ES細胞の培養、継代も含む）においては、 rLIFを含有する培養液を用いることが好ましい。濃度としては培養液 1 mlあたり rLIFを 100単位以上添加することが好ましく、 1000単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましい。当該 rLIFは市販品（ケミコン社）を利用することができる。

培養液中のその他の成分に関しては、 ES細胞の培養に通常用いられる成分を、当業者の常識の範囲で組み合わせ培養液中に適宜含有させる。

以下に、培養液の具体的組成を例示する。

1)ラット ES細胞樹立用培養液、

胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液を、「ラット ES細胞樹立用培養液」と称する。

(組成の具体例）

ダルべッコ改変ィ一ダル培地/ F12 (旭テタノグラス、東京、日本） 380 ml 0. 2M L-グルタミン 5 ml

血清代替試薬（KSR: ギブコ BRレフナコシ、東京、日本） 100 ml

非必須アミノ酸（ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 5 ml

抗生物質-抗菌物質溶液（ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 5 ml

100 mM Na -Pyruvate 5 ml

0. 1M ]3メルカプトエタノール 0. ml 2)ラット ES細胞用培養液

内部細胞塊形成以降の培養（樹立ラット ES細胞の培養も含む）において使用する培養液を、「ラット ES細胞用培養液」と称する。

(組成の具体例）

ダルベッコ改変イーグル培地/ F12 (旭テクノグラス、東京、日本） 375 ml

0. 2M L-グルタミン 5 ml

血清代替試薬（KSR: ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 100 ml

'非必須アミノ酸（ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 5 ml

100倍ヌクレオシド保存液 5 ml

(アデノシン 4 mg、グアノシン 4. 25 mg、シチジン 3. 65 rag、ゥリジン 3. 65 m g、チミジン 1. 2 rag)

100 mM Na - Pyruvate 5 ml

0. 1M メルカプトエタノーノレ 0. 5 ml

1000U ラット由来白血病阻害因子（rLIF)

このうちラット由来白血病阻害因子 (rLIF)は、要時に添加して混合するのが好ましい。

4.培養条件、

本発明のラット ES細胞の製造（樹立 .培養）における細胞の培養温度は、 35°C〜3

7. 5°Cの範囲内であれば良く、好ましくは 37°Cである。培養は、通常の培養に用いられる 5% C0₂ 培養装置中で行われる。

5.ラット ES細胞の樹立方法 ·

以下本発明のラット ES細胞の樹立方法につき具体例を示す。

1)卵（胚盤胞期胚）の採取

卵採取用のラットとしては、前記した Wistar Kyoto株（WKY)、 Brown Norway株（BN )、 Goto- Kakizaki株（GK)、 SD株、 F344/Du株 (Fischer)、 Wister株、 ister Hanno ver株、 ACI株といった系統のラットから選択される。週齢は 8週齢〜 40週齢の範囲 6 内であれば使用可能であるが、好ましくは 10週齢〜 20週齢のラットが用いられ、より好ましくは 10週齢〜 12週齢のラットが用いられる。

卵の採取は当業者に知られた常法により行えば良い。具体的にはラットを自然交配させ、膣栓確認 3日目頃に採卵用メスラットをと殺し子宮を摘出する。この子宮を適当な培地で灌流することにより、受精卵（胚）を回収する。ここで灌流に用いる培養液としては、例えば■培地（NaCl 640. 0 mg/100 ml, KC1 35. 6 mg/100 ml, KH₂P0₄ 16. 2 mg/100 ml, MgS0₄ - 7H₂0 29. 4 mg/100 ml, NaHC0₃ 190. 0 mg/ 100 ml, Glucose 100. 0 mg/ 100 ml, Na-Pyruvate 2. 5 mg/ 100 ml, Ca - lactate 46. 0 mg/ 100 ml, Streptomycin 5. 0 rag/ 100 ml, Penicillin 7. 5 rag/ 100 ml, 0. 5% phen rol red 0. 2 ml, 20mM beta - ME 10 μ 1， lOOmM EDTA_2Na 10 μ 1, BSA 300. 0 mg/ 100 ml) や M2培地（Calcium Chloride - 2H20 0. 251 g/ L, Magnesium Sulfate 0. 143 g/L Potassium Chloride 0. 356 g/ L, Potassium Phosphate 0. 162 g/ L, Sodium Chloride 5. 532 g/ L, Albumin 4. 0 g/ L, D-glucose 1. 0 g/ L, HEPES 4. 969 g/ し， Phenol Red-Na 0. 01 g/ L, Pyruvic Acid-Na 0. 036 g/ L, Sodium Bicarbonat e 0. 35 g/ L, Penicillin G 0. 06 g/ L, Streptomycin Sulfate 0. 05 g/ L, DL~La ctic Acid 4. 349 g/ L)などが挙げられる。

回収された胚は、 mw培地、 M2、 M16等の培養液中で培養を行う。

培養により受精卵（胚）から桑実胚を経て胚盤胞（胚盤胞期胚）まで発生を進める。この段階まで発生を進めるためには通常、 37°C、 5%、C0₂培養装置内にて一晚培養を行う。胚盤胞まで発生が進んだことは、顕微鏡で観察することにより確認することができる。好ましくは、胚盤胞後期段階まで発生を進める。

2)内部細胞塊の形成 ·分離

前記 1)で得られた胚盤胞を顕微鏡下にて確認した後、透明帯を除去する。透明帯の除去は、酸性タイロイド (_PH2. 5)、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ等を用いて行う。その後、マイトマイシン C処理を施したフィーダ一細胞をゼラチンコート培養皿に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞を 5〜10個ずつ移し、ラット ES細胞樹立用培養液にて培養を開始する。

培養から 1~4日目にフィーダ一細胞上に透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）が接着する。接着後 5〜10日目に丕盤胞から出現した内部細胞塊を 200 z lのピぺットなどを用いて物理的に分離する。この分離した内部細胞塊をラット ES細胞樹立用培養液を含有する滅菌チューブ等に移し、 5個〜 20個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで解離する。その際、トリプシン■ EDTAなどの蛋白分解酵素を用いた解離は行わず、ピぺット等を用いて物理的に内部細胞塊を解離する。また細胞が単 —化される.まで解離を行うことは避け、前記のように 5個〜 20個程度の細胞からなる細胞集塊を保持する程度に解離を行う。ここで細胞集塊を保持した状態であることは顕微鏡下で確認することができる。

3) ES細胞の樹立

フィーダ一細胞を播種したゼラチンコート培養皿において、前記 2)で解離した内部細胞塊をラット ES細胞用培養液で培養する。通常、培養から 2〜4日目に初代 ES細胞コロニーが出現する。初代 ES細胞コロエーの出現は顕微鏡下で観察することにより確認することができる（出現した ES細胞を「初代 ES細胞」と称する）。その後 5 〜10日程度培養を続行することにより、初代 ES細胞コ口ニーが継代可能な状態となる。ここで「継代可能な状態」とは、形成された初代 ES細胞コロニーを構成している細胞数が 200〜600個前後に達し、かつ各細胞間が緊密になった状態を指す。このような形態となったことを顕微鏡下にて確認しながら、 200 μ 1のピぺット等を用いて当該 ES細胞コロニーを分離する。この分離した ES細胞コロニーをラット ES細胞用培養液を含有する滅菌チューブ等に移し、 5個〜 ²0個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで解離する。この段階においても細胞が単一化されるまで解離を行うことは避け、前記のように細胞集塊を保持する程度に解離を行う。またこの段階においても、トリプシン · EDTA等の蛋白分解酵素を用いた細胞解離は行わず、物理的に解離することが望ましい。解離した ES細胞コロニーは、フィーダ一細胞を播種したゼラチンコート培養皿においてラット ES細胞用培養液で初代培養を行う（継代 1代目の細胞）。培養から 2〜4日程度で ES細胞コロニーが出現し、 5〜10日程度で継代可能な状態となる。

以降の細胞継代は、細胞が単一化されない状態、すなわち 5個〜 20個程度の細胞力なる細胞集塊を維持した状態を保てば、当業者の常識の範囲内で継代を行うことができるが、トリプシン■ EDTA等の蛋白分解酵素による処理は最低限にとどめ、物理的手段により細胞解離を行うことが望ましい。以下に具体例を示す。前記において継代可能となつた ES細胞コ口ニーから培養液を除去し、室温に戻した PBS (-)にて洗净し、予め37°( に保温した2. 5% トリプシンを全面に塗り広げる。トリプシンの量としては 60ramディッシュあたり' 500 /z l程度、若しくはそれ以下であることが好ましい。トリプシンを全面に塗り広げた後は、ただちに溶液を除去する。顕微鏡下にて全体の 7割以上の ES細胞コ口ニーがフィーダ一細胞から剥離してくる状態を確認し、ただちにトリプシン処理を停止させる。ここでトリプシン処理を停止させるためには、例えば 10% ゥシ胎仔血清を含む培養液を添加することが容易であるが、大量の無血清培養液等を加えてトリプシンの濃度を希釈することにより停止させても良い。その後、 5mlピペット等を用いて更に物理的に ES細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心（室温で 1000rpm、 3分程度）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。ラット ES細胞用培養液で細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて 5〜20個の細胞塊を形成している状態を確認し、フィ一ダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿に移し培養を行う（継代 2代目の細胞）。

その後は、約 5〜10 毎に継代可能な状態となるため、前記継代 1代目の細胞の継代（継代 2代目の細胞への継代）と同様の継代方法により継代 ·培養を続行することができる。

細胞集塊の数や細胞集塊を構成する細胞数が安定化した段階をもって、 ES細胞が樹立されたと判断する。具体的には、継代 3代目以降、望ましくは継代 5代目以降の細胞を、樹立したラット ES細胞と判断することができる。樹立ラット ES細胞を商品として供給する場合は、 1系統における安定した供給量を保持するために、継代 3代目以降、好ましくは継代 5代目以降、より好ましくは継代 10代目以降の細胞を商品化の対象とする。

6.本発明のラット ES細胞

本発明のラット ES細胞は、以下の（a)〜（j)の性質：

(a) 0ct3/4遺伝子および Nanog遺伝子を発現する、

(b) アルカリホスファターゼ活性陽性である、

(c) 胚様体形成能を有する、 (d) SSEA (胎児ステージ特異的抗原) - 1および SSEA- 4を発現する、

(e) 正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、

(f) 未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、

(g) インビトロで多分化能を有する、

(h) 三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、

(i) 奇形腫形成能を有する、

(j) キメララット作製能を有する、

を含有することを特徴とする。

本発明は、前記 (a)〜（j)に示した ES細胞としての性質を全て保持したラット ES細胞をはじめて提供するものである。樹立したラット ES細胞が ES細胞としての†生質を保持していること、すなわち未分化状態（全能性）を維持した ES細胞としての性質を保持していることは、以下の手法により解析することができる。

1) 未分化マーカーの発現

ES細胞であることを特徴づける決定的な因子として、 0ct3/4 (Okaraoto, K. et al . , Cell, 60 : 461-472 (1990)、 Scholer, H. R. et al. , EMB0 J. 9： 2185-2195 (1990) ) および Nanog (Mitsui, K. , et al. , Cell, 113 : 631-642 (2003)、 Chambers I. , et al. , Cell, 113： 643-655 (2003) ) が知られている。これらの遺伝子の発現は、ラット 0ct3/4および Nanog特異的なプライマーを用いた RT- PCRを行うことにより確認することができる。ここで用いられるラット 0ct3/4および Nanog特異的なプライマーとしては、実施例に記載のプライマー（Oct 3/4： 5' -ATGGACTACCCAGAACCCCAG-3' ( 配列番号： 3) 、 5' - TTACAGGAGCTGCAGTTATAC - 3，（配列番号： 4) 、 Nanog： 5' - TAGCC CTGATTCTTCTAGCA- 3' (配列番号： 5)、 5' -TTTGCTGCMCGGCACATM - 3' (配列番号： 6) ) を例示することができる。

2)アル力リホスファターゼ活性

未分化 ES細胞ではアルカリホスファターゼが大量に発現している。当該アルカリホスファターゼの発現は、市販の種々のアルカリホスファターゼ検出キットを用いることにより容易に測定することができる。当該検出キットとしては、例えば ALP 組織染色キット（Sigma社)やべクターレツドアルカリホスファターゼ基質キット I ( フナコシ）などが挙げられる。 3) 胚様体形成能

ES細胞をフィーダ一細胞や LIFの存在しない条件下で非コート培養皿を用いて培養することにより、胚様体が形成されることが知られている（Roy. S. et al. , Mol . Cell. Biol. , 18： 3947-3955 (1998) )。胚様体の形成は、ラット ES細胞を非コート培養皿にて LIFを除いたラット ES細胞用培養液を用いて 7日間〜 14日間程度培養し、顕微鏡下で細胞が凝集して形成される球状体の出現を観察することにより確認することができる。

4) 細胞表面抗原の発現

ES細胞をはじめとする多能性幹細胞の分化を同定する指標の一つとして、分化段階特異的に発現量が変化する細胞表面抗原の検出が挙げられる。本発明のラット ES 細胞は SSEA (胎児ステージ特異的抗原) - 1および SSEA-4を発現している。当該細胞表面マーカーの発現は、 ES細胞キャラクタライゼイシヨンキット（フナコシ）を用いた免疫染色により、評価することができる。

5)染色体数

樹立されたラット ES細胞が起源となるラットの染色体数（2n=42) を保持した正常 ES細胞であることは、 G -バンド法（Sumner A. T. Cancer Genet Cytogenet. 6： 59-87 (1982) ) によって染色体数を分析することにより確認することができる。

6) 未分化状態の維持

樹立された ES細胞は、未分化状態を維持したまま継代培養を行うことができる。本発明で樹立したラット ES細胞は、少なくとも 35継代目まで継代培養を行うことができるという優れた特徴を有する。未分化状態の維持は、本発明のラット ES細胞の継代培養方法（後述の 7. ) により継代培養を行い、前記アルカリホスファターゼ活性等を測定することにより確認することができる。

7) 多分化能

ES細胞をフィーダー細胞や LIFの存在しない条件下で培養することにより、胚様体を経て種々の細胞へと自発的に分化する。この ES細胞の性質は、まず前記³)に記載の方法により胚様体を形成させ、その後ゼラチンコート培養皿に胚様体を移し、 7曰間〜 14日間程度培養を行うことにより観察することができる。各細胞の特徴的な形態から、神経様細胞、脂肪様細胞、または上皮系細胞などの出現を確認することができる。

8) 三胚葉系列の細胞への分化能

ES細胞は三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）系列の細胞へ分化する能力を有する。この ES細胞の性質は、前記 3)に記載の方法で形成させた胚様体（心筋様細胞の出現した胚様体）力ら RNAを抽出し、外胚葉系列の細胞（例えば神経細胞）、中胚葉系列の細胞 (例えば心筋細胞）、内胚葉系列の細胞 (例えば肝細胞）の各マーカー遺伝子の発現を RT - PCRで解析することにより確認することができる。

ここで神経細胞マーカーとしては Nestin、 TUJ1 (beta3- tublin) 、 MSI-1 (musas hi- 1) 、 GFAP (glial fibrillary acidic proteins alpha) などが挙げられる。また心筋細胞マーカーとしては CCC (cardiac dihydropyridine-sensitive calcium c hannel protein) , A F (atrial natriuretic factor) KvLQTlなど;^挙げられる。また月干細胞マーカーとしては ALB (albumin)、 TDO (tryptophan 2， 3- dioxygenase)、 TAT ^tyrosine aminotransferase) _Λ G6P (glucose_6—phospataseノなど力 S挙け bれる ⁹)奇形腫（テラトーマ）形成能

ES細胞を同種若しくは先天的に免疫不全である異種動物に移植することにより、奇形腫（テラトーマ）を形成させることができる。ここでテラトーマとは、内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉から出来る諸組織を雑然と一腫瘍中に存する混合腫瘍の称である。当該テラトーマの形成は、同種または先天的こ免疫不全である異種動物の皮下等にラット ES細胞を移植し、数ケ月後にコブ状の物体の存在を肉眼で観察することにより確認することができる。形成されたテラトーマが三胚葉構造を有していることは、摘出したテラトーマを切片化し、へマトキシリン 'ェォジンで染色し、顕微鏡下で組織や細胞の形態を観察することにより、確認することができる。 10)キメララット作製能

ES細胞を同種または異種ラットに導入することによりキメララットを産生することができる。キメララットの作製は、例えば以下の手法により行うことができる。キメララットが作製されたことを容易に確認するために、あらかじめマーカー遺伝子（例えば GFP、 /3 gal、ルシフェラーゼ等）を本発明のラット ES細胞に導入しておくと良い。具体的にはこのようなマーカー遺伝子を含むベクターをエレクトロポレーシヨン法等によってラット ES細胞の染色体上に組込み、培養液中に薬剤を添カロしてセレクションすることにより、 ES細胞染色体に前記ベクターが組み込まれた組換えラット ES細胞を樹立する。この組換えラット ES細胞を、例えば、顕微操作でラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または 16細胞期に移植して内部細胞塊と一緒にまた内部細胞塊の一部として発生させるか（マイクロインジェクション法： Gordon J . . et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 77： 7380-7384 (1980) ) 、若しくは 2個の 8細胞期胚の透明帯を取り除き前記組換えラット ES細胞と共培養して凝集塊を作らせる。この凝集塊を培養すると 1個の胚盤胞となる（細胞凝集法： Dvorak P. e t al. , Int. J. Dev. Biol. , 39： 645-652 (1995) ) 。以上のようにして得られた胚（移植用卵）を、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠させた雌ラットの子宮内に移植し発生させることにより、キメララットを産出させることができる。

得られたキメララットが ES細胞に由来する細胞 ·組織を有していること、すなわち樹立したラット ES細胞がキメララット作製能を有していることは、当業者に知られた一般的な手法により確認することができる。例えばキメララットの種々の組織から抽出したゲノム DNAを铸型として用い、マーカー遺伝子（ES細胞に導入したマ一力一遺伝子）特異的プライマーを用いたゲノム PCRを行うことにより、確認することができる。さらに、 ES細胞が各組織系列の細胞へ分化していることは、例えばキメララットの各組織を切片化し、マーカー遺伝子発現産物（マーカータンパク）の存在を、用いたマーカータンパクの性質に基づき検出することにより、確認することができる。

11)血清存在下での培養による分化

さらに本発明のラット ES細胞は、 20%血清存在下での培養により分化するという性質を有する。好ましくは、本発明のラット ES細胞は、 10%血清存在下での培養により分化するものであり、さらに好ましくは 5%血清存在下での培養により分化するものである。ラット ES細胞の分化は、了, カリホスファターゼ活性の消失や、 0c t3/4や Nanog等の ES細胞マーカー遺伝子の発現消失により、確認することができる 7.ラット ES細胞の継代培養方法

本発明のラット ES細胞は、未分化状態を維持した状態で継代培養を行うことができる。本発明のラット ES細胞の継代は、細胞が単一化されない状態、すなわち 5個〜20個程度の細胞からなる細胞集塊を維持した状態を保てば、当業者の常識の範囲内で継代を行うことができるが、トリプシン■ EDTA等の蛋白分解酵素による処理は最低限にとどめ、物理的手段により細胞解離を行うことが望ましい。以下に具体例を示す。

樹立されたラット ES細胞が継代可能な状態となった段階で、培養液を除去し、室温に戻した PBS (-)にて洗浄し、予め37¾に保温した2. 5% トリプシンを全面に塗り広げる。トリプシンの量としては 60瞧ディッシュあたり 500 μ ΐ程度、若しくはそれ以下であることが好ましい。トリプシンを全面に塗り広げた後は、ただちに溶液を除去する。顕微鏡下にて全体の 7割以上の ES細胞コ口ニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、ただちにトリプシン処理を停止させる。ここでトリプシン処理を停止させるためには、例えば 10% ゥシ胎仔血清を含む培養液を添加することが容易であるが、大量の無血清培地等を添加してトリプシン濃度を希釈することにより停止させても良い。その後、 5ralピペット等を用いて更に物理的に ES細胞コ口-一を剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心（室温で 1000rpm、 3分程度）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。培養液で細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて 5〜20個の細胞塊を形成して V、る状態を確認し、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿に移し培養を行う。その後も同様に、約 5〜10日毎に継代可能な状態となるため、同様の継代培養を行う。

継代細胞の培養には、実質的に血清を含有しない培養液を用いる。ここで「実質的に血清を含有しない」とは、血清の影響によりラット ES細胞が ES細胞としての性質を示さなくなる（例えばアルカリホスファターゼ活性が陰性となる）程の血清を含有しないことを意味し、具体的には血清濃度が 10%以下であること、好ましくは 5%以下であること、より好ましくは 2%以下であることを意味する。さらに血清を含有しない無血清培地を用いることがより好ましい。この場合、血清の代わりとなる試薬を添加する必要があり、具体的には、血清代替試薬（KSR :ギブコ BRL) などを含有する培養液を用いる。当該血清代替試薬は 20%程度の濃度で使用することが好ましい。

また前記継代細胞の培養に用いる培養液は、 rLIFを含有していることが望ましい。 rLIFの濃度としては培養液 1 mlあたり rLIFを 100単位以上添加することが好ましく、 1000単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましい。

以上のように、本発明のラット ES細胞の継代培養用の培養液は、血清代替試薬および rLIFを含有することが好ましく、前記 3. -2)に記載のラット ES細胞用培養液が有効に用いられる。

8.ラット ES細胞培養キット

本発明は、本発明のラット ES細胞を培養するための培養キットを提供する。具体的には、血清代替試薬 (KSR)および rLIFを成分として含有する、ラット ES細胞培養キットを提供する。血清代替試薬および rLIFは、混合して 1つの容器中に封入されていても良いが、それぞれ別々の容器に封入されていることが好ましい。ここで Rとしてはギブコ BRL社製のものを用いることができ、また rLIFとしてはケミコン社製のものを用いることができる。

前記キットは、さらに、本発明のラット ES細胞を成分として含有することができる。本発明のラット ES細胞を商品として供給する場合は、継代 3代目以降、好ましくは継代 5代目以降、より好ましくは継代 10代目以降の細胞を商品化の対象とする。当該ラット ES細胞は、それ単独で商品化されても良いが、前記のように本発明の培養キットの 1成分として商品化されても良い。

前記キットは、さらにフィーダ一細胞を成分として含有することができる。フィ一ダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダ一細胞よりも正常繊維芽細胞を用いることが好ましい。具体的には、妊娠 12日〜 16日目のマウス胎児の繊維芽細胞の初代培養細胞 (正常繊維芽細胞）が挙げられ、当該正常繊維芽細胞としては、例えばマウス ICR の胎児 12. 5 Θ目の正常繊維芽細胞が例示される。当該フィーダ一細胞は常法により調製することもできれば、マウス胎児繊維芽細胞（旭テクノグラス株式会社）等を利用することもできる。

以上に述べた ES細胞の製造方法（樹立方法、継代培養方法）、および ES細胞の培養液や培養キットは、ラット ES細胞のみならず、他の動物種にも適用可能である（ただしマウスは除く）。

マウス ES細胞はコロニーがドーム状に盛り上がり、全体的に隣接する細胞同士の境界が不明瞭である。また光沢を有している。一方、霊長類 ES細胞のコロニーは扁平状に広がり、マウス ES細胞のような光沢は観察されない。さらに細胞同士の境界がマウス ES細胞と比べて明瞭である。本発明において樹立されたラット ES細胞は扁平状のコロニーを形成し、マウス ES細胞のような強い光沢が観察されず、マウスよりも霊長類 ES細胞に近い形態を示すことが明らかとなった。よって、本宪明の ES細胞の製造方法（樹立方法、継代培養方法）および ES細胞の培養液や培養キットは、霊長類の ES細胞にも適用可能である。

9.ラット ES細胞を分化誘導して得られた細胞

本発明は、本発明のラット ES細胞の分化誘導方法、および分化誘導して得られた細胞を提供する。

マウスゃヒト ES細胞で知られているように、 ES細胞をフィーダ一細胞や LIFの存在しない条件下で培養することにより種々の細胞に分化誘導させることができるな oy. S. et al. , Mol. Cell. Biol. , 18 : 3947 - 3955 (1998) )。またレチノイン酸、細胞増殖因子、ダルココルチコィド等の作用により種々の細胞に分化誘導させることができる（Kawamorita M. et al. , Hum. Cell. , 15： 178-182 (2002) )。さらに細胞外基質により分化誘導させることもできる。従って本発明のラット ES細胞を前記のような条件下で培養することにより、同様に分化誘導することができる。ここで ES細胞から分化誘導して得られる細胞としては、例えば神経細胞、血球系細胞、肝細胞、血管内皮細胞、または心筋細胞などが挙げられる。

これら ES細胞から分化誘導して得られた細胞は、例えば移植治療の実験モデルにおける移植用細胞として有用である。また当該分化細胞は、核酸、タンパク質または発がん物質、環境変異原物質などに細胞を暴露した際の影響を調べるためにも有効に用いられる。具体的には前記物質の添加による細胞の geneticあるいは epigene ticな変化、細胞のトランスフォーメーション、軟寒天培地中でのコロニー形成能、浸潤能を含むがん化の指標の変化、代謝機能の変化、生理機能の変化、生化学的変化などの生物学的指標に基づき細胞への影響を調べることができる。

10.ラット ES細胞由来の物質

本発明においてラット ES細胞を樹立したことにより、ラット ES細胞のみならず、それに由来する種々の物質（例えば樹立ラット ES細胞由来の mRNAより調製された cD NAライブラリーやゲノムライブラリー、あるいはラット ES細胞の細胞抽出物など）を提供することが可能となった。本発明の ES細胞由来の種々の物質は、再生医療における研究や発生学における分子レベルでの発現解析の研究、動物個体に代わる創薬研究や安全性評価試験などにおいて有効に用いることができる。

ここで cDNAライブラリ一は、本発明のラット ES細胞より抽出した RNAを錄型として用い、市販の cDNAライブラリー作製キット（例えばクローンマイナー cDNAライプラリ一作製キット（Invitrogen)や Creator SMART cDNAライブラリ一作製キット（BD Biosciences)等）などを用いて作製することができる。またゲノムライブラリー ^Molecular Cloning, A Laboratory Manual. , T. Maniatis ら編、第 2版 (1989) 、 Cold Spring Harbor Laboratory等の基本書を参考にして常法により作製することができる。また ES細胞由来の細胞抽出物は、常法により細胞を破碎し、プロテアーゼ阻害剤の存在下にて遠心分離することなどにより調製することができる。

11.組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法、

本発明は、以下の（i)〜（iii) ：

(i) 被験物質を本発明のラット ES細胞に接触させる工程、

(ii) ラット ES細胞の分化の有無や程度を評価する工程、

を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリ一二ング方法を提供する。

前記工程 (i)においてスクリーングに供される被験物質は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、前記スクリー二ングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）をラット ES細胞に接触させることにより行われる。力かる被験試料としては、細胞抽出液、遺伝子（ゲノム、 cDNA) ライプラリー、 RNAiライプラリー、アンチセンス核酸、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。これら被験試料又は被験物質は、ラット ES細胞への取り込み可能な形態で接触させる。例えば被験試料が核酸の場合は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム、 DEAE-デキストランゃ遺伝子導入用リピッドを用いて ES細胞に導入する。

ラット ES細胞と被験物質とを接触させる条件は、該細胞が死滅せず且つ被験物質が取り込まれるのに適した培養条件（温度、 pH、培養液の組成など）であれば特に制限はない。好ましくは分化誘導に適した条件、すなわちフィーダ一細胞やしの存在しない条件下で培養されたラット ES細胞に対して前記被験物質を添加する。続く工程（ii)においてはラット ES細胞の分化の有無や程度を評価し、（iii)においては当該評価結果に基づき被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する。ラット ES細胞から所望の組織または細胞への分化は、例えば、所望の組織または細胞で発現するマーカーを指標として評価することができる。所望の組織又は細胞のマーカーとては、組織または細胞特異的抗原が挙げられる。当該マーカーとして具体的には、例えば神経系細胞のマーカーとして-ユーロン特異的エノラーゼ、グリア線維†生酸性タンパク質、ネスチン等が挙げられ、軟骨のマーカーとして S - 100タンパク質、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ等が挙げられる。また筋肉のマ一力一としてデスミン、筋特異的ァクチン等が挙げられる。このような組織 '細胞特異的マーカーは、該マーカーに対する抗体を用い、 EL1SAや免疫染色などにより検出することができる。またこれらのマーカー遺伝子の発現を RT - PCR等の手法により検出することもできる。

12.組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法

本発明は、以下の（I)〜（III)の工程：

(I) 被験物質を本発明のラット ES細胞に接触させる工程、

(II) ES細胞の分化誘導条件下で前記（I)のラット ES細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、

(III) 上記 (II)の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程、を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーユング方法を提供する。

ES細胞は、前記のようにフィーダー細胞や LIFの存在しない条件下で培養することにより種々の細胞に分化誘導させることができる（Roy. S. et al. , Mol. Cell. Biol. , 18 : 3947-3955 (1998))。またレチノイン酸、増殖因子、ダルココルチコィド等の作用により種々の細胞に分化誘導させることもできる（Kawamorita M. et al . , Hum. Cell. , 15： 178-182 (2002) )。さらに細胞外基質により分化誘導させることもできる。この培養系に被験ィヒ合物（例えば抗癌剤等の医薬品や環境変異物質など）を加えて培養することにより、被験物質が正常な分化にどのような影響を及ぼすかを評価することができる。当該スクリーニングは、例えば開発中の医薬品の副作用研究などに応用することができる。

工程 (I)においてスクリーニングに供される被験物質としては、前記 11.と同様の物質が挙げられる。被験物質とラット ES細胞との接触については、被験物質を本発明のラット ES細胞に接触させた後に ES細胞の分化誘導条件下で培養しても良く、またラット ES細胞を分化誘導条件下で培養開始し、その後被験物質を接触させても良い。

分化誘導条件下での培養とは、前記したようなフィーダー細胞や LIFの存在しない培養条件下や、レチノイン酸、増殖因子、ダルココルチコイドまたは細胞外基質等を培養液中に添加した培養条件などが挙げられる。分ヒ誘導条件下での培養過程若しくは培養後に、被験物質がラット ES細胞の分化に及ぼす影響を評価する。当該評価は、被験物質を作用させない対象細胞における分化の程度との比較に基づき行われることが望ましい。具体的には、例えば肝細胞分化誘導因子（特願 2004 - 59705 ) を培養液に添加することにより機能を有した成熟肝細胞へと分化誘導を行い、肝細胞特異的発現遺伝子（アルブミンやトリブトファン 2, 3ジォキシゲナーゼ等）などを指標として評価することができる。

13.遺伝子改変ラット

本発明のラット ES細胞は、遺伝子改変ラットの作製において使用することができる。ラットはマウスに比べて約 10倍という実験上適当な大きさの哺乳動物であり、 ① 細胞の血管に容易に薬物投与可能である、 ②外科■移植実験が可能である、 ③組織を大量に採取可能である、といった利点を有する。従来から多くのヒト疾患モデルラットが開発■発見されてきたが、ラット ES細胞が樹立されていなかつたがために、遺伝子改変ラット、特にノックアウトラットやノックインラットといったジーンターゲッティングを要する遺伝子改変ラットの作製は事実上不可能であった。本発明のラット ES細胞は、そのような遺伝子改変ラットの作製を初めて可能とするものである。本発明のラット ES細胞の提供により、当業者に周知の技術にて当該遺伝子改変ラットを作製することができる。

ここで「遺伝子改変ラット」とは、キメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジエニックラットおよびノックダウンラットといった当業者に知られた全ての遺伝子改変ラットを意味する。

前記遺伝子改変ラットは、以下の（X)〜（Z)の工程：

(X) 本発明のラット ES細胞に所望の遺伝子を導入する工程、

(Y) 遺伝子導入されたラット ES細胞を含有する移植用卵を調製する工程、

(Z) 移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程、 . を含むプロセスを行うことにより製造することができる。

ノックアウトラットとは人為的に標的とする遺伝子を破壌した変異ラットを意味し、遺伝子ターゲッティングラットとも呼ぶことがでぎる。ノックアウトラットの作製は、例えば Donehower A. L. et al. Nature, 356 : 215-221 (1992)等に記載のノックアウトマウスの作製法に準じて行うことができる。簡単に述べると、まず標的とする遺伝子のゲノム DNA配列をもとに、相同組換えのためのベクター（ターゲッティングベクター）を構築する。この時組換えクローンの選別のために、マーカー遺伝子として G418耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を組み込む。この構築したターゲッティングベクターをエレクト口ポレーション法等によってラット ES細胞に導入する。得られた導入細胞の中から相同組換えを起こしたコロニーを選別する。このようにして得られた相同糸且換えラット ES細胞を、例えば、顕微操作でラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または 16細胞期に移植して内部細胞塊と一緒にまた内部細胞塊の一部として発生させるか（マイクロインジェクシヨン法： Gordon J. W. et ah , ？ roc. Natl. Acad. Sci. USA. , 77： 7380 - 7 384 (1980) ) 、若しくは 2個の 8細胞期胚の透明帯を取り除き前記相同組換えラット ES細胞と共培養して凝集塊を作らせる。この凝集塊を培養すると 1個の胚盤胞となる（細胞凝集法： Dvorak P. et al. , Int. J. Dev. Biol. , 39： 645-652 (1995) ) 。以上のようにして得られた胚（移植用卵）を、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠させた雌ラットの子宮内に移植し発生させることにより、キメララットを産出させる。当該キメララットを野生型ラットと交配させることにより、ヘテロノックアウトラットを産出させることができ、このへテロノックアウトラット同士を交配させることによりホモノックアウトラットを産出させることができる。

前記ノックァゥトラットの範疇には、コンデイショナル · ノックァゥトラッドも含まれる。ここでコンディショナル ·ノックアウトとは、 Cre/loxPシステムまたは FLP/FRTシステムを利用して、部位特異的 ·時期特異的に遺伝子をノックアウトするシステムである。具体的にはターゲッティングしたレ、遺伝子を ΙοχΡ配列または FR T配列で挟んだものに置き換えておき、 Creまたは FLPタンパクの供給により前記 lox P配列または FRT配列で挟んだ遺伝子を切り取るシステムである（Sternberg N. , et al. , J. Mol. Biol. , 150： 487-507 (1981) )。

ノックインラットとは、標的とする遺伝子の位置に、人為的に作製した相同性を有する外来性遺伝子を導入した変異ラットを意味する。檫的遺伝子は破壊される場合もあれば破壌されない場合もある。例えば遺伝子の発現をモニターするために la cZ遺伝子や GFP遺伝子などのマーカー遺伝子を導入したり、遺伝子に変異を導入して入れ替えることも可能である。

当該ノックインラットはヽ例えば Pewzner- Jung Y. et al. , J. Immunol. , 161： 4634-4645 (1998)等に記載のノックインマウスの作製法に準じて作製することができる。基本的には前記ノックアウトラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。

トランスジエニックラットとは、人為的に外来遺伝子を導入したラットを意味する。トランスジュニック動物の作製は従来より顕微操作によって受精卵の雄性前核に所望の遺伝子を注入する方法が一般化されている。そのため前記ノックアウトラットゃノックインラットほど本発明のラット ES細胞の必要性は高くない。し力、しながら導入効率や個体の作製効率を上昇させるためには、本発明のラット ES細胞が有効に用いられる。

当該トランスジエニックラットは、例えば Yamamoto H. et al. , Cancer Res. , 6 2 : 1641-1647 (2002)等に記載のトランスジエニックマウスの作製法に準じて作製することができる。すなわち、 ES細胞をガラスピペットで吸い付けて固定し、他端から先端 2 μ m以下の銳く細いガラスピぺットを使って核の中に直接外来性標的遺伝子溶液を注入する。溶液を注入した ES細胞を培養系に移行し、遺伝子が組み込まれた株を樹立し、マウスの受精卵（モルラ胚またはプラスト胚）をガラスピペットで吸い付けて固定し、樹立した ES細胞をガラスピペットを使って受精卵に注入し、試験管内で培養し、ある程度発生させた後に、偽妊娠雌マウスの卵管または子宮に戻して仔マゥスを得る技法である。

前記トランスジエニックラットの範疇には、コンデイショナル■ トランスジェニックラットも含まれる。ここでコンデイショナル · トランスジエニックとは、 Cre/ ΙοχΡまたは FLP/FRTを利用して、部位特異的 ·時期特異的に遺伝子を発現させるシステムである。具体的には薬剤耐性遺伝子などを ΙοχΡ配列または FRT配列で挟んでおき、 Creまたは FLPタンパクの供給により前記 ΙοχΡ配列または FRT配列で挟んだ遺伝子を切り取ることにより、目的遺伝子を発現させるシステムである（Sternberg N . , et al. , J. Mol. Biol. , 150： 487-507 (1981) )。、

ノックダウンラットとは、 RNAiの中間物質である短い 2本鎖 RNA (siRNA) やアンチセンス核酸を人為的に導入 ·発現させ、当該 siRNAやアンチセンス核酸の作用により標的遺伝子の発現を抑制させたラットを意味する。このようなノックダウン動物は、ベクター系による siRNAの発現システムが確立したことに基づき、作製可能となった (Science 296： 550- 553 (2002)、 Nature Biotech. 20 : 500- 505 (2002)等）当該ノックダウンラットは、例えば Tiscornia G. et al. , Proc. Natl. Acad. S ci. USA. 100： 1844-1848 (2003)等に記載の方法に準じて作製することができる。基本的には前記トランスジエニックラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。本発明は、以上のような操作により製造された遺伝子改変ラットをも提供する。ここで「遺伝子改変ラット」とは、前記のようにキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジエニックラット若しくはノックダウンラットといった当業者に知られた全ての遺伝子改変ラットを意味する。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

ラット ES細胞の樹立

1)卵の採取

Wistar Kyoto株である WKY/Nのメス（日本チャールズ. リバ一、 10週齢以上）を自然交配し、膣栓確認 3日目に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出した。 mw培地（N aCl 640. 0 mg/100 ml, KC1 35. 6 rag/ 100 ml, KH₂ P0₄ 16. 2 mg/100 ml, MgS0₄ _7H₂0 29. 4 rag/100 ml, NaHC0₃ 190. 0 mg/ 100 ml, Glucose 100. 0 mg/ 100 ml, Na-Pyr uvate 2. 5 rag/ 100 ml, Ca - lactate 46. 0 mg/ 100 ml, Streptomycin 5. 0 mg/ 100 ml, Penicillin 7. 5 rag/ 100 ml, 0. 5% phenrol red 0. 2 ml, 20mM beta - ME 10 μ ΐ, lOOraM EDTA - 2Na 10 μ ΐ, BSA 300. 0 mg/ 100 ml) で権流して胚を回収し、 5% C0₂培養装置にて胚盤胞（後期段階）まで発生を進めた図 1 ) 。なおラット ES細胞の樹立において、胚盤胞後期段階の卵が最も樹立（内部細胞塊形成）効率が高かつたため、前記のように胚盤胞後期段階の卵を使用することとした。

2)フィーダ一細胞の調製

ラット ES細胞の樹立および培養の際に使用するフィーダ一細胞として、マウス IC Rの胎児 12. 5日目の正常繊維芽細胞をマイトマイシン Cで処理したものを使用した（図 2 ) 。使用に際し、凍結保存したフィーダ一細胞を使用前日に解凍し、 ST0培地 (DMEM 450 ml, FBS 50 ml, Antibiotic-Antirai erotics solution 5 ml) とセラチンコート培養皿（イワキ、東京、曰本）を用いて培養した。

3)ラット ES細胞樹立用培養液およびラット ES細胞用培養液の検討

(1) LIF添加の検討前記 1 ) で調製されたラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させ、この内部細胞塊から ES細胞コロニーを形成させ、最終的に安定化したラット ES細胞を樹立する。これら一連のステップにおいて用いる培養液の検討を行った。

まずラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させる段階における、ラット由来白血病阻害因子（rLIF)の培養液中への添カ卩の必要性につき検討を行った。ラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させる段階で、種々の濃度（0〜5000単位）の rLIF (ケミコン社）を添加して培養し、その後形成された内部細胞塊の数および初代 ES細胞の数を観察した。その結果、 rLIFを除いた方が効率良く内部細胞塊が形成され、 rLIFの添加濃度に依存して変化する事が示された。この結果から内部細胞塊形成までの段階では LIF無添加の培養液を用いることとした。

次に内部細胞塊形成後〜ラット ES細胞樹立までの段階における rLIFの添加の有無にっき検討を行った。内部細胞塊形成 ·分離後に rLIFを添加（1000単位）した培養液で培養を行った結果、内部細胞塊から約 50%以上の割合で ES細胞を樹立することができた。さらに、ラット ES細胞樹立後における rLIFの添加の必要性についても検討した。ラット ES細胞を 5継代目まで rLIFを 1000単位添加した培養液で培養し、継代 5代目のラット ES細胞に種々の濃度の rLIFを添加し、さらに 3代継代した。この細胞に対して未分可能を維持しているか否かを、アルカリホスファターゼ陽性率 ( %) を測定することにより行った（アルカリホスファターゼ活性測定法については実施例 2に記載）。その結果、未分化能を維持するためには、培養液 lmlあたり rL IFを 100単位以上添加することが好ましく、 1000単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましいことが明らかとなった（図 3 ) 。これらの結果から、内部細胞塊形成後は rLIF添加培養液を用いることとした。

(2) 血清添加の検討

従来、 ES細胞の培養にはゥシ胎仔血清（FBS) が用いられている。ラット ES細胞の樹立における FBSの添加の有無につき検討を行った。

具体的には、ラット胚盤胞から内部細胞塊を形成する段階において、 20%FBSを添カロした場合としない場合（血清代替試薬を用いた場合）における内部細胞塊形成能および形成率を調べた。また初代培養した継代 1代目の ES細胞における未分化能維持の有無についても調べた。未分化能維持の有無は、アルカリホスファターゼ活性および胚様体形成能の有無により判定した。その結果、 FBSを添加した場合は大部分が内部細胞塊を形成せずに（形成されても栄養芽細胞と分離可能な大きさまで成長しない）、多核の細胞に分化した。また初代培養した ES細胞では未分化指標であるアル力リホスファターゼ活性は陰性で、コロニーゃ胚様体も形成されなかった。一方、血清の代わりに血清代替試薬 (KSR) を用いた場合は、ラット胚盤胞からピックァップ可能な内部細胞塊が形成され、また初代培養した ES細胞においてもァルカリホスファターゼ活性が陽性で、コロニーゃ胚様体が形成された（図 4 ) 。この結果から、ラット ES細胞樹立において FBSよりも KSRの方が優れている事が明らかとなった。なお FBS濃度が 5%、 10%の場合も前記 20%FBSの場合と同様の結果であつた。

(3) 培養液の組成

以上の（1) および（2) の検討結果に基づき、ラット ES細胞の樹立には以下の組成の培養液を用いることとした。

ラット ES細胞樹立用培養液

胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液である。

ダノレべッコ改変イーグル培地/ F12 (旭テクノグラス、東京、日本） 380 ml 0. 2M L -グルタミン 5 ml

非必須アミノ酸（ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 5 ml

抗生物質-抗菌物質溶液（ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 5 ral

100 mM Na - Pyruvate 5 ral

0. 1M βメルカプトエタノール 0. 5 ml

ラット ES細胞用培養液

内部細胞塊形成以降の培養において使用する培養液である。

0. 2M L-グルタミン 5 ml

非必須アミノ酸（ギブコ BRL、フナコシ、東京、日本） 5 ml

100倍ヌクレオシド保存液 5 ml (アデノシン 4 mg、グアノシン 4. 25 mg、シチジン 3. 65 rag, ゥリジン 3. 65 m g、チミジン 1. 2 mg)

100 mM Na - Pyruvate 5 ral

0. 1M j3メルカプトエタノーノレ 0. 5 ral

1000U ラット由来白血病阻害因子

4)ラット ES細胞の単離方法の検討

細胞を単離する際のトリプシン処理の影響を調べた。まず、内部細胞塊を単離してフィーダ一細胞上に撒く段階で通常のトリプシン ' EDTA処理を行った結果、大部分の ES細胞が分化してしまった。一方、ピペットを用いて物理的に細胞塊を解離した結果、未分化状態を維持できることが分かった。また、初代ラット ES細胞コロニ一（細胞塊）を継代する際にも、トリプシン ' EDTA処理して継代した場合には細胞は単一化され分化してしまうが、前記と同様に物理的手法により細胞クランプを解離させて継代した場合は未分化状態を維持できることが明らかとなった。

次に、 2回目以降の継代におけるトリプシンの影響について調べた。すなわち 2 回目の継代においてトリプシン■ EDTAを用いて完全に単一細胞化した場合と、トリプシン · EDTAによる処理を最小限にとどめ、最終的には物理的操作により 5〜20個の細胞塊として継代した場合とで未分化状態維持に差があるかどう力検討を行つた。その結果、単一細胞状態で,継代すると自発的に分化しャしまうのに対し、物理的に ES細胞コロニーを剥離し、 5〜20個の細胞塊として継代した場合は、未分化状態を維持できることが明らかとなった（図 5 ) 。

以上の結果から、マウス ES細胞の場合はトリプシン · EDTA溶液で完全に単一細胞化し、継代する事が望ましいが、ラット ES細胞の場合、マウス ES細胞の方法を適用すると自発的分化が発生するため、物理的に ES細胞コロニーを剥離し、 5〜20個の細胞塊として継代するのが望ましいことが分かった。

5)ラット ES細胞の樹立

以上の検討結果に基づきラット ES細胞を樹立した。樹立法の概略を図 6に示す。ラット胚盤胞（後期段階）を顕微鏡下にて確認した後、タイロイド酸 (PH2. 5)を用いて透明帯を除去した。マイトマイシン C処理を施した正常マウス胎児繊維芽細胞（フィーダ一細胞）を 60 mmゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）を 5〜10個ずつ移し、ラット ES 細胞樹立用培養液にて培養を開始した。 1〜4 0目に正常マウス胎児繊維芽細胞上に透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）が接着し、接着後 5〜10日目に内部細胞塊（図 7 ) のみを 200 1のピペットを用いて分離した。 200 /z lのラット ES細胞樹立用培養液を 1. 5 ml滅菌チューブに分注し、分離した内部細胞塊を移し、ビぺットを用いて物理的に細胞塊を解離した。使用前日にフィーダ一細胞を播種した 6穴ゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）において、解離した內部細胞塊をラット ES細胞用培養液で培養した。培養から 2〜4日目に ES細胞コロニーが出現し（図 8、また図 6中「初代 ES細胞」）、コロニーの出現から 5〜10日目の ES細胞コロェ一（図 9 ) を顕微鏡下にて形態を確認しながら 200 μ 1のピペットを用いて分離した。使用前日にフィーダ一細胞を播種した 6穴ゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）において、物理的に解離した ES細胞コロニーをラット ES細胞用培養液で培養した（図 6中「継代 1代目」）。培養から 2〜4日目に ES細胞コロニーが出現し、 5〜10日目に継代可能となつた。

次に培養液を除去し、室温に戻した PBS にて 2回洗浄し、予め 37°Cに保温した 2 . 5% トリプシン（ギブコ BRL、フナコシ、東京、 3本）を 60 ディッシュあたり 50 0 /z l加えて全面に塗り広げ、ただちに溶液を除去した。顕微鏡下にて全体の 7割以上の ES細胞コロニーがフィーダ一細胞から剥離してくる、状態を確認し、 10% ゥシ胎仔血清を含む培養液を 2ml加えてトリプシン処理を停止させた。 5mlピぺットを用いて更に物理的に ES細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心（lOOOrpmで 3分、室温）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収した。ラット ES細胞用培養液で細胞を懸濁し、完全に単離化するのでは無く、顕微鏡下にて 5〜20個の細胞塊を形成している状態を確認し（図 5の a ) ) 、使用前日にフィーダ一細胞を播種した 60 mmゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、ョ本）に移し培養した（図 6中「継代 2代目」）。その後 5〜10日目に継代可能な状態へと安定ィヒした細胞を、前記と同様の手法にて継代して得られた継代 3代目の細胞以降の細胞を、樹立ラット ES細胞とした（図 10) 。この樹立したラット ES細胞の形態は、これまでに報告されている各種 ES細胞と非常に良く似た ES細胞の典型的な形態であった（図 11) 。なお、樹立以降も前記と同様の手法にて 5〜10日毎に継代を行い、細胞を維持した。

実施例 2

樹立したラット ES細胞の解析

継代 5代目のラット ES細胞を用いて、 ES細胞としての特性を有することを確認した。具体的には以下の各性質について検討した。

1) RT-PCR分析による未分化マーカー遺伝子の発現解析

樹立したラット ES細胞における、代表的な未分化マーカーである 0ct3/4および Na nog遺伝子の発現の有無を検討した。まず樹立したラット ES細胞から総 R Aを IS0GE N (二ツボンジーン、東京、 0本）を用いて抽出した。一本鎖 cDNAは、総 RNA 2 μ _§ 、オリゴ（dT) _{1 8}プライマー 0. 5 μ 1、 dNTPs 10pmol、 RAV-2 RT ァーゼ 5単位、および一本鎖合成緩衝液（タカラ、京都、日本）を含む全量 20 / lにおいて合成した。合成は、 37°Cで 10分間、 42°Cで 1時間、 56°Cで 10分間、および 99°Cで 5分間行った。また、以下のプライマーを合成した (オリゴヌクレオチド配列は、センス、アンチセンスプライマーの順に括弧内に記載し、その後にアニーリング温度、 PCRに用いたサイクル、および増幅した断片の長さを示す）： β -ァクチン (5' - AGAGCMGAGAG GTATCCTG- 3' (配列番号： 1) 、 5' - AGAGCATAGCCCTCGTAGAT- 3' (配列番号： 2) ; 55 °C； 25サイクル； 339bp) 、 Oct 3/4 (5， - ATGGACTACCCAGAACCCCAG- 3，（配列番号： 3) 、 5，— TTACAGGAGCTGCAGTTATAC-3' (配列番号： 4) ； 56。C； 35サイクル； 448bp ) 、 Nanog (5' - TAGCCCTGATTCTTCTAGCA- 3，（配列番号： 5)、（5， -TTTGCTGCAACGGCACA TAA-3' (配列番号： 6) ; 54°C ; 35 サイクル； 617bp)。なおラット Oct 3/4のプライマ一は、マウス Oct 3/4遺伝子の CDS配列を GenBankより入手し、さらに、その塩基配列を BLASTにて検索してラット Oct 3/4遺伝子配列を得、マウスとラットの相同性を検索し、マウス ES細胞は増幅しない領域を選んで、これをラット特異的 Oct 3/4プライマーとして設計した。 Nanogについてもマウスおよびヒト Nanog遺伝子の C DS配列をもとにしてプライマーを設計した。

増幅は、铸型 cDNA 4 μ 1、 100 μ Μ dNTPs _Ν プライマー 10pmol、 Εχ-Taq 1. 0単位およひ Έχ- Taq緩衝液（タカラ、京都、日本）を含む全量 50 1において行った。 PCR後、少量を 3. 0°/。ァガロースゲル上で泳動させて、ェチジゥムブロマイド（EtBr) によつて染色した後、 UV照射下で写真を撮影した。結果を図 12に示す。図 12より明らかなように、ラット ES細胞の cDNAでのみ、ラット特異的 0ct3/4および Nanog遺伝子断片の増幅を示すバンドが確認された。

2) アル力リホスファターゼ活性の分析

細胞が未分化能を有していることを証明する代表的な指標の一つであるアル力リホスファターゼ活性の有無を分析した。まずラット ES細胞用培養液およびフィーダ一細胞存在下にて培養を行った樹立ラット ES細胞を直接、 4%パラホルムアルデヒドを用いて 10分間固定して、その後 100% EtOHで 10分間固定した。 0によって 30分間洗浄した。アル力リホスファターゼ活性は、説明書に従って、ベクターレツドアルカリホスファタ一ゼ基質キット I (フナコシ、東京、曰本）によって検出した。結果を図 13に示す。樹立したラット ES細胞はアル力リホスファターゼ活性陽性であることが示された。

3) 胚様体形成能の分析

ES細胞をフィーダ一細胞や LIFの存在しない条件下で非コート培養皿を用いて培養することにより、胚様体が形成されることが知られている（Roy. S.， et al. , Mo 1. Cell. Biol. , 18 : 3947-3955 (1998) )。そこで樹立ラット ES細胞 1. O X 10⁷個を非コート培養皿にて rLIFを除いたラット ES細胞用培養液を用いて播種し、 37°Cで 3 日間置きに培養液を交換し、 20日間インキュベートした。結果を図 14に示す。図 14 より明らかなように胚様体が形成され、心筋様に鼓動する胚様体が多数確認できた 4) ES細胞マーカー染色の分析

未分化マーカーの発現の有無につき検討した。ラット ES細胞用培養液およびフィーダー細胞存在下にて培養を行った樹立ラット ES細胞を直接、 4%パラホルムアルデヒドを用いて 10分間固定して、その後 0. 02% トライトン X-100で 15分間静置し、 3 %過酸化水素水/メタノールにて 15分間静置した。 5%血清/ PBSにて 15分間プロツキングした後、 ES細胞の代表的な膜タンパク質であり、未分化マーカーの一種である SSEA (胎児ステージ特異的抗原； stage- specific embryonic antigen) - 1、 SSEA- 4 、 TRA- 1-60および TRA- 1-81を、説明書に従って、 ES細胞キャラクタライゼイシヨンキット（フナコシ、東京、日本）と二次抗体（抗マウス IgG抗体-ピオチン標識（フナコシ、東京、日本)）、 DAB染色キット（コゥヮ、東京、日本）によって検出した。結果を図 15に示す。 SSEA-1および SSEA- 4は陽性であり、これら未分化マーカーが発現していることが示された。 TM - 1 - 60および TRA - 1 - 81については本抗体染色結果では発現は検出できなかった。

5) 染色体数の分析

樹立したラット ES細胞が正常な染色体数を保持しているかどう力確認した。樹立ラット ES細胞をフィーダ一細胞非存在下のゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）ラット ES細胞用培養液を用いて培養を行い、 G-バンド法（Sumner A. T. Can cer Genet Cytogenet. 6： 59-87 (1982) ) によって染色体数を分析した。結果を図 16に示す。正常ラット細胞の染色体数（2n=42)を保持していることが示された。 6) 継代回数の分析

樹立したラット ES細胞の継代回数と未分化能維持率について検討した。ラット ES 細胞をフィーダ一細胞存在下のゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）においてラット ES細胞用培養液を用いて培養し、継代回数と未分化能力の保持性についてアル力リホスファターゼ活性を指標に検討した。開始は継代回数 5代目からで、以後、 5代目毎にアルカリホスファターゼ活性染色を行った。アルカリホスファターゼ活性は、説明書に従って、ベクターレッドアルカリホスファタ一ゼ基質キッ卜 I (フナコシ、東京、日本）によって検出した。結果を図 17に示す。ラット ES細胞用培養液を用いることにより少なくとも継代 25代目まで安定的に未分化能を維持した状態で培養が可能であることが明らかとなった。なお^の後、継代 35代目まで安定的に培養できることが明らかとなっている。

7) インビトロ系における多分化能の分析

樹立したラット ES細胞の自発的分化能につき検討した。樹立ラット ES細胞 1. 0 X 1 0⁷個を非コート培養皿（イワキ、東京、 S本）において、ラット由来白血病阻害因子 (rLIF)を除いたラット ES細胞用培養液で培養することにより胚様体形成を開始した。形成開始 7日目にゼラチンコート培養皿（イワキ、東京、日本）に胚様体を移し、さらに 7日間培養を行った。結果を図 18に示す。

図 18 (a)に示されるように、胚様体から神経様細胞が出現した。この神経様細胞の拡大図（b)においては 2細胞間で神経突起を伸ばし、また連結しているような像が確認された。脂肪様細胞は細胞質内に多数の透明顆粒を含んでいるのが特徴であるが、図 18 (c)に示すように多数の透明顆粒を含む脂肪様細胞像が確認された。また図 18 (d)に示すように上皮系細胞も多数確認された。このように樹立したラット E S細胞は自発的に様々な細胞へと分化する能力を有していることが確認された。 8)血清および LIF添加のラット ES細胞への影響

樹立したラット ES細胞に対する LIFと血清が及ぼす未分化能維持や増殖能への影響について検討した。継代 5代目のラット ES細胞を以下の 4種類の培養条件にて 1代継代した。（1)ラット LIF (rLIF)含有、無血清（20%KSR含有）、（2) LIF無添加、無血清（20%KSR含有）、（¾マウス LIF (mLIF) 含有、無血清（²0%KSR含有）、及び（ 4)ラット LIF (rLIF)含有、 20%血清含有。

未分化能を維持しているか否かは、 ES細胞の未分化マーカー遺伝子である 0ct3/4

、 Nanog、 Rex- 1の各遺伝子の発現の有無を解析することにより調べた。また ES細胞の特徴である奇形 fl重瘍形成に重要な ERas遺伝子の発現の有無も角军析した。用いたプライマーの配列、アニーリング温度おょぴ PCRに用いたサイクルは以下の通りである：

Oct 3/4： 5' -ATGGACTACCCAGAACCCCAG-3' (配列番号： 3) 、 5， TTACAGGAGCTGCAGTTA TAC-3' (配列番号： 4) 、 56°C、 40サイクル、

Nanog： 5' -TAGCCCTGATTCTTCTAGCA - 3' (配列番号： 5)、 5' - TTTGCTGCAACGGCACATM- 3' (配列番号： 6)、 60。C、 40サイクル、

Rex-1： 5' -AAATCATGACGAGGCAAGGC-3' (配列番号： 7)、 5' -TGAGTTCGCTCCAACAGTCT-3' (配列番号： 8)、 60°C、 40サイクル、

ERas： 5' -ACCTGAGCCCCGGCACACAG-3' (配列番号： 9)、 5， - CAGCTGCAGCGGTGTGGGCG- 3， (配列番号： 10) 、 64°C、 40サイクル。

さらに形態学的な観察も行った。結果を図 19に示す。

rLIFと 20%KSRでラット ES細胞を培養（前記（1) ) すると、形態的に安定であり（図 19) 、また ES細胞マーカー遺伝子の発現が観察されたことにより、未分化能を維持した状態で増殖出来ることが確認された。一方、残りの 3条件（前記 (²)〜(4) ) で培養すると、特徴的な ES細胞マーカー類の発現は消失し、形態的にも分化状態に移行した（図 19)。以上の結果より、ラット ES細胞の培養にはラット LIFと血清代替試薬 (KSR)の両者が重要であることが明らかとなつた。 9) 奇形腫形成能の分析

樹立したラット ES細胞を PBSにて 1. 0 X 10⁷個/ 200 z lに懸濁調整し、同系雄ラット (15週齢）の精巣内部および皮下内部に細胞移植を行う。ラットをと殺し、形成された奇形腫を摘出した後、 4%パラホルムアルデヒドにて固定する。組織切片を作成し、へマトキシリン 'ェォジンで染色し、顕微鏡下にて三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）への分化誘導を確認する。

10) キメララット作製能の分析

pEGFP- 1ベクター（クローンテック社）の EGFP遺伝子上流にニヮトリのアルブミンプロモーターを組み込み、 EGFP遺伝子が安定的に細胞内で発現するベクターとして構築した。本作製したベクターをエレクトロポレーシヨン法を用いてラット ES細胞内部に導入し、ラット ES細胞内部の染色体遺伝子内に組み込まれた細胞株を G418 を用いて薬剤選別を行い、樹立した（RESCZEGFP株）。

一方、 ES細胞と同系のラットを用いて自然交配し、膣栓確認 3日目に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出し、 mw培地で灌流して卵を回収した。その後 5% C0₂培養装置にて 40個の採卵を 8細胞期胚まで発生を進める。オイルドロップ内でタイロイド酸 (pH2. 5)を用いて透明帯を除去し、フィーダ一細胞を除去し、前記で樹立したラット ES細胞株 (RESC/EGFP細胞）の細胞塊 1個（5から 20個）を、同系ラットの受精卵にマイクロインジェクション法を用いて導入する。 5% C0₂培養装置内でー晚培養を行う（移植用卵）。一方、予め輸精管結紮手術を施し^雄ラットと採卵用雌ラットを交配させ、翌日に雌ラットの膣栓を確認し、偽妊娠雌ラットを作製する。麻酔を掛けた偽妊娠雌ラットを開腹し、子宮内に移植用卵をそれぞれ 10個注入する。自然分娩や、特に必要とされた場合には帝王切開にて仔を摘出し、仔ラットに蛍光を照射して体が蛍光色を呈する事によりキメララットの誕生を確認する。

実施例 3

ES細胞の樹立及び樹立したラット ES細胞の解析 ( 2 )

1) ES細胞の樹立

実施例 1に示した Wister Kyotoラット（WKY)の場合と同様の手法にて、 Wister Ha nnover GALASラット（WHG)および Brown Norwayラット（BN)についても ES細胞の樹立を行った。その結果、いずれのラットについても ES細胞を樹立することができた。各ラット（WKY、 WHG及び BN)の胚盤胞から形成された内部細胞塊の写真を図 20に示す

。また継代 5代目の樹立 ES細胞の写真も併せて図 20に示す。 WHGラット ES細胞、 BNラット ES細胞いずれについても WKYラット ES細胞と同様に未分化能を維持したまま継代できることが確認できた。

2) RT - PCR分析による ES細胞マーカー遺伝子の発現解析

樹立した WKYラット ES細胞、 WHGラット ES細胞、 BNラット ES細胞における ES細胞マ一力一遺伝子の発現の有無を、 RT- PCR分析により行った。実験は実施例 2の 1)と同様にして行った。 ES細胞の未分化マーカー遺伝子である 0ct3/4、 Rex- 1および Nanog 遺伝子の発現を解析した。また ES細胞の特徴である奇形腫瘍形成に重要な ERas遺伝子の発現も角析した。 RT-PCRのプライマーは実施例 2の 1)及び 8)に示したものを用いた。 WKYラット ES細胞の結果を図 21に示す。 0ct3/4、 Rex- 1、 Nanog, ERasのいずれの因子についても発現が示された。 WHGラット ES細胞、 BNラット ES細胞についても同じ結果が得られた。

3) ES細胞から形成された胚様体の分析

樹立ラット ES細胞を非コート培養皿にて rLIFを除いたラット ES細胞用培養液を用いて播種し、 37°Cで 3 Θ間置きに培養液を交換し、 20日間インキュベートした。そ. の結果胚様体が形成され、心筋様に鼓動する胚様体が多数確認できた。

次に、この心筋様細胞の出現した胚様体から RNAを抽出し、神経細胞 (外胚葉)、心筋細胞（中胚葉）および肝細胞（内胚葉）の各マーカ一遺伝子の発現を RT- PCRで解析した。各マーカー遺伝子の名称、' プライマー配列、アニーリング温度および PCRに用いたサイクルを以下に示す。

A)神経細胞マーカー

Nest in : 5' - GCTCTGACCTATCATCTGAG- 3，（配列番号： 11)、 5' -AGATGCACAGGAGATGCTAC- 3 ，（配列番号： 12) 、 58°C、 40サイクル、

TUJ1： 5， -GGAACGCATCAGTGTCTACT-3' (配列番号： 13) 、 5' -ACCACGCTGAAGGTGTTCA T-3' (配列番号： 14)、 60°C、 40サイクル、

MSI- 1： 5' - TCTCACTGCTTATGGTCCGA- 3' (配列番号： 15)、 5' - TCAGTGGTACCCATTGGTG A - 3' (配列番号： 16)、 60°C、 40サイクル、

GFAP : 5' -GGCTCTGAGAGAGATTCGCA-3' (配列番号： 17)、 5' - ATGTCCAGGGCTAGCTTMC- 3 ， (配列番号： 18)、 58°C、 40サイクル、

B)心筋細胞マーカー

CCC : 5' -TCTGAAGCGGCAGAAGAATC-3' (配列番号： 19) 、 5， - TGACCTCGATG CTTGGGA- 3，（配列番号： 20)、 58°C、 40サイクル、

ANF : 5' -ATACAGTGCGGTGTCCAACA-3' (配列番号： 21) ヽ 5' -TTATCTTCGGTACCGGAAGC- 3, (配列番号： 22)、 58°C、 40サイクル、

KvLQTl : 5' - TGCGGATGCTGCATGTTGAT- 3，（配列番号： 23) 、 5' -CAAACCCAGAGCCAAGTA TG-3' (配列番号： 24)、 58°C、 40サイクル、

C)肝細胞マーカー

ALB : 5' -GCTTGCTGTGATMGCCAGT-3' (配列番号： 25)、 5， - TGGCAGACAGATAGTCTTCC-3 ' (配列番号： 26)、 58°C、 40サイクル、

TD0 : 5' -CGATGAGAAGCGTCATGACT-3' (配列番号： 27)、 5， - MCCAGGTACGATGAGAGGT- 3， ( 配列番号： 28)、 58°C、 40サイクル、

TAT : 5' -AATGAGATTCGAGACGGGCT-3' (配列番号： 29)、 5, - TTCATCACAGTGGTAGTGCT- 3' (配列番号： 30)、 58°C、 40サイクル、

G6P : 5' -GTCAACGTATGGATTCCGGT-3' (配列番号： 31)、 5， - GTTCTCCTTTGCAGCTCTTG- 3， ( 配列番号： 32)、 58°Cs 40サイクル。

RT - PCRの結果を図 22に示す。未分化状態（レーン 1) では発現していない遺伝子力胚葉体（レーン 2)では全て陽性に転じていることが明らかとなった。この結果より、樹立したラット ES細胞は三胚葉 (外胚葉、中胚葉、内胚葉)系列の細胞へと分化する能力を有していること、すなわち ES細胞としての性質を有していることが明らかとなつた。，

4)奇形腫（テラトーマ）形成能の分析

樹立した WKYラット ES細胞、 WHGラット ES細胞、および BNラット ES細胞を、それぞれ免疫不全マウスの皮下に 2. 5 X 10⁷細胞個移植した。その後 1-2ヶ月後にこれら全ての ES細胞移植マウスにおいてテラトーマの形成を確認した。 WHGラット ES細胞の結果を図 23に示す。マウスをと殺し、形成されたテラトーマを摘出した後、 4%ノ、。ラホルムアルデヒドにて固定した。組織切片を作成し、へマトキシリン 'ェォジンで染色した（図 23)。顕微鏡下での観察により、腺構造（中胚葉系列）、血管内皮様構造（外胚葉系列）、腸管様構造（内胚葉系列）、および骨細胞様構造（中胚葉系列）の各組織が観察された。以上の結果より、樹立したラット ES細胞はテラトーマ形成能を有し、形成されたテラトーマは三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）構造を有することが明らかとなった。

5) キメララット作製能の分析

pCAG- EGFP遺伝子をエレクトロポレーション法を用いてラット ES細胞（WHGラット E S細胞）に導入し、 pCAG- EGFP遺伝子を染色体上に組み込んだ WHGラット ES細胞株（以下、 pCAG - EGFP/WHGrES細胞株と称する）を作製した。

WHGラット ES細胞と同系統の雌ラットを用いて自然交配し、翌日の膣栓陽性確認後、 4日目に採卵した。その後 5% C0₂培養装置にて胚盤胞期まで発生を進めた受精卵を採取し、 1個の卵につき 8〜12個の pCAG- EGFP/WHGrES細胞をマイクロインジエタシヨン法にて移植した卵を作製した（以下、 ES (+)と称する）。

一方、精管結紮を施した同系統ラット雄と同系統ラット雌との交配を行い、翌日の膣栓陽性を確認し、偽妊娠雌ラットを作製した。膣栓陽性確認後 4日目に、偽妊娠ラット 1匹あたり 6個〜 10個の ES (+)卵を移植した。その後帝王切開にて仔ラット (GFPキメララット）を摘出した。

この GFPキメララットから種々の糸且織を分離し、ゲノム DNAを抽出した。このゲノム DNAを铸型として、 GFP特異的プライマーを用いて常法にてゲノム PCRを行った。結果を図 24に示す。結果として、胸腺 ·血管 '脾臓の 3 を除く調べた全ての臓器で pCAG - EGFP/WHGrES細胞由来であることを示す GFP遺伝子のバンドが確認された。 —方、コントロール (野生型ラット）のゲノムには GFP遺伝子のバンドが確認されなかった。以上のようにラット ES細胞（_PCAG-EGFP/WHGrES細胞）由来の遺伝子が各組織や細胞中に含まれていたことから、樹立したラット ES細胞はキメララット作製能を有していることが明らかとなった。

6)キメララットの組織解析

前記 5)で得られた GFPキメララット、及び同系統の野生型ラットを用いて、それぞれ各組織を切片化し、 GFP抗体 (CL0NTECH) を用いて免疫染色を行った。結果を図 25に示す。 GFPキメララットの組織でのみ MB発色が確認され、確かに ES細胞由来の GFP細胞が各組織に存在し、且つ GFPを発現していることが明らかとなった。また GFPキメララットの肝臓切片をへキスト（青色）とローダミン (赤色）を用いて蛍光染色したところ、中心静脈近傍に GFP発現細胞であることを示す赤色領域が確認された（データは示さず）.。

以上の結果より、ラット ES細胞由来の遺伝子が各糸且織中に含まれているだけでなく、形態的に観察した結果、各組織系列の細胞へと分化していることが明らかとなつた。産業上の利用可能性

本発明によりラット ES細胞が提供される。本発明の樹立ラット ES細胞は、遺伝子改変ラット（ノックアウトラット、ノックインラット等）の作製を初めて可能とするものであり、癌や脳神経系を初めとする様々な領域における薬理研究や生理学における研究、さらには再生医療の研究などに幅広く用いることができる。配列表フリーテキスト

配列番号： 1に記載の塩基配列は PCRプライマーである。

配列番号： 2に記載の塩基配列は PCRプライマーである。

配列番号： 3に記載の塩基配列は PCRプラィマーである。

配列番号： 4に記載の塩基配列は PCRプライマー ό、める。

配列番号： 5に記載の塩基配列は PCRプライマーである。

配列番号： 6に記載の塩基配列は PCRプラィマーである。

配列番号： 7に記載の塩基配列は PCRブライマ一である。

配列番号： 8に記載の塩基配列は PCRプライマーである。

配列番号： 9に記載の塩基配列は PCRプライマーである。

配列番号： 1 0に記載の塩基配列は PCRプライマ一である。

配列番号： 1 1に記載の塩基配列は PCRプライマ一である。

配列番号： 1 2に記載の塩基配列は PCRプライマ一である。

配列番号： 1 3に記載の塩基配列は PCRプラィマ一である。

配列番号： 1 4に記載の塩基配列は PCRプライマ一である。

配列番号： 1 5に記載の塩基配列は PCRプライマ一である。配列番号： 1 6に記載の塩基配列は PCRプライマ—である。配列番号： 1 7に記載の塩基配列は PCRプライマ' —である。配列番号： 1 8に記載の塩基配列は PCRプライマ一である。配列番号： 1 9に記載の塩基配列は PCRプライマ、一である。配列番号： 2 0に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 1に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 2に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 3に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 4に記載の塩基配列は PCRプライマ、 ―である。配列番号： 2 5に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 6に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 7に記載の塩基配列は PCRプラィマ、 —である。配列番号： 2 8に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 2 9に記載の塩基配列は PCRプライマ、一である。配列番号： 3 0に記載の塩基配列は PCRプライマ、 —である。配列番号： 3 1に記載の塩基配列は PCRプライマ、一である。配列番号： 3 2に記載の塩基配列は PCRプラィマ、 —であ。。

Claims

請求の範囲

1 . 以下の（a)〜（j)の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞： (a) 0ct3/4遺伝子および Nanog遺伝子を発現する、

(b) アルカリホスファターゼ活性陽性である、

(c) 胚様体形成能を有する、

(d) SSEA (胎児ステージ特異的抗原) - 1および SSEA- 4を発現する、

(e) 正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、

(f) 未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、

(g) インビトロで多分化能を有する、

(h) 三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、

(i) 奇形腫形成能を有する、

(j) キメララット作製能を有する。

2 . 実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（A)〜ゆ)の工程を含むプロセスを行うことにより得られる、ラット胚性幹細胞：

(A) ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保挎した状態で解離する工程、

(B) 解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、ゝ

(C) 継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代 -培養する工程、

(D) さらに継代 ·培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程。

3 . 培養液が血清代替試薬を含有する、請求項 2記載の胚性幹細胞。

4 . 工程 (A)が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、請求項 2または 3記載の fi3性幹細胞。

5 . 工程 (C)が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、請求項 2〜 4 、ずれか記載の胚性幹細胞。

6 . 工程 (A)においてラット由来白血病阻害因子（rLIF) を含有しない培養液を用いる、請求項 2〜 5いずれ力記載の胚性幹細胞。

7 . 工程 (B)〜(D)において rLIFを含有する培養液を用いる、請求項 2〜 6いずれか記載の胚性幹細胞。

8 . 実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下の（A)〜(D)の工程を含むプロセスを行うことを特徴とする、ラット胚性幹細胞の製造方法：

(0 継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代 '培養する工程、

9 . 培養液が血清代替試薬を含有する、請求項 8記載の製造方法。

1 0. 工程 (A)が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、請求項 8または 9 記載の製造方法。

1 1 . 工程 (C)が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、請求項 8〜 1 0いずれか記載の製造方法。

1 2 . 工程 (A)において rLIFを含有しない培養液を用いる、請求項 8〜1 1いずれか記載の製造方法。

1 3 . 工程 (B)〜(D)において rLIFを含有する培養液を、用いる、請求項 8〜1 2いずれか記載の製造方法。

1 4 . 細胞集塊を保持した状態で解離し継代することを特徴とする、ラット胚性幹細胞の継代培養方法。

1 5 . 物理的に細胞を解離する工程を含む、請求項 1 4記載の継代培養方法。

1 6 . 実質的に血清を含有しない培養液を用いて培養することを特徴とする、請求項 1 4または 1 5記載の継代培養方法。

1 7 . 培養液が血清代替試薬を含有するものである、請求項 1 6記載の継代培養方法。

1 8 . 培養液が rLIFを含有するものである、請求項 1 6または 1 7記載の継代培養方法。

1 9 . 血清代替試薬および rLIFを含有するラット胚性幹細胞用培養液。

2 0 . 血清代替試薬および rLIFを成分として含有する、ラット胚性幹細胞培養キッ卜。

2 1 . さらに請求項 1〜 7いずれか記載のラット胚性幹細胞を成分として含有する、請求項 2 0記載の培養キット。 ·

2 2 . さらにフィーダ一細胞を成分として含有する、請求項 2 0または 2 1記載の培養キット。

2 3 . フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、請求項 2 2記載の培養キット。

2 4 . 請求項 1〜 7 、ずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導剤で刺激することを特徴とする、ラット胚性幹細胞の分化誘導方法。

2 5 . 分化誘導剤がレチノィン酸、増殖因子、ダルココルチコィドまたは細胞外基質である、請求項 2 4記載の分化誘導方法。

2 6 . 請求項 1〜 7いずれ力記載のラット胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞。

2 7 . 請求項 1〜 7 、ずれか記載のラット胚性幹細胞に由来する c D N Aライブラリー、ゲノムライブラリーまたは細胞抽出物。

2 8 . 以下の（i)〜（iii)の工程を含む、，袓織または細胞の分化誘導剤のスクリ一ユング方法：、

(i) 被験物質を請求項 1〜 7いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、

(iii) 上記 (ii)の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程。

2 9 . 以下の（I)〜（III)の工程を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリ一ユング方法：

(II) 胚性幹細胞の分化誘導条件下で前記 (I)のラット胚性幹細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、

(III) 上記 (II)の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程。

3 0 . 請求項 1〜 7いずれか記載のラット胚性幹細胞の、遺伝子改変ラットの作製における使用。

3 1 . 遗伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェエツクラットおよびノックダウンラットのいずれかである、請求項 3 0記載の使用。

3 2 . 以下の（X)〜（Z)の工程を含むプロセスを行うことによる遺伝子改変ラットの製造方法：

(X) 請求項 1〜 7いずれか記載のラット胚性幹細胞に所望の遺伝子を導入する工程

(Y) 遺伝子導入されたラット胚性幹細胞を含有する移植用卵を調製する工程、 (Z) 移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程。

3 3 . 請求項 3 2記載の製造方法により製造された遺伝子改変ラット。

3 4 . 遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジエニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、請求項 3 3記載のラット。