KR20120091471A - 래트 배아 줄기 세포 - Google Patents

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KR20120091471A
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KR1020127019774A
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다쿠미 데라타니
다카히로 오치야
Original Assignee
도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠간켄큐센터
다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 (a) Oct3/4 유전자 및 Nanog 유전자를 발현하고, (b) 알칼리 포스파타제 활성 양성이고, (c) 배양체 형성능을 가지며, (d) SSEA(태아기 특이적 항원)-1 및 SSEA-4를 발현하고, (e) 정상 래트 세포와 동일한 염색체 수를 가지며, (f) 미분화 상태를 유지한 채 계대 배양이 가능하고, (g) 시험관내에서 다분화능을 가지며, (h) 삼배엽 계열의 세포로 분화하는 능력을 가지고, (i) 기형종 형성능을 가지며, 또 (j) 키메라 래트 제작능을 갖는다 라는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 래트 배아 줄기 세포, 및 상기 래트 배아 줄기 세포의 수립 방법 등을 제공한다.

Description

래트 배아 줄기 세포{RAT EMBRYONIC STEM CELL}
본 발명은 래트 배아 줄기 세포(이하 ES 세포)에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 래트 ES 세포, 래트 ES 세포의 제조 방법, 래트 ES 세포의 계대 배양 방법, 래트 ES 세포를 이용한 분화 유도 관련 물질의 스크리닝 방법 및 유전자 개변 래트의 제작에서의 상기 래트 ES 세포의 용도 등에 관한 것이다.
ES 세포는 배반포의 내부 세포괴로부터 수립된 세포주로, 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor; LIF)의 존재 하에서 자기 복제할 수 있는 세포이다. 배양 조건을 변경함으로써, ES 세포를 모든 종류의 세포(신경 세포, 근육 세포, 혈관 내피 세포, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 뼈, 연골, 신장, 장, 간장, 췌장, 폐 등)로 분화시킬 수 있다. 게놈 프로젝트에 의해 많은 동물종의 게놈이 해독되고, 인간과의 상동성에 관한 정보가 축적되어 왔다. 이들 정보에 기초하여 ES 세포의 단계에서 특정 유전자를 파괴하여 그 유전자가 세포의 분화 또는 개체의 육성, 항상성의 유지 등에서 담당하는 역할(기능)을 알 수 있다. 구체적으로는 특정 유전자를 파괴한 ES 세포를 정상적인 숙주의 배반포에 주입하여 숙주배의 세포와 혼합하여 자궁에 복귀시키면 키메라 동물을 만들 수 있고, 얻어진 키메라 동물을 교배시킴으로써 특정 유전자가 파괴된 동물(넉아웃 동물)을 제작할 수 있다. 또한 ES 세포에 화합물을 작용시킴으로써 여러 가지 세포(장기) 중의 유전자에 부여하는 영향을 평가할 수 있다. 한편, ES 세포를 분화시켜 얻어진 정상적인 세포를 이용함으로써 세포 요법, 재생 의료가 가능해진다. 이상과 같이 ES 세포는 생리학, 약리학이나 재생 의료 등의 연구에서 폭 넓게 응용할 수 있다. 그러나, 실험 동물에서는 지금까지 마우스[Evans M. J. et al., Nature 1981, 292: 154-156], 붉은털 원숭이[Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92: 7844-7848], 명주 원숭이[Thomson J. A. et al., Cur. Top. Dev. Biol. 1998, 38: 133-165] 및 게잡이 원숭이[Suemori H, et al., Methods Enzymol. 2003, 365: 419-429]의 ES 세포가 수립된 것뿐이며, 래트 ES 세포는 아직 수립되어 있지 않다.
래트는 마우스에 비해 약 10배라는 실험상 적당한 크기를 갖는 포유 동물이며, ① 세포 혈관에 용이하게 약물 투여가 가능하고, ② 외과?이식 실험이 가능하며, 그리고 ③ 조직을 대량으로 채취 가능하다 라고 하는 이점을 갖는다. 지금까지 많은 인간 질환 모델 래트가 개발?발견되어 있고, 래트는 의학을 비롯한 각 분야에서 광범위하게 이용되는 가장 유용한 실험 동물 중 하나이다. 래트는 과거 100년 이래, 현재도 암, 뇌 신경계, 이식 및 인간 다인자 질환 등의 모델로서 기능 연구 등에 이용되고 있고, 기능에 관한 방대한 연구 자산이 축적되어 있다. 특히 뇌 지도의 해석이 진행되면서, 심리 생리학에서의 행동 연구에서도 정보가 풍부하다. 마우스에 비해 최대의 약점이었던 유전자 해석에 관해서도 래트 게놈의 해석이 진행되고 있기 때문에 인간과의 유전자 레벨에서의 비교가 가능해지고, 포스트 게놈을 주도하는 우수한 실험 동물로서 주목되고 있다. 실제로 2002년 3월에 개최된 과학 기술?학술 심의회 연구 계획?평가 분과회 생명 과학 위원회 바이오 재원 영역 소위원회도 래트가 금후 일본이 충실해야 하는 바이오 재원 중 하나이며, 넉아웃 래트의 생산을 목적으로 한 ES 세포의 수립이 필요하다고 보고되고 있다.
이러한 래트의 유용성과 그 주변의 유전자 정보 등의 충실에도 불구하고, 유전자 개변 래트 제작에 필수적인 래트 ES 세포의 수립은 최대의 어려움이었다. 예컨대 문헌[Iannaccone PM et al., Developmental Biology 1994, 163: 288-292] 및 그 대응 특허 출원인 WO 95/06716호 공보에는 래트 PVG주로부터 ES 세포를 수립하고, 키메라 래트를 제작한 것이 기재되어 있다. 그러나 그 후, 문헌[Brenin D., et al., Developmental Biology 1997, 185: 124-125]에 있어서, 상기 문헌[Developmental Biology 1994, 163: 288-292]에서 제작한 키메라 래트는 마우스 ES 세포의 혼입에 의해 제작되었다는 기재가 이루어져 있다. 즉 래트 ES 세포의 수립 및 키메라 래트의 제작에는 성공하지 못하였음이 개시되어 있다. 또한 그 외에도 래트 ES 세포의 수립을 시도한 예는 있지만(WO 99/27076호 공보 및 특허 공개 제2002-176973호 공보를 참조), 모두 그 수립에는 도달해 있지 않다.
이와 같이, 지금까지 복수의 연구 그룹이 래트 ES 세포주의 수립을 시도하고 있지만, 수립에는 도달하지 못하고, 2004년 1월에 미국 키스톤에서 개최된 STEM CELL 국제 회의에서도 래트 ES 세포의 수립은 전 세계적으로도 보고는 없다는 인식이었다. 래트 ES 세포 수립의 성공의 열쇠를 쥐는 것은 ES 세포 제작의 배양 조건의 설정이다. 지금까지 마우스 ES 세포의 수립 및 배양 조건을 기본으로 하여 수립이 시도되어 왔지만, 래트 ES 세포의 수립에는 도달해 있지 않다. 이러한 배경으로부터, 래트 ES 세포의 작출에는 배양 조건의 고안이 필요 불가결이라고 생각되고 있다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 종래 얻을 수 없었던 래트 ES 세포를 제공하는 것에 있다. 또한 래트 ES 세포의 수립 방법, 제조 방법, 래트 ES 세포의 계대 배양 방법, 래트 ES 세포를 이용한 분화 유도 관련 물질의 스크리닝 방법 및 유전자 개변 래트의 제작에서의 상기 래트 ES 세포의 용도 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 여러 가지 계통의 래트에서 유래하는 배반포로부터 래트 ES 세포의 수립을 시도한 결과, 마우스 ES 세포와는 전혀 다른 배양 조건?계대 조건을 확립함으로써, 래트 ES 세포주를 수립하는 것에 성공하였다. 구체적으로는, 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용하고, 내부 세포괴의 단리 및 ES 세포의 계대에서 물리적 방법에 의해 수립을 시도하는 등 여러 가지 고안을 집중시킴으로써, 안정적이면서 ES 세포의 조건을 모두 만족시킨 래트 ES 세포를 수립?공급하는 것에 처음으로 성공하였다.
본 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성하기에 이르렀다.
즉 본 발명은 하기에 속하는 것이다:
(1) 이하의 (a)?(j)의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 래트 배아 줄기 세포:
(a) 0ct3/4 유전자 및 Nanog 유전자를 발현한다,
(b) 알칼리 포스파타제 활성 양성이다,
(c) 배양체 형성능을 갖는다,
(d) SSEA(태아기 특이적 항원)-1 및 SSEA-4를 발현한다,
(e) 정상 래트 세포와 동일한 염색체 수를 갖는다,
(f) 미분화 상태를 유지한 채 계대 배양이 가능하다,
(g) 시험관내에서 다분화능을 갖는다,
(h) 삼배엽 계열의 세포로 분화하는 능력을 갖는다,
(i) 기형종 형성능을 갖는다,
(j) 키메라 래트 제작능을 갖는다;
(2) (k) 20% 혈청 존재 하에서의 배양에 의해 분화한다 라는 성질을 추가로 갖는 상기 (1) 기재의 래트 배아 줄기 세포;
(3) 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용한 배양 조건 하에서 이하의 (A)?(D)의 공정을 포함하는 프로세스를 행함으로써 얻어지는 래트 배아 줄기 세포:
(A) 래트 배반포를 배양함으로써 형성시킨 내부 세포괴를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하는 공정,
(B) 해리한 내부 세포괴를 배양함에 의해 출현한 초대 배아 줄기 세포를 계대 가능해질 때까지 배양하는 공정,
(C) 계대 가능해진 초대 배아 줄기 세포를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하고, 계대?배양하는 공정,
(D) 계대?배양을 추가로 행함으로써 배아 줄기 세포를 수립하는 공정;
(4) 배양액이 혈청 대체 시약을 함유하는, 상기 (3) 기재의 배아 줄기 세포;
(5) 공정 (A)가 물리적으로 내부 세포괴를 해리하는 공정을 포함하는, 상기 (3) 또는 (4) 기재의 배아 줄기 세포;
(6) 공정 (C)가 물리적으로 배아 줄기 세포를 해리하는 공정을 포함하는, 상기 (3)?(5) 중 어느 하나에 기재한 배아 줄기 세포;
(7) 공정 (A)에서 래트 유래 백혈병 저해 인자(rLIF)를 함유하지 않는 배양액을 이용하는, 상기 (3)?(6) 중 어느 하나에 기재한 배아 줄기 세포;
(8) 공정 (B)?(D)에서 rLIF를 함유하는 배양액을 이용하는, 상기 (3)?(7) 중 어느 하나에 기재한 배아 줄기 세포;
(9) 배양에서 피더(feeder) 세포를 이용하는, 상기 (3)?(8) 중 어느 하나 기재한 배아 줄기 세포;
(10) 피더 세포가 태아 유래 정상 섬유아세포인, 상기 (9) 기재의 배아 줄기 세포;
(11) 위스터 교토(주)(WKY), 위스터 하노버 갈라스(주)(WHG) 및 브라운 노르웨이(주)(BN) 중 어느 하나의 계통에서 유래하는, 상기 (1)?(10) 중 어느 하나에 기재한 배아 줄기 세포;
(12) 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용한 배양 조건 하에서 이하의 (A)?(D)의 공정을 포함하는 프로세스를 행하는 것을 특징으로 하는, 마우스 이외의 배아 줄기 세포의 제조 방법:
(A) 래트 배반포를 배양함으로써 형성시킨 내부 세포괴를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하는 공정,
(B) 해리한 내부 세포괴를 배양함에 의해 출현한 초대 배아 줄기 세포를 계대 가능해질 때까지 배양하는 공정,
(C) 계대 가능해진 초대 배아 줄기 세포를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하고, 계대?배양하는 공정,
(D) 계대?배양을 추가로 행함으로써 배아 줄기 세포를 수립하는 공정;
(13) 마우스 이외의 배아 줄기 세포가 래트 배아 줄기 세포인, 상기 (12) 기재의 제조 방법;
(14) 배양액이 혈청 대체 시약을 함유하는, 상기 (12) 또는 (13) 기재의 제조 방법;
(15) 공정 (A)가 물리적으로 내부 세포괴를 해리하는 공정을 포함하는, 상기 (12)?(14) 중 어느 하나에 기재한 제조 방법;
(16) 공정 (C)가 물리적으로 배아 줄기 세포를 해리하는 공정을 포함하는, 상기 (12)?(15) 중 어느 하나에 기재한 제조 방법;
(17) 공정 (A)에서 rLIF를 함유하지 않는 배양액을 이용하는, 상기 (12)?(16) 중 어느 하나에 기재한 제조 방법;
(18) 공정 (B)?(D)에서 rLIF를 함유하는 배양액을 이용하는, 상기 (12)?(17) 중 어느 하나에 기재한 제조 방법;
(19) 배양에서 피더 세포를 이용하는, 상기 (12)?(18) 중 어느 하나에 기재한 제조 방법;
(20) 피더 세포가 태아 유래 정상 섬유아세포인, 상기 (19) 기재의 제조 방법;
(21) 래트 배아 줄기 세포가 위스터 쿄토(주)(WKY), 위스터 하노버 갈라스(주)(WHG) 및 브라운 노르웨이(주)(BN) 중 어느 하나의 계통에서 유래하는, 상기 (13)?(20) 중 어느 하나에 기재한 제조 방법;
(22) 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하여 계대하는 것을 특징으로 하는, 마우스 이외의 배아 줄기 세포의 계대 배양 방법;
(23) 마우스 이외의 배아 줄기 세포가 래트 배아 줄기 세포인, 상기 (22) 기재의 계대 배양 방법;
(24) 물리적으로 세포를 해리하는 공정을 포함하는, 상기 (22) 또는 (23) 기재의 계대 배양 방법;
(25) 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 (22)?(24) 중 어느 하나에 기재한 계대 배양 방법;
(26) 배양액이 혈청 대체 시약을 함유하는 것인, 상기 (25) 기재의 계대 배양 방법;
(27) 배양액이 rLIF를 함유하는 것인, 상기 (25) 또는 (26) 기재의 계대 배양 방법;
(28) 혈청 대체 시약 및 rLIF를 함유하는 것인, 마우스 이외의 배아 줄기 세포용 배양액;
(29) 마우스 이외의 배아 줄기 세포가 래트 배아 줄기 세포인, 상기 (28) 기재의 배양액;
(30) 혈청 대체 시약 및 rLIF를 성분으로서 함유하는, 마우스 이외의 배아 줄기 세포 배양 키트;
(31) 마우스 이외의 배아 줄기 세포가 래트 배아 줄기 세포인, 상기 (30) 기재의 배양 키트;
(32) 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포를 성분으로서 추가로 함유하는, 상기 (31) 기재의 배양 키트;
(33) 피더 세포를 추가로 함유하는, 상기 (30)?(32) 중 어느 하나에 기재한 배양 키트;
(34) 피더 세포가 태아 유래 정상 섬유아세포인, 상기 (33) 기재의 배양 키트;
(35) 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포를 분화 유도제로 자극하는 것을 특징으로 하는 래트 배아 줄기 세포의 분화 유도 방법;
(36) 분화 유도제가 레티노산, 증식 인자, 글루코코티코이드 또는 세포외기질인, 상기 (35)에 기재한 분화 유도 방법;
(37) 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어진 세포;
(38) 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포에서 유래하는 cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리 또는 세포 추출물;
(39) 이하의 (i)?(iii)의 공정을 포함하는, 조직 또는 세포의 분화 유도제의 스크리닝 방법:
(i) 피검 물질을 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포에 접촉시키는 공정,
(ii) 래트 배아 줄기 세포의 분화의 유무나 정도를 평가하는 공정,
(iii) 상기 (ii)의 평가 결과에 기초하여, 피검 물질이 분화 유도에 관련되는 물질인지의 여부를 판단하는 공정;
(40) 이하의 (I)?(III)의 공정을 포함하는, 조직 또는 세포의 분화 유도에 작용하는 물질의 스크리닝 방법:
(I) 피검 물질을 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포에 접촉시키는 공정,
(II) 배아 줄기 세포의 분화 유도 조건 하에서 상기 (I)의 래트 배아 줄기 세포를 배양하고, 분화의 유무나 정도를 평가하는 공정,
(III) 상기 (II)의 평가 결과에 기초하여, 피검 물질이 분화 유도에 작용하는 물질인지의 여부를 판단하는 공정;
(41) 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포의, 유전자 개변 래트의 제작에서의 용도;
(42) 유전자 개변 래트가 키메라 래트, 넉아웃 래트, 넉인 래트, 유전자 이식 래트 및 넉다운 래트 중 어느 하나인, 상기 (41) 기재의 용도;
(43) 이하의 (X)?(Z)의 공정을 포함하는 프로세스를 행하는 것에 의한 유전자 개변 래트의 제조 방법:
(X) 상기 (1)?(11) 중 어느 하나에 기재한 래트 배아 줄기 세포에 원하는 유전자를 도입하는 공정,
(Y) 유전자 도입된 래트 배아 줄기 세포를 함유하는 이식용 난을 조제하는 공정,
(Z) 이식용 난을 위임신시킨 암컷 래트에 도입하고, 새끼 래트를 산출하는 공정;
(44) 상기 (43) 기재의 제조 방법에 의해 제조된 유전자 개변 래트;
(45) 유전자 개변 래트가 키메라 래트, 넉아웃 래트, 넉인 래트, 유전자 이식 래트 및 넉다운 래트 중 어느 하나인, 상기 (44) 기재의 래트;
(46) 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용한 배양 조건 하에서 이하의 (A)?(D):
(A) 래트 배반포를 배양함으로써 형성시킨 내부 세포괴를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하는 공정,
(B) 해리한 내부 세포괴를 배양함에 의해 출현한 초대 배아 줄기 세포를 계대 가능해질 때까지 배양하는 공정,
(C) 계대 가능해진 초대 배아 줄기 세포를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하고, 계대?배양하는 공정,
(D) 계대?배양을 추가로 행함으로써 배아 줄기 세포를 수립하는 공정
의 공정을 포함하는 프로세스를 행함으로써 얻어지고, 또한 이하의 (a)?(j):
(a) Oct3/4 유전자 및 Nanog 유전자를 발현한다,
(b) 알칼리 포스파타제 활성 양성이다,
(c) 배양체 형성능을 갖는다,
(d) SSEA(태아기 특이적 항원)-1 및 SSEA-4를 발현한다,
(e) 정상 래트 세포와 동일한 염색체 수를 갖는다,
(f) 미분화 상태를 유지한 채 계대 배양이 가능하다,
(g) 시험관내에서 다분화능을 갖는다,
(h) 삼배엽 계열의 세포로 분화하는 능력을 갖는다,
(i) 기형종 형성능을 갖는다,
(j) 키메라 래트 제작능을 갖는다
라는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 래트 배아 줄기 세포;
(47) (k) 20% 혈청 존재 하에서의 배양에 의해 분화된다 라는 성질을 추가로 갖는, 상기 (46) 기재의 래트 배아 줄기 세포; 및
(48) 위스터 교토(주)(WKY), 위스터 하노버 갈라스(주)(WHG) 및 브라운 노르웨이(주)(BN) 중 어느 하나의 계통에서 유래하는, 상기 (46) 또는 (47) 기재의 배아 줄기 세포.
도 1은 래트 ES 세포 수립에 이용한 래트 배반포(후기)의 사진이다.
도 2는 래트 ES 세포 수립에 이용한 미토마이신 C 처리를 실시한 정상 마우스 태아 섬유아세포(피더 세포)의 사진이다.
도 3은 래트 ES 세포 수립 후에 있어서 래트 LIF의 첨가의 필요성에 관해서 검토한 결과를 도시하는 도면이다. 시작시는 계대 5대째로, 동일한 배양 접시로부터 각 농도의 rLIF를 첨가한 배양액을 사용하여 3회 계대하였을 때의 알칼리 포스파타제 활성 양성률을 조사한 결과를 도시하고 있다.
도 4는 배양액에서의 혈청의 유무의 검토 결과를 보여주는 사진이다. 각각, (A) 20% 혈청 대체 시약(KSR)을 이용한 래트 유래 내부 세포괴의 형성 사진, (B) 20% 소 태아 혈청을 이용한 래트 유래 내부 세포괴의 형성 사진, (C) 20% 혈청 대체 시약(KSR)을 이용하여 제작한 래트 유래 내부 세포괴를, 20% 혈청 대체 시약(KSR)을 첨가한 래트 ES 세포용 배양액과 피더 세포를 이용하여 배양한 경우의 형태 사진, (D) 20% 소 태아 혈청을 이용하여 제작한 래트 유래 내부 세포괴를, 20% 소 태아 혈청을 첨가한 래트 ES 세포용 배양액과 피더 세포를 이용하여 배양한 경우의 형태 사진이다.
도 5는 5?20개의 세포 집괴 상태로 래트 ES 세포를 계대한 경우 (a)와, 트립신?EDTA 용액으로 완전히 단일 세포화하여 계대한 경우 (b)를 비교한 결과를 보여주는 사진이다. 단일 세포화하는 것에 의해 자발적 분화가 발생한다.
도 6은 래트 ES 세포 수립법의 개략을 도시하는 도면이다.
도 7은 피더 세포와 래트 ES 세포 수립용 배양액을 이용하여 투명대를 제거한 래트 배반포를 배양하고, 내부 세포괴를 형성시킨 사진이다. 화살표는 형성시킨 내부 세포괴를 지시하고 있다.
도 8은 래트 유래 내부 세포괴를 래트 ES 세포용 배양액과 피더 세포를 이용하여 배양하여 출현한 초대 래트 ES 세포의 사진이다.
도 9는 ES 세포 콜로니 출현으로부터 7일째의 계대 가능해진 상태의 래트 ES 세포의 사진이다.
도 10은 래트 ES 세포용 배양액과 피더 세포를 이용하여 안정적으로 증식 및 계대 가능해진 래트 ES 세포(수립 래트 ES 세포)의 세포군을 보여주는 사진이다. 도면 중 화살표는 래트 ES 세포괴를 지시한다.
도 11은 수립한 래트 ES 세포의 형태를 보여주는 사진이다. a)는 100배, b)는 200배, c)는 400배의 사진이다.
도 12는 수립한 래트 ES 세포가 미분화 마커 유전자를 발현하고 있는 것을 보여주는 RT-PCR의 사진이다. ES 세포의 대표적인 미분화 마커 유전자인 Oct 3/4 유전자 및 Nanog 유전자의 발현의 유무를 조사하였다. 대조군으로서 β-액틴의 유전자 발현도 분석하였다.
도 13은 수립한 래트 ES 세포가 미분화능을 갖고 있는 것을 증명하는 대표적인 지표의 하나인 알칼리 포스파타제 활성을 보여주는 사진이다.
도 14는 수립한 래트 ES 세포의 배양체 형성능을 분석한 결과를 보여주는 사진이다. 약 20일째에 심근과 같이 고동(화살표)치는 배양체가 다수 확인되었다.
도 15는 수립한 세포가 ES 세포인 것을 나타내는 지표 마커 항체 4 종류[(A): SSEA-1, (B): SSEA-4, (C): TRA-1-60, (D): TRA-1-81]를 이용하여 면역 염색을 행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 16은 수립한 래트 ES 세포를 G 밴드법을 이용하여 염색체 수를 해석한 사진이다. 정상 래트 세포의 염색체 수(2n=42)를 보여주고 있다.
도 17은 수립한 래트 ES 세포의 계대 횟수와 미분화 유지 능력(알칼리 포스파타제 활성)의 관계를 도시하는 그래프이다. 시작은 계대 횟수 5대째로부터이고, 이후 5대째마다 알칼리 포스파타제 활성 염색을 행하였다. 종축은 양성 ES 세포 콜로니 수를 모든 ES 세포 콜로니 수로 나눈 값을 백분율로써 나타내고, 횡축은 계대 횟수를 나타내고 있다.
도 18은 수립한 래트 ES 세포가 시험관내에서 다분화능을 갖고 있는 것을 보여주는 사진이다. 배양체 형성 시작 7일 후에 젤라틴 코트 배양 접시에 배양체를 옮기고, 자발적 분화 유도를 행하였다. (a) 래트 ES 세포 유래 신경양 세포 사진, (b) 도 (a)의 사각으로 둘러싼 영역을 확대한 사진, (c) 래트 ES 세포 유래 지방양 세포의 사진, (d) 래트 ES 세포 유래 상피양 세포의 사진.
도 19는 수립한 래트 ES 세포에 대한 혈청?LIF 첨가의 영향을 조사한 결과를 보여주는 사진이다. 도면 중「래트 LIF + 20% FBS」는 래트 LIF(rLIF) 함유, 20% 혈청 함유 조건 하에서 배양한 결과를, 「무혈청」은 LIF 무첨가, 무혈청(20% KSR 함유) 조건 하에서 배양한 결과를, 「마우스 LIF + 무혈청」은 마우스 LIF(mLIF) 함유, 무혈청(20% KSR 함유) 조건 하에서 배양한 결과를, 또한 「래트 LIF + 무혈청」은 래트 LIF(rLIF) 함유, 무혈청(20% KSR 함유) 조건 하에서 배양한 결과를 각각 도시한다.
도 20은 각 래트(WKY, WHG 및 BN)로부터 ES 세포를 수립한 결과를 보여주는 사진이다. 상측 도면: 각 래트의 배반포로부터 형성시킨 내부 세포괴의 사진. 도면 중, 화살표는 형성시킨 내부 세포괴를 지시하고 있다. 하측 도면: 계대 5대째의 수립 ES 세포의 사진. 도면 중, WKYrES는 WKY 래트로부터 수립한 ES 세포를, WHGrES는 WHG 래트로부터 수립한 ES 세포를, 또한 BNrES는 BN 래트로부터 수립한 ES 세포를 각각 보여준다.
도 21은 수립한 래트 ES 세포(WKY 래트 ES 세포)가 ES 세포 마커 유전자를 발현하고 있는 것을 보여주는 RT-PCR의 사진이다. ES 세포의 대표적인 마커 유전자인 Oct 3/4, Rex-1, Nanog 및 ERas의 각 인자의 유전자 발현을 해석하였다. 대조군으로서 β-액틴 유전자의 발현도 해석하였다. 레인 1: 미분화 래트 ES 세포, 레인 2: 마우스 섬유아세포, 레인 3: 주형 DNA 무첨가(대조군). 각각으로부터 RNA를 추출하고, RT-PCR을 행하였다.
도 22는 수립한 래트 ES 세포(WHG 래트 ES 세포)로부터 형성시킨 배양체가 삼배엽 계열의 세포로 분화되어 있는 것을 보여주는 RT-PCR의 사진이다. 도면 중, 좌측은 각 마커 유전자의 명칭을 나타내고, TUJ1은 베타3-튜불린을, MSI-1은 무사시(musashi)-1을, GFAP는 신경교 섬유성 산성 단백질 알파를, CCC는 심장 디히드로피리딘 감수성 칼슘 채널 단백질을, ANF는 심장 나트륨 배설 인자를, ALB는 알부민을, TDO는 트립토판 2,3-디옥시게나제를, TAT는 티로신 아미노트랜스퍼라제를, G6P는 글루코스-6-포스페이트를, 그리고 ACT는 β-액틴을 각각 나타낸다. 레인 1: 미분화 래트 ES 세포, 레인 2: 래트 ES 세포 유래 배양체, 레인 3: 대조군(주형 DNA 무첨가), 레인 4: WHG 개체 유래의 각 장기(뇌, 심장, 간장). 각각으로부터 RNA를 추출하고, RT-PCR을 행하였다.
도 23은 수립한 래트 ES 세포(WHG 래트 ES 세포)의 마우스 피하에의 이식에 의해 테라토마가 형성된 것과, 이 테라토마가 삼배엽 구조를 갖는 것을 보여주는 사진이다. a): WHG 래트 ES 세포를 면역부전 마우스 피하에 이식하여 테라토마가 형성된 마우스의 사진. 목 주위의 혹이 테라토마이다. b): 적출한 테라토마의 사진. 도면 중 사이즈 바는 1 cm이다. c): 테라토마를 절편화하고, 헤마톡실린?에오신으로 염색한 조직상. 좌측 위는 선(gland) 구조, 우측 위는 혈관 내피양 구조, 좌측 아래는 장관양 구조, 우측 아래는 골세포양 구조를 각각 나타낸다.
도 24는 수립한 유전자 도입 래트 ES 세포(pCAG-EGFP/WHGrES 세포)를 이용하여 제작한 키메라 래트에 있어서, 대부분의 조직에서 EGFP가 발현되어 있는 것을 보여주는 게놈 PCR의 사진이다. 상측 도면은 pCAG-EGFP/WHGrES 세포를 이용하여 제작한 키메라 래트의 결과를 보여주고, 하측 도면은 야생형 래트의 결과를 보여준다. 레인 1: 뇌, 레인 2: 흉선, 레인 3: 심장, 레인 4: 식도, 레인 5: 폐, 레인 6: 위, 레인 7: 췌장, 레인 8: 소장, 레인 9: 대장, 레인 10: 간장, 레인 11: 비장, 레인 12: 신장, 레인 13: 정소, 레인 14: 혈관, 레인 15: 근육. 각각의 조직으로부터 염색체 DNA를 추출하고, 게놈 PCR을 행하였다.
도 25는 GFP 키메라 래트의 각 조직(신장, 골격근 및 위)을 절편화하고, GFP 항체를 이용하여 면역 염색을 행한 사진이다.
본 발명은, 종래의 방법으로는 얻을 수 없었던 래트 ES 세포를 처음으로 제공하는 것이다.
본 발명의 래트 ES 세포는 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용한 배양 조건 하에서, 이하의 (A)?(D)의 공정:
(A) 래트 배반포를 배양함으로써 형성시킨 내부 세포괴를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하는 공정,
(B) 해리한 내부 세포괴를 배양함에 의해 출현한 초대 ES 세포를 계대 가능해질 때까지 배양하는 공정,
(C) 계대 가능해진 초대 ES 세포를, 세포 집괴를 유지한 상태로 해리하고, 계대?배양하는 공정,
(D) 계대?배양을 추가로 행함으로써 ES 세포를 수립하는 공정
을 포함하는 프로세스를 행함으로써, 수립, 제조할 수 있다.
본 발명의 래트 ES 세포의 수립 방법의 특징은 (1) 배반포, 내부 세포괴 및 ES 세포의 배양 전반에 있어서 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용하는 점과, (2) 내부 세포괴나 ES 세포의 해리(박리)를 행하는 단계에서, 세포를 단일화하지 않고, 어느 정도의 세포 집괴를 유지한 상태로 해리(박리)를 행하는 점이다.
이하, 본 발명의 래트 ES 세포의 수립 방법, 수립 래트 ES 세포의 성질 분석법, 및 래트 ES 세포의 계대 배양 방법 등에 관해서 설명한다.
1. 래트
본 발명의 래트 ES 세포의 유래가 되는 래트는, 상기 본 발명의 수립 방법의 특징에 기초하여 ES 세포를 수립할 수 있는 것이면 어떠한 계통의 래트이더라도 좋다. 예컨대 위스터 교토(주)(WKY), 브라운 노르웨이(주)(BN), 고토-가키자키(주)(GK), SD(주), F344/Du(주)(Fischer), 위스터(주), 위스터 하노버(주), ACI(주) 등의 계통의 래트로부터 선택된다.
2. 피더 세포
본 발명의 래트 ES 세포의 수립 및 수립 후의 배양에서는 피더 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 피더 세포로서는 당업자가 입수할 수 있는 어떠한 종 유래의 피더 세포이더라도 좋지만, 세포주로 확립된 피더 세포보다 정상 섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 마우스 태아의 정상 섬유아세포를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 임신 12일?16일째의 마우스 태아 섬유아세포의 초대 배양 세포(정상 섬유아세포)를 들 수 있고, 이 정상 섬유아세포로서는, 예컨대 마우스 ICR의 태아 12.5일째의 정상 섬유아세포가 예시된다. 이 피더 세포는 통상의 방법에 의해 조제할 수도 있으며, 시판품(마우스 섬유아세포, 아사히 테크노 글라스 주식회사 등)을 이용할 수도 있다. 이 피더 세포는 미토마이신 C 등으로 처리하여 불활성화하여 이용하는 것이 바람직하다.
3. 배양액
본 발명의 래트 ES 세포의 제조(수립?배양)에서는, 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용한다. 여기서 「실질적으로 혈청을 함유하지 않는」이란, 혈청의 영향에 의해 래트 ES 세포가 ES 세포로서의 성질을 나타내지 않게 될(예컨대 알칼리 포스파타제 활성이 음성이 될) 정도의 혈청을 함유하지 않는 것을 의미하고, 구체적으로는 혈청 농도가 10% 이하인 것, 바람직하게는 5% 이하인 것, 보다 바람직하게는 2% 이하인 것을 의미한다. 더 바람직하게는 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지를 이용한다. 이 경우, 혈청을 대체하는 시약을 첨가해야 하고, 구체적으로는 혈청 대체 시약(KSR: 깁코 BRL) 등이 이용된다. 이 혈청 대체 시약은 20% 정도의 농도로 이용하는 것이 바람직하다.
또한 래트 유래 백혈병 저해 인자(rLIF)에 관해서는, 배반포로부터 내부 세포괴를 형성?분리하기까지의 단계에서는 래트 LIF(rLIF)를 함유하지 않는 배양액을 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 내부 세포괴 형성 이후의 단계(수립한 래트 ES 세포의 배양, 계대도 포함한다)에서는, rLIF를 함유하는 배양액을 이용하는 것이 바람직하다. 농도로서는 배양액 1 ml당 rLIF를 100 단위 이상 첨가하는 것이 바람직하고, 1000 단위 정도, 또는 그 이상 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 이 rLIF는 시판품(케미콘사)을 이용할 수 있다.
배양액 중의 그 외의 성분에 관해서는 ES 세포의 배양에 통상 이용되는 성분을 당업자의 상식의 범위에서 조합 배양액 중에 적절하게 함유시킨다.
이하에, 배양액의 구체적 조성을 예시한다.
1) 래트 ES 세포 수립용 배양액
배반포로부터 내부 세포괴를 형성하기까지의 단계에서 사용하는 배양액을 「래트 ES 세포 수립용 배양액」이라고 칭한다.
(조성의 구체예)
둘베코 개변 이글 배지/F12(아사히 테크노 글라스, 동경, 일본) 380 ml 0.2 M L-글루타민 5 ml
혈청 대체 시약(KSR: 깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 100 ml
비필수 아미노산(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
항생 물질-항균 물질 용액(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
100 mM Na-피루베이트 5 ml
0.1 M β-머캅토에탄올 0.5 ml
2) 래트 ES 세포용 배양액
내부 세포괴 형성 이후의 배양(수립 래트 ES 세포의 배양도 포함한다)에서는 사용하는 배양액을 「래트 ES 세포용 배양액」이라고 칭한다.
(조성의 구체예)
둘베코 개변 이글 배지/F12(아사히 테크노 글라스, 동경, 일본) 375 ml 0.2 M L-글루타민 5 ml
혈청 대체 시약(KSR: 깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 100 ml
비필수 아미노산(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
100배 뉴클레오시드 보존액 5 ml
(아데노신 4 mg, 구아노신 4.25 mg, 시티딘 3.65 mg, 우리딘 3.65 mg, 티미딘 1.2 mg)
항생 물질-항균 물질 용액(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
100 mM Na-피루베이트 5 ml
*0.1 M β-머캅토에탄올 0.5 ml
1000U 래트 유래 백혈병 저해 인자(rLIF)
이 중 래트 유래 백혈병 저해 인자(rLIF)는 필요시에 첨가하여 혼합하는 것이 바람직하다.
4. 배양 조건
본 발명의 래트 ES 세포의 제조(수립?배양)에서의 세포의 배양 온도는 35℃?37.5℃의 범위 내이면 좋고, 바람직하게는 37℃이다. 배양은 통상의 배양에 이용되는 5% CO2 배양 장치 내에서 행해진다.
5. 래트 ES 세포의 수립 방법
이하 본 발명의 래트 ES 세포의 수립 방법에 관해서 구체예를 도시한다.
1) 난(배반포기 배)의 채취
난 채취용 래트로서는, 상기한 위스터 교토(주)(WKY), 브라운 노르웨이(주)(BN), 고토-가키자키(주)(GK), SD(주), F 344/Du(주)(Fischer), 위스터(주), 위스터 하노버(주), ACI(주) 등의 계통의 래트로부터 선택된다. 주령은 8주령?40주령 범위 내이면 사용 가능하지만, 바람직하게는 10주령?20주령의 래트가 이용되고, 보다 바람직하게는 10주령?12주령의 래트가 이용된다.
난의 채취는 당업자에게 알려진 통상의 방법에 의해 행하면 좋다. 구체적으로는 래트를 자연 교배시키고, 질전(vaginal plug) 확인 3일째쯤에 채란용 암컷 래트를 죽여 자궁을 적출한다. 이 자궁을 적당한 배지로 관류함으로써, 수정란(배)을 회수한다. 여기서 관류에 이용하는 배양액으로서는, 예컨대 mw 배지(NaCl 640.0 mg/100 ml, KCl 35.6 mg/100 ml, KH2PO4 16.2 mg/100 ml, MgSO4-7H2O 29.4 mg/100 ml, NaHCO3 190.0 mg/100 ml, 글루코스 100.0 mg/100 ml, Na-피루베이트 2.5 mg/100 ml, Ca-락테이트 46.0 mg/100 ml, 스트렙토마이신 5.0 mg/100 ml, 페니실린 7.5 mg/100 ml, 0.5% 페놀 레드 0.2 ml, 20 mM β-ME 10 ㎕, 100 mM EDTA-2Na 10 ㎕, BSA 300.0 mg/100 ml)이나 M2 배지(염화칼슘-2H20 0.251 g/L, 황산마그네슘, 0.143 g/L 염화칼륨 0.356 g/L, 인산칼륨 0.162 g/L, 염화나트륨 5.532 g/L, 알부민 4.0 g/L, D-글루코스 1.0 g/L, HEPES 4.969 g/L, 페놀 레드-Na 0.01 g/L, 피루브산-Na 0.036 g/L, 중탄산나트륨 0.35 g/L, 페니실린 G 0.06 g/L, 스트렙토마이신 설페이트 0.05 g/L, DL-락트산 4.349 g/L) 등을 들 수 있다.
회수된 배는 mw 배지, M2, M 16 등의 배양액 중에서 배양을 행한다.
배양에 의해 수정란(배)으로부터 상실배를 경유하여 배반포(배반포기 배)까지 발생을 진행시킨다. 이 단계까지 발생을 진행시키기 위해서는 통상, 37℃, 5% CO2 배양 장치 내에서 밤새 배양을 행한다. 배반포까지 발생이 진행한 것은 현미경으로 관찰함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는 배반포 후기 단계까지 발생을 진행시킨다.
2) 내부 세포괴의 형성?분리
상기 1)에서 얻어진 배반포를 현미경으로 확인한 후, 투명대를 제거한다. 투명대의 제거는 산성 타이로이드(pH2.5), 히알루로니다제, 푸로나제 등을 이용하여 행한다. 그 후, 미토마이신 C 처리를 실시한 피더 세포를 젤라틴 코트 배양 접시에 파종하고, 투명대를 제거한 래트 배반포를 5?10개씩 옮겨서, 래트 ES 세포 수립용 배양액에서 배양을 시작한다.
배양으로부터 1?4일째에 피더 세포 상에 투명대를 제거한 래트 배반포(후기 단계)가 접착한다. 접착후 5?10일째에 배반포로부터 출현한 내부 세포괴를 200 ㎕의 피펫 등을 이용하여 물리적으로 분리한다. 이 분리한 내부 세포괴를 래트 ES 세포 수립용 배양액을 함유하는 멸균 튜브 등에 옮기고, 5개?20개 정도의 세포로 이루어지는 세포 집괴가 될 때까지 해리한다. 그 때, 트립신?EDTA 등의 단백 분해 효소를 이용한 해리는 행하지 않고, 피펫 등을 이용하여 물리적으로 내부 세포괴를 해리한다. 또한 세포가 단일화될 때까지 해리를 행하는 것은 피하고, 상기한 바와 같이 5개?20개 정도의 세포로 이루어지는 세포 집괴를 유지하는 정도로 해리를 행한다. 여기서 세포 집괴를 유지한 상태인 것은 현미경 하에서 확인할 수 있다.
3) ES 세포의 수립
피더 세포를 파종한 젤라틴 코트 배양 접시에 있어서, 상기 2)에서 해리한 내부 세포괴를 래트 ES 세포용 배양액에서 배양한다. 통상 배양으로부터 2?4일째에 초대 ES 세포 콜로니가 출현한다. 초대 ES 세포 콜로니의 출현은 현미경 하에서 관찰함으로써 확인할 수 있다(출현한 ES 세포를 「초대 ES 세포」라고 칭한다). 그 후 5?10일 정도 배양을 속행함으로써, 초대 ES 세포 콜로니가 계대 가능한 상태가 된다. 여기서「계대 가능한 상태」란, 형성된 초대 ES 세포 콜로니를 구성하고 있는 세포수가 200?600개 전후에 도달하면서, 각 세포간이 긴밀하게 된 상태를 가리킨다. 이러한 형태가 된 것을 현미경 하에서 확인하면서, 200 ㎕의 피펫 등을 이용하여 해당 ES 세포 콜로니를 분리한다. 이 분리한 ES 세포 콜로니를 래트 ES 세포용 배양액을 함유하는 멸균 튜브 등에 옮기고, 5개?20개 정도의 세포로 이루어지는 세포 집괴가 될 때까지 해리한다. 이 단계에서도 세포가 단일화될 때까지 해리를 행하는 것은 피하고, 상기한 바와 같이 세포 집괴를 유지하는 정도로 해리를 행한다. 또한 이 단계에서도 트립신?EDTA 등의 단백 분해 효소를 이용한 세포 해리는 행하지 않고, 물리적으로 해리하는 것이 바람직하다. 해리한 ES 세포 콜로니는 피더 세포를 파종한 젤라틴 코트 배양 접시에서 래트 ES 세포용 배양액으로 초대 배양을 행한다(계대 1대째의 세포). 배양으로부터 2?4일 정도에 ES 세포 콜로니가 출현하고, 5?10일 정도에 계대 가능한 상태가 된다.
이후의 세포 계대는 세포가 단일화되지 않는 상태, 즉 5개?20개 정도의 세포로 이루어지는 세포 집괴를 유지한 상태를 유지하면 당업자의 상식 범위 내에서 계대를 행할 수 있지만, 트립신?EDTA 등의 단백 분해 효소에 의한 처리는 최저한으로 하고, 물리적 수단에 의해 세포 해리를 행하는 것이 바람직하다. 이하에 구체예를 나타낸다.
상기에서 계대 가능해진 ES 세포 콜로니로부터 배양액을 제거하고, 실온으로 복귀시킨 PBS(-)로 세정하여, 미리 37℃로 보온한 2.5% 트립신을 전면에 도포한다. 트립신의 양으로서는 60 mm 접시당 500 ㎕ 정도, 또는 그 이하인 것이 바람직하다. 트립신을 전면에 도포한 후에는 바로 용액을 제거한다. 현미경 하에서 전체의 7할 이상의 ES 세포 콜로니가 피더 세포로부터 박리되어 가는 상태를 확인하고, 바로 트립신 처리를 정지시킨다. 여기서 트립신 처리를 정지시키기 위해서는, 예컨대 10% 소 태아 혈청을 포함하는 배양액을 첨가하는 것이 용이하지만, 대량의 무혈청 배양액 등을 추가하여 트립신의 농도를 희석함으로써 정지시키더라도 좋다. 그 후, 5 ml 피펫 등을 이용하여 더 물리적으로 ES 세포 콜로니를 박리시키고, 세포 현탁 용액을 원심분리(실온에서 1000 rpm, 3분 정도)하여 세포와 배양액으로 분리하여 세포만을 회수한다. 래트 ES 세포용 배양액에 세포를 현탁하고, 완전히 단일화하는 것이 아니라, 현미경 하에서 5?20개의 세포괴를 형성하고 있는 상태를 확인하며, 피더 세포를 파종한 젤라틴 코트 배양 접시에 옮겨 배양을 행한다(계대 2대째의 세포).
그 후는 약 5?10일 마다 계대 가능한 상태가 되기 때문에, 상기 계대 1대째의 세포의 계대(계대 2대째의 세포에의 계대)와 같은 계대 방법에 의해 계대?배양을 속행할 수 있다.
세포 집괴의 수나 세포 집괴를 구성하는 세포수가 안정화된 단계가 되었을 때 ES 세포가 수립되었다고 판단한다. 구체적으로는 계대 3대째 이후, 바람직하게는 계대 5대째 이후의 세포를, 수립한 래트 ES 세포로 판단할 수 있다. 수립 래트 ES 세포를 상품으로서 공급하는 경우는 1 계통에서의 안정된 공급량을 유지하기 위해 계대 3대째 이후, 바람직하게는 계대 5대째 이후, 보다 바람직하게는 계대 10대째 이후의 세포를 상품화의 대상으로 한다.
6. 본 발명의 래트 ES 세포
본 발명의 래트 ES 세포는 이하의 (a)?(j)의 성질:
(a) Oct3/4 유전자 및 Nanog 유전자를 발현하는 성질,
(b) 알칼리 포스파타제 활성 양성인 성질,
(C) 배양체 형성능을 갖는 성질,
(d) SSEA(태아기 특이적 항원)-1 및 SSEA-4를 발현하는 성질,
(e) 정상 래트 세포와 동일한 염색체 수를 갖는 성질,
(f) 미분화 상태를 유지한 채 계대 배양이 가능한 성질,
(g) 시험관내에서 다분화능을 갖는 성질,
(h) 삼배엽 계열의 세포로 분화하는 능력을 갖는 성질,
(i) 기형종 형성능을 갖는 성질,
(j) 키메라 래트 제작능을 갖는 성질
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 상기 (a)?(j)에 나타낸 ES 세포로서의 성질을 모두 유지한 래트 ES 세포를 처음으로 제공하는 것이다. 수립한 래트 ES 세포로서의 성질을 유지하고 있는 것, 즉 미분화 상태(전능성)를 유지한 ES 세포로서의 성질을 유지하고 있는 것은 이하의 방법에 의해 해석할 수 있다.
1) 미분화 마커의 발현
ES 세포인 것을 특징짓는 결정적인 인자로서, Oct3/4[Okamoto, K. et al., Cell, 60: 461-472(1990), Scholer, H. R. et al., EMBO J. 9: 2185-2195(1990)] 및 Nanog[Mitsui, K., et al., Cell, 113: 631-642(2003), Chambers I., et al., Cell, 113: 643-655(2003)]가 알려져 있다. 이들의 유전자의 발현은 래트 Oct3/4 및 Nanog 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR을 행함으로써 확인할 수 있다. 여기서 이용되는 래트 Oct3/4 및 Nanog 특이적인 프라이머로서는, 실시예에 기재한 프라이머[Oct 3/4: 5'-ATGGACTACCCAGAACCCCAG-3'(서열 번호 3), 5'-TTACAGGAGCTGCAGTTATAC-3'(서열 번호 4), Nanog: 5'-TAGCCCTGATTCTTCTAGCA-3'(서열 번호 5), 5'-TTTGCTGCAACGGCACATAA-3'(서열 번호 6)]를 예시할 수 있다.
2) 알칼리 포스파타제 활성
미분화 ES 세포에서는 알칼리 포스파타제가 대량으로 발현된다. 이 알칼리 포스파타제의 발현은 시판되는 여러 가지의 알칼리 포스파타제 검출 키트를 이용함으로써 용이하게 측정할 수 있다. 이 검출 키트로서는, 예컨대 ALP 조직 염색 키트(Sigma사)나 벡터 레드 알칼리 포스파타제 기질 키트 I(후나코시) 등을 들 수 있다.
3) 배양체 형성능
ES 세포를 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 조건 하에서 비코트 배양 접시를 이용하여 배양하는 것에 의하면 배양체가 형성된다는 것이 알려져 있다[Roy. S. et al., Mol. Cell. Biol., 18: 3947-3955(1998)]. 배양체의 형성은 래트 ES 세포를 비코트 배양 접시에서 LIF를 제외한 래트 ES 세포용 배양액을 이용하여 7일간?14일간 정도 배양하고, 현미경 하에서 세포가 응집하여 형성되는 구형체의 출현을 관찰함으로써 확인할 수 있다.
4) 세포 표면 항원의 발현
ES 세포를 비롯하여 다능성 줄기 세포의 분화를 동정하는 지표 중 하나로서, 분화 단계 특이적으로 발현량이 변화하는 세포 표면 항원의 검출을 들 수 있다. 본 발명의 래트 ES 세포는 SSEA(태아기 특이적 항원)-1 및 SSEA-4를 발현하고 있다. 이 세포 표면 마커의 발현은 ES 세포 캐릭터라이제이션 키트(후나코시)를 이용한 면역 염색에 의해 평가할 수 있다.
5) 염색체 수
수립된 래트 ES 세포가 기원이 되는 래트의 염색체 수(2n=42)를 유지한 정상 ES 세포인 것은 G-밴드법[Sumner A. T. Cancer Genet Cytogenet. 6: 59-87(1982)]에 의해 염색체 수를 분석함으로써 확인할 수 있다.
6) 미분화 상태의 유지
수립된 ES 세포는 미분화 상태를 유지한 채 계대 배양을 행할 수 있다. 본 발명에서 수립한 래트 ES 세포는 적어도 35 계대째까지 계대 배양을 행할 수 있다고 하는 우수한 특징을 갖는다. 미분화 상태의 유지는, 본 발명의 래트 ES 세포의 계대 배양 방법(후술의 7.)에 의해 계대 배양을 행하고, 상기 알칼리 포스파타제 활성 등을 측정함으로써 확인할 수 있다.
7) 다분화능
ES 세포를 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 조건 하에서 배양하는 것에 의하면, 배양체를 경유하여 여러 가지의 세포로 자발적으로 분화한다. 이 ES 세포의 성질은 우선 상기 3)에 기재한 방법에 의해 배양체를 형성시키고, 그 후 젤라틴 코트 배양 접시에 배양체를 옮겨서, 7일간?14일간 정도 배양을 행함으로써 관찰할 수 있다. 각 세포의 특징적인 형태로부터 신경양 세포, 지방양 세포, 또는 상피계 세포 등의 출현을 확인할 수 있다.
8) 삼배엽 계열의 세포로의 분화능
*ES 세포는 삼배엽(내배엽, 중배엽, 외배엽) 계열의 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 이 ES 세포의 성질은, 상기 3)에 기재한 방법으로 형성시킨 배양체(심근양 세포가 출현한 배양체)로부터 RNA를 추출하고, 외배엽 계열의 세포(예컨대 신경 세포), 중배엽 계열의 세포(예컨대 심근 세포), 내배엽 계열의 세포(예컨대 간세포)의 각 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석함으로써 확인할 수 있다.
여기서 신경 세포 마커로서는 네스틴(Nestin), TUJ1(베타3-튜불린), MSI-1(무사시-1), GFAP(신경교 섬유성 산성 단백질 알파) 등을 들 수 있다. 또한 심근 세포 마커로서는 CCC(심장 디히드로피리딘 감수성 칼슘 채널 단백질), ANF(심방 나트륨 배설 인자), KvLQT1 등을 들 수 있다. 또한 줄기 세포 마커로서는 ALB(알부민), TDO(트립토판 2,3-디옥시게나제), TAT(티로신 아미노트랜스퍼라제), G6P(글루코스-6-포스파타제) 등을 들 수 있다.
9) 기형종(테라토마) 형성능
ES 세포를 동종 또는 선천적으로 면역부전인 이종 동물에게 이식함으로써, 기형종(테라토마)을 형성시킬 수 있다. 여기서 테라토마란, 내배엽, 중배엽, 외배엽의 삼배엽으로부터 발생하는 여러 가지 조직이 무작위적으로 한 종양 중에 존재하는 혼합 종양의 호칭이다. 이 테라토마의 형성은 동종 또는 선천적으로 면역부전인 이종 동물의 피하 등에 래트 ES 세포를 이식하고, 수개월 후에 혹형 물체의 존재를 육안으로 관찰함으로써 확인할 수 있다. 형성된 테라토마가 삼배엽 구조를 갖고 있는 것은, 적출한 테라토마를 절편화하고, 헤마톡실린?에오신으로 염색하여, 현미경 하에서 조직이나 세포의 형태를 관찰함으로써 확인할 수 있다.
10) 키메라 래트 제작능
ES 세포를 동종 또는 이종 래트에 도입함으로써 키메라 래트를 생산할 수 있다. 키메라 래트의 제작은, 예컨대 이하의 방법에 의해 행할 수 있다.
키메라 래트가 제작된 것을 용이하게 확인하기 위해, 미리 마커 유전자(예컨대 GFP, β-gal, 루시퍼라제 등)를 본 발명의 래트 ES 세포에 도입해 두면 좋다. 구체적으로는 이러한 마커 유전자를 포함하는 벡터를 전기천공법 등에 의해 래트 ES 세포의 염색체 상에 도입하고, 배양액 중에 약제를 첨가하여 선별함으로써, ES 세포 염색체에 상기 벡터가 도입된 재조합 래트 ES 세포를 수립한다. 이 재조합 ES 세포를, 예컨대 현미 조작으로 래트 배반포의 배반포 내나 상실배기 또는 16 세포기에 이식하여 내부 세포괴와 함께 또한 내부 세포괴의 일부로서 발생시키거나[마이크로인젝션법: Gordon J. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-7384(1980)], 또는 2개의 8 세포기 배의 투명대를 제거하여 상기 재조합 ES 세포와 공배양하여 응집괴를 만들게 한다. 이 응집괴를 배양하면 1개의 배반포가 된다[세포 응집법: Dvorak P. et al., Int. J. Dev. Bio1., 39: 645-652(1995)]. 이상과 같이하여 얻어진 배(이식용 난)를 정관 결찰 처치를 실시한 수컷 래트와 자연 교배를 행하여 준비한 위임신시킨 암컷 래트의 자궁 내에 이식하여 발생시킴으로써 키메라 래트를 산출시킬 수 있다.
얻어진 키메라 래트가 ES 세포에 유래하는 세포?조직을 갖고 있는 것, 즉 수립한 래트 ES 세포가 키메라 래트 제작능을 갖고 있는 것은 당업자에게 알려진 일반적인 방법에 의해 확인할 수 있다. 예컨대 키메라 래트의 여러 가지의 조직으로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로서 이용하고, 마커 유전자(ES 세포에 도입한 마커 유전자) 특이적 프라이머를 이용한 게놈 PCR을 행함으로써 확인할 수 있다. 또한 ES 세포가 각 조직 계열의 세포로 분화하고 있는 것은, 예컨대 키메라 래트의 각 조직을 절편화하고, 마커 유전자 발현 산물(마커 단백)의 존재를, 이용한 마커 단백의 성질에 기초하여 검출함으로써 확인할 수 있다.
11) 혈청 존재 하에서의 배양에 의한 분화
또한 본 발명의 래트 ES 세포는 20% 혈청 존재 하에서의 배양에 의해 분화된다고 하는 성질을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 래트 ES 세포는 10% 혈청 존재 하에서의 배양에 의해 분화하는 것이며, 또한 바람직하게는 5% 혈청 존재 하에서의 배양에 의해 분화하는 것이다. 래트 ES 세포의 분화는 알칼리 포스파타제 활성의 소실이나, Oct 3/4나 Nanog 등의 ES 세포 마커 유전자의 발현 소실에 의해 확인할 수 있다.
7. 래트 ES 세포의 계대 배양 방법
본 발명의 래트 ES 세포는 미분화 상태를 유지한 상태에서 계대 배양을 행할 수 있다. 본 발명의 래트 ES 세포의 계대는, 세포가 단일화되지 않는 상태, 즉 5개?20개 정도의 세포로 이루어지는 세포 집괴를 유지한 상태를 유지하면 당업자의 상식의 범위 내에서 계대를 행할 수 있지만, 트립신?EDTA 등의 단백 분해 효소에 의한 처리는 최저한으로 하고, 물리적 수단에 의해 세포 해리를 행하는 것이 바람직하다. 이하에 구체예를 나타낸다.
수립된 래트 ES 세포가 계대 가능한 상태가 된 단계에서 배양액을 제거하고, 실온으로 복귀시킨 PBS(-)로 세정하며, 미리 37℃로 보온한 2.5% 트립신을 전면에 도포한다. 트립신의 양으로서는 60 mm 접시당 500 ㎕ 정도, 또는 그 이하인 것이 바람직하다. 트립신을 전면에 도포한 후에는 바로 용액을 제거한다. 현미경 하에서 전체의 7할 이상의 ES 세포 콜로니가 피더 세포로부터 박리되어 가는 상태를 확인하고, 바로 트립신 처리를 정지시킨다. 여기서 트립신 처리를 정지시키기 위해서는, 예컨대 10% 소 태아 혈청을 포함하는 배양액을 첨가하는 것이 용이하지만, 대량의 무혈청 배지 등을 첨가하여 트립신 농도를 희석함으로써 정지시키더라도 좋다. 그 후, 5 ml 피펫 등을 이용하여 물리적으로 ES 세포 콜로니를 더 박리시키고, 세포 현탁 용액을 원심분리(실온에서 1000 rpm, 3분 정도)하여 세포와 배양액으로 분리하여 세포만을 회수한다. 배양액에 세포를 현탁하고, 완전히 단일화하는 것이 아니라, 현미경 하에서 5?20개의 세포괴를 형성하고 있는 상태를 확인하며, 피더 세포를 파종한 젤라틴 코트 배양 접시에 옮겨 배양을 한다. 그 후도 마찬가지로, 약 5?10일 마다 계대 가능한 상태가 되기 때문에 동일한 방식으로 계대 배양을 행한다.
계대 세포의 배양에는 실질적으로 혈청을 함유하지 않는 배양액을 이용한다. 여기서 「실질적으로 혈청을 함유하지 않는」이란, 혈청의 영향에 의해 래트 ES 세포가 ES 세포로서의 성질을 나타내지 않게 될(예컨대 알칼리 포스파타제 활성이 음성이 될) 정도의 혈청을 함유하지 않는 것을 의미하고, 구체적으로는 혈청 농도가 10% 이하인 것, 바람직하게는 5% 이하인 것, 보다 바람직하게는 2% 이하인 것을 의미한다. 또한 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 이 경우, 혈청을 대체하는 시약을 첨가해야 하고, 구체적으로는 혈청 대체 시약(KSR: 깁코 BRL) 등을 함유하는 배양액을 이용한다. 이 혈청 대체 시약은 20% 정도의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 계대 세포의 배양에 이용하는 배양액은 rLIF를 함유하고 있는 것이 바람직하다. rLIF의 농도로서는 배양액 1 m1당 rLIF를 100 단위 이상 첨가하는 것이 바람직하고, 1000 단위 정도, 또는 그 이상 첨가하는 것이 보다 바람직하다.
이상과 같이, 본 발명의 래트 ES 세포의 계대 배양용 배양액은 혈청 대체 시약 및 rLIF를 함유하는 것이 바람직하고, 상기 3. -2)에 기재한 래트 ES 세포용 배양액이 유효하게 이용된다.
8. 래트 ES 세포 배양 키트
본 발명은, 본 발명의 래트 ES 세포를 배양하기 위한 배양 키트를 제공한다. 구체적으로는 혈청 대체 시약(KSR) 및 rLIF를 성분으로서 함유하는 래트 ES 세포 배양 키트를 제공한다. 혈청 대체 시약 및 rLIF는 혼합하여 하나의 용기 중에 봉입되어 있더라도 좋지만, 각각 별도의 용기에 봉입되어 있는 것이 바람직하다. 여기서 KSR로서는 깁코 BRL 제품을 이용할 수 있고, 또한 rLIF로서는 케미콘 제품을 이용할 수 있다.
상기 키트는, 본 발명의 래트 ES 세포를 성분으로서 더 함유할 수 있다. 본 발명의 래트 ES 세포를 상품으로서 공급하는 경우는 계대 3대째 이후, 바람직하게는 계대 5대째 이후, 보다 바람직하게는 계대 10대째 이후의 세포를 상품화의 대상으로 한다. 이 래트 ES 세포는 그것 단독으로 상품화되더라도 좋지만, 상기한 바와 같이 본 발명의 배양 키트의 1 성분으로서 상품화되더라도 좋다.
상기 키트는 피더 세포를 성분으로서 더 함유할 수 있다. 피더 세포로서는 당업자가 입수할 수 있는 어떠한 종 유래의 피더 세포이더라도 좋지만, 세포주로 확립된 피더 세포보다 정상 섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 임신 12일?16일째의 마우스 태아의 섬유아세포의 초대 배양 세포(정상 섬유아세포)를 들 수 있고, 이 정상 섬유아세포로서는, 예컨대 마우스 ICR의 태아 12.5일째의 정상 섬유아세포가 예시된다. 이 피더 세포는 통상의 방법에 의해 조제할 수도 있으며, 마우스 태아 섬유아세포(아사히 테크노 글라스 주식회사) 등을 이용할 수도 있다.
이상에 진술한 ES 세포의 제조 방법(수립 방법, 계대 배양 방법), 및 ES 세포의 배양액이나 배양 키트는 래트 ES 세포뿐만 아니라, 다른 동물 종에도 적용 가능하다(다만 마우스는 제외한다).
마우스 ES 세포는 콜로니가 돔형으로 솟아 오르고, 전체적으로 인접하는 세포끼리의 경계가 불명료하다. 또한 광택을 갖고 있다. 한편, 영장류 ES 세포의 콜로니는 편평형으로 확대되고, 마우스 ES 세포와 같은 광택은 관찰되지 않는다. 또한 세포끼리의 경계가 마우스 ES 세포와 비교하여 명료하다. 본 발명에서 수립된 래트 ES 세포는 편평형의 콜로니를 형성하고, 마우스 ES 세포와 같은 강한 광택이 관찰되지 않으며, 마우스보다 영장류 ES 세포에 가까운 형태를 나타내는 것이 명백하였다. 따라서, 본 발명의 ES 세포의 제조 방법(수립 방법, 계대 배양 방법) 및 ES 세포의 배양액이나 배양 키트는 영장류의 ES 세포에도 적용 가능하다.
9. 래트 ES 세포를 분화 유도하여 얻어진 세포
본 발명은, 본 발명의 래트 ES 세포의 분화 유도 방법, 및 분화 유도하여 얻어진 세포를 제공한다.
마우스나 인간 ES 세포에서 알려져 있는 바와 같이, ES 세포를 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 조건 하에서 배양함으로써 여러 가지의 세포로 분화 유도시킬 수 있다[Roy. S. et al., Mol. Cell. Biol., 18: 3947-3955(1998)]. 또한 레티노산, 세포 증식 인자, 글루코코티코이드 등의 작용에 의해 여러 가지의 세포로 분화 유도시킬 수 있다[Kawamorita M. et al., Hum. Cell., 15: 178-182(2002)]. 또한 세포외 기질에 의해 분화 유도시킬 수도 있다. 따라서 본 발명의 래트 ES 세포를 상기와 같은 조건 하에서 배양함으로써, 마찬가지로 분화 유도할 수 있다. 여기서 ES 세포로부터 분화 유도하여 얻어지는 세포로서는, 예컨대 신경 세포, 혈구계 세포, 간세포, 혈관 내피 세포, 또는 심근 세포 등을 들 수 있다.
이들 ES 세포로부터 분화 유도하여 얻어진 세포는, 예컨대 이식 치료의 실험 모델에서의 이식용 세포로서 유용하다. 또한 이 분화 세포는 핵산, 단백질 또는 발암 물질, 환경 변이원 물질 등에 세포를 노출시켰을 때의 영향을 조사하기 위해서도 유효하게 이용된다. 구체적으로는 상기 물질의 첨가에 의한 세포의 유전적 또는 후생적(epigenetic) 변화, 세포의 트랜스포메이션, 연한천 배지 중에서의 콜로니 형성능, 침윤능을 포함하는 암화(canceration)의 지표의 변화, 대사 기능의 변화, 생리 기능의 변화, 생화학적 변화 등의 생물학적 지표에 기초하여 세포에의 영향을 조사할 수 있다.
10. 래트 ES 세포 유래의 물질
본 발명에서 래트 ES 세포를 수립한 것에 의해 래트 ES 세포뿐만 아니라, 그에서 유래되는 여러 가지의 물질(예컨대 수립 래트 ES 세포 유래의 mRNA보다 조제된 cDNA 라이브러리나 게놈 라이브러리, 또는 래트 ES 세포 유래의 세포 추출물 등)을 제공하는 것이 가능하게 되었다. 본 발명의 ES 세포 유래의 여러 가지의 물질은 재생 의료에서의 연구나 발생학에서의 분자 레벨에서의 발현 해석의 연구, 동물 개체로 대신하는 창약 연구나 안전성 평가 시험 등에서 유효하게 이용할 수 있다.
여기서 cDNA 라이브러리는, 본 발명의 래트 ES 세포로부터 추출한 RNA를 주형으로서 이용하고, 시판의 cDNA 라이브러리 제작 키트[예컨대 CloneMiner cDNA 라이브러리 제작 키트(Invitrogen)나 Creator SMART cDNA 라이브러리 제작 키트(BD Biosciences) 등] 등을 이용하여 제작할 수 있다. 또한 게놈 라이브러리는 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual., T. Maniatis 등편, 제2판(1989), Cold Spring Harbor Laboratory] 등의 기본서를 참고로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한 ES 세포 유래의 세포 추출물은 통상의 방법에 의해 세포를 파쇄하고, 프로테아제 저해제의 존재 하에 원심분리하는 것 등에 의해 조제할 수 있다.
11. 조직 또는 세포의 분화 유도제의 스크리닝 방법
본 발명은, 이하의 (i)?(iii):
(i) 피검 물질을 본 발명의 래트 ES 세포에 접촉시키는 공정,
(ii) 래트 ES 세포의 분화의 유무나 정도를 평가하는 공정,
(iii) 상기 (ii)의 평가 결과에 기초하여, 피검 물질이 분화 유도에 관련하는 물질인지의 여부를 판단하는 공정
을 포함하는 조직 또는 세포의 분화 유도제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 공정 (i)에서 스크리닝에 제공되는 피검 물질은 제한되지 않지만, 핵산, 펩티드, 단백질, 유기 화합물, 무기 화합물 등이며, 상기 스크리닝은 구체적으로는 이들 피검 물질 또는 이들을 포함하는 시료(피검 시료)를 래트 ES 세포에 접촉시킴으로써 행해진다. 이러한 피검 시료로서는 세포 추출액, 유전자(게놈, cDNA) 라이브러리, RNAi 라이브러리, 안티센스 핵산, 합성 저분자 화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등을 들 수 있다. 이들 피검 시료 또는 피검 물질은 래트 ES 세포로 취득 가능한 형태로 접촉시킨다. 예컨대 피검 시료가 핵산인 경우는 마이크로인젝션, 인산칼슘, DEAE-덱스트란이나 유전자 도입용 지질을 이용하여 ES 세포에 도입한다.
래트 ES 세포와 피검 물질을 접촉시키는 조건은, 이 세포가 사멸하지 않으면서 피검 물질이 취입되는 데 적합한 배양 조건(온도, pH, 배양액의 조성 등)이면 특별히 제한은 없다. 바람직하게는 분화 유도에 알맞은 조건, 즉 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 조건 하에서 배양된 래트 ES 세포에 대하여 상기 피검 물질을 첨가한다.
후속 공정 (ii)에서는 래트 ES 세포에 대하여 분화의 유무나 정도를 평가하고, (iii)에서는 이 평가 결과에 기초하여 피검 물질이 분화 유도에 관련되는 물질인지의 여부를 판단한다. 래트 ES 세포로부터 원하는 조직 또는 세포로의 분화는, 예컨대 원하는 조직 또는 세포에서 발현되는 마커를 지표로 하여 평가할 수 있다. 원하는 조직 또는 세포의 마커로서는 조직 또는 세포 특이적 항원을 들 수 있다. 이 마커로서 구체적으로는, 예컨대 신경계 세포의 마커로서 뉴런 특이적 에놀라제, 신경교 섬유성 산성 단백질, 네스틴 등을 들 수 있고, 연골의 마커로서 S-100 단백질, 타르타르산 저항성산 포스파타제 등을 들 수 있다. 또한 근육의 마커로서 데스민, 근 특이적 액틴 등을 들 수 있다. 이러한 조직?세포 특이적 마커는 이 마커에 대한 항체를 이용하고, ELISA나 면역 염색 등에 의해 검출할 수 있다. 또한 이들의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR 등의 방법에 의해 검출할 수도 있다.
12. 조직 또는 세포의 분화 유도에 작용하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 이하의 (I)?(III)의 공정:
(I) 피검 물질을 본 발명의 래트 ES 세포에 접촉시키는 공정,
(II) ES 세포의 분화 유도 조건 하에서 상기 (I)의 래트 ES 세포를 배양하고, 분화의 유무나 정도를 평가하는 공정,
(III) 상기 (II)의 평가 결과에 기초하여, 피검 물질이 분화 유도에 작용하는 물질인지의 여부를 판단하는 공정을 포함하는, 조직 또는 세포의 분화 유도에 작용하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
ES 세포는 상기와 같이 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 조건 하에서 배양함으로써 여러 가지의 세포로 분화 유도시킬 수 있다[Roy. S. et al., Mol. Cell. Biol., 18: 3947-3955(1998)]. 또한 레티노산, 증식 인자, 글루코코티코이드 등의 작용에 의해 여러 가지의 세포로 분화 유도시킬 수도 있다[Kawamorita M. et al., Hum. Cell., 15: 178-182(2002)]. 또한 세포외 기질에 의해 분화 유도시킬 수도 있다. 이 배양계에 피검 화합물(예컨대 항암제 등의 의약품이나 환경 변이 물질 등)을 추가하여 배양함으로써, 피검 물질이 정상적인 분화에 어떠한 영향을 미치는지를 평가할 수 있다. 이 스크리닝은 예컨대 개발중인 의약품의 부작용 연구 등에 응용할 수 있다.
*공정 (I)에서 스크리닝에 제공되는 피검 물질로서는, 상기 11.과 같은 물질을 들 수 있다. 피검 물질과 래트 ES 세포와의 접촉에 관해서는 피검 물질을 본 발명의 래트 ES 세포에 접촉시킨 후에 ES 세포의 분화 유도 조건 하에서 배양하더라도 좋고, 또한 래트 ES 세포를 분화 유도 조건 하에서 배양 시작하며, 그 후 피검 물질을 접촉시키더라도 좋다.
분화 유도 조건 하에서의 배양이란, 상기한 바와 같은 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 배양 조건 하의 배양 조건이나, 레티노산, 증식 인자, 글루코코티코이드 또는 세포외 기질 등을 배양액 중에 첨가한 배양 조건 등을 들 수 있다. 분화 유도 조건 하에서의 배양 과정 또는 배양 후에, 피검 물질이 래트 ES 세포의 분화에 미치는 영향을 평가한다. 해당 평가는 피검 물질을 작용시키지 않는 대상 세포에서의 분화의 정도와의 비교에 기초하여 행해지는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예컨대 간세포 분화 유도 인자(일본 특허 출원 2004-59705)를 배양액에 첨가함으로써 기능을 갖은 성숙 간세포로 분화 유도를 행하고, 간세포 특이적 발현 유전자(알부민이나 트립토판 2,3-디옥시케나아제 등) 등을 지표로서 평가할 수 있다.
13. 유전자 개변 래트
본 발명의 래트 ES 세포는 유전자 개변 래트의 제작에서 사용할 수 있다.
래트는 마우스에 비해 약 10배라는 실험상 적당한 크기의 포유 동물이며, ① 세포 혈관에 용이하게 약물 투여가 가능하고, ② 외과?이식 실험이 가능하며, ③ 조직을 대량으로 채취 가능하다 라고 하는 이점을 갖는다. 종래부터 많은 인간 질환 모델 래트가 개발?발견되어 왔지만, 래트 ES 세포가 수립되어 있지 않았기 때문에 유전자 개변 래트, 특히 넉아웃 래트나 넉인 래트 등의 유전자 타겟팅을 요하는 유전자 개변 래트의 제작은 사실상 불가능하였다. 본 발명의 래트 ES 세포는, 그와 같은 유전자 개변 래트의 제작을 처음으로 가능하게 하는 것이다. 본 발명의 래트 ES 세포의 제공에 의해, 당업자에게 주지된 기술에 의해 이 유전자 개변 래트를 제작할 수 있다.
여기서 「유전자 개변 래트」란, 키메라 래트, 넉아웃 래트, 넉인 래트, 유전자 이식 래트 및 넉다운 래트 등의 당업자에 알려진 모든 유전자 개변 래트를 의미한다.
상기 유전자 개변 래트는, 이하의 (X)?(Z)의 공정:
(X) 본 발명의 래트 ES 세포에 원하는 유전자를 도입하는 공정,
(Y) 유전자 도입된 래트 ES 세포를 함유하는 이식용 난을 조제하는 공정,
(Z) 이식용 난을 위임신시킨 암컷 래트에 도입하고, 새끼 래트를 산출하는 공정을 포함하는 프로세스를 행함으로써 제조할 수 있다.
넉아웃 래트란 인위적으로 표적으로 하는 유전자를 파괴한 변이 래트를 의미하고, 유전자 타켓팅 래트라고도 부를 수 있다. 넉아웃 래트의 제작은, 예컨대 문헌[Donehower A. L. et al. Nature, 356: 215-221(1992)] 등에 기재의 넉아웃 마우스의 제작법에 준하여 행할 수 있다. 간단히 진술하면, 우선 표적으로 하는 유전자의 게놈 DNA 서열을 바탕으로, 상동 재조합을 위한 벡터(타겟팅 벡터)를 구축한다. 이 때 재조합 클론의 선별을 위해 마커 유전자로서 G418 내성 유전자나 하이그로마이신 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자를 내장한다. 이 구축한 타겟팅 벡터를 전기천공법 등에 의해 래트 ES 세포에 도입한다. 얻어진 도입 세포 중에서 상동 재조합을 일으킨 콜로니를 선별한다. 이와 같이 하여 얻어진 상동 재조합 래트 ES 세포를, 예컨대 현미 조작으로 래트 배반포의 배반강 내나 상실배기 또는 16 세포기에 이식하여 내부 세포괴와 함께 또한 내부 세포괴의 일부로서 발생시키거나[마이크로인젝션법: Gordon J. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-7384(1980)], 또는 2개의 8 세포기 배의 투명대를 제거하여 상기 상동 재조합 ES 세포와 공배양하여 응집괴를 만들게 한다. 이 응집괴를 배양하면 1개의 배반포가 된다[세포 응집법: Dvorak P. et al., Int. J. Dev. Biol., 39: 645-652(1995)]. 이상과 같이 하여 얻어진 배(이식용 난)를 정관 결찰 처리를 실시한 수컷 래트와 자연 교배를 행하여 준비한 위임신시킨 암컷 래트의 자궁 내에 이식하여 발생시킴으로써 키메라 래트를 산출시킨다. 이 키메라 래트를 야생형 래트와 교배시킴으로써, 헤테로 넉아웃 래트를 산출시킬 수 있고, 이 헤테로 넉아웃 래트끼리를 교배시킴으로써 호모 넉아웃 래트를 산출시킬 수 있다.
상기 넉아웃 래트의 범주에는 컨디셔널?넉아웃 래트도 포함된다. 여기서 켠디셔널?넉아웃이란, Cre/loxP 시스템 또는 FLP/FRT 시스템을 이용하여 부위 특이적?시기 특이적으로 유전자를 넉아웃하는 시스템이다. 구체적으로는 타겟팅하고 싶은 유전자를 loxP 서열 또는 FRT 서열 사이에 측접한 유전자로 치환하고, Cre 또는 FLP 단백의 공급에 의해 상기 loxP 서열 또는 FRT 서열 사이에 측접한 유전자를 절취하는 시스템이다[Sternberg N., et al., J. Mol. Biol., 150: 487-507(1981)].
넉인 래트란, 표적으로 하는 유전자의 위치에 인위적으로 제작한 상동성을 갖는 외래성 유전자를 도입한 변이 래트를 의미한다. 표적 유전자는 파괴되는 경우도 있으며, 파괴되지 않는 경우도 있다. 예컨대 유전자의 발현을 모니터하기 위해 lacZ 유전자나 GFP 유전자 등의 마커 유전자를 도입하거나, 유전자에 변이를 도입하여 교체하는 것도 가능하다.
이 넉인 래트는 예컨대 문헌[Pewzner-Jung Y. et al., J. Immunol., 161: 4634-4645(1998)] 등에 기재한 넉인 마우스의 제작법에 준하여 제작할 수 있다. 기본적으로는 상기 넉아웃 래트의 제작과 완전히 동일한 원리를 이용하여 제작할 수 있다.
유전자 이식 래트는, 인위적으로 외래 유전자를 도입한 래트를 의미한다. 유전자 이식 동물의 제작은 종래로부터 현미 조작에 의해 수정란의 웅성 전핵에 원하는 유전자를 주입하는 방법이 일반화되어 있다. 그 때문에 상기 넉아웃 래트나 넉인 래트 정도로 본 발명의 래트 ES 세포의 필요성은 높지 않다. 그러나 도입 효율이나 개체의 제작 효율을 상승시키기 위해서는 본 발명의 래트 ES 세포가 유효하게 이용된다.
이 유전자 이식 래트는, 예컨대 문헌[Yamamoto H. et al., Cancer Res., 62: 1641-1647(2002)] 등에 기재한 유전자 이식 마우스의 제작법에 준하여 제작할 수 있다. 즉, ES 세포를 유리 피펫을 끌어 당겨 고정하고, 타단으로부터 선단 2 μm 이하의 예리하고 가는 유리 피펫을 사용하여 핵 속에 직접 외래성 표적 유전자 용액을 주입한다. 용액을 주입한 ES 세포를 배양계로 이행하고, 유전자가 삽입된 주를 수립하며, 마우스의 수정란(상실배 또는 배반포배)을 유리 피펫으로 끌어 당겨 고정하고, 수립한 ES 세포를 유리 피펫을 사용하여 수정란에 주입하여 시험관 내에서 배양하고, 어느 정도 발생시킨 후에 위임신 암컷 마우스의 난관 또는 자궁에 복귀하여 새끼 마우스를 얻는 기법이다.
상기 유전자 이식 래트의 범주에는 컨디셔널?유전자 이식 래트도 포함된다. 여기서 컨디셔널?유전자 이식이란, Cre/loxP 또는 FLP/FRT를 이용하여 부위 특이적?시기 특이적으로 유전자를 발현시키는 시스템이다. 구체적으로는 약제 내성 유전자 등을 loxP 서열 또는 FRT 서열 사이에 측접시키고, Cre 또는 FLP 단백의 공급에 의해 상기 loxP 서열 또는 FRT 서열 사이에 측접한 유전자를 절취함으로써, 목적 유전자를 발현시키는 시스템이다[Sternberg N., et al., J. Mol. Biol., 150: 487-507(1981)].
넉다운 래트란, RNAi의 중간 물질인 짧은 2본쇄 RNA(siRNA)나 안티센스 핵산을 인위적으로 도입?발현시키고, 이 siRNA나 안티센스 핵산의 작용에 의해 표적 유전자의 발현을 억제시킨 래트를 의미한다. 이러한 넉다운 동물은 벡터계에 의한 siRNA의 발현 시스템이 확립한 것에 기초하여 제작 가능해졌다[Science 296: 550-553(2002), Nature Biotech. 20: 500-505(2002) 등].
이 넉다운 래트는, 예컨대 문헌[Tiscornia G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 1844-1848(2003)] 등에 기재한 방법에 준하여 제작할 수 있다. 기본적으로는 상기 유전자 이식 래트의 제작과 완전히 동일한 원리를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명은, 이상과 같은 조작에 의해 제조된 유전자 개변 래트도 제공한다. 여기서 「유전자 개변 래트」란, 상기한 바와 같이 키메라 래트, 넉아웃 래트, 넉인 래트, 유전자 이식 래트 또는 넉다운 래트 등의 당업자에게 알려진 모든 유전자 개변 래트를 의미한다.
<실시예>
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다.
<실시예 1>
래트 ES 세포의 수립
1) 난의 채취
위스터 교토(주)의 WKY/N의 암컷(일본 찰스?리버, 10 주령 이상)을 자연 교배하고, 질전 확인 3일째에 채란용 암컷 래트를 죽여 자궁을 적출하였다. mw 배지(NaCl 640.0 mg/100 ml, KCl 35.6 mg/100 ml, KH2PO4 16.2 mg/100 ml, MgSO4-7H2O 29.4 mg/100 ml, NaHCO3 190.0 mg/100 ml, 글루코스 100.0 mg/100 ml, Na-피루베이트 2.5 mg/100 ml, Ca-락테이트 46.0 mg/100 ml, 스트렙토마이신 5.0 mg/100 ml, 페니실린 7.5 mg/100 ml, 0.5% 페놀 레드 0.2 ml, 20 mM β-ME 10 ㎕, 100 mM EDTA-2Na 10 ㎕, BSA 300.0 mg/100 ml)로 관류하여 배를 회수하고, 5% CO2 배양 장치에서 배반포(후기 단계)까지 발생을 진행시킨다(도 1). 또한 래트 ES 세포의 수립에서, 배반포 후기 단계의 난이 가장 수립(내부 세포괴 형성) 효율이 높기 때문에, 상기한 바와 같이 배반포 후기 단계의 난을 사용하기로 하였다.
2) 피더 세포의 조제
래트 ES 세포의 수립 및 배양 때에 사용하는 피더 세포로서, 마우스 ICR의 태아 12.5일째의 정상 섬유아세포를 미토마이신 C로 처리한 것을 사용하였다(도 2). 사용시에는, 동결 보존한 피더 세포를 사용 전날에 해동하고, STO 배지(DMEM 450 ml, FBS 50 ml, 항생 물질-항균 물질 용액 5 ml)와 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)를 이용하여 배양하였다.
3) 래트 ES 세포 수립용 배양액 및 래트 ES 세포용 배양액의 검토
(1) LIF 첨가의 검토
상기 1)에서 조제된 래트 배반포로부터 내부 세포괴를 형성시키고, 이 내부 세포괴로부터 ES 세포 콜로니를 형성시키며, 최종적으로 안정화된 래트 ES 세포를 수립한다. 이들 일련의 단계에서 이용하는 배양액의 검토를 행하였다.
우선 래트 배반포로부터 내부 세포괴를 형성시키는 단계에서의, 래트 유래 백혈병 저해 인자(rLIF)의 배양액 중으로의 첨가의 필요성에 관해서 검토를 행하였다. 래트 배반포로부터 내부 세포괴를 형성시키는 단계에서, 여러 가지의 농도(0?5000 단위)의 rLIF(케미콘사)를 첨가하여 배양하고, 그 후 형성된 내부 세포괴의 수 및 초대 ES 세포의 수를 관찰하였다. 그 결과, rLIF를 제외하는 편이 효율적으로 내부 세포괴가 형성되며, rLIF의 첨가 농도에 의존하여 변화되는 것으로 나타났다. 이 결과로부터 내부 세포괴 형성까지의 단계에서는 LIF 무첨가의 배양액을 이용하기로 하였다.
다음에 내부 세포괴 형성 후 내지 래트 ES 세포 수립까지의 단계에서의 rLIF의 첨가의 유무에 관해서 검토를 행하였다. 내부 세포괴 형성?분리 후에 rLIF를 첨가(1000 단위)한 배양액으로 배양을 행한 결과, 내부 세포괴로부터 약 50% 이상의 비율로 ES 세포를 수립할 수 있었다. 또한, 래트 ES 세포 수립 후에서의 rLIF의 첨가의 필요성에 관해서도 검토하였다. 래트 ES 세포를 5 계대째까지 rLIF를 1000 단위 첨가한 배양액으로 배양하고, 계대 5대째의 래트 ES 세포에 여러 가지의 농도의 rLIF를 첨가하여, 3대 더 계대하였다. 이 세포에 대하여 미분 가능을 유지하고 있는지의 여부를, 알칼리 포스파타제 양성률(%)을 측정함으로써 행하였다(알칼리 포스파타제 활성 측정법에 관해서는 실시예 2에 기재). 그 결과, 미분화능을 유지하기 위해서는 배양액 1 ml당 rLIF를 100 단위 이상 첨가하는 것이 바람직하고, 1000 단위 정도, 또는 그 이상 첨가하는 것이 보다 바람직한 것이 명백하였다(도 3). 이들 결과로부터, 내부 세포괴 형성 후에는 rLIF 첨가 배양액을 이용하기로 하였다.
(2) 혈청 첨가의 검토
종래, ES 세포의 배양에는 소 태아 혈청(FBS)이 이용되고 있다. 래트 ES 세포의 수립에서의 FBS의 첨가의 유무에 관해서 검토를 행하였다.
구체적으로는, 래트 배반포로부터 내부 세포괴를 형성하는 단계에서, 20% FBS를 첨가한 경우와 첨가하지 않는 경우(혈청 대체 시약을 이용한 경우)에서의 내부 세포괴 형성능 및 형성률을 조사하였다. 또한 초대 배양한 계대 1대째의 ES 세포에서의 미분화능 유지의 유무에 관해서도 조사하였다. 미분화능 유지의 유무는 알칼리 포스파타제 활성 및 배양체 형성능의 유무에 의해 판정하였다. 그 결과, FBS를 첨가한 경우는 대부분이 내부 세포괴를 형성하지 않고(형성되더라도 영양아 세포와 분리 가능한 크기까지 성장하지 않는다), 다핵의 세포로 분화하였다. 또한 초대 배양한 ES 세포로는 미분화 지표인 알칼리 포스파타제 활성은 음성으로, 콜로니나 배양체도 형성되지 않았다. 한편, 혈청 대신에 혈청 대체 시약(KSR)을 이용한 경우는 래트 배반포로부터 픽업 가능한 내부 세포괴가 형성되고, 또한 초대 배양한 ES 세포에서도 알칼리 포스파타제 활성이 양성으로, 콜로니나 배양체가 형성되었다(도 4). 이 결과로부터, 래트 ES 세포 수립에서 FBS보다 KSR이 우수한 것이 명백해졌다. 또한 FBS 농도가 5%, 10%인 경우도 상기 20% FBS의 경우와 같은 결과였다.
(3) 배양액의 조성
이상의 (1) 및 (2)의 검토 결과에 기초하여, 래트 ES 세포의 수립에는 이하의 조성의 배양액을 이용하기로 하였다.
래트 ES 세포 수립용 배양액
배반포로부터 내부 세포괴를 형성하기까지의 단계에서 사용하는 배양액이다.
둘베코 개변 이글 배지/F12(아사히 테크노 글라스, 동경, 일본) 380 ml
0.2 M L-글루타민 5 ml
혈청 대체 시약(KSR: 깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 100 ml
비필수 아미노산(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
항생 물질-항균 물질 용액(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
100 mM Na-피루베이트 5 ml
0.1 M β-머캅토에탄올 0.5 ml
래트 ES 세포용 배양액
내부 세포괴 형성 이후의 배양에서 사용하는 배양액이다.
둘베코 개변 이글 배지/F12(아사히 테크노 글라스, 동경, 일본) 375 ml
0.2 M L-글루타민 5 ml
혈청 대체 시약(KSR: 깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 100 ml
비필수 아미노산(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
100 배 뉴클레오시드 보존액 5 ml
(아데노신 4 mg, 구아노신 4.25 mg, 시티딘 3.65 mg, 우리딘 3.65 mg, 티미딘 1.2 mg)
항생 물질-항균 물질 용액(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본) 5 ml
100 mM Na-피루베이트 5 ml
0.1 M β-머캅토에탄올 0.5 ml
1000U 래트 유래 백혈병 저해 인자
4) 래트 ES 세포의 단리 방법의 검토
세포를 단리할 때의 트립신 처리의 영향을 조사하였다. 우선, 내부 세포괴를 단리하여 피더 세포상에 파종하는 단계에서 통상의 트립신?EDTA 처리를 행한 결과, 대부분의 ES 세포를 분화해버렸다. 한편, 피펫을 이용하여 물리적으로 세포괴를 해리한 결과, 미분화 상태를 유지할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 초대 래트 ES 세포 콜로니(세포괴)를 계대할 때에도 트립신?EDTA 처리하여 계대한 경우에는 세포는 단일화되고 분화되어 버리지만, 상기와 마찬가지로 물리적 방법에 의해 세포괴를 해리시켜 계대한 경우는 미분화 상태를 유지할 수 있는 것이 명백하였다.
다음에, 2 회째 이후의 계대에서의 트립신의 영향에 관해서 조사하였다. 즉 2 회째의 계대에서 트립신?EDTA를 이용하여 완전히 단일 세포화한 경우와, 트립신?EDTA에 의한 처리를 최소한으로 하고, 최종적으로는 물리적 조작에 의해 5?20개의 세포괴로서 계대한 경우로 미분화 상태 유지에 차이가 있는지 여부를 검토하였다. 그 결과, 단일 세포 상태로 계대하면 자발적으로 분화되어 버리는 것에 대하여, 물리적으로 ES 세포 콜로니를 박리하고, 5?20개의 세포괴로서 계대한 경우는 미분화 상태를 유지할 수 있는 것이 명백하였다(도 5).
이상의 결과로부터, 마우스 ES 세포의 경우는 트립신?EDTA 용액으로 완전히 단일 세포화하고 계대하는 것이 바람직하지만, 래트 ES 세포의 경우, 마우스 ES 세포의 방법을 적용하면 자발적 분화가 발생하기 때문에 물리적으로 ES 세포 콜로니를 박리하고, 5?20개의 세포괴로서 계대하는 것이 바람직한 것을 알 수 있었다.
5) 래트 ES 세포의 수립
이상의 검토 결과에 기초하여 래트 ES 세포를 수립하였다. 수립법의 개략을 도 6에 도시한다. 래트 배반포(후기 단계)를 현미경 하에서 확인한 후, 타이로이드산(pH 2.5)을 이용하여 투명대를 제거하였다. 미토마이신 C 처리를 실시한 정상 마우스 태아 섬유아세포(피더 세포)를 60 mm 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에 파종하고, 투명대를 제거한 래트 배반포(후기 단계)를 5?10개씩 옮겨서 래트 ES 세포 수립용 배양액에서 배양을 시작하였다. 1?4일째에 정상 마우스 태아 섬유아세포 상에 투명대를 제거한 래트 배반포(후기 단계)가 접착되고, 접착 후 5?10일째에 내부 세포괴(도 7)만을 200 ㎕의 피펫을 이용하여 분리하였다. 200 ㎕의 래트 ES 세포 수립용 배양액을 1.5 ml 멸균 튜브에 분주하고, 분리한 내부 세포괴를 옮겨서 피펫을 이용하여 물리적으로 세포괴를 해리하였다. 사용 전날에 피더 세포를 파종한 6구 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에서, 해리한 내부 세포괴를 래트 ES 세포용 배양액에서 배양하였다. 배양으로부터 2?4일째에 ES 세포 콜로니가 출현하고(도 8, 또한 도 6 중 「초대 ES 세포」), 콜로니의 출현으로부터 5?10일째의 ES 세포 콜로니(도 9)를 현미경 하에서 형태를 확인하면서 200 ㎕의 피펫을 이용하여 분리하였다. 사용 전날에 피더 세포를 파종한 6구 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에서, 물리적으로 해리한 ES 세포 콜로니를 래트 ES 세포용 배양액에서 배양하였다(도 6 중「계대 1대째」). 배양으로부터 2?4일째에 ES 세포 콜로니가 출현하고, 5?10일째에 계대 가능하게 되었다.
다음에 배양액을 제거하고, 실온으로 복귀시킨 PBS(-)로 2회 세정하고, 미리 37℃로 보온한 2.5% 트립신(깁코 BRL, 후나코시, 동경, 일본)을 60 mm 접시당 500 ㎕ 추가하여 전면에 도포하고, 바로 용액을 제거하였다. 현미경 하에서 전체의 7할 이상의 ES 세포 콜로니가 피더 세포로부터 박리되어 가는 상태를 확인하고, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 배양액을 2 ml 추가하여 트립신 처리를 정지시켰다. 5 ml 피펫을 이용하여 물리적으로 ES 세포 콜로니를 더 박리시키고, 세포 현탁 용액을 원심분리(1000 rpm으로 3분, 실온)하여 세포와 배양액으로 분리하여 세포만을 회수하였다. 래트 ES 세포용 배양액에 세포를 현탁하고, 완전히 단리화하는 것이 아니라, 현미경 하에서 5?20개의 세포괴를 형성하고 있는 상태를 확인하고(도 5의 a)), 사용 전날에 피더 세포를 파종한 60 mm 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에 옮겨 배양하였다(도 6 중 「계대 2대째」). 그 후 5?10일째에 계대 가능한 상태로 안정화한 세포를, 상기와 같은 방법으로써 계대하여 얻어진 계대 3대째의 세포 이후의 세포를 수립 래트 ES 세포로 하였다(도 10). 이 수립한 래트 ES 세포의 형태는 지금까지 보고되어 있는 각종 ES 세포와 매우 닮은 ES 세포의 전형적인 형태였다(도 11). 또한 수립 이후도 상기와 같은 방법에 의해 5?10일마다 계대를 행하고, 세포를 유지하였다.
<실시예 2>
수립한 래트 ES 세포의 해석
계대 5대째의 래트 ES 세포를 이용하여 ES 세포로서의 특성을 갖는 것을 확인하였다. 구체적으로는 이하의 각 성질에 관해서 검토하였다.
1) RT-PCR 분석에 의한 미분화 마커 유전자의 발현 해석
수립한 래트 ES 세포에서의 대표적인 미분화 마커인 Oct3/4 및 Nanog 유전자의 발현의 유무를 검토하였다. 우선 수립한 래트 ES 세포로부터 총 RNA를 ISOGEN(일본 유전자, 동경, 일본)을 이용하여 추출하였다. 단일쇄 cDNA는 총 RNA 2 μg, 올리고(dT)18 프라이머 0.5 ㎕, dNTPs 10 pmol, RAV-2 RTase 5 단위, 및 1본쇄 합성 완충액(다카라, 쿄토, 일본)을 포함하는 전량 20 ㎕로 합성하였다. 합성은 37℃로 10 분간, 42℃로 1 시간, 56℃로 10 분간, 및 99℃ 5 분간 행하였다. 또한, 이하의 프라이머를 합성하였다(올리고뉴클레오티드 서열은 센스, 안티센스 프라이머의 순으로 괄호 내에 기재하고, 그 후에 어닐링 온도, PCR에 이용한 사이클, 및 증폭한 단편의 길이를 나타낸다): β-액틴(5'-AGAGCAAGAGAGGTATCCTG-3'(서열 번호 1), 5'-AGAGCATAGCCCTCGTAGAT-3'(서열 번호 2); 55℃; 25 사이클; 339 bp), Oct 3/4(5'-ATGGACTACCCAGAACCCCAG-3'(서열 번호 3), 5'-TTACAGGAGCTGCAGTTATAC-3'(서열 번호 4); 56℃; 35 사이클; 448 bp), Nanog(5'-TAGCCCTGATTCTTCTAGCA-3'(서열 번호 5), (5'-TTTGCTGCAACGGCACATAA-3'(서열 번호 6); 54℃; 35 사이클; 617 bp). 또한 래트 Oct 3/4의 프라이머는 마우스 Oct 3/4 유전자의 CDS 서열을 GenBank로부터 입수하고, 또한 그 염기 서열을 BLAST로 검색하여 래트 Oct 3/4 유전자 서열을 얻으며, 마우스와 래트의 상동성을 검색하고, 마우스 ES 세포는 증폭하지 않는 영역을 선택하여, 이것을 래트 특이적 Oct 3/4 프라이머로서 설계하였다. Nanog에 관해서도 마우스 및 인간 Nanog 유전자의 CDS 서열을 바탕으로 하여 프라이머를 설계하였다.
증폭은, 주형 cDNA 4 ㎕, 100 μM dNTPs, 프라이머 10 pmol, Ex-Taq 1.0 단위 및 Ex-Taq 완충액(다카라, 쿄오토, 일본)을 포함하는 전량 50 ㎕로 행하였다. PCR 후, 소량을 3.0% 아가로스 겔 상에서 영동시키고, 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색한 후, UV 조사 하에 사진을 촬영하였다. 결과를 도 12에 도시한다. 도 12로부터 명백한 바와 같이, 래트 ES 세포의 cDNA에서만, 래트 특이적 Oct3/4 및 Nanog 유전자 단편의 증폭을 나타내는 밴드가 확인되었다.
2) 알칼리 포스파타제 활성의 분석
세포가 미분화능을 갖고 있는 것을 증명하는 대표적인 지표 중 하나인 알칼리 포스파타제 활성의 유무를 분석하였다. 우선 래트 ES 세포용 배양액 및 피더 세포 존재 하에 배양을 행한 수립 래트 ES 세포를 직접, 4% 파라포름알데히드를 이용하여 10분간 고정하여 그 후 100% EtOH에서 10분간 고정하였다. H2O로 30분간 세정하였다. 알칼리 포스파타제 활성은 설명서에 따라 벡터 레드 알칼리 포스파타제 기질 키트 I(후나코시, 동경, 일본)에 의해 검출하였다. 결과를 도 13에 도시한다. 수립한 래트 ES 세포는 알칼리 포스파타제 활성 양성인 것으로 나타났다.
3) 배양체 형성능의 분석
ES 세포를 피더 세포나 LIF가 존재하지 않는 조건 하에서 비코트 배양 접시를 이용하여 배양하는 것에 의하면, 배양체가 형성된다는 것이 알려져 있다[Roy. S., et al., Mol. Cell. Biol., 18: 3947-3955(1998)]. 따라서 수립 래트 ES 세포 1.0×107개를 비코트 배양 접시에 rLIF를 제외한 래트 ES 세포용 배양액을 이용하여 파종하고, 37℃에서 3일마다 배양액을 교환하며, 20일간 항온처리하였다. 결과를 도 14에 도시한다. 도 14로부터 명백한 바와 같이 배양체가 형성되고, 심근과 같이 고동치는 배양체를 다수 확인할 수 있었다.
4) ES 세포 마커 염색의 분석
미분화 마커의 발현의 유무에 관해서 검토하였다. 래트 ES 세포용 배양액 및 피더 세포 존재 하에 배양을 행한 수립 래트 ES 세포를 직접, 4% 파라포름알데히드를 이용하여 10분간 고정하고, 그 후 0.02% 트리톤 X-100으로 15분간 정치한 후, 3% 과산화수소수/메탄올로 15분간 정치하였다. 5% 혈청/PBS로 15분간 블로킹한 후, ES 세포의 대표적인 막 단백질이며 미분화 마커의 일종인 SSEA(태아기 특이적 항원; stage-specific embryonic antigen)-1, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81을 설명서에 따라 ES 세포 캐릭터라이제이션 키트(후나코시, 동경, 일본)와 2차 항체[항 마우스 IgG 항체-비오틴 표지(후나코시, 동경, 일본)], DAB 염색 키트(코우와, 동경, 일본)에 의해 검출하였다. 결과를 도 15에 도시한다. SSEA-1 및 SSEA-4는 양성이며, 이들 미분화 마커가 발현되어 있는 것이 나타나 있다. TRA-1-60 및 TRA-1-81에 관해서는 본 항체 염색 결과로는 발현은 검출할 수 없었다.
5) 염색체 수의 분석
수립한 래트 ES 세포가 정상적인 염색체 수를 유지하고 있는지의 여부를 확인하였다. 수립 래트 ES 세포를 피더 세포 비존재 하의 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본) 래트 ES 세포용 배양액을 이용하여 배양을 행하고, G-밴드법[Sumner A. T. Cancer Genet Cytogenet. 6: 59-87(1982)]에 의해 염색체 수를 분석하였다. 결과를 도 16에 도시한다. 정상 래트 세포의 염색체 수(2n=42)를 유지하고 있는 것이 나타났다.
6) 계대 횟수의 분석
수립한 래트 ES 세포의 계대 횟수와 미분화능 유지율에 관해서 검토하였다. 래트 ES 세포를 피더 세포 존재 하의 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에서 래트 ES 세포용 배양액을 이용하여 배양하고, 계대 횟수와 미분화 능력의 유지성에 관해서 알칼리 포스파타제 활성을 지표로 검토하였다. 시작은 계대 횟수 5대째로부터이고, 이후 5대째마다 알칼리 포스파타제 활성 염색을 행하였다. 알칼리 포스파타제 활성은 설명서에 따라 벡터 레드 알칼리 포스파타제 기질 키트 I(후나코시, 동경, 일본)에 의해 검출하였다. 결과를 도 17에 도시한다. 래트 ES 세포용 배양액을 이용함으로써 적어도 계대 25대째까지 안정적으로 미분화능을 유지한 상태에서 배양이 가능한 것이 분명하였다. 또한 그 후, 계대 35대째까지 안정적으로 배양할 수 있는 것이 명백하다.
7) 시험관내에서의 다분화능의 분석
수립한 래트 ES 세포의 자발적 분화능에 관해서 검토하였다. 수립 래트 ES 세포 1.0×107개를 비코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에서, 래트 유래 백혈병 저해 인자(rLIF)를 제외한 래트 ES 세포용 배양액으로 배양함으로써 배양체 형성을 시작하였다. 형성 시작 7일째에 젤라틴 코트 배양 접시(이와키, 동경, 일본)에 배양체를 옮기고, 7일간 추가로 배양을 행하였다. 결과를 도 18에 도시한다.
도 18(a)에 도시되는 바와 같이, 배양체로부터 신경양 세포가 출현하였다. 이 신경양 세포의 확대도(b)에서는 2 세포 간에 신경 돌기가 신장되어 또한 연결되어 있는 상이 확인되었다. 지방양 세포는 세포질 내에 다수의 투명 과립을 포함하고 있는 것이 특징이지만, 도 18(c)에 도시하는 바와 같이 다수의 투명 과립을 포함하는 지방양 세포상이 확인되었다. 또한 도 18(d)에 도시하는 바와 같이 상피계 세포도 다수 확인되었다. 이와 같이 수립한 래트 ES 세포는 자발적으로 여러 가지 세포로 분화하는 능력을 갖고 있는 것이 확인되었다.
8) 혈청 및 LIF 첨가의 래트 ES 세포에의 영향
수립한 래트 ES 세포에 대한 LIF와 혈청이 미치는 미분화능 유지나 증식능에의 영향에 관해서 검토하였다. 계대 5대째의 래트 ES 세포를 이하의 4 종류의 배양 조건으로 1대 계대하였다. (1) 래트 LIF(rLIF) 함유, 무혈청(20% KSR 함유), (2) LIF 무첨가, 무혈청(20% KSR 함유), (3) 마우스 LIF(mLIF) 함유, 무혈청(20% KSR 함유), 및 (4) 래트 LIF(rLIF) 함유, 20% 혈청 함유.
미분화능을 유지하고 있는지의 여부는 ES 세포의 미분화 마커 유전자인 Oct3/4, Nanog, Rex-1의 각 유전자의 발현의 유무를 해석함으로써 조사하였다. 또한 ES 세포의 특징인 기형 종양 형성에 중요한 ERas 유전자의 발현의 유무도 분석하였다. 이용한 프라이머의 서열, 어닐링 온도 및 PCR에 이용한 사이클은 이하와 같다.
Oct 3/4: 5'-ATGGACTACCCAGAACCCCAG-3' (서열 번호 3),
5'-TTACAGGAGCTGCAGTTATAC-3' (서열 번호 4), 56℃, 40 사이클,
Nanog: 5'-TAGCCCTGATTCTTCTAGCA-3' (서열 번호 5),
5'-TTTGCTGCAACGGCACATAA-3' (서열 번호 6), 60℃, 40 사이클,
Rex-1: 5'-AAATCATGACGAGGCAAGGC-3' (서열 번호 7),
5'-TGAGTTCGCTCCAACAGTCT-3' (서열 번호 8), 60℃, 40 사이클,
ERas: 5'-ACCTGAGCCCCGGCACACAG-3' (서열 번호 9),
5'-CAGCTGCAGCGGTGTGGGCG-3' (서열 번호 10), 64℃, 40 사이클.
또한 형태학적인 관찰도 행하였다. 결과를 도 19에 도시한다.
rLIF와 20% KSR에서 래트 ES 세포를 배양[상기(1)]하면, 형태적으로 안정적이며(도 19), 또한 ES 세포 마커 유전자의 발현이 관찰됨으로써, 미분화능을 유지한 상태에서 증식할 수 있는 것이 확인되었다. 한편, 나머지의 3 조건[상기 (2)?(4)]으로 배양하면, 특징적인 ES 세포 마커류의 발현은 소실하고, 형태적으로도 분화 상태로 이행하였다(도 19). 이상의 결과로부터 래트 ES 세포의 배양에는 래트 LIF와 혈청 대체 시약(KSR)의 양자가 중요한 것이 명백하였다.
9) 기형종 형성능의 분석
수립한 래트 ES 세포를 PBS를 사용하여 1.0×107개/200 ㎕로 현탁 조정하고, 동계 수컷 래트(15 주령)의 정소 내부 및 피하 내부에 세포 이식을 행한다. 래트를 죽이고, 형성된 기형종을 적출한 후, 4% 포름알데히드로 고정한다. 조직 절편을 작성하고, 헤마톡실린?에오신으로 염색하여, 현미경 하에 삼배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로의 분화 유도를 확인한다.
10) 키메라 래트 제작능의 분석
pEGFP-1 벡터(클론테크사)의 EGFP 유전자 상류에 닭의 알부민 프로모터를 내장하고, EGFP 유전자가 안정적으로 세포 내에서 발현되는 벡터로서 구축하였다. 본 제작한 벡터를 전기천공법을 이용하여 래트 ES 세포 내부에 도입하고, 래트 ES 세포 내부의 염색체 유전자 내에 삽입된 세포주를 G418을 이용하여 약제 선별을 행하여 수립하였다[RESC/EGFP(주)].
한편, ES 세포와 동계의 래트를 이용하여 자연 교배하고, 질전 확인 3일째에 채란용 암컷 래트를 죽여 자궁을 적출하여, mw 배지로 관류하여 난을 회수하였다. 그 후 5% CO2 배양 장치에서 40개의 채란을 8 세포기 배까지 발생을 진행시킨다. 오일 드롭 내에서 타이로이드산(pH 2.5)을 이용하여 투명대를 제거하고, 피더 세포를 제거하며, 상기에서 수립한 래트 ES 세포주(RESC/EGFP 세포)의 세포괴 1개(5?20개)를 동계 래트의 수정란에 마이크로인젝션법을 이용하여 도입한다. 5% CO2 배양 장치 내에서 밤새 배양을 행한다(이식용 난). 한편, 미리 수정관 결찰 수술을 실시한 수컷 래트와 채란용 암컷 래트를 교배시키고, 다음날에 암컷 래트의 질전을 확인하여 위임신 암컷 래트를 제작한다. 마취한 위임신 암컷 래트를 개복하고, 자궁 내에 이식용 난을 각각 10개 주입한다. 자연 분만이나, 특별히 요구된 경우에는 제왕 절개술로 새끼를 적출하고, 새끼 래트에 형광을 조사하여 몸이 형광색을 나타내는 것에 의해 키메라 래트의 탄생을 확인한다.
<실시예 3>
ES 세포의 수립 및 수립한 래트 ES 세포의 분석(2)
1) ES 세포의 수립
실시예 1에 나타낸 위스터 교토 래트(WKY)의 경우와 같은 방법으로, 위스터 하노버 갈라스 래트(WHG) 및 브라운 노르웨이 래트(BN)에 관해서도 ES 세포의 수립을 행하였다. 그 결과, 어느 래트에 있어서도 ES 세포를 수립할 수 있었다.
각 래트(WKY, WHG 및 BN)의 배반포로부터 형성된 내부 세포괴의 사진을 도 20에 도시한다. 또한 계대 5대째의 수립 ES 세포의 사진도 더불어 도 20에 도시한다. WHG 래트 ES 세포, BN 래트 ES 세포 어느 것에 있어서도 WKY 래트 ES 세포와 마찬가지로 미분화능을 유지한 채 계대할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
2) RT-PCR 분석에 의한 ES 세포 마커 유전자의 발현 분석
수립한 WKY 래트 ES 세포, WHG 래트 ES 세포, BN 래트 ES 세포에서의 ES 세포 마커 유전자의 발현의 유무를 RT-PCR 분석에 의해 행하였다. 실험은 실시예 2의 1)과 마찬가지로 하여 행하였다. ES 세포의 미분화 마커 유전자인 0ct3/4, Rex-1 및 Nanog 유전자의 발현을 분석하였다. 또한 ES 세포의 특징인 기형 종양 형성에 중요한 ERas 유전자의 발현도 해석하였다. RT-PCR의 프라이머는 실시예 2의 1) 및 8)에 나타낸 것을 이용하였다. WKY 래트 ES 세포의 결과를 도 21에 도시한다. Oct3/4, Rex-1, Nanog, ERas 중 어느 인자에 있어서도 발현이 확인되었다. WHG 래트 ES 세포, BN 래트 ES 세포용에 있어서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
3) ES 세포로부터 형성된 배양체의 분석
수립 래트 ES 세포를 비코트 배양 접시에서 rLIF를 제외한 래트 ES 세포용 배양액을 이용하여 파종하고, 37℃에서 3일마다 배양액을 교환하며, 20일간 항온처리하였다. 그 결과 배양체가 형성되고, 심근과 같이 고동치는 배양체를 다수 확인할 수 있었다.
다음에, 이 심근양 세포가 출현한 배양체로부터 RNA를 추출하고, 신경 세포(외배엽), 심근 세포(중배엽) 및 간세포(내배엽)의 각 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 해석하였다. 각 마커 유전자의 명칭, 프라이머 서열, 어닐링 온도 및 PCR에 이용한 사이클을 이하에 나타낸다.
A) 신경 세포 마커
네스틴: 5'-GCTCTGACCTATCATCTGAG-3' (서열 번호 11),
5'-AGATGCACAGGAGATGCTAC-3' (서열 번호 12), 58℃, 40 사이클,
TUJ1: 5'-GGAACGCATCAGTGTCTACT-3' (서열 번호 13),
5'-ACCACGCTGAAGGTGTTCAT-3' (서열 번호 14), 60℃, 40 사이클,
MSI-1: 5'-TCTCACTGCTTATGGTCCGA-3' (서열 번호 15),
5'-TCAGTGGTACCCATTGGTGA-3' (서열 번호 16), 60℃, 40 사이클,
GFAP: 5'-GGCTCTGAGAGAGATTCGCA-3' (서열 번호 17),
5'-ATGTCCAGGGCTAGCTTAAC-3' (서열 번호 18), 58℃, 40 사이클,
B) 심근 세포 마커
CCC: 5'-TCTGAAGCGGCAGAAGAATC-3' (서열 번호 19),
5'-TGACCTCGATGAACTTGGGA-3' (서열 번호 20), 58℃, 40 사이클,
ANF: 5'-ATACAGTGCGGTGTCCAACA-3' (서열 번호 21),
5'-TTATCTTCGGTACCGGAAGC-3' (서열 번호 22), 58℃, 40 사이클,
KvLQT1: 5'-TGCGGATGCTGCATGTTGAT-3' (서열 번호 23),
5'-CAAACCCAGAGCCAAGTATG-3' (서열 번호 24), 58℃, 40 사이클,
C) 간 세포 마커
ALB: 5'-GCTTGCTGTGATAAGCCAGT-3' (서열 번호 25),
5'-TGGCAGACAGATAGTCTTCC-3' (서열 번호 26), 58℃, 40 사이클,
TD0: 5'-CGATGAGAAGCGTCATGACT-3' (서열 번호 27),
5'-AACCAGGTACGATGAGAGGT-3' (서열 번호 28), 58℃, 40 사이클,
TAT: 5'-AATGAGATTCGAGACGGGCT-3' (서열 번호 29),
5'-TTCATCACAGTGGTAGTGCT-3' (서열 번호 30), 58℃, 40 사이클,
G6P: 5'-GTCAACGTATGGATTCCGGT-3' (서열 번호 31),
*5'-GTTCTCCTTTGCAGCTCTTG-3' (서열 번호 32), 58℃, 40 사이클.
RT-PCR의 결과를 도 22에 도시한다. 미분화 상태(레인 1)에서는 발현하지 않는 유전자가 배엽체(레인 2)에서는 모두 양성으로 바뀌고 있는 것이 명백하였다. 이 결과로부터, 수립한 래트 ES 세포는 삼배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽) 계열의 세포로 분화하는 능력을 갖고 있는 것, 즉 ES 세포로서의 성질을 갖고 있는 것이 명백하였다.
14) 기형종(테라토마) 형성능의 분석
수립한 WKY 래트 ES 세포, WHG 래트 ES 세포, 및 BN 래트 ES 세포를 각각 면역부전 마우스의 피하에 2.5×107 세포개 이식하였다. 그 후 1?2 개월 후에 이들 모든 ES 세포 이식 마우스에서 테라토마의 형성을 확인하였다. WHG 래트 ES 세포의 결과를 도 23에 도시한다. 마우스를 죽이고, 형성된 테라토마를 적출한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 조직 절편을 작성하고, 헤마톡실린?에오신으로 염색하였다(도 23). 현미경 하에서의 관찰에 의해 선구조(중배엽 계열), 혈관 내피양 구조(외배엽 계열), 장관양 구조(내배엽 계열), 및 골세포양 구조(중배엽 계열)의 각 조직이 관찰되었다. 이상의 결과로부터, 수립한 래트 ES 세포는 테라토마 형성능을 가지며, 형성된 테라토마는 삼배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 구조를 갖는 것이 명백하였다.
5) 키메라 래트 제작능의 분석
pCAG-EGFP 유전자를 전기천공법을 이용하여 래트 ES 세포(WHG 래트 ES 세포)에 도입하고, pCAG-EGFP 유전자를 염색체 상에 내장한 WHG 래트 ES 세포주(이하, pCAG-EGFP/WHGrES 세포주라고 칭한다)를 제작하였다.
WHG 래트 ES 세포와 동 계통의 암컷 래트를 이용하여 자연 교배하고, 다음날 질전 양성 확인 후 4일째에 채란하였다. 그 후 5% CO2 배양 장치에서 배반포기까지 발생을 진행시킨 수정란을 채취하고, 1개의 난에 관해서 8?12개의 pCAG-EGFP/WHGrES 세포를 마이크로인젝션법으로 이식한 난을 제작하였다[이하, ES(+)라고 칭한다].
한편, 정관 결찰을 실시한 동 계통 래트 수컷과 동 계통 래트 암컷과의 교배를 행하고, 다음날의 질전 양성을 확인하며, 위임신 암컷 래트를 제작하였다. 질전 양성 확인 후 4일째에 위임신 래트 1 마리당 6개?10개의 ES(+) 난을 이식하였다. 그 후 제왕 절개술로 새끼 래트(GFP 키메라 래트)를 적출하였다.
이 GFP 키메라 래트로부터 여러 가지의 조직을 분리하고, 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로서, GFP 특이적 프라이머를 이용하여 통상의 방법으로 게놈 PCR을 행하였다. 결과를 도 24에 도시한다. 결과로서 흉선?혈관?비장의 3개를 제외하는 조사한 모든 장기에서 pCAG-EGFP/WHGrES 세포 유래인 것을 나타내는 GFP 유전자의 밴드가 확인되었다. 한편, 대조군(야생형 래트)의 게놈에는 GFP 유전자의 밴드가 확인되지 않았다. 이상과 같이 래트 ES 세포는 (pCAG-EGFP/WHGrES 세포) 유래의 유전자가 각 조직이나 세포 중에 포함되어 있었기 때문에, 수립한 래트 ES 세포는 키메라 래트 제작능을 갖고 있는 것이 명백하였다.
*6) 키메라 래트의 조직 해석
상기 5)에서 얻어진 GFP 키메라 래트, 및 동 계통의 야생형 래트를 이용하여 각각 각 조직을 절편화하고, GFP 항체(CLONTECH)를 이용하여 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 25에 도시한다. GFP 키메라 래트의 조직에서만 DAB 발색이 확인되고, 확실히 ES 세포 유래의 GFP 세포가 각 조직에 존재하면서, GFP를 발현하고 있는 것이 명백하였다.
또한 GFP 키메라 래트의 간장 절편을 휙스트(청색)와 로다민(적색)을 이용하여 형광 염색한 바, 중심 정맥 근방에 GFP 발현 세포인 것을 나타내는 적색 영역이 확인되었다(데이터는 도시 생략).
이상의 결과로부터 래트 ES 세포 유래의 유전자가 각 조직 중에 포함되어 있을 뿐만 아니라, 형태적으로 관찰한 결과, 각 조직 계열의 세포로 분화하고 있는 것이 명백하였다.
본 발명에 의해 래트 ES 세포가 제공된다. 본 발명의 수립 래트 ES 세포는 유전자 개변 래트(넉아웃 래트, 넉인 래트 등)의 제작을 처음으로 가능하게 하는 것이며, 암이나 뇌신경계를 비롯한 각종 영역에서의 약리 연구나 생리학에 있어서의 연구, 더 나아가서는 재생 의료의 연구 등에 폭넓게 이용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1에 기재한 염기 서열은 PCR 프라이머이다.
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Claims (1)

  1. 이하의 (a)?(j)의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 래트 배아 줄기 세포:
    (a) 0ct3/4 유전자 및 Nanog 유전자를 발현하는 성질,
    (b) 알칼리 포스파타제 활성 양성인 성질,
    (c) 배양체 형성능을 갖는 성질,
    (d) SSEA(태아기 특이적 항원)-1 및 SSEA-4를 발현하는 성질,
    (e) 정상 래트 세포와 동일한 염색체 수를 갖는 성질,
    (f) 미분화 상태를 유지한 채 계대 배양이 가능한 성질,
    (g) 시험관내에서 다분화능을 갖는 성질,
    (h) 삼배엽 계열의 세포로 분화하는 능력을 갖는 성질,
    (i) 기형종 형성능을 갖는 성질,
    (j) 키메라 래트 제작능을 갖는 성질.
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