JP5807862B2 - ラット胚性幹細胞を用いたキメララットの作製法 - Google Patents
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Description
また、このように限定的ではあるもののジャームライントランスミッションされたキメララットの作製例が報告されているにもかかわらず、依然として遺伝子ターゲッティングされた遺伝子改変ラット(例、ノックアウトラット、ノックインラット)の樹立は報告されていない。これには元となるラットES細胞の質が影響している可能性がある。
本発明の別の目的は、ES細胞作製後に遺伝子改変を施しても、キメララット作製能、特に該遺伝子改変を生殖系列に伝達する能力が維持されたラットES細胞を提供し、当該ラットES細胞を用いて、遺伝子改変、特に遺伝子ターゲッティングされた遺伝子改変ラットを提供することである。
さらに、本発明者らは、ラットES細胞を樹立する際にES細胞分化抑制剤とROCK阻害剤とを培地に添加することにより、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持したラットES細胞を樹立することに成功し、当該ES細胞を用いて遺伝子ターゲッティングされたES細胞が寄与したキメララットを作製することに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
(1)以下の(a)および(b)の工程を含む、キメラ胚の作製方法:
(a)雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とを、ES細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程、
(b)ラット多能性幹細胞を接触させた宿主胚を培養し、キメラ胚を形成させる工程。
(2)該接触が、ラット多能性幹細胞を宿主胚に注入することにより行われる、(1)に記載の方法。
(3)工程(a)において、ラット多能性幹細胞と宿主胚とを、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の存在下で接触させる、(1)または(2)に記載の方法。
(4)ラット多能性幹細胞が、遺伝子組み換え細胞である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)ラット多能性幹細胞と接触させる前に、宿主胚をES細胞分化抑制剤の存在下で前培養する、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前培養を、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の存在下で行う、(5)に記載の方法。
(7)工程(b)の培養を、ES細胞分化抑制剤の存在下で行う、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)工程(b)の培養を、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の存在下で行う、(7)に記載の方法。
(9)ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびFGF受容体阻害剤からなる群より選択される少なくとも2種の薬剤からなる、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる、(9)に記載の方法。
(11)多能性幹細胞がES細胞である、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)ラット多能性幹細胞が、工程(a)においてES細胞分化抑制剤の非存在下で宿主胚と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから作製された多能性幹細胞である、(1)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)宿主胚が、工程(a)においてES細胞分化抑制剤の非存在下でラット多能性幹細胞と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラット由来である、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)(1)〜(13)のいずれかに記載の方法で作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させることを含む、キメララットの作製方法。
(15)キメララットにおけるジャームライントランスミッションを確認することをさらに含む、(14)に記載の方法。
(16)(12)または(13)に記載の方法で作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させることにより得られる、ジャームライントランスミッションされたキメララット。
(17)(15)に記載の方法によりジャームライントランスミッションが確認されたキメララットを異性ラットと交配させることを含む、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラットの作製方法。
(18)MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む、キメララット作製のための培地。
(19)ROCK阻害剤をさらに含む、(18)に記載の培地。
(20)キメララット作製用培地の製造のための、ES細胞分化抑制剤の使用。
(21)キメララット作製用培地の製造のための、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の使用。
(22)ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ阻害剤である、(20)または(21)に記載の使用。
(23)ES細胞分化抑制剤を含む、キメララットのジャームライントランスミッション効率改善剤。
(24)ROCK阻害剤をさらに含む、(23)に記載の剤。
(25)ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびFGF受容体阻害剤からなる群より選択される少なくとも2種の薬剤からなる、(23)または(24)に記載の剤。
(26)ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる、(25)に記載の剤。
(27)ES細胞分化抑制剤とROCK阻害剤を用いたES細胞の作製方法。
(28)ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤の組み合わせ、またはMEK阻害剤、GSK3阻害剤およびFGF受容体阻害剤の組み合わせからなる、(27)に記載の方法。
(29)(19)に記載の培地を用いたES細胞の作製方法。
(30)ES細胞が、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットES細胞である、(27)〜(29)のいずれかに記載の方法。
(31)遺伝子改変が遺伝子ターゲッティングによる改変である、(30)に記載の方法。
(32)キメララットがジャームライントランスミッションされたキメララットである、(30)または(31)に記載の方法。
(33)遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットES細胞。
(34)遺伝子改変が遺伝子ターゲッティングによる改変である、(33)に記載の方法。
(35)キメララットがジャームライントランスミッションされたキメララットである、(33)または(34)に記載の細胞。
(36)遺伝子改変を施された(33)〜(35)のいずれかに記載のラットES細胞が寄与してなる、遺伝子改変キメララット。
(37)遺伝子改変ES細胞が生殖細胞系列に寄与した(36)記載のラット。
(38)(37)記載のラットを交配して得られる、遺伝子改変ES細胞が全身に寄与したラット。
(39)ES細胞分化抑制剤とROCK阻害剤を含む、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットES細胞作製用培地。
(40)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびROCK阻害剤を含む、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットES細胞作製用培地。
(41)両アレル遺伝子改変を施したラットES細胞が寄与してなる、遺伝子改変ラット。
(42)ラットES細胞に両アレル遺伝子改変を施す工程を含む、遺伝子改変ラットの作製方法。
本発明において「多能性幹細胞」とは、ES細胞や人工多能性幹細胞(iPS細胞)に代表される未分化・多能性を維持する細胞を指す。ES細胞は、体細胞から核初期化されて生じたES細胞であっても良いが、好ましくは後述の方法によりラット初期胚から作製される。またES細胞以外では、始原生殖細胞に由来するEmbryonic Germ Cell(EG細胞)、精巣から単離されたmultipotent germlinestem cell (mGS細胞) などが挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるラット多能性幹細胞はラットES細胞またはラットiPS細胞であり、より好ましくはラットES細胞である。
本発明におけるキメララットの作製に用いるラットES細胞は、ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能を有するラットES細胞であれば、如何なる系統のラット由来のES細胞であっても良い。当該ラットの系統としては、特に限定されないが、例えば、Wistar Kyoto株(WKY)、Brown Norway株(BN)、Goto-Kakizaki株(GK)、SD株、F344/Du株(Fischer)、Wistar株、Wistar Hannover株、Long-Evans Agouti株(LEA)、ACI株などの系統のラットから選択することができる。また本発明においては、当該系統は純粋な種であっても良く、または2種以上の交雑によって得られた種であっても良い。ラットES細胞の系統によらず、ジャームライントランスミッションされたキメララットを効率よく作製できるという本発明の特徴を考慮すれば、後述する宿主胚とラットES細胞との接触工程において、ES細胞分化抑制剤の非存在下で宿主胚と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから作製したES細胞を用いる際に、本発明は特に有用である。
(A)ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を解離する工程、
(B)解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代ES細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
(C)継代可能となった初代ES細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、培養する工程、
を含むプロセスを行うことにより、樹立、作製することもできる。
ES細胞分化抑制剤とROCK阻害剤を含む培地を用いることにより、ES細胞の樹立後に遺伝子改変を施しても、キメララット作製能、特にジャームライントランスミッションされたキメララットの作製能を維持できるラットES細胞を作製することができる。
また、当該培地は、血清含有培地または無血清培地とすることができる。無調整または未精製の血清を用いる場合は、血清の影響によりラットES細胞がジャームライントランスミッションされたキメララットの作製能を喪失しない程度で培地に添加されるべきである。5%以上、例えば約10〜約20%の血清を添加する場合には、ES細胞の培養用に調整または精製された血清を用いることが望ましい。そのようなES細胞培養用の血清(例えば、ウシ胎児血清)は市販されている。
当該培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸(例えば、非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有することができる。
1) ラットES細胞樹立用培地(培養液)
胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液を、「ラットES細胞樹立用培養液」と称する。
(組成の具体例)
DMEM including 110mg/L Sodium Pyruvate and 200mM GlutaMax(GIBCO社)
20% FBS(ES Cell Qualified FBS)(GIBCO社)
0.1mM 2-Mercaptoethanol(Sigma社)
1% Non Essential Amino Acid Stock(GIBCO社)
1% 1×Antibiotic antimycotic(GIBCO社)
10μM Y-27632(WAKO社)
1μM PD0325901(Axon Medchem社)
0.5μM A-83-01(TOCRIS社)
3μM CHIR99021(Axon Medchem社)
内部細胞塊形成以降の培養(樹立ラットES細胞の培養も含む)において使用する培養液を、「ラットES細胞用培養液」と称する。
ラットES細胞用培養液は、ラットES細胞作製用培養液と同様のものであり、ラット由来白血病阻害因子(rLIF)を更に添加したものでもよい。rLIFは、要時に添加して混合するのが好ましい。
以下に、本発明におけるラットES細胞の樹立方法の具体例を示す。
1) 卵(胚盤胞期胚)の採取
卵採取用のラットとしては、前記したWistar Kyoto株(WKY)、Brown Norway株(BN)、Goto-Kakizaki株(GK)、SD株、F344/Du株(Fischer)、Wistar株、Wistar Hannover株、Long-Evans Agouti株(LEA)、ACI株などの系統のラットを用いることができる。当該ラットの週齢は8週齢〜40週齢の範囲内であれば使用可能であるが、好ましくは10週齢〜20週齢のラットが用いられ、より好ましくは10週齢〜12週齢のラットが用いられる。
前記1)で得られた胚盤胞を顕微鏡下にて確認した後、透明帯を除去する。透明帯の除去は、酸性タイロード(pH2.5)、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼなどを用いて行うことができる。その後、マイトマイシンC処理を施したフィーダー細胞を培養皿に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞を該培養皿に移し、ラットES細胞樹立用培養液にて培養を開始する。
フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿において、前記2)で解離した内部細胞塊をラットES細胞用培養液で培養する。通常、培養開始から2〜4日目に初代ES細胞コロニーが出現する。初代ES細胞コロニーの出現は、顕微鏡下で観察することにより確認することができる(出現したES細胞を「初代ES細胞」と称する)。その後、5〜10日間程度培養を継続することにより、初代ES細胞のコロニーが継代可能な状態となる。ここで「継代可能な状態」とは、形成された初代ES細胞コロニーを構成している細胞数が200〜600個前後に達し、かつ各細胞間が緊密になり細胞集塊が光沢を持つドーム状の形態を示した状態を意味する。このような形態となったことを顕微鏡下にて確認しながら、200μLのピペットなどを用いて当該ES細胞コロニーを分離する。この分離したES細胞コロニーを、ラットES細胞用培養液を含有する滅菌チューブなどに移し、5〜20個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで物理的に解離するか、アキュターゼ(登録商標)などのタンパク質分解酵素を用いて細胞解離を行う。解離は、物理的に解離することが望ましい。解離したES細胞コロニーは、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿においてラットES細胞用培養液で初代培養を行う(継代1代目の細胞)。培養開始から2〜4日程度でES細胞コロニーが出現し、5〜10日程度で継代可能な状態となる。
ラットiPS細胞は、例えば、Cell Stem Cell 4, 16-19 (2009) に記載される方法に従って作製することができる。出発材料となるラット体細胞としては、ラットES細胞について前記した系統から採取される胎児期、幼児期あるいは成体の体細胞を用いることができる。具体的には、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞);組織前駆細胞;リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の既に分化した細胞等を用いることができる。核初期化に用いられる初期化因子としては、上記文献で用いられるものの他、可能な範囲で、マウスやヒトなどの他の哺乳動物のiPS細胞樹立に用いられ得る初期化因子を適宜選択して用いることもできる。核初期化効率を改善するためのMEK阻害剤、GSK3阻害剤、TGFβ阻害剤としては、ラットES細胞の樹立において前記したと同様の物質を適宜選択して使用することができる。樹立されたラットiPS細胞が未分化状態(多能性)を維持していることは、上記と同様の方法により確認することができる。
本発明は、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚を作製する方法であり、該キメラ胚を移植したラットから仔ラットを得ることによりキメララットを作製する方法である。本発明の方法を用いることにより、ラット多能性幹細胞や宿主胚の系統に制限されることなく、ジャームライントランスミッションされたキメララットを効率よく提供することができる。
(a)雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とをES細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程。
(b)ラットES細胞と接触させた宿主胚を培養してキメラ胚を形成させる工程。
また、本発明のキメララットの作製方法は、上記方法により作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させる工程を含む。
本発明において宿主胚を採取するラットは、如何なる系統のラットであっても良い。当該ラットの系統としては、例えば、Wistar Kyoto株(WKY)、Brown Norway株(BN)、Goto-Kakizaki株(GK)、SD株、F344/Du株(Fischer)、Wistar株、WistarHannover株、Long-Evans Agouti株(LEA)、ACI株などを挙げることができる。また本発明においては、当該系統は純粋な種であっても良く、または2種以上の交雑によって得られた種であっても良い。宿主胚の系統によらず、ジャームライントランスミッションされたキメララットを効率よく作製できるという本発明の特徴を考慮すれば、宿主胚とラット多能性幹細胞との接触工程において、ES細胞分化抑制剤の非存在下でラット多能性幹細胞と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから採取した宿主胚を用いる際に、本発明は特に有用である。
採卵用雌ラットの週齢は8週齢〜40週齢の範囲内であれば使用可能であるが、好ましくは10週齢〜20週齢のラットが用いられ、より好ましくは10週齢〜12週齢のラットが用いられる。
宿主胚は自体公知の方法により交配後の雌ラットから採取することができる。交配は自然交配によってもよいし、排卵誘発後に交配を行ってもよい。当該宿主胚の採取方法としては特に限定されないが、具体的に説明すれば、採卵用雌ラットを同系の雄ラットと自然交配または性腺刺激ホルモン(卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン)を投与して過剰排卵を誘起した後に交配させ、適当な時期(例えば、8細胞期胚であれば交配後3.5日、16細胞期胚であれば交配後3.75日、桑実期胚であれば交配後4日、胚盤胞期胚であれば交配後4.5日)に採卵用雌ラットをと殺して子宮を摘出し、当該子宮を適当な培地で灌流することにより、初期胚を回収することができる。ここで灌流に用いる培養液としては、上述のラットES細胞樹立用培養液、初期胚の回収にも用いられる上記mw培地、M2培地などが、例示される。
好ましい実施態様においては、上記の前培養用培地にES細胞分化抑制剤が添加される。ES細胞分化抑制剤としては、MEK阻害剤、GSK阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、FGF受容体阻害剤から選択される少なくとも2種の薬剤が挙げられる。MEK阻害剤、GSK阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびFGF受容体阻害剤としては、ラットES細胞の培養の際に前記した物質を使用することができる。好ましくは、ES細胞分化抑制剤として、MEK阻害剤およびGSK阻害剤を含む組合せが挙げられ、より好ましい例として、さらにTGFβ受容体阻害剤を用いる組合せが挙げられる。
MEK阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.01〜100μM、好ましくは0.1〜5μMの範囲から適宜選択され得る。GSK3阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.01〜100μM、好ましくは1〜10μMの範囲から適宜選択され得る。TGFβ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.001〜10μM、好ましくは0.1〜1μMの範囲から適宜選択され得る。FGF受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.005〜500μM、好ましくは0.07〜50μMの範囲から適宜選択され得る。
別の好ましい実施態様として、宿主胚の前培養用培地に、ES細胞分化抑制剤に加えてROCK阻害剤をさらに添加することができる。ROCK阻害剤の具体例としては、ラットES細胞の培養の際に前記した物質が同様に挙げられる。ROCK阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.0001〜500μM、好ましくは1〜50μMの範囲から適宜選択され得る。
当該接触用培地には、2種以上のES細胞分化抑制剤が添加される。2種以上のES細胞分化抑制剤は、MEK阻害剤、GSK阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、FGF受容体阻害剤から選択される。MEK阻害剤、GSK阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびFGF受容体阻害剤の具体例としては、ラットES細胞の培養の際に前記した物質が同様に挙げられる。好ましくは、2種以上のES細胞分化抑制剤として、MEK阻害剤およびGSK阻害剤を含む組合せが挙げられ、より好ましい例として、さらにTGFβ受容体阻害剤を用いる組合せが挙げられる。
MEK阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.01〜100μM、好ましくは0.1〜5μMの範囲から適宜選択され得る。GSK3阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.01〜100μM、好ましくは1〜10μMの範囲から適宜選択され得る。TGFβ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.001〜10μM、好ましくは0.1〜1μMの範囲から適宜選択され得る。FGF受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.005〜500μM、好ましくは0.07〜50μMの範囲から適宜選択され得る。
好ましい実施態様として、当該接触用培地に、ES細胞分化抑制剤に加えてROCK阻害剤をさらに添加することができる。ROCK阻害剤の具体例としては、ラットES細胞の培養の際に前記した物質が同様に挙げられる。ROCK阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、0.0001〜500μM、好ましくは1〜50μMの範囲から適宜選択され得る。
上述のとおり、ジャームライントランスミッションされたキメララットを異性ラットと交配させることにより、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラットを作製することができるので、該ラット多能性幹細胞に遺伝子改変を施すことにより、全細胞が該遺伝子改変を有する遺伝子改変ラットを作出することができる。したがって、本発明はまた、上記の「2.キメラ胚およびキメララットの作製方法」により作製されたキメララットを用いた遺伝子改変ラットの作製方法、および当該方法により作製された遺伝子改変ラットを提供する。ここで「遺伝子改変ラット」とは、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットなどのような当業者に周知の全ての遺伝子改変ラットを含むことを意味する。
好ましくは、遺伝子改変ラットの作製に用いられるキメララットは、上記1−1.に記載される、ES細胞分化抑制剤とROCK阻害剤とを用いて樹立されたラットES細胞が寄与したキメララットである。
近年、標的とする遺伝子について両アレル改変させることが、細胞レベルで容易に実施可能となっている。具体的には、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)等の技術を用いることで容易に行うことができる。従って、ラットES細胞について、これらの公知技術を用いて標的とする遺伝子の両アレル欠損を施し、両アレル欠損したES細胞を用いればホモノックアウトラットを容易に産出させることもできる。
本発明は、ジャームライントランスミッションされたキメララットを作製するための培地を含むキットを提供する。本発明のキットに含まれる培地(例えば、培養液)は、ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能を有するラットES細胞の樹立にも用いることができる。
ES細胞の樹立、検証のためOct4遺伝子発現を蛍光モニターするトランスジェニックラット作製を行った。Oct4プロモーター領域DNAは、WistarラットゲノムDNAからKOD Ver.2 DNA polymerase(東洋紡)を用いPCRで増幅し、pCS2-Venus plasmidに挿入した。Oct4 promoter-Venus DNAはWistarラットの受精卵前核内に注入し(Oct4−VENUSトランスジェニックラット)を得た。
(1)試薬、フィーダー細胞の調製
最初に、ROCK阻害剤であるY−27632(WAKO社)、MEK阻害剤であるPD0325901(Axon Medchem社)、I型TGF−β受容体阻害剤であるA−83−01(TOCRIS社)、GSK3阻害剤であるCHIR99021(Axon Medchem社)の4種類の阻害剤を準備した(以下、これらの4種類の阻害剤を「YPAC因子」という。)。
ラット胚盤胞(ブラストシスト)は、4.5または5日目の妊娠ラット子宮をES細胞用基礎培地で灌流し、得た。タイロード液(Ark Resource社)で透明帯を除去後、6ウェルプレートに移し、フィーダー細胞(MEF)上に(1)で調製したYPAC因子を加えたES細胞用基礎培地(YPAC培地)で培養した。約7日後、胚盤胞のアウトグロースをYPAC培地に再播種し、ES細胞コロニーをアキュターゼ(Innovative cell technologies社)で酵素的に分離し培養した。樹立したES細胞は、MEF−YPAC培地条件で培養し、3〜4日おきに継代した。尚、ES細胞はYPAC培地にDMSO(dimethylsulfoxide)を加え常法に従い凍結、融解した。また、TgWL1(ES細胞)、TgWL2(ES細胞)培養時は、継代数3、4まで1000U/mL rLIFを加えて培養した。
上記(2)のラットES細胞の樹立方法を用いて、Wistar以外のラット系統でラットES細胞の樹立が可能であるかどうかについて検討を行った。その結果、表1に示すように、検討を行った全ての系統でラットES細胞が樹立できた。
実施例2で得られたラットES細胞および作製過程についての検証を行った。
(1)YPAC培地中での内部細胞塊(ICM)のアウトグロース
実施例1で作製したトランスジェニックラットのブラストシスト由来内部細胞塊(ICM)を用いて、実施例2のES細胞用基礎培地にYPAC因子を加えた場合、加えない場合での検討を行った。YPAC因子非存在下でOct4−Venus蛍光はプレート播種後3日後に検出されたが、7日後には、マウスESコロニーに似たドーム形状増殖を示したものの消失した。YPAC因子の存在下、ICM細胞は7日後もOct4−Venus蛍光を維持したまま急速に増殖した(図1a、b)。また、多能性因子であるOct4、Nanog、Sox2、Rex1の遺伝子発現を定量PCRで確認したところ、YPAC因子非存在下に比較し、YPAC因子添加時が高レベルであった。YPAC因子非存在下の場合、Oct4のmRNAはVenus mRNA発現、蛍光強度と同様に減少した(図1c)。本実験において、ブラストシストはトランスジェニックWistar(TgWW、Arbino)、Wild-type Wistar(WW、albion)、LEA(LL、agouti)、トランスジェニックWistar/LEA(TgWL、agouti)ハイブリッド由来のものを使用した。YPAC因子の存在下で樹立したラットES細胞は、免疫染色でもOct4、Nanog、Sox2の発現が確認できた(図2h)。
樹立したラットES細胞を、ROCK阻害剤(以下、「Y因子」という。)を含まないが、MEK阻害剤、I型TGF-β受容体阻害剤およびGSK3阻害剤(以下、これら3種の阻害剤を「PAC因子」という。)を添加したES細胞用培地で培養を行った場合、コロニーは未分化形態を維持したが、まばらなコロニーとなった(図2a)。一方、Y因子のみ添加したES細胞用培地で培養した場合、MEF上に接着し増殖するが、未分化能を維持できずアルカリフォスファターゼ活性を示さなかった(図2a、b)。
得られた50個のラットES細胞の核型をギムザ染色により解析し、ほとんどの細胞が正常である42本の核型を示した(図2c)。結果は、TgWL1(70%, XX, P14)、TgWL2(84%, XX, P7, 図2c)、TgWW1(92%, XX, P5)、LL1(84%, XX, P6)であった。
(i)マイクロアレイ解析1
マイクロアレイ解析の結果、遺伝子発現においてTgWW1とLLのES細胞間は類似しているが、TgWW1とラット胎児線維芽細胞(REF)間には差が認められた。ES細胞間の統計解析による相関係数は0.968であり、TgWW1、LL(図2d)中の多能性マーカーOct4、Sox2、Dppa3、Tbx3、Fbxo15、E−カドヘリンとして知られているCdh1の発現レベルはTgWW1とLLは類似していたが、REFよりは高値であった(図2e)。
(ii)マイクロアレイ解析2
マイクロアレイ解析の結果、遺伝子発現においてTgWL1、TgWW1とLL1のES細胞間は類似しているが、ES細胞とラット胎児線維芽細胞(REF)間には差が認められた(図2g)。ES細胞間の統計解析による相関係数はTgWL1とTgWW1間で0.971、TgWW1とLL1間で0.961であった。
実施例2で作製したTgWW1(ES細胞)をアキュターゼでシングルセルに分散後、10mL PBSで2回洗浄し、100μL PBSで懸濁した2.6×106個を免疫不全マウス皮下に注入したところ、34日目のマウスにてテラトーマが確認できた(図2f)。テラトーマをパラフィンワックスで固定し、ヘマトキシリン・エオジンを用い組織染色を行ったところ、内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉への分化が確認できた(図2i)。
実施例2で作製したラットES細胞をアキュターゼでシングルセルに分散後、低接着性ディッシュ(NUNC社)上に、実施例2のES細胞用培地にY因子を含まない3阻害剤(PAC因子)添加ES細胞用培地で培養し胚様体(EBs)を作製したところ、細胞は高効率で凝集し、明瞭な3D体EBsを構築した(図3b)。また、Oct4−Venus蛍光強度は7日目で増加し、Venus、Oct4、Nanog、Sox2、Rex1の発現も定量PCRで維持されていることが確認できた(図3c)。一方、PAC因子非添加時にはマウスEBsと比較し著しく低効率でEBsを作製するものの(図3a)、各種の多能性マーカー遺伝子発現は減少した(図3c)。
以下の方法にて多系統のES細胞を用いたジャームライントランスミッションキメララットの作製を行った。
4.5日目妊娠ラットから得たブラストシストは、インジェクション培地(抗生物質不含YPAC培地)で2〜3時間インキュベートしマイクロインジェクションに使用した。
実施例2のES細胞のドーム上コロニーをガラス管で10〜20個採取し、5分間アキュターゼで処理した後、インジェクション培地内でシングルセルに分散した。次に細胞をインジェクション培地500μLに移し、室温で30〜60分インキュベート後、遠心して得られたES細胞をインジェクション培地に移し、ミネラルオイル(SIGMA社)で覆った。
10〜15個のES細胞を胚盤胞に注入し、胚を元の状態に戻すためインジェクション培地で37℃、3〜5時間インキュベーションした。10〜20個の胚を妊娠3.5日目の偽妊娠ラットの子宮角に移植した。キメララットは毛色で判定し、ジャームライントランスミッションは、キメララットの交配で誕生したF1ラットの毛色と胎児生殖細胞のOct4−VENUS蛍光で判定した。ジェノタイピングは尾部DNAをPCRすることで行った。
以下の方法でYPACインジェクション法の有用性及びジャームライントランスミッションの検証を行った。
ラットES細胞をモニターするため、5μg pCAG-AmCyan1を3.2×106個のTgWW1(ES細胞)にMouse ES Cell Nucreofector Kit(Amaxa社)を用い導入し、シアン・緑の蛍光を発するCAG-AmCyan1・Oct4−VENUS陽性のES細胞のコロニーをガラス管で採取し、薬剤選択なしで増幅しモニター細胞(TgWW1+C)とした。また、LL(ES細胞)細胞に対しても、2.4×106個の細胞に10μg pOct4-Venusを導入し同様の方法でレポーターES細胞(LL1+V)を作製した。
インジェクション培地へのYPAC因子添加の有無について検討した。インキュベーション5時間後では、YPAC因子非存在下インジェクションとYPAC因子存在下でのインジェクション(以下、「YPACインジェクション」という。)の間に差はなく、様々なシアン陽性の細胞は内部細胞塊(ICM)及び栄養外胚葉(TE)上に接着した。しかしながら、インキュベーション30時間後でYPAC因子非存在下では少数のアポトーシスを起こしているシアン陽性細胞がブラストシスト内に存在する一方、YPAC因子存在下ではいくつかの細胞がICM上に集積しており、ブラストシストの形状も維持されていた(図4b)。
ブラストシストに実施例5(1)のES細胞TgWW1+Cをインジェクションし、3.5時間インキュベートした後、偽妊娠3.5日のマウス子宮に移した。18日胎児9個体中シアン陽性で表皮および腎臓におけるOct4−Venus陰性の2個体が確認できた。Oct4−Venus陽性細胞は性腺上のジャームセル特異的に検出された(図4c)。また、他の全てのES細胞においても胎児性腺上のOct4−Venus蛍光を確認することによりジャームラインキメラの発生を確認した。ジャームラインキメラはTgWL2細胞の22継代の長期培養細胞でも12匹中2匹を確認した。更にLEAラット系統から誘導したLL細胞にOct4−Venus遺伝子を導入したLL1+Vにおけるジャームライントランスミッションも確認した。
なお、cell lineは、TgWL1とTgWL2がTgWLラット(トランスジェニックWistarとLEAのハイブリッドラット)から樹立したES細胞、TgWW1とTgWW2がTgWWラット(TgWW:トランスジェニックWistarとワイルドタイプWistarのハイブリッドラット)から樹立したES細胞、WW1がWWラット(ワイルドタイプWisterラット)から樹立したES細胞、LL1とLL2 がLLラット(LEAラット)から樹立したES細胞である。
更に、YPAC因子のキメラ率に関する影響について検討した。TgWL1ラットES細胞(継代数6)をブラストシストにインジェクションする時、およびブラストシスト培養時にYPACを添加せずキメラを作製したところ(図4j)、図4jの矢印に示すように、アグーチコートカラーのキメラ率が低いことが判明した。一方で、TgWW1、LL1のES細胞をYPAC因子存在下でキメラを作製したところ(A:TgWW1細胞をLEAブラストシストにインジェクション、B :LL1細胞をWistar ブラストシストにインジェクション)、図4kに示すように、アグーチコートカラーのキメラ率が高いことが判明した。図4kの矢印はES細胞のキメラ貢献度を示す。
ラットES細胞の多能性を確認する為、ブラシストシストにシングルセルをインジェクションし確認を行った(図4g)。継代数9のTgWW1細胞のWistarブラストシストへのインジェクションの後、YPAC因子インジェクション培地で3時間インキュベーションしシングルセルを内表面に結合させた。35個のブラシストシストから16日の8胎児が発生し、1胎児でジャームライントランスミッションを達成した(図4h)。
ROCK阻害剤、MEK阻害剤、I型TGF−β受容体阻害剤とGSK3阻害剤からなる「YPAC因子」、またはMEK阻害剤(PD0325901)、I型TGF−β受容体阻害剤(A−83−01)とGSK3阻害剤(CHIR99021)の3種類の阻害剤からなる「PAC因子」を用いてキメララット作製を検討した結果を表4に示す。なお、rES細胞はいずれもYPAC培地を用いて樹立した。
以下の方法で遺伝子改変ES細胞を用いたジャームライントランスミッションキメララットの作製を行った。
10μg pOct4-Venusを3×106個のLL2(YPAC因子で樹立したES細胞)にMouse ES Cell Nucleofector Kit(Amaxa社)を用い導入し、2% Matrigel(BD Bioscience社)が塗布された培養器で、MEF上に播種した。緑の蛍光を発するOct4-Venus陽性のES細胞のコロニーをガラス管で採取し、薬剤選択なしで増幅し、Oct4-Venus陽性ES細胞(LL2)とした。2回継代後、ES細胞コロニー15個のうち、13個は緑の蛍光は不均一であったが、2個は均一な蛍光を発していた(図5A、B)。
Wister由来ブラストシストに、安定に緑の蛍光を発するES細胞LL2をYPAC因子の存在下でインジェクションし、3-5時間インキュベーションした後、偽妊娠3.5日のマウス子宮に移し、トランスジェニックラット(esTGラット)を作製した。作製したesTGラットのジャームライントランスミッションはF1ラットの毛色と(図5C、表3)、胎児16日esTGラットの性腺上のVenus蛍光から確認した(図5D)。また、esTGラットは正常な生殖能力が保持されたまま成長した。
esTGラットに由来するES細胞のVenus蛍光の発現パターンを検証した。esTGラットに由来するブラストシストのアウトグロース(図5E)が発現するVenus蛍光は、実施例1で作製したコンベンショナルトランスジェニックラット(cvTG)に由来するブラストシストのアウトグロース(図1b)と同じであった。また、10回の継代後もVenus蛍光を安定に維持したまま培養できた(図5F)。これらの結果から、Venusを安定に発現する良質なesTGラットが作製できることが判明した。
Oct4遺伝子の最初のエクソン中のスタートコドンより124bp下流を認識するZFNペアをデザイン(シグマ社)し、図6Aに示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナーをラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ(東洋紡)を用いPCRによって作製した。
このAmCyan1-IRES-NEOカセットを含むドナーの正確なターゲティングは内在性のOct4プロモーター制御下でAmCyan1とネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼの発現を導いた。10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを、6×106個のES細胞(Long-Evans Agouti(LEA)、継代数7)にMouse ES Cell Nucreofector kit(Amaxa Inc.)と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel(BD Bioscience)が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で薬剤選択なしで培養し、ガラス管にてAmCyan1陽性細胞を採取した。ドナー単独の挿入によるAmCyan-1陽性コロニーはなく、ZFNエンコーディングmRNAとドナーの両方を挿入した18コロニーでAmCyan1の発現が確認できた。これら18コロニーの継代を行い、11コロニーが生存できた。ジェノタイピング解析の結果、11クローン中8クローンで正確にジーンターゲティングが行われていた(73%)(図6B)。
これらヘテロ(Oct4+/-)な8クローンは未分化細胞中で均一なAmCyan1発現を示したが、分化したものは示さなかった(図6C)。また増幅できた4つのクローンを4.5日妊娠ラットから得たブラシスト中にYPAC因子添加下で15〜18個のES細胞をインジェクションし、妊娠3.5日目の偽妊娠ラットの子宮角へ移植した(種:Wister)。3匹のコートカラーキメラが1種類(No.11)のクローンから発生した。
従って、YPAC因子で樹立したラットES細胞は、ES細胞樹立後にジーンターゲティング等の遺伝子改変を行っても、キメララット作製能を有することが判明した。
(1)p53遺伝子欠損ラットES細胞(p53+/-)の作製
ラットp53遺伝子(exon 4)を認識するZFN発現プラスミドとZFNエンコーディング mRNA をデザイン(シグマ社)し、図7に示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナーをラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ(東洋紡株式会社)を用いPCRによって作製した。
10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを実施例6(1)で樹立した6.5 x 105個のOct4-Venus陽性ES細胞(LEA系ラット)[LL2] (継代数5) にMouse ES Cell Nucreofector kit(Amaxa社)と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel(BD Bioscience社)が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養1日後、ジェネティシンを0.2μg/ml濃度で培地に添加した。培養11日後に、ジェネティシン耐性のES細胞コロニーをガラス管に採取し、培養した。ジェノタイピング解析の結果、図8Aに示すように、採取した7コロニー中の6コロニーでホモロガスリコンビネーションが行われ、p53遺伝子が欠損していた (p53+/- ES細胞)。1コロニー(Clone No. 3)はホモロガスリコンビネーションが行われなかった。シアン蛍光からもp53+/- ES細胞におけるp53遺伝子座へのホモロガスリコンビネーションが確認された(図8B)。
ホモロガスリコンビネーションが確認できたp53+/- ES細胞(継代数9)の1クローンをWistar系ラットから得たブラシスト90個中にYPAC因子添加下でインジェクション(12 cells / 1 blastocyst)し、妊娠3.5日目の偽妊娠ラットの子宮角へ移植した(種:Wister)。その結果、13個体中9個体のキメラ色ラット(雄キメラ:5個体、雌キメラ:4個体)が発生した。
雌キメラとワイルドタイプLEA系ラットを交配させ、生まれたラットのうちキメラ色ラットをジェノタイピング解析したところ、キメラ色ラット(ジャームライントランスミッションしたラット)の雄3匹中2匹は、p53遺伝子がノックアウト(p53+/-)されていた(図9)。
従って、YPAC因子で樹立したラットES細胞は、ES細胞樹立後にジーンターゲティング等の遺伝子改変を行っても、キメララット作製能を有し、更には、ジャームライントランスミッションしたキメララットが作製できることから、ノックアウトラットの作製に使用可能であることが判明した。
(1)p53遺伝子欠損ラットES細胞(p53+/-)の作製
ラットp53遺伝子(exon 4)を認識するZFN発現プラスミドとZFNエンコーディング mRNA をデザイン(シグマ社)し、図10Aに示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナー(CAG-AmCyan1-IRES-Neo-pA)をラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ(東洋紡株式会社)を用いPCRによって作製した。
10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを4.5 x 106個のOct4-Venus陽性ES細胞(Wistar系ラット)(継代数3) にMouse ES Cell Nucreofector kit(Amaxa社)と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel(BD Bioscience社)が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養1日後、ジェネティシンを0.2μg/ml濃度で培地に添加した。培養9日後に、ジェネティシン耐性の46コロニーを採取し、培養した。ジェノタイピング解析の結果、ホモロガスリコンビネーションが行われたp53遺伝子欠損ES細胞 (p53+/-ES細胞[Cell Line: p53+/C])が確認できた(図10B Lane2、図10D)。46コロニー中の1コロニーは、両アレルでホモロガスリコンビネーションされていた(p53-/-ES細胞[Cell Line: p53C/C]) (2.2%)(図10B Lane7、図10D)。46コロニー中の7コロニーは、片アレルでホモロガスリコンビネーションされ、片アレルはフレームシフトが起こっていた(p53-/- ES細胞[Cell Line: p53C/Z]) (15%)(図10B Lane3,4、図10C、図10D)。コントロールとして、10μgのターゲティングドナーだけを4.5 x 106個のOct4-Venus陽性ES細胞(Wistar系ラット)(継代数3) にヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel(BD Bioscience社)が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養1日後、ジェネティシンを0.2μg/ml濃度で培地に添加した。培養9日後に、ジェネティシン耐性の14コロニーを採取し、培養した。ジェノタイピング解析の結果、これらのコロニーはホモロガスリコンビネーションされておらず、ターゲティングドナーがランダムに組み込まれていた(p53+/+ ES細胞[Cell Line: p53+/+(-ZFN)]) (図10B、Lane5)。
ラットp53遺伝子(exon 4)を認識するZFN発現プラスミドとZFNエンコーディング mRNA をデザイン(シグマ社)し、図10Aに示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナー(AmCyan1の代わりにレポーター遺伝子としてtdTomatoを含む; CAG-tdTomato-IRES-Neo-pA)をラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ(東洋紡株式会社)を用いPCRによって作製した。
10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを2.5 x 106個の実施例9(1)で作製したp53+/- ES細胞[Cell Line: p53+/C] (継代数9) にMouse ES Cell Nucreofector kit(Amaxa社)と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel(BD Bioscience社)が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養6日後に、tdTomatoの赤色の蛍光を発現する8コロニーを採取し、培養した(図11B)。ジェノタイピング解析の結果、3コロニー(Clone No. 1, 3, 8)でホモロガスリコンビネーションが起こっていた(38%)(p53-/- ES細胞[Cell Line: p53C/R])(図11A)。
実施例9(1)で作製したp53+/-ES細胞[Cell Line: p53+/C] と、実施例9(1)、(2)で作製したp53-/-ES細胞[Cell Line: p53C/C、p53C/Z、p53C/R]を、各々4.5日妊娠ラットから得たブラシスト中にYPAC因子添加下で12個のES細胞をインジェクションし、妊娠3.5日目の偽妊娠ラットの子宮角へ移植した(種:LEA)。
その結果、p53+/-ES細胞を用いた場合、コートカラーキメラが発生した。また、キメララット胎児の正常な発育は高頻度で確認でき、更には、p53+/-ES細胞の寄与率も高かった。
一方、p53-/-ES細胞を用いた場合、キメララット胎児209匹中184匹で奇形が生じた。このような奇形は、p53-/-ES細胞6クローンで確認できた(図12)。奇形が生じたキメララット胎児の大部分は流産した(図12A)。p53-/-ES細胞2クローン(p53C/C1、p53C/R2)から発生したキメララット胎児は、頭部に奇形が生じていた(図12B左)。この表現型は、シアン蛍光で確認できるように、p53-/-ES細胞が頭部に高く寄与したことによる(図12C左)。正常に発育したキメララット胎児209匹中25匹のキメララット胎児(図12B右)のp53-/-ES細胞の頭部への寄与は低かった(図12C右)。キメラの異常な発育は、p53-/-ES細胞を用いた場合(85.5±2.6%)は、p53+/-ES細胞を用いた場合(25.2±5.7%)に比べ著しく高頻度で起こった。
なお、従来は、遺伝子改変されたES細胞をセレクションするには膨大な時間と経費を要するため、目的遺伝子の両アレルを改変した遺伝子改変動物を作製するには、片側アレルを改変したES細胞が用いられていた。そのため、ラットES細胞の両アレルに目的の遺伝子を欠損させることにより遺伝子改変動物を作製した報告は全くない。また、2010年に、片側アレルのp53遺伝子を欠損させたES細胞から作製された片側アレル欠損のp53ノックアウトラット同士を交配させて産まれた両アレル欠損のp53ノックアウトラットに関する報告(Nature vol.467,211-215(2010))があるが、上述の実施例9のように、奇形が生じたとは報告されていない。
本発明のように、ラットES細胞の段階で、目的遺伝子について両アレルを改変(遺伝子の破壊や変異等)して遺伝子改変動物を作製すれば、遺伝子改変動物作製期間を短縮できるため、個体レベルでの遺伝子機能解析を高速化できると考えられる。また、従来よりも、遺伝子機能解析の信頼性や精度が高くなることや、より病態に近い疾患モデル動物が作製できることが期待される。
Claims (17)
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、キメラ胚の作製方法:
(a)雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とを、ES細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程、
(b)ラット多能性幹細胞を接触させた宿主胚を培養し、キメラ胚を形成させる工程。 - 該接触が、ラット多能性幹細胞を宿主胚に注入することにより行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)において、ラット多能性幹細胞と宿主胚とを、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の存在下で接触させる、請求項1または2に記載の方法。
- ラット多能性幹細胞と接触させる前に、宿主胚をES細胞分化抑制剤の存在下で前培養する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前培養を、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の存在下で行う、請求項4に記載の方法。
- 工程(b)の培養を、ES細胞分化抑制剤の存在下で行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)の培養を、ES細胞分化抑制剤およびROCK阻害剤の存在下で行う、請求項6に記載の方法。
- ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびFGF受容体阻害剤からなる群より選択される少なくとも2種の薬剤からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ES細胞分化抑制剤が、MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる、請求項8に記載の方法。
- 多能性幹細胞がES細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ラット多能性幹細胞が、工程(a)においてES細胞分化抑制剤の非存在下で宿主胚と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから作製された多能性幹細胞である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 宿主胚が、工程(a)においてES細胞分化抑制剤の非存在下でラット多能性幹細胞と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラット由来である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法で作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させることを含む、キメララットの作製方法。
- 請求項13に記載の方法で作製されたキメララットを異性ラットと交配させることを含む、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラットの作製方法。
- MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む、キメララット作製のための培地であって、以下の(1)〜(4)から選ばれる1以上の工程に用いられる培地:
(1)雌のラットから採取された受精後の宿主胚を前培養する工程、
(2)該宿主胚と、ラット多能性幹細胞とを接触させる工程、
(3)ラット多能性幹細胞を接触させた宿主胚を培養し、キメラ胚を形成させる工程、
(4)該キメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植するまで維持する工程。 - ROCK阻害剤をさらに含む、請求項15に記載の培地。
- キメララット作製用のラット多能性幹細胞の前培養のための培地であって、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、TGFβ阻害剤およびROCK阻害剤を含む血清培地。
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