CN102762717A - 使用大鼠胚胎干细胞构建嵌合大鼠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合胚胎和嵌合大鼠的制备方法，其特征在于，在ES细胞分化抑制剂的存在下，使大鼠多能干细胞和宿主胚胎接触。所述方法包括：（a）在ES细胞分化抑制剂的存在下使从雌性大鼠采集的受精宿主胚胎与大鼠多能干细胞接触的步骤，和（b）培养与大鼠多能干细胞接触的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步骤。

Description

使用大鼠胚胎干细胞构建嵌合大鼠的方法
技术领域
本发明涉及制备具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎的方法，所述方法使用大鼠多能干细胞、特别是大鼠胚胎干细胞（在下文中称作“ES细胞”），使用所述嵌合胚胎制备嵌合大鼠的方法，通过所述方法制备的嵌合大鼠，和可用于制备嵌合大鼠的培养基。
背景技术
ES细胞是一种几乎全能的细胞系，非常适用于制备基因修饰动物等。例如，通过将ES细胞（其中已经破坏了特定基因）注射进要与宿主胚胎的细胞混合的正常宿主胚泡中，并将所述混合物返回子宫，可以生产嵌合动物，通过杂交所得嵌合动物或后代，并选择出生的动物，可以生产其中已经破坏了特定基因的基因修饰动物（敲除动物）。
大鼠是具有比小鼠更适合操作的大小的哺乳动物，且是在不同领域（包括医学）广泛使用的最有用的实验动物之一。因此，一直希望建立大鼠ES细胞并使用所述细胞生产嵌合大鼠。但是，迄今为止尚未建立有效地制备嵌合大鼠的技术，其中ES细胞分化成生殖细胞谱系，来自ES细胞的遗传信息被传递给下一代，而不受大鼠ES细胞的品系和宿主胚胎的品系的影响（即，传递种系的嵌合大鼠）。
关于证实了种系传递的嵌合大鼠的制备，Qi-Long Ying等人的研究组和Austin Smith等人的研究组分别在2008年提供了报道（专利文件1，非专利文件1和2）。在这2个报道中，使用大鼠ES细胞来制备嵌合大鼠；但是，在两种情况下，从ES细胞品系和宿主胚胎品系的多种组合中的仅一种组合成功地制备出传递种系的嵌合大鼠。已暗示在制备敲除大鼠的常规实践中，重要的是使用ES细胞品系和宿主胚胎品系的多种组合来实现嵌合大鼠的制备，这提出了一个在将来要解决的问题。
另外，尽管事实上已经报道了制备传递种系的嵌合大鼠的一些实际案例，尽管如上所述它们是有限的，并没有关于建立基因靶向的基因修饰大鼠（例如，敲除大鼠、敲入大鼠）的报道。这可能是由于起始大鼠ES细胞的特性的影响。
尽管使用MEK抑制剂、GSK3抑制剂和I型TGFβ受体Alk5抑制剂（A-83-01）会建立能够生产嵌合体的大鼠iPS细胞，但尚未实现种系传递（非专利文件3）。另外，还已经报道，MEK抑制剂和Alk5抑制剂的组合会显著提高从人成纤维细胞生产iPS细胞的效率（非专利文件4）。
近年来，Watanabe等人已经发现，Rho结合激酶（Rho相关的激酶; ROCK）抑制剂Y-27632会阻断人ES细胞的细胞凋亡，并在通过酶处理分离出单个细胞以后诱导生长（非专利文件5），也没有报道ROCK抑制剂用于人干细胞培养的有用性（专利文件2）。
[文件列表]
[专利文件]
专利文件1: WO2008/015418
专利文件2: WO2008/035110
[非专利文件]
非专利文件1:Cell, 135, 1299-1310（2008）
非专利文件2:Cell, 135, 1287-1298（2008）
非专利文件3: Cell Stem Cell 4, 16-19（2009）
非专利文件4: Nat. Methods, 6, 805-808（2009）
非专利文件5: Mol. Pharmacol. 57, 976-983（2000）。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是，提供一种制备新颖的嵌合胚胎的方法，所述方法使得可有效地得到传递种系的嵌合大鼠，而无需限制大鼠多能干细胞品系和宿主胚胎品系的组合，使用所述嵌合胚胎制备嵌合大鼠的方法，和它们所用的培养基，并从而提供常规尚不可能制备的、包含大鼠多能干细胞品系和宿主胚胎品系的组合的传递种系的嵌合大鼠。
本发明的另一目的是，提供一种大鼠ES细胞，其即便是在ES细胞制备以后经历基因修饰后，也维持产生嵌合大鼠的能力，特别是将基因修饰传递给种系的能力，以及使用该大鼠ES细胞提供一种基因修饰的、特别是基因靶向的基因修饰大鼠。
解决问题的方法
发明人进行了广泛研究以开发使用大鼠ES细胞制备嵌合大鼠的方法，结果发现，通过在ES细胞分化抑制剂的存在下将大鼠ES细胞注射进宿主胚胎中，可有效地制备具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎，并且通过使用所述嵌合胚胎，可制备传递种系的嵌合大鼠。经发现，当将小量的大鼠ES细胞注射进宿主胚胎中时，会得到更好的结果，因为除了ES细胞分化抑制剂以外当在ROCK抑制剂存在下进行注射处理时，ES细胞与胚泡的粘附强度增加。此外，发明人新近发现，通过使用ES细胞分化抑制剂或通过使用与ROCK抑制剂相组合的ES细胞分化抑制剂，利用大鼠ES细胞品系和宿主品系的多种组合，可制备具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎，并可利用所述嵌合胚胎有效地制备传递种系的嵌合大鼠。
此外，发明人通过在建立大鼠ES细胞时将ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂加入培养基中，成功地建立了大鼠ES细胞，其即便在经历基因修饰以后也维持产生嵌合大鼠的能力，并且还使用该ES细胞成功地制备出嵌合大鼠，其具有基因靶向的ES细胞的贡献。
发明人已经进行了以这些发现为基础的进一步研究，所述研究导致本发明的完成。
因此，本发明如下：
（1）一种制备嵌合胚胎的方法，所述方法包括下述步骤（a）和（b）：
（a）在ES细胞分化抑制剂的存在下使从雌性大鼠采集的受精宿主胚胎与大鼠多能干细胞接触的步骤，
（b）培养该与大鼠多能干细胞接触的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步骤。
（2）根据（1）所述的方法，其中通过将大鼠多能干细胞注射进宿主胚胎中来实现所述接触。
（3）根据（1）或（2）所述的方法，其中在步骤（a）中，在ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的存在下，使所述大鼠多能干细胞与所述宿主胚胎接触。
（4）根据（1）至（3）中任一项所述的方法，其中所述大鼠多能干细胞是基因重组细胞。
（5）根据（1）至（4）中任一项所述的方法，其中在与大鼠多能干细胞接触之前，在ES细胞分化抑制剂的存在下，预培养所述宿主胚胎。
（6）根据（5）所述的方法，其中在ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的存在下，进行所述预培养。
（7）根据（1）至（6）中任一项所述的方法，其中在ES细胞分化抑制剂的存在下，进行步骤（b）中的培养。
（8）根据（7）所述的方法，其中在ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的存在下，进行步骤（b）中的培养。
（9）根据（1）至（8）中任一项所述的方法，其中所述ES细胞分化抑制剂由至少2种选自下述的药物组成：MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂。
（10）根据（9）所述的方法，其中所述ES细胞分化抑制剂由MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ受体抑制剂组成。
（11）根据（1）至（10）中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞。
（12）根据（1）至（11）中任一项所述的方法，其中所述大鼠多能干细胞是从这样的大鼠品系制备的多能干细胞：在步骤（a）中，在ES细胞分化抑制剂的非存在下与宿主胚胎接触时，所述大鼠品系不会生产传递种系的嵌合大鼠。
（13）根据（1）至（12）中任一项所述的方法，其中所述宿主胚胎源自这样的大鼠品系：在步骤（a）中，在ES细胞分化抑制剂的非存在下与大鼠多能干细胞接触时，所述大鼠品系不会生产传递种系的嵌合大鼠。
（14）一种制备嵌合大鼠的方法，所述方法包括：将根据（1）至（13）中的任一项所述的方法制备的嵌合胚胎移植进假妊娠的雌性大鼠的子宫或输卵管中，以使后代大鼠生出。
（15）根据（14）所述的方法，所述方法进一步包括：证实嵌合大鼠中的种系传递。
（16）一种传递种系的嵌合大鼠，其通过将根据（12）或（13）所述的方法制备的嵌合胚胎移植进假妊娠的雌性大鼠的子宫或输卵管中以使后代大鼠生出而得到。
（17）一种制备大鼠的方法，所述大鼠具有大鼠多能干细胞对整个身体的贡献，所述方法包括：使具有根据（15）所述的方法证实的种系传递的嵌合大鼠与异性大鼠交配。
（18）一种用于制备嵌合大鼠的培养基，所述培养基包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ抑制剂。
（19）根据（18）所述的培养基，所述培养基进一步包含ROCK抑制剂。
（20）ES细胞分化抑制剂用于生产培养基的用途，所述培养基用于制备嵌合大鼠。
（21）ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂用于生产培养基的用途，所述培养基用于制备嵌合大鼠。
（22）根据（20）或（21）所述的用途，其中所述ES细胞分化抑制剂是MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ抑制剂。
（23）嵌合大鼠的种系传递效率提高剂，其包含ES细胞分化抑制剂。
（24）根据（23）所述的试剂，所述试剂进一步包含ROCK抑制剂。
（25）根据（23）或（24）所述的试剂，其中所述ES细胞分化抑制剂由至少2种选自下述的药物组成：MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂。
（26）根据（25）所述的试剂，其中所述ES细胞分化抑制剂由MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ受体抑制剂组成。
（27）一种使用ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂制备ES细胞的方法。
（28）根据（27）所述的方法，其中所述ES细胞分化抑制剂包括：MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ受体抑制剂的组合，或MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体抑制剂的组合。
（29）一种使用根据（19）所述的培养基制备ES细胞的方法。
（30）根据（27）至（29）中任一项所述的方法，其中所述ES细胞是大鼠ES细胞，其即便在经历基因修饰以后也能够维持产生嵌合大鼠的能力。
（31）根据（30）所述的方法，其中所述基因修饰是通过基因靶向进行的修饰。
（32）根据（30）或（31）所述的方法，其中所述嵌合大鼠是传递种系的嵌合大鼠。
（33）一种大鼠ES细胞，其即便在经历基因修饰以后也能够维持产生嵌合大鼠的能力。
（34）根据（33）所述的方法，其中所述基因修饰是通过基因靶向进行的修饰。
（35）根据（33）或（34）所述的细胞，其中所述嵌合大鼠是传递种系的嵌合大鼠。
（36）一种基因修饰嵌合大鼠，其具有根据（33）至（35）中任一项所述的基因修饰大鼠ES细胞的贡献。
（37）根据（36）所述的大鼠，其具有基因修饰ES细胞对生殖细胞系的贡献。
（38）通过交配根据（37）的大鼠得到的大鼠，其具有基因修饰ES细胞对整个身体的贡献。
（39）一种用于制备大鼠ES细胞的培养基，所述大鼠ES细胞即便在经历基因修饰以后也能够维持产生嵌合大鼠的能力，所述培养基包含ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂。
（40）一种用于制备大鼠ES细胞的培养基，所述大鼠ES细胞即便在经历基因修饰以后也能够维持产生嵌合大鼠的能力，所述培养基包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和ROCK抑制剂。
（41）一种基因修饰大鼠，其具有经历双等位基因基因修饰大鼠ES细胞的贡献。
（42）一种制备基因修饰大鼠的方法，所述方法包括对大鼠ES细胞进行双等位基因基因修饰的步骤。
本发明的效果
根据本发明，不论大鼠多能干细胞的品系或所述宿主胚胎的品系如何，均可以制备具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎；通过使用所述嵌合胚胎，可以高效率地制备传递种系的嵌合大鼠。因此，可容易地制备基因修饰大鼠（敲除大鼠、敲入大鼠等），所述大鼠可以广泛地用于各种药理学研究或生理学研究，以及用于再生医学研究等。
附图说明
图1显示了胚泡在（a）没有添加YPAC因子和（b）添加YPAC因子的ES细胞培养基中的生长晕的照片。将4.5天的胚泡接种在分裂灭活的MEF上。使用Tyrode缓冲溶液，去除透明带。（c）是显示内细胞团（ICM）中的Venus、Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的定量PCR分析结果的图示。在接种7天后，从没有添加YPAC因子和添加YPAC因子的7或4个胚泡诱导的ICM的穹顶样部分中提取RNA。数据是3个独立实验的平均值，分别是REF、ICM和ICM+YPAC因子中的相对基因表达水平。
[图2-1]该图显示了大鼠ES细胞的特征检查的结果。（a）显示的集落照片显示了Y-27632的影响。将分离的单个细胞（1×105 TgWW1细胞，代数6）接种至6-孔板。左图显示了向培养基中加入MEF+YPAC因子所得到的集落，中图显示了加入PAC因子得到的集落，右图显示了加入Y因子得到的集落。（b）显示了相同的各种细胞的碱性磷酸酶（ALP）染色的照片。（c）是50个TgWL2细胞（代数: 7）的吉姆萨染色的照片。TgWL2（代数: 7）表现出42条染色体（包括XX性染色体）的核型。（d）是通过散布图分析来对比基因表达模式的图示。TgWW1和REF显示在左图中，TgWW1和LL显示在右图中。使用Agilent基因芯片（全大鼠基因组微阵列试剂盒）进行微阵列分析。中心线代表当量曲线；在它上面和下面的线表明样品基因表达水平相差2倍。（e）是对比REF、TgWL1、TgWW1和LL的基因表达模式的图示。这些是大鼠ES细胞系中的Venus、Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的Q-PCR的结果。数据是3个独立实验的平均值，分别是REF、TgWL1、TgWW1和LL的相对基因表达水平。（f）是显示来自大鼠细胞的畸胎瘤形成的照片。这是通过将2.6×106 TgWW1（代数: 5）细胞皮下移植到免疫缺陷的小鼠所产生的畸胎瘤。
[图2-2]（g）的图显示了微阵列分析和分级簇分析的结果。使用了含有41,000个基因的基于单色微阵列的基因表达分析（Agilent Technology）。图上的数字值指示相关系数。（h）显示了大鼠ES细胞中的Oct4、Nanog和Sox2的免疫染色图（下图）。上图显示了DAPI染色图像。（i）显示了从TgWW1 ES细胞系诱导的畸胎瘤的3个胚层的横截面视图。
图3是显示胚胎体（Eb）和YPAC因子的作用的检查结果的图示。显示了在没有Y-27632存在下在基础培养基中培养ES细胞3天后和7天后拍摄的胚胎体（TgWL1）的照片：（a）没有加入PAC因子，和（b）加入PAC因子。（c）是显示EB中的Venus、Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的Q-PCR分析的结果的图示。数据是3个独立实验的平均值，分别是没有加入抑制剂（空心圆圈）和加入PAC因子（实心正方形）培养0、3和7天时ES细胞中的基因表达水平。
[图4-1]关于通过YPAC注射方法制备种系嵌合体的图示。（a）是通过将p-CAG-AmCyan1质粒导入核酸中产生的稳定转化的克隆中的AmCyan1的表达的图示。（b）是显示YPAC因子在注射方法中的影响的检查结果的照片。将YPAC因子加入ES基础培养基中得到的图像显示在右图中，没有加入时得到的图像显示在左图中。上图是在温育5小时后拍摄的照片；下图是在温育30小时后拍摄的照片。（c）显示胎儿种系嵌合体的照片。将TgWW1+C细胞注射进Wistar胚泡中。在18天时在整个胎儿、肾和睾丸中检测到Venus和AmCyan1荧光。（d）显示通过YPAC注射方法制备的嵌合彩色大鼠的产生。（e）显示成年嵌合体中的种系传递。使嵌合体（TgWL1）与雌性Wistar交配。通过它们的毛色，鉴别种系个体（4/16）。（f）显示雌性嵌合体（TgWL2）的F1的基因分型分析。采集尾巴基因组DNA以后，通过PCR来扩增Venus区域。6个个体中的3个被鉴定为种系个体。Venus基因具有199 bp大小；M指示100 bp的DNA标志物。泳道1、2和3显示具有刺鼠毛色的种系个体，泳道4、5和6显示了刺鼠毛色为阴性（白化变种）的个体。（g）显示注射进胚泡中的单个细胞（TgWW1）的照片。在注射以后温育3小时时对胚泡拍摄照片。各箭头指示注射的细胞。（h）显示具有经证实的种系传递的嵌合大鼠胎儿的照片。在16天的生殖腺的一侧检测到Venus-阳性的生殖细胞。比例条是100 μm。
[图4-2]（i）显示长期传代培养的ES细胞中的种系传递。将长期培养的ES细胞（TgWL2: 代数: 22）注射进胚泡中；17.5天以后，检测出生殖腺上的Venus荧光（比例条: 300 μm）。上图显示明视野图像，下图显示荧光图像。（j）显示没有添加YPAC因子通过注射得到的毛色嵌合体的一个实例。（k）显示添加YPAC通过注射得到的毛色嵌合体的一个实例。
图5是关于从ES细胞制备Tg大鼠的图示。（A）和（B）显示Oct4-Venus转化体细胞的克隆和表达。将Oct4-Venus转基因导入第5代的ES细胞（LL2）中，并在没有药物选择下传代培养Venus-阳性的克隆。（A）中的箭头指示Venus表达受到抑制。（B）显示Oct4-Venus在ES细胞中的均一表达。（C）显示从表现出Oct4-Venus的均一表达的ES细胞得到的Tg大鼠。箭头指示通过种系传递从嵌合大鼠得到的esTG大鼠。（D）显示在处于胚胎16天的esTg大鼠的生殖腺上的Venus荧光。（E）显示esTg胚泡在YPAC培养基中的生长晕。（F）显示了源自esTg胚泡的大鼠ES细胞系。甚至在10代以后，也没有观察到Oct4-Venus的表达的抑制。（比例条: 300 μm（A, B, D）, 100 μm（E, F））
图6是关于经由ZFN通过同源重组制备敲入大鼠的图示。（A）是关于Oct4靶向的示意图。所述ZFN对会识别外显子1。各灰色框指示编码区，各空心框指示非编码区。秃线指示同源臂。各P是引物。（B）显示基因靶向的ES细胞克隆的基因分型PCR分析。（C）显示基因靶向的ES细胞克隆编号11（代数: 14）（空心箭头：未分化的细胞，实心箭头：分化的细胞）。
图7是关于经由ZFN通过同源重组制备敲除大鼠的图示。这是关于p53靶向的示意图。所述ZFN对会识别外显子4。秃线指示同源臂。
图8（A）显示基因靶向的ES细胞克隆的基因分型PCR分析（WT: 野生型, KI: p53基因靶向的等位基因）。（B）显示AmCyan1在同源重组的p53+/- ES细胞克隆中的表达。
图9（A）显示通过交配雌性嵌合体和野生型LEA-品系大鼠得到的p53基因敲除大鼠（箭头指示种系传递大鼠）。（B）显示作为交配雌性嵌合体和野生型LEA-品系大鼠的结果所产生的大鼠的基因分型分析（KI: p53基因靶向的等位基因）。
图10是关于经由ZFN通过同源重组制备敲除大鼠的图示。（A）是关于p53靶向的示意图。所述ZFN对会识别外显子4。秃线指示同源臂。（B）显示基因靶向的ES细胞克隆的基因分型分析（WT: 野生型, KI: p53基因靶向的等位基因）。泳道从左侧编号为1-7。（C）显示p53-/- ES细胞[细胞系: p53C/Z]的基因靶向的细节。（D）显示AmCyan1在同源重组的p53+/- ES细胞克隆中的表达。
在图11中，（A）显示基因靶向的ES细胞克隆的基因分型分析（WT: 野生型）。（B）显示AmCyan1和tdTomato在同源重组的p53-/- ES细胞克隆中的表达。
图12显示（A）从p53-/- ES细胞[细胞系: p53C/R2]发育成的嵌合大鼠胎儿。（B）显示了从p53-/- ES细胞[细胞系: p53C/R2]发育成的嵌合大鼠胎儿的头部畸形（在图的左侧）。（C）显示了AmCyan1在（B）的胎儿的头中的表达。
具体实施方式
本发明提供一种使用大鼠多能干细胞来有效地制备传递种系的嵌合大鼠的方法，而无需限于大鼠多能干细胞的特定品系或宿主胚胎的品系。下面描述了本发明所述的大鼠多能干细胞、制备嵌合胚胎和嵌合大鼠的方法、制备基因修饰大鼠的方法和用于制备嵌合大鼠的试剂盒。
1.大鼠多能干细胞
在本发明中，“多能干细胞”表示维持未分化状态和多能性的细胞，其以ES细胞和诱导的多能干细胞（iPS细胞）为代表。ES细胞可以是从体细胞的细胞核重新程序化得到的ES细胞，但是优选地通过以后描述的方法从大鼠早期胚胎制备。除了ES细胞以外，实例包括：源自原始生殖细胞的胚胎生殖细胞（EG细胞）、从睾丸分离出的多能种系干细胞（mGS细胞）等。优选地，要在本发明中使用的大鼠多能干细胞是大鼠ES细胞或大鼠iPS细胞，更优选大鼠ES细胞。
1-1.大鼠ES细胞
在本发明中用于生产嵌合大鼠的大鼠ES细胞可以源自任意大鼠品系，只要它可以生产传递种系的嵌合大鼠。尽管大鼠的品系没有特别限制，例如，它选自诸如下述的大鼠品系：Wistar Kyoto品系（WKY）、Brown Norway品系（BN）、Goto-Kakizaki品系（GK）、SD品系、F344/Du品系（Fischer）、Wistar品系、Wistar Hannover品系、Long-Evans刺鼠品系（LEA）、ACI品系等。另外，在本发明中，所述品系可以是纯品系，或通过杂交2个品系或更多品系得到的品系。考虑到本发明的不论大鼠ES细胞品系如何均可以有效地制备传递种系的嵌合大鼠的特征，在使用从下述大鼠品系制备的ES细胞时，本发明是特别有用的：在下述的使宿主胚胎和大鼠ES细胞接触的步骤中，在ES细胞分化抑制剂的非存在下使大鼠ES细胞与宿主胚胎接触时，所述大鼠品系不会生产传递种系的嵌合大鼠。
能够生产传递种系的嵌合大鼠的大鼠ES细胞，可以在给定情形下从上面例证的细胞系得到，或者也可以根据本身已知的方法来生产。大鼠ES细胞的生产方法的实例包括Buehr M等人的方法（Cell 2008; 135:1287-1298）等。
通过执行包括下述步骤（A）至（C）的方法，也可以建立和制备具有制备传递种系的嵌合大鼠的能力的大鼠ES细胞：
（A）离解通过培养大鼠胚泡形成的内细胞团的步骤，
（B）培养从离解的内细胞团的培养物得到的原代胚胎干细胞直到它可以传代的步骤，
（C）离解已经变得能够传代的原代胚胎干细胞、保留细胞聚集体的状态和培养它们的步骤。
上述的制备方法中的培养，优选地使用含有至少2种ES细胞分化抑制剂的培养基来进行，更优选地使用含有至少2种ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的培养基来进行。在这里，“ES细胞分化抑制剂”是指除了白血病抑制因子（LIF）以外的这样的物质：其能够抑制ES细胞分化成其它细胞或组织等，且在本发明中，可以是具有抑制大鼠ES细胞的分化的作用的任意物质。ES细胞分化抑制剂包括，例如，MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂、FGF受体抑制剂等。就该培养而言，具体地，优选地使用含有MEK抑制剂和GSK3抑制剂的培养基；更优选地使用含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂、FGF受体抑制剂和ROCK抑制剂的培养基；更优选地使用含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和ROCK抑制剂的培养基；特别优选地使用含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和ROCK抑制剂的培养基。
通过使用含有ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的培养基，可能制备大鼠ES细胞，其即便是在ES细胞建立以后经历基因修饰后，也能够维持产生嵌合大鼠的能力，特别是产生传递种系的嵌合大鼠的能力。
MEK抑制剂没有特别限制，只要它具有抑制MEK（MAP激酶-ERK激酶）的功能的作用，例如，可以提及AZD6244、CI-1040（PD184352）、PD0325901、RDEA119（BAY869766）、SL327、U0126（以上都来自Selleck）、PD98059、U0124、U0125（以上都来自COSMO BIO Co., Ltd.）等。要加入培养基中的MEK抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 100 μm，优选0.1 - 5 μM。
GSK3抑制剂没有特别限制，只要它具有抑制糖原合酶激酶（GSK）3的功能的作用，例如，可以提及SB216763（Selleck）、CHIR98014、CHIR99021（以上都来自Axon Medchem）、SB415286（Tocris Bioscience）、Kenpaullone（COSMO BIO Co., Ltd.）等。要加入培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 100 μm，优选1 - 10 μm。
TGFβ受体抑制剂没有特别限制，只要它具有抑制转化生长因子（TGF）β受体的功能的作用，例如，可以提及2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫代氨甲酰基-1H-吡唑（A-83-01）、2-(5-氯-2-氟苯基)喋啶-4-基)吡啶-4-基胺（SD-208）、3-(吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶（以上都来自Merck）、SB431542（Sigma Aldrich）等。TGFβ受体抑制剂也包括TGFβ受体拮抗剂。要加入培养基中的TGFβ受体抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 10 μm，优选0.1 - 1 μM。
FGF受体抑制剂没有特别限制，只要它具有抑制成纤维细胞生长因子（FGF）受体的功能的作用，例如，可以提及SU5402（COSMO BIO Co., Ltd.）、PD173074（STEMGENT）等。FGF受体抑制剂也包括FGF受体拮抗剂。要加入培养基中的FGF受体抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.005 - 500 μm，优选0.07 - 50 μm。
ROCK抑制剂没有特别限制，只要它具有抑制Rho结合激酶的功能的作用。ROCK抑制剂的实例包括：GSK269962A（Axon Medchem）、盐酸法舒地尔（Tocris Bioscience）、Y-27632、H-1152（以上都来自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）等。要加入培养基中的ROCK抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.0001 - 500 μm，优选1 - 50 μm。
要用于建立和培养大鼠ES细胞的基础培养基没有特别限制，只要它可以用于培养动物细胞。其实例包括：BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、hamF12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer氏培养基和它们的混合培养基等。
所述培养基可以是含有血清的培养基或不含血清的培养基。当使用非条件的或未纯化的血清时，所述血清必须加入培养基中至下述程度：不会由于血清的影响而使大鼠ES细胞丧失其产生传递种系的嵌合大鼠的能力。当加入5%或更多（例如约10至约20%）的血清时，希望使用条件的或纯化的血清进行ES细胞培养。这样的用于ES细胞培养的血清（例如，牛胎血清）是可商业得到的。
所述培养基也可含有脂肪酸或脂质、氨基酸（例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
在培养大鼠ES细胞的情况下，也可以使用白血病抑制因子（LIF）。所述LIF特别优选地是大鼠衍生的LIF（rLIF）。所述LIF可以在上述的制备方法的步骤（B）和步骤（C）的培养中适宜地加入培养基使用。同时，在步骤（A）中，为了增加内细胞团形成效率、大鼠ES细胞建立效率, 和大鼠ES细胞质量，加入培养基中的rLIF的浓度非常优选地不超过100单位/mL培养基，更优选地，使用不含LIF的培养基培养大鼠ES细胞至少至内细胞团形成阶段，优选经历整个步骤（A）。对于rLIF，可以购买和使用商业产品（Chemicon Company等）。
优选地进一步使用饲养细胞来生产和培养大鼠ES细胞。饲养细胞可以是源自本领域普通技术人员可得到的任意物种的细胞，且优选地是正常成纤维细胞，而不是建立的饲养细胞系。具体地，可以提及正常的小鼠胚胎成纤维细胞。更具体地，可以提及在妊娠第12天至第16天之间的小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养细胞（正常的成纤维细胞）。作为正常的成纤维细胞，例如，例示有第12.5天的ICR胎儿小鼠的正常成纤维细胞。通过常规方法，可以制备饲养细胞。也可以使用可商业得到的产品（小鼠成纤维细胞;Asahi Techno Glass Corporation, 等）。优选地，使用通过丝裂霉素C等处理灭活的饲养细胞。
用于培养大鼠ES细胞的培养容器没有特别限制，只要它可用于细胞培养；这样的培养容器包括，例如，烧瓶、组织培养瓶、平皿、培养皿、组织培养皿、多皿、微量培养板、微孔平板、多板、多孔平板、室载玻片、培养皿、试管、托盘、培养袋、滚瓶等。所述培养容器可以是非细胞附着的或细胞附着的。可以使用细胞附着的培养容器，其表面涂有细胞支持基底层，用于改善细胞附着的目的；这样的细胞支持基底层包括，例如，胶原、明胶、基质胶、聚-L-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等。
所述培养可以例如，在CO2培养箱中，在约1至约10%、优选约2至约5%、更优选约5%的CO2浓度的气氛下，在约30至约40 ℃、优选约35至约37.5 ℃、更优选约37 ℃下进行。
作为培养基中的其它组分，适当地包含常规地用于培养ES细胞的组分，这通过将它们组合在本领域普通技术人员的普通知识内来实现。
在下面例证了培养基的具体组成。
1）用于大鼠ES细胞建立的培养基（培养基）
在从胚泡至内细胞团形成的步骤中使用的培养基称作“用于大鼠ES细胞建立的培养基”。
（组成的具体实例）
包括110 mg/L丙酮酸钠和200 mM GlutaMax（GIBCO）的DMEM
20% FBS（ES CELL QUALIFIED FBS）（GIBCO）
0.1 mM 2-巯基乙醇（Sigma）
1% 非必需氨基酸储备液（GIBCO）
1% 1×抗生素抗霉菌剂（GIBCO）
10 μM Y-27632（WAKO）
1 μM PD0325901（Axon Medchem）
0.5 μM A-83-01（TOCRIS）
3 μM CHIR99021（Axon Medchem）
2）大鼠ES细胞的培养基
在内细胞团形成以后的培养（包括建立的大鼠ES细胞的培养）中使用的培养基称作“大鼠ES细胞的培养基”。
（组成的具体实例）
ES细胞的培养基与用于生产大鼠ES细胞的培养基类似，且可以另外含有大鼠白血病抑制因子（rLIF）。rLIF优选地在即将使用前加入和混合。
（1）大鼠ES细胞建立方法
在下面显示了用于建立本发明的大鼠ES细胞的方法的一个具体实施例。
1）卵母细胞（处于胚泡期的胚胎）取样
作为用于卵母细胞取样的大鼠，可以使用来自下述品系的大鼠：诸如前述的Wistar Kyoto（WKY）品系、Brown Norway（BN）品系、Goto-Kakizaki（GK）品系、SD品系、F344/Du（Fischer）品系、Wistar品系、Wistar Hannover品系、Long-Evans刺鼠品系（LEA）和ACI品系。可以使用在8-40周龄范围内的大鼠，优选地使用10-20周龄的大鼠，更优选地使用10-12周龄的大鼠。
通过本领域普通技术人员已知的常规方法，可以进行卵母细胞取样。具体地，使大鼠自然地杂交，在阴道栓检测约4-5天后，处死用于卵母细胞取样的雌性大鼠，以摘出子宫。用合适的培养基灌注该子宫，以回收受精的卵母细胞（胚胎）。在这里使用的培养基包括，例如，mw培养基（640.0 mg/100 ml NaCl、35.6 mg/100 ml KCl、16.2 mg/100 ml KH2PO4、29.4 mg/100 ml MgSO4-7H2O、190.0 mg/100 ml NaHCO3、100.0 mg/100 ml葡萄糖、2.5 mg/100 ml丙酮酸钠、46.0 mg/100 ml乳酸钙、5.0 mg/100 ml链霉素、7.5 mg/100 ml青霉素、0.5% 酚红（0.2 ml）、20 mM β-ME（10 μl）、100 mM EDTA-2Na（10 μl）、300.0 mg/100 ml BSA），M2培养基（0.251 g/L氯化钙-2H2O、0.143 g/L硫酸镁、0.356 g/L氯化钾、0.162 g/L磷酸钾、5.532 g/L氯化钠、4.0 g/L白蛋白、1.0 g/L D-葡萄糖、4.969 g/L HEPES、0.01 g/L酚红-Na、0.036 g/L丙酮酸-Na、0.35 g/L碳酸氢钠、0.06 g/L青霉素G、0.05 g/L硫酸链霉素、4.349 g/L D,L-乳酸）等。
也可以在诸如mw培养基、M2、M16等培养基中培养回收的胚胎。通过该培养，从受精的卵母细胞（胚胎）经过桑椹胚而发育成胚泡（处于胚泡期的胚胎）。为了促进向该阶段的发育，所述培养通常在5% CO2培养箱中在37 ℃过夜进行。通过显微镜观察可以证实，发育已经进行至胚泡期。优选地，所述发育进行至晚胚泡期。
2）内细胞团的形成和分离
用显微镜证实在前述1）中得到的胚泡，并去除透明带。使用Acidic Tyrode（pH 2.5）、透明质酸酶、链霉蛋白酶等，去除透明带。然后，将用丝裂霉素C处理过的饲养细胞接种在培养皿上，将去除了透明带的大鼠胚泡转移至该皿，并使用用于大鼠ES细胞建立的培养基开始培养。
在培养的第1天和第4天之间，去除了透明带的大鼠胚泡（晚期）附着于饲养细胞上。在附着后5-10天，使用200 μl移液器等机械地分离从胚泡出现的内细胞团。使用移液器或蛋白酶诸如胰蛋白酶-EDTA、Accutase（注册商标, Innovative Cell Technologies）等，机械地离解该分离的内细胞团。该离解步骤优选地使用移液器等进行，直到所述内细胞团变成由约5-20个细胞组成的细胞聚集体。用显微镜可以证实维持的细胞聚集体的状态。
3）ES细胞的建立
在明胶包被的培养皿（其中接种了饲养细胞）中，在大鼠ES细胞的培养基中培养在前述2）中离解的内细胞团。原代ES细胞集落通常在培养开始后第2天至第4天之间出现。通过显微镜观察，可以证实原代ES细胞集落的出现（出现的ES细胞称作“原代ES细胞”）。通过此后继续培养约5-10天，原代ES细胞集落变成处于能够被传代的状态。在本文中使用的“能够被传代的状态”是指这样的状态：其中构成所形成的原代ES细胞集落的细胞的数目已经达到大约200-600个，且每个细胞间隔已经变得紧凑，且细胞团显示出具有光泽的穹顶样形式。在用显微镜证实它具有这样的形态学的同时，使用200 μl移液器等分离ES细胞集落。将该分离的ES细胞集落转移至含有大鼠ES细胞的培养基的灭菌试管等，并机械地离解，直到它变成由约5-20个细胞组成的细胞聚集体，或通过使用蛋白酶诸如Accutase（注册商标）进行离解。机械离解是优选的。在明胶包被的培养皿（其中接种了饲养细胞）中，在大鼠ES细胞的培养基中对离解的ES细胞集落进行原代培养（处于第1代的细胞）。ES细胞集落在培养开始以后约2-4天出现，并在约5-10天时变成处于能够被传代的状态。
在去除培养基以后，用预先在37 ℃温育的Accutase（注册商标）或2.5% 胰蛋白酶，包被已经在上述中变成能够被传代的ES细胞集落及其整个表面。当用显微镜证实全部ES细胞集落的70%或更多正在脱离饲养细胞的状态时，立即停止蛋白酶处理。可以如下停止蛋白酶处理：例如，加入含有10% 胎牛血清的培养基或大量不含血清的培养基。然后，使用5 ml移液器等，进一步机械地打散所述ES细胞集落，将所述细胞悬浮液离心(约3分钟、在室温、1000 rpm)，以分离细胞和培养基，并仅回收细胞。将细胞悬浮于大鼠ES细胞的培养基中，在用显微镜证实所述细胞形成5-20个细胞的聚集体（而不是变成完全单个细胞）的状态以后，将细胞转移至培养皿（其中接种了饲养细胞），并培养（第2代的细胞）。
此后，由于细胞每约3-5天变成能够被传代的状态，通过用蛋白酶诸如Accutase（注册商标）离解细胞或机械地离解细胞，可以对它们连续传代和培养。
可以证实，大鼠ES细胞保留ES细胞的性能，也就是说，所希望的ES细胞维持未分化状态（全能性）的性能，例如，通过检查ES细胞特异性的基因（例如，Oct3/4基因、Nanog基因）的表达、碱性磷酸酶活性、胚状体形成能力、SSEA-1和SSEA-4的表达、染色体的数目、传代培养后的状况、体外多能性、分化成3种生殖细胞的细胞的能力、畸胎瘤形成能力等。使用本身已知的技术（参见，例如，WO 2005/085427），可以实现它们的验证，在下面的实施例中给出了一些具体实例。
1-2.大鼠iPS细胞
根据例如在Cell Stem Cell 4, 16-19（2009）中描述的方法，可以制备大鼠iPS细胞。作为原料，可以使用从前述大鼠ES细胞品系采集的大鼠体细胞、胎儿、幼儿或成年体细胞。具体地，可以使用组织干细胞（体干细胞）诸如神经干细胞、造血干细胞、间质干细胞、精子干细胞等；组织祖细胞；已经分化的细胞诸如淋巴细胞、上皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等；等。作为用于细胞核重新程序化的重新程序化因子，除了在前述参考文献中使用的那些以外，也可以在可行的范围内适当地选择和使用可以用于在小鼠、人和其它哺乳动物中建立iPS细胞的重新程序化因子。作为用于提高细胞核重新程序化效率的MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ抑制剂，可以适当地选择和使用与上面关于大鼠ES细胞的建立所述的那些相同的物质。通过上述的方法，可以证实建立的大鼠iPS细胞对未分化状态（全能性）的维持。
2. 制备嵌合胚胎和嵌合大鼠的方法
本发明提供了一种制备具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎的方法，和一种通过从经历嵌合胚胎移植的大鼠得到后代大鼠来制备嵌合大鼠的方法。通过使用本发明的方法，可有效地提供传递种系的嵌合大鼠，而不受大鼠多能干细胞或宿主胚胎的品系的限制。
大鼠是具有在实验方面合适的尺寸（是小鼠的尺寸的约10倍）的哺乳动物，且在下述方面有利：（1）可以容易地将药物施用进细胞内的血管中，（2）可以进行外科手术或移植实验，（3）可以采集大量组织等。尽管以往已经开发和发现了许多人疾病模型大鼠，由于没有建立有效地制备传递种系的嵌合大鼠且不受大鼠ES细胞品系和宿主大鼠品系限制的方法，尚未制备基因修饰大鼠、特别是需要基因靶向的基因修饰大鼠（诸如敲除大鼠和敲入大鼠）。
使用通过本发明的方法制备的嵌合大鼠，可以容易地生产基因修饰大鼠，而不受大鼠多能干细胞谱系和宿主大鼠谱系限制。在这里，“基因修饰大鼠”是指本领域普通技术人员已知的任意基因修饰大鼠，诸如嵌合大鼠、敲除大鼠、敲入大鼠、转基因大鼠和沉默大鼠。
更具体地，本发明的嵌合胚胎的制备方法包括下述步骤（a）和（b）：
（a）在ES细胞分化抑制剂的存在下使从雌性大鼠采集的受精宿主胚胎与大鼠多能干细胞接触的步骤，
（b）培养与大鼠多能干细胞接触的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步骤。
另外，本发明的嵌合大鼠的制备方法包括下述步骤：将通过上述方法制备的嵌合胚胎移植进假妊娠的雌性大鼠的子宫或输卵管中，以使后代大鼠生出。
用于制备本发明的嵌合大鼠的大鼠多能干细胞是在上面的“1.大鼠多能干细胞”中提及的细胞，优选大鼠ES细胞或大鼠iPS细胞，更优选大鼠ES细胞。所述大鼠多能干细胞可以是具有通过公众已知的方法重组的特定基因的基因重组细胞。实例包括人工去除了特定基因的ES细胞、人工引入了特定基因的ES细胞等。
用于获得本发明的宿主胚胎的大鼠可以源自任意大鼠品系。例如，所述大鼠品系包括Wistar Kyoto品系（WKY）、Brown Norway品系（BN）、Goto-Kakizaki品系（GK）、SD品系、F344/Du品系（Fischer）、Wistar品系、Wistar Hannover品系、Long-Evans刺鼠品系（LEA）、ACI品系等。在本发明中，所述品系可以是纯品系，或通过杂交2种或更多种得到的品系。考虑到本发明的不论大鼠ES细胞品系均可以有效地制备传递种系的嵌合大鼠的特征，在使用从下述大鼠品系采集的宿主胚胎时，本发明是特别有用的：在使宿主胚胎和大鼠多能干细胞接触的步骤中，在ES细胞分化抑制剂的非存在下使大鼠ES细胞与大鼠多能干细胞接触时，所述大鼠品系不会生产传递种系的嵌合大鼠。
可以使用在8-40周龄范围内的雌性大鼠进行卵母细胞取样，优选地使用10-20周龄的大鼠，更优选地使用10-12周龄的大鼠。
原料宿主胚胎没有特别限制，只要它是从雌性大鼠采集的受精的早期胚胎；经常，可以提及在胚泡期之前的早期胚胎（例如，8-细胞期胚胎、16-细胞期胚胎、桑椹期胚胎、胚泡期胚胎）等。
通过本身已知的方法，可以从交配的雌性大鼠采集宿主胚胎。所述交配可以是自发的交配，或可以在诱导排卵以后进行。采集宿主胚胎的方法没有特别限制；为了具体地解释，使用于卵采集的雌性大鼠自发地或在施用促性腺激素（滤泡刺激激素、然后促黄体激素）以诱导过度排卵以后与相同品系的雄性大鼠交配，此后在适当时间（例如，对于8-细胞期胚胎，在交配后3.5天，对于16-细胞期胚胎，在交配后3.75天，对于桑椹期胚胎，在交配后4天，对于胚泡期胚胎，在交配后4.5天）杀死用于卵采集的雌性大鼠，摘出子宫，用适当的培养基灌注该子宫，由此可以回收早期胚胎。在这里，用于灌注的培养基的实例包括上述的用于建立大鼠ES细胞的培养基、上述的也用于回收早期胚胎的mw培养基、M2培养基等。
在与大鼠多能干细胞接触之前，可以培养采集的宿主胚胎。作为用于预培养的基础培养基，可以使用与用于建立大鼠ES细胞的基础培养基类似的培养基。所述培养基可以是含有血清的培养基或不含血清的培养基。所述培养基也可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸（例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
在一个优选的实施方案中，将ES细胞分化抑制剂加入上述的预培养基中。作为ES细胞分化抑制剂，可以提及至少2种选自下述的药物：MEK抑制剂、GSK抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂。作为MEK抑制剂、GSK抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂，可以使用上述的用于培养大鼠ES细胞的物质。ES细胞分化抑制剂优选地是包括MEK抑制剂和GSK抑制剂的组合，更优选的实施例是进一步使用TGFβ受体抑制剂的组合。
要加入培养基中的MEK抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 100 μm，优选0.1 - 5 μM。要加入培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 100 μm，优选1 - 10 μm。要加入培养基中的TGFβ受体抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.001 - 10 μm，优选0.1 - 1 μM。要加入培养基中的FGF受体抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.005 - 500 μm，优选0.07 - 50 μm。
在另一个优选的实施方案中，除了ES细胞分化抑制剂以外，可以另外将ROCK抑制剂加入用于宿主胚胎预培养的培养基中。ROCK抑制剂的具体实例包括上述的用于大鼠ES细胞培养的物质。要加入培养基中的ROCK抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.0001 - 500 μm，优选1 - 50 μm。
预培养可以例如，在CO2培养箱中，在约1至约10%、优选约2至约5%、更优选约5%的CO2浓度的气氛下，在约30至约40 ℃、优选约35至约37.5 ℃、更优选约37 ℃下进行。
在适当时，从上面在1中描述的那些中，选择要与宿主胚胎接触的大鼠多能干细胞，优选地为上面1-1中描述的大鼠ES细胞。为了促进嵌合大鼠的制备，希望所述大鼠多能干细胞是具有报道基因（例如，GFP（包括修饰的GFP诸如EGFP和Venus）、β-gal、萤光素酶等）的重组大鼠多能干细胞，所述报道基因通过常规方法预先导入其中。在仅使用毛色选择嵌合大鼠时，将在后代世代中证实种系传递；但是，假如使用报道多能干细胞，可以通过检测报道基因在嵌合大鼠的生殖细胞中的表达，在嵌合大鼠的当前世代中证实种系传递。具体地，可以预先制备引入了报道基因的转基因大鼠，可以从上述的大鼠得到多能干细胞；或者，可以将表达载体（其含有转化体细胞选择标记基因诸如药物抗性基因以及报道基因）导入如上所述通过电穿孔等制备的大鼠多能干细胞中，并可以通过药物选择等选择引入了报道基因的大鼠ES细胞。
通过技术人员已知的方法，可以使大鼠多能干细胞与宿主胚胎接触。例如，通过显微操作，将大鼠多能干细胞移植进大鼠胚泡的囊胚腔中或桑椹期或16-细胞期胚胎中，并与内细胞团一起或作为内细胞团的一部分（microinjection method: Gordon J. W. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-7384（1980））发育。或者，从2个8-细胞胚胎去除透明带，注射多能干细胞，并共培养所述胚胎以形成聚集体。当培养所得的聚集体时，得到一个胚泡（cell aggregate method: Dvorak P. 等人, Int. J. Dev. Biol., 39: 645-652（1995））。当注射大鼠多能干细胞时，优选地用矿物油、油滴、液体石蜡等覆盖大鼠ES细胞，并进行向宿主胚胎中的注射。
作为用于使大鼠多能干细胞和宿主胚胎接触的培养基，可以使用与用于建立大鼠ES细胞的基础培养基类似的培养基作为基础培养基。所述培养基可以是含有血清的培养基或不含血清的培养基。所述培养基也可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸（例如，非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
将2种或更多种ES细胞分化抑制剂加入接触培养基中。所述至少2种ES细胞分化抑制剂选自：MEK抑制剂、GSK抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂。MEK抑制剂、GSK抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂的实例包括：上述的用于培养大鼠ES细胞的物质。所述至少2种ES细胞分化抑制剂优选地包括：包括MEK抑制剂和GSK抑制剂的组合，更优选的实施例是进一步使用TGFβ受体抑制剂的组合。
要加入培养基中的MEK抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 100 μm，优选0.1 - 5 μM。要加入培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.01 - 100 μm，优选1 - 10 μm。要加入培养基中的TGFβ受体抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.001 - 10 μm，优选0.1 - 1 μM。要加入培养基中的FGF受体抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.005 - 500 μm，优选0.07 - 50 μm。
在一个优选的实施方案中，除了ES细胞分化抑制剂以外，可以进一步将ROCK抑制剂加入接触培养基中。ROCK抑制剂的具体实例包括上述的用于大鼠ES细胞培养的物质。要加入培养基中的ROCK抑制剂的浓度可以适当地选自下述范围：例如，0.0001 - 500 μm，优选1 - 50 μm。
在与大鼠多能干细胞接触以后，当继续培养时，所述宿主胚胎可以形成嵌合胚胎。这种用于后培养的培养基可以具有与前述用于接触的培养基相同的组成；所述培养基优选地是含有ES细胞分化抑制剂的培养基，更优选含有2种或更多种ES细胞分化抑制剂的培养基。具体地，含有MEK抑制剂和GSK3抑制剂的培养基是优选的，含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ受体抑制剂的培养基是更优选的。此外，可以将ROCK抑制剂加入培养基中。
所述后培养可以在与用于前述预培养的那些条件类似的条件下进行。
将上面制备的嵌合胚胎移植进假妊娠的雌性大鼠（通过与输精管结扎术处理以后的雄性大鼠自然异种交配来制备）的子宫或输卵管中，以使该大鼠生产后代大鼠，由此可以得到嵌合大鼠。
通过例如嵌合大鼠中大鼠多能干细胞的来源大鼠品系的毛色的表达、嵌合大鼠的组织切片中报道基因的表达等，可以证实通过本发明的方法制备的嵌合大鼠具有源自大鼠多能干细胞的组织的事实。具体地，通过报道基因在生殖细胞中的表达来检测向生殖细胞系的分化，由此可迅速地且方便地证实种系传递的存在与否。可以如下实现种系传递的最终证实：例如，从通过嵌合大鼠的同胞交配得到的后代大鼠的细胞提取DNA，并通过DNA印迹法、基因组PCR等检测报道基因的存在。
通过使具有经证实的种系传递的嵌合大鼠与异性大鼠交配，可制备具有对其整个身体做出贡献的大鼠多能干细胞的大鼠，即，这样的大鼠：其所有的细胞都携带源自大鼠多能干细胞的遗传信息。例如，通过使传递种系的嵌合大鼠和野生型大鼠交配得到的后代大鼠将具有仅一个源自大鼠多能干细胞的同源染色体，而通过嵌合大鼠的同胞交配得到的后代大鼠将具有2个源自大鼠多能干细胞的同源染色体。
3. 制备基因修饰大鼠的方法
如上所述，通过使传递种系的嵌合大鼠与异性大鼠交配，可制备具有对其整个身体做出贡献的大鼠多能干细胞的大鼠；因此，通过基因修饰大鼠多能干细胞，可建立这样的基因修饰大鼠：其所有细胞都具有基因修饰。因此，本发明也提供了一种使用通过上述“2. 制备嵌合胚胎和嵌合大鼠的方法”制备的嵌合大鼠来制备基因修饰大鼠的方法，和通过所述方法制备的基因修饰大鼠。在这里，“基因修饰大鼠”是指本领域普通技术人员已知的任意基因修饰大鼠，诸如敲除大鼠、敲入大鼠、转基因大鼠和沉默大鼠。
优选地，用于制备基因修饰大鼠的嵌合大鼠是这样的嵌合大鼠：其具有对其做出贡献的、在上面1-1中描述的、使用ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂建立的大鼠ES细胞。
敲除大鼠是指其中靶基因已经被人工破坏的突变型大鼠，且也称作基因靶向的大鼠。可以制备敲除大鼠，例如，根据在Donehower, A.L. 等人Nature, 356: 215-221（1992）等中所述的敲除小鼠的制备方法。具体而言，基于靶基因的基因组DNA序列，构建用于同源重组的载体（靶向载体）。在此时，引入药物抗性基因（诸如G418抗性基因、潮霉素抗性基因等）作为用于选择重组克隆的标记基因。通过电穿孔方法等，将构建的靶向载体导入大鼠多能干细胞中。基于标记基因等，从得到的引入了靶向载体的细胞中选择出其中已经发生同源基因重组的集落。使用如此得到的基因重组的大鼠多能干细胞，根据本发明的嵌合大鼠生产方法，生产嵌合大鼠。通过使所述嵌合大鼠与野生型大鼠杂交，可以在其后代大鼠中生成杂合的敲除大鼠，且当杂交杂合的敲除大鼠时，可以在其后代大鼠中生成纯合的敲除大鼠。
近年来，已可能在细胞水平容易地进行靶基因的双等位基因修饰。具体地，例如，这可以使用诸如锌指核酸酶（ZFN）等技术来促进。因此，对于大鼠ES细胞，通过使用这些公众已知的技术造成靶基因发生双等位基因缺陷，并使用双等位基因缺陷的ES细胞，可以容易地生产同型敲除（homo-knockout）大鼠。
前述敲除大鼠的种类包括有条件的敲除大鼠。“有条件的敲除”是指，使用Cre/loxP系统或FLP/FRT系统，位点特异性地或时间特异性地敲除基因的系统。具体而言，用侧接loxP序列或FRT序列的基因替换要靶向的基因的两端（3’-端和5’-端），并供给Cre或FLP蛋白以切割前述loxP序列或FRT序列侧接的基因（Sternberg N., 等人, J. Mol. Biol., 150: 487-507（1981））。
“敲入大鼠”是指这样的突变型大鼠：其中已经在其位点中导入了具有与靶基因的同源性的人工制备的外源基因。所述外源基因的导入可能破坏或不破坏靶基因的功能。例如，为了监测靶基因的表达，可以导入标记基因诸如lacZ基因、GFP基因等，或可以将基因替换为其中已经导入了突变的基因。
可以生产敲入大鼠，例如，根据在Pewzner-Jung, Y. 等人, J. Immunol., 161: 4634-4645（1998）等中描述的敲入小鼠的制备方法。基本上，通过与在前述敲除大鼠中相同的原理，可以生产所述大鼠。
“转基因的大鼠”是指其中已经人工导入外源基因的大鼠。常规地通过显微操作将目标基因注射进从供体动物采集的受精卵母细胞的雄性原核中，从而制备转基因的动物（显微注射方法）。将所述受精卵移植进受体动物的输卵管中，自然地出生的动物变成转基因的动物。对嵌合大鼠的要求不象在前述敲除大鼠和敲入大鼠的情况下那样高。但是，本发明的嵌合大鼠的制备方法可有效地用于增加外源基因的导入效率和转基因的动物个体的制备效率。
可以生产转基因大鼠，例如，根据在Yamamoto H. 等人, Cancer Res., 62: 1641-1647（2002）等中所述的转基因小鼠的制备方法。
前述转基因大鼠的种类包括有条件的转基因的大鼠。“有条件的转基因的”是指，使用Cre/loxP系统或FLP/FRT系统，位点特异性地或时间特异性地表达基因的系统。具体而言，通过向目标基因中插入其中药物抗性基因等的两端（3’-端和5’-端）侧接loxP序列或FRT序列的盒，由此抑制目标基因的表达，并供给Cre或FLP蛋白以切割所述loxP序列或FRT序列侧接的基因，由此表达目标基因（Sternberg, N., 等人, J. Mol. Biol., 150: 487-507（1981））。
“沉默大鼠”是指这样的大鼠：其中已经人工地导入和表达短双链RNA（siRNA，它是用于RNAi（RNA干扰）的中间体）或反义核酸，且siRNA或反义核酸的作用会抑制靶基因的表达。基于载体系统对siRNA的表达系统的建立（Science 296: 550-553（2002）, Nature Biotech. 20: 500-505（2002）等），已经实现了这样的沉默动物的制备。
可以生产沉默大鼠，例如，根据在Tiscornia, G. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 1844-1848（2003）等中描述的方法。基本上，通过与在前述转基因的大鼠中相同的原理，可以生产所述大鼠。
4. 用于制备嵌合大鼠的试剂盒
本发明提供了一种试剂盒，其包含用于制备传递种系的嵌合大鼠的培养基。在本发明的试剂盒中包含的培养基（例如，培养液）也可以用于建立大鼠ES细胞，其具有产生传递种系的嵌合大鼠的能力。
本发明的试剂盒的一个特征是，它包含含有ES细胞分化抑制剂作为组分的培养基。所述ES细胞分化抑制剂可以是任意物质，只要它在本发明中具有抑制大鼠ES细胞的分化能力的作用。ES细胞分化抑制剂包括，例如，MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂。在本发明中，使用它们中的至少2种ES细胞分化抑制剂。优选地，ES细胞分化抑制剂包括：MEK抑制剂和GSK抑制剂的组合，MEK抑制剂、GSK抑制剂和TGFβ受体抑制剂的组合，以及MEK抑制剂、GSK抑制剂和FGF受体抑制剂的组合；因为产生传递种系的嵌合大鼠的高能力，MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ受体抑制剂是更优选的。在另一个优选模式的实施方案中，除了ES细胞分化抑制剂以外，可以进一步加入ROCK抑制剂。MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂、FGF受体抑制剂和ROCK抑制剂的细节如上所述。
本发明的试剂盒可以含有单独的或与至少2种或更多种（在适当时）组合的前述ES细胞分化抑制剂。当在所述试剂盒中组合地包含2种或更多种ES细胞分化抑制剂时，可以混合多种ES细胞分化抑制剂并封装在单个容器中，但是它们优选地封装在分开的容器中。
所述试剂盒可以包含在上面“1.大鼠多能干细胞”中定义的大鼠多能干细胞作为试剂盒组分。所述大鼠多能干细胞优选地是大鼠ES细胞。
前述试剂盒可以进一步含有饲养细胞作为构成组分。所述饲养细胞可以是源自本领域普通技术人员可得到的任意物种的细胞，且优选地是正常成纤维细胞，而不是建立的饲养细胞系。具体地，可以提及在妊娠第12天至第16天之间的小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养细胞（正常的成纤维细胞）。作为正常的成纤维细胞，例如，例示有第12.5天的ICR胎儿小鼠的正常成纤维细胞。通过常规方法，可以制备饲养细胞。也可以使用可商业得到的小鼠胚胎成纤维细胞（Asahi Techno Glass Corporation）。
实施例
在下面解释本发明的实施例，它们不应解释为限制性的。
实施例1: 荧光报道基因转基因大鼠的制备
为了建立和验证ES细胞，制备了转基因大鼠，用于通过荧光监测Oct4基因的表达。使用KOD Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo），通过PCR从Wistar大鼠基因组DNA扩增Oct4启动子区DNA，并插入pCS2-Venus质粒中。将Oct4启动子-Venus DNA注射进Wistar大鼠的受精卵的原核中，以得到Oct4-VENUS转基因的大鼠。
实施例2: 大鼠ES细胞的制备
（1）试剂和饲养细胞的制备
首先，制备4种抑制剂，即，Y-27632作为ROCK抑制剂（WAKO Company）、PD0325901作为MEK抑制剂（Axon Medchem Company）、A-83-01作为I型TGF-β受体抑制剂（TOCRIS Company）和CHIR99021作为GSK3抑制剂（Axon Medchem Company）（在下文中，这4种抑制剂称作“YPAC因子”）。
通过将用于ES细胞的20% FBS（批号1204059: GIBCO Company）、0.1 mM 2-巯基乙醇（Sigma Company）、1% 非必需氨基酸储备液（GIBCO Company）和1% 1×抗生素抗霉菌剂（GIBCO Company）加入含有110 mg/L丙酮酸钠和200 mM GlutaMax的DMEM（GIBCO Company）中，制备ES细胞的基础培养基。
将YPAC因子加入用于ES细胞的该基础培养基中，以得到下述浓度：10 μM的ROCK抑制剂Y-27632、10 μM的MEK抑制剂PD0325901、0.5 μM的I型TGF-β受体抑制剂A-83-01和3 μM的GSK3抑制剂CHIR99021，并将所述培养基用于实验（在下文中，该培养基称作“YPAC培养基”）。
使用的饲养细胞是丝裂霉素C处理过的新霉素抗性的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF: Millipore），它们使用如下制备的培养基来维持：将10% FBS（EQUITECH-BIO Company, 批号SFB30-1502）和1% 1×抗生素抗霉菌剂（GIBCO Company）加入DMEM中。
（2）ES细胞的建立
通过用ES细胞的基础培养基灌注怀孕4.5或5天的怀孕大鼠的子宫，得到大鼠胚泡。在使用Tyrode缓冲溶液（Ark Resource Company）去除透明带以后，将所述胚泡转移至6-孔板，并使用通过将（1）中的YPAC因子加至饲养细胞（MEF）而得的ES细胞的基础培养基（YPAC培养基）进行培养。约7天后，将胚泡的生长晕重新接种至YPAC培养基；使用Accutase（Innovative Cell Technologies Company），酶促地分离ES细胞集落，并培养。在MEF-YPAC培养基条件下培养所建立的ES细胞，并每3-4天传代。根据常规方法，向YPAC培养基中加入DMSO（二甲基亚砜），冷冻和融化ES细胞。在加入1000 U/mL rLIF下，培养TgWL1（ES细胞）和TgWL2（ES细胞），直到代数达到3或4。
（3）使用多种大鼠品系的研究
使用在上面（2）中描述的建立大鼠ES细胞的方法，进行研究来确定是否可以建立非-Wistar品系的大鼠的大鼠ES细胞。结果，能够建立研究的所有品系的大鼠ES细胞，如表1所示。
表1
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a. 使用不同的培养基(FBS: MEF培养, EQUITECH+BIO)
b. 生长晕指示ICM的伸长。  
c. 细胞系指示，培养持续至少7代。在第1代和第3代之间开始单细胞传代培养。由单细胞连续形成未分化的细胞的穹顶集落。  
TgWL: 在Wistar和LEA之间的转基因杂种
TgWW:在Wistar和野生型 Wistar之间的转基因杂种
WW: 野生型 Wistar
LL: LEA。
实施例3: 大鼠ES细胞的验证
验证了在实施例2中得到的大鼠ES细胞和它们的制备方法。
（1）YPAC培养基中的内细胞团（ICM）的生长晕
使用来自在实施例1中制备的转基因大鼠的胚泡的内细胞团（ICM），在向实施例2的ES细胞的基础培养基中添加和不添加YPAC因子的情况下，进行了研究。在没有YPAC因子存在下，在平板接种以后3天检测到Oct4-Venus荧光；但是，7天后，与小鼠ES集落类似的穹顶样生长出现，但是随后消失。在有YPAC因子存在下，所述ICM细胞快速地生长，同时在甚至7天后也维持Oct4-Venus荧光（图1a和b）。通过定量PCR，检查多能性因子Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的基因表达；与在没有YPAC因子存在下相比，添加YPAC因子时发现了更高的水平。在有YPAC因子存在下，Oct4 mRNA减少，如同Venus mRNA和荧光强度的表达（图1c）。在该实验中，使用的胚泡是从转基因的Wistar（TgWW, Arbino）、野生型Wistar（WW, albion）、LEA（LL, 刺鼠）或转基因的Wistar/LEA（TgWL, 刺鼠）杂种衍生出的那些。通过免疫染色证实，在有YPAC因子存在下建立的大鼠ES细胞表达Oct4、Nanog和甚至Sox2（图2h）。
（2）培养基中的Y因子（ROCK抑制剂）的作用的验证
当使用不含有ROCK抑制剂（在下文中，称作“Y因子”）、但是补充了MEK抑制剂、I型TGF-β受体抑制剂和GSK3抑制剂（在下文中，这3种抑制剂称作“PAC因子”）的ES细胞培养基培养所建立的大鼠ES细胞时，得到的集落维持未分化状态，但是变成稀疏的集落（图2a）。同时，当使用补充了单独的Y因子的ES细胞培养基进行培养时，大鼠ES细胞附着于MEF上并繁殖，但是不能维持未分化状态，且没有表现出碱性磷酸酶活性（图2a, b）。
（3）ES细胞中的核型分析
通过吉姆萨染色，分析了得到的50个大鼠ES细胞的核型；几乎所有细胞表现出正常的42-染色体核型（图2c）。结果是：TgWL1（70%，XX，P14），TgWL2（84%，XX，P7，图2c），TgWW1（92%，XX，P5），和LL1（84%，XX，P6）。
（4）DNA微阵列分析
（i）微阵列分析1
作为微阵列分析的结果，发现TgWW1和LL ES细胞具有类似的基因表达，但是在TgWW1和大鼠胚胎成纤维细胞（REF）之间观察到差异。ES细胞的统计分析揭示0.968的相关系数；尽管多能性标志物Oct4、Sox2、Dppa3、Tbx3、Fbxo15和Cdh1（也称作E-钙粘着蛋白）在TgWW1和LL中的表达水平是类似的（图2d），但是比在REF中更高（图2e）。
（ii）微阵列分析2
作为微阵列分析的结果，发现TgWL1、TgWW1和LL1 ES细胞具有类似的基因表达，但是在ES细胞和大鼠胚胎成纤维细胞（REF）之间观察到差异（图2g）。ES细胞的统计分析揭示TgWL1和TgWW1之间的0.971的相关系数以及TgWW1和LL1之间的0.961的相关系数。
（5）畸胎瘤的形成
使用Accutase，将在实施例2中制备的TgWW1细胞（ES细胞）分散成单个细胞，此后用10 mL PBS洗涤细胞2次，并将悬浮于100 μL PBS中的2.6×106细胞皮下注射进免疫缺陷的小鼠中；在34天时在该小鼠中检测到畸胎瘤（图2f）。将所述畸胎瘤固定在石蜡中，并使用苏木素-曙红进行组织学染色；证实了分化成内胚层、中胚层和外胚层3个胚层（图2i）。
（6）ES细胞胚状体的形成（胚状体: EB）
使用Accutase，将在实施例2中制备的大鼠ES细胞分散成单个细胞，此后使用通过将不含Y因子的3种抑制剂（PAC因子）添加至低附着力皿（NUNC Company）上的实施例2的ES细胞培养基而制备的ES细胞培养基培养来细胞，以获得胚状体（EB）；所述细胞高效率地聚集，形成明显的三维EB（图3b）。Oct4-Venus荧光强度在7天时增加，通过定量PCR证实，Venus、Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的表达也得到维持（图3c）。同时，在没有添加PAC因子的情况下，EB的制备效率显著低于小鼠EB（图3a），但是各种多能性标记基因的表达降低（图3c）。
实施例4: 使用多个品系通过YPAC注射制备种系传递嵌合大鼠
使用如下所述的多个ES细胞品系，制备种系传递嵌合大鼠。
（1）胚泡的制备
在注射培养基（不含抗生素的YPAC培养基）中温育从怀孕4.5天的怀孕大鼠得到的胚泡2-3小时，然后用于显微注射。
（2）ES细胞的制备
使用玻璃管，采集在实施例2中的ES细胞的10-20个穹顶样集落，并用Accutase处理5分钟，然后将它们在注射培养基中分散成单个细胞。接着，将所述细胞转移至500 μL注射培养基，并在室温温育30-60分钟，然后离心ES细胞，并转移至注射培养基，用矿物油（SIGMA Company）覆盖。
（3）ES细胞注射进胚泡中
将10-15个ES细胞注射进胚泡中，并恢复胚胎的原始状态，在注射培养基中在37 ℃温育胚泡3-5小时。将10-20个胚胎转移至怀孕3.5天的假妊娠大鼠的子宫角。通过毛色来鉴定嵌合大鼠，并通过出生的F1大鼠（作为交配嵌合大鼠的结果）的毛色和通过胎儿生殖细胞的Oct4-VENUS荧光来鉴定种系传递。通过对尾巴DNA进行PCR，实现基因分型。
实施例5: 种系传递嵌合大鼠和及其制备方法的验证
如下所述验证YPAC注射方法和种系传递的实用性。
（1）大鼠ES报道细胞（青色）的制备
为了监测大鼠ES细胞，使用小鼠ES细胞Nucreofector试剂盒（Amaxa Company），将5 μg pCAG-AmCyan1导入3.2×106个TgWW1细胞（ES细胞）中；使用玻璃管，采集发射青色/绿色荧光的CAG-AmCyan1/Oct4-VENUS阳性的ES细胞的集落，并在没有药物选择下扩增，将这些用作监测细胞（TgWW1+C）。另外，将10 μg pOct4-Venus导入2.4×106个LL细胞（ES细胞）中，并以相同的方式制备报道ES细胞（LL1+V）。
（2）添加YPAC因子的注射培养基的作用的验证
进行了向注射培养基中添加和不添加YPAC因子的研究。在温育5小时以后，在没有YPAC因子存在下进行注射所得到的结果与在有YPAC因子存在下进行注射（在下文中，称作“YPAC注射”）所得到的结果之间没有差异；多个青色阳性的细胞附着到内细胞团（ICM）和营养外胚层（TE）上。但是，在没有YPAC因子存在下温育30小时以后，小量凋亡的青色阳性的细胞存在于胚泡中，而在有YPAC因子存在下，一些细胞积累在ICM上，且胚泡的形状得到维持（图4b）。
（3）产生种系嵌合大鼠的能力的验证
将实施例5（1）的ES细胞TgWW1+C注射进胚泡中，并温育3.5小时，然后将它们转移至假妊娠3.5天的小鼠的子宫中。发现处于18天胚胎的9个个体中的2个在表皮和肾中是青色阳性的且Oct4-Venus阴性的。在生殖腺的生殖细胞中特异性地检测到Oct4-Venus阳性的细胞（图4c）。对于所有其它ES细胞，也通过检测胎儿生殖腺上的Oct4-Venus荧光，证实种系嵌合体的形成。在12只小鼠中的2只中，甚至在经过22代的长期培养的TgWL2细胞中，也鉴别出种系嵌合体。此外，也在LL1+V中证实了种系传递，所述LL1+V通过将Oct4-Venus基因导入从LEA大鼠品系诱导的LL细胞中来制备。
为了通过毛色来鉴定嵌合体，在添加YPAC因子的情况下，将TgWL1细胞注射进Wistar大鼠中。在23个个体中，经过11或12的代数，从TgWL1细胞形成了8只嵌合彩色大鼠（图4d）。同时，当在没有添加YPAC因子的情况下进行注射时，尽管使用具有6或8的小代数的相同细胞系，也难以制备嵌合彩色大鼠，44个个体中仅1个是嵌合彩色大鼠；嵌合体比率低。在所有4个细胞系中，使用YPAC因子来制备嵌合彩色大鼠都是成功的。为了证实在F1中的种系传递，使TgWL1嵌合体和Wistar大鼠交配；雌性嵌合体中的一个个体生产了16个含有TgWL1细胞系的种系传递的个体中的4个刺鼠色的后代个体（图4e）。另外，也在源自TgWL2细胞系的细胞中证实了F1种系传递。已经发现，如表2和表3所示，当使用YPAC因子来制备嵌合大鼠时，可以制备出传递种系的嵌合大鼠，而不受大鼠ES细胞品系和宿主大鼠品系的限制。
使用的细胞系是：TgWL1和TgWL2，它们是从TgWL大鼠（转基因的Wistar大鼠和LEA大鼠之间的杂种）建立的ES细胞，TgWW1和TgWW2，它们是从TgWW大鼠（TgWW: 转基因的Wistar大鼠和野生型Wistar大鼠之间的杂种）建立的ES细胞，WW1，它是从WW大鼠（野生型Wister大鼠）建立的ES细胞，以及LL1和LL2，它们是从LL大鼠（LEA大鼠）建立的ES细胞。
为了通过基因分析鉴定Venus区，采集尾巴基因组DNA，并通过PCR进行扩增。F0嵌合体的Oct4-Venus基因通过孟德尔定律遗传给3个刺鼠色的F1种系个体中的2个（图4f）。如表2所示，当将长期培养的ES细胞（TgWL2: 代数: 22）注射进胚泡中时，在17.5天的胚胎的生殖腺上检测到Venus荧光（图4i）。
此外，研究了YPAC因子对嵌合体比率的影响。当在将TgWL1大鼠ES细胞（代数: 6）注射进胚泡中时和在培养胚泡时不添加YPAC地制备嵌合体时（图4j），如图4j中的箭头所示，发现刺鼠毛色嵌合体比率较低。同时，在有YPAC因子存在下，制备TgWW1和LL1 ES细胞的嵌合体（A：将TgWW1细胞注射进LEA胚泡中；B：将LL1细胞注射进Wistar胚泡中）；如图4k所示，发现刺鼠毛色嵌合体比率较高。图4k中的箭头指示ES细胞对嵌合体的贡献程度。
表2
Figure 150875DEST_PATH_IMAGE002
使用单独的培养基建立ES细胞。  
M, 雄性; F, 雌性
TgWL: 转基因的Wistar-LEA杂种
TgWW: 转基因的Wistar-野生型 Wistar杂种
WW: 野生型 Wistar
LL: LEA
TgWW1+C 指示稳定地表达转基因的细胞系。  
LL1+V 指示稳定地表达转基因Oct4-Venus的细胞系。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
a: 毛色范围是狭窄的。
（4）源自单个大鼠ES细胞的种系嵌合体的制备
为了证实大鼠ES细胞的多能性，将单个细胞注射进胚泡中（图4g）。将第9代TgWW1细胞注射进Wistar胚泡中，然后使用YPAC因子注射培养基温育它们3小时，以使单个细胞结合至内表面。在16天，从35个胚泡发育成了8个胎儿，在1个胎儿中实现了种系传递（图4h）。
（5）传递种系的嵌合大鼠的制备条件的研究
使用“YPAC因子”或“PAC因子”制备嵌合大鼠的研究的结果如表4所示，所述“YPAC因子”由ROCK抑制剂、MEK抑制剂、I型TGF-β受体抑制剂和GSK3抑制剂组成，所述“PAC因子”由3种抑制剂（即，MEK抑制剂（PD0325901）、I型TGF-β受体抑制剂（A-83-01）和GSK3抑制剂（CHIR99021））组成。使用YPAC培养基，建立所有rES细胞。
研究结果证实，不仅使用YPAC因子，而且使用PAC因子，都可以制备嵌合大鼠，并且得到的嵌合大鼠已经发生种系传递。另外，当要注射进宿主胚泡中的rES细胞的数目较小时，在将rES细胞注射进宿主胚胎的步骤中将ROCK抑制剂加入YPAC或PAC因子中，会增加ES细胞与胚泡的附着强度，认为这是希望的。
尽管迄今为止已经报道了使用大鼠ES细胞或小鼠ES细胞来制备嵌合动物，但不可得到关于在将ES细胞注射进宿主胚胎中时加入抑制ES细胞分化的化合物（MEK抑制剂、GSK3抑制剂等）的报道。认为在实施例1中制备的大鼠ES细胞具有与在现有技术文件中描述的大鼠ES细胞类似的能力，因为它们是能够种系传递的大鼠ES细胞；但是，在没有加入抑制剂的条件下，不能制备传递种系的大鼠。因此，已经发现，使用抑制ES细胞分化的药物来制备嵌合大鼠的方法，使得比常规方法远远更有效地制备传递种系的大鼠成为可能。
[表4]
Figure 5699DEST_PATH_IMAGE004
实施例6: 源自基因修饰ES细胞的传递种系的嵌合大鼠的制备
如下所述，使用基因修饰ES细胞来制备传递种系的嵌合大鼠。
（1）基因修饰大鼠ES细胞的制备
使用小鼠ES细胞Nucleofector试剂盒（Amaxa Company），将10 μg pOct4-Venus导入3×106个LL2细胞（用YPAC因子建立的ES细胞）中，并接种到用2% 基质胶（BD Bioscience Company）包被的培养容器中的MEF上。使用玻璃管，采集发射绿色荧光的Oct4-Venus-阳性的ES细胞的集落，并用药物选择进行扩增，将它们用作Oct4-Venus-阳性的ES细胞（LL2）。在2代以后，来自15个ES细胞集落中的13个的绿色荧光是不均匀的，而其它2个发射均匀的荧光（图5A, B）。
（2）源自基因修饰ES细胞的传递种系的嵌合大鼠的制备
在有YPAC因子存在下，将ES细胞LL2（其稳定地发射绿色荧光）注射进Wister-衍生的胚泡中，并温育3-5小时，随后将它转移至假妊娠3.5天的小鼠的子宫中，以产生转基因大鼠（esTG大鼠）。通过F1大鼠的毛色（图5C,表3）和在16天胚胎的esTG大鼠的生殖腺上的Venus荧光（图5D），证实制备的esTG大鼠中的种系传递。另外，esTG大鼠在生长的同时保留了正常的生殖能力。
（3）源自esTG大鼠的ES细胞的验证
验证了源自esTG大鼠的ES细胞的Venus荧光表达模式。由源自esTG大鼠的胚泡的生长晕表达的Venus荧光（图5E）与源自在实施例1中制备的常规转基因大鼠（cvTG）的胚泡的生长晕（图1b）相同。甚至在10代以后，也成功地培养所述细胞，同时稳定地维持Venus荧光（图5F）。从这些结果判断，发现可以制备出稳定地表达Venus的良好质量的esTG大鼠。
实施例7: 使用基因靶向的大鼠ES细胞制备嵌合大鼠
设计了ZFN对（Sigma Company），其识别在Oct4基因的第一个外显子的起始密码子下游的124 bp，并使用KOD Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo），通过PCR，从大鼠基因组DNA制备出用图6A所示的短同源臂构建的靶向供体。
含有AmCyan1-IRES-NEO盒的该供体的准确靶向，会诱导在内源性Oct4启动子控制下的AmCyan1和新霉素磷酸转移酶的表达。将10 μg靶向供体和5 μg ZFN编码mRNA与小鼠ES细胞Nucreofector试剂盒（Amaxa Inc.）一起加入6×106个ES细胞（Long-Evans刺鼠（LEA）, 代数: 7）中，以实现核转染。将ES细胞接种到用2% 基质胶（BD Bioscience）包被的培养容器中的MEF上，并在没有药物选择的、补充了YPAC因子的培养基中进行培养，使用玻璃管采集AmCyan1-阳性的细胞。没有在其中仅插入供体的AmCyan-1-阳性的集落，在18个引入了ZFN编码mRNA和供体的集落中，证实了AmCyan1的表达。传代培养这18个集落，有11个集落存活。作为基因分型分析的结果，发现在11个克隆中的8个（73%）中已经准确地实现了基因靶向（图6B）。
这8个杂合（Oct4+/-）克隆表现出AmCyan1在未分化的细胞中的均匀表达，但是在分化的细胞中则不如此（图6C）。对于4个扩增的克隆，在添加YPAC因子的情况下将15-18个ES细胞注射进从怀孕4.5天的怀孕大鼠得到的胚泡中，并移植至怀孕3.5天的假妊娠大鼠（物种: Wister）的子宫角。从1种（编号11）克隆发育成3个毛色嵌合体。
因此，发现使用YPAC因子建立的大鼠ES细胞甚至在经历基因修饰（诸如在其建立以后的基因靶向）以后，也具有产生嵌合大鼠的能力。
表5
从基因靶向的ES细胞克隆发育成嵌合大鼠
供体ES细胞: Long-Evans Agouti (LEA)
受体胚泡: Wister
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例8: 使用p53基因缺陷型大鼠ES细胞（p53 +/- ）制备p53基因敲除大鼠
（1）p53基因缺陷型大鼠ES细胞（p53+/-）的制备
设计了识别大鼠p53基因（外显子4）的ZFN表达质粒（Sigma Company）和ZFN编码mRNA，并使用KOD Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo Co., Ltd.），通过PCR，从大鼠基因组DNA制备出用图7所示的短同源臂构建的靶向供体。
将10 μg靶向供体和5 μg ZFN编码mRNA与小鼠ES细胞Nucreofector试剂盒（Amaxa Company）一起加入在实施例6（1）中建立的6.5 x 105个Oct4-Venus-阳性的ES细胞（LEA-品系大鼠）[LL2]（代数: 5）中，以实现核转染。将ES细胞接种到用2% 基质胶（BD Bioscience Company）包被的培养容器中的MEF上，并在补充了YPAC因子的培养基中进行培养。培养1天以后，以0.2 μg/ml的浓度，将遗传霉素加入培养基中。在培养11天时，将遗传霉素抗性的ES细胞集落采集进玻璃管中，并培养。作为基因分型分析的结果，如图8A所示，发现采集的7个集落中的6个集落已经发生同源重组，缺少p53基因（p53+/- ES细胞）。1个集落（克隆编号3）没有发生同源重组。青色荧光也证实了p53+/- ES细胞中与p53基因座的同源重组（图8B）。
（2）使用p53基因缺陷型大鼠ES细胞（p53+/-）制备嵌合大鼠
在加入YPAC因子的情况下，将1个发现经历同源重组的p53+/- ES细胞克隆（代数: 9）注射进从Wistar-品系大鼠得到的90个胚泡中（12个细胞/ 1个胚泡），并移植至怀孕3.5天的假妊娠大鼠（物种: Wister）的子宫角。结果，13只中形成了9嵌合彩色大鼠（雄性嵌合体: 5只，雌性嵌合体: 4只）。
使雌性嵌合体和野生型LEA-品系大鼠交配；在活产大鼠中，对嵌合彩色大鼠进行基因分型分析；发现3只雄性嵌合彩色大鼠（具有种系传递的大鼠）中的2只具有p53敲除（p53+/-）（图9）。
因此发现，使用YPAC因子建立的大鼠ES细胞具有产生嵌合大鼠的能力，甚至在经历基因修饰（诸如在其建立以后的基因靶向）以后，也能够产生具有种系传递的嵌合大鼠，并因此可用于制备敲除大鼠。
实施例9:使用p53基因缺陷型大鼠ES细胞（p53 -/- ）制备嵌合大鼠
（1）p53基因缺陷型大鼠ES细胞（p53+/-）的制备
设计了识别大鼠p53基因（外显子4）的ZFN表达质粒（Sigma Company），和ZFN编码mRNA，并使用KOD Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo Co., Ltd.），通过PCR，从大鼠基因组DNA制备出用图10A所示的短同源臂构建的靶向供体（CAG-AmCyan1-IRES-Neo-pA）。
将10 μg靶向供体和5 μg ZFN编码mRNA与小鼠ES细胞Nucreofector试剂盒（Amaxa Company）一起加入4.5 x 106个Oct4-Venus-阳性的ES细胞（Wistar-品系大鼠）（代数: 3）中，以实现核转染。将ES细胞接种到用2% 基质胶（BD Bioscience Company）包被的培养容器中的MEF上，并在补充了YPAC因子的培养基中进行培养。培养1天以后，以0.2 μg/ml的浓度，将遗传霉素加入培养基中。在培养9天时，采集46个遗传霉素抗性的集落，并培养。作为基因分型分析的结果，鉴别出已经发生同源重组的p53基因缺陷型ES细胞（p53+/-ES细胞[细胞系: p53+/C]）（图10B泳道2, 图10D）。发现46个集落中的1个已经发生双等位基因同源重组（p53-/-ES细胞[细胞系: p53C/C]）（2.2%）（图10B泳道7, 图10D）。发现46个集落中的7个已经发生单等位基因同源重组和单等位基因移码（p53-/- ES细胞[细胞系: p53C/Z]）（15%）（图10B泳道3和4, 图10C, 图10D）。作为对照，将10 μg单独的靶向供体核转染（nucleofect）进4.5 x 106个Oct4-Venus-阳性的ES细胞（Wistar-品系大鼠）（代数: 3）。将ES细胞接种到用2% 基质胶（BD Bioscience Company）包被的培养容器中的MEF上，并在补充了YPAC因子的培养基中进行培养。培养1天以后，以0.2 μg/ml的浓度，将遗传霉素加入培养基中。在培养9天时，采集14个遗传霉素抗性的集落，并培养。作为基因分型分析的结果，发现这些集落没有发生同源重组，并具有随机地整合在其中的靶向供体（p53+/+ ES细胞[细胞系: p53+/+（-ZFN）]）（图10B, 泳道5）。
（2）p53基因-缺陷型大鼠ES细胞（p53-/-）的制备
设计了识别大鼠p53基因（外显子4）的ZFN表达质粒（Sigma Company），和ZFN编码mRNA，并使用KOD Ver.2 DNA聚合酶（Toyobo Co., Ltd.），通过PCR，从大鼠基因组DNA制备出用图10A所示的短同源臂构建的靶向供体（其含有替代AmCyan1的tdTomato作为报道基因; CAG-tdTomato-IRES-Neo-pA）。
将10 μg靶向供体和5 μg 的ZFN编码mRNA与小鼠ES细胞Nucreofector试剂盒（Amaxa Company）一起加入在实施例9（1）中制备的2.5 x 106个p53+/- ES细胞[细胞系: p53+/C]（代数: 9）中，以实现核转染。将ES细胞接种到用2% 基质胶（BD Bioscience Company）包被的培养容器中的MEF上，并在补充了YPAC因子的培养基中进行培养。培养6天以后，采集表达tdTomato的红色荧光的8个集落，并培养（图11B）。作为基因分型分析的结果，发现3个集落（克隆编号1、3和8）已经发生同源重组（38%）（p53-/- ES细胞[细胞系: p53C/R]）（图11A）。
（3）使用p53基因缺陷型大鼠ES细胞（p53-/-）（p53+/-）制备嵌合大鼠
在添加YPAC因子的情况下，将在实施例9（1）中制备的p53+/- ES细胞[细胞系: p53+/C]和在实施例9（1）和（2）中制备的p53-/- ES细胞[细胞系: p53C/C, p53C/Z, p53C/R]（各12个ES细胞）注射进从怀孕4.5天的大鼠得到的胚泡中，并移植至怀孕3.5天的假妊娠大鼠（物种: LEA）的子宫角。
结果，当使用p53+/- ES细胞时，出现毛色嵌合体。另外，以高频率证实了嵌合大鼠胎儿的正常生长，p53+/- ES细胞的贡献百分比也高。
同时，当使用p53-/- ES细胞时，在209个嵌合大鼠胎儿中的184个中发生畸形。在6个p53-/- ES细胞克隆中发现了这些畸形（图12）。具有畸形的嵌合大鼠胎儿大部分遭受流产（图12A）。从2个p53-/- ES细胞克隆（p53C/C1、p53C/R2）发育成的嵌合大鼠胎儿在它们的头部中具有畸形（图12B中的左侧）。通过青色荧光证实，该表型可归因于p53-/- ES细胞对头部的高贡献（图12C中的左侧）。在209个正常生长的嵌合大鼠胎儿中的25个嵌合大鼠胎儿（图12B中的右侧）中，p53-/- ES细胞对头部的贡献低（图12C中的右侧）。与使用p53+/- ES细胞（25.2±5.7%）相比，当使用p53-/- ES细胞（85.5±2.6%）时，以明显更高的频率发生了嵌合体的异常生长。
表6
从不同的细胞克隆发育成嵌合大鼠的研究
Figure 972387DEST_PATH_IMAGE006
因此发现，使用YPAC因子建立的大鼠ES细胞即便在经历基因修饰（诸如在其建立以后在2个循环中的基因靶向）以后，也具有产生嵌合大鼠的能力。
常规地，因为耗费大量时间和成本来选择基因修饰ES细胞，已经使用单等位基因修饰ES细胞来制备具有双等位基因修饰目标基因的基因修饰动物。为此原因，绝对没有关于通过双等位基因地删除ES细胞中的靶基因来制备基因修饰动物的报道。在2010年，也报道，作为交配单等位基因缺陷的p53敲除大鼠（从p53基因单等位基因缺陷的ES细胞制备）的结果，出生了单等位基因缺陷的p53敲除大鼠（Nature vol.467, 211-215（2010）），但是没有报道，如在上面的实施例9中所述发生任何畸形。
在本发明中，通过双等位基因地修饰靶基因（基因破坏、突变等）来在大鼠ES细胞阶段产生基因修饰动物，可以缩短制备基因修饰动物所需的时间，所以认为会加速在个体水平的基因功能分析。也预见到，基因功能分析的可靠性和准确度与常规分析相比提高，并且会制备出更准确地反映实际状况的疾病动物模型。
工业实用性
通过使用本发明的方法，不论大鼠ES细胞的品系或宿主胚胎的品系如何，均可以制备出具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎；通过使用所述嵌合胚胎，可以高效率地制备传递种系的嵌合大鼠。由此可能容易地制备基因修饰大鼠（敲除大鼠、敲入大鼠等），所述大鼠可以广泛地用于多种药理学研究或生理学研究，以及用于再生医学研究等。
本申请是基于在日本于2009年12月1日提交的专利申请号2009-274008和于2010年7月23日提交的专利申请号2010-166571，它们的内容全部并入本文中。

Claims (18)

1. 一种制备嵌合胚胎的方法，所述方法包括下述步骤（a）和（b）：
（a）在ES细胞分化抑制剂的存在下使从雌性大鼠采集的受精宿主胚胎与大鼠多能干细胞接触的步骤，
（b）培养该与大鼠多能干细胞接触的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步骤。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中通过将大鼠多能干细胞注射进宿主胚胎中来实现所述接触。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤（a）中，在ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的存在下，使所述大鼠多能干细胞与所述宿主胚胎接触。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在与大鼠多能干细胞接触之前，在ES细胞分化抑制剂的存在下，预培养所述宿主胚胎。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中在ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的存在下，进行所述预培养。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在ES细胞分化抑制剂的存在下，进行步骤（b）中的培养。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中在ES细胞分化抑制剂和ROCK抑制剂的存在下，进行步骤（b）中的培养。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述ES细胞分化抑制剂由至少2种选自下述的药物组成：MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGFβ受体抑制剂和FGF受体抑制剂。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述ES细胞分化抑制剂由MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ受体抑制剂组成。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述大鼠多能干细胞是从这样的大鼠品系制备的多能干细胞：在步骤（a）中，在ES细胞分化抑制剂的非存在下与宿主胚胎接触时，所述大鼠品系不会生产传递种系的嵌合大鼠。
12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述宿主胚胎源自这样的大鼠品系：在步骤（a）中，在ES细胞分化抑制剂的非存在下与大鼠多能干细胞接触时，所述大鼠品系不会生产传递种系的嵌合大鼠。
13. 一种制备嵌合大鼠的方法，所述方法包括：将根据权利要求1-12中任一项所述的方法制备的嵌合胚胎移植进假妊娠的雌性大鼠的子宫或输卵管中，以使后代大鼠生出。
14. 一种制备大鼠的方法，所述大鼠具有大鼠多能干细胞对整个身体的贡献，所述方法包括：使嵌合大鼠与异性大鼠交配。
15. 一种用于制备嵌合大鼠的培养基，所述培养基包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和TGFβ抑制剂。
16. 根据权利要求15所述的培养基，所述培养基进一步包含ROCK抑制剂。
17. 一种基因修饰大鼠，其具有经历双等位基因基因修饰大鼠ES细胞的贡献。
18. 一种制备基因修饰大鼠的方法，所述方法包括对大鼠ES细胞进行双等位基因基因修饰的步骤。
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