WO2021193596A1

WO2021193596A1 - 一時処理培地、処理キット、胚発生停止抑制剤、胚発生停止抑制方法、発生工学産物作製方法、移植方法、治療方法、及び発生工学産物

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Publication number: WO2021193596A1
Application number: PCT/JP2021/011891
Authority: WO
Inventors: 恭光長尾; 遠藤　仁司; 坂下　英司; 司大森; 盛禎早川
Original assignee: 学校法人自治医科大学
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-09-30
Also published as: JPWO2021193596A1; US20230220331A1; EP4130244A1; EP4130244A4

Abstract

胚等の操作による胚発生停止を抑制する一時処理培地を提供する。一時処理培地は、多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む体外培養物への操作によるダメージを減少させる。このため、一時処理培地は、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む。この細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であることが好適である。具体的には、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｒｏｃｋ阻害剤を用いることが可能である。このＲｏｃｋ阻害剤は、例えば、Ｙ－２７６３２である。一時処理培地は、ダメージを伴う操作の前及び／又は後の特定期間、体外培養物を処理するのに用いられる。

Description

一時処理培地、処理キット、胚発生停止抑制剤、胚発生停止抑制方法、発生工学産物作製方法、移植方法、治療方法、及び発生工学産物

　本発明は、特に、体外培養物への一時処理を行うための一時処理培地、処理キット、胚発生停止抑制剤、胚発生停止抑制方法、発生工学産物作製方法、移植方法、治療方法、及び発生工学産物に関する。

　従来、発生工学や生殖医療が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル等で多用されてきている。配偶子の凍結および融解技術は必須の技術であるが、種によっては効率の低いことがある。生殖技術を実施の際に、卵などの配偶子が安定化され、凍結・融解操作、ＩＣＳＩ、核移植、キメラ胚作製、遺伝子導入操作などに耐えることが可能な技術、例えば胚を安定化する技術が求められている。たとえば、近年、疾患モデル動物の作製や遺伝子治療モデルの基盤研究として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ等のゲノム編集による遺伝子改変動物の作製が多く報告されている。
　遺伝子改変動物等を作製するためには、体外で胚を培養及び遺伝子を改変等の胚操作をする必要がある。
　しかし、体外で培養及び操作された胚はダメージを受けるため、系統や動物種によっては、個体まで作製できない場合が多かった。

　従来、非特許文献１を参照すると、組み換えＲｈｏキナーゼを細胞に導入等してＲｈｏキナーゼの作用を増強することで、凍結により細胞骨格にダメージをうけた胚の生存率を増加させると記載されている。このＲｈｏキナーゼは、セリン－スレオニンタンパク質リン酸化酵素の一種であり、相同性の高いＲＯＣＫ１とＲＯＣＫ２の二つのアイソフォームがある。いずれも細胞骨格に作用することにより、主に細胞の形状と動きの調節を含む、重要な生理機能に関連している。
　ここで、非特許文献１によれば、Ｒｈｏキナーゼの作用を抑える「Ｒｈｏキナーゼインヒビター」を用いると、胚の生存率が著しく下がることが記載されている（非特許文献１の要約等参照）。

　一方、特許文献１を参照すると、Ｒｈｏキナーゼインヒビターの一種であるＹ２７６３２を用いて、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を形成させる方法が記載されている。

国際公開第２０１８／１６４２４０号特開２０１５－７０８２５号公報

Ｇｕ他、「Ｒｈｏ／ＲｈｏＡ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｈａｔｃｈｅｄ　ａｎｄ　ｄｉａｐａｕｓｅｄ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ」、Ｓｃｉ　Ｒｅｐ、（米）、２０１７、７：６７０５Ｈｏｒｉｉ，Ｔ他、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ｖｉａ　ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｘ　ｓｉｔｅｓ」、Ｓｃｉ　Ｒｅｐ、（米）、７、：７８９１

　しかしながら、非特許文献１のＲｈｏキナーゼ増強では、遺伝子改変動物の作製の際に、胚のダメージを十分抑えることはできず、ダメージを伴う人工的胚操作等に感受性のある系統での個体の作製は、極めて難しかった。

　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

　本発明の一時処理培地は、多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む体外培養物への操作によるダメージを減少させるための一時処理培地であって、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含むことを特徴とする。
　本発明の処理キットは、前記一時処理培地を含むことを特徴とする。
　本発明の胚発生停止抑制剤は、アポトーシス抑制剤を含み、体外培養物への操作によるダメージを減少させ、胚発生停止を抑制することを特徴とする。
　本発明の胚発生停止抑制方法は、多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む体外培養物への操作によるダメージを減少させ、胚発生停止を抑制する胚発生停止抑制方法であって、ダメージを伴う操作の前及び／又は後の特定期間、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む一時処理培地で処理することを特徴とする。
　本発明の発生工学産物作製方法は、前記胚発生停止抑制方法により処理された前記体外培養物から、個体、器官、組織、及び細胞のいずれか又は任意の組み合わせを含む発生工学産物を作製することを特徴とする。
　本発明の移植方法は、前記胚発生停止抑制方法により処理された前記体外培養物、及び／又は前記発生工学産物作製方法にて作製された前記発生工学産物を移植することを特徴とする。
　本発明の治療方法は、哺乳類の治療方法であって、前記胚発生停止抑制方法により処理された前記体外培養物、及び／又は前記発生工学産物作製方法にて作製された前記発生工学産物を移植することを特徴とする。
　本発明の発生工学産物は、前記発生工学産物作製方法にて作製されたことを特徴とする。

　本発明によれば、ダメージを伴う人工的胚操作等に感受性のある系統でも個体の作製を行うことが可能な時処理培地を提供することができる。

本発明の実施の形態に係る胚発生停止抑制方法のフローを示す概念図である。本発明の実施例１に係る胚発生停止抑制方法及び発生工学産物作製方法により個体の作製が可能となった系統、操作の結果をまとめた表である。本発明の実施例１に係るＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いたエレクトロポレーションによるノックアウトマウスの作製例を示す表である。本発明の実施例１に係るＣ５７ＢＬ／６Ｊを用いた２ＳＴＥＰ法によるＦｌｏｘマウスを確認した電気泳動写真である。本発明の実施例１に係る異種マウスＭｕｓ　ｓｐｒｅｔｕｓ（アルジェリアハツカネズミ）の近交系ＳＰＲ２（異種マウス近交系ＳＰＲ２）の凍結卵から発生させた一個体の写真である。本発明の実施例１に係る異種マウスＭｕｓ　ｃａｒｏｌｉで樹立したＥＳ細胞の写真である。本発明の実施例１に係るＴｙｒ遺伝子をノックアウトしたＭｕｓ　ｃａｒｏｌｉを確認した電気泳動の写真である。本発明の実施例１に係る近交系ラットをゲノム編集した胚の状態を示す表である。本発明の実施例１に係る近交系ラットをゲノム編集した胚の状態を示す表である。本発明の実施例１に係る近交系ラットをゲノム編集した胚の状態を示す表である。本発明の実施例１に係る異種マウス近交系ＳＰＲ２をゲノム編集して発生した個体の写真である。本発明の実施例１に係る異種マウス近交系ＳＰＲ２をゲノム編集して発生した個体の写真である。本発明の実施例１に係る異種マウス近交系ＳＰＲ２をゲノム編集して発生した個体の写真である。本発明の実施例２に係る近交系ラットのエレクトロポレーションによるホモ大欠損ノックアウトを行い発生した個体の写真である。

＜実施の形態＞
　遺伝子改変動物等を作製するためには体外で多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、胚等（以下、「体外培養物」という。）を培養し、分子生物学的、遺伝子工学的、生殖工学的、発生工学的、生殖医療的、再生医療的、その他の各種技術による処理、処置、操作等（以下、単に「操作」という。）をする必要がある。しかし体外培養物の操作では、細胞にダメージを受けるため、系統や動物種によっては発生段階の停止（以下、「胚発生停止」という。）が生じる。このため、個体まで作製できない場合が多かった。
　そこで、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、操作によりダメージを受けた細胞に対して細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む一時処理培地で処理することで、ダメージを減少させ、胚発生停止を抑制することが可能であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

〔一時処理培地〕
　本実施形態の一時処理培地は、体外培養物への操作によるダメージを減少させるための一時処理培地であって、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含むことを特徴とする。
　ここで、本実施形態の体外培養物は、分子生物学、遺伝子工学、生殖工学、発生工学、生殖医療、再生医療等（以下、「発生工学等」という。）に用いられ、体外で培養や各種操作に用いられる動物の多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む。

　本実施形態の多能性幹細胞は、例えば、ヒトを含む哺乳類、その他の脊椎動物等の生物で各種細胞に分化可能な、多分化能を備える幹細胞（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）を含む。ここで、本実施形態の多能性幹細胞は、継代可能であり、継代しても分化が進まない状態を保ち、核型等が変化しにくく、又はエピジェネティックな表現型が変化しにくい性質を有することが好適である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、これに関連して、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で十分な増殖能力を備えていることが好適である。このような本実施形態の多能性幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、以下、「ＥＳ細胞」という。）、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、以下、「ｉＰＳ細胞」という。）、その他の人工的に生成され若しくは選択された多能性を備える幹細胞等が挙げられる。これら本実施形態の多能性幹細胞は、特定の遺伝子を含むレトロウイルスやアデノウイルスやプラスミド等の各種ベクター、ＲＮＡ、低分子化合物等により、体細胞を再プログラミングして作成された幹細胞であってもよい。

　加えて、本実施形態の多能性幹細胞としては、必ずしも全能性に近い多分化能を備えている細胞である必要はないものの、通常より多分化能が高いナイーブ（Ｎａｉｖｅ）な細胞を用いることも可能である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、下記で説明する生殖細胞とキメラ化することで個体として発生する等、後述する発生工学産物に分化する分化能力を備えることが好適である。
　また、本実施形態の多能性幹細胞は、フィーダー細胞上又はコラーゲン等の基底膜マトリックスをコーティングした細胞培養用プレート等で培養され、維持された後、これを取得したり、凍結保存したものを取得したりすることが可能である。

　さらに加えて、本実施形態の多能性幹細胞は、疾患の患者から得られた細胞から作成された細胞、その他の疾患のモデルとなる細胞、レポーター遺伝子が組み込まれた細胞（レポーター細胞）、コンディショナルノックアウトやノックインが可能な細胞、その他の遺伝子組み換えされた細胞等であってもよい。この遺伝子組み換えは、染色体内の遺伝子の追加や修飾や削除、各種ベクターや人工染色体による遺伝子等の付加、エピジェネティック制御の変更、ＰＮＡ等の人工遺伝物質の付加、その他の遺伝子組み換えを含む。

　本実施形態の生殖細胞は、始原生殖細胞、精原細胞、卵祖細胞、減数分裂をする前の生殖細胞、生殖細胞由来のその他の細胞、卵細胞、精子、単為発生可能な細胞、上述の多能性幹細胞とは異なる奇形腫形成能力のある細胞、その他、何らかの操作で個体発生する可能性のある細胞を含む。本実施形態に係る生殖細胞も、凍結保存されたものが解凍されたものが用いられてもよい。

　本実施形態の受精卵は、動物の卵細胞と精子とが受精された受精卵、単為発生卵、その他の発生可能な卵様細胞である。この受精卵は、体外受精や顕微授精で受精されたものであってもよく、卵割が開始され全分能がある時点で取得された細胞（受精卵クローンの細胞）等であってもよく、凍結保存されたものが解凍されたものが用いられてもよい。本実施形態では、その他、当業者に一般的に用いられる形式の受精卵を用いることが可能である。

　本実施形態の胚は、受精卵から卵割により細胞数を増やし、ある程度の数に達した段階の細胞塊である。本実施形態の胚は、分割胚、例えば、２細胞期胚を二分割した胚のような胚にも適用可能である。または、本実施形態の胚は、分割胚、例えば、２細胞期胚を二分割した胚のような胚であってもよく、桑実胚、原腸胚へと発達したものであってもよい。または、本実施形態の胚は、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）等であってもよい。
　ここで、本実施形態の胚は、多能性幹細胞から作成された始原生殖細胞等を用いて作成された、全能性をもつ細胞に由来した胚であってもよい。加えて、本実施形態の対象となる哺乳類の胚は、複数の種類の動物の細胞が混合されたキメラであってもよい。この際、キメラの胚に、哺乳類以外の動物の細胞等が組み合わせられていてもよい。
　また、本実施形態の胚処理の対象として、単なる胚ではなく、必ずしも個体や胎児に成長せず、各系統（系列）の組織や器官（臓器）にのみ分化するような胚様体についても適用可能である。この際、胚の一部を解析用に取り除いた胚、すなわちバイオプシーした胚も適用可能である。
　さらに、本実施形態の胚は、凍結保存されたものが解凍されたものが用いられてもよい。この凍結保存は、当業者に一般的な胚盤胞であってもよい。
　すなわち、本実施形態に係る体外培養物は、いずれも凍結保存されたものが解凍されたものが用いられてもよい。

　本実施形態に係る胚を得るための方法は特に限定されない。たとえば、本実施形態の胚は、体内受精、体外受精、核移植によって得ることができる。
　加えて、本実施形態の哺乳類の胚は、各種ベクター等により、遺伝子組み換えの手法で遺伝子を導入されたトランスジェニック、遺伝子ノックアウト、コンディショナルノックアウト等の手法で遺伝情報を加工された哺乳類の胚であってもよい。この遺伝情報の加工は、ゲノム編集等によるゲノム中への遺伝子導入若しくは除去であっても、プラスミドや人工染色体のような染色体外への遺伝子導入であっても、染色体の特定部位のメチル化の制御やヒストンの修飾等のエピジェネティック制御であっても、ＰＮＡや人工的な塩基の付加であってもよく、その他の各種遺伝情報の加工手法が使用可能である。

　ここで、本実施形態の体外培養物は、各種マーカーや目視等によりコロニー等の形式で選択したものであってもよい。また、本実施形態の体外培養物は、混合細胞集団、組織、臓器等（以下、「組織等」という。）であってもよい。これらの体外培養物は、様々な分化や発生の状態のものを混合して含んでいてもよい。すなわち、体外培養物に属する各細胞は、発生の段階にあって十分分化していなかったり、未成熟であったりしてもよい。

　本実施形態の体外培養物が属する動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。
　本実施形態の胚処理の対象となる哺乳類は、例えば、霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）、奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）、又は食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）由来であり、例えば、それぞれの目や種毎に異なる胚用に用意した、本実施形態の一時処理培地で処理可能である。なお、これらの目以外の稀少な哺乳類を含む、真獣下綱（Ｅｕｔｈｅｒｉａ）の有胎盤哺乳類の胚について、本実施形態の胚処理の対象としてすべて適用可能である。

　本実施形態の体外培養物が属する動物について、上述の目単位とは異なる観点で説明すると、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）、実験動物、家畜、伴侶動物等が挙げられる。このうち、実験動物としては、齧歯目の動物として、マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ　ａｕｒａｔｕｓ）、モルモット（Ｃａｖｉａ　ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）等が挙げられる。ウサギ目の動物としては、ウサギ（Ｌｅｐｏｒｉｎａｅ　Ｔｒｏｕｅｓｓａｒｔ）等が挙げられる。家畜としては、例えば、鯨偶蹄目の動物として、ブタ（Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ　ａｒｉｅｓ）等が挙げられる。奇蹄目の動物としては、ウマ（Ｅｑｕｕｓ　ｃａｂａｌｌｕｓ）等が挙げられる。また、伴侶動物としては、食肉目の動物として、ネコ（Ｆｅｌｉｓ　ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ　ｃａｔｕｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ　ｌｕｐｕｓ　ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ　ｐｕｔｏｒｉｕｓ）等が挙げられる。また、ヒト以外の霊長目の動物としては、類人猿であるゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ）やチンパンジー（Ｐａｎ　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲサル（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）、その他の真猿類（Ｓｉｍｉｉｆｏｒｍｅｓ）、それ以外の霊長類等が挙げられる。この他にも、上述の例とは種が異なる異種の動物、例えば、齧歯目としては、後述の実施例で記載したオキナワハツカネズミ（Ｍｕｓ　ｃａｒｏｌｉ）、アルジェリアハツカネズミ（Ｍｕｓ　ｓｐｒｅｔｕｓ）、及びこれらの亜種等も挙げられる。このうち、本実施形態に係る亜種は、分類上の亜種、ミトコンドリアＤＮＡの配列等が既存のものと少なくとも一部は異なっているもの等てあってもよい。また、いわゆる「野生種」として、ゲノム情報的なバリエーションがある種や亜種が設定されてもよい。これに加え、上述の他の目の異種についても含まれてもよい。これら異種の動物は、本実施形態においては、便宜上、「異種マウス」「異種ラット」「異種ネコ」のように、見た目や性質等が近い動物に対応付けて称呼する。さらに、上述の実験動物、家畜、伴侶動物等の分類は、便宜上のものであり、それぞれ別の目的、更に、繁殖目的や医療目的等でも用いられる。さらに、本実施形態係る動物は、既に遺伝子改変された動物、交配による遺伝子改変が生じた動物、系統化された動物、その他の遺伝的に改変された動物であってもよい。
　また、本実施形態の動物は、無脊椎動物等であっても、脊索動物、軟体動物、環形動物、節足動物等の卵割を行い発生する動物も広く含む。

　本実施形態の体外培養物が属する動物は、特に、本実施形態の操作に感受性があり、胚発生停止が起こりやすい系統の哺乳類に由来してもよい。さらに、後述する実施例で示すように、このような哺乳類は、遺伝子的背景が明らかな状態の雑種である交雑系（ｈｙｂｒｉｄ）、主に兄妹、姉弟同士の近親交配を２０世代以上継続して得られた動植物の系統である近交系（Ｉｎｂｒｅｄ　ｓｔｒａｉｎ）等であってもよい。さらに、ヌードマウス等のミュータント（遺伝子変異）系の動物、所定の疾患モデル動物、又は、種として変化した異種の動物、種同士の交雑（Ｈｙｂｒｉｄ）動物等であってもよい。さらに、人工的に品種改良、種として固定された動物、亜種等も含む。

　ここで、本実施形態の体外培養物への操作（人工的胚操作等、以下、単に「操作」という。）は、発生工学等に必要な体外培養物のダメージを伴う処理を含む。この操作は、体外培養物自体への操作に加え、体外培養物の取得に伴う母体や生殖細胞等への操作も含む。また、体外培養物のダメージは、体外培養物を取得してからの実験や処理等の各種操作に伴うダメージを含む。具体的には、このダメージは、核を含む細胞内器官、遺伝子を含むＤＮＡ、細胞内骨格、その他の細胞内の各種構造物、細胞膜、及び細胞外の構造物である細胞外マトリックス等、細胞の生存や正常な分化等に必要な各種構造の損傷又は変質等を含む。特に、本実施形態においては、細胞に与える物理的又は器質的なストレス、電離、細胞内小器官の破壊等に伴う活性酸素、化学物質による損傷等により、核内のＤＮＡにニック（Ｎｉｃｋ）や二重鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）が生じるような操作であってもよい。
　そして、これらのダメージは、細胞が代謝することで少なくとも一部は回復可能であってもよい。逆に、細胞がダメージから回復しない場合には、セルサイクルの停止、分化の停止や変化、アポトーシス、ネクローシス、その他の正常とは異なる状態に変化する。

　具体的には、本実施形態の体外培養物への操作は、例えば、胚（細胞）へのダメージを伴う処理として、胚の易供給性に関する母体への過排卵処置、凍結胚の移植に伴う胚の凍結又は解凍、細胞の解離、核移植（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＮＴ）、顕微授精（卵細胞質内精子注入法、体外受精、ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐｅｒｍ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＣＳＩ）、マイクロインジェクション（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＭＩ）、エレクトロポレーション（電気穿孔法、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、ＥＰ）等を含む。または、核及び核内のＤＮＡへのダメージを伴う処理としては、多量又は高分子（長い配列の）ＤＮＡやＲＮＡの暴露、後述する複数回のＤＳＢを伴う処理等を含む。さらに、細胞融合等の操作も、本実施形態の操作に含む。細胞融合等においては、異数体、４倍体等の倍数体の細胞の作成も含まれる。

　これらに加えて、本実施形態の体外培養物への操作は、浸透圧変化、その他の化学物質による穿孔、鉗子等による穿孔、体外受精（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ＩＶＦ）、等の各種処理を含む。これらの処理は、上述のように、発生工学等の目的で、核、染色体、ＤＮＡやＲＮＡ等を体外培養物へ導入するために行われるものを含む。この導入は、各種媒体を用いて行われてもよい。この媒体としては、例えば、プラスミドやウイルスベクター、リポソーム等のＤＤＳ（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ）、その他の高分子を細胞内に導入する各種手法を用いてもよい。このうち、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の当業者に一般的なウイルスを用いて構成されてもよい。さらに、これらの媒体を使用する際に、上述の操作を行ってもよい。または、上述の多能性幹細胞等を作製するために、上述の操作を行うことも可能である。なお、未熟卵体外成熟（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ、ＩＶＭ）、胚移植（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＢＴ）等に関連する各種の処理も、本実施形態の操作に含まれてもよい。この胚移植は、当業者に一般的な卵管への外科的な移植、非外科的な子宮への移植等も含む。

　より具体的には、本実施形態の体外培養物への操作は、複数回のＤＳＢを伴う処理等、体外培養物へ大きなダメージを与える処理を行う各種手法も含まれる。このような複数回のＤＳＢを伴う処理としては、例えば、複数個所の遺伝子変異動物の作製が挙げられる。この複数個所の遺伝子変異動物は、例えば、遺伝子ノックアウト、ノックイン、コンディショナルノックアウト動物等を作製する手法も含む。より具体的には、コンディショナルノックアウト動物を作成するための２ＳＴＥＰ法等も含む。２ＳＴＥＰ法は、連続してエレクトロポレーションを行い、２箇所にＦｌｏｘ配列をゲノム編集にて挿入させる方法である（例えば、非特許文献２参照。）。これにより、標的となる遺伝子領域を、Ｃｒｅリコンビナーゼ標的配列ｌｏｘＰで挟んだ遺伝子座を持つ動物（Ｆｌｏｘ動物）を作製可能である。

　本実施形態の細胞内骨格調整剤は、細胞内骨格に関連するタンパクの重合、脱重合、集合、解離、動作等を調整する物質である。本実施形態の細胞内骨格は、細胞骨格、核骨格、膜構造体、その他の細胞内の骨格的な構造を構成するアクチンフィラメント、微小管、中間径フィラメント等の構造タンパク質の重合体や集合体等を含む。具体的には、本実施形態の細胞内骨格調整剤は、例えば、ＤＳＢ修復に関連する核内外のアクチン、ミオシンの重合や脱重合等に関与するような物質であってもよい。ここで、ＤＳＢ修復の活性は細胞周期によって異なり、受精卵から初期胚の発達段階において、主要な細胞周期が体細胞とは異なっていることが知られている。このため、本実施形態委の細胞内骨格調整剤は、これらの細胞周期の期間やこの割合に合わせ、細胞周期を調整する物質を用いることが可能である。すなわち、細胞内骨格調整剤により、細胞内骨格の重合、脱重合、集合、解離等を調整することで、後述する操作によりダメージを受けた核内のＤＮＡのＤＳＢ修復を促進することが可能である。これにより、ダメージによる発生停止を抑えることが可能となる。

　また、本実施形態のアポトーシス抑制剤は、発生段階又は維持段階の細胞のアポトーシスを遅延及び／又は抑制する物質である。これは、上述の細胞内骨格調整剤におけるＤＳＢ修復や細胞周期の調整に伴って、アポトーシスを遅延及び／又は抑制する効果、作用を伴う物質を含む。すなわち、細胞内骨格調整剤及びアポトーシス抑制剤は、同じ物質であってもよい。

　ここで、本実施形態の細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤は、例えば、タンパク質、核酸、低分子化合物、その他の各種有機化合物等であり、特に限定されない。

　本実施形態においては、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤は、例えば、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｏｃｋ１又はＲｏｃｋ２）の阻害剤を用いることが好適である。
　このＲｈｏキナーゼ阻害剤は、例えば、Ｒｏｃｋ阻害剤を用いることが好適である。
　このＲｏｃｋ阻害剤は、例えば、Ｙ－２７６３２（ｔｒａｎｓ－４－［（１Ｒ）－１－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］－Ｎ－４－ｐｙｒｉｄ　ｉｎｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｆａｓｕｄｉｌ（１－（５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）又はＨ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－４－Ｇｌｙｃｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１－［（４－ｍｅｔｈｙｌ－５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］－ｈ　ｅｘａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－１，４－ｄｉａｚｅｐｉｎｅ）等を用いることが可能であるが、これに限定されない。これ以外のＲｏｃｋ阻害剤についても、好適に用いることが可能である。

　本実施形態の一時処理培地に含まれるＲｏｃｋ阻害剤の濃度は、体外培養物の種類、状態、密度、操作の種類や内容、その他の条件等に応じて、当業者により適宜設定可能である。このＲｏｃｋ阻害剤の濃度は、例えば、非特許文献１で示された「最適」濃度２０μＭ（非特許文献１のｐ．６、第４段落等参照。）の１／２～１／１００程度の低濃度であってもよい。すなわち、Ｒｏｃｋ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼの活性を必ずしも完全に抑制する濃度でなくてもよい。
　具体的には、本実施形態の一時処理培地に含まれるＲｏｃｋ阻害剤の濃度は、例えば、Ｙ－２７６３２であれば、０．１μＭ～２０μＭ、好ましくは５μＭ～１５μＭ、より好ましくは８μＭ～１２μＭであることが好適である。後述の実施例では、Ｙ－２７６３２について１０μＭの濃度で含まれる一時処理培地で一時処理をする例について記載している。

　この他にも、本実施形態においては、通常の細胞において、アポトーシス抑制作用の認められない又は少ない細胞内骨格調整剤を用いることも可能である。
　本実施形態において、このような細胞内骨格調整剤として、例えば、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ、ＣＡＳ番号：１４９３０－９６－２、２Ｈ－Ｏｘａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃｉｎｏ［２，３－ｄ］ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ－２，１８（５Ｈ）－ｄｉｏｎｅ，　６，７，８，９，１０，１２ａ，１３，１４，１５，１５ａ，１６，１７－ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒｏ－５，１３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－９，１５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１４－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ－１６－（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）－，　（３Ｅ，５Ｒ，９Ｒ，１１Ｅ，１２ａＳ，１３Ｓ，１５Ｓ，１５ａＳ，１６Ｓ，１８ａＳ）－）を用いることも可能である。
　サイトカラシンＢを用いる場合、Ｙ－２７６３２の１／２０～１／５等の用量でも、同様の効果を得ることが可能である。具体的には、サイトカラシンＢは、０．０１μＭ～１５μＭ、好ましくは１μＭ～１２μＭ、より好ましくは３μＭ～８μＭであることが好適である。すなわち、サイトカラシンＢは、Ｙ－２７６３２よりも数μＭ少ない量の方が、良好な結果を得られる。

　その他の細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤の場合、上述の濃度の範囲から設定できる。加えて、本実施形態の細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤の濃度は、後述する各期間において、一定でもよく、各期間において変化させてもよく、それぞれの期間で段階的に変化させてもよい。

　加えて、本実施形態に係る細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤は、本実施形態に係る胚発生停止抑制剤の一例である。上述したように、これら胚発生停止抑制剤は、多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む体外培養物への操作によるダメージを減少させ、胚発生停止を抑制する。また、本実施形態に係る胚発生停止抑制剤は、本実施形態に係る一時処理培地用に用いられる。

　その他に、本実施形態の一時処理培地は、体外培養物の種類、状態、密度、操作の種類や内容、その他の条件等に応じた成分を含む。
　この成分としては、例えば、体外培養物を培養するのに必要な培地を構成するための成分及び水を含んでいてもよい。たとえば、本実施形態の一時処理培地は、ｐＨバッファー化合物、アミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、抗生物質、コラーゲン前駆体、微量金属イオンや錯体、各種塩等が加えられて使用されてもよい。
　より具体的には、本実施形態の一時処理培地は、例えば、当業者が体外培養物の培養に一般的に使用する培地の成分を含んでいてもよい。この培地としては、例えば、一般的なＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）等の培地を用いることが可能である。または、多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、胚等に特化した特定成分を含む培地等を用いることが可能である。加えて、培地には、血清や各種血清代替物が含まれていてもよい。この各種血清代替物が含まれた培地は、異種由来成分不含有（Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ、ＸＦ、又はＡｎｉｍａｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ、ＡＣＦ）の培養系で使用されてもよい。

　さらに、培地には、分化や生育を促進するための各種ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質等も含んでいてもよい。これらは、各種分化誘導因子、成長因子等を含む。また、操作の種類によって必要なレチノイン酸のような分化誘導用の低分子化合物等を含んでいてもよい。
　または、本実施形態の一時処理培地は、ＰＢＳのように、細胞が短い期間で死滅しないようにした成分のみが含まれていてもよい。

〔処理キット〕
　本実施形態の処理キットは、上述の一時処理培地を含んで構成されることを特徴とする。これに加えて、本実施形態の処理キットは、各種の操作に合わせた操作用の溶液（用液）、通常培養時に用いる通常培地、操作の種類に応じた操作用の培地（以下、「操作溶液」という。）、その他の操作に必要な試薬を含んでいてもよい。このような試薬としては、例えば、本実施形態のプローブやプライマー、各種酵素、緩衝液、洗浄液、溶解液、検査用の試薬等も含まれる。
　加えて、本実施形態の操作に必要な体外培養物、容器、その他の資材、器材、道具類等を加えて、本実施形態の処理キットとして提供されてもよい。さらに、本実施形態の処理キットは、後述する発生工学産物を維持するための試薬、食餌、ケージ、飲料水、その他のものが含まれていてもよい。
　加えて、後述する治療に必要な担体その他の試薬を含んだ構成の処理キットを提供することも可能である。
　さらに、通常培地に付加して一時処理培地として完成するような細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤と、濃度や処理方法を記載したマニュアル等を添付した処理キットとして提供することも可能である。

〔胚発生停止抑制方法〕
　本実施形態の胚発生停止抑制方法は、体外培養物への操作によるダメージを減少させ、胚発生停止を抑制する方法である。具体的には、本実施形態の胚発生停止抑制方法は、操作の前及び／又は後の特定期間、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む一時処理培地で処理することを特徴とする。

　具体的に、図１を参照して、本実施形態の胚発生停止抑制方法の主な流れについて説明する。
　本実施形態の胚発生停止抑制方法においては、処理の期間及び期間を適切に設定することが好適である。具体的には、体外培養物を準備した後、第一特定期間、本実施形態の一時処理培地にて一時処理を行う。その後、第一待機期間、通常培地又は操作溶液に替えて、待機してから、操作を行う。その後、第二特定期間、本実施形態の通常培地に替えて、待機する。そして、本実施形態の一時処理培地に替えて、もう一度、一時処理を行う。さらに、場合によっては、第三待機期間、待機してから、その後の処理を行う。

　より具体的に説明すると、まず、本実施形態の胚発生停止抑制方法では、処理を行う体外培養物を用意する。この用意は、体外培養物の採取、冷凍保存されていたものの解凍、コロニーのピックアップ、細胞塊の解離、培養液をミネラルオイル等で被覆するドロップの作製等の各種準備処理を含む。

　次に、用意された体外培養物への操作の前の第一特定期間だけ、本実施形態の一時処理培地による処理を行う。この第一特定期間は、後に行う体外培養物の種類や操作の種類に応じて適宜設定可能である。第一特定期間は、例えば、１分～２時間程度であることが好適であり、１５分～１時間程度であることがより好適であり、３０分～１時間程度であることが更に好適である。この第一特定期間の一時処理を行うことで、体外培養物の胚発生停止抑制効果を高めることができる。なお、種や系統によっては、第一特定期間の一時処理は、行わなくてもよい。

　次に、この一時処理培地で処理された体外培養物を遠心器等で回収して、血清等をあまり含まない最小培地やＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）等の洗浄液で洗浄して再度回収し、通常培地に移す。この通常培地は、操作を行う前段階で通常用いられる培地であり、ＤＭＥＭ培地、無血清培地、ＰＢＳ自体等、操作の種類によって適宜設定される。そして、通常培地に移された体外培養物は、操作まで第一待機期間、待機される。この第一待機期間は、例えば、１分～２時間程度であることが好適であり、１５分～１時間程度であることがより好適である。この範囲より長いと、体外培養物の胚発生停止抑制効果が十分得られないことがある。
　なお、この第一待機期間は、なくてもよい。つまり、一時処理培地を洗浄して、操作溶液（操作用の培地等）や通常培地に替え、体外培養物を投入等して、そのまま操作を行ってもよい。

　次に、上述の体外培養物への操作が行われる。この操作により、体外培養物にダメージが生じることがある。この際、操作の種類によっては、体外培養物を操作溶液に投入してから、操作を行う。なお、操作の種類によっては、通常培地又は一時処理培地のままで操作を行うことも可能である。

　その後、操作が行われた体外培養物は、回収され、通常培地に移されて、第二待機期間だけ待機される。この第二待機期間は、操作の種類や内容等により適宜設定可能である。具体的には、この第二待機期間は、例えば、１分～２時間程度であることが好適であり、１５分～１時間程度であることがより好適である。または、この第二待機期間を経ることなく、すぐ下記の一時処理を行うことも可能である。すなわち、第二待機期間も、なくてもよい。

　ここで、体外培養物への操作の前の第二特定期間だけ、本実施形態の一時処理培地による処理を行う。この第二特定期間は、動物種、系統、操作の種類等により、最適な値を当業者により調整可能である。具体的には、非近交系等、操作しても胚発生停止が起こりにくい、すなわち、操作に感受性が低い体外培養物を用いる場合には、第一特定期間より第二特定期間を長くすることが可能である。たとえば、未凍結で近交系のマウスやラットについては、この第二特定期間として、１～１２時間のような長い時間、本実施形態の一時処理培地で一時処理をすることが可能である。この場合、１時間よりも特定程度長い方が、胚発生停止を抑制する効果が高くなる。または、ブタについては、第二特定期間として、１時間～３日間という長い期間、本実施形態の一時処理培地で一時処理をすることが可能である。
　逆に、近交系や異種等の操作に感受性がある体外培養物を用いる場合は、第二特定期間を第一特定期間と同じ程度か少し長い程度にして、その後、通常培地下記で説明する第三待機期間、待機するのがよい。同様に、冷凍卵や胚を用いた場合、未凍結の体外培養物よりも操作よるダメージの耐性が低く、ＤＮＡ等のダメージにより胚発生停止が起こりやすい、すなわち、操作に感受性があるため、第二特定期間を短くすることが好適である。
　このように構成することで、胚発生停止抑制効果をより高めることができる。

　その後、操作が行われた体外培養物は、回収されて通常培地に移される。そして、場合によっては、第三待機期間、待ってから、子宮への移植等の操作が行われてもよい。
　さらに、その後、発生段階まで待機され、後述する発生工学産物として取得される。

　これらの一時処理培地による処理の特定期間の間に、細胞内に細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤が浸漬され、核骨格におけるＤＳＢ修復の活性を亢進させたり、ＤＳＢ修復の活性が高い細胞サイクルまで細胞サイクルを調整したり、細胞サイクルの進展に伴う細胞内骨格の重合や脱重合を調整したりして、本来ならダメージによりアポトーシスやセルサイクル停止等の経路が惹起されるところを抑制することで、操作によるダメージの耐性が上昇すると推測される。この上で、通常培地に移されることで、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤による悪影響を抑え、正常な細胞サイクルへ復帰させ、細胞内骨格の重合や脱重合を正常なレベルに戻し、細胞が自ら修復されることで胚発生停止が抑制されると推測される。

　上述の各期間のいずれを用いるか、及び、各期間の長さは、動物種、系統、操作の種類等により、最適な値を当業者により調整可能である。
　下記に、実際の処理時間についての具体例をまとめたものを示す。

　この表で示すように、マウス又はラットにおいては、未凍結の卵又は胚を用いる未凍結近交系の場合、第一特定期間は３０～１時間、第一待機期間は０～１時間、第二待機期間は０～１時間、第二特定期間は１～１２時間であることが好適である。または、凍結卵又は凍結胚を用いる凍結近交系の場合、第一特定期間は３０～１時間、第一待機期間は０～１時間、第二待機期間は０～１時間、第二特定期間は３０分～１時間、第三待機期間は１～１２時間であることが好適である。または、凍結又は未凍結の野生マウス若しくはラット、異種マウス若しくはラット等の近交系の場合、第一特定期間は３０～１時間、第一待機期間は０～１時間、第二待機期間は０～１時間、第二特定期間は３０分～１時間、第三待機期間は１～１２時間であることが好適である。ブタにおいては、ＩＶＭ、ＩＶＦ胚の場合、第一特定期間は３０～１時間、第一待機期間は０時間、第二特定期間は０時間、第二特定期間は１時間～３日間であることが好適である。

　なお、これらの一時処理培地での処理は、上述のように、操作の前の処理のみ行っても、操作の後の処理のみ行ってもよい。操作の前及び後の一時処理培地の処理を両方行うことで、動物種、系統、操作の種類によっては、胚発生停止の抑制効果を高めることが可能である。加えて、一時処理培地での処理を操作の前又は後で行う場合に、第一特定期間、第一待機期間、第二待機期間、第二特定期間は異なってもよく、その際の一時処理培地に含まれる各細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤の濃度も異なってもよい。これらは、当業者により最適化して調整可能である。
　さらに、操作の前及び／又は後に一時処理培地での処理を複数回行ってもよい。この場合、処理の後の通常培地への変更後に待機期間を設けることが好適である。

〔発生工学産物作製方法、発生工学産物〕
　本実施形態の発生工学産物作製方法は、上述の胚発生停止抑制方法により処理された体外培養物から、発生工学産物を作製することを特徴とする。
　本実施形態の発生工学産物は、上述の発生工学産物作製方法にて作製されたことを特徴とする。
　ここで、本実施形態の発生工学産物は、個体、器官、組織、及び細胞のいずれか又は任意の組み合わせを含む。このうち、個体としては、キメラ個体、モデル生物、その他の実験、生殖工学、医療上に必要な個体を含む。器官や組織は、必ずしも臓器のレベルまで成熟したものでなくてもよく、特定の分化した細胞が細胞塊として特定の構造を備えていればよい。さらに、細胞は、特定の構造がない細胞塊が解離されたものを含む。

　本実施形態によって作製された発生工学産物は、従来の手法では不可能な動物、系統等で可能とするものを得られ、更に、ダメージによる突然変異等も少ないため、当業者に区別可能である。しかしながら、本実施形態の当業者の属する分野において、その構造又は特性により、直接特定することは、当業者にとって非常に難しいという特段の事情が存在する。

〔創薬支援方法〕
　本実施形態の創薬支援方法は、本実施形態の発生工学産物作製方法にて作製された発生工学産物を評価することを特徴とする。
　加えて、本実施形態の創薬支援方法は、発生工学産物に対して、創薬のための毒性及び／又は疾患に関する薬物を投与し、発生工学産物の状態を評価することも可能である。

　本実施形態の創薬のための毒性及び／又は疾患に関する薬物としては、毒性を調べる必要のある薬剤スクリーニングの候補薬物、疾患を治療するための候補薬物等を用いることが可能である。本実施形態の候補薬物は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、細胞の抽出物や上清や発酵産物、その他の合成化合物や天然化合物等が挙げられる。これらの候補薬物は、純度や精製度等が任意であってもよい。また、本実施形態の薬剤スクリーニングが対象とする疾患は、任意の疾患を含む。
　これらについて、発生工学産物のマーカー遺伝子等の発現解析、形態解析等を行うことで、毒性の評価が可能である。さらに、臨床試験のプロトコルに合わせたり、当業者に任意の方法を用いたりして、スクリーニングを行ってもよい。
　これらの解析において、候補薬物を投与した細胞において、正常な機能が維持された場合に、当該候補薬物が毒性の少ないものと推定可能である。

〔治療法、移植方法、医薬〕
　本実施形態の治療方法は、哺乳類の治療方法であって、上述の胚発生停止抑制方法により処理された体外培養物、及び／又は上述の発生工学産物作製方法にて作製された発生工学産物を移植することを特徴とする。

　本実施形態の治療方法は、例えば、凍結受精卵や胚盤胞等に、本実施形態の胚発生停止抑制方法を適用して、生殖医療に用いることが可能である。これにより、例えば、遺伝的背景、高齢、各種疾病等で胚の定着が難しい母体についても、適用可能となる。この際、本実施形態の発生工学産物を母胎に移植することで、本実施形態の移植方法は、治療方法としても機能する。

　または、本実施形態の治療方法として、上述の発生工学産物作製方法にて作製された発生工学産物そのもの、又は加工若しくは抽出したものを本実施形態の医薬（医療用組成物）として取得し、治療に用いてもよい。すなわち、本実施形態の治療方法においては、再生医療として、ヒトを含む動物の疾患を治療するために用いることが可能である。

　この本実施形態の治療方法の際、まず、本実施形態の発生工学産物は、患者から取得して作成又は生成された多能性幹細胞、又は、ＨＬＡ等の型が近い多能性幹細胞のライブラリー等から取得される。これらの細胞は、上述の操作で製造されても、製造されたものについて操作が行われてもよく、これらの操作の前及び／又は後に、上述の一時処理培地で処理されてもよい。取得された多能性幹細胞等は、分化誘導され、その後、特定期間培養され、細胞、細胞塊、組織、又は器官等のいずれかの段階で、本実施形態の発生工学産物として取得される。取得された発生工学産物は、解離等されて加工されてもよい。そして、これらのいずれかの期間、一時処理培地で処理される。
　これらの取得された発生工学産物は、疾患等の患者の疾病の部位に注入、シートや組織や臓器の少なくとも一部として移植等の治療に用いることができる。この際、本実施形態の発生工学産物を、当業者に用いられる培養器材を用いて単層又は多層のシートを作成し、患患に移植してもよい。さらに、本実施形態の細胞を、適切な担体を用いて培養したり、３Ｄプリンター等を用いて積層したりして、より組織化された培養物を移植することも可能である。
　すなわち、本実施形態の移植方法は、本実施形態の治療方法としても機能する。
　さらに、本実施形態の発生工学産物を、医薬として用いることも可能である。

　なお、本実施形態の移植方法、治療方法を哺乳類の内、ヒトに適用する場合、各種生殖医療の倫理に則って、必要な範囲、限度での実施を行うようにする。すなわち、遺伝子改変等は通常はしないようにし、目的上、遺伝子改変等が必要であっても、例えば、遺伝疾患や感染症予防等の特定の基準に従って、最低限の程度で実施する必要がある。
　また、本発明を日本国で実施する場合、培養物の提供より後の移植、治療は医師により行われる。このため、本発明の治療方法の「動物」は、ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）を含まないものとする。一方、それ以外の国においては、「動物」「治療法」の定義は、限定されない。

　一方、本発明の実施の形態に係る医薬は、ヒト以外の動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、上述の霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）、又は奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）、食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）の各種の動物であってもよい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、フェレット、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類等であってもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
　すなわち、本発明の実施の形態に係る医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。

　加えて、本発明の実施の形態に係る医薬は、動物の体内の一部分、又は動物から摘出又は排出された臓器や組織等についても、治療用の対象とすることができる。さらに、この治療は広義の治療であり、バイオリアクター、モデル動物での培養、人体移植用の培養臓器の培養等にも適用可能である。
　加えて、本実施形態の発生工学産物は、再生医療以外の治療用途、例えば、バイオリアクター、人工臓器の製造、クローン個体の作成等、各種用途に使用可能である。

　本発明の実施の形態に係る治療法を行う際に、発生工学産物の投与間隔及び投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
　本発明の実施の形態に係る発生工学産物の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
　投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。

　加えて、本発明の発生工学産物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の発生工学産物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
　また、本発明の実施の形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。

　以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
　従来から、遺伝子改変動物等を作製するためには体外で胚を培養し、遺伝子を改変等の胚操作をする必要がある。しかし体外で培養及び操作された胚はダメージを受けるため、系統や動物種によっては個体まで作製できない場合が多い。
　たとえば、従来の方法で近交系の動物を用いた場合、大量の受精卵を用いる必要があった。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法で、近交系Ｃ５７ＢＬ／６をゲノム編集するには大量の受精卵を必要とした。しかも、体外の複数回の胚操作を行った場合、胚発生は、ほぼ停止した。つまり、近交系Ｃ５７ＢＬ／６は、１度のエレクトロポレーション操作しかすることができなかった。これは、近交系Ｃ５７ＢＬ／６の場合はダメージに対する耐性が低いためであった。

　ここで、複数個所の遺伝子変異マウス、Ｆｌｏｘマウス、ノックインマウス等は、様々な方法で、作製できると報告されているものの、実際に作製可能な動物種及び系統は限定的であった。

　また、複数回の操作が必要な場合はダメージに耐性を持つ非近交系（ＢＤＦ１等）を使用していた。具体的には、疾患モデル動物の作製や遺伝子治療モデルの基盤研究として、近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ等のゲノム編集による遺伝子改変動物の作製が多く報告されている。しかし、現在、人工的胚操作に耐性の高い、限られた動物の特定の系統（例えば、マウス交雑系統）の報告以外は極めて少なかった。
　たとえば、胚操作によるダメージが最も高いと思われる２ＳＴＥＰ法では、動物実験に汎用される純系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６等）での成功例は、報告されていなかった。
　また、胚操作に耐性の高い交雑系マウスにおいても、ダメージの高い胚操作では多くの胚が成熟停止や発生停止となり、目的の遺伝子改変動物の確実な作製のためには、大量に受精卵の供給が必要であった。

　すなわち、従来の遺伝子改変動物等の作製では、まず体外での培養及び操作に耐えうる動物種や系統を選別することが必要であり、更にそれらの受精卵を大量に用いること、及び胚操作のダメージを極力減らすことが必要であった。

　これに対して、本発明の実施の形態に係る一時処理培地は、体外培養の操作による胚等へのダメージを減少させ、効率的に個体、器官、組織、及び細胞等の作製を行うことが可能となる。
　すなわち、操作に耐性の低い系統の受精卵等を操作する際の特定時期に、ダメージから守り安定化させる細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む一時処理培地で処理することで、胚発生停止を抑制し、胚盤胞への発生や個体作製が可能となる。これにより、実験に汎用される近交系マウスの胚操作を容易にし、胚操作に必要な受精卵数を削減させ、個体作製の効率を上昇させることが可能である。すなわち、大量の受精卵を得ることが難しく、体外培養や操作に抵抗性が低い動物種や系統の初期胚から効率的に遺伝子改変等の個体、組織、器官、及び細胞等を得ることが可能となる。このため、遺伝子改変動物等を作製する発生工学における基幹技術として利用可能である。

　具体的には、下記の実施例で示すように、本実施形態のアポトーシス抑制物質を含む一時処理培地により、でエレクトロポレーション後に起きる胚発生停止がほとんどなくなり、ゲノム編集に必要な近交系Ｃ５７ＢＬ／６受精卵数が通常数で十分となる。また、複数回の操作の必要が必要な２ＳＴＥＰ法によるＦｌｏｘマウスの作製が近交系Ｃ５７ＢＬ／６で可能であった。さらに、従来不可能であった異種マウスを用いて、ＥＳ細胞を確立したり、個体を作製したりすることが可能となった。

　すなわち、本実施形態の一時処理培地を用いることで、
　１．少量の受精卵で、個体作製が可能となる。
　２．体外の複数回の胚操作が可能となる。
　３．複数個所の遺伝子変異、Ｆｌｏｘ、ノックインなど様々な方法で様々な動物種及び特殊な系統等から個体及び細胞が作製できる。
　４．ヒトの生殖補助技術等にも応用できる。

　なお、上述の実施形態及び下記で説明する実施例においては、発生工学産物として、体外培養及び操作によりダメージを受ける胚から効率的に個体作製を行う例について記載した。
　これについて、従来の個体作製を行う技術を併用して、この上で、本実施形態の胚発生停止抑制方法、一時処理培地等を、成功率を高めるために実施することが可能である。

　また、上述の実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤として、Ｙ－２７６３２のような低分子化合物を一時処理培地に含ませる例について記載した。
　しかしながら、Ｒｈｏキナーゼの発現調整の対象となる遺伝子、遺伝子産物、アゴニスト／アンタゴニスト、その他のパスウェイに対する作用を介した組成物を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤として用いることも可能である。

　なお、上述の一時処理培地に加え、操作溶液にも、細胞融合、核移植、インジェクション等の操作時の物理的破損を防止するために、サイトカラシン類等が添加されていてもよい。

　また、本発明の実施の形態に係る一時処理培地は、他の組成物等と併用することも可能である。

　また、本実施形態に係る一時処理培地を用いて、効率的に個体、器官、組織、及び細胞等の作製を行うことが可能である。さらに、希少品種の遺伝子改変、遺伝病を持つ動物の遺伝子治療、ペットの治療、不妊治療、下記の実施例で示すＣａｓ９以外の技術を使用可能とするようなことも考えられる。

　以下で、本発明の実施の形態に係る胚発生停止抑制方法、発生工学産物作製方法について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。

〔材料と方法〕
［試薬］
（主な試薬類）
　ＰＺＭ－５培地（機能性ペプチド研究所製：ＩＦＰ０４１０Ｐ）：ブタ培養胚発生用培地、ＰＢＭ培地（機能性ペプチド研究所製：ＩＦＰ１０３０Ｐ）：ブタ後期胚培養用培地、ＫＳＯＭ　ＡＡ培地（本発明者らが作製）、ｍＲ１ＥＣＭ培地（アーク・リソース製）、ｍＷＭ培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）培地（アーク・リソース製）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）、Ｍ２培地（Ｓｉｇｍａ製、カタログ番号Ｍ７１６７）、Ｙ－２７６３２（富士フィルム和光製：０３６－２４０２３）。
　その他、ＩＶＦ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、体外受精）関連試薬は、機能性ペプチド研究所から入手した。ｄｂｃＡＭＰ（ＳＩＧＭＡ　ａｌｄｒｉｃｈ製：Ｄ０６２７）、ＦＳＨ（メルクセローノ製：ゴナールエフ皮下注１５０）、ＰＭＳＧ（共立製薬製：セラルモン）、ｈＣＧ（共立製薬製：ゲストロン）、ＴＧＦ－α（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ製：２３９－Ａ）、ブタ卵胞液（本発明者らが作製。採卵時回収液を１００００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ上清ろ過滅菌液）。

（その他の試薬類の調整）
（２ｎｍｏｌ　Ａｌｔ－Ｒ　ＣＲＩＳＰＲ　ｃｒＲＮＡ）
　ＩＤＴＥバッファー又はＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ水　２０μＬに入れて１００μＭにした。分注して－８０℃に保存した。

（２０ｎｍｏｌ　Ａｌｔ－Ｒ　ＣＲＩＳＰＲ　ｔｒａｃｒＲＮＡ）
　ＩＤＴＥバッファー又はＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ水　２００μＬ入れて１００μＭにした。分注して－８０℃に保存した。

（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡストック溶液（１００μＬ））
　ｃｒＲＮＡ（１００μＭ）を４．５μＬ（最終１８μＭ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（１００μＭ）を４．５μＬ（最終１８μＭ）、及びＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｄｕｐｌｅｘ　Ｂｕｆｆｅｒを１６μＬで調製した。最終量は、２５　μＬとした。
　ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、９５℃で５分加熱し、１５～２５℃でハイブリダイズした。参考として、ｃｒＲＮＡ平均分子量：１１，７００ｇ／ｍｏｌであり１００μＭ＝１．１７ｕｇ／μＬ、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子量：２２，１８２ｇ／ｍｏｌであり１００μＭ＝２．２２ｕｇ／μＬ、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：１００μＭ＝３．３９　ｕｇ／μＬ、１μＭ＝３３．９ｎｇ／μＬであった。

（エレクトロポレーション法のワーキング溶液（１０μＬ）（ＣＵＹ２１　ＥＤＩＴ））
　ＧｅｎｅＡｒｔ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｃａｓ９　Ｎｕｃｌｅａｓｅ（１ｕｇ／μＬ，Ｔｈｅｒｍｏ）を１．０　μＬ（最終１００ｎｇ／μＬ）、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡストック溶液（１８μＭ）を１．７μＬ（最終３μＭ、約１００ｎｇ／μＬ）、ｓｓＯＤＮ（高濃度１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（１００μＭ）を０．７６μＬ（最終　約４００ｎｇ／μＬ）、及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液をＩ６．６μＬにて調製。これを標準的な濃度とした。

［機器類］
　ＮＥＰＡ２１（登録商標、ネッパジーン製）：遺伝子導入装置本体、ＣＵＹ５０１Ｐ１－１．５：ＭＳ　白金ブロック電極、１ｍｍ　ｇａｐ　容量：５μＬ、Ｃ１１５ＣＢ又はＣ１１５ＣＢ－２：ケーブル（装置本体に接続）、Ｃ１１７：ケーブル（Ｃ１１５ＣＢを経由して、白金プレート電極に接続）を用いた。

［胚発生停止抑制方法、一時処理方法、その他の培養方法］
（受精卵エレクトロポレーション法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、以下「ＴＡＫＥ」ともいう。）
　ＴＡＫＥは、特許文献２に記載の方法に準じて行った。
　１．　電極のバスタブ内に、Ｃａｓ９　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｇＲＮＡ、ｓｓＯＤＮ溶液等を、ノックアウトかノックインか等に合わせた容量のゲノム編集用溶液又はＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液に投入した。
　２．　溶液抵抗値は、２００Ω（１９０～２１０Ω）になるよう、調整した。
　３．　まず、体外培養物を、培養液がミネラルオイルで被覆されたもの（以下、「ドロップ」という）から取りだし、ディッシュに入れたＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液で一度洗浄した。
　４．　次いで、電極内のゲノム編集用溶液又はＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中に、体外培養物を投入した。
　５．　実際の抵抗値を測定した。抵抗値が１６０Ω以下であった場合、ゲノム編集用溶液又はＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液を少し吸引して、再度抵抗値を測定し、２００Ω前後（１９０Ω～２１０Ω程度）に揃えた。抵抗値が２２０Ω以上であった場合、ゲノム編集用溶液又はＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液を添加して、再度抵抗値を測定し、２００Ω（１９０Ω～２１０Ω程度）に揃えた。
　６．　抵抗値を揃えた後、直ちにＮＥＰＡ２１のスタートボタンを押し、エレクトロポレーション（ＥＰ）処理を行った。
　７．　ＥＰ処理後、体外培養物を取りだした。

　その後は、他のＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液で洗浄した体外培養物をバスタブ内の液中に入れて、抵抗値を揃えて、同様にＥＰを行った。

（未凍結近交系の場合）
　１．　ＴＡＫＥを行う３時間前までに、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地（Ｙ－２７６３２終濃度１０μＭ、本実施例の「一時処理培地」の一例）、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地（本実施例の「通常培地」の一例）を、それぞれ３５ｍｍペトリディッシュに５滴落としパラフィンオイルで被覆したドロップを作製した。
　２．　ドロップから前核期胚を採取し、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて、３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　３．　その後、ＴＡＫＥを行った。このＴＡＫＥの際は、上述のように、前核期胚、洗浄後、ＴＡＫＥ用のゲノム編集用溶液又はＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液に移されていた。以下の処理でも同様である。
　４．　ＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れ（一時処理）、翌日（１時間以上１２時間以内）まで３７℃、５％　ＣＯ₂、（５％　ＯＯ₂）条件下で培養した。
　５．　必要に応じてＹ無添加ｍＷＭ培地で培養の継続、又は、胚移植を行った。

（標準的な凍結近交系又は特殊系統の場合）
　１．　ＴＡＫＥを行う３時間前までにＹ－２７６３２添加ｍＷＭ培地（Ｙ－２７６３２終濃度１０μＭ、本実施例の「一時処理培地」の一例）、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地（本実施例の「通常培地」の一例）をそれぞれ３５ｍｍペトリディッシュに５滴落としパラフィンオイルで被覆したドロップを作製した。
　２．　ドロップから前核期胚を採取し、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　３．　その後、ＴＡＫＥを行った。
　４．　ＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　５．　その後、Ｙ無添加ｍＷＭ培地に入れ、翌日まで３７℃、５％　ＣＯ₂、（５％　Ｏ₂）条件下で培養した。必要に応じてＹ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地で培養の継続、あるいは胚移植を行った。

（凍結及び未凍結異種野生マウス由来近交系の場合）
　１．　ＴＡＫＥを行う３時間前までにＹ－２７６３２添加ｍＷＭ培地（Ｙ－２７６３２終濃度１０μＭ、本実施例の「一時処理培地」の一例）、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地（本実施例の「通常培地」の一例）をそれぞれ３５ｍｍペトリディッシュに５滴落としパラフィンオイルで被覆したドロップを作製した。
　２．　ドロップから２細胞期胚を採取又は融解し、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　３．　その後、ＴＡＫＥを行った。
　４．　ＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。その後、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地に入れ、移植まで３７℃、５％　ＣＯ₂、５％　Ｏ₂条件下で培養した。
　５．　その後、必要に応じてＹ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地で培養の継続を行い、ＥＳ細胞の樹立を行った。

（ブタＩＶＭ、ＩＶＦ胚の場合）
　１．　ＴＡＫＥを行う前日にＹ－２７６３２添加ＰＺＭ－５培地（Ｙ－２７６３２終濃度１０μＭ、本実施例の「一時処理培地」の一例）を３５ｍｍペトリディッシュに５滴落とし、パラフィンオイルで被覆したドロップを作製した。本実施例のドロップでは、培地を２０μＬ滴下し、オイルを１ｍＬ入れ、その後、培地を再度２０μＬ加え、オイルで完全に覆った。このドロップは、ＴＡＫＥするものの２倍の枚数を作製した。
　２．　当業者に一般的な手法に基づいてＩＶＦを行った。
　３．　媒精の翌日に、ＩＶＦ胚をＹ－２７６３２添加ＰＺＭ－５培地に投入し、３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　４．　その後、ＴＡＫＥを行った。
　５．　Ｙ－２７６３２無添加ＰＺＭ－５培地（本実施例の「通常培地」の一例）に戻し、３９℃、５％　ＣＯ₂、５％　Ｏ₂条件下で培養した。
　６．　必要に応じて、発生段階でサンプリング等を行った。胚盤胞期まで培養を継続する場合は、媒精の４日後にＹ－２７６３２無添加のＰＺＭ－５培地とＰＢＭ培地とを含むドロップを１．のステップと同様に作製しておいた。
　７．　媒精の５日後に桑実期、胚盤胞期まで発生した胚をＰＢＭ培地（本実施例の「通常培地」の一例）に移した。残りの生存胚もＹ－２７６３２無添加ＰＺＭ－５培地に移し、発生が進んだら、適宜ＰＢＭ培地に移した。
　８．　媒精の７～８日後に胚盤胞～拡張胚盤胞となった。

（近交系マウス２ＳＴＥＰ法）
　１．　ＴＡＫＥを行う３時間前までにＹ－２７６３２添加ｍＷＭ培地（Ｙ－２７６３２終濃度１０μＭ、本実施例の「一時処理培地」の一例）、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地（本実施例の「通常培地」の一例）を、それぞれ３５ｍｍペトリディッシュに５滴落としパラフィンオイルで被覆したドロップを作製した。このドロップは、ＴＡＫＥするものの２倍の枚数を作製した。
　２．　前核期胚を採取し、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　３．　その後、一回目のＴＡＫＥを行った。
　３ａ．凍結卵の場合、一回目のＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　３ｂ．未凍結卵の場合、一回目のＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れ、翌日まで３７℃、５％　ＣＯ₂、（５％　Ｏ₂）条件下で培養した（一時処理）。
　４．　一時処理後、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地に入れ、翌日まで３７℃、５％　ＣＯ₂、（５％　Ｏ₂）条件下で培養した。
　５．　いずれも、翌日確認し、２細胞期になった胚に、二回目のＴＡＫＥを行った。
　６．　二回目のＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ｍＷＭ培地に入れ、３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　７．　その後、Ｙ－２７６３２無添加ｍＷＭ培地に移した。必要に応じて、培養の継続、又は胚移植を行った。

（近交系ラット２ＳＴＥＰ法）
　１．　ＴＡＫＥを行う３時間前までにＹ－２７６３２添加ＫＳＯＭ　ＡＡ培地（Ｙ－２７６３２終濃度１０μＭ、本実施例の「一時処理培地」の一例）を３５ｍｍペトリディッシュに５滴落としパラフィンオイルで被覆したドロップを作製した。
　２．　前核期胚を採取し、Ｙ－２７６３２添加ＫＳＯＭ　ＡＡ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　３．　その後、一回目のＴＡＫＥを行った。
　４．　ＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ＫＳＯＭ　ＡＡ培地に入れ、３０分以上１２時間まで３７℃、５％　ＣＯ₂、５％　Ｏ₂条件下で培養した（一時処理）。
　５．　その後、Ｙ－２７６３２無添加ＫＳＯＭ　ＡＡ培地に入れ（本実施例の「通常培地」の一例）、二回目のＴＡＫＥまで３７℃、５％　ＣＯ₂、５％　Ｏ₂条件下で培養した。
　６．　翌日、２細胞になった胚を分別し、採卵から２０～２２時間程度で、再度Ｙ－２７６３２添加ＫＳＯＭ　ＡＡ培地に入れて３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　７．　その後、二回目のＴＡＫＥを行った。
　８．　二回目のＴＡＫＥ後、Ｙ－２７６３２添加ＫＳＯＭ　ＡＡ培地に入れ３０分から１時間程度培養した（一時処理）。
　９．　その後、ｍＲ１ＥＣＭ培地（本実施例の「通常培地」の一例）に移した。必要に応じて培養の継続、あるいは胚移植を行った。

（胚移植）
　定法に従い、マウス、ラットに精管結紮雄と交配しプラグ確認した午後に、プラグ確認成熟メスマウス、ラットの左右卵管又は子宮に各１０個前後を移植した。
　また、ブタの場合は、各１０個前後の胚を、子宮に非外科的な手法で移植した。

〔結果〕
［全体まとめ］
　まず、図２により、本実施例の胚発生停止抑制方法及び発生工学産物作製方法により個体の作製が可能となった系統、操作について説明する。
　図２において、マウスは、交雑系、クローズドコロニー、近交系（Ｂ６等）、疾患モデル、異種マウスの個体の作成難易度を示している。ラットは、交雑系、クローズドコロニー、近交系（Ｆ３４４等）、疾患モデルについての個体の作成難易度を示している。また、ブタ、ヒツジ、イヌ、サル、ヒトも、一部の処理における難易度について示している。また、各操作については、胚（細胞）へのダメージを与える操作として、過排卵処置、凍結胚（移植、胚凍結）、核移植（ＮＴ）、顕微授精（ＩＣＳＩ）、マイクロインジェクション（ＭＩ）、エレクトロポレーション法（ＥＰ）の各操作について示す。さらに、核へのダメージとして、多量又は高分子のＤＮＡの暴露、複数回のＤＳＢを伴う操作（２ＳＴＥＰ法等）について示す。さらに、細胞融合等として、異数体、倍数体（４倍体等）にする操作について示す。
　具体的には、各欄の記号は、個体の作製について、「◎」は（容易、低難易度）、「〇」は（可能、通常難易度）、「△」は（高難易度）、「×」（不可能）の難易度であることを示す。すなわち、「◎」～「〇」～「△」～「×」の順で難しいことを示す。「？」は、難易度が不明であることを示す。
　ここで、各欄の矢印の先の難易度は、本実施例の胚発生停止抑制方法、発生工学産物作製方法により作製が可能になったことが、本発明者らにより実際に示されたものを示す。各欄の背景がグレー（濃い）箇所は、本実施例の効果が期待できる範囲であるものの、まだ試験例がない箇所を示す。
　このように、幅広い哺乳類、系統、操作について、本実施例の胚発生停止抑制方法及び発生工学産物作製方法を実現可能である。

　以下において、この図２で示した各体外培養物の処理例について説明する。

（処理例１）
　まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いたエレクトロポレーション法によるノックアウトマウスの作製例について説明する。
　従来、通常、エレクトロポレーション法（ＴＡＫＥ）で処置した受精卵は発生率、産子率が低くなるためレシピエント１匹当たりの移植胚数を増やす必要がある。
　本作製例では、Ｙ－２７６３２を添加することで発生率、産子率を高くして移植胚数の低減を目的とした。
　このため、本作製例では、ＴＡＫＥ前後にＹ－２７６３２を含む一時処理培地で、一時処理した。体外培養物として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（クレアジャパン）の前核期胚、ＭＣＨ（メス、クレアジャパン製）、メスを使用した。

　図３によると、結果として、エレクトロポレーション前後に本実施形態の細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤の一例としてＹ－２７６３２を含む培養液で培養した。Ｍｋ－３遺伝子を２種類のｇＲＮＡ（「ＭＫＩＩＩ　ｖｅｒ．１」又は「ＭＫＩＩＩ　ｖｅｒ．２」）でノックアウトしたところ、出生率が約５倍となった。この際、非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｎｄ　ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）効率は、変わらなかった。

（処理例２）
　次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを用いた２ＳＴＥＰ法によるＦｌｏｘマウスの作製例について説明する。
　従来、２ＳＴＥＰ法で処置した近交系受精卵は、発生率、産子率が著しく低くなるため近交系Ｆｌｏｘマウスが得られなかった。このため、本作製例では、発生率、産子率を高くし、近交系Ｆｌｏｘマウスを作製することを目的とした。
　このため、本作製例では、Ｙ－２７６３２を含む一時処理培地で、２ＳＴＥＰ法のエレクトロポレーション（ＥＰ）の前及び後に一時処理した。体外培養物として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（クレアジャパン）の前核期胚、ＭＣＨ（メス、クレアジャパン製）を使用した。

　本発明者らは、Ｍｅｃｐ２遺伝子をターゲットとした２ＳＴＥＰ法によるＦｌｏｘマウスを得る実験を行った。
　この結果を、下記の表２に示す：

　表２において、「ｍ」は通常培地での処理、「Ｙ］は一時処理培地での一時処理を示す。それぞれの実験区は、２ＳＴＥＰ法の第一のエレクトロポレーションのステップ、第二のエレクトロポレーションのステップにおいて、それぞれ、通常培地（ｍ）又は一時処理培地（Ｙ）で処理したことを示す。すなわち、「ｍ－＞ｍ」は、全て通常培地、「ｍ－＞Ｙ」は第一のエレクトロポレーションのステップのみ一時処理培地で一時処理、「Ｙ－＞Ｙ」は、両方のステップで一時処理培地にて一時処理を行った。
　各欄は、第一のエレクトロポレーションのステップによる左側のみｌｏｘＰ配列が挿入されたもの（Ｌｅｆｔ　ｌｏｘＰ）、第二のエレクトロポレーションのステップによる右側のみｌｏｘＰ配列が挿入されたもの（Ｒｉｇｈｔ　ｌｏｘＰ）、両方のステップにより両方のｌｏｘＰ配列が挿入されたもの（２ｌｏｘＰ）の割合を、それぞれ示す。

　結果として、胚盤胞１５個中１個（７％）、新生児で２５匹中１匹（４％）のＣ５７ＢＬ／６ＪのＦｌｏｘマウスが得られた。一方、Ｙ－２７６３２を添加しない実験区では、胚盤胞、新生児ともに得られなかった。

　Ｄｒｂ１遺伝子においても同様に新生児でＣ５７ＢＬ／６ＪのＦｌｏｘマウスが得られた。
　図４に、この２ｌｏｘＰで、コンディショナルノックアウトが可能になったＦｌｏｘマウスの例を示す。「２７」のレーンにおいて、Ｆｌｏｘマウスであることを示すバンド（５３９８ｂｐ又は５４４０ｂｐ）が生じている。

　このように、２ＳＴＥＰ法で、コンディショナルノックアウトが可能な、近交系Ｆｌｏｘマウスの作製を２種類の遺伝子を用いて試みたところ、いずれもＹ－２７６３２を添加した実験区だけから、これまで成功例が報告されていなかった近交系Ｆｌｏｘマウスが得られた。このように、Ｙ－２７６３２による一時処理は、Ｂ６等のダメージに弱い系統に有効であると考えられる。

（処理例３）
　次に、異種マウスＭｕｓ　ｓｐｒｅｔｕｓ（アルジェリアハツカネズミ）の近交系ＳＰＲ２（以下、単に「異種近交系マウスＳＰＲ２」又は単に「ＳＰＲ２」という。）の凍結卵からの個体作製例、及び異種マウス凍結胚からのＥＳ細胞樹立を行った処理例について説明する。
　本作製例では、ＳＰＲ２の２細胞凍結卵を融解後、Ｙ－２７６３２を含む一時処理培地で１時間培養し、偽妊娠メスマウスの子宮に移植した。
　この例では、異種近交系マウスＳＰＲ２の２細胞凍結卵を融解後、Ｙ－２７６３２を含む培養液で１時間培養、偽妊娠メスマウスの子宮に移植したところ、凍結卵由来個体（移植胚１６個、出生仔６匹）が得られた。
　この結果を、下記の表３に示す：

　図５は、得られた個体の一例を示す。異種近交系マウスＳＰＲ２での凍結胚からの個体作成は、従来は不可能であった。

　次に、異種近交系マウスＳＰＲ２凍結胚からのＥＳ細胞樹立の処理例の結果について説明する。
　異種近交系マウスＳＰＲ２の２細胞凍結卵を融解後、Ｙ－２７６３２を含む一時処理培地で胚盤胞まで培養し、ＥＳ細胞の樹立を試みた。結果として、効率にＥＳ細胞が樹立できた（凍結胚５個、樹立数２株）。一方、Ｙ－２７６３２を加えない場合、個体作製およびＥＳ細胞は樹立されなかった。
　このように、Ｙ－２７６３２の一時処理により、従来は不可能であった、異種マウスの凍結胚からのＥＳ細胞の作成も行うことができた。

（処理例４）
　次に、エレクトロポレーションした異種近交系マウスＳＰＲ２、及び異種マウスＭｕｓ　ｃａｒｏｌｉ（オキナワハツカネズミ）の初期胚からのＥＳ細胞樹立を行った処理例について説明する。
　異種近交系マウスＳＰＲ２、及び異種マウスＭｕｓ　ｃａｒｏｌｉの初期胚をＹ－２７６３２入り培地で培養後、エレクトロポレーションしゲノム編集を試み、高率にＥＳ細胞を樹立した。Ｍｕｓ　ｃａｒｏｌｉのＥＳ細胞について、ゲノム編集によるＴｙｒ遺伝子のノックアウトを行い、その一部を解析したところ、ＮＨＥＪが起きており、異種マウスＥＳ細胞が樹立されることが示された。
　図６は、Ｍｕｓ　ｃａｒｏｌｉで樹立したＥＳ細胞のディッシュを示す。ＥＳ細胞らしい形態が目視で確認できる。
　図７は、Ｔｙｒ遺伝子をノックアウトしたＭｕｓ　ｃａｒｏｌｉを示す。アローヘッドは、ノックアウトを示すバンドである。

（処理例５）
　次に、本実施例の一時処理培地が、エレクトロポレーションの発生に与える悪影響を低減できるかを検証した例について説明する。
　まず、近交系ラット胚等を用いたエレクトロポレーション後の発生に与える影響について実験した。
　近交系ラットＦ３４４は、２回、エレクトロポレーション）を行うと、胚発生停止が生じる。これについて、本実施形態の一時処理培地にて、エレクトロポレーション前及び後の特定期間、培養して結果を確認した。

　図８Ａは、コントロールで、本実施形態の一時処理培地にて処理をしなかったものの結果を示す。胚盤胞まで発生したものは皆無であった。
　図８Ｂは、エレクトロポレーションの前及び後、本実施形態の一時処理培地にて処理したものの結果を示す。７１．８％が胚盤胞まで発生した。
　図８Ｃは、コントロールで、エレクトロポレーションを行わず、本実施形態の一時処理培地での処理もしなかったものを示す。７１．４％が胚盤胞まで発生した。
　これらの図において、２細胞期の発生率は前核期胚に対する２細胞期胚の割合、胚盤胞期の発生率は２細胞期胚に対する胚盤胞期の割合として算出された。

　結果として、近交系ラットＦ３４４は、エレクトロポレーションの前及び後、本実施形態の一時処理培地にて処理することで、胚発生停止することなく胚盤胞まで発生した。具体的には、２細胞期の胚１０３個中、７４個（７１．８％）が胚盤胞期まで発生した。
　この割合は、無処理でエレクトロポレーションを行わなかったものと、ほぼ同じであった。

　次に、凍結融解した後、エレクトロポレーション後に胚移植して個体を得ることができない異種近交系マウスＳＰＲ２における、本実施例の一時処理培地の効果を測定した。
　この結果を、下記の表４に示す：

　融解２細胞期胚を、エレクトロポレーション前後の特定期間、本実施例の一時処理培地で培養した、異種マウス近交系ＳＰＲ２は２細胞期胚を１７個卵管に移植したもので７匹の個体を得ることができた。
　さらに、ｍＷＭ培地で胚盤胞期まで発生させた胚（ブラスト）１６個を、プラグ確認後３．５日の子宮に移植したもので、５匹の個体を得ることができた。

　また、体外成熟および凍結精液による体外受精を行ったブタ受精胚について、本実施例の一時処理培地の効果を測定した。
　結果として、本実施例の一時処理培地で培養した場合、２細胞期の胚１２３個中、３５個が後期胚盤胞（拡張又は脱出胚盤胞）にまで発生した。これに対して、コントロールの通常培地のみで培養し、エレクトロポレーションを行った場合、胚盤胞は得られなかった。

（処理例６）
　次に、近交系ラットＦ３４４に高濃度ｓｓＯＤＮを用いたエレクトロポレーションによるノックイン（Ｋｎｏｃｋ－Ｉｎ、ＫＩ）によるＦｌｏｘラットの作製例について説明する。
　近交系Ｆ３４４ラットをエレクトロポレーションする場合、ｓｓＯＤＮの濃度及びトランスレーションパルス数を増加させると発生が停止してしまっていた。さらに、通常の濃度、回数であっても２回、エレクトロポレーションすると発生が停止してしまっていた。近交系Ｆ３４４ラットにおいて、エレクトロポレーション前後に、本実施例の一時処理培地で培養することで、ｓｓＯＤＮ濃度、トランスレーションパルス数を増加させることでノックインされなかったＬｏｘＰ配列をノックインが可能か、加えて２ＳＴＥＰのＦｌｏｘが可能か検証した。

　本作製例では、２ＳＴＥＰ法によるノックインをＦ３４４ラット前核期胚で行った。通常の濃度の２倍８００ｎｇ／μＬのｓｓＯＤＮ、約２倍の１４回のトランスファーパルスでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの前及び後の特定期間、本実施例の一時処理培地で培養した。
　この結果を、下記の表５に示す：

　表中の８６サンプルのうち、胚盤胞まで発生したものを６７個取得し、まずＬｅｆｔ　ＬｏｘＰ配列がノックインされたものをＰＣＲで調べた。すると、通常培地のみで処理した場合にはＬｏｘＰがノックインできなかった（０／１２、０％）のに対して、本実施例の一時処理培地で処理したものでは胚盤胞で確認できた（１９／６７、２８％）。また、発生停止をすることなく胚盤胞まで発生し、標的遺伝子の両端にｌｏｘＰ配列を有するＦｌｏｘが胚盤胞で確認できた（１／６７、１．５％）。
　すなわち、通常のｓｓＯＤＮ濃度、及びパルス数ではノックインされなかったＬｏｘＰ配列を、エレクトロポレーション前及び後に、Ｙ－２７６３２を含む培養液で培養することで、ノックインすることができた。この際、エレクトロポレーションの際のｓｓＯＤＮの濃度を２倍にし、エレクトロポレーションの回数を２倍にすることが可能となった。

（処理例７）
　次に、疾患モデルマウスなど大量の受精卵を得ることの困難なマウスから少量の受精胚から複数遺伝子ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ、ＫＯ）マウスの作製例について説明する。
　本作製例では、免疫不全マウス（ｎｕｄｅ、ヌードマウス）胚を用いた複数遺伝子ＫＯマウスを作製した。
　具体的には、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕのオスと過排卵処置をしたＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／＋のメスを掛け合わせ、前核期胚を採取した。ＢＢＯＸ１遺伝子に対して２個、ＩＬ２ＲＧ遺伝子に対して２個のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）を１個当たり約１００ｎｇ／μＬ、合計約４００ｎｇ／μＬで、トランスファーパルス１４回でエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの前及び後、本実施例の一時処理培地で培養した。
　この結果、６３個の胚を移植して、１６匹が生まれた。一部（生存仔４匹、死産仔３匹）を解析したところ３匹で変異が見られ、１匹は２つの遺伝子に変異が確認された。下記の表６の生存仔の＃２及び＃４が、成功例である。

　結果として、ヌードマウスにおいて、ＢＡＬＢ／ｃ　ｍＢＢＯＸ１及びｍＩＬ２ＲＧの両遺伝子をノックアウトしたものが作製できた。一方、通常培地だけで処理したコントロールでは、そもそも個体が生まれなかった。

（処理例８）
　次に、異種ノックアウト（ＫＯ）マウスの作製例について説明する。
　異種近交系マウスＳＰＲ２の２細胞期胚を用いて、Ｔｙｒ遺伝子に対して４個のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）を１個当たり約１００ｎｇ／μＬ、合計約４００ｎｇ／μＬを用いて、１回又は２回エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの前及び後、本実施例の一時処理培地で培養した。
　その結果を、下記の表７に示す：

　結果として、１回だけエレクトロポレーションした場合、胚を２０個移植し７匹の個体が得られた。その内、モザイクが３匹であった。２回、エレクトロポレーションした場合、胚を１３個移植し７匹の個体が得られた。その内、モザイク３匹、白（ホモまたはコンパウンドヘテロ）が３匹得られた。
　図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃは、得られた個体の一例を示す。

　このように、異種近交系マウスＳＰＲ２の２細胞凍結卵から、Ｔｙｒ遺伝子をノックアウトしたノックアウトマウスを作製するのに成功した。すなわち、異種マウスの近交系を用いてＫＯホモ（コンパウンドヘテロを含む）を効率的に作製することができた。

（処理例９）
　次に、近交系マウスＢ６Ｊ系統の初期胚で、胚盤胞段階で保存してある凍結胚を用いて、本実施形態の通常培地一時処理培地を用いた際に操作の前後で用いることで、発生が変化するか比較を行った例について説明する。

　本処理例では、一時処理培地として、ｍＷＭ培地に、Ｙ－２７６３２を１０μＭになるよう添加したものを用いた（この例では、「Ｙ＋培地」という。）。また、通常培地として、Ｙ－２７６３２を加えないｍＷＭ培地を用いた。（この例では、「Ｙ－培地」という。）。

　処理としては、用意された凍結胚を融解し、そのままＹ－培地で胚盤胞段階まで発生させた。
　次に、胚盤胞まで発生した胚の半数をＹ＋培地へ移して３０分、載置した。その後、再びＹ－培地に胚を移し替え、３０分間載置した。
　次に、Ｙ＋培地で処理した胚と、処理しなかった胚とを、それぞれ１本のチューブで凍結した。
　次に、両方のチューブを融解し、１０分、通常培地に載置した。
　その後、Ｙ＋培地と、Ｙ－培地とに、それぞれ胚を均等に分割し、１時間、載置した。
　次に、再び、各チューブをＹ－培地に戻して、胚を観察した。この観察は、融解直後、３時間後、及び２４時間後に行った。

　これらの操作及び処理の結果を、以下の表８に示す。

　Ｙ－音地とＹ＋培地とを比較した結果、Ｙ＋培地を使用した培地の方が、生存、回復した胚を多く確認することができた。Ｙ＋培地を凍結の前及び後に使用した胚の回復率が、一番良い結果であり、次に良い状態だったのはＹ＋培地を凍結前に使い凍結後にはＹ－培地を使用したものであった。続いて、凍結前後でＹ－培地、Ｙ＋培地をそれぞれ使ったもの、Ｙ－培地のままのものという結果になった。それぞれの胚は凍結を２回行っているものの、Ｙ＋培地で発生させると、９２％まで回復させることができた。

（処理例１０）
　次に、細胞内骨格調整剤として、Ｙ－２７６３２以外のものである、サイトカラシンＢ（以下、「ＣＢ」という。）に、同様の効果があるか否かを検証した例について説明する。
　本処理例では、上述の処理例９と同様に通常培地（以下、処理例９と同様に「Ｙ－培地」という。）、Ｙ－２７６３２を加えた一時処理培地（以下、処理例９と同様に「Ｙ＋培地」という。）、ＣＢを加えた培地（以下、「ＣＢ＋培地」という。）を使用した。ＣＢ＋培地に含まれるＣＢの濃度は、５μＭ及び１０μＭのものを用意した。操作としては、凍結胚を融解発生させ胚盤胞で再凍結、再融解した場合の回復率を比較した。

　処理としては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（クレア製）２細胞期の凍結胚を１０７個使用し、まず、２細胞期凍結胚を融解し、そのまま通常培地で胚盤胞まで発生させた。
　次に、胚盤胞を上述の各培地に移し、３０分間、載置した。その後再びＹ－培地に胚を移し替え、３０分間、載置した。
　次に、胚をそれぞれ凍結した。
　次に、胚を融解し、Ｍ２培地で１０分間、載置した。
　その後、培地にそれぞれ胚を均等に分別して１時間、載置した。
　再びＹ－培地に戻して胚を観察した。この観察は、融解直後、３時間後、及び２４時間後に行った。

　これらの操作及び処理の結果を、以下の表９に示す。

　結果として、ＣＢ＋培地とＹ＋培地を使用して比較した結果、ＣＢ＋培地もＹ＋培地と同様に胚の生存、回復を多く確認することができた。
　具体的には、Ｙ－培地（コントロール）、Ｙ＋培地、ＣＢ＋培地を使用して比較した結果、Ｙ－２７６３２を使用した培地が一番胚の生存、回復を多く確認することができた。その次に結果が良かったものはＣＢ＋培地（ＣＢ濃度５μＭ）であった。ＣＢ＋（ＣＢ濃度５μＭ）の３時間後に観察したデータでは、Ｙ＋培地と並んだ良い結果となっていた。ＣＢ＋培地の濃度比較では、５μＭの方が、２４時間後の段階で１０μＭに比べて回復率が１５％の高かった。
　コントロールのＹ－培地は検証した中では一番回復率が低かった。　　　　

　なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

　次に、本発明の実施例２として、他の系統、他の種類の操作によるダメージ等による体外培養物を一時処理した処理例の結果について説明する。
　各処理例について、材料と方法は、上述の実施例１と同様である。

　実施例２に係る近交系マウスＢ６Ｊ、複合型免疫不全マウスＮＯＤ－ｓｃｉｄ、近交系ラットＷｉｓｔａｒ－Ｉｍａｍｉｃｈｉは、いずれもクレアジャパン製である。

（処理例１１）
　実施例１に係る処理例２の近交系マウスとは異なる近交系（Ｂ６系統のＢ６Ｊ）マウスを用いて、上述の処理例２と同様の２ステップ法によるノックインを行い、更に個体作製を行った。
　この２ＳＴＥＰ法での個体作製の結果を下記の表１０に示す。

　さらに、同様にして、高濃度ｓｓＯＤＮを用いたエレクトロポレーション法（１ＳＴＥＰ法）での近交系マウスＢ６Ｊ系統での個体作製も行った。
　この結果を下記の表１１に示す。

　このように、１ＳＴＥＰ法でもＦｌｏｘ近交系マウス個体の作製が可能となった。

（処理例１２）
　実施例１に係る処理例６と同様の近交系ラットの前核期胚について、高濃度ｓｓＯＤＮを用いたエレクトロポレーション法（１ＳＴＥＰ法）によるノックインを行い、更に個体作製を行った。
　上述の処理例６のように、通常のｓｓＯＤＮ濃度およびトランスファーパルス数ではノックインされなかったＬｏｘＰについて、上述の実施例１と同様の一時処理を行った。具体的には、エレクトロポレーション前後に、１時間の一時処理、２４時間の通常培地での培養（待機期間）、１時間の一時処理を行った。
　これにより、ｓｓＯＤＮの濃度、エレクトロポレーション回数を２倍にすることが可能となりノックインすることができた。さらにＣａｓ９の濃度を５倍にすると、１回のエレクトロポレーションでＦｌｏｘ近交系ラットが得られた。
　この結果を下記の表１２、表１３に示す。

　結果として、操作難度の非常に高い近交系ラット初期胚、複数部位に同時にＦｌｏｘ配列のＤＮＡ断片を挿入し、ｇＲＮＡ濃度２倍、Ｃａｓ９タンパク質濃度５倍として、ゲノム編集後に個体作製を行うことができた。

　このように、操作難度の非常に高い近交系ラット、近交系マウスの初期胚の複数部位に同時にゲノム編集を行うことが可能であった。

（処理例１３）
　近交系ラットを用いたエレクトロポレーションによるホモ大欠損ノックアウトの個体の作製を行った。
　近交系に準ずるＷｉｓｔａｒ－Ｉｍａｍｉｃｈ系統、近交系ＷＫＹ系統について、通常では欠損することが出来なかったＫｌｏｔｈｏ遺伝子（４０Ｋｂｐ）について、エレクトロポレーションによりノックアウトを行った際、上述の実施例１と同様の一時処理を行った。具体的には、エレクトロポレーション前後に、１時間の一時処理、２４時間の通常培地での培養（待機期間）、１時間の一時処理を行った。
　これにより、高効率で４０Ｋｂｐもの遺伝子を欠損した（大欠損）ノックアウト近交系ラットが得られ、多くはホモであった。
　この結果を、下記の表１４、表１５に示す。

　図１０に、大欠損ノックアウト近交系ラットとして発生した個体の一例を示す。「大欠損あり」が本実施例の大欠損ノックアウト近交系ラット、「大欠損なし」がコントロールのラットであった。
　このように、ホモの遺伝子大欠損個体を作製することが可能となった。

　上述したように、本実施例では、複数回のエレクトロポレーションによる近交系マウス、異種マウスの近交系、近交系ラットまたは近交系に準ずるラットのゲノム編集個体作製、及び高濃度のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の受精卵導入による近交系マウス、異種マウスの近交系、近交系ラットまたは近交系に準ずるラットのゲノム編集個体作製等が可能となった。

（処理例１４）
　次に、実施例１の処理例７と同様に、別系統の重症複合免疫不全マウスのＮＯＤ－ｓｃｉｄ系統において、複数遺伝子のゲノム編集を行ったものの個体作製を行った。
　ここでは、ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕｄｅに用いた上述の処理例と同じ処理法にて、ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスのｍＢＢＯＸ１及びｍＩＬ２ＲＧの両遺伝子をノックアウトしたものの個体を作製した。
　この結果を、下記の表１６に示す。

　結果として、９個体中６個体（６６．７％）で２つの遺伝子のいずれかに変異が生じていた。
　このように、操作難度の非常に高く、入手（調整）が容易でない免疫不全マウス初期胚、複数遺伝子の複数部位にゲノム編集し、個体作製することが可能となった。

（処理例１５）
　次に、実施例１に係る処理例９と同様にして、通常のマウスではなく近交系マウスＢ６Ｊ系統の初期胚で、複数回の凍結融解を行って回復するかどうかを調べた。
　この結果を、下記の表１７に示す。

（処理例１６）
　次に、実施例１に係る処理例１と同様にして、近交系ラットのＦ３４４の未凍結の前核期胚（１セル）において、エレクトロポレーション法によるノックアウトも作製した。この際の条件は、ｇＲＮＡ濃度が規定量の２倍、パルス１４回、減数率２０％であった。
　この結果を下記の表１８に示す。

（処理例１７）
　次に、凍結融解した近交系ラットＷｉｓｔａｒ－Ｉｍａｍｉｃｈｉの前核期胚（１セル）、２細胞期（２セル）において、ＴＡＫＥによるノックアウトも作製した。この際の条件は、ｇＲＮＡ濃度が規定量（１倍）、パルス７回、減数率４０％であった。
　この結果を下記の表１９に示す。

　このように、近交系のマウス、ラットであっても、ダメージの大きな操作、特に前核期胚に加えて、２細胞期のような時期に凍結融解を複数回行っての操作等を行うことが可能となった。

（処理例１８）
　次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスの胚盤胞を用いた凍結胚移植を行った際の発生効率について検討した。
　具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚盤胞について、上述のＹ－２７６３２を用いた一時処理培地又はコントロールの通常培地を用いて、凍結ー融解操作を行った。この上で、レシピエント（ＭＣＨマウス）に、１匹あたり平均２０個の胚盤胞を子宮に移植した。帝王切開（ＣＳ）にて出産し、着床痕と産仔数を確認した。仮親に哺乳させ、離乳マウス数を確認し離乳生存率を算定した。なお、胚の培地は、ｍＷＭ培地を基に使用した。
　この結果を、下記の表２０に示す。

　結果として、Ｙ－２７６３２を使用しない場合に比べ、Ｙ－２７６３２を使用して凍結胚盤胞を融解して移植した場合は、移植した胚盤胞の数に対する産仔数が多く、離乳生存率も向上していた。
　このため、本実施形態に係るＹ－２７６３２を含む一時処理培地は、胚盤胞の凍結融解の際の胚へのダメージを減少させ安定化させることができた。

（処理例１９）
　次に、免疫不全マウスＮＯＤ－ｓｃｉｄの初期胚を用いて、複数標的のゲノム編集の効率について検討した。
　操作難度が非常に高く、調整が容易でない免疫不全マウスの初期胚に、複数遺伝子の複数部位（合計４箇所）のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を混合した高濃度ＲＮＡ－タンパク質をエレクトロポレーション（ゲノム編集）し、レシピエントの子宮に移植し、産仔を得た。
　この結果を、下記の表２１に示す。

　結果として、本実施形態に係るＹ－２７６３２を含む一時処理培地を使用しない場合は全く産仔が得られなかった。一方、Ｙ－２７６３２を使用した場合は、ゲノム編集による高濃度ＲＮＡ－タンパク質とエレクトロポレーションのストレスに耐えて、移植した卵が少なくても産仔を得た。しかも、ゲノム編集の効率が、従来より劇的に向上していた。
　このように、本実施形態に係るＹ－２７６３２を含む一時処理培地を用いることで、（１）操作難易度の高い免疫不全マウスの初期胚を安定化させ、効率よく産仔を得ることができる。（２）高濃度核酸－タンパク質溶液と、エレクトロポレーションのストレスを回避できる。（３）ゲノム編集による二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復効率を上げ、ゲノム編集効率を高効率化することができる。

　ヌードマウス、疾患モデル近交系ラット、マウスは一般に繁殖能力が低い。採卵できる受精卵も少なく体外で受精卵を操作することも困難である。希少品種、絶滅危惧種についても同様と考えられる。本実施形態に係る一時処理培地を用いた各処理により、このように数少ない、貴重な、しかも脆弱な初期胚を用いた繁殖、生殖工学を利用することを可能とすることができる。

（処理例２０）
　次に、本実施形態に係る一時処理培地を使用して作製したマウスの継代効率について検討した。
　上述の処理例１４のＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスを用いたＩＬ２ＲＧ遺伝子とＢｂｏｘ１遺伝子のダブルノックアウトマウス同士で交配し、仔マウスにＹ－２７６３２の影響がないかを検討した。
　この結果を、下記の表２２に示す。

　結果として、第一世代（Ｆ１）、第二世代（Ｆ２）共に、１胎から平均６～８匹の仔が出産された。これは、ベースとなるＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスの産仔率とほぼ同等である。また、子孫マウスの表現型に異常はなかった。
　このように、本実施形態に係るＹ－２７６３２の使用は、マウスの継代と表現型に影響を与えなかった。

　ここで、市販の「ＮＯＧ」系統のマウスは、ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウスにおいてＩＬ２ＲＧ遺伝子を破壊した高度の重症複合免疫不全マウスである。この市販のＮＯＧマウスは、ライセンス上、繁殖が許可されていないため、その他の遺伝子のノックアウトマウスとの組み合わせマウスを自由に作製することができない。このような場合であっても、ＩＬ２ＲＧを含むダブルノックアウトを直接作製することで、容易に研究等に用いることが可能となる。

　本発明によれば、体外培養物への操作によるダメージを減少させるための一時処理培地を提供することができ、産業上利用可能である。

Claims

　多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む体外培養物への操作によるダメージを減少させるための一時処理培地であって、
　細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む
　ことを特徴とする一時処理培地。
　前記細胞内骨格調整剤及び／又は前記アポトーシス抑制剤は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤である
　ことを特徴とする請求項１に記載の一時処理培地。
　前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、
　Ｒｏｃｋ阻害剤を含む
　ことを特徴とする請求項２に記載の一時処理培地。
　前記Ｒｏｃｋ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であり、
　前記Ｙ－２７６３２の濃度は、０．１μＭ～２０μＭである
　ことを特徴とする請求項３に記載の一時処理培地。
　前記細胞内骨格調整剤は、サイトカラシンＢである
　ことを特徴とする請求項１に記載の一時処理培地。
　前記サイトカラシンＢの濃度は、０．１μＭ～１５μＭである
　ことを特徴とする請求項５に記載の一時処理培地。
　前記体外培養物は、霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）、奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）、又は食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）由来である
　ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の一時処理培地。
　請求項１乃至７のいずれか１項に記載の一時処理培地を含む
　ことを特徴とする処理キット。
　アポトーシス抑制剤を含み、
　体外培養物への操作によるダメージを減少させ、胚発生停止を抑制する
　ことを特徴とする胚発生停止抑制剤。
　前記体外培養物が生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む
　ことを特徴とする請求項９に記載の胚発生停止抑制剤。
　前記胚発生停止抑制剤は、一時処理培地用である
　ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の胚発生抑制停止剤。
　前記アポトーシス抑制剤は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤である
　ことを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の胚発生停止抑制剤。
　前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、
　Ｒｏｃｋ阻害剤を含む
　ことを特徴とする請求項１２に記載の胚発生停止抑制剤。
　前記Ｒｏｃｋ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である
　ことを特徴とする請求項１３に記載の胚発生停止抑制剤。
　多能性幹細胞、生殖細胞、受精卵、及び胚のいずれか又は任意の組み合わせを含む体外培養物への操作によるダメージを減少させ、胚発生停止を抑制する胚発生停止抑制方法であって、
　ダメージを伴う操作の前及び／又は後の特定期間、細胞内骨格調整剤及び／又はアポトーシス抑制剤を含む一時処理培地で処理する
　ことを特徴とする胚発生停止抑制方法。
　前記体外培養物は、霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）、奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）、又は食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）由来である
　ことを特徴とする請求項１５に記載の胚発生停止抑制方法。
　前記特定期間は、前記操作に感受性のある動物種、系統、及び／又は凍結卵を用いた場合は、１時間以内である
　ことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の胚発生停止抑制方法。
　前記体外培養物は、前記操作に感受性のある系統の哺乳類に由来する
　ことを特徴とする請求項１７に記載の胚発生停止抑制方法。
　前記操作は、複数回のエレクトロポレーション法であり、
　前記哺乳類は、交雑系、近郊系、疾患モデル、又は異種である
　ことを特徴とする請求項１８に記載の胚発生停止抑制方法。
　請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載の胚発生停止抑制方法により処理された前記体外培養物から、個体、器官、組織、及び細胞のいずれか又は任意の組み合わせを含む発生工学産物を作製する
　ことを特徴とする発生工学産物作製方法。
　請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載の胚発生停止抑制方法により処理された前記体外培養物、及び／又は
　請求項２０に記載の発生工学産物作製方法にて作製された前記発生工学産物を移植する
　ことを特徴とする移植方法。
　哺乳類の治療方法であって、
　請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載の胚発生停止抑制方法により処理された前記体外培養物、及び／又は
　請求項２０に記載の発生工学産物作製方法にて作製された前記発生工学産物を移植する
　ことを特徴とする治療方法。
　請求項２０に記載の発生工学産物作製方法にて作製された
　ことを特徴とする発生工学産物。