CN102395672A - 用于干细胞培养的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开提供用于培养干细胞，包括胚胎干细胞、成体干细胞和胚胎生殖细胞的方法和组合物。

Description

用于干细胞培养的方法和组合物

相关申请的交叉参考

该申请要求于2009年4月13日提出的美国临时专利申请系列号61/168,679的优先权，该文献的全文通过参考并入本文。

技术领域

本公开涉及细胞培养技术。具体而言，本公开涉及可用于基本未分化状态的干细胞长期培养而同时维持高生存力的培养基和培养条件。

背景技术

干细胞是可再生器官、修复组织、制备或递送生物因子以及治疗疾病或病症的潜在来源。

发明内容

在单细胞条件下，人多能干细胞(hPS)例如人胚胎干细胞(hES)和诱导的多能干细胞(hiPS)极其脆弱，这妨碍了实际应用。本公开表明，用非肌肉肌球蛋白II(NMII)的高效抑制剂(例如肌球蛋白II马达活性抑制剂(blebbistatin))处理相当大地增强了克隆密度和悬浮条件下hES和hiPS细胞的存活，并且与合成的基质一起支持用于自我更新的确定环境。

本公开通过消除培养过程中动物或人来源的细胞外基质(ECM)提供用于人诱导的多能干细胞(hiPS)和人胚胎干细胞(hES)增殖的基本上无病原体的培养环境。本公开证明了抑制肌球蛋白II增加细胞-基质粘附和细胞存活，这有效支持了hiPS和hES细胞在完全限定培养基中的化学合成的培养物质聚D-赖氨酸包被上的自我更新。因为人多能干细胞的诱导利用了与细胞维持和扩大相同的培养环境，所以该方法还可用于对于基于细胞的治疗方法所必需的完全无异源材料的新hiPS和hES细胞系的诱导。

当前的无饲养层hESC培养方法需要特定的包被，例如Matrigel^TM(基质胶)，血清成分和人细胞来源的ECM，hESC需要粘附到其上以增殖。本公开提供促进在缺乏此类包被和饲养层下的干细胞生长的培养组合物和条件。本公开至少因为下列原因影响hESC培养技术：首先，因为Matrigel^TM或人细胞来源的ECM是多种细胞外基质例如层粘连蛋白、纤连蛋白、和IV型胶原的混合物，其成分可随批次而不同，通过消除使用细胞来源的材料，可以使当前取决于包衣材料的质量和条件而高度变化的hESC繁殖过程进一步标准化；第二，由于细胞来源的生物材料从来不能够完全避免生物污染，包括病毒和抗原，不需要细胞来源的包衣将导致对GMP级hESC的生长相当有利；第三，虽然人重组ECM可以绕开潜在的污染问题，但是它们与简单地使用塑料组织培养板在制备时间、工作量和成本方面没有竞争性；以及第四，由于合成的小分子相对简单并具有稳定结构，所以对于它们转移至临床环境中认为是有利的。实际上，例如Rock抑制剂Y27632已经成功地用于临床研究。在本文中描述了用于本公开的方法和组合物中的另外的化学抑制剂。

本公开提供了包含基础培养基和肌球蛋白I I抑制剂的组合物。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。基础培养基可包含完全确定成分培养基。在一些实施方案中，组合物中还可以包括ROCK抑制剂。在某些实施方案中，组合物中可包括血清，包括与细胞类型同种异体的或者自体的血清。在又一实施方案中，组合物还可进一步包括氨基酸，例如非必需氨基酸。在另一实施方案中，在组合物中可以包括还原剂(例如β巯基乙醇)。在组合物中可以包括抗微生物剂和/或抗真菌剂。

本公开还提供包含补加有非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子、丙酮酸盐和肌球蛋白II抑制剂的基础培养基的组合物。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

本公开还提供包含聚-D-赖氨酸或者以聚-D-赖氨酸包被的组织培养板、瓶或生长基底，确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂的试剂盒。应当认识到，试剂盒可以如此区室化，以致于本公开的组合物可以在使用前混合。肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

本公开还提供培养干细胞(包括hiPS和ESC)的方法，包括将干细胞悬浮于包含肌球蛋白II抑制剂的培养基中；和在聚-D-赖氨酸包被的组织培养基底存在下培养干细胞。在一个实施方案中，培养基是确定成分培养基。在另一实施方案中，培养基无动物产物。

本公开还提供干细胞培养物，包含在包含确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂的组合物中的干细胞，其中无干细胞和Neu5Gc并且其中干细胞没有在任何动物产物材料存在下培养(例如培养至少1、2、5、10、20、30、40或50或更多代)。在一个实施方案中，在聚-D-赖氨酸存在下培养干细胞。在一个实施方案中，肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

附图说明

图1A-D显示肌球蛋白II是调节ES细胞的细胞-细胞接触中的Rock下游的典型效应物。(A)以混杂的(scrambled))siRNA转染的mES(CJ7)细胞的形态学，显示对细胞-细胞粘附没有影响，而以靶向肌球蛋白IIA和IIB两者的siRNA转染的细胞表现出细胞-细胞接触的显著破坏。细胞接触指数支持形态学观察。数据是平均值±SD，**p＜0.001，n＝5。(B)免疫荧光分析将MYPT1蛋白质定位在未分化ES细胞的细胞-细胞间连接部位。插图显示同一集落的相差图像。(C)描述Rock通过MYPT1的抑制而调节肌球蛋白II功能的分子途径。虚线表示直接磷酸化和活化MRLC的替代的Rock功能。(D)在通过siRNA的保护性实验中，mES细胞以MYPT1 siRNA转染，并且24小时后，以Y27632处理24小时。细胞能够对抗抑制剂的强破坏细胞接触作用而维持它们的细胞-细胞完整性。在挽救实验中，以Y27632处理24小时的mES细胞，随后以靶向MYPT1的siRNA转染。24小时后，将细胞拍照。相当大比例的细胞能够恢复它们的细胞-细胞接触并且形成了前集落样结构。通过表现形态学观察的CCI定量细胞-细胞接触状态。数据是平均值±SD，**p＜0.005，n＝5。标尺，25μm。

图2显示ES细胞中的siRNA介导的基因沉默。为了确定mES细胞中的siRNA转染效率，使用Lipofectamine 2000以40nM的绿色荧光团(FAM)标记的siRNA转染细胞，并且24小时后，在荧光倒置显微镜上评价细胞。实际上几乎所有的细胞掺入了荧光团标记的siRNA。插图表示相差图像。为了评价内源基因被siRNA处理敲低的水平，当将两种不同的siRNA混合时，以40nM或25nM的靶向特定基因的每一siRNA转染mES细胞。24小时后，收获细胞，并进行Western分析和QPCR分析。对于Western分析，使用β-肌动蛋白作为加样对照。虽然似乎Rock I siRNA具有同种型特异性的作用，但是Rock II siRNA以相似方式影响两种同种型。因此，仅当通过共转染Rock I和Rock II siRNA使Rock I和RockII同时耗竭时，才能评价Rock siRNA对细胞-细胞接触的影响。对于QPCR分析，将数据针对β-肌动蛋白的表达水平标准化。mES细胞中肌球蛋白IIC的内源mRNA水平比其它肌球蛋白低两个数量级。虽然肌球蛋白IIC特异性siRNA处理进一步降低表达水平至对照的40％，但是没有观察到对细胞-细胞接触的实质影响。标尺，25μm。

图3A-D显示调节细胞-细胞通讯的Rho-Rock-肌球蛋白II信号轴在hES细胞中是保守的。(A)未分化hES细胞(H9)的形态学，显示紧密连接的集落。通过投射电子显微镜的超微结构分析表明在细胞-细胞接触部位存在特化的连接复合体(箭头)。(B)以C3胞外酶(20μg/ml)处理24小时的hES细胞表现出紧密的细胞-细胞连接被破坏。超微结构分析显示，C3处理的细胞偶尔会通过细胞边缘的小区域与毗邻细胞接触(插图)。(C)Y27632以比对于mES细胞(10μM)的浓度更高的浓度(20μM)分解生长在基质胶上的hES细胞中的细胞-细胞连接。细胞接触指数概述了抑制剂对hES细胞的影响。数据是平均值±SD，**p＜0.001，n＝5。(D)在对照条件下生长的hES细胞的免疫荧光分析显示，肌球蛋白IIA专一性定位于细胞-细胞接触部位，其与E-钙黏着蛋白的亚细胞分布重叠。肌球蛋白II特异性的合成的抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂(10μM)以与在C3或Y27632处理的细胞中所看到的相似的方式破坏hES细胞中的细胞-细胞连接。标尺，25μm。

图4A-E显示肌球蛋白II选择性抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂增强在确定条件下的人诱导的多能干细胞(iPS)的细胞-基质相互作用、细胞存活和自我更新。(A)以不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y27632处理的PDL包被上的hiPS细胞的形态学。在抑制剂缺乏下hiPS细胞没有粘附到PDL包被上(数据未显示)。(B)以不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y27632处理的悬浮培养的hiPS细胞的胚状体形成。在显微镜下计数5个不同视野内的胚状体数量。数据是平均值±SD，n＝5。在三个独立的实验中观察到类似的结果。(C)在2.5μM的肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y27632存在下在基质胶或PDL上生长的hiPS细胞的细胞生长。(D)如通过QPCR所测定的在2.5μM肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y27632存在下在基质胶或PDL上生长的hiPS细胞中Oct3/4的表达。(E)在2.5μM肌球蛋白II马达活性抑制剂存在下在PDL包被上生长传代15次hiPS细胞的形态学(顶图)。中图显示图通过免疫细胞化学评价的在同样条件下生长的hiPS细胞中的Oct3/4表达。在基质胶上生长的hiPS细胞表现出未分化集落和分化成纤维细胞的混合物(底图)。标尺，除(E)底图外为50μm，100μm。

图5显示总结调节ES细胞中基础细胞-细胞相互作用的Rho-Rock-肌球蛋白信号传导途径的模型。在研究中使用的化学物和siRNA分别以红色和星号突出显示。虚线表示细胞完整性和自我更新途径之内或之间潜在的机械相互作用。箭头表示活化并且横线表示移植。

图6A-L显示通过肌球蛋白II马达活性抑制剂抑制NMII增强在克隆和悬浮培养条件下hPS细胞的存活。(a)如通过Western和免疫细胞化学分析所测定的hES细胞中NMHCIIA和IIB的表达。β-肌动蛋白用作加样对照。(b)通过ALP测定评价的hiPS细胞的克隆测定。hiPS细胞以每孔一个细胞铺于存在或缺乏5μM肌球蛋白II马达活性抑制剂的96孔板中7天，随后通过ALP测定评价。(c)通过ALP阳性集落孔的数量与所接种孔的数量的比率测定克隆效率。数据是平均值±SD，**p＜0.01，n＝3。从hES细胞得到相似结果。(d-g)在粘附条件下hiPS细胞的细胞生存力测定。细胞以1×10⁵个细胞/孔一式三份铺于PDL包被的12孔板中。24小时后，将细胞拍照(d)，并且通过台盼兰排染法计数有活力细胞的数量(e)。铺于含肌球蛋白II马达活性抑制剂的细胞显示存活率相当大地高于对照。数据是平均值±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝3。相同的实验每一细胞系重复至少3次并且显示代表性的数据。对于每一单独的细胞系观察到对不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632具有相同的反应模式。从hES细胞得到相似的结果。(f)hiPS细胞凋亡的评价。对用于(e)中细胞生存力测定的细胞进行TUNEL分析。数据是平均值±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，n＝3。(g)通过使用抗裂解型胱天蛋白酶-3抗体的Western分析评价与(e)中所示相同条件下铺板的细胞。β-肌动蛋白用作加样对照。(h-1)肌球蛋白II马达活性抑制剂处理增加了悬浮培养中的hPS细胞的存活。hiPS(FS)或hES(BGN01)细胞于肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632存在或缺乏下在悬浮培养液中培养2天，随后拍照(显示hiPS细胞)(h)，并且进行活细胞计数(i，j)。还开展TUNEL测定(k)和检测裂解型胱天蛋白酶-3的Western分析(I)(显示来自hiPS细胞的数据)。数据是平均值±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，n＝3。β-肌动蛋白用作加样对照。标尺，25μm。

图7A-H显示增强的NMHCIIA^-/A^-mES细胞存活率。(a)通过Western分析评价亲本野生型(RW4)和NMHCIIA^-/A^-突变体mES细胞中NMHCIIA和NMHCIIB表达。β-肌动蛋白用作加样对照。(b)生长于明胶包被板上的RW4和NMHCIIA^-/A^-突变体细胞的形态学。突变体细胞显示松散的细胞-细胞接触，而RW4细胞表现出紧密的细胞-细胞粘附。(c-e)NMHCIIA^-/A^-mES细胞存活率高于RW4。将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度一式三份铺于明胶包被的12-孔板中。24小时后，将细胞拍照(c)，并通过活细胞计数(d)以及TUNEL测定(e)评价。图是三次独立实验的代表性数据。数据是平均值±SD，*p＜0.05，n＝3。(f)NMHCIIB^-/B^-mES细胞的相差图像。细胞保持细胞-细胞粘附。(c，d)NMHCIIB^-/B^-mES细胞如上所述铺板并且开展细胞生存力(g)和TUNEL(h)测定。数据是平均值±SD，n＝3。标尺，25μm。

图8A-G显示对NMII的抑制增强人和小鼠多能干细胞中自我更新调节物的表达。(a-d)hES细胞以1×10⁵个细胞/孔铺于基质胶包被的6-孔板中不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的mTeSR中。24小时后，将培养基换成新鲜的mTeSR或者含不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的hESm中。在更换培养基后48小时时，收获细胞提取RNA或蛋白质。通过QPCR检测mTeSR(a)或hESm(b)中生长的细胞中的Oct3/4和Nanog表达，或者通过Western分析检测hESm中生长的细胞中的Oct3/4和Nanog表(c，d)。生长在不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的mTeSR中的细胞的条件指示为“对照”。从hiPS细胞得到相似结果(数据未显示)。对于QPCR，将数据针对β-肌动蛋白表达水平进行标准化。在Y轴上的表达水平以任意单位显示(对照设置为1.0)。对于Western分析，β-肌动蛋白用作加样对照。(e)还对在相同条件下(含5μM或不含肌球蛋白II马达活性抑制剂的hESm)生长的细胞开展免疫细胞化学以检测Oct3/4表达。在每一条件之间使用完全相同的参数，包括对于每一滤光片的曝光时间捕获图像。相差图像显示生长于hESm中的细胞表现出大而扁的形态，而生长于mTeSR(对照)中的细胞保持紧凑且致密的形态。标尺，25μm。(f)通过QPCR分析在LIF存在下生长的野生型(RW4)和NMHCIIA^-/A^-mES细胞中的Oct3/4和Nanog的表达。数据针对β-肌动蛋白表达水平标准化。对照设置为1.0。(g)通过Western分析评价在LIF存在或缺乏下生长2天的相同组的mES细胞系。β-肌动蛋白用作加样对照。

图9A-H显示肌球蛋白II马达活性抑制剂处理支持完全确定条件下的hPS细胞的自我更新。(a-d)hiPS细胞于肌球蛋白II马达活性抑制剂存在下在PDL上生长20代。显示了在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL条件(a)或标准无饲养层条件

(b)下的hiPS细胞的形态血。通过使用共焦显微镜的免疫荧光评价在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL条件下生长的细胞Oct3/4表达的高倍图像或相差图像(c)。(d)通过Western分析评价在标准无饲养层(基质胶)、肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL或Y-27632/PDL条件下生长的细胞中的Oct3/4和Nanog表达。β-肌动蛋白用作加样对照。(e)通过计数活细胞数量确定在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL、Y-27632/PDL或标准无饲养层(基质胶)条件下培养的hiPS细胞的细胞生长曲线。每一数据点显示为平均值±SD，n＝3。在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL、Y-27632/PDL或标准无饲养层条件下生长的细胞的群体倍增时间分别为约32.1小时、32.2小时或31.8小时。从hES细胞得到相似的结果。(f)将在肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL条件下生长20代的细胞收获，并将大约2×10⁶个细胞皮下注射入SCID/beige小鼠内。4至8周后，收集畸胎瘤，并进行组织学评价。证实每一畸胎瘤样品中存在3胚层衍生的组织。(g)通过免疫荧光分析检查石蜡包埋的畸胎瘤切片。在畸胎瘤来源的组织中检测到组织特异性标记物，例如巢蛋白、甲胎蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。(h)通过标准的G-显带对在确定条件(肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL)下生长20代的hiPS(FS)细胞进行核型分析，并证实保持染色体完整性。标尺，25μm。

图10A-D显示肌球蛋白II马达活性抑制剂处理增强粘附条件下的hPS细胞的存活。(a)hiPS细胞以1×10⁵个细胞/孔接种于基质胶包被的12-孔板中。24小时后，通过台盼兰排染测定法计数活细胞的数量。数据是平均值±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝3。(b)hiPS细胞的凋亡测定。在荧光显微镜下检测TUNEL-FITC-阳性细胞，并且计算TUNEL-阳性细胞数与PI-阳性细胞数的比率。数据是平均值±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，n＝3。(c)在PDL包被的皿中的含不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂培养基中生长24小时的hiPS细胞的高倍相差图像。注意用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的粘附细胞的延长的细胞突起。(d)使用铺于PDL包被皿上的hiPS细胞测定不同浓度MLCK抑制剂ML-7对细胞生存力的作用。观察到细胞存活没有显著增加。从使用hES细胞的实验得到相似的结果。标尺，25μm。

图11A-C显示通过肌球蛋白II马达活性抑制剂增强悬浮培养的hiPS细胞的存活。hiPS(NHDF1)细胞在肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632存在或缺乏下悬浮培养生长2天，并进行活细胞计数(a)和TUNEL测定(b)。数据是平均值±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，n＝3。(c)悬浮条件下生长的hiPS细胞以不同浓度的ML-7处理。在以ML-7处理的细胞中观察到存活率没有差异。

图12显示在确定条件下培养的hES细胞中保持了染色体完整性。hES(H9)细胞在确定条件(肌球蛋白II马达活性抑制剂/PDL)下生长20代，并通过标准G-带核型分析评价。证实了没有异常的雌性核型分析。

如本领域技术人员将意识到的那样，在附图中表示的数据和信息仅是代表性的并且没有描述本公开的全部范围。

具体实施方式

如本文和后附权利要求书中所使用，单数形式“一”、“和”和“the”包括复数形式，除非上下文明确地另外说明。因此，例如，当提到“细胞”时包括此类细胞的复数形式，并且当提到“试剂”时包括本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等等。

同样，“或”的使用意思是指“和/或”，除非另外说明。类似地，“包含”、“包含着”、“包含的”、“包括”、“包括着”和“包括着”可互换并且不旨在是限制性的。

还应当进一步理解，当使用术语“包含”描述不同实施方案时，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施方案可备选地使用“基本上由......组成”或“由......组成”描述。

虽然在实施本公开的方法和组合物中可使用与本文所述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料，但是本文描述示例性的方法、装置和好材料。

除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。因此，如在本申请通篇中所使用，下列术语将具有下列含义。

多能干细胞是经历自我更新而同时保持了产生所有三胚层衍生组织和生殖细胞谱系能力的细胞类型。虽然来源于人胚泡的多能人胚胎干细胞(hES)是用于治疗疾病和病症例如帕金森病、心肌梗塞、脊髓损伤和糖尿病的基于细胞治疗的有希望的来源，但是由于它们的免疫原性和伦理问题妨碍了它们的临床潜能。

本公开证明，Rho-Rock-肌球蛋白II(RRM)信号轴调节细胞-细胞以及细胞-基质相互作用，以及hiPS和hES细胞两者的细胞存活。

基于该信息，本公开提供组合肌球蛋白II的化学抑制剂的培养系统(例如肌球蛋白II选择性的化学抑制剂)。此外，本公开证明生长在确定的合成的D-赖氨酸上的hES和hiPS可以用于培养hES和hiPS细胞。因此，进一步添加低浓度肌球蛋白II抑制剂(例如诸如肌球蛋白II马达活性抑制剂及其类似物)与单一的合成基质的组合，以及完全确定成分培养基提供了如此的培养系统，即其减少(或消除)来自人来源或动物来源培养系统的病原体的存在。

可以使用本公开培养基培养的细胞类型包括来自任何哺乳动物包括人、猴和猿的干细胞，并且包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和Nanog iPS细胞(见例如Nature，448：313-318，2007年7月；和Takahashi等，Cell，131(5)：861-872；该两篇文献通过参考并入本文)。例如，诱导的多能干细胞(iPS或iPSC)是通过(内源基因的)选择性基因表达或者通过以异源基因转染从非多能细胞得到的一种类型的多能干细胞。

诱导的多能干细胞由日本京都大学的Shinya Yamanaka研究组描述。Yamanaka已经鉴定了在胚胎干细胞中特别活跃的基因，并使用反转录病毒以选择的这些基因转染小鼠成纤维细胞。最后，分离了对于多能干细胞产生必需的四个关键的多能性基因：Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4。通过抗生素选择从细胞中分离出Fbx15⁺细胞。该研究组与来自哈佛大学、MIT和加州大学洛杉矶分校的两个其他独立研究组一起公布了的一项研究显示成功地将小鼠成纤维细胞重编程进入iPS并且甚至产生活的嵌合体。

虽然iPS细胞与ES细胞在分子和功能水平实际上相同，但是将它们的治疗潜能转化成医学应用存在关键的障碍。问题之一是，由于用于iPS细胞重编程和繁殖的当前标准方案包括不适宜用于潜在临床目的的动物来源的材料，所以需要开发产生和扩增hiPS细胞的确定的方法。

用于hiPS和hES细胞的培养环境基本上依赖于两大主要元素，即培养基和ECM包被，后者包括基质胶，一种广泛用于无培养层培养方法的小鼠肿瘤细胞来源的ECM的混合物。虽然在理解自我更新机制中的最新进展已经导致制造出完全限定培养基，由于ECM结构成分的复杂性和关于多能干细胞细胞-细胞或细胞-基质相互作用方面的基础研究积累不足，所以满足严格的临床标准的包被方法的开发仍然是主要的挑战。

细胞迁移、肌球蛋白合成和ECM相互作用在细胞发育、分化以及某些疾病例如动脉粥样硬化、关节炎和肾小球肾炎的发展中是重要的。细胞迁移的最初事件是突出物向迁移方向的极化和延伸。Rho家族小GTP酶通过调节细胞骨架和细胞粘附控制这些突出物(板状伪足和丝足)的形成。Rac和Cdc42分别参与板状伪足和丝足的形成，并且Rho参与张力纤维的形成和收缩。通过这些Rho家族成员的协同调节使细胞能够迁移。

当通过激动剂刺激细胞时，GDP结合形式的Rho家族小GTP酶转变成GTP结合形式，并且它们与效应分子相互作用。Rho通过其效应分子例如Rho-激酶/ROCK/ROK和肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白结合亚基(MBS)调节肌球蛋白磷酸化(Kimura等，1996)。活化的Rho与Rho-激酶和MBS相互作用并活化Rho-激酶。随后，活化的Rho-激酶磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)和MBS。MBS的磷酸化使肌球蛋白磷酸酶失活。

ESC源自胚泡的内细胞团(ICM)。ESC可无限生长(自我更新)而同时保持产生所有体细胞类型和生殖细胞谱系的能力(多能性)。这种特异性的干细胞功能已经在分子水平进行了研究，结果鉴定出主要转录因子例如Oct3/4和Nanog以及分泌的信号分子包括白血病抑制因子(LIF)、骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt具有关键作用。最近对hESC的诱导开启了使用多能干细胞作为治疗疾病例如帕金森病和糖尿病的细胞移植治疗来源的大门。随着对hESC用于医学应用研究需求的日益增加，有必要研究如何调节多能性以开发过硬的技术以便诱导和扩大在诱导任何分化类型的成体细胞之前处于整个细胞治疗策略中心地位的hESC。

干细胞是能够分化成其它细胞类型，包括具有特定的专门功能的那些细胞(例如组织特异性细胞、实质细胞及其祖细胞)的细胞。祖细胞(即“专能”)是可以产生不同的终末分化细胞类型的细胞，和能够产生不同祖细胞的细胞。产生一些或许多，但并非全部生物体细胞类型的细胞常常称作“多能性”干细胞，其能够分化成成熟生物体身体内的任何细胞类型，虽然在不重编程时它们不能够去分化成衍生它们的细胞。如将认识到的那样，“专能干细胞/祖细胞(例如神经干细胞)比多能干细胞具有更窄的分化潜能。比多能干细胞甚至更原始的另一类细胞(即未定型至走向特定分化的命运)是所谓的“全能”干细胞(例如受精卵，处于发育中二细胞和四细胞阶段的胚胎细胞)，可具有分化成特定物种任何细胞类型的能力。例如，单个全能干细胞将产生完整的动物，以及特定物种(例如人)中存在的无数的细胞类型。

如可认识到的那样，在分离和培养干细胞用于移植、细胞再生和取代治疗、药物开发、产生模型系统用于研究哺乳动物发育、以及基因治疗存在很大的兴趣。然而，当前的培养条件在其维持分离的干细胞处于未分化但增殖状态的能力有限。例如，使用已经补加白血病抑制因子(LIF)的无饲养层培养可以维持胚胎干细胞和生殖细胞。另一方面，当细胞在没有适当的饲养细胞层或者来自适当饲养细胞系的条件培养基情况下培养时，甚至在LIF存在下培养时，用于维持人胚胎干细胞的常规技术导致它们快速分化。

此外，培养未分化干细胞的当前方法除了需要添加饲养细胞层(或者来自适当饲养细胞系的条件培养基)外，还需要诸如使用血清。对成分诸如血清、饲养细胞和/或条件培养基使培养干细胞过程复杂化，另外，对于体内应用，培养条件会导致异种材料的污染。此外，饲养细胞和异种培养成分(例如胎牛血清等等)的使用增加了干细胞被不必要成分(例如异常细胞、病毒、会引起干细胞群体接受体内免疫反应的细胞、异种融合细胞等等)污染的风险，因此限制了干细胞作为治疗剂或者在生产治疗剂中的治疗潜能。

本公开提供用于在缺乏动物产物的情况下培养干细胞的组合物、方法和系统。因此，本公开提供无动物产物的干细胞、使用此类干细胞的方法和包含此类干细胞的组合物。本公开还提供用于在饲养细胞和动物材料缺乏情况下在完全确定成分培养基中培养干细胞，而同时维持高生存力(例如等于或高于典型的干细胞培养技术)并维持细胞处于未分化状态的方法和组合物。本公开包括修饰干细胞维持过程中的细胞信号发放，由此组织分化并且同时维持旺盛的细胞增殖的方法和组合物。例如，本公开的培养基将缺乏N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和/或乳酸脱氢酶增高症病毒(LDEV)，它们是来源于存在动物产物的培养基的污染物。

本公开证明，通过选择性化学抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂抑制肌球蛋白II增强hiPS和hES细胞的细胞-基质相互作用和细胞存活，这是人多能干细胞在临床相关培养环境下成功生长的关键要素。

此外，由于用于hiPS细胞和hES细胞诱导过程的培养条件与用于人多能干细胞常规维持和生长的培养条件基本上相同，所以本公开中开发的技术可用于产生无动物来源材料的新的hiPS和hES细胞系。

通过由特异性细胞内信号传导途径调节的多种粘附分子、它们互联的支架蛋白质以及肌动蛋白-细胞骨架的协同合作实现细胞-细胞接触。虽然研究已经证明，数种细胞外分泌性信号分子例如LIF、BMP、FGF、TGF-β/Nodal和Wnt对于多能性遗传程序是重要的，但是关于控制细胞-细胞通讯和整合的特异性细胞内信号分子在多能ESC内的功能意义知道的很少。

细胞-细胞接触受多种类型粘附分子和互联骨架结构，包括肌球蛋白的调节，肌球蛋白是一种ATP-驱动的分子马达，其还决定细胞结构和极性细胞功能。siRNA介导的功能丧失实验证明，对于ES细胞的细胞粘附需要非肌肉肌球蛋白II。肌球蛋白II是双头常规肌球蛋白，它包括三种同种型，IIA，IIB和IIC，它们当中除了IIC外均在ES细胞中表达，而分化的细胞表达所有这三种同种型。惊人的是，当肌球蛋白IIA和IIB同种型同时缺乏时，细胞表现出细胞-细胞接触的瓦解，这模拟了在缺乏Rho和Rock功能的细胞中所观察到的表型。Rock磷酸化MYPT1并使其失活，以保护驱动肌球蛋白II功能的磷酸化的活化形式MRLC。发现MYPT1专一性地定位于mES细胞中的细胞-细胞接触部位。如果Rock通过抑制mES细胞中的MYPT1控制肌球蛋白功能，则缺乏MYPT1将从Rock抑制剂的强大效应中援救本来的细胞-细胞通讯。与该假设相一致，在抑制剂处理之前或之后使MYPT1缺乏分别导致细胞-细胞接触明显地保护或恢复。

当ESC在未分化状态下生长时，保持了较小的细胞大小和高的核/质比并经历紧密的集落形成。然而，当它们开始分化时表现出更大的和更扁的形态学，并且偶尔降低细胞-细胞接触，然后迁移至集落的外面。不管形态学观察的描述性性质如何，由于形态学准确地代表干细胞的特异生物学状态，所以它仍然常规用作主要且可靠的指标确定ESC分化状态。

整联蛋白和受体酪氨酸激酶(RTK)通过例如G蛋白偶联受体(GPCR)向细胞骨架发信号可导致对细胞的活性，包括细胞形态、迁移、增殖和存活的变化产生不同的影响。整联蛋白与黏着斑(FA)复合体的其它成分一起充当细胞外基质和细胞骨架之间的连接。整联蛋白活化导致黏着斑激酶(FAK)和Src激酶活化，这导致其它FA成分例如桩蛋白和Crk相关底物p130CAS的磷酸化，以及信号衔接蛋白的募集。这除了FA动力学和FA周转之外，还通过肌动蛋白装配实现。

RTK以相似的方式利用内在的酪氨酸激酶活性磷酸化它们的细胞内环和/或相关信号成分上的部位。这导致衔接蛋白和调节磷酸肌醇信号下游介导物的信号激酶的募集，小的GTP酶活化，和MAP激酶级联。GPCR利用异源三聚体G蛋白起始的第二信使欧联至相似的信号机制，影响肌动蛋白动力学行为。

细胞对外界信号的细胞内调节通过大量的信号级联发生，包括Rho家族小的GTP酶(Rho、Rac和cdc42)和它们的激活剂，鸟苷酸交换因子(GEF)，以及下游蛋白质激酶效应子，包括Rho-激酶/ROCK和p21活化激酶(PAK)。这些级联使调节肌动蛋白细胞骨架行为的蛋白质聚集，包括肌动蛋白相互作用调节性蛋白质例如肌动蛋白丝切蛋白、Arp2/3、Ena/VASP、成蛋白、肌动蛋白抑制蛋白和凝溶胶蛋白。通过不同途径发信号可导致不同肌动蛋白依赖性结构的形成，它们的协调装配/分解对于定向细胞迁移和其它细胞行为是重要的。还通过向肌球蛋白发信号调节迁移，这涉及前缘肌动蛋白动力学并能使细胞后部收缩。

Rho是小的GTP结合蛋白质，其已经被证明是髓磷脂衍生的生长抑制性信号的中心整合者(McKerracher和Winton，Neuron，36：345-348，2002)。在髓磷脂相关抑制剂(例如MAG或Nogo-A)缺乏情况下，据信因为Rho-GDI-诱导的Rho活性的阻抑，发生神经生长和再生。在一个非限定性的机制中，髓磷脂相关抑制剂(例如MAG和Nogo-A)结合NgR，其反过来结合并活化p75。活化的p75使Rho-GDI远离Rho，使得Rho通过将GDP换成GTP而变成活化的。然后活化的GTP结合的Rho与信号蛋白质例如Rho激酶(ROCK)相互作用抑制轴突生长和再生(综述于Kaplan和Miller，Nat.Neurosci.，6：435-436，2003中)。

Rho GTP酶家族蛋白，包括RhoA、Rac1和Cdc42，控制广泛的细胞过程，例如细胞形态、运动、增殖、分化和凋亡(Hall，1994；Van Aelst andD′Souza-Schorey，1997)。

Rho相关的形成卷曲螺旋的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族成员是Ras相关小GTP酶Rho的效应子。ROCK家族包括p160ROCK(ROCK-1)、ROK α/Rho-激酶/ROCK-II、蛋白激酶PKN以及citron和citron激酶。ROCK涉及多种疾病和病症，包括高血压、脑血管痉挛、冠状血管痉挛、支气管哮喘、勃起功能障碍、青光眼、血管平滑肌细胞增殖、心肌肥大、malignoma、缺血/再灌注引起的损伤、内皮功能障碍、克隆病和大肠炎、神经突生长物、雷诺氏病、咽痛、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和心脏肥大以及血管周纤维化。

ROCK的两种同种型包括ROCK1(其还称作ROK-β或p160ROCK)和ROCKII(其还称作ROK-α或Rho-激酶)。两种同种型具有65％的总体序列相似性，并且激酶结构域包含92％的序列同一性。虽然两种同种型在组织中遍在表达，但是它们在某些组织中强度不同。

ROCK1是具有Ser/Thr蛋白激酶活性的RhoA结合蛋白并且长度为1358个氨基酸。多肽包括在N-末端的催化激酶结构域，其长度大约300个氨基酸并且包含Ser/Thr激酶特征性的保守性模体；激酶结构域还涉及与ROCK活性负调节物RhoE结合。此外，ROCK1的C-末端具有数个功能结构域，包括易弯曲的卷曲螺旋区域内的Rho-结合结构域、pleckstrin同源(PH)结构域和半胱氨酸丰富结构域。在一些实施方案中，PH结构域对于通过与脂质信使例如花生四烯酸的调节可能是必需的。当ROCK的羧基末端与激酶结构域相互作用时降低激酶活性，从而证明了ROCK具有自身抑制活性。长度大约80个氨基酸并且对于与活化的RhoA相互作用所需的Rho-结合结构域与一些Rho结合蛋白质中存在的结构域具有相当大的序列相似性。

示例性的ROCK抑制剂包括Y-27632和法舒地尔，它们结合激酶结构域以ATP竞争性机制抑制ROCK的酶活性。ROCK活化的负调节物包括小的GTP结合蛋白质例如Gem、RhoE和Rad，它们可以减弱ROCK活性。还可以使用H-1152二盐酸盐(H-1152P-2HCl；(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉)磺酰]高哌嗪)。另外的ROCK抑制剂包括国际申请公布号：WO 01/56988；WO 02/100833；WO 03/059913；WO 02/076976；WO 04/029045；WO 03/064397；WO 04/039796；WO 05/003101；WO 02/085909；WO 03/082808；WO 03/080610；WO 04/112719；WO 03/062225；和WO 03/062227中描述的那些。在这些例子中的一些例子中，抑制剂中的模体包括吲唑核；2-氨基吡啶/嘧啶核；9-脱氮鸟嘌呤衍生物；含苯甲酰胺；含氨基呋咱；和/或其组合。例如，WO 03/080610涉及作为激酶抑制剂例如ROCK抑制剂的咪唑并吡啶衍生物以及用于抑制ROCK1和/或ROCK2效应的方法。上面所引用申请的公开通过参考并入本文。

Rho的另一抑制剂是S-法呢基硫代水杨酸(FTS)及其衍生物和类似物。另一抑制剂是包含咪唑的苯二氮和类似物(见例如WO 97/30992)。Rho抑制剂还可以通过与ROCK(Rho活化激酶)相互作用作用于下游，导致Rho抑制。此类抑制剂描述于美国专利号6,642,263中(其公开全文通过参考并入本文)。可以使用的其它Rho抑制剂描述于美国专利号6,642,263和6,451,825中。此类抑制剂可以使用常规细胞筛选测定法鉴定，例如描述于美国专利号6,620,591(它们全文通过参考并入本文)中的方法。在本公开的特定实施方案中，靶向ROCK1，而不是ROCK 2，其中试剂结合变构部位导致抑制ROCK1。

由于只有活性形式的Rho GTP酶可以通过结合特异的效应蛋白质(对于Rho信号传导途径为Rho激酶和Diaphanous的哺乳动物同系物mDia)而将信号传导至下游途径，所以认为它们是时空性整合肌动蛋白细胞骨架和分子马达成为高等亚细胞结构特定构象的分子开关(图1)。虽然已经在许多不同细胞类型中广泛研究了Rho家族蛋白质对于多方面生物学功能的重要作用，但是在本文描述它们对于干细胞调节的作用的研究。

研究表明，Rho GTP酶对于控制成年皮肤、造血和间质干细胞中的干细胞功能起着关键的作用。本公开证明，ESC利用Rho信号传导途径控制细胞-细胞完整性同时维持多能性。

本公开证明，抑制ROCK导致干细胞(例如人胚胎干细胞-hESC和诱导的干细胞)具有不需要任何包被例如细胞外基质而在塑料培养皿上生长的能力。此外，本公开证明，抑制肌球蛋白I I的活性还调节干细胞(例如hES和hiPS)生长和维持多能性的能力(对于所述途径的示意图见例如图5)。

在一个实施方案中，提供包含肌球蛋白II抑制剂的培养基。在另一实施方案中，提供包含ROCK抑制剂、肌球蛋白II抑制剂或其组合的培养基。培养基用于在饲养层或细胞外基质包被组织培养材料缺乏下培养干细胞，包括hESC和hiPS细胞。在另一实施方案中，培养基用于在聚-D-赖氨酸包被的组织培养材料上培养干细胞。

在又一实施方案中，培养基除了包含ROCK抑制剂、肌球蛋白II抑制剂或其组合外还包含其它成分。例如，培养基可包含氨基酸(例如非必需氨基酸)、抗生素、杀真菌剂、生长因子、LIF、含硫生物活性化合物(例如β-巯基乙醇)、丙酮酸盐(例如丙酮酸钠)、血清(例如人血清、牛血清)及其任意组合。优选地，任何另外的试剂可以来自与待培养干细胞相同的物种，或者可以化学性合成。在仍然进一步优选的实施方案中，细胞培养基和培养条件缺乏任何动物来源的产物。

本公开部分地基于生物学试剂可以用于促进在缺乏动物来源产物情况下培养的干细胞的增殖和强壮的发现。此外，本公开基于本公开的生物学试剂还促进在饲养层缺乏下的干细胞培养物生长、复制和强壮的发现。培养基可以是基本上无血清的，并且不需要使用饲养细胞层或者来自分开培养的饲养细胞的条件培养基，虽然在一些实施方案中，其可以用于在对于连续传代(例如1-50代或更多代)的将细胞转移至新鲜的、无饲养层培养基之前的包括异基因饲养细胞(或者来自此类细胞的条件培养基)的生长环境中最初培养干细胞。

根据本公开的培养基包含肌球蛋白II抑制剂、ROCK抑制剂或其组合。培养基还可包括但不限于非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子和丙酮酸盐。基础培养基可以是例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F-12或KO-DMEM，每一种添加有L-谷氨酰胺(例如包括二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Invitrogen))、非必需氨基酸和β-巯基乙醇。培养基有代表性地在加入至细胞培养物中之前已经灭菌(例如通过过滤)。培养基还可以补加有抗生素和杀真菌剂。

示例性的肌球蛋白II抑制剂包括肌球蛋白II马达活性抑制剂(同义词：1-苯基-1，2，3，4-四氢-4-羟基吡咯并[2.3-b]-7-甲基喹啉-4-酮；C₁₈H₁₆N₂O₂)和具有通式I的类似物：

式I

其中R^1-4每一个独立的是甲基或氢。

肌球蛋白II马达活性抑制剂阻断分支，延伸。然而，可以使用特异性较差的肌球蛋白抑制剂，例如BDM。在文献中公布了肌球蛋白II马达活性抑制剂的数种功能类似物(Lucas-Lopez等，2008)。由于肌球蛋白II功能受肌球蛋白轻链激酶(MLCK)调节，所以MLCK抑制剂例如ML-7和ML-9还可用于阻断肌球蛋白II的活性。在一个实施方案中，大约1.25-10μM之间的肌球蛋白II马达活性抑制剂浓度是有益的。在该范围当中，已经常规使用2.5μM的化合物与聚-D-赖氨酸包被组合用于长期的细胞培养，这对人ES和iPS细胞表现出相当高且一致的平板效率和抗细胞凋亡效应。

生长因子指有效促进干细胞生长，并且除非作为添加物添加至培养基中否则不是基础培养基成分的物质。生长因子包括，但不限于，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、血小板来源生长因子-AB(PDGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)、激活蛋白-A、Wnt和骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、细胞因子、趋化因子、形态发生素、中和抗体、其它蛋白质和小分子。

外源性生长因子也可加入至本公开的培养基中以帮助维持干细胞培养物处于基本上未分化状态。此类因子以及它们的有效浓度可以如本文别处所述鉴定，或者使用培养细胞领域技术人员已知的技术鉴定。用于本公开组合物和方法的生长因子的代表性实例包括bFGF、胰岛素、酸性FGF(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、IGF-II、血小板来源生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)、激活蛋白-A、骨形态发生蛋白(BMP)、毛喉素、糖皮质激素(例如地塞米松)、转铁蛋白和白蛋白。

基础培养基指有效支持所培养细胞生长的氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液，虽然正常情况下这些化合物不支持细胞生长，除非添加有另外的化合物。营养素包括可以被细胞代谢的碳源(例如糖如葡萄糖)，以及对于细胞存活所必需的其他化合物。有一些化合物细胞自身不能合成，因为细胞缺乏一种或更多种编码合成化合物(例如必需氨基酸)所必需一种或多种蛋白质的一个或多个基因，对于细胞可以合成的化合物，由于细胞的特定发育状态造成编码必需的生物合成性蛋白质的一个或多个基因的表达水平不足。虽然可以采用可以添加bFGF、胰岛素和抗坏血酸并支持干细胞以基本上未分化状态生长的任何基础培养基，但是许多基础培养基是哺乳动物细胞培养领域已知的，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、敲除DMEM(KO-DMEM)和DMEM/F12。

“条件培养基”指还添加有来自培养基中所培养细胞的可溶性因子的生长培养基。用于从细胞培养物中分离条件培养基的技术是本领域众所周知的。正如将认识到的那样，条件培养基优选地基本上无细胞。在本文中，“基本上无细胞”指包含与分离条件培养基的培养基相比，每单位体积细胞数少于大约10％、优选地少于大约5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％的条件培养基。

“确定成分”培养基指仅由生物化学性确定组分组成的生物化学确定的配方。确定成分培养基可仅包含具有已知化学组成的组分。确定成分培养基还可包括来自已知来源的组分。例如，确定成分培养基还可包括从已知组织或细胞分泌的因子和其它成分；然而，确定成分培养基将不包括来自此类细胞培养物的条件培养基。因此，“确定成分培养基”将根据所标明包括添加的特定化合物以形成培养基，一直到并且包括已经分级分离去除至少一种在未分级分离的条件培养基样品中可检测到的成分的部分条件培养基。在此，“基本上去处”一种或多种可检测的条件培养基成分指，从条件培养基中去除至少一定量的可检测的、已知的一种或多种成分，以致于产生与未分级分离的条件培养基在支持灵长类干细胞长期基本未分化培养的能力不同的分级分离的条件培养基。条件培养基的分级分离可通过适于去除可检测的一种或多种成分的任何方法(或方法组合)实现，例如凝胶过滤层析、亲和层析、免疫沉淀等等。类似地，或者“确定成分培养基”可包括来源于动物的血清成分，包括人血清成分。在本文中，“已知的”指本领域普通技术人员的关于化学成分或组成的知识。

当细胞培养中不包含来自饲养细胞培养物的外源性添加条件培养基，也不在培养基中外源性添加培养饲养细胞时，则细胞培养物是“基本上无饲养层的”，其中“无外源性添加饲养细胞”意思是指细胞发生由于该原因没有有意引入的饲养细胞层。当然，如果待培养的细胞来源自包含饲养细胞的种子培养物，将一些少部分的这些饲养细胞与想要的细胞(例如未分化干细胞)偶然共分离并随后引入到另一培养物中不认为是有意的引入饲养细胞。类似地，从接种在培养基中的干细胞发展而来的饲养细胞或饲养样细胞不认为是有意引入至培养基中。

“非必需氨基酸”指对于给定的细胞类型不需要向培养基中添加的氨基酸种类，有代表性地因为细胞合成或者能够合成特定氨基酸种类。虽然在物种与物种之间存在差异，但是已知非必需氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸。

当细胞培养中不包含外源添加的血清时，则细胞培养物是“基本上无血清的”。如果正在培养的细胞产生一些或者全部的血清成分，或者如果待培养的细胞来源于在包含血清的培养基中生长的种子培养物时，则一些少量的血清(例如少于大约1％)偶然共分离并随后引入到另一培养物中不应该认为是有意的引入血清。

有用的还原剂包括β-巯基乙醇。另外的还原剂例如单独或组合的单硫代甘油或二硫代苏糖醇(DTT)可以用于相似的作用。其它等效物质将是细胞培养领域技术人员熟悉的。

丙酮酸盐一可以包含在本公开的培养基中。丙酮酸盐包括有效维持和/或增强干细胞以基本未分化状态生长的丙酮酸钠或另一丙酮酸盐，例如丙酮酸钾。

适宜向本公开的培养基中补加的更多的化合物包括核苷(例如腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷和胸苷)和核苷酸。可以包含不同浓度的核苷和/或核苷酸。

如将意识到的那样，希望不断地或者以定期间隔，代表性地每1-3天以新鲜培养基替换失去效力的培养基。使用新鲜培养基的一个优点是具有调节条件以致于细胞更均一地和比在根据常规技术在饲养细胞上或者条件培养基上培养时更快速的扩大生长的能力。

当与先前的起始细胞群体相比时，可以得到的干细胞群体扩大4、10、20、50、100、1000或更多倍。在适宜的条件下，与用于起始培养的干细胞相比，扩大的群体中的细胞将有50％、70％或更多处于未分化状态。可以通过将培养结束时收获的细胞的大约数量除以开始接种到培养基中的细胞数量计算每一代扩大的程度。当生长环境的几何形状受限或者其它原因，可任选地将细胞传代进入相似的生长环境中用于进一步扩大。总的扩大是所有每一代扩大的乘积。当然，没有必要保留每次传代的所有扩大的细胞。例如，如果在每次培养中细胞扩大2倍，但是每次传代只保留大约50％的细胞，因此大约相同数量的细胞将会转入下一代中。但是在四次培养之后，可以说细胞已经经历了16倍的扩大。可以通过本领域已知的低温冷冻技术储存细胞。

使用技术人员众所周知的方法，例如Doetschman等，(1985)J.Embryol.Exp.Mol.Biol.87：27-45)描述的那些方法产生和维持胚胎干细胞。可使用任何ES细胞系。有代表性的用于产生ES细胞的一个小鼠品种是129J品种。另一ES细胞系是鼠细胞系D3(美国典型培养物保藏中心，目录号CKL 1934)。又一ES细胞系是WW6细胞系(Ioffe等，(1995)PNAS 92：7357-7361)。人胚胎干细胞(hESC)可以从例如自人体内植入前胚胎、体外受精的胚胎或者扩大至胚泡阶段的单细胞人胚胎得到的人胚泡分离(Bongso，等，(1989)，Hum.Reprod.，vol.4：706)。人胚胎可以在G1.2和G2.2培养基中培养至胚泡阶段(Gardner，等，(1998)，Fertil.Steril.，vol.69：84)。通过短暂接触链霉蛋白酶(Sigma)将透明带从胚泡中去除。通过免疫外科或通过机械分离可分离内细胞团，并铺板于小鼠胚胎饲养层上或者如本文所述的确定成分培养系统中。在9至15天后，通过与含1mM EDTA的无钙和镁的磷酸缓冲盐(PBS)接触、通过与中性蛋白酶、胶原酶或胰蛋白酶接触、或者通过使用微量移液器机械分离，将内细胞团衍生的生长物分开成团。然后将分开的细胞如以前重新铺板于新鲜培养基中并观察集落形成。通过微量移液器单独选择证明为未分化形态的集落，机械性地分散成团并重新铺板。胚胎干细胞样的形态表征为具有明显高核/质比和显著核仁的紧密集落。然后将所得到的胚胎干细胞常规性地通过短暂的胰蛋白酶消化、接触Dulbecco PBS(无钙或镁并含2mM EDTA)、接触IV型胶原酶(大约200U/mL)或者通过机械性分离例如使用微量移液器对单独集落的选择，每1-2周分开一次。

一旦分离后，可以使用任何适宜的细胞培养技术在本公开的支持干细胞基本上未分化性生长的培养基中培养干细胞。例如，在裂解灵长类饲养细胞(优选异基因饲养细胞)之前放置的基质或者合成的或纯化的基质可以使用标准方法制备。然后将待培养的干细胞加入至基质连同培养基的上面。在另外的实施方案中，一旦分离之后，未分化的干细胞可以直接加入至包含层粘连蛋白或生长停滞的人饲养细胞层(例如人包皮成纤维细胞层)的细胞外基质中，并在根据本公开的培养方法中维持于无血清的生长环境中。在又一实施方案中，干细胞可以直接加入至缺乏细胞外基质材料的生物相容性细胞培养板中(例如直接加入至聚苯乙烯、玻璃等上)。与目前使用常规技术培养的胚胎干细胞细胞系不同，根据本公开的方法制备和培养的胚胎干细胞及其衍生物避免或减少与饲养层中存在的异种抗原接触。这部分地因为培养基成分在饲养层缺乏情况下或者直接在细胞培养基质上促进生长。这避免了人细胞污染有例如非人动物细胞，将病原体从非人动物细胞传递到人细胞，形成异种融合细胞和将人细胞暴露于毒性的异种因素中的风险。

可以看出，本公开的细胞培养基以及用于根据本公开培养干细胞的方法适用于可用于干细胞的所有技术。例如，基于本公开的培养基和方法培养的细胞可以用于筛选鉴定用于以未分化状态培养干细胞的生长因子，以及诱导此类细胞向特定细胞或组织谱系分化的化合物。本公开还允许对待发育的干细胞进行遗传修饰，以及产生新的干细胞系。

本公开还提供包含肌球蛋白I I抑制剂和多种基础培养基成分的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或更多种ROCK抑制剂、细胞培养基质。在一些实施方案中，可以包含用于包被在基底上的基本上纯化的聚-D-赖氨酸或者细胞培养基底可以以聚-D-赖氨酸预包被。可以将试剂盒进行区室化以分隔开生物学试剂直到使用时将其加入至基础培养基中。

本公开的培养条件包含根据本公开的培养基和有代表性地包括生物相容性基底的支持干细胞未分化性生长的细胞培养容器。在一个实施方案中，生物相同性基底是固体的，例如塑料、陶瓷、金属或细胞可以粘附的其他生物相容性材料。在一个实施方案中，生物相容性基底包含聚-赖氨酸(例如聚-D-赖氨酸)。生物相容性基底可以排除任何细胞外基质成分。然而，在一些方面中，其可以用于提供最低数量的基质材料。有代表性地，基质材料来源于与细胞类型相同的物种。例如，可以适用细胞可以粘附的成分(例如基质)。在一个实施方案中，基底可以是，但不限于，尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(例如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE；TEFLON)、thermanox(TPX)，硝基纤维素、棉花、聚乙醇酸(PGA)、肠线、纤维素、明胶、葡聚糖、胶原、纤连蛋白和其多种组合。当培养容器上的基质材料或包被包括可在活生物体中找到的生物材料时，优选地，基质材料是化学合成的以避免出现会污染培养环境的任何动物产物或细胞培养材料。

培养容器可以是任何形状和大小，包括多孔组织培养板中的孔，或者大至搅拌的筒生物反应器。对于大规模应用，用于细胞粘附的表面积可以通过使用可以悬浮于培养基中的微珠或其他基底(例如塑料珠或聚合物)等增加，或者是包被的或者是未包被的。

使用此类方法，可以从所得到的细胞培养物中分离干细胞群体，例如人胚胎干细胞或hiPS细胞，由此代表了本公开的另一实施方案。此类群体可以通过任何适宜的技术分离。此类技术包括亲和层析、淘洗和荧光辅助的细胞分选。此类技术中每一种采用一种或更多种对于预示未分化状态的基于细胞的标志物所特异性的分离试剂(例如，但不限于抗体和抗体片段、受体基因/蛋白质等等。在基本上未分化人胚胎干细胞的情况下，此类标志物包括，例如，但不限于转录因子Oct-4和Nanog，和细胞表面标志物SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81。其它标志物包括端粒酶、Myc、p300和Tip60组蛋白乙酰转移酶、乙酰化组蛋白和碱性磷酸酶。还可以开展阴性选择，由此表达一种或多种预示着基本上未分化状态之外的标志物的细胞，或者备选地，不能表达特定标志物的细胞，可以从想要的细胞群体中去除。此类群体可以用于产生稳定的干细胞的细胞系，包括干细胞如人胚胎干细胞的细胞系。如果需要，可对此类细胞进行遗传修饰以便例如改变(即提高或降低)一种或多种内源基因的表达，和/或表达一种或多种引入至细胞内的基因。此类遗传修饰可以例如用于纠正特定干细胞系内检测到的遗传缺陷，以及产生异常细胞系(其可用作模拟或复制与特定疾病状态相关遗传背景的模型系统)。本公开的此类细胞系的分离群体可以定义为是无动物材料的干细胞(即它们没有与任何从动物得到的材料一起培养)。

本发明的另外的实施方案涉及使用干细胞的方法，包括根据本发明培养或分离的基本上未分化的干细胞。例如，此类细胞可以用于鉴定促进细胞分化的因子，或者备选地，它们持续维持在基本上未分化状态或者去分化至更加原始状态(例如从专能干细胞至多能或全能干细胞)的因子。简言之，在分化或者维持基本上未分化状态的背景中，此类方法包括例如，将肌球蛋白II抑制剂、ROCK抑制剂或其组合与在本公开培养基培养的基本上未分化的干细胞接触。在接触测试化合物之后，评价细胞以确定它们是否更好地维持在基本上未分化状态或者通过一种或更多种生物学试剂诱导分化。如果细胞已经更好地维持在基本上未分化状态，则生物学试剂可以鉴定为促进干细胞未分化状态或者自我更新的生物学试剂。如果细胞已经被诱导以致于分化，则测试化合物可以鉴定为促进基本上未分化干细胞分化的化合物。可以追踪分化中的细胞以确定它们的发育命运，换句话说，确定作为分化的结果它们将变成什么细胞谱系。在去分化背景中，分化程度更大状态的细胞(例如造血干细胞)接触一种或更多种化合物，然后评价它们以确定接触是否导致细胞成为比开始接触测试化合物的那些细胞更加原始的类型(例如干细胞)。如果是这样的话，产生效应的化合物被鉴定为促进细胞去分化或重编程的化合物。有代表性地，根据本公开的这些和其它筛选方法以高通量方式开展，以致于可以同时筛选众多的化合物。

本公开的另一实施方案包括干细胞系，特别是未分化的人胚胎干细胞系在根据本公开的确定成分的生长环境中的分离、确立以及培养。例如，根据本公开培养的干细胞，特别是在无异物生长环境中培养和维持的多能性未分化人胚胎干细胞(hESC)或hiPS细胞以及它们的衍生物(例如hESC衍生的专能神经干细胞、造血前体细胞、心肌细胞和胰岛素生成细胞等等)，可以治疗性使用。代表性的治疗性使用包括基于细胞的治疗以治疗病症例如心脏病、糖尿病、肝病、神经变性疾病、癌症、肿瘤、中风、脊髓损伤或疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和由单基因缺陷引起的病症。在此类方法中，向需要此种治疗的患者施用一群基本上未分化的人胚胎干细胞或者从基本上未分化人胚胎干细胞衍生的分化的细胞。虽然不是必须，但是可以对如此施用的细胞进行遗传修饰。

本公开的另一实施方案涉及以向特定组织或者细胞谱系分化的方式指导干细胞命运的方法。在此类方法的实例中，例如通过施用一种或更多种促进分化的因子，基本上未分化的干细胞(例如人胚胎干细胞)被诱导分化成特定细胞类型或者谱系。相反，本公开还涉及用于将更加发育定型的细胞重编程变成更加原始或者不成熟的方法。例如，人造血干细胞被诱导去分化变成不仅产生造血谱系而且还产生其他非造血细胞类型的细胞。在一个实施方案中，细胞培养在聚-D-赖氨酸基底上的包含肌球蛋白II抑制剂、ROCK抑制剂或两者的培养基中，以生长和维持未分化的多能性细胞类型。然后，通过将培养基替换成或者加入分化培养基或因子使未分化的细胞分化。

提供下列实施例以说明本公开的某些方面并且帮助本领域技术人员实施本公开。无论如何，这些实施例不能被认为是以任何方式限制本公开的范围。

实施例

化学物品.肌球蛋白II马达活性抑制剂(InSolution^TM肌球蛋白II马达活性抑制剂)、Y-27632(InSolution^TMY-27632)和ML-7购自EMD。PDL从Millipore得到。

细胞培养.检查了两个独立的hES细胞系，H9(WiCell)和BGN01(BresaGen)。在研究中使用的hiPS细胞包括iPS(包皮)克隆1(WiCell)和已经通过一系列分子和功能测定法表征的从正常人表皮成纤维细胞(NHDF)独立衍生的两个hiPS细胞。对于规则的无饲养层培养，hES或hiPS细胞生长在基质胶(BD Biosciences)包被平板上的确定成分培养基mTeSR(StemCell Technologies)中。细胞通过使用中性蛋白酶(Invitrogen)或胰蛋白酶-EDTA(Lonza)的标准方法常规传代。一般的干细胞培养技术描述于Freshney等，Culture of Human Stem Cells(Culture of Specialized Cells)，John Wiley & Sons，1992中(该文献的公开为了全部目的通过参考并入本文)。在实验中使用的mES细胞包括CJ7、E14、RW4(NMHCIIA^-/A^-mES细胞的亲本系)、NMHCIIA^-/A^-、和NMHCIIB^-/B^-mES细胞。细胞在1400U/ml白血病抑制因子(LIF)(Millipore)存在下的标准培养基中的有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞上或明胶(Sigma)包被的皿上维持。对于显微镜或免疫荧光分析，细胞以大约5000-10000个细胞/cm²铺板。对于确定成分培养，细胞以大约10000个细胞/cm²铺于以PDL新鲜包被的板上或者PDL-预包被板(BD Bioscience)上的添加有2.5至5μM肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632的mTeSR中。取决于汇合程度，每天或每隔一天更换培养基。通过使用胰蛋白酶-EDTA每3至4天将细胞传代一次。

对于细胞生长测定，hiPS或hES细胞以2.5×10⁴个细胞/cm²铺于PDL或基质胶包被板上的存在5μM肌球蛋白II马达活性抑制剂或者5μMY-27632(PDL)或者缺乏化合物(基质胶)的mTeSR中。在标明的时间点收获细胞，用台盼蓝染色并且通过血球计数器计数。

克隆测定.将添加或不添加肌球蛋白II马达活性抑制剂的mTeSR中的hES或hiPS细胞以每孔一个细胞铺于基质胶包被96-孔板中。铺板7天后，使用碱性磷酸酶检测试剂盒(Millipore)根据生产商的说明书对细胞进行碱性磷酸酶测定。

细胞生存力测定.hES或hiPS细胞以1×10⁵个细胞/孔一式三份铺于PDL或基质胶包被12-孔板中的缺乏或存在不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632的mTeSR中。还向对照条件中加入DMSO(用于溶解肌球蛋白II马达活性抑制剂的溶剂)并且发现对生存力没有影响。对于mES细胞，除了使用明胶包被和mES培养基外，细胞在相同的条件下铺板。24小时后，收获细胞，胰蛋白酶消化至单细胞，并通过血球计数器计数。由两名研究者独立地开展细胞计数以证实一致性。在取出小部分样品用于细胞计数后，同一样品立即用于TUNEL测定。

对于悬浮培养下细胞生存力的评价，hES或hiPS细胞以5×10⁵一式三份铺于非组织培养处理的6-孔板中的包含不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632的非条件培养基标准hESm中。2天后，通过胰蛋白酶消化和用移液器充分吹打收获细胞，并且通过使用血球计数器和台盼蓝染色人工计数活细胞数。细胞存活率(％)表示活细胞数与铺板细胞数的比率。将同一样品进行TUNEL测定用于与来自细胞生存力测定的数据一起比较。

免疫染色.对于免疫细胞化学，在培养容器中生长的细胞用4％多聚甲醛(USBCorporation)固定。用PBS/BSA洗涤后，将样品与识别靶蛋白的初级抗体于4℃孵育过夜。在研究中使用的初级抗体包括Oct3(BD Biosciences)、肌球蛋白IIA(Covance)和肌球蛋白IIB(Covance)。将样品洗涤三次，并用以Alexa荧光团(Invitrogen)缀合的适当次级抗体室温孵育30分钟。在洗涤三次之后，将样品用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Invitrogen)复染，并通过配备CFI Fluor40×物镜的Nikon TE-2000-U荧光倒置显微镜(Nikon Instruments)或者配备Apochromate水浸透镜(Carl Zeiss)的Zeiss LSM 510共焦显微镜检查。

对于免疫组织化学，畸胎瘤样品的石蜡切片浸入二甲苯和一系列梯度乙醇中，然后与抗巢蛋白、甲胎蛋白或α-平滑肌肌动蛋白(均来自Chemicon)的初级抗体于4℃孵育过夜。包括与次级抗体孵育在内的剩余的步骤与上述的那些步骤相同。

TUNEL测定.一式三份用于细胞生存力测定的样品立即通过使用APO-DIRECT试剂盒(BD Pharmingen)并根据生产商的说明书用TUNEL测定法检测。通过在20×物镜的荧光显微镜下的血球计数器计数TUNEL(FITC)或碘化丙啶(PI)阳性细胞数。当需要时，通过使用40×物镜证实FITC标记的细胞以排除非特异性信号。每一样品评价至少300个细胞并且计数重复两次。计算TUNEL阳性细胞数与PI阳性细胞数的比值。代表性的结果示于从重复至少3次的实验得到的图中。虽然最初尝试了流式细胞术分析，但是由于甚至在充分的胰蛋白酶消化和吹打之后来自悬浮培养实验的细胞持续聚集，所以我们决定改成人工细胞计数，这很好地与来自细胞生存力测定的数据关联。

QPCR.通过使用Qiashredder和RNAeasy mini试剂盒(Qiagen)从细胞分离总RNA。提取的RNA样品通过UV分光光度计定量，并通过RNA Nano Lab chip(Agilent Technologies)鉴定质量。使用SuperScript III RT-PCR系统(Invitrogen)根据生产商的方案将2μg的总RNA反转录。使用MyiQ实时PCR检测系统(BioRad)并使用特异性PCR引物和FullVelocity SYBR Green QPCRmaster mix(Stratagene)将每一cDNA样品一式三份PCR扩增。通过iQ5光学系统软件(BioRad)检测每一循环的阈值(CT)，并通过β-肌动蛋白表达水平进行标准化。通过Primer Express软件(Applied Biosystems)设计引物序列，并通过Silico PCR(University of California，Santa Cruz)对它们与其他序列的可能的交叉反应性进行与筛选。对于引物使用的所有序列示于下表中。

畸胎瘤形成.所有的动物相关方案经过Institutional Animal Care and UseCommittee批准。在确定成分条件下偶尔冻融并多次传代生长的细胞(大约2×10⁶个细胞)皮下注射入重症联合免疫缺陷(SCID)/beige小鼠(Charles RiverLaboratories)中。4至8周后，将发生的畸胎瘤切下，在4％多聚甲醛或者10％福尔马林中固定，并进行组织切片制备。

Western分析.用RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mMNa₂EDTA，1mM EGTA，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，2.5mM焦磷酸钠，1mM β-甘油磷酸，1mM Na₃VO₄，和蛋白酶抑制剂)提取总蛋白质。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定蛋白质浓度。将相等量(20μg)的蛋白质家在每一泳道中，通过10％SDS/PAGE分离，并且转移至PVDF膜上(BioRad)。将膜在Odyssey封闭缓冲液(LI-COR Biotechnology)中封闭，然后与抗Oct3(Santa Cruz Biotechnology)、Nanog(Millipore)、肌球蛋白IIA(Covance)、肌球蛋白IIB(Covance)、裂解型胱天蛋白酶-3(Cell Signaling)或β-肌动蛋白(Sigma)的初级抗体于4℃孵育过夜，接着与过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG(JacksonImmunoResearch，Inc.)孵育，并且用ECL试剂(GE Healthcare)显色。

胚状体(EB)形成.通过使用中性蛋白酶或者胰蛋白酶-EDTA收获细胞，铺于不存在化合物的非组织培养处理的皿(大约10⁶个细胞/孔/6孔板)上，并在非条件hES培养基中生长14天。收获细胞用于蛋白质提取并进行Western。

核型分析.对于每一细胞系大约每10-20代开展标准的G-带核型分析。

统计学分析.通过使用方差分析(ANOVA)或配对t检验对生物学平行测试数据(每一条件有3-5个平行测试)进行统计学分析。统计学显著性显示为概率值例如**p＜0.01。数据点显示为平均值±标准差(SD)。

肌球蛋白II调节Rock下游的细胞-细胞粘附.Rho和Rho相关激酶(Rock)在调节多能干细胞的细胞-细胞相互作用中起作用。为了进一步研究细胞-细胞粘附背后的核心机制，检查了Rock下游的主要调节物。基于功能性预筛，通过siRNA介导的功能丧失分析将非肌肉肌球蛋白II鉴定为效应物。非肌肉肌球蛋白II(肌球蛋白II)，双头的常规肌球蛋白，包含非肌肉肌球蛋白II重链(NMHC)二聚体和两组肌球蛋白轻链(MLC)。存在三种不同的NMHC，即NMHC IIA、NMHC IIB和NMHC IIC，分别由Myh9、Myh10和Myh14基因编码，它们当中的每一个在哺乳动物中表现出不同的功能。在它们当中，除了IIC外，所有基因在多能干细胞中表达，而分化的细胞表达所有三种同种型。当肌球蛋白IIA和IIB同种型同时缺乏时，细胞表现出细胞-细胞接触的显著瓦解，这模拟了在缺乏Rho和Rock功能的表型(图1A)。通过定量RT-PCR(QPCR)证实通过每一siRNA敲低的靶基因的的特异性和水平(图2)。检查了肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)，即通过肌球蛋白调节性轻链(MRLC)的磷酸化负向调节肌球蛋白功能的主要的Rock下游靶标。MYPT1专一性地定位于mES细胞中的细胞-细胞接触部位(图1B)。如果Rock通过抑制MYPT1控制肌球蛋白功能，则缺乏MYPT1将从Y27632的强大效应中援救本来的细胞-细胞相互作用(图1C)。在抑制剂处理之前或之后使MYPT1缺乏分别导致细胞-细胞接触明显地保护或恢复，这支持该假设(图1D)。对siRNA处理不敏感的部分细胞的存在表明存在通过介导的直接活化MRLC的肌球蛋白II的替代调节。总之，这些数据表明ES细胞中的细胞-细胞接触由Rho-Rock-肌球蛋白II(RRM)信号轴调节。

siRNA序列

实时QPCR引物序列(SEQ ID NO)

Rock和肌球蛋白II调节hES细胞中的细胞-细胞相互作用。为了测试所观察到的RRM信号在mES细胞中的细胞-细胞接触中的功能在hES细胞中是否保存，将在含Matrigel^TM的无饲养层条件下和条件培养基(CM)中生长的H1细胞(图3A)用C3胞外酶处理。用C3处理的细胞显示出在mES细胞中可见的清晰的细胞-细胞瓦解，这表明Rho信号在人中具有保守的作用(图3B)。Rock-抑制剂处理也导致细胞粘附缺陷，虽然这需要比用于mES细胞的浓度(10μM)更高的浓度(20μM)(图3C)。肌球蛋白IIA和IIB在hES细胞的细胞-细胞边界处共定位，这表明它们在细胞-细胞粘附中具有潜在的作用(图3D)。下面的结果支持这一结论，即使用对于肌球蛋白II高选择性的合成抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂处理导致明显的细胞-细胞瓦解，这模拟了抑制Rho或Rock的表型(图3D)。这些数据表明，人和小鼠ES细胞均利用RRM信号轴作为细胞-细胞相互作用的核心调节物。

肌球蛋白II控制hiPS和hiES细胞中细胞-基质接触和脱离诱导的凋亡。为了测试肌球蛋白II是否也充当细胞-基质接触的Rock下游的主要调节物，hiPS细胞以不同浓度blebbistain处理。当hiPS和hES细胞在用于人多能干细胞的完全确定成分培养基mTeSR中生长时，正常情况下不粘附至化学合成的基质聚-D-赖氨酸(PDL)。然而，在最低浓度2μM时肌球蛋白II马达活性抑制剂明显支持hiPS细胞粘附于PDL上，此时没有观察到细胞-细胞粘附的缺陷症兆(图4A)。在更高浓度时，肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的hiPS细胞表现出与Y27632处理细胞可比的水平瓦解细胞-细胞接触(图4A)。从使用hES细胞的实验中得到相似的结果。这些数据表明RRM信号还控制人多能干细胞中的细胞-基质相互作用。

虽然当hiPS和hES细胞以高密度铺于非粘附性培养表面例如非组织培养处理板上时可以形成团块并且随后作为胚状体生长，但是当将它们一阻止形成团块的低密度铺板时大部分凋亡。这是因为人多能干细胞是按照程序当脱离培养表面时活化细胞死亡信号的上皮细胞(失巢凋亡)。最近的报导证明，通过Y27632抑制hES细胞内的Rock相当大地增加了基质胶上克隆密度下的和悬浮培养时低密度下的细胞存活，虽然背后的机制仍不清楚。由于本公开证明了肌球蛋白II作为细胞内相互作用中Rock下游的主要效应物，并且肌球蛋白II直接参与非粘附细胞如淋巴细胞的凋亡，所以猜测肌球蛋白II还在调节iPS细胞的失巢凋亡中起着作用。令人惊奇的是，用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的hiPS细胞和hES细胞明显地以与Y27632可比的水平或者更有效的增加低密度悬浮培养中的细胞存活(图4B)。这表明，仅对肌球蛋白II功能的抑制足以替代由Rock阻抑所介导的抗细胞凋亡效应。

确定成分因子、肌球蛋白II马达活性抑制剂和聚-D-赖氨酸(PDL)包被的组合有效支持人多能干细胞的自我更新。由于这些数据加在一起表明选择性的肌球蛋白II抑制剂肌球蛋白II马达活性抑制剂极大地增强hES和iPS细胞的细胞-基质相互作用和脱离诱导的凋亡，所以进一步开展实验评价hiPS细胞在基于肌球蛋白II马达活性抑制剂、PDL包被和mTeSR组合的完全确定成分培养条件下是否持续自我更新。在该培养方法中，使用2.5μM的肌球蛋白II马达活性抑制剂，该浓度是足以支持hiPS细胞的细胞-基质相互作用但是不影响其细胞-细胞粘附的最低浓度。由于已知高浓度(50～100μM)肌球蛋白II马达活性抑制剂介导的对肌球蛋白II的完全抑制影响胞质分裂，通过Y27632完全抑制Rock也如此，所以重要的是通过使用最低限度需要的浓度避免任何副作用。在整个使用肌球蛋白II马达活性抑制剂的确定成分条件下的超过15次传代中，hiPS细胞能够以与用Y27632处理的细胞可比的恒定生长率自我复制，而没有出现任何胞质分裂缺陷征兆，例如多核细胞(图4C)。通过免疫细胞化学和QPCR证实保留了多能性标志物Oct3/4、Nanog和Sox2(图4D和4E)。从使用hES细胞系的实验得到相似结果。有趣的是，虽然在该研究中使用的hiPS细胞系当在使用Matrigel^TM的标准无饲养层条件下生长时倾向于经历分化(图4E，下图)，但是在使用肌球蛋白II马达活性抑制剂的新方法中生长的绝大多数细胞保持具有强的Oct3/4表达的未分化集落形态，这突出了新方法超过传统无饲养层方法的优越性(图4E，上图和中图)。

通过肌球蛋白II马达活性抑制剂抑制NMII增强hPS细胞的克隆效率.NMII(NMHCII)重链具有三种同种型，其中通过Western分析可容易地在独立的hES和iPS细胞系中检测到NMHCIIA和NMHCIIB，但NMHCIIC则不然(图6a)。免疫细胞化学分析证明两种同种型均主要定位于未分化hPS细胞的质膜，这与它们在细胞-细胞接触中的作用一致(图6a)。为了评价NMII在hPS细胞的细胞死亡中的功能，使用有效且可逆阻断NMII的ATP酶活性的合成的化合物肌球蛋白II马达活性抑制剂，由此抑制运动功能。测定了处于建立各个克隆系最初临界障碍的克隆密度下的铺于基质胶包被板上的hES和hiPS细胞的生存力。单个hiPS细胞铺于基质胶包被的96-孔板的每一孔中，并且在铺板后7天时通过碱性磷酸酶染色评价未分化的集落形成。虽然在铺板后7天时在对照条件下没有形成或者仅形成少数的集落，但是当用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理细胞时大约30％的孔包含单一集落(0.47±0.25％对29±1.8％，p＜0.01)(图6b，c)。从hES细胞得到相似的结果。该克隆效率与报导的使用Y-27632的效率具有可比性。选择一些集落，进一步扩大培养，并且通过一系列分子和功能分析，包括检测多能性标志物以及体外和体内分化测定法来确定多能性。

通过肌球蛋白II马达活性抑制剂处理增强粘附条件下hPS细胞的存活.在铺板后的短时期内可检测到肌球蛋白II马达活性抑制剂的细胞保护性作用。细胞(1×10⁵个细胞/孔，12-孔板)用不同浓度的肌球蛋白II马达活性抑制剂处理或不处理，并且在铺板后24小时时通过直接的细胞计数评价生存力。用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的hiPS细胞在不同基质例如聚-D-赖氨酸(PDL)(10μM时7.9±0.6×10⁴个细胞对0.5±0.26×10⁴个细胞，n＝3，p＜0.001)和基质胶包被(10μM时8.6±0.6×10⁴个细胞对1.8±0.25×10⁴个细胞，n＝3，p＜0.01)上存活的数量比对照明显更高(在5和10μM之间观察到最高效应)(图6d，e，和图10a-d)。还在相同条件下并行测试了Y-27632，并且发现肌球蛋白II马达活性抑制剂的存活效应与Y-27632(10μM时在PDL上为7.2±1.1×10⁴个细胞，n＝3，p＜0.05)具有可比性(图6d，e，和图10a-d)。该结果与末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定法检测的凋亡水平负相关。在对照条件下超过70％的细胞是TUNEL染色阳性的，而用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的细胞表现出显著较低数量的TUNEL阳性细胞(73±2.5％对11±3.8％，n＝3，p＜0.01)(图6f)。该结果通过细胞凋亡的另一指示物裂解型胱天蛋白酶-3得到进一步证实，其中通过Western分析表明裂解型胱天蛋白酶-3在肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的细胞中降低，这表明在肌球蛋白II马达活性抑制剂处理后凋亡的细胞极大水平降低(图6g)。从使用hES细胞的实验得到相似的结果。

肌球蛋白II马达活性抑制剂阻止悬浮条件下hPS细胞的细胞死亡.为了测试肌球蛋白II马达活性抑制剂对没有细胞-基质粘附的细胞是否也有效，将细胞在悬浮培养下生长，这是标准分化方案中的产生胚状体的普通的初期步骤。明显地，肌球蛋白II马达活性抑制剂处理以显著高于悬浮条件下对照的水平增强hiPS细胞的生存力(10μM时的1.6±0.12×10⁵个细胞对0.05±0.02×10⁵个细胞，n＝3，p＜0.01)(图6h，i)。hES细胞和其它独立的hiPS细胞系表现出可比的肌球蛋白II马达活性抑制剂存活效应(图6j和图11a)。该结果得到TUNEL和裂解型胱天蛋白酶-3测定的支持，表明在肌球蛋白II马达活性抑制剂处理条件下凋亡水平显著更低(图6k，1，图11b)。然而，值得注意的是，在较低浓度时，肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的生存力始终高于Y-27632，而在10μM时，肌球蛋白II马达活性抑制剂或Y-27632的存活效应因各个细胞系而变化(图6i，j和图11a)。因此，基于对于每一细胞系的剂量和有效性，肌球蛋白II马达活性抑制剂提供了保护hPS细胞的可替代的策略。有趣的是，参与其它细胞类型中调节肌球蛋白介导的收缩和凋亡的肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的抑制剂ML-7没有表现出对存活具有显著的效应(图10d，和11c)。这表明NMII在多能干细胞中细胞死亡调节中的作用可能主要由ROCK通过肌球蛋白轻链磷酸酶，而不是MLCK来控制，尽管有必要进一步研究确定此可能性。

缺乏NMHCIIA的mES细胞存活增强.为了在遗传水平直接证实NMII在细胞生存力中的作用，使用其中NMHCIIA基因的两个等位基因均被打断的突变体(NMHCIIA^-/A^-)小鼠胚胎干细胞(mES)(图7a)。在铺板后24小时时突变体细胞的细胞-细胞接触严重受损(图7b)。NMHCIIA^-/A^-mES细胞表现出比亲本系(RW4)显著更高的生存力(1.3±0.3×10⁵个细胞对0.4±0.1×10⁵个细胞，n＝3，p＜0.05)(图7c，d)，这与使用肌球蛋白II马达活性抑制剂的hPS细胞得到的数据一致。还通过TUNEL测定确定凋亡水平，表明与野生型mES细胞相比，TUNEL阳性突变体细胞数量相当低(图7e)。

已经证明，NMII的两种同种型NMIIA和NMIIB在细胞粘附、迁移和收缩中具有不同的功能。为了评价NMIIB是否还在细胞存活调节中起作用，检查了遗传上缺乏NMHCIIB(NMHCIIB^-/B^-)的突变体mES细胞(图7f)。与NMHCIIA^-/A^-mES细胞生存力显著增加相反，NMHCIIB突变体表现出与野生型mES细胞相似的存活率(0.54±0.1×10⁵个细胞对0.55±0.14×10⁵个细胞，n＝3)(图7g，h)。这些结果表明，不同的调节机制会控制NMII每一同种型对多能干细胞细胞死亡的调节，对于细胞粘附和迁移也是如此。

NMII和自我更新调节物之间的机械性连接.在查询大批数据库时，认为NMHCIIA转录物作为在分化状态hES细胞中明显丰富(表1)，表明其是自我更新/分化程序和NMII之间的可能的分子连接。检查了自我更新调节物例如Oct3/4和Nanog以及NMII并且在hPS细胞中机械性连接。将hiPS或hES细胞在不同浓度肌球蛋白II马达活性抑制剂存在或缺乏的支持未分化状态的mTeSR中或者诱导被动分化的人ES非条件培养基(hESm)中生长48小时。以肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的hES细胞表明，如通过定量RT-PCR(QPCR)、Western分析和免疫细胞化学所测定，在两种培养基条件下两个转录因子的水平均以剂量依赖方式提高(图8a-e)。从hiPS细胞得到相似结果。为了确定该连接在小鼠中是否也保留，检查了在白血病抑制因子(LIF)存在或缺乏下生长2天的mES细胞。与来自hES细胞的数据相一致，在每一条件下，与亲本细胞相比，两种自我更新调节物Oct3/4和Nanog均以相当高的蛋白质水平在NMHCIIA^-/A^-mES细胞中表达(图8f，g)。这些数据家在一起表明，NMII可能作为原因因素，而非结果因素在人和小鼠多能干细胞自我更新的负调节中均起作用。该连接可能通过黏着斑处的NMII和β1整联蛋白之间的相互作用介导，反过来这活化了参与ES细胞分化的多个途径，包括ERK信号途径。备选地，NMII可与其它自我更新途径例如TGF-β、PI3激酶和Wnt信号途径交叉通讯。通过抑制NMII上调自我更新调节物会促进自我更新中的多能干细胞存活的增强。

表1：通过微列阵分析NMHCII同种型在未分化或分化状态hES细胞中的表达强度

探针ID	基因名称	未分化的	分化的
				211926_s_at	NMHC IIA	326	2401.2
212372_at	NMHC IIB	2177.4	2125.3
				217660_at	NMHC IIC	10.4	8

表2：通过微列阵分析对II类肌球蛋白在未分化或分化状态hES细胞中表达的评价

探针ID	基因名称	未分化的	分化的
				205951_at	MYH1	1.4	18
204631_at	MYH2	37.3	-1.8
				205940_at	MYH3	1.5	2.3
208148_at	MYH4	3.4	2.8
				204737_s_at	MYH7	1.3	10.5
206717_at	MYH8	11.2	8.8
				207961_x_at	MYH11	7.7	11

使用肌球蛋白II马达活性抑制剂建立用于hPS细胞的完全确定成分培养条件.本公开证明，Y-27632处理使hES细胞能够在正常情况下hES细胞在其上不能生长的PDL包被上自我更新。由于与小鼠肿瘤来源的提取物基质胶不同，PDL是化学合成的基质，所以本公开使用确定成分培养基提供了用于hES细胞自我更新的完全确定成分的条件。由于肌球蛋白II马达活性抑制剂精确地复制了Y-27632对hES和iPS细胞两者的所有效应，所以测试了单独的肌球蛋白II马达活性抑制剂以确定它是否能够完全取代确定成分培养条件中的Y-27632。以2.5和5μM之间的浓度使用肌球蛋白II马达活性抑制剂，这是足以支持自我更新但不影响细胞-细胞粘附的最低限度浓度。所需要的肌球蛋白II马达活性抑制剂最低浓度因各个hES或hiPS细胞系而不同，但是在5μM肌球蛋白II马达活性抑制剂下大多数的细胞系。由于通过高浓度(50～100μM)肌球蛋白II马达活性抑制剂强烈抑制NMII会影响胞质分裂(在高浓度Y-27632⁸时也可观察到)，重要的是使用最低浓度的肌球蛋白II马达活性抑制剂。在该确定成分条件下传代20次的每一细胞系中证实保持了典型的未分化形态和多能性标志物的表达(图9a-d)。hiPS或hES细胞在PDL上以与用Y-27632处理的细胞或者在常规使用基质胶的无饲养层条件下生长的细胞可比的恒定生长率自我更新(图9e)。为了评价体内完全分化功能，通过将传代的细胞皮下注射入重症联合免疫缺陷(SCID)/beige小鼠内进行畸胎瘤测定。通过组织切片检查畸胎瘤样品，并且确定包含所有三个胚层来源的分化组织例如黑素细胞(外胚层)、神经元组织(外胚层)、骨(中胚层)、骨骼肌(中胚层)、具有杯状细胞的胃肠道样黏膜上皮(内胚层)和神经纤维球(内胚层)(图9f)。这通过检测特定的细胞特异性标志物蛋白质的免疫组织化学进一步得到证实(图9g)。这些结果证实，在含肌球蛋白II马达活性抑制剂的确定成分条件下生长的hES或hiPS细胞可以长时间阶段自我更新，而不损害多分化能力，这证实了肌球蛋白II马达活性抑制剂效应的完全可逆性。如通过核型分析所评价，检测到细胞保持了基因组完整性(图9h中的hiPS细胞，和图12中的hES细胞)。肌球蛋白II马达活性抑制剂的使用在正确确认NMII功能中比Y-27632有优越性，Y-27632可能影响ROCK下游的众多效应分子。此外，对于常规使用，肌球蛋白II马达活性抑制剂比Y-27632成本更低。已经证明，在无饲养层条件下可以比常规的饲养层依赖培养条件更有效地产生完全重编程的hiPS细胞。因此，该新的培养方法可以提供基础以开发关键技术以在完全确定成分条件下有效取得并繁殖新的hiPS细胞系。

还应当注意，用肌球蛋白II马达活性抑制剂处理的hiPS细胞表现出比用Y27632处理的细胞更高的生长和细胞存活率。与Rock扩大了除肌球蛋白II之外的下游效应物数量的事实一起，通过肌球蛋白II马达活性抑制剂对主要调节物肌球蛋白II的准确抑制，在排除因肌球蛋白II之外的众多下游分子的抑制而出现不必要的结果中比使用Y27632具有巨大的优势。

虽然上面已经描述了许多实施方案和特征，本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本公开教导或者后附权利要求书所定义本公开范围的情况下对所述实施方案进行修饰和修改。

Claims (35)

1.组合物，包含基础培养基和肌球蛋白II抑制剂。

2.权利要求1的组合物，还包含结合并抑制RHO的激酶结构域的ROCK抑制剂。

3.权利要求1的组合物，其中肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

4.权利要求1的组合物，还包含血清。

5.权利要求4的组合物，其中血清与待培养的细胞是异体的。

6.权利要求4的组合物，其中血清与待培养的细胞是自体的。

7.权利要求1的组合物，还包含氨基酸。

8.权利要求7的组合物，其中氨基酸是非必需氨基酸。

9.权利要求1的组合物，还包含还原剂。

10.权利要求9的组合物，其中还原剂是β-巯基乙醇。

11.权利要求1的组合物，还包含抗生素和/或杀真菌剂。

12.权利要求1的组合物，还包含丙酮酸盐。

13.权利要求12的组合物，其中丙酮酸盐是丙酮酸钠或丙酮酸钾。

14.权利要求1的组合物，还包含LIF。

15.权利要求1的组合物，还包含L-谷氨酰胺。

16.组合物，包含补加有非必需氨基酸、抗氧化剂、还原剂、生长因子、丙酮酸盐和肌球蛋白II抑制剂的基础培养基。

17.权利要求16的组合物，其中基础培养基是DMEM。

18.试剂盒，包含聚-D-赖氨酸、确定成分培养基和肌球蛋白II抑制剂。

19.权利要求18的试剂盒，还包含组织培养基底。

20.权利要求18的试剂盒，还包含含有生长因子的添加物。

21.权利要求18的试剂盒，其中确定成分培养基是无血清的并且包含重组bFGF、重组TGFβ，具有大约330-350mOsm的容量克分子渗透压浓度和7.25至7.45的pH。

22.权利要求18的试剂盒，其中肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

23.培养干细胞的方法，包括：

将干细胞悬浮于包含肌球蛋白II抑制剂的培养基中；和

在聚-D-赖氨酸包被的组织培养基底存在下培养干细胞。

24.权利要求23的方法，其中培养基是确定成分培养基。

25.权利要求24的方法，其中确定成分培养基是无血清的。

26.权利要求25的方法，还包含重组bFGF、重组TGFβ、大约330-350mOsm的容量克分子渗透压浓度和7.25至7.45的pH。

27.干细胞培养物，包含在权利要求1的组合物中的干细胞。

28.权利要求23的干细胞培养物，其中干细胞在聚-D-赖氨酸存在下培养。

29.权利要求27的干细胞培养物，其中肌球蛋白II抑制剂是肌球蛋白II马达活性抑制剂或其类似物。

30.试剂盒，包含权利要求1或16的组合物。

31.试剂盒，包含区室化的肌球蛋白II抑制剂，所述区室化的肌球蛋白II抑制剂将添加至基础培养基或者确定成分培养基中。

32.培养干细胞的方法，包括：

在饲养层缺乏情况下将干细胞与权利要求1或16的组合物接触，其中干细胞生长和增殖。

33.组合物，包含含有重组bFGF、重组TGFβ的确定成分培养基，其中组合物是无血清的并且包含肌球蛋白II抑制剂。

34.权利要求33的组合物，其中确定成分培养基具有大约330-350mOsm的容量克分子渗透压浓度和7.25至7.45的pH。

35.在包含聚-D-赖氨酸基底的无动物培养基中和促进干细胞增殖和生长的培养基中培养干细胞的方法，其中培养基包含无动物成分和肌球蛋白II抑制剂、ROCK抑制剂或其组合。

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