CN103555661B - 一种无血清、无饲养层的多能干细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无血清、无饲养层培养多能干细胞的新方法，该方法稳定、可靠，能长期培养且维持多能干细胞的自我更新。本发明应用无血清无饲养层化学成分明确的培养体系对多能干细胞进行悬浮培养。培养15代后的干细胞的形态学、多能性标志分子的mRNA和蛋白表达，以及细胞染色质核型分析均表明，该类新培养体系能在长期培养过程中维持多能干细胞的特性。此外，本发明还通过体外拟胚体形成实验和体内畸胎瘤形成实验进一步验证了经15代悬浮培养后多能干细胞的分化潜能。

Description

一种无血清、无饲养层的多能干细胞培养方法

技术领域

本发明涉及一种无血清、无饲养层悬浮培养多能干细胞的体系和方法。具体地，本发明涉及使用无血清、无饲养层、化学成分明确的培养体系对多能干细胞进行悬浮培养的体系和方法。

背景技术

近几十年来，干细胞生物学的研究推进了人们对于许多生物学基础问题的认识，同时也促使人们探究许多疾病的细胞治疗方法。自1981年Evans和Matthew Kaufman第一次发现小鼠胚胎干细胞，胚胎干细胞研究一直是人们关注的焦点。此后，诱导多能干细胞（iPSCs）的获得使多能干细胞研究进入高潮。小鼠多能干细胞（包括小鼠胚胎干细胞和iPSCs）因具有无限增殖潜能和分化全能性，常常被用于研究人和哺乳动物细胞生长、分化和发育的最佳细胞模型；此外，由于多能干细胞在体内、外的增殖和分化受各种特定信号的调控，人们可以在体外获得大量由多能干细胞定向分化而来的组织特异型细胞，如心肌细胞、血液细胞、皮肤细胞、骨和肌肉细胞等，故其在临床方面具有巨大潜在应用价值，是一个有前景光明的研究领域。

若要有效使用多能干细胞进行基础科学研究和临床应用，首先要保证能够提供足够数量的、高纯度的均一细胞群体用于干细胞研究和临床应用。目前，未分化的多能干细胞是产生组织特异类型细胞的种子细胞来源，但现有的小鼠多能干细胞培养方法费时、费力，或不适合扩增或扩增后的细胞不纯，导致其不能进行均一性分化。

目前维持小鼠多能干细胞培养的方法主要包括使用含血清、含饲养层或无血清、无饲养层的贴壁培养模式来进行的。但这些方法都有其自身缺点。首先，血清是一种成分极其复杂的外源物质，在实验和应用中无法确定是血清中何种组分影响了细胞的行为，其次动物源性的血清和饲养层细胞的污染物会污染多能干细胞自身的应用。此外，目前广泛采用的贴壁培养方法需要在培养皿底部铺基质，一方面它增加了实验的繁琐性，也提高了细胞培养费用；另一方面，一些动物源性的基质如动物明胶（gelatin）、层粘蛋白（laminin）和基质胶（matrigel）等应用在临床上无法保证细胞的生物安全性和质量控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、高效的多能干细胞培养体系，具体地，本发明提供一种用于培养多能干细胞的培养基，以及使用该培养基培养多能干细胞的方法。

一方面，本发明提供一种多能干细胞培养基，所述培养基为无血清、无饲养层的培养基，所述多能干细胞培养基包括100-2000单位/毫升的白血病抑制因子（LIF），优选地，所述白血病抑制因子为1000单位/毫升。

优选地，所述培养基为改良的N2B27完全培养基，包括按1:1的体积比混合的DMEM/F12基础培养基和Neurobasal基础培养基，以及体积百分比为所述培养基的1～2%的N2添加剂、体积百分比为所述培养基的1～2%的无维生素A添加的B27添加剂、以及100-2000单位/毫升的白血病抑制因子（LIF）。

优选地，所述培养基还包括50～100毫摩尔/升的2-巯基乙醇、5～20微摩尔/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂(MAPK inhibitor)、10～50微摩尔/升的糖原合酶激酶抑制剂3(GSK3 inhibitor)。

进一步优选地，所述培养基还包括50毫摩尔/升的2-巯基乙醇、10微摩尔/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂(MAPK inhibitor)、30微摩尔/升的糖原合酶激酶抑制剂3(GSK3 inhibitor)。

优选地，在配制前，使用二甲基亚砜(DMSO)将所述促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂和糖原合酶激酶抑制剂3稀释为10mM浓度的储液。

其中，所述N2B27完全培养基源自2003年美国科学家首次应用于小鼠胚胎干细胞的培养，但当前该培养基主要是应用于维持贴壁状态细胞的生长和分化，而且细胞培养的过程中需要贴壁生长在含动物源性基质包被的培养皿上，基质包括明胶、层粘蛋白等。

本申请使用的培养基添加了白血病抑制因子，并适当调整了促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂和糖原合酶激酶抑制剂3的配比。

其中，所述DMEM/F12基础培养基和Neurobasal基础培养基为常规培养基，可以购买商业化的培养基，也可以自行配制，在本申请的一个优选的实施例中，所述DMEM/F12培养基购自Gibco公司。

所述N2添加剂为N2神经细胞生长添加剂，用于无血清培养神经细胞，特别是神经元细胞的生长。在本申请的一个优选的实施例中，所述N2添加剂购自Gibco公司，货号为17502-048。

所述B27添加剂为B27无血清培养基添加因子，通常用于海马神经元和其他中枢神经系统（CNS）神经元的生长和保持其短期或长期活性。在本申请的一个优选的实施例中，所述B27添加剂购自Gibico公司，货号为17504-044。

本发明还公开了所述培养基在培养多能干细胞中的应用。

优选地，所述多能干细胞为小鼠多能干细胞。

优选地，所述小鼠多能干细胞为小鼠胚胎干细胞。

另一方面，本发明还提供了一种培养多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1）将多能性干细胞克隆使用胰蛋白酶消化，并吹散为单细胞悬液；优选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.05%～0.25%；

优选地，将细胞数为1×10⁵～1×10⁷的多能性干细胞克隆使用1～2毫升0.05%的胰蛋白酶在37℃下消化2分钟，并吹散为单细胞悬液；

优选地，所述多能性干细胞克隆为小鼠胚胎干细胞系R1或小鼠胚胎成纤维细胞诱导的多能性干细胞克隆；

2）使用胰蛋白酶抑制剂终止消化，然后加入PBS混合为细胞悬液，将悬液离心后，使用所述多能干细胞培养基重悬细胞，将得到的单细胞悬液接种于超低粘附培养皿中，置于培养箱中培养；

优选地，所述胰蛋白酶抑制剂加入量与所述步骤1）中胰蛋白酶加入量相等；

优选地，所述PBS加入量为所述步骤1）中胰蛋白酶加入量的4倍以上；

优选地，加入多能性干细胞培养基，使得所述单细胞悬液中单细胞的密度为1.0×10⁶L^-1～1.0×10⁹L^-1；

在一个优选的实施方案中，所述步骤2）为：在所述步骤1）中经1～2毫升胰蛋白酶消化的多能干细胞克隆中加入1～2毫升胰蛋白酶抑制剂（T6414，Sigma）终止消化，再加入5～8毫升PBS，混合后将细胞悬液移入15毫升离心管中进行离心，离心后弃上清，用2毫升多能性干细胞培养基重悬细胞，将制得的单细胞悬液以1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1的密度接种于超低粘附6孔细胞培养板中，每孔加入3-4毫升多能性干细胞培养基，置于培养箱中培养；

优选地，所述培养箱的条件为36-38℃、3-8%（体积比）CO₂、湿度饱和；

更优选地，所述培养箱的条件为37℃、5%（体积比）CO₂、湿度饱和；

3）每隔24-60小时更换一次培养基；

优选地，更换培养基时间为48小时。

优选地，所述更换培养基按照以下步骤进行：

更换培养基时，收集细胞球悬液至15毫升离心管中，采用800RPM离心转速离心2分钟，离心后弃上清，添加2毫升所述多能干细胞培养基，轻轻吹打重悬后继续置于培养箱培养；

4）将细胞传代培养，将所述单细胞悬液培养3-4天后即可形成干细胞球，将所述干细胞球消化后按1.0×10⁶L^-1～1.0×10⁹L^-1密度重新接种在新的超低粘附的6孔细胞培养板中，添加多能性干细胞进行悬浮培养；

优选地，所述传代培养包括以下步骤：

a.将培养3-4天的干细胞球悬液移入15毫升离心管，采用800RPM离心转速对细胞进行离心，离心后弃上清，使用PBS重悬再离心洗涤，然后用0.05%的胰蛋白酶消化2-5分钟；优选地，所述消化条件为37℃消化3分钟；

优选地，所述PBS加入量为5-8毫升，0.05%胰蛋白酶加入量为1-2毫升；

b.采用胰蛋白酶抑制剂（T6414，Sigma）终止消化，并吹打干细胞球以获得单细胞悬液；加入PBS后，将上述单细胞悬液离心，弃上清后用新鲜的多能干细胞培养基重悬细胞，并按1.0×10⁶L^-1～1.0×10⁹L^-1密度例将单细胞悬液重新接种于超低粘附的培养皿中；

优选地，胰蛋白酶抑制剂加入量与上述胰蛋白酶加入量等同，所述细胞传代的比例为按1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1密度；

优选地，所述PBS加入量为所述胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂总量的3-5倍；

c.将培养皿置于培养箱内继续培养；

优选地，所述培养箱的条件为37℃、5%（体积比）CO₂、湿度饱和；

d.重复步骤a-c连续传代；

5）在传3-4代后，细胞纯化成高度均一的多能干细胞群；

优选地，所述步骤4）为：

a.将培养3-4天的干细胞球悬液移入15ml离心管，以800RPM离心收集细胞球，弃上清，添加PBS并在800RPM下再离心洗涤一次，细胞球沉淀后用0.05%～0.25%胰蛋白酶在37℃消化3～5min；

优选地:所述消化条件为浓度是0.05%的胰蛋白酶,温度为37℃消化3分钟。

优选地，所述PBS加入量为5-8毫升，0.05%胰蛋白酶加入量为1-2毫升。

b.采用胰蛋白酶抑制剂（T6414，Sigma）终止消化，并吹打细胞球以获得单细胞悬液。添加适量PBS后，用1000RPM离心上述细胞悬液，弃上清后用新鲜的多能性干细胞培养基重悬细胞，并按按1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1密度将单细胞悬液重新接种于超低粘附的6孔细胞培养板中；

优选地，所述PBS加入量为所述胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂总量的3-5倍。

c.将培养皿置于37℃、5%（体积比）CO₂、饱和湿度的培养箱中内继续培养；

d.将培养3-4天后的干细胞再次传代。按照上述方法连续传代；在传3-4代后干细胞即可完全适应无血清、无饲养层的悬浮培养体系，且可将含有杂细胞的细胞群纯化成高度均一的多能干细胞群。

优选地，所述单细胞在1-2天即可形成细胞球状小克隆，3-4天细胞球进一步增大，形成直径为80-150微米的干细胞球。

优选地，所述多能干细胞为小鼠多能干细胞。

优选地，所述小鼠多能干细胞为小鼠胚胎干细胞。

其中，所述胰蛋白酶百分比浓度的计算方法为：

百分比浓度=[胰蛋白酶质量（克）/配制胰蛋白酶溶液所用体积（毫升）

在本发明的一个优选实施方案中，本发明利用了一种含有OCT4启动子驱动绿色荧光蛋白的转基因小鼠胚胎干细胞系（OGR1）。该细胞系优点在于表达OCT4的细胞在荧光显微镜下即可见绿色荧光，可用于实时追踪OCT4的表达情况来判断细胞的多能性状态。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明选择了化学成分明确的N2B27完全培养基和超低粘附的培养皿用于培养小鼠多能干细胞，建立了一种新型的小鼠多能干细胞培养体系。这种体系可以不需要利用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为滋养层细胞，同时也不需要利用到铺有动物明胶或其它细胞外基质的培养皿。而目前报道的传统培养小鼠多能干细胞培养的方法主要包括使用含血清、含饲养层或无血清、无饲养层的贴壁培养模式来进行的。这些培养体系由于含有动物源性物质，增加了实验的不稳定性和安全性，加大了实验步骤的繁琐。而本发明使用的小鼠多能干细胞培养体系和方法，其培养基成分明确，操作简单，可悬浮培养小鼠多能干细胞，细胞能稳定传代15代以上，并能保持小鼠多能干细胞未分化状态和多能性，维持干细胞自我更新和快速增殖能力。此外，本悬浮培养体系还可纯化已经部分分化的小鼠多能干细胞或作为小鼠多能细胞含其它杂细胞的纯化方法，去除已分化的细胞或杂细胞。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A是悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞单细胞在明视场下的照片；B是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞单细胞绿色荧光蛋白在激发光下显示出绿色；C是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞形成球状克隆在明视场下照片；D是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞形成球状克隆在荧光显微镜激发下显示绿色荧光照片。标尺=100um。

图2是对悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆碱性磷酸酶染色的照片，结果显示球状克隆碱性磷酸酶染色为阳性，表明细胞仍具有多能性。

图3是对长期悬浮培养后小鼠胚胎干细胞进行多能性相关转录因子mRNA水平表达PCR鉴定照片。结果显示与传统贴壁培养一样，悬浮培养的干细胞高表达Oct4、Sox2、Nanog、Esg1、Rex1和Utf1多能性基因，Actin为持家基因。

图4是对悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞进行多能性相关转录因子OCT4、SOX2和NANOG蛋白水平表达免疫荧光染色照片。结果显示长期悬浮培养后的小鼠胚胎干细胞高表达OCT4、SOX2和NANOG。其中标尺=50μm。

图5是对悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞进行染色质核型分析的照片。结果显示长期悬浮培养后小鼠胚胎干细胞核型正常，染色体数为2n=40条。

图6是对悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞进行体外EB形成实验。结果显示长期悬浮培养后小鼠胚胎干细胞能形成EB。

图7是对悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞进行体内注射验证畸胎瘤的形成实验。A是长期悬浮培养后的小鼠胚胎干细胞在裸鼠体内形成的畸胎瘤，B-F是畸胎瘤石蜡切片进行的HE染色图片。

图8是传统的含血清含饲养层贴壁培养方法和无血清无滋养层细胞悬浮培养方法培养的小鼠胚胎干细胞克隆。A是贴壁培养第10代小鼠胚胎干细胞克隆明视场下的照片，B是贴壁培养第10代小鼠胚胎干细胞克隆绿色荧光蛋白在激发光下显示出绿色。C是悬浮培养第10代小鼠胚胎干细胞克隆明视场下的照片，D是悬浮培养第10代小鼠胚胎干细胞克隆绿色荧光蛋白在激发光下显示出绿色。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明做进一步阐述，但本发明的实施并不仅限于此。除非特别说明，本发明使用的小鼠胚胎干细胞购自美国伊利诺伊大学。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1：无饲养层无血清培养体系培养基的制备

培养基的制备

本申请使用DMEM/F12培养基、Neurolbasal培养基、N2添加剂、B27添加剂、2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol）、白血病抑制因子（LIF）、促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂（Stemolecule^TMPD0325901）、糖原合酶激酶抑制剂3（Stemolecule^TM CHIR99021）来配制。

其中，培养基的各组分分别购自：

DMEM/F12培养基购自Gibco公司，货号为11320-082；

Neurolbasal培养基购自Gibco公司，货号为21103-049；

N2添加剂购自Gibco公司，货号为17502-048；

B27添加剂购自Gibco公司，货号为12587-010；

2-巯基乙醇购自Gibco公司，货号为21985-23；

白血病抑制因子购自Milipore公司，货号为ESG1107；

促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂（Stemolecule^TM PD0325901）购自Stemgene公司，货号为04-0006；

糖原合酶激酶抑制剂3（Stemolecule^TM CHIR99021）购自Stemgene公司，货号为04-0004。

配制本发明所述的培养基。其中促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂和糖原合酶激酶抑制剂3分别为固态粉末状，使用前需要用二甲基亚砜(DMSO)进行溶解粉末，使其稀释成10mM浓度的储液。

具体地，所述培养基通过以下方法配制：

首先将向DMEM/F12基本培养基和Neurobasal基本培养基按1:1混合，搅拌均匀后，在混合后的基本培养基中添加以下因子，各种因子的最终浓度为：体积百分比为1%的N2添加剂，体积百分比为1%的B27添加剂，50毫摩尔/升的2-巯基乙醇，1000单位/毫升的白血病抑制因子（LIF），10微摩尔/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂(MAPK inhibitor)，30微摩尔/升的糖原合酶激酶抑制剂3(GSK3 inhibitor)。

各种因子的添加无严格的顺序，在常温操作即可，配制的过程无需加热，但培养基整个制备过程需在无菌条件下进行。

或，所述培养基通过以下方法配制：

首先将向DMEM/F12基本培养基和Neurobasal基本培养基按1:1混合，搅拌均匀后，在混合后的基本培养基中添加以下因子，各种因子的最终浓度为：体积百分比为2%的N2添加剂，体积百分比为2%的B27添加剂，100毫摩尔/升的2-巯基乙醇，100单位/毫升的白血病抑制因子（LIF），20微摩尔/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂(MAPK inhibitor)，50微摩尔/升的糖原合酶激酶抑制剂3(GSK3 inhibitor)。

各种因子的添加无严格的顺序，在常温操作即可，配制的过程无需加热，但培养基整个制备过程需在无菌条件下进行；

或，所述培养基通过以下方法配制：

首先将向DMEM/F12基本培养基和Neurobasal基本培养基按1:1混合，搅拌均匀后，在混合后的基本培养基中添加以下因子，各种因子的最终浓度为：体积百分比为1%的N2添加剂，体积百分比为2%的B27添加剂，50毫摩尔/升的2-巯基乙醇，2000单位/毫升的白血病抑制因子（LIF），5微摩尔/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂(MAPK inhibitor)，10微摩尔/升的糖原合酶激酶抑制剂3(GSK3 inhibitor)。

各种因子的添加无严格的顺序，在常温操作即可，配制的过程无需加热，但培养基整个制备过程需在无菌条件下进行。

实施例2小鼠胚胎干细胞的悬浮培养

本实施例采用的是OCT4-GFP小鼠胚胎干细胞系（OGR1）（购自美国伊利诺伊大学），可通过检测绿色荧光信号表达强度直观判断胚胎干细胞多能性。

首先，将于传统贴壁培养条件下培养的小鼠多能性干细胞克隆采用0.05%胰蛋白酶在37℃下消化2分钟，将克隆团块吹打成单细胞。

然后，将制得的单细胞悬液以1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1的密度接种于超低吸附培养皿中，置于37℃、5%（体积比）CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。细胞每隔48小时换一次液，换液时，收集细胞悬液至15ml离心管中，以800RPM（转/分钟）离心3分钟，弃上清后添加新鲜的培养基，轻轻吹打重悬后继续置于培养箱培养。小鼠胚胎干细胞细胞悬液在悬浮培养1-2天后，在光学显微镜下可见一些小的类似神经球状的球体形成,3-4天后球体增大，此时球体直径可达到80-150μm，且每个球状克隆内细胞排列紧密。

实施例3小鼠胚胎干细胞的传代培养

将实施例2中培养3-4天的小鼠胚胎干细胞OGR1消化后按一定的细胞密度重新接种在新的超粘附的皿中，添加N2B27完全培养及进行悬浮培养。

具体地：

（1）将实施例2中扩增后的球形细胞悬液移入15ml离心管，以800RPM离心收集细胞球，弃上清，添加PBS并在800RPM下再离心洗涤一次，细胞球沉淀后用0.05%胰蛋白酶在37℃消化2～3min。

（2）采用胰蛋白酶抑制剂（T6414，Sigma）终止消化，并吹打细胞球以获得单细胞悬液。添加适量PBS后，用1000RPM离心上述细胞悬液，弃上清后用新鲜的培养基重悬细胞，并按1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1的密度将单细胞悬液重新接种于超低粘附的培养皿中。37℃、5%（体积比）CO₂、饱和湿度的培养箱中内继续培养。培养3-4天后的OGR1细胞又可再次传代。按照上述方法连续传代。在传3-4代后OGR1细胞即可完全适应无血清、无饲养层的悬浮培养体系，且可将含有杂细胞的细胞群完全纯化成高度均一的多能干细胞群。

实施例4小鼠胚胎干细胞形态结构和绿色荧光蛋白表达鉴定

倒置荧光纤维镜检测OGR1细胞形态和绿色荧光蛋白的表达将实施例2中制得的单细胞悬液和实施例3中培养成球状的干细胞克隆置于倒置荧光显微镜（显微镜型号：Nikon ECLIPSE Ti，购自NIKON公司）下观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达情况。观察时，发绿色荧光的细胞即为表达OCT4的阳性细胞或球状克隆，可以通过观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况初步确定细胞的多能性状态。结果见图1。

其中，图1A是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞单细胞悬液在明视场下的照片；B是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞单细胞悬液绿色荧光蛋白在激发光下显示出绿色；C是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞形成球状克隆在明视场下照片；D是悬浮培养第15代小鼠胚胎干细胞形成球状干细胞克隆在荧光显微镜激发下显示绿色荧光照片。

结果表明，使用本发明的无血清、无饲养层培养体系和悬浮培养的方法，在培养15代的小鼠胚胎干细胞保持均质细胞形态，可以检测到多能性标志分子OCT4的表达。

实施例5小鼠胚胎干细胞的碱性磷酸酶染色鉴定

将实施例3中悬浮培养15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆移入15ml离心管，以800RPM离心收集细胞球，弃上清，添加适当的新鲜培养基重悬细胞，调整细胞球的浓度在每毫升液体含500～1000个干细胞球，将用多聚赖氨酸包被过的显微镜载玻片安装于甩片机的转头后（离心机型号：Cytospin3，购自美国SHANDON），加入0.05ml细胞悬液，室温下1000RPM离心1min。离心后可见载玻片上有贴壁的细胞球。将载玻片置于空气中干燥5min，干燥后加入4%多聚甲醛（PFA）进行固定，PBS洗涤1-2遍，然后加入碱性磷酸酶底物BCIP/NBT显示液（ZLI-9041，购买自北京中杉金桥生物技术有限公司），染色详细步骤见其说明书。染色后在光学显微镜下观察。检测结果见图2。

结果表明，使用本发明的无血清、无饲养层培养体系和悬浮培养的方法，在培养15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆显示碱性磷酸酶染色阳性。

实施例6小鼠胚胎干细胞多能性相关转录因子mRNA水平表达鉴定

收集实施例3中悬浮培养后的干细胞样品进行mRNA水平的检测，参照文献Chen Q,Zhang Y,Peng H,Lei L,Kuang H,Zhang L,Ning L,Cao Y,Duan E.Transient{beta}2-adrenoceptor activation confers pregnancy loss bydisrupting embryo spacing at implantation.J Biol Chem.2011 Feb11;286(6):4349-56中描述的TRIzol提取RNA方法及RT-PCR步骤。实验中分别收集实施例3中悬浮培养第10代和第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆，并提取其总mRNA，通过普通RT-PCR进行鉴定。实验中所使用的引物序列见表1，即国际上公认的小鼠胚胎干细胞常用多能性标志分子的基因。多能性标志分子分别为Oct4、Sox2、Nanog、Esg1、Rex1和Utf1等，以持家基因Actin的表达作为内参。

结果表明与传统贴壁培养一样，悬浮培养的小鼠胚胎干细胞高表达Oct4、Sox2、Nanog、Esg1、Rex1和Utf1多能性基因。

表1 RT-PCR引物序列

实施例7小鼠胚胎干细胞多能性标志分子免疫细胞化学染色鉴定

收集实施例3中悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆并进行免疫荧光染色鉴定，方法参照Liu S,Liu S,Wang X,Zhou J,Cao Y,Wang F,DuanE.The PI3K-Akt pathway inhibits senescence and promotes self-renewal ofhuman skin-derived precursors in vitro.Aging Cell.2011 Aug;10(4):661-74中描述的免疫荧光染色步骤。其中实验中所用的一抗分别为山羊抗小鼠OCT4抗体（SC-8628，购买自Santa Cruz公司），兔抗小鼠SOX2抗体（AB5603，购买自Milipore公司）以及兔抗Nanog多抗（09-0020，购买自STEMGENT公司）。实验用到的二抗为TRITC荧光素标记的兔抗山羊（购买自北京中杉金桥生物技术有限公司）和山羊抗兔二抗（购买自北京中杉金桥生物技术有限公司）。细胞核染色用Hoechst33342（购买自Sigma公司）。染色后将片子置于正置荧光显微镜下观察、照相（显微镜型号：Nikon ECLIPSE 80i，购自NIKON公司）。图4结果显示的为悬浮培养第15代的干细胞球状克隆的染色结果。

结果表明，与传统贴壁培养培养小鼠胚胎干细胞一样，悬浮培养的小鼠胚胎干细胞高表达OCT4，SOX2和NANOG蛋白。

实施例8小鼠胚胎干细胞染色体核型分析

收集实施例3中悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆并进行染色体核型分析鉴定，参照Zhang S,Hu H,Zhang H,Liu S,Liu S,Zhang Y,Lei X,Ning L,Cao Y,Duan E.Hair Follicle Stem Cells Derived from Single RatVibrissa via Organ Culture Reconstitute Hair Follicles in vivo.Cell Transplant.2012 Apr 24中描述的实验方法和步骤。将实施例3中悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆并进行染色体核型分析。染色后将片子置于正置荧光显微镜下放大1000倍观察、照相（显微镜型号：Nikon ECLIPSE 80i，购自NIKON公司）。结果见图5。

结果表明，悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆细胞的染色体核型正常。

实施例9体外拟胚体（EB）形成试验

收集实施例3中悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆并进行小鼠胚胎干细胞体外诱导EB形成实验，方法参照Okita K,Hong H,Takahashi K,Yamanaka S.Generation of mouse induced pluripotent stem cells with plasmidvectors.Nat Protoc.2010 Mar;5(3):418-28中的步骤进行。实验中采用实施例3中悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆干细胞进行EB形成、分化实验。结果见图6。

结果表明，悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞在体外能够诱导形成EB。

实施例10体外畸胎瘤形成试验

收集实施例3中悬浮培养第15代的小鼠胚胎干细胞球状克隆并进行小鼠胚胎干细胞体内畸胎瘤实验参照Okita K,Hong H,Takahashi K,YamanakaS.Generation of mouse induced pluripotent stem cells with plasmid vectors.NatProtoc.2010 Mar;5(3):418-28中的步骤进行。实验中采用悬浮培养15代的干细胞进行体内畸胎瘤形成实验。结果见图7。

实施例11采用传统的含血清、饲养层培养多能干细胞对比试验

本实施例采用了传统的含血清含饲养层贴壁培养方法进行小鼠胚胎干细胞系（OGR1）培养和传代试验，并与实施例2中悬浮培养的方法进行了对比。含血清、饲养层贴壁培养的传统方法参照Evans,M.,Kaufman,M.(1981)Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos.Nature292,154–156中的步骤进行。

主要包括：

（1）配制小鼠胚胎干细胞培养基。向高糖的DMEM基础培养基（购自Gibico公司）中添加以下因子，各种因子的最终浓度为：2.0mM L-谷酰胺，0.1mM非必需氨基酸,50微摩尔/升～100微摩尔/升2-巯基乙醇，100单位/毫升白血病抑制因子，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素，体积百分含量为15%的胎牛血清。

（2）滋养层细胞的准备。采用丝裂霉素C或辐射方法处理小鼠胚胎成纤维细胞。

（3）明胶包被。0.1%～0.2%动物明胶包被培养皿，将处理后的小鼠胚胎成纤维细胞接种至包被后的皿中。

（4）胚胎干细胞的复苏和培养。将冻存的胚胎干细胞复苏后接种在含滋养层细胞的皿中，添加含血清的小鼠胚胎干细胞常规培养基进行培养。

（5）细胞传代。待细胞长满后对细胞进行传代，传代需要再次准备滋养层细胞和包被明胶的皿。

对比实验结果显示采用传统的含血清含饲养层贴壁培养方法的小鼠胚胎干细胞克隆与实施例2中形成的球状克隆形态不一致。结果表明，与传统的小鼠胚胎干细胞培养相比悬浮培养方法简单，形成均质球状克隆，且100%的球状克隆为OCT4阳性克隆。结果见图8。此外，干细胞多能性基因表达悬浮培养组细胞表达量要高于传统贴壁组。结果见图3。

在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (24)

1.一种多能干细胞培养基，所述培养基为无血清、无饲养层的培养基，其特征在于，所述培养基由按1:1的体积比混合的DMEM/F12基础培养基和Neurobasal基础培养基、体积百分比为所述培养基的1～2％的N2添加剂、体积百分比为所述培养基的1～2％的无维生素A添加的B27添加剂、100-2000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF)、50～100毫摩尔/升的2-巯基乙醇、5～20微摩尔/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂、10～50微摩尔/升的糖原合酶激酶3抑制剂组成。

2.根据权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述白血病抑制因子为1000单位/毫升。

3.根据权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述2-巯基乙醇的含量为50毫摩尔/升、所述促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂的含量为10微摩尔/升、所述糖原合酶激酶3抑制剂的含量为30微摩尔/升。

4.根据权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述促分裂素原活化蛋白激酶抑制剂和糖原合酶激酶3抑制剂使用二甲基亚砜稀释为10mM浓度的储液。

5.一种多能干细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)将多能性干细胞克隆使用胰蛋白酶消化，并吹散为单细胞悬液；

2)使用胰蛋白酶抑制剂终止消化，然后加入PBS混合为细胞悬液，将细胞悬液离心后，使用如权利要求1-4中任一项所述的多能干细胞培养基重悬细胞，将得到的单细胞悬液接种于超低粘附培养皿中，置于培养箱中培养；

3)每隔24-60小时更换一次培养基；

4)将细胞传代培养，将所述单细胞悬液培养3-4天后即可形成干细胞球，将所述干细胞球消化后按1.0×10⁶L^-1～1.0×10⁹L^-1密度接种在新的超低粘附的6孔细胞培养板中，添加如权利要求1-4中任一项所述的多能性干细胞培养基进行悬浮培养；

5)在传3-4代后，细胞纯化成高度均一的多能干细胞群。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述胰蛋白酶的浓度为0.05％～0.25％。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，将细胞数为1×10⁵～1×10⁷的多能性干细胞克隆使用1～2毫升0.05％的胰蛋白酶在37℃下消化2分钟，并吹散为单细胞悬液。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述胰蛋白酶抑制剂加入量与所述步骤1)中胰蛋白酶加入量相等。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述PBS加入量为步骤1)中胰蛋白酶加入量的4倍以上。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，加入如权利要求1-4中任一项所述的多能性干细胞培养基，使得所述单细胞悬液中单细胞的密度为1.0×10⁶L^-1～1.0×10⁹L^-1。

11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，更换培养基时间为48小时。

12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述更换培养基按照以下步骤进行：

更换培养基时，收集细胞球悬液至15毫升离心管中，采用800RPM离心转速离心2分钟，离心后弃上清，添加2毫升如权利要求1-4中任一项所述的多能干细胞培养基，轻轻吹打重悬后继续置于培养箱培养。

13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)为：在所述步骤1)中经1～2毫升胰蛋白酶消化的多能干细胞克隆中加入1～2毫升胰蛋白酶抑制剂终止消化，再加入5～8毫升PBS，混合后将细胞悬液移入15毫升离心管中进行离心，离心后弃上清，用2毫升如权利要求1-4中任一项所述的多能干细胞培养基重悬细胞，将制得的单细胞悬液以1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1的密度接种于超低粘附6孔培养板中，每孔加入3-4毫升如权利要求1-4中任一项所述的多能干细胞培养基，置于培养箱中培养。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述培养箱的条件为36-38℃、3-8％(体积比)CO₂、湿度饱和。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述培养箱的条件为37℃、5％(体积比)CO₂、湿度饱和。

16.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的传代培养包括以下步骤：

a.将培养3-4天的干细胞球悬液移入15毫升离心管，采用800RPM离心转速对细胞进行离心，离心后弃上清，使用PBS重悬再离心洗涤，然后用胰蛋白酶消化2-5分钟；

b.采用胰蛋白酶抑制剂终止消化，并吹打干细胞球以获得单细胞悬液；加入PBS后，将上述单细胞悬液离心，弃上清后用如权利要求1-4中任一项所述的多能干细胞培养基重悬细胞，并按1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1密度比例将单细胞悬液重新接种于超低粘附的培养皿中；

c.将培养皿置于培养箱内继续培养；

d.重复步骤a-c连续传代。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在步骤c中，所述培养箱的条件为37℃、5％(体积比)CO₂、湿度饱和。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的传代培养包括以下步骤：

a.将培养3-4天的干细胞球悬液移入15ml离心管，以800RPM离心收集细胞球，弃上清，添加PBS并在800RPM下再离心洗涤一次，细胞球沉淀后用0.05％～0.25％胰蛋白酶在37℃消化3～5分钟；

b.采用胰蛋白酶抑制剂终止消化，并吹打细胞球以获得单细胞悬液；添加PBS后，用1000RPM离心上述细胞悬液，弃上清后用如权利要求1-4中任一项所述的多能干细胞培养基重悬细胞，并按1.0×10⁷L^-1～1.0×10⁸L^-1密度比例将单细胞悬液重新接种于超低粘附的培养皿中；

c.将培养皿置于37℃、5％(体积比)CO₂、饱和湿度的培养箱中内继续培养；

d.将培养3-4天后的干细胞球重复a-c的步骤再次传代。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在步骤c中，所述消化条件为浓度是0.05％的胰蛋白酶，温度为37℃消化3分钟。

20.根据权利要求5-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述单细胞悬液为经胰蛋白酶消化后的贴壁培养小鼠多能性干细胞克隆和饲养层细胞悬液。

21.根据权利要求5-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述多能性干细胞克隆为小鼠胚胎干细胞系R1或小鼠胚胎成纤维细胞诱导的多能性干细胞克隆。

22.权利要求1-4中任一项所述的培养基或权利要求5-21中任一项所述的方法在培养多能干细胞中的应用。

23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述多能干细胞为小鼠多能干细胞。

24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述小鼠多能干细胞为小鼠胚胎干细胞。