WO2019131940A1 - 多能性幹細胞凝集抑制剤 - Google Patents

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WO2019131940A1
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将人 伊吹
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株式会社カネカ
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
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    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a pluripotent stem cell aggregation inhibitor and a method of suppressing aggregation of pluripotent stem cells.
  • the present invention also relates to a method of producing pluripotent stem cell aggregates, and pluripotent stem cell aggregates produced thereby.
  • the invention further relates to pluripotent stem cell culture compositions.
  • pluripotent stem cells such as human ES cells and human iPS cells have increased the possibility of practical application of regenerative medicine. Because these cells have the ability to proliferate indefinitely and the ability to differentiate into various cells, in regenerative medicine using pluripotent stem cells, treatment for intractable diseases, lifestyle-related diseases, etc. Is expected to fundamentally change. It is already possible to induce differentiation from pluripotent stem cells to various types of somatic cells such as neurons, cardiomyocytes, kidney cells, hepatocytes, blood cells, retinal cells and their progenitor cells in vitro There is.
  • somatic cells such as neurons, cardiomyocytes, kidney cells, hepatocytes, blood cells, retinal cells and their progenitor cells in vitro There is.
  • Non Patent Literature 1 uses spinner flasks as a cell culture vessel for suspension culture, and performs suspension culture of human pluripotent stem cells while stirring a liquid culture medium with strong stirring force to produce spheroids of uniform size. A method is disclosed.
  • Non-Patent Document 2 discloses a method of producing spheroids of uniform size in each microwell, using a substrate on which minute microwells are formed.
  • Non-Patent Document 3 discloses a method of using a culture medium in which viscosity and specific gravity are adjusted as culture medium to maintain suspension of pluripotent stem cells while suppressing collision between cells. .
  • Patent Document 1 discloses a technique for culturing a cell in a liquid medium while swirling to produce a cell aggregate.
  • Patent Document 2 discloses a method of suspension culture of pluripotent stem cells until the average diameter of cell mass is about 200 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • Patent Document 3 discloses a technique for suppressing cell aggregation by suspending and culturing cells in a medium containing lysophospholipid such as lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine-1-phosphate (S1P). There is.
  • lysophospholipid such as lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine-1-phosphate (S1P).
  • Patent Document 4 discloses a technique of suspending and culturing human pluripotent stem cells to form clumps of cells, in a method of producing retinal cells or retinal tissue.
  • Patent Document 5 discloses a technology related to a structure (deacylated gellan gum) of a polymer compound having an anionic functional group, which can uniformly disperse cells or tissues such as pluripotent stem cells in a suspended state. It is disclosed.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Documents 1 to 2 and 4 to 5 have the following problems.
  • Non-Patent Document 1 has a problem that cell death is likely to occur due to shear stress.
  • the method of Non-Patent Document 2 has problems such as difficulty in increasing the scale and difficulty in replacing the culture medium.
  • Patent Document 3 there is a problem that oxygen and nutrient components are difficult to be supplied to cell aggregates because the movement of the culture medium at the time of culture is small.
  • Patent Document 1 does not disclose means for controlling the size of a cell mass to an appropriate size.
  • Patent Document 2 describes that a water-soluble polymer is added to a culture medium to increase viscosity as a means for preventing adhesion between cell masses.
  • Patent Document 4 does not provide a technique for controlling the size of cell aggregates.
  • patent document 5 since it is necessary to add the structure of a high molecular compound to a culture medium, it is necessary to isolate
  • the present inventors suppress cell aggregation by suspending and culturing the cells in a medium containing lysophospholipid in Patent Document 3, thereby suppressing aggregation of appropriate size.
  • a suspension culture technology that can be produced without causing damage.
  • lysophospholipid is disclosed as a component which suppresses cell aggregation. If, in addition to lysophospholipids, a component that suppresses or promotes cell aggregation by being present in the culture medium in suspension culture is provided, the size of the cell aggregate is a mechanical / physical means. The present inventors thought that it would be possible to control more appropriately without depending on
  • the present inventors have found that a cell cycle arresting agent exerts an action of suppressing cell aggregation by being present in a culture medium in suspension culture, and completed the present invention. Accordingly, the present invention includes the features listed below.
  • a pluripotent stem cell aggregation inhibitor for use in suspension culture of pluripotent stem cells comprising a cell cycle arresting agent.
  • the pluripotent stem cell aggregation inhibitor according to (1) wherein the concentration of the cell cycle arresting agent is 55.0 mg / mL or more and 1.1 g / mL or less, or 60 mM or more and 15 M or less.
  • the cell cycle arresting agent is a concentrated form which can be diluted at the time of culturing to make the concentration in the medium 3 ng / mL or more and 30 mg / mL or less, or 3 nM or more and 300 mM or less.
  • the pluripotent stem cell aggregation inhibitor as described in 4.).
  • the cell cycle arresting agent is at least one substance selected from a G1 arresting agent, a G1 / S arresting agent, a G2 arresting agent, a G2 / M arresting agent, and an M-phase arresting agent, The pluripotent stem cell aggregation inhibitor according to any one of the above (1) to (3).
  • the cell cycle arresting agent is colchicine (Colchicine), dimethylsulfoxide (DMSO), cytochalasin D, cytochalasin B, docetaxel (Docetaxel), podophyllotoxin (Podophyllotoxin), Demecolcine (Demecolcine), Nocodazole (Nocodazole), Jasplaquinolide (Jasplakinolide), Vinblastine (Vinblastine), Griseofulvin (Griseofulvin), Vinorelbine, Latrunculin A (Latorunculin A), 2,3,5-Triiodobenzoic Acid Acid (2,3,5-Triiodobenzoic acid; TIBA), ansamitocin P-3 (Ansamitocin P-3), cytochalasin A (Cytochalasin A), cytochalasin E (Cytochalasin E), indanocine (Indanocine), latrunculin B (Latorunculin
  • the G2 arrest agent is at least one substance selected from cytochalasin D, colchicine, and docetaxel. Aggregation inhibitor.
  • the G2 / M phase arresting agent is selected from podophyllotoxin (Podophyllotoxin), demecortin (Demecolcine), latrunculin A (Latorunculin A), cytochalasin B (Cytochalasin B), and nocodazole (Nocodazole)
  • the agent for suppressing pluripotent stem cell aggregation according to the above (4) which is at least one substance.
  • a method for producing pluripotent stem cell aggregates which comprises the step of suspension culture of pluripotent stem cells in a medium containing a cell cycle arresting agent.
  • the cell cycle arresting agent is at least one substance selected from a G1 arresting agent, a G1 / S arresting agent, a G2 arresting agent, a G2 / M arresting agent, and an M-phase arresting agent, The manufacturing method as described in said (11) or (12).
  • the cell cycle arresting agent is colchicine (Colchicine), dimethylsulfoxide (DMSO), cytochalasin D, cytochalasin B, docetaxel (Docetaxel), podophyllotoxin (Podophyllotoxin), Demecolcine (Demecolcine), Nocodazole (Nocodazole), Jasplaquinolide (Jasplakinolide), Vinblastine (Vinblastine), Griseofulvin (Griseofulvin), Vinorelbine, Latrunculin A (Latorunculin A), 2,3,5-Triiodobenzoic Acid Acid (2,3,5-Triiodobenzoi acid; TIBA), ansamitocin P-3 (Ansamitocin P-3), cytochalasin A (Cytochalasin A), cytochalasin E (Cytochalasin E), indanocine (Indanocine), latrunculin B (Latorunculin
  • the production method according to (13), wherein the G1 / S-phase terminator is cytochalasin D.
  • the G2-phase arresting agent is at least one substance selected from cytochalasin D, colchicine, and docetaxel.
  • the G2 / M phase arresting agent is selected from podophyllotoxin (Podophyllotoxin), demecoltine (Demecolcine), latrunculin A (Latorunculin A), cytochalasin B (Cytochalasin B), and nocodazole (Nocodazole)
  • the production method according to (13) above which is at least one substance.
  • the production method according to (13), wherein the M-phase terminator is jasplakinolide.
  • a pluripotent stem cell culture composition comprising a cell aggregate of pluripotent stem cells, a culture medium, and a cell cycle terminator at a concentration of 3 ng / mL to 30 mg / mL, or 3 nM to 300 mM.
  • the cell cycle arresting agent is at least one substance selected from a G1 arresting agent, a G1 / S arresting agent, a G2 arresting agent, a G2 / M arresting agent, and an M arresting agent, The pluripotent stem cell culture composition as described in said (21).
  • the cell cycle arresting agent is colchicine (Colchicine), dimethylsulfoxide (DMSO), cytochalasin D, cytochalasin B, docetaxel (Docetaxel), podophyllotoxin (Podophyllotoxin), Demecolcine (Demecolcine), Nocodazole (Nocodazole), Jasplaquinolide (Jasplakinolide), Vinblastine (Vinblastine), Griseofulvin (Griseofulvin), Vinorelbine, Latrunculin A (Latorunculin A), 2,3,5-Triiodobenzoic Acid Acid (2,3,5-Triiodobenzoi acid; TIBA), ansamitocin P-3 (Ansamitocin P-3), cytochalasin A (Cytochalasin A), cytochalasin E (Cytochalasin E), indanocine (Indanocine), latrunculin B (Latorunculin
  • a method for suppressing aggregation of pluripotent stem cells which comprises the step of suspending pluripotent stem cells in a culture medium containing a cell cycle arresting agent.
  • the cell cycle arresting agent is at least one substance selected from a G1 arresting agent, a G1 / S arresting agent, a G2 arresting agent, a G2 / M arresting agent, and an M-phase arresting agent, The method as described in said (25) or (26).
  • the cell cycle arresting agent is colchicine (Colchicine), dimethylsulfoxide (DMSO), cytochalasin D, cytochalasin B, docetaxel (Docetaxel), podophyllotoxin (Podophyllotoxin), Demecolcine (Demecolcine), Nocodazole (Nocodazole), Jasplaquinolide (Jasplakinolide), Vinblastine (Vinblastine), Griseofulvin (Griseofulvin), Vinorelbine, Latrunculin A (Latorunculin A), 2,3,5-Triiodobenzoic Acid Acid (2,3,5-Triiodobenzoi acid; TIBA), ansamitocin P-3 (Ansamitocin P-3), cytochalasin A (Cytochalasin A), cytochalasin E (Cytochalasin E), indanocine (Indanocine), latrunculin B (Latorunculin
  • the method according to (27) above, wherein the G1 / S phase terminator is cytochalasin D.
  • the G2 terminator is at least one substance selected from cytochalasin D, colchicine and docetaxel.
  • the G2 / M phase arresting agent is selected from podophyllotoxin (Podophyllotoxin), demecoltine (Demecolcine), latrunculin A (Latorunculin A), cytochalasin B (Cytochalasin B), and nocodazole (Nocodazole)
  • the M phase terminator is jasplakinolide.
  • a pluripotent stem cell culture medium comprising a medium and a cell cycle arrester at a concentration of 3 ng / mL to 30 mg / mL, or a concentration of 3 nM to 300 mM.
  • the cell cycle arresting agent is at least one substance selected from a G1 arresting agent, a G1 / S arresting agent, a G2 arresting agent, a G2 / M arresting agent, and an M-phase arresting agent, The pluripotent stem cell culture medium as described in (34) above.
  • the above-mentioned cell cycle arresting agent is colchicine (Colchicine), dimethyl sulfoxide (DMSO), cytochalasin D (Cytochalasin D), cytochalasin B (Cytochalasin B), docetaxel (Docetaxel), podophyllotoxin (Podophyllotoxin), Demecolcine (Demecolcine), Nocodazole (Nocodazole), Jasplaquinolide (Jasplakinolide), Vinblastine (Vinblastine), Griseofulvin (Griseofulvin), Vinorelbine, Latrunculin A (Latorunculin A), 2,3,5-Triiodobenzoic Acid Acid (2,3,5-Triiodobenzoi acid; TIBA), ansamitocin P-3 (Ansamitocin P-3), cytochalasin A (Cytochalasin A), cytochalasin E (Cytochalas
  • the G2 / M phase arresting agent is selected from podophyllotoxin (Podophyllotoxin), demecoltine (Demecolcine), latrunculin A (Latorunculin A), cytochalasin B (Cytochalasin B), and nocodazole (Nocodazole)
  • the pluripotent stem cell culture medium according to any one of (34) to (42) above for producing a cell aggregate (4) Any of the above-mentioned (11) to (19), wherein in 70% or more (by weight) of the cell aggregate, the dimension of the widest part of the cell aggregate is 500 ⁇ m or less, preferably 300 ⁇ m or less (20), the pluripotent stem cell culture composition according to any one of (21) to (24), or the method according to (43). Pluripotent stem cell culture medium. (45) In (70) or more (by weight) of the cell aggregate, the dimension of the widest part of the cell aggregate is 40 ⁇ m or more, preferably 100 ⁇ m or more.
  • the present specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2017-254829 based on which the priority of the present application is based.
  • One embodiment of the pluripotent stem cell aggregation inhibitor (active ingredient; at least one cell cycle arresting agent) of the present invention is to be added to a culture medium to suppress aggregation of pluripotent stem cells during suspension culture.
  • a culture medium to suppress aggregation of pluripotent stem cells during suspension culture.
  • aggregation of pluripotent stem cells can be suppressed in suspension culture in the presence of the above-described pluripotent stem cell aggregation inhibitor.
  • cell aggregates can be produced in high yield.
  • the cell aggregate having a suitable size has a high viable cell rate.
  • One embodiment of the cell culture composition of the present invention can be used to produce cell aggregates in high yield.
  • This figure shows cell cycle arresting agents at the concentrations indicated in the figure, i.e., human iPS cells in the presence of Y-27632 (10 [mu] M), namely Colchicine, Demecolcine, Cytochalasin D, vinblastine.
  • a control is an observation image by a phase contrast microscope on the first day of culture when human iPS cells are cultured in suspension in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) in the above medium without the cell cycle terminator.
  • the scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • This figure shows cell cycle arresting agents at the concentrations indicated in the figure, i.e., human iPS cells, in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M), ie, latrunculin A, podophyllotoxin (Podophyllotoxin), vinorelbine
  • Y-27632 10 ⁇ M
  • ie latrunculin A
  • podophyllotoxin podophyllotoxin
  • vinorelbine The observation image by the phase-contrast microscope of the culture day 1 when it carries out suspension culture in the culture medium containing Vinorelbine, nocodazole (Nocodazole), jasplaquinolide (Jasplakinolide), or docetaxel (Docetaxel) is shown.
  • a control is an observation image by a phase contrast microscope on the first day of culture when human iPS cells are cultured in suspension in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) in the above medium without the cell cycle terminator.
  • the scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • This figure shows human iPS cells in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) in medium without cell cycle arrester (negative control), sphingosine-1-phosphate (S1P) (0.8 ⁇ g / mL (2
  • cultivation the 1st day of culture when it carries out suspension culture in the culture medium (positive control) which contains (.1 micromol) (positive control), or the culture medium containing cytochalasin B (1 micromol) is shown.
  • the scale bar on each image data is 500 ⁇ m.
  • This figure shows that human iPS cells are cultured in suspension in a medium containing Y-27632 (10 ⁇ M) to prepare cell aggregates, and then suspension culture is continued from day 1 to day 5 of culture
  • the observation image by phase-contrast microscope to The scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • This figure shows that when human iPS cells are cultured in suspension in a medium containing cytochalasin D (20 nM) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to produce cell aggregates and then suspension culture is continued.
  • the observation image by the phase-contrast microscope from day 1 to day 5 of culture is shown.
  • the scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • human iPS cells were cultured in suspension in a medium containing jasplakinolide (20 nM) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to prepare cell aggregates, and then suspension culture was continued.
  • cultivation is shown.
  • the scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • human iPS cells are cultured in suspension in a medium containing demecortin (10 ng / mL (26.9 nM)) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to produce cell aggregates, and then continued.
  • An observation image by phase contrast microscopy from day 1 to day 5 of culture when suspended in culture is shown.
  • the scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • human iPS cells are cultured in suspension in a medium containing DMSO (1% (0.14 M)) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to prepare cell aggregates, and then continued.
  • cultivation day 1 to the 5th day when suspension culture is carried out is shown.
  • the scale bar on each image data is 200 ⁇ m.
  • This figure shows human iPS cells in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M), cytochalasin D (20 nM), jasplakinolide (20 nM), demecortin (10 ng / mL (26.9 nM)) or DMSO (1%)
  • the graph shows the glucose consumption from day 1 to day 5 of culture when suspension culture is carried out in a medium containing (0.14 M) to prepare a cell aggregate and then suspension culture is continued. is there.
  • Control is glucose consumption when cultured in medium containing Y-27632 (10 ⁇ M).
  • This figure shows human iPS cells (seed cell number 8 ⁇ 10 5 cells / well) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M), cytochalasin D (20 nM), jasplakinolide (20 nM), demecortin (10 ng / 10).
  • the control is the cell yield when cultured in medium containing Y-27632 (10 ⁇ M).
  • This figure shows cell aggregation on the first day of culture when human iPS cells are cultured in suspension in a medium containing cytochalasin D (20 nM) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to prepare cell aggregates. It is the graph which showed distribution of the diameter of a lump.
  • This figure shows the cells on the first day of culture when human iPS cells are cultured in suspension in a medium containing jasplakinolide (20 nM) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to prepare cell aggregates. It is the graph which showed distribution of the diameter of an aggregate.
  • This figure shows culture of human iPS cells cultured in suspension in a medium containing demecortin (10 ng / mL (26.9 nM)) in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) to produce cell aggregates 1 It is the graph which showed distribution of the diameter of the cell aggregate on the day.
  • This figure shows culture of human iPS cells in suspension culture in the presence of Y-27632 (10 ⁇ M) in a medium containing DMSO (1% (0.14 M)) to prepare cell aggregates It is the graph which showed distribution of the diameter of the cell aggregate of the eye.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention have the property of forming embryoid bodies or cell aggregates (hereinafter generically referred to as "cell aggregates") in a culture medium, Specific examples of cells include animal-derived pluripotent stem cells, preferably mammalian-derived pluripotent stem cells, and more preferably human-derived pluripotent stem cells.
  • pluripotency is the ability to differentiate into all three germ layers (ie endoderm, mesoderm and ectoderm), and high self-replication ability is the ability to proliferate indefinitely.
  • pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), EG cells that are pluripotent stem cells derived from fetal primordial germ cells (Shamblott M. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 13726-13731 (1998)), GS cells (Conrad S., Nature 456: 344-349 (2008)) which are pluripotent stem cells derived from testis, artificial pluripotent stem cells derived from somatic cells And iPS cells (induced pluripotent stem cells) and the like, but not limited thereto.
  • Preferred pluripotent stem cells are ES cells and iPS cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos called blastocysts.
  • iPS cells are artificially established pluripotent stem cells to which pluripotency is imparted by reprogramming somatic cells to an undifferentiated state by introducing reprogramming factors into somatic cells.
  • a reprogramming factor for example, a combination of OCT3 / 4 and KLF4, SOX2 and c-Myc (or L-Myc) (Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-872 (2007)), OCT3 / 4, SOX2, A combination of LIN28 and Nanog (Yu J, et al. Science. 318: 1917-1920 (2007)) can be used.
  • the mode of transfer of these factors into cells is not particularly limited, and examples include gene transfer using vectors such as viruses and plasmids, transfer of synthetic RNA, direct transfer of proteins, and the like.
  • iPS cells produced by a method using microRNA, RNA, low molecular weight compounds and the like may be used.
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells
  • iPS cells for example, known strains 253G1, 201B6, 201B7, 409B2, 454E2, HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A, Nips-B2, TkDN4-M strain, TkDA3-1 strain, TkDA3-2 strain, TkDA3-4 strain, TkDA3-5 strain, TkDA3-9 strain, TkDA3-20 strain, hiPSC 38-2 strain, MSC-iPSC1 strain, BJ-iPSC1 strain , RPC hi PS 771-2 etc.
  • ES cells for example, known strains KhES-1 strain, KhES-2 strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SEES-1 strain, SEES-1 strain, SEES-2 strain, SEES-3 strain, SEES 4 strains, SEES-5 strain, SEES-6 strain, SEES-7 strain, HUES8 strain, CyES 49 strain, H1 strain, H9 strain, HS-181 strain and the like can be used.
  • Freshly generated clinical grade iPS cells or ES cells may be used.
  • the origin of the cells in producing the iPS cells is not particularly limited. For example, fibroblasts or lymphocytes can be used.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention may be derived from any animal, for example, rodents such as mice, rats and hamsters, humans, primates such as gorilla and chimpanzee, and further dogs and cats, It may be derived from mammals such as domestic animals such as rabbits, cows, horses, pigs, sheep, goats or companion animals, but cells of human origin are particularly preferred.
  • the separation method is not particularly limited, and examples of the release agent include enzymes such as trypsin and collagenase, and mixtures of the enzymes with a chelating agent such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  • the isolated pluripotent stem cells and their cell populations can be cryopreserved if necessary, and can be thawed and used in the case of suspension culture for cell proliferation according to the present invention.
  • Cell clumps The “cell aggregate” in the present specification is a massive cell population (also referred to as “spheroid”) formed by three-dimensional aggregation of a plurality of cells. Cell clumps typically have a generally spherical shape. The aggregation by the same cell also includes the case where a mass is formed by the proliferation of one cell. The mechanism of cell aggregation includes, but is not limited to, nonspecific adsorption between membrane proteins and cells of cell membrane, adhesion between cells via cadherin on the cell surface, and the like.
  • pluripotent stem cells constituting a cell aggregate may be a single cell line or may consist of a plurality of cell lines, preferably consist of a single cell line. Is good.
  • a cell aggregate composed of pluripotent stem cells such as human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human embryonic stem cells (ES cells) expresses a pluripotent stem cell marker and / or Includes cells that are positive for pluripotent stem cell markers.
  • pluripotent stem cell markers are substantially common to iPS cells and ES cells, for example, Alkaline Phosphatase, NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, c-Myc, KLF4, LIN28, SSEA -4, markers such as SSEA-1, etc. can be exemplified.
  • a pluripotent stem cell marker as an indicator, cells can be proliferated and managed while confirming that the cells can maintain an undifferentiated state.
  • Pluripotent stem cell markers can be detected by any detection method in the art.
  • Methods of detecting cell markers include, but are not limited to, flow cytometry, for example.
  • flow cytometry In the case of using a fluorescently labeled antibody as a detection reagent in flow cytometry, when a cell that emits stronger fluorescence compared to a negative control (isotype control) is detected, the cell is determined as “positive” for the marker. Ru.
  • the proportion of cells that show positive for fluorescently labeled antibody analyzed by flow cytometry may be described as "positive rate".
  • fluorescently labeled antibody any antibody known in the art can be used, and for example, an antibody labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC) or the like But not limited thereto.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • API allophycocyanin
  • the positive rate of the pluripotent stem cell marker by the above detection method is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 91% or more, more preferably 92% or more, more preferably 93% or more, more preferably Is preferably 94% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, more preferably 100% or less it can.
  • a pluripotent stem cell marker is synonymous with an undifferentiated marker, and both can be substituted and used.
  • cell aggregation of pluripotent stem cells is suppressed by the presence of a cell cycle arresting agent in the medium.
  • the terms “inhibit cell aggregation”, “inhibit cell aggregation”, “inhibit cell aggregation”, or the like terms inhibit cell aggregation, thereby forming or expanding cell aggregates. I say to suppress.
  • the term “cell aggregation inhibitor” refers to a substance or a drug having an effect of suppressing cell aggregation, and in the present invention, a cell cycle arresting agent, for example, a substance that controls the cytoskeleton to stop the cell cycle or It is a composition containing a drug.
  • the size (also referred to as “size”) of the cell aggregate produced by the method of the present invention is not particularly limited, but when observed with a microscope, the upper limit of the size of the widest part in the observed image is, for example, 900 ⁇ m
  • the thickness is 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, or 300 ⁇ m or less.
  • the lower limit is, for example, 40 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more.
  • one human iPS cell has a size of about 10 ⁇ m.
  • a cell aggregate having such a size range is preferable as a cell growth environment because oxygen and nutrient components are easily supplied to the cells inside.
  • the population of cell aggregates produced by the method of the present invention is, for example, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more of the above-mentioned range on a weight basis among cell aggregates constituting the population. It should have a dimension of
  • suspension culture is one of cell culture methods, and refers to growing cells in suspension in a medium.
  • suspension culture according to the method of the present invention, the size of cell aggregates of pluripotent stem cells formed in a culture solution to which a cell aggregation inhibitor containing a cell cycle arresting agent is added is suppressed to a predetermined size. It is adjusted.
  • the “suspension culture method” is a method of suspension culture of cells, and the cells in this method exist as aggregated cell masses in a culture solution. Although not limiting, it is used herein as a method for three-dimensionally culturing cells for mass production. As another culture method for suspension culture, there is adhesion culture.
  • the “adhesion culture method” is a method of adhesion culture of cells. "Adhesive culture” refers to adhering cells to an external matrix or the like such as a culture vessel and growing the cells in principle in a monolayer.
  • the culture method of interest is the suspension culture method in order to produce cell aggregates and to control their size.
  • the culture method used other than the main steps such as the maintenance culture stage is not limited to this.
  • the above-mentioned adherent cells can usually be cultured not only in adherent culture but also in suspension culture.
  • medium refers to a liquid or solid substance prepared to culture cells. In principle, components essential for cell growth and / or maintenance are included at least the necessary minimum.
  • the medium of the present specification corresponds to a liquid medium for animal cells used for culturing animal-derived cells, unless otherwise specified.
  • Pluripotent stem cells can be obtained by culture such as adhesion culture described in>.
  • a predetermined cell line can be grown by adhesion culture to obtain a cell line of a predetermined number of cells.
  • adheresion culture usually refers to culturing cells on a culture vessel surface, on a polymer carrier, or on feeder cells (eg, mouse fibroblasts) and growing them in principle in a monolayer.
  • the culture medium for proliferation of pluripotent stem cells by suspension culture is susceptible to the culture environment, and it is necessary to select one suitable for maintaining cell quality (eg, undifferentiated).
  • a serum-free culture medium In order to maintain quality stability and eliminate harmful substances such as pathogens, it is preferable to use a serum-free culture medium, and various serum-free synthetic media are commercially available or described in the literature.
  • Such media can be used in the culture of the present invention (e.g., Y. Mikoto and M. Furue, Bioengineering 92, 487-490, 2014 (Japan Society of Bioengineering); R. Ian Freshney, Culture. of Animal Cells: Manual of Basic Techniques and Specialized Applications (Sixth Ed.), John Wiley & Sons, Inc., 2010).
  • the medium used in the present invention is preferably one suitable for suspension culture of pluripotent stem cells, and is typically a liquid medium containing a basal medium for animal cells and additives.
  • basal medium refers to a medium on which various animal cell culture media are based. A single culture is possible, and various culture additives can be added to prepare a culture medium specific to various cells according to the purpose.
  • the weight ratio of DMEM medium to ham F12 medium is preferably 60/40 to 40/60, more preferably 55/45 to 45/55, most preferably equivalent.
  • the culture medium mixed at (weight ratio of 50/50) is used.
  • the medium used in the present invention is preferably a medium without serum (serum-free medium) or a medium containing serum replacement.
  • serum replacement may be mentioned KnockOut TM Serum Replacement (KSR) ( Gibco).
  • the additives in the culture medium used in the present invention can include, for example, but not limited to, the components listed below.
  • L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate contains at least one selected from L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate, and more preferably contains all of them.
  • L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate can be added to the medium in the form of solution, derivative, salt or mixed reagent.
  • L-ascorbic acid may be added to the culture medium in the form of a derivative such as 2-phosphate magnesium ascorbate.
  • Selenium may be added to the medium in the form of selenite (such as sodium selenite).
  • Insulin and transferrin may be of natural origin separated from tissues (such as humans, mice, rats, cattle, horses, goats, etc.) or serum of animals (preferably human, mouse, rat, etc.) or recombinantly produced by genetic engineering It may be a protein. Insulin, transferrin and selenium may be added to the medium in the form of the reagent ITS (insulin-transferrin-selenium). ITS is an additive for promoting cell growth, including insulin, transferrin, and sodium selenite.
  • a medium containing the above-mentioned additive for example, a commercially available medium containing at least one selected from L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate can be used.
  • Commercially available media to which insulin and transferrin have been added include CHO-S-SFM II (Life Technologies Japan Ltd.), Hybridoma-SFM (Life Technologies Japan Ltd.), eRDF Dry Powdered Media (Life Technologies Japan Ltd.), UltraCULTURE TM (BioWhittaker Inc.), UltraDOMA TM (BioWhittaker Inc.), UltraCHO TM (BioWhittaker, Inc.), can be used UltraMDCK TM (BioWhittaker Inc.).
  • STEMPRO TM hESC SFM Life Technologies Japan, Ltd.
  • mTeSR1 (Veritas, Inc.)
  • TeSR2 (Veritas, Inc.)
  • media used for culturing human iPS cells and human ES cells can also be suitably used.
  • the medium used in the present invention further preferably contains at least one growth factor.
  • the growth factors include, but are not limited to, FGF2 (Basic fibroblast growth factor-2), TGF- ⁇ 1 (Transforming growth factor- ⁇ 1), Activin A, IGF-1, MCP-1, IL-6, PAI, It is preferable to include one or more selected from the group consisting of PEDF, IGFBP-2, LIF (Leukemia Inhibitory Factor), and IGFBP-7. Since LIF has a differentiation suppressive action, it is preferable to add a predetermined amount thereof to the culture medium. Also, preferred growth factors are FGF2 and / or TGF- ⁇ 1.
  • the most preferable medium as used in the present invention is a serum-free medium containing L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate, and at least one of the above-mentioned growth factors as components other than the cell cycle arrester described later. And particularly preferably L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium bicarbonate, and at least one growth factor (eg LIF, FGF2 and TGF- ⁇ 1), in serum free DMEM / F12 medium It is.
  • Such media include, but are not limited to, the addition of ROCK inhibitor (see ⁇ 5.Rho- kinase inhibitor>), Essential 8 TM medium (Life Technologies Japan Ltd.) can be preferably used .
  • Essential 8TM medium is DMEM / F12 medium DMEM / F-12 (HAM) 1: 1, which is commercially available from Life Technologies Japan KK, and Essential 8TM supplement (L-ascorbic acid, insulin, transferrin, Selenium, sodium bicarbonate, FGF2 and TGF- ⁇ 1 can be mixed and prepared. Since the ROCK inhibitor has an effect of suppressing cell death of pluripotent stem cells, it is preferable to add a predetermined amount thereof to the culture medium.
  • the medium used in the present invention may further comprise additional components such as fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffers, inorganic salts, antibiotics, etc. May be contained.
  • additional components such as fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffers, inorganic salts, antibiotics, etc. May be contained.
  • antibiotics penicillin, streptomycin, amphotericin B and the like can be used.
  • Cell cycle arrester> when pluripotent stem cells are cultured in suspension, at least one arbitrary cell cycle arresting agent, for example, a substance or agent that controls the cytoskeleton to stop the cell cycle, in order to suppress cell aggregation of the stem cells. , Is characterized by adding to the culture medium. If the aggregate size is too large due to cell aggregation, oxygen and nutrient components are not sufficiently supplied to the inside of the aggregate, and as a result, cell proliferation is significantly suppressed. For this reason, it is important to control culture conditions so that the aggregate size is substantially uninhibited or hardly inhibited of cell growth. In the present invention, in order to suppress such cell aggregation, it is effective to add a predetermined amount of cell cycle terminator to the culture medium.
  • a predetermined amount of cell cycle terminator to the culture medium.
  • G 1 phase is a preparatory phase before DNA replication
  • S phase is the DNA replication stage
  • G 2 phase is a preparatory phase before cell division
  • It consists of M phase which is cell division phase.
  • substances or agents capable of arresting the cell cycle can suppress aggregation of pluripotent stem cells.
  • Cell cycle arresting agents include all cytoskeletal control agents capable of suppressing aggregation of pluripotent stem cells in suspension culture, in other words, substances or drugs that control the cytoskeleton to stop the cell cycle.
  • Actin polymerization inhibitors, actin fiber depolymerization inhibitors, tubulin polymerization inhibitors, tubulin fiber depolymerization inhibitors and the like can be mentioned as non-limiting examples.
  • Various substances (or drugs) are known as these arresting agents, and the cell cycle arresting time at which they act (G 1 phase, G 2 phase, G 1 / S phase, G 2 / M phase, M phase Etc) depends on the substance (or drug).
  • the cell cycle arresting agent is a G 1 phase arresting agent, a G 1 / S phase arresting agent, a G 2 phase arresting agent, a G 2 / M phase arresting agent, and an M phase arresting agent At least one (ie, one or more) substance (or drug) selected from agents.
  • Colchicine Cold-chain sulfoxide
  • Cytochalasin D Cytochalasin B
  • Docetaxel Docetaxel
  • Podophyllotoxin Podophyllotoxin
  • Demecolcine Demecolcine
  • Nocodazole Nocodazole
  • Jasplakinolide Jasplakinolide
  • vinblastine Vinblastine
  • griseofulvin Griseofulvin
  • vinorelbine Vinorelbine
  • latrunculin A Latorunculin A), 2,3,5-triiodobenzoic acid (2,3,5-Triiodobenzoic acid)
  • TIBA Ansa Mitocin P-3 (Ansamitocin P-3), Cytochalasin A (Cytochalasin A), Cytochalasin
  • Ras / Rac trans conformation blockers Ras / Rac Transformation Blocker
  • SCH51344 6- methoxy - 4- (2-((2-hydroxyethoxy) -ethyl) amino) -3-methyl-1H-pyrazolo [3,4-b] quinoline
  • sodium 4-phenylbutyrate sodium 4-phenylbutyrate
  • STAT3 Inhib) bitor for example, Ac-PpYLKTK-OH (SEQ ID NO: 2), PpYLKTK-mts (SEQ ID NO: 3, Turkson, J.
  • the “salt” in the present specification is a salt exhibiting an aggregation inhibitory effect on pluripotent stem cells and is a salt formed from an acid or a base (including an inorganic acid or inorganic base, or an organic acid or organic base), If the above substance or compound is basic, it can form a salt from an inorganic or organic acid, or, if the above substance or compound is acidic, form a salt from an inorganic or organic base Can.
  • inorganic acids and organic acids include, without limitation, inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, boric acid, carbonic acid, etc., acetic acid, succinic acid, aspartic acid, glutamic acid, methanesulfonic acid, tartaric acid, maleic acid etc.
  • organic acids and the like examples of the inorganic base and the organic base include, without limitation, alkali metals such as sodium and potassium, amines such as diethanolamine and ethylenediamine, amino acids such as lysine and arginine, and the like.
  • G 1 phase terminating agents include, for example, colchicine (Colchicine) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the G 1 / S phase terminator includes, for example, cytochalasin D.
  • G 2 phase terminating agents include, for example, cytochalasin D (Cytochalasin D), colchicine (Colchicine), or docetaxel (Docetaxel).
  • the G 2 / M phase terminator includes, for example, podophyllotoxin (Podophyllotoxin), demecolcine (Demecolcine), latrunculin A (Latorunculin A, cytochalasin B), or nocodazole (Nocodazole).
  • M-phase terminators include, for example, Jasplakinolide.
  • Rho-kinase inhibitor A substance that inhibits the kinase activity of Rho-kinase (ROCK, Rho-associated protein kinase) (referred to as "ROCK inhibitor") is a medium for the purpose of suppressing cell death of the pluripotent stem cells in suspension culture. Preferably, it is added to the inside.
  • ROCK inhibitor for example, Y-27632 (4-[(1R) -1-aminoethyl] -N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide or a salt thereof (eg, dihydrochloride)) (eg, N. Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57: 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol.
  • H-1152 ((S)-(+)-2 -Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl) sulfonyl] -hexahydro-1H-1,4-diazepine or a salt thereof (eg dihydrochloride) (eg Sasaki et al., Pharmacol. Ther.
  • Fasudi / HA 1077 (1- (5-isoquinolinesulfonyl) homopiperazine or a salt thereof (eg dihydrochloride)) (see, eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), Wf-536 ((+) -(R) -4- (1-aminoethyl) -N- (4-pyridyl) benzamide monohydrochloride (see, for example, Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003).
  • ROCK inhibitors include RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative mutants, and expression vectors thereof.
  • other low molecular weight compounds are known as ROCK inhibitors, and such compounds or their derivatives can also be used as ROCK inhibitors in the present invention (eg, US Patent Application Publication No. 2005/0209261, Patent Publication Nos. 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508, 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and WO 2003/062227 2003/059913, 2003/0622225, 2002/076976, 2004/039796).
  • the ROCK inhibitor one or more ROCK inhibitors can be used as the ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor is particularly preferably one or more selected from Y-27632 and H-1152, most preferably Y-27632.
  • Y-27632 and H-1152 may each be used in the form of a dihydrochloride.
  • Another aspect of the present invention is a method of suppressing aggregation of pluripotent stem cells, comprising the step of suspension culture of pluripotent stem cells in a medium containing a cell cycle arresting agent.
  • pluripotent stem cells used for suspension culture can be made to have a predetermined number of cells by maintaining culture while maintaining undifferentiated property in advance by a conventional method.
  • the cells are grown while maintaining the undifferentiated state of the cell population before the step of suspension culture, or the cell aggregate obtained after the suspension culture step or after the subsequent recovery step. It is a process of culturing in order to
  • adhesion culture can be used in which cells are cultured while being adhered to a culture substrate such as a culture vessel surface or a polymer carrier.
  • a culture substrate such as a culture vessel surface or a polymer carrier.
  • Cells which had been cultured and maintained for example a known release agent (e.g., trypsin, collagenase, papain, Acutase TM, etc.) is peeled peeling or between cells from the culture substrate, the use in suspension culture from well dispersed . It can be passed through a strainer to disperse the cells into single cells.
  • a known release agent e.g., trypsin, collagenase, papain, Acutase TM, etc.
  • the predetermined number of pluripotent stem cells collected by the above maintenance culture are subjected to the suspension culture step of the present invention and, if necessary, the cell recovery step as follows.
  • the concentration of the cell cycle arresting agent in the culture medium in the above steps can be appropriately adjusted according to various conditions such as the type of cells, the number of cells, the type of culture medium, etc., so as to suppress cell aggregation. .
  • the concentration of the cell cycle arresting agent in the culture medium in the above step varies depending on the type of the inhibitor, and a concentration range in which aggregation of pluripotent stem cells is suppressed in suspension culture can be appropriately selected.
  • the concentration is not limited, but the lower limit is, for example, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 7 ng / mL or more, 10 ng / mL or more, 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, 40 ng / mL or more , 50 ng / mL or more, 100 ng / mL or more, 200 ng / mL or more, 300 ng / mL or more, 500 ng / mL or more, 1 ⁇ g / mL or more, 5 ⁇ g / mL or more, 10 ⁇ g / mL or more, 15 ⁇ g / mL or more, 20 ⁇ g / mL or more 50 ⁇ g / mL or more, 70 ⁇ g / mL or more, 100 ⁇ g / mL or more, and the upper limit is, for example, 50 mg
  • the lower limit is, for example, 3 nM or more, 5 nM or more, 10 nM or more, 15 nM or more, 20 nM or more, 25 nM or more, 40 nM or more, 50 nM or more, 50 nM or more, 80 nM or more, 100 nM or more, 300 nM or more, 500 nM or more, 1 ⁇ M or more, 2 ⁇ M or more , 3 ⁇ M or more, 4 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 20 ⁇ M or more, 30 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, 60 ⁇ M or more, 70 ⁇ M or more, 80 ⁇ M or more, 100 ⁇ M or more, and the upper limit is, for example, 800 mM or less, 600 mM or less, 400 mM Hereinafter, it can be 200 mM or less, 150 mM or less, 100 mM or less, 70 mM or less, 70
  • the concentration of ROCK inhibitor in the medium is desirably at a level that does not affect aggregation suppression of pluripotent stem cells, and the lower limit is, for example, 3.3 ng / mL or more, 33 ng or more / ML or more, 330 ng / mL or more, 800 ng / mL or more, 1 ⁇ g / mL or more, 2 ⁇ g / mL or more, 3 ⁇ g / mL or more, 4 ⁇ g / mL or more, 5 ⁇ g / mL or more, 6 ⁇ g / mL or more, 7 ⁇ g / mL or more, 8 ⁇ g / ML, 9 ⁇ g / mL or more, or 10 ⁇ g / mL or more, and the upper limit is not limited as
  • the lower limit of the concentration is not limited, but for example, 10 nM or more, 100 nM or more, 1 ⁇ M or more, 2.5 ⁇ M or more, 3 ⁇ M or more, 4 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, 6 ⁇ M or more, 7 ⁇ M or more, 8 ⁇ M or more, 9 ⁇ M or more
  • the upper limit is, for example, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 50 ⁇ M or less, 40 ⁇ M or less.
  • the ROCK inhibitor is any of Y-27632 ⁇ dihydrochloride, H-1152 ⁇ dihydrochloride, HA10777 ⁇ dihydrochloride and Wf-536 ⁇ monohydrochloride
  • the lower limit is, for example, 270 ng / mL or more
  • the range is 400 ng / mL or less, 1.3 ⁇ g / mL or more and 2.0 ⁇ g / mL or less, 2.2 ⁇ g / mL or more and 3.2 ⁇ g / mL or less
  • the upper limit is, for example, 2.8 ⁇ g / mL.
  • the suspension culture in the same culture medium in which the other components are the same except for containing no cell cycle arrester and containing a ROCK inhibitor as a criterion for determining that the aggregation of pluripotent stem cells is suppressed, the suspension culture in the same culture medium in which the other components are the same except for containing no cell cycle arrester and containing a ROCK inhibitor.
  • the degree of cell clumping eg by microscopy) can be used as a control.
  • the culture vessel used in the above process is preferably a vessel having low adhesion of cells to the inner surface of the vessel.
  • the inner surface of the container may be subjected to a hydrophilic surface treatment, for example, with a biocompatible substance, a polymer substance or the like.
  • a biocompatible substance for example, a polymer substance or the like.
  • Nunclon TM Sphera Thermo Fisher Scientific, Inc.
  • the shape of the culture vessel is not particularly limited, but, for example, culture vessels in the form of wells, dishes, flasks (for example, spinner flasks), bottles (for example, roller bottles), multilayers (for example, cell factories), radial flow type reactors, hollow fiber reactors (eg material, polyethylene coated with ethylene-vinyl alcohol copolymer, cellulose acetate, etc.), CultiLife TM Spin bags with plastic bag reactors (eg, ethylene vinyl acetate material (TAKARA ), VueLife FEP Bag 32-C (American Fluoroseal Corporation), culture bag A-1000NL (Nipro), etc.
  • plastic bag reactors eg, ethylene vinyl acetate material (TAKARA ), VueLife FEP Bag 32-C (American Fluoroseal Corporation), culture bag A-1000NL (Nipro), etc.
  • a reactor preferably a bioreactor suitable for mass culture, etc. may be mentioned.
  • a system which reduces or suppresses shear stress on pluripotent stem cells as much as possible and reduces cell death as much as possible is preferable.
  • Suspension culture may be static culture or culture under conditions in which the medium flows, but preferably culture in conditions in which the medium flows.
  • cultivation on the conditions which a culture medium flows culture
  • the culture medium flows so as to suppress cell aggregation for example, the culture medium flows so that the cells gather at one point by stress (centrifugal force, afferent force) by the flow such as swirling flow or rocking flow
  • Culture under conditions or culture under conditions in which the medium flows by linear reciprocation may be mentioned, and culture using swirling flow and / or oscillating flow is particularly preferable.
  • a culture vessel containing a medium, cells, and a cell culture composition containing a cell cycle arresting agent is generally closed along a horizontal plane such as a circle, an ellipse, a flattened circle, a flattened ellipse, a figure of eight, etc. It can be done by pivoting as described, or by combining pivoting and swinging, or pivoting and shaking.
  • the turning speed is not particularly limited, but the upper limit is preferably 200 rpm or less, for example, 150 rpm or less, 120 rpm or less, 115 rpm or less, 110 rpm or less, 105 rpm or less, 100 rpm or less, 95 rpm or less, 90 rpm or less.
  • the lower limit is preferably 1 rpm or more, for example 10 rpm or more, 50 rpm or more, 60 rpm or more, 70 rpm or more, 80 rpm or more, 90 rpm or more.
  • the swing width at the time of the swing culture is not particularly limited, but the lower limit can be, for example, 1 mm or more, 10 mm or more, 20 mm or more, 25 mm or more. Further, the swing width in the case of the swing culture is not particularly limited, but the upper limit of the swing width can be, for example, 200 mm or less, 100 mm or less, 50 mm or less, 30 mm or less, 25 mm or less.
  • the turning radius in the case of spin culture is also not particularly limited, but preferably the spin width is set to be in the above range.
  • the lower limit of the rotation radius is, for example, 5 mm or more and 10 mm or more, and the upper limit can be, for example, 100 mm or less and 50 mm or less.
  • Swing culture is culture performed while flowing a liquid culture medium by rocking agitation.
  • the swing culture is performed by swinging the culture vessel containing the cell culture composition containing the medium, the cells, and the cell cycle arresting agent in a plane generally perpendicular to the horizontal plane.
  • the rocking speed is not particularly limited, for example, when one reciprocation is performed once, the lower limit is, for example, twice or more, 4 or more, 6 or more, 8 or more, or 10 times or more in one minute,
  • the upper limit may be, for example, 15 or less, 20 or less, 25 or less, or 50 or less in one minute.
  • the swing angle is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 0 ° or more, 1 ° or more, 2 ° or more, 4 ° or more, 6 ° or more, 8 ° or more, the upper limit is, for example, 10 ° or less, 12 ° Hereinafter, it can be 15 degrees or less, 18 degrees or less, 20 degrees or less, or the like.
  • the swing culture conditions By setting the swing culture conditions in this range, it is possible to produce cell aggregates of an appropriate size, which is preferable.
  • the culture using a spinner flask-like culture vessel is a culture that is performed while stirring the liquid medium using a stirring wing in the culture vessel.
  • the number of rotations and the amount of medium are not particularly limited. If it is a commercially available spinner flask-like culture vessel, the amount recommended by the manufacturer can be suitably used as the amount of the cell culture composition.
  • the rotation speed can be, for example, 10 rpm or more and 100 rpm or less, but is not particularly limited.
  • the bioreactor includes a tank, column, bag, etc., equipped with a stirring system such as shaking, peristalsis, rotation, etc., and a medium supply / removal system, an oxygen / carbon dioxide supply system, temperature, medium components, gas components. It is preferable that the whole be automated, including a monitoring system including a measurement sensor, a cell recovery system, and the like.
  • the mode of culture may be batch, semi-continuous or continuous.
  • the seeding density (cell density at the start of suspension culture) of the cells in suspension culture in the medium can be appropriately adjusted, and is not limited to the following, but the lower limit is, for example, 0.01 ⁇ 10 5 For example, cells / mL or more, 0.1 ⁇ 10 5 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 5 cells / mL or more, and the like.
  • the upper limit of the seeding density is, for example, 20 ⁇ 10 5 cells / mL or less, 10 ⁇ 10 5 cells / mL or less. When the seeding density is in this range, cell aggregates of appropriate size are likely to be formed.
  • the amount of the cell culture composition in suspension culture can be appropriately adjusted depending on the inner volume of the culture vessel or bioreactor used, but is not limited to, for example, 1 mL or more and 100 L or less.
  • the well plate the Erlenmeyer flask and the culture bag, without limitation, for example, when using a 12 well plate (the area of the well bottom in plan view per well is 3.5 cm 2 ), for example, 0. It can be 5 ml / well or more and 1.5 ml / well or less, for example, 1.3 ml / well.
  • the area of the well bottom in plan view is 9.6 cm 2 per well
  • 6.0 mL / well or less, 5 mL / well or less, 4 mL / well or less, and the like can be used.
  • a 125 mL Erlenmeyer flask (a volume of 125 mL Erlenmeyer flask), for example, 10 mL / container or more, 15 mL / container or more, 20 mL / container or more, 25 mL / container or more, 20 mL / container or more, 25 mL / container or more, 30 mL
  • it can be 50 mL / container or less, 45 mL / container or less, 40 mL / container or less, or the like.
  • a 500 mL Erlenmeyer flask e.g.
  • 500 mL Erlenmeyer flask it can be 100 mL / container, 105 mL / container, 110 mL / container, 115 mL / container, 120 mL / container, etc.
  • it may be 150 mL / container, 145 mL / container, 140 mL / container, 135 mL / container, 130 mL / container, 125 mL / container, and the like.
  • a 1000 mL Erlenmeyer flask 1000 mL Erlenmeyer flask
  • 250 mL / container 250 mL / container
  • 260 mL / container 270 mL / container
  • 280 mL / container 290 mL / container
  • 350 mL / container or less 340 mL / container or less, 330 mL / container or less, 320 mL / container or less, 310 mL / container or less, etc.
  • a 2000 mL Erlenmeyer flask (a capacity of 2000 mL Erlenmeyer flask)
  • it can be, for example, 500 mL / container, 550 mL / container, 600 mL / container, etc., for example 1000 mL / container or less, 900 mL / container or less, 800 mL / Container or less, 700 mL / container or less, etc.
  • a 3000 mL Erlenmeyer flask (a Erlenmeyer flask with a capacity of 3000 mL), for example, 1000 mL / container, 1100 mL / container, 1200 mL / container, 1300 mL / container, 1400 mL / container, 1500 mL / container, etc.
  • 2000 mL / vessel or less 1900 mL / vessel or less, 1800 mL / vessel or less, 1700 mL / vessel or less, 1600 mL / vessel or less, and the like can be used.
  • a 2 L culture bag (disposable culture bag having a volume of 2 L), for example, 100 mL / bag or more, 200 mL / bag or more, 300 mL / bag or more, 400 mL / bag or more, 500 mL / bag or more, 600 mL / bag or more, 700 mL / bag or more More than bag, 800 mL / bag, 900 mL / bag, 1000 mL / bag, etc., for example, 2000 mL / bag, 1900 mL / bag, 1800 mL / bag, 1700 mL / bag, 1600 mL / bag, etc.
  • a 10 L culture bag (a disposable culture bag having a capacity of 10 L), for example, 500 mL / bag, 1 L / bag, 2 L / bag, 3 L / bag, 4 L / bag, 5 L / bag, etc.
  • 10 L / bag or less 9 L / bag or less, 8 L / bag or less, 7 L / bag or less, 6 L / bag or less, and the like.
  • a 20 L culture bag (a disposable culture bag having a volume of 20 L), for example, 1 L / bag, 2 L / bag, 3 L / bag, 4 L / bag, 5 L / bag, 6 L / bag, 7 L / More than bag, 8 L / bag, 9 L / bag, 10 L / bag, etc.
  • a 50 L culture bag (a disposable culture bag having a capacity of 50 L), for example, 1 L / bag, 2 L / bag, 5 L / bag, 10 L / bag, 15 L / bag, 20 L / bag, 25 L / bag
  • it can be 50 L / bag, 45 L / bag, 40 L / bag, 35 L / bag, 30 L / bag, and the like.
  • the amount of cell culture composition is in this range, cell aggregates of an appropriate size are likely to be formed.
  • another larger volume of bioreactor it may be more than the upper limit of the amount of cell culture composition exemplified above, and its size may vary with the volume of the bioreactor. .
  • the volume of the culture vessel to be used can be appropriately selected and is not particularly limited, but for example, it is 2 mL or more and 200 L or less, or the lower limit is, for example 0 .32Cm 2 above, 0.65 cm 2 or more, 0.65 cm 2 or more, 1.9 cm 2 or more, 3.0 cm 2 or more, 3.5 cm 2 or more, 9.0 cm 2 or more, culture vessels, such as 9.6 cm 2 or more
  • the upper limit is, for example, 1000 cm 2 or less, 500 cm 2 or less, 300 cm 2 or less, 150 cm 2 or less, 75 cm 2 or less, 55 cm 2 or less, 25 cm 2 or less, 21 cm 2 or less, 9.6 cm 2 or less, 3
  • a culture vessel having a size of 0.5 cm 2 or less can be used.
  • it may be larger than the upper floor area exemplified above, and its size may vary depending on the shape of the bioreactor.
  • Conditions such as temperature, time, CO 2 concentration and the like of suspension culture of cells in the presence of the above-mentioned lipid are not particularly limited.
  • the culture temperature is not limited, but the lower limit is, for example, 20 ° C. or more, 25 ° C. or more, 30 ° C. or more, 35 ° C. or more, and the upper limit is, for example, 45 ° C. or less, 40 ° C. or less Preferably 37.degree.
  • the culture time is not limited, but the lower limit is, for example, 0.5 hours or more, 12 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, and the upper limit is, for example, 7 days or less, 6 days The following is 5 days or less, 4 days or less, 3 days or less.
  • the CO 2 concentration during culture is not limited, but the lower limit is, for example, 4% or more, 4.3% or more, or 4.5% or more, and the upper limit is, for example, 10% or less, It is 8% or less, 7% or less, or 6% or less, preferably 5%.
  • Suspension culture may involve passage. When culture conditions are in this range, cell aggregates of appropriate size tend to be formed. When culture conditions are in this range, cell aggregates of appropriate size tend to be formed.
  • medium exchange can be performed at an appropriate frequency.
  • the frequency of medium replacement varies depending on the cell type to be cultured, but for example, once or more on 5 days, once or more on 4 days, once or more on 3 days, once or more on 2 days, or once or more per day You can do it in
  • the preferable frequency of medium exchange is, for example, once or more a day.
  • the medium may be exchanged by collecting the cells in the same manner as the recovery step described later, adding fresh medium, gently dispersing the cell aggregate, and culturing again.
  • the extent to which the number of cells is increased in the suspension culture step and where the state of the cells is to be adjusted may be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured, the purpose of cell aggregation, the type of culture medium and culture conditions.
  • medium exchange can be performed continuously or periodically.
  • This frequency of media change is particularly suitable for culturing cell clumps of pluripotent stem cells.
  • the method of medium exchange is not particularly limited, but cells and medium are separated via porous membrane, fresh medium is replenished, old medium is discharged from the circulatory system when the medium is allowed to flow, and fresh medium is extracted. It is a method of replenishing continuously or at fixed time intervals. There is also a method of separating cells and culture media by centrifugation, but it is necessary to suppress cell death.
  • the cells used in the suspension culture step are cells previously cultured in the maintenance culture step, recovered in the recovery step, and optionally made single cells.
  • the maintenance culture step, the recovery step, and single cell formation are as described later.
  • the culture solution is discarded and cells are recovered by a conventional method.
  • cells are preferably recovered as single cells by exfoliation or dispersion treatment. The specific method will be described in detail in the recovery step described later.
  • the collected cells may be subjected to the next step after washing as they are or, if necessary, washing with buffer (including PBS buffer), saline or medium (preferable to the medium used in the next step or the basal medium). .
  • Maintenance culture In the "maintenance culture step", the cell population before the suspension culture step, or the cell aggregate obtained after the suspension culture step or after the subsequent recovery step is cultured to grow the cells while maintaining the undifferentiated state It is a process.
  • Maintenance culture may be adhesion culture in which cells are cultured while being attached to a culture substrate such as a container or carrier, or may be suspension culture in which cells are cultured in suspension in a medium.
  • cells of interest may be cultured by an animal cell culture method known in the art. Either adhesion culture or suspension culture may be used.
  • the culture vessel used in the maintenance culture step, the seeding density of cells, and the culture conditions are as described above for the suspension culture step.
  • the flow state of the culture medium in the maintenance culture process does not matter. It may be stationary culture or fluid culture.
  • the term "stationary culture” refers to culture in a state where the medium is allowed to stand in a culture vessel. In adherent culture, this static culture is usually employed.
  • fluid culture refers to culture under conditions in which the medium is allowed to flow. Specific embodiments of the fluid culture are as described above for the suspension culture process.
  • the extent to which the number of cells is increased in the maintenance culture step and where the state of the cells is to be adjusted may be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured, the purpose of cell aggregation, the type of culture medium and culture conditions.
  • a preferred embodiment of the maintenance culture step is a maintenance culture step of further culturing the cell aggregate formed by the suspension culture step in the presence of the cell aggregation inhibitor containing the cell cycle arresting agent.
  • the culture method in the maintenance culture step of this embodiment is not particularly limited, but includes, for example, the step of suspension culture of cell aggregates in a medium not containing a cell aggregation inhibitor containing the above-mentioned cell cycle arresting agent.
  • the culture medium used for the maintenance culture the same culture medium as described above can be used except that the cell aggregation inhibitor containing the above-mentioned cell cycle arresting agent is not contained, and the culture conditions are the same as the suspension culture process. It can be used.
  • the frequency of medium exchange varies depending on the cell type, but for example, once or more on 5 days, once or more on 4 days, once or more on 3 days, once or more on 2 days, or once or more times a day
  • a medium exchange operation can be included, preferably at a frequency of one or more times a day.
  • This frequency of media change is particularly suitable for culturing stem cell clumps.
  • the method of medium exchange is not particularly limited, for example, the entire amount of cell culture composition containing cell aggregates is collected in a centrifuge tube, centrifuged or left in a standing state for about 5 minutes, leaving the precipitated cell aggregates leaving the supernatant.
  • the cell aggregates After removing fresh cells, adding fresh medium and gently dispersing the cell aggregates, the cell aggregates can be continuously cultured by returning the cell aggregate dispersion medium to the culture vessel such as a plate again. it can.
  • cultivation process of this aspect is not specifically limited, For example, it is a period of 3 to 7 days.
  • the culture solution is discarded and cells are recovered by a conventional method.
  • cells are preferably recovered as single cells by exfoliation or dispersion treatment.
  • the specific method will be described in detail in the recovery step described later.
  • the collected cells may be subjected to the next step after washing as they are or, if necessary, after washing with a buffer (eg PBS buffer etc.), a diet, or a medium (the medium used in the next step or the basal medium is preferred). .
  • the “recovery step” is a step of recovering the cultured cells from the culture solution after the maintenance culture step or the suspension culture step, and is a step of recovering a target cell aggregate in the method of the present invention.
  • “cell recovery” or simply “recovery” refers to the separation of culture fluid and cells to obtain cells.
  • the cell recovery method may be in accordance with a conventional method used in cell culture methods in the art, and is not particularly limited. Cell culture methods can generally be roughly divided into suspension culture methods and adhesion culture methods. Hereinafter, methods for recovering cells after each culture method will be described.
  • the container containing the culture solution When the liquid component is removed in the standing state, the container containing the culture solution may be left in the standing state for about 5 minutes, and the supernatant may be removed leaving the precipitated cells and cell aggregates. Centrifugation may be carried out at a rotational speed and treatment time at which cells are not damaged by the centrifugal force.
  • the lower limit of the rotation speed is not particularly limited as long as cells can be sedimented, but may be, for example, 500 rpm or more, 800 rpm or more, or 1000 rpm or more.
  • the upper limit may be a speed at which cells are not damaged or hardly damaged by centrifugal force, and may be, for example, 1400 rpm or less, 1500 rpm or less, or 1600 rpm or less.
  • the lower limit of the treatment time is not particularly limited as long as the cells can be sedimented by the rotation speed, but may be, for example, 30 seconds or more, 1 minute or more, 3 minutes or more, or 5 minutes or more.
  • the upper limit may be a time during which cells are not damaged or hardly received by the rotation, and may be, for example, 6 minutes or less, 8 minutes or less, or 10 minutes or less.
  • the recovered cells can be washed as needed.
  • the cleaning method is not limited.
  • washing solution e.g, PBS buffer etc.
  • a saline or a medium e.g, basal medium
  • the cell surface attached to the external matrix can also be washed, if necessary.
  • a buffer eg, PBS buffer etc.
  • a saline or a medium eg, basal medium
  • the washing solution after washing may be removed by the same operation as the culture solution. This washing step may be repeated multiple times.
  • the peeling method may be performed by a method known in the art. Usually, scraping, a stripping agent containing a proteolytic enzyme as an active ingredient, a chelating agent such as EDTA, or a mixture of a stripping agent and a chelating agent are used.
  • Scraping is a method in which cells attached to the outer matrix are scraped off by mechanical means using a scraper or the like.
  • the cells are susceptible to damage by mechanical manipulation, when the recovered cells are subjected to further culture, the scaffold portion of the cells adhered to the external matrix is chemically disrupted or degraded to The peeling method which cancels
  • a peeling agent and / or a chelating agent is used.
  • the release agent is not limited, for example, trypsin, collagenase, pronase, hyaluronidase, other elastase, commercially available Accutase (registered trademark), TrypLE TM Express Enzyme (Life Technologies Japan, Ltd.), TrypLE TM Select Enzyme (Life Technologies Japan stock Companies), dispase (trademark registration), etc. can be used.
  • the concentration and treatment time of each exfoliating agent may be used within the range of conventional methods used for exfoliation or dispersion of cells.
  • the lower limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as it is a concentration at which cells can be detached, for example, 0.01% or more, 0.02% or more, 0.03% or more, 0.04 % Or more, 0.05% or more, 0.08% or more, or 0.10% or more.
  • the upper limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as the cells themselves are not affected by the action of trypsin or the like, but for example 0.15% or less, 0.20% or less, 0 .25% or less or 0.30% or less may be sufficient.
  • the treatment time depends on the concentration of trypsin
  • the lower limit is not particularly limited as long as the cells are sufficiently detached from the external matrix by the action of trypsin, for example, 1 minute or more, 2 minutes or more, It may be 3 minutes or more, 4 minutes or more, or 5 minutes or more.
  • the upper limit of the treatment time is not particularly limited as long as the cells themselves are not affected by the action of trypsin or the like, for example, 8 minutes or less, 10 minutes or less, 12 minutes or less, 15 minutes or less , 18 minutes or less, or 20 minutes or less.
  • the other release agents or chelating agents may be generally the same.
  • it can carry out by the density
  • the cells exfoliated from the external matrix are centrifuged to remove the supernatant containing the exfoliating agent. Centrifugation conditions may be the same as in the above-mentioned "recovery method after suspension culture method”.
  • the recovered cells can be washed as needed. The washing method may be carried out in the same manner as the above-mentioned "recovery method after suspension culture method”.
  • the cells obtained after this step may partially include cell aggregates such as monolayer cell fragments and cell aggregates.
  • the collected cells can also be made into single cells if necessary.
  • single cell formation refers to dispersion of cell aggregates in which a plurality of cells adhere or aggregate to one another, such as monolayer cell fragments or cell aggregates, etc., to a single free cell state. Say what to do.
  • Unicellularization may be achieved by increasing the concentration of the exfoliating agent and / or chelating agent used in the above exfoliating method and / or prolonging the treatment time with the exfoliating agent and / or chelating agent.
  • the lower limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as it is a concentration at which the cell aggregate can be dispersed, but, for example, 0.15% or more, 0.18% or more, 0.20% or more, or It may be 0.24% or more.
  • the upper limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as the concentration is not affected by dissolution of the cells themselves, for example, 0.25% or less, 0.28% or less, or 0.30% The following is sufficient.
  • the treatment time depends on the concentration of trypsin, the lower limit thereof is not particularly limited as long as the cell aggregate is sufficiently dispersed by the action of trypsin, for example, 5 minutes or more, 8 minutes or more, It may be 10 minutes or more, 12 minutes or more, or 15 minutes or more.
  • the upper limit of the treatment time is not particularly limited as long as the cells themselves are not affected by the action of trypsin or the like, for example, 18 minutes or less, 20 minutes or less, 22 minutes or less, 25 minutes or less , 28 minutes or less, or 30 minutes or less.
  • a commercially available release agent it may be used at a concentration capable of dispersing cells into a single state as described in the attached protocol.
  • the treatment with the release agent and / or the chelating agent can be physically lightly treated to promote single cell formation.
  • this physical treatment is not limited, for example, a method of pipetting cells several times with a solution may be mentioned.
  • cells may be passed through a strainer or mesh as needed.
  • the single-celled cells can be recovered by removing the supernatant containing the exfoliating agent by standing or centrifuging.
  • the collected cells may be washed as necessary.
  • the conditions for centrifugation and the washing method may be carried out in the same manner as the above-mentioned "recovery method after suspension culture method".
  • Pluripotent stem cell aggregation inhibitor for use in suspension culture of pluripotent stem cells, which comprises a cell cycle arresting agent.
  • the pluripotent stem cell aggregation inhibitor of the present invention can be used to appropriately suppress cell aggregation in a suspension culture system to form cell aggregates of substantially uniform size.
  • suspension culture of stem cells using the pluripotent stem cell aggregation inhibitor of the present invention the undifferentiated nature of stem cells can be maintained.
  • the form of the pluripotent stem cell aggregation inhibitor in the present invention is not particularly limited, and may be a cell cycle arresting agent itself, or a composition in which a cell cycle arresting agent and other components are combined.
  • the type of the other components is not particularly limited, and examples thereof include solvents, excipients, and / or compounds having other pharmacological effects and effects. These may be natural products or non-natural products. Further, the composition obtained as a result of the combination may be a natural composition existing in nature or may be an artificial composition. The artificial composition may be such that at least one of the components is non-naturally occurring. Examples of non-natural products include synthetic compounds. Specific examples of synthetic compounds that may be included in the cell aggregation inhibitor include ROCK inhibitors (eg, Y-27632 and the like) used for cell death suppression in the examples described later.
  • ROCK inhibitors eg, Y-27632 and the like
  • the form of the above composition is not particularly limited.
  • the composition may be, for example, in the form of a culture medium used for suspension culture, or may be in the form of a composition for addition added at the time of preparation of the culture medium.
  • a preferred embodiment of the pluripotent stem cell aggregation inhibitor in the present invention is a medium containing a cell cycle arresting agent or a buffer such as a phosphate buffer.
  • concentration of the cell cycle arresting agent in the medium ⁇ 6.
  • concentration of the cell cycle arresting agent in the medium described for suspension culture can be illustrated in the column of "Method for suppressing aggregation of pluripotent stem cells".
  • Another embodiment of the pluripotent stem cell aggregation inhibitor of the present invention is a liquid or solid composition containing a cell cycle arresting agent in a liquid or solid medium.
  • the liquid or solid composition is an additive to be added when preparing a culture medium for suspension culture.
  • the final concentration of the cell cycle arresting agent in the medium to be prepared is ⁇ 6. It is preferable to be prepared in a concentrated (or concentrated) form so that the concentration of the cell cycle arresting agent in the medium described in the suspension culture in the column of "Method for suppressing aggregation of pluripotent stem cells".
  • the concentration of the cell cycle arresting agent in the pluripotent stem cell aggregation inhibitor of this embodiment is not particularly limited, for example, the concentration of the above mentioned cell cycle arresting agent as the preferred concentration in the culture medium during suspension culture is For example, 1 time or more, 2 times or more, 10 times or more, 100 times or more, 1000 times or more, 10000 times or more, etc., and a solvent for dissolving the pluripotent stem cell aggregation inhibitor (eg DMSO, EtOH, buffer etc. Although it depends on the solubility to the above, but not limited thereto, for example, 55.0 mg / mL or more and 1.1 g / mL or less can be exemplified.
  • the lower limit of the concentration of the cell cycle arresting agent in one embodiment is not particularly limited as long as it is a concentration at which the cell aggregation inhibitory effect can be obtained, and for example, 60 mg / mL or more, 70 mg / mL or more, 80 mg / mL or more, 100 mg / mL More than mL, 110 mg / mL or more, 130 mg / mL or more, 140 mg / mL or more, 150 mg / mL or more, 160 mg / mL or more, 180 mg / mL or more, 200 mg / mL or more, 300 mg / mL or more, 500 mg / mL or more, etc.
  • the upper limit can be, for example, 600 mg / mL or less, 700 mg / mL or less, 800 mg / mL or less, 900 mg / mL or less, 1 g / mL or less, and the like.
  • the upper limit is not particularly limited as long as the cell does not die, but may be, for example, 15 M or less, 10 M or less, 5 M or less, 1 M or less, and may be, for example, in the range of 60 mM to 15 M.
  • the pluripotent stem cell aggregation inhibitor is, in addition to a cell cycle terminator, as an additive, an antibiotic, a buffer, a thickener, a colorant, a stabilizer, a surfactant, an emulsifier, a preservative, a preservative, It may contain an antioxidant and the like.
  • Antibiotics are not particularly limited, and for example, penicillin, streptomycin, amphotericin B and the like can be used.
  • As the buffer phosphate buffer, Tris-HCl buffer, glycine buffer and the like can be mentioned.
  • As the thickener gelatin, polysaccharides and the like can be mentioned.
  • a coloring agent phenol red etc. are mentioned.
  • albumin As the stabilizing agent, albumin, dextran, methylcellulose, gelatin and the like can be mentioned.
  • surfactant cholesterol, alkyl glycoside, alkyl polyglucoside, alkyl monoglyceryl ether, glucoside, maltoside, neopentyl glycol type, polyoxyethylene glycol type, thioglucoside, thiomaltoside, peptide, saponin, phospholipid, fatty acid sorbitan ester And fatty acid diethanolamide.
  • the emulsifier include glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sucrose fatty acid ester and the like.
  • aminoethylsulfonic acid benzoic acid, sodium benzoate, ethanol, sodium edetate, agarten, dl-camphor, citric acid, sodium citrate, salicylic acid, sodium salicylate, phenyl salicylate, dibutylhydroxytoluene, sorbic acid , Potassium sorbate, nitrogen, dehydroacetic acid, sodium dehydroacetate, 2-naphthol, sucrose, honey, isobutyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, butyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, p-hydroxybenzoic acid Methyl, l-menthol, eucalyptus oil etc.
  • Preservatives include benzoic acid, sodium benzoate, ethanol, sodium edetate, dried sodium sulfite, citric acid, glycerin, salicylic acid, sodium salicylate, dibutylhydroxytoluene, D-sorbitol, sorbic acid, potassium sorbate, sodium dehydroacetate And isobutyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, butyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, methyl p-hydroxybenzoate, propylene glycol, phosphoric acid and the like.
  • citric acid citric acid derivatives, vitamin C and its derivatives, lycopene, vitamin A, carotenoids, vitamin B and its derivatives, flavonoids, polyphenols, glutathione, selenium, sodium thiosulfate, vitamin E and Derivatives thereof, alpha lipoic acid and derivatives thereof, pycnogenol, flavangenol, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase, glutathione-S-transferase, glutathione reductase, catalase, ascorbic acid peroxidase, and mixtures thereof .
  • SOD superoxide dismutase
  • the pluripotent stem cell aggregation inhibitor may contain growth factors, such as one or more growth factors of FGF2 and TGF- ⁇ 1.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a cell aggregate, which comprises the step of suspension culture of pluripotent stem cells in a medium containing, for example, but not limited to, the concentration of cell cycle arresting agent described below.
  • the lower limit of the concentration of the cell cycle arresting agent in the above medium is, for example, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 7 ng / mL or more, 10 ng / mL or more, 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, 40 ng / mL or more , 50 ng / mL or more, 100 ng / mL or more, 200 ng / mL or more, 300 ng / mL or more, 500 ng / mL or more, 1 ⁇ g / mL or more, 5 ⁇ g / mL or more, 10 ⁇ g / mL or more, 15 ⁇ g / mL or more, 20 ⁇ g / mL or more 50 ⁇ g / mL or more, 70 ⁇ g / mL or more, or 100 ⁇ g / mL or more, and the upper
  • the lower limit is, for example, 3 nM or more, 5 nM or more, 10 nM or more, 15 nM or more, 20 nM or more, 25 nM or more, 40 nM or more, 50 nM or more, 50 nM or more, 80 nM or more, 100 nM or more, 300 nM or more, 500 nM or more, 1 ⁇ M or more, 2 ⁇ M or more , 3 ⁇ M or more, 4 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 20 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, 60 ⁇ M or more, 70 ⁇ M or more, 80 ⁇ M or more, or 100 ⁇ M or more, and the upper limit is, for example, 800 mM or less, 600 mM or less, 400 mM Hereinafter, it can be 200 mM or less, 150 mM or less, 100 mM or less, 70 mM or less, 50 mM or
  • cell aggregates of a suitable size can be produced in high yield while maintaining the undifferentiated nature of stem cells.
  • the production method of the present invention consumes about glucose on the fifth day of the culture. It is 1.3 times higher (see FIG. 3), and the cell yield is also increased by 5 times the number of seeded cells (see FIG. 4).
  • Yet another aspect of the present invention is a cell aggregate obtained by the method for producing a cell aggregate described above.
  • Cell clumps according to this aspect of the invention have moderate dimensions and high viable cell rates (see FIGS. 1A-1C and FIGS. 2B-2E).
  • the size range of cell aggregates of pluripotent stem cells that can be prepared by the method of the present invention is, for example, 400 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, when observed under a microscope, for the size of the widest part in the observed image. It is 300 micrometers or more and 400 micrometers or less, or 200 micrometers or more and 300 micrometers or less.
  • the lower limit of the narrowest part is, for example, 50 to 70 ⁇ m, 70 to 100 ⁇ m, 100 to 150 ⁇ m, or 100 to 200 ⁇ m.
  • a preferred size range of cell aggregates of pluripotent stem cells that can be produced by the method of the present invention is, for example, about 100 ⁇ m or more and about 300 ⁇ m or less.
  • a cell aggregate having such a size range is preferable as a cell growth environment because oxygen and nutrient components are easily supplied to the cells inside. Furthermore, the cells that make up the cell clumps remain undifferentiated.
  • the cell aggregate according to this aspect of the present invention is preferably characterized by being produced by suspension culture in a medium containing a cell cycle arresting agent.
  • Cell Aggregates The features described in the section are included.
  • Cell culture composition Another aspect of the present invention is a cell culture composition comprising cell aggregates of pluripotent stem cells, a culture medium, and a cell cycle arresting agent at, for example, but not limited to, the concentrations shown below.
  • the lower limit of the concentration of the cell cycle arresting agent in the above medium is, for example, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 7 ng / mL or more, 10 ng / mL or more, 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, 40 ng / mL or more , 50 ng / mL or more, 100 ng / mL or more, 200 ng / mL or more, 300 ng / mL or more, 500 ng / mL or more, 1 ⁇ g / mL or more, 5 ⁇ g / mL or more, 10 ⁇ g / mL or more, 15 ⁇ g / mL or more, 20 ⁇ g / mL or more 50 ⁇ g / mL or more, 70 ⁇ g / mL or more, or 100 ⁇ g / mL or more, and the upper
  • the lower limit is, for example, 3 nM or more, 5 nM or more, 10 nM or more, 15 nM or more, 20 nM or more, 25 nM or more, 40 nM or more, 50 nM or more, 50 nM or more, 80 nM or more, 100 nM or more, 300 nM or more, 500 nM or more, 1 ⁇ M or more, 2 ⁇ M or more , 3 ⁇ M or more, 4 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 20 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, 60 ⁇ M or more, 70 ⁇ M or more, 80 ⁇ M or more, or 100 ⁇ M or more, and the upper limit is, for example, 800 mM or less, 600 mM or less, 400 mM Hereinafter, it can be 200 mM or less, 150 mM or less, 100 mM or less, 70 mM or less, 50 mM or
  • the cell culture composition according to this aspect of the invention can be used to produce cell aggregates of pluripotent stem cells in high yield.
  • the stem cell can be used to maintain the undifferentiated nature of stem cells and to produce the above-mentioned suitably sized cell aggregate.
  • Specific embodiments of the cell cycle arrester, culture medium and pluripotent stem cells are as described above.
  • the step of producing cell aggregates of pluripotent stem cells from the cell culture composition includes suspension culture of pluripotent stem cells in the cell culture composition. Specific embodiments of this process are described in ⁇ 6.
  • the cell culture composition may be prepared by adding a cell cycle arresting agent to a culture medium and then adding pluripotent stem cells, or mixing a pluripotent stem cell into the culture medium and then adding a cell cycle arresting agent although it may be prepared by addition, it is preferably prepared by adding pluripotent stem cells after adding a cell cycle arresting agent to the culture medium.
  • a stabilizing agent can also be added.
  • the stabilizing agent is a substance that contributes to the stabilization of the cell cycle arresting agent in liquid medium, the maintenance of activity, the prevention of adsorption to a culture vessel, etc., and a substance that does not interfere with pluripotent stem cell aggregation suppression.
  • a medium containing a cell cycle arresting agent (which may further contain the above-mentioned stabilizer) may be frozen and stored, and then thawed before adding pluripotent stem cells. It may be prepared by
  • Pluripotent stem cell culture medium Another aspect of the present invention is a pluripotent stem cell culture medium comprising a culture medium and, without limitation, a concentration of, for example, the cell cycle arresting agent shown below.
  • the lower limit of the concentration of the cell cycle arresting agent in the above medium is, for example, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 7 ng / mL or more, 10 ng / mL or more, 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, 40 ng / mL or more 50 ng / mL or more, 100 ng / mL or more, 200 ng / mL or more, 300 ng / mL or more, 500 ng / mL or more L, 1 ⁇ g / mL or more, 5 ⁇ g / mL or more, 10 ⁇ g / mL or more, 15 ⁇ g / mL or more, 20 ⁇ g / mL or more Or more, 50 ⁇ g / mL or more, 70 ⁇ g / mL or more, or 100 ⁇ g / mL or more, and
  • the lower limit is, for example, 3 nM or more, 5 nM or more, 10 nM or more, 15 nM or more, 20 nM or more, 25 nM or more, 40 nM or more, 50 nM or more, 50 nM or more, 80 nM or more, 100 nM or more, 300 nM or more, 500 nM or more, 1 ⁇ M or more, 2 ⁇ M or more , 3 ⁇ M or more, 4 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 20 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, 60 ⁇ M or more, 70 ⁇ M or more, 80 ⁇ M or more, or 100 ⁇ M or more, and the upper limit is, for example, 800 mM or less, 600 mM or less, 400 mM Hereinafter, it can be 200 mM or less, 150 mM or less, 100 mM or less, 70 mM or less, 50 mM or
  • the pluripotent stem cell culture medium according to this aspect of the present invention can be used as a medium for producing cell aggregates in high yield from pluripotent stem cells by suspension culture. Also, by using the cell culture medium, stem cells can be used to maintain the undifferentiated nature of stem cells and to produce the above-described appropriately sized cell aggregate. Specific embodiments of the cell cycle arrester, culture medium and pluripotent stem cells are as described above.
  • the step of producing cell aggregates of pluripotent stem cells from the pluripotent stem cell culture medium includes a step of suspension culture of pluripotent stem cells in the pluripotent stem cell culture medium. Specific embodiments of this process are described in ⁇ 6.
  • the pluripotent stem cell culture medium can be frozen and stored before use, and can be used after thawing (thawing) at the time of use.
  • TkDN4-M strain The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, Tokyo, Japan
  • Vitronectin Thermo Fisher Scientific, Inc.
  • the cell-releasing agent during the passage, with Accutase TM (Thermo Fisher Scientific, Inc.).
  • Y-27632 Thermo Fisher Scientific, Inc.
  • Y-27632 was added to the culture medium to a concentration of 10 ⁇ M.
  • Medium change was performed daily. Up to 50 passages of human iPS cells were used for the experiments.
  • Example 2 Confirmation of aggregation inhibitory effect by cell aggregation assay The aggregation inhibitory effect of cells by the addition of a cell cycle terminator was examined.
  • Y27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to a final concentration of 10 ⁇ M, or Y27632 at a final concentration of 10 ⁇ M is added.
  • Colchicine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 039-03851) has a final concentration of 10 mg / mL (25 mM)
  • Demecolcine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 049-16961) has a final concentration of 10 mg / mL (26.9 mM)
  • Cytochalasin D (Wako Pure Chemical Industries, 037-17561) to a final concentration of 0.51 mg / mL (1 mM)
  • Cytochalasin B (Wako Pure Chemical Industries, 030-17551) to a final concentration of 2.40 mg / mL (5 mM)
  • Vinblastine (Wako Pure Chemical Industries, 037-17561) to a final concentration of 4.55 mg / mL (5 mM)
  • FIG. 1A The microscopic observation image after the above-mentioned floating culture (culture day 1) is shown in FIG. 1A, FIG. 1B and FIG. 1C.
  • FIG. 1A The microscopic observation image after the above-mentioned floating culture (culture day 1) is shown in FIG. 1A, FIG. 1B and FIG. 1C.
  • large cell clumps of 1 mm or more were formed under the conditions (control) in which only Y27632 was added, whereas cell clumps with a diameter of 500 ⁇ m or less were formed under the conditions in which the cell cycle terminator was added .
  • Example 3 Effect on cell proliferation ability and undifferentiated ability after formation of aggregates under cell cycle arresting agent presence condition Suspension culture of human iPS cells is performed, glucose consumption, cell yield and positive rate of undifferentiated marker Were measured to analyze the effect of the cell cycle arrester on the cells.
  • ⁇ Method> Prepare a cell suspension as in Example 2, separately using Demecolcine (same as above) to a final concentration of 10 mg / mL (26.9 mM), or Cytochalasin D (as above) at a final concentration of 0.51 mg / mL (1 mM), or DMSO (the same as above) adjusted the concentration of the cell aggregation inhibitor so that the concentration of the stock solution, or the concentration of the cell aggregation inhibitor to a final concentration of 0.14 mg / mL (0.2 mM) of Jasplakinolide (Cayman, 11705)
  • the final concentration of Demecolcine in the cell suspension is 10 ng / mL, or final concentration of Cytochalasin D is 20 nM, or final concentration of DMSO is 1% (v / v), or final concentration of Jasplakinolide is 20 nM.
  • the medium was replaced with fresh medium (Essential 8 TM medium containing BSA (final concentration 5 mg / mL) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) every day from the next day of culture (day 1 of culture) and culture was continued until after 5 days of culture .
  • Images were acquired daily by phase contrast microscopy during culture. Observe the 182 to 252 cell clumps in the image obtained on the first day of culture, and determine the width (" ⁇ ") of the widest part of each cell clump as compared with the scale of the photomicrograph, The distribution was examined and the mean value ⁇ standard deviation was calculated.
  • the concentration of glucose contained in the culture supernatant collected at the time of medium replacement was measured with a biosensor BF-5iD (Oji Scientific Instruments Co., Ltd.) to calculate the glucose consumption.
  • the cell clumps were collected on day 5 of culture, after dispersion by Accutase TM, was suspended in Essential 8 TM medium containing BSA of 5 mg / mL. A portion of this cell suspension was stained with trypan blue to examine the cell number. After centrifuging the cell suspension at 300 g for 3 minutes, the supernatant was removed and the cells were washed with PBS (phosphate buffered saline). Then, fix at room temperature with 4% paraformaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 20 minutes, wash 3 times with PBS, resuspend cells in 300 ⁇ L PBS, and add 3 mL of cold methanol while vortexing And permeabilized at ⁇ 20 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • cell yield was measured on the 5th day of culture. Measurement of cell yield was performed in the following procedure. That is, the formed cell clumps for 5 minutes to 10 minutes in Accutase TM, cells were monodisperse by pipetting with blue-chip, after trypan blue staining, and the coefficient and the number of cells using a hemocytometer, Cell yield was measured.
  • FIGS. 2A to 2E are photomicrographs observed from day 1 to day 5 of culture. Compared to FIG. 2A (control), in FIGS. 2B to 2E, cell aggregates are formed from the seeding to the first day of culture, and by continuing the culture, the cells gradually proliferate and the cell aggregates become large. It became almost uniform and of moderate size.
  • FIG. 6A-D is a distribution chart of cell aggregate size (the diameter of the cell aggregate, or the size of the widest part of the cell aggregate) on day 1 of culture. Tables 1 to 4 also show the number and proportion of cell aggregates of a certain size according to the first day of culture.
  • the percentage of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) was 40 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less with respect to the total number of cell aggregates was 100%.
  • the ratio of the cell aggregate in which the cell aggregate size (diameter) is 60 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 96%.
  • the ratio of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 80 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 88.1%.
  • the proportion of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 100 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 80.6%.
  • the percentage of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) was 40 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less with respect to the total number of cell aggregates was 100%.
  • the ratio of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 60 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 98.1%.
  • the proportion of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 80 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 96.2%.
  • the proportion of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 100 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 95.7%.
  • the percentage of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) was 40 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 100% with respect to the total number of cell aggregates.
  • the proportion of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 60 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 97.3%.
  • the ratio of the cell aggregate in which the size (diameter) of the cell aggregate is 80 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 93.5%.
  • the proportion of cell aggregates in which the cell aggregate size (diameter) is 100 ⁇ m to 300 ⁇ m was 92.4%.
  • the proportion of cell aggregates in which the size (diameter) of the cell aggregate is 40 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 100% with respect to the total number of cell aggregates.
  • the ratio of the cell aggregate in which the size (diameter) of the cell aggregate is 60 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 100%.
  • the ratio of the cell aggregate in which the size (diameter) of the cell aggregate is 80 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 98.5%.
  • the ratio of the cell aggregate in which the cell aggregate size (diameter) is 100 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less was 96.0%.
  • the amount of glucose consumption is shown in FIG. 3, and the cell yield on day 5 of culture is shown in FIG. It was suggested that the consumption of glucose was higher in the conditions added with the cell cycle arrester than in the conditions not added, and the cells proliferated. In fact, on the 5th day of culture, it was revealed that the cells were proliferated to more than 5 times the number of seeded cells.
  • FIGS. 5A to 5D The measurement results of the positive rate of undifferentiated markers are shown in FIGS. 5A to 5D.
  • 99% or more of SOX2 positive cells as markers, 97% or more of OCT4 positive cells, and 99% or more of Nanog positive cells It was confirmed that the clumps of human iPS cells formed by the addition of the cell cycle arrester maintain the undifferentiated nature.
  • the present invention keeps undifferentiated in suspension culture of pluripotent stem cells, suppresses the formation of cell aggregates with dimensions exceeding 1000 ⁇ m (1 mm), has high cell viability, and has a suitable size (500 ⁇ m or less). It is possible to produce cell aggregates with high yield.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells can induce differentiation of these cells into various living cells, and thus can be supplied for regenerative medicine.
  • Sequence number 1 Synthetic peptide sequence number 2: Synthetic peptide sequence number 3: Synthetic peptide sequence number 4: Synthetic peptide All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety. I assume.

Abstract

この出願は、細胞周期停止剤を含むことを特徴とする多能性幹細胞の浮遊培養に用いるための多能性幹細胞凝集抑制剤、その凝集抑制剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞凝集塊の製造方法、その方法により得られた多能性幹細胞凝集塊、並びに、多能性幹細胞の細胞凝集塊と培地と細胞周期停止剤とを含む多能性幹細胞培養組成物を提供し、上記方法により多能性幹細胞の浮遊培養において未分化性を保ち、凝集を抑制し、細胞生存率の高い、及び適度な寸法の細胞凝集塊を収率よく製造することを可能にする。

Description

多能性幹細胞凝集抑制剤
　本発明は、多能性幹細胞凝集抑制剤、及び、多能性幹細胞の凝集を抑制する方法に関する。本発明はまた、多能性幹細胞凝集塊の製造方法、及び、それにより製造された多能性幹細胞凝集塊に関する。本発明はさらに、多能性幹細胞培養組成物に関する。
　ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性幹細胞の近年の研究により、再生医療の実用化の可能性が高まっている。これらの細胞は、無限に増殖できる能力と、様々な細胞に分化する能力を有していることから、多能性幹細胞を用いた再生医療には、難治性疾患、生活習慣病等に対する治療法を根本的に変革することが期待されている。多能性幹細胞からは、神経細胞、心筋細胞、腎細胞、肝細胞、血液細胞、網膜細胞、それらの前駆細胞などさまざまな種類の体細胞に試験管内で分化誘導することが既に可能になっている。
　その一方で、多能性幹細胞を用いて各種臓器を再生する再生医療に関する実用化において、生体内臓器又は組織の再生に必要な大量の多能性幹細胞の効率的生産法に対する強い要望がある。例えば肝臓の再生には約２×１０１１個の細胞が必要であるが、例えばディッシュ表面上での接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０６ｃｍ２以上のディッシュが必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。ディッシュ表面上での接着培養によって得られる細胞数が培養面積に依存するためスケールアップが困難であり、再生医療に必要な十分な量の多能性幹細胞を供給することは困難である。
　このような状況において、接着培養に替えて浮遊培養等の三次元培養による多能性幹細胞の大量生産技術の研究及び開発が進められている。
　例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、強い撹拌力により液体培地を撹拌しながらヒト多能性幹細胞の浮遊培養を行い均一な大きさのスフェロイドを製造する方法が開示されている。
　非特許文献２には、微小なマイクロウェルが形成された基板を用い、各マイクロウェル中で均一な大きさのスフェロイドを作製する方法が開示されている。
　非特許文献３には、培地として、粘性や比重が調整された培地を用いて、多能性幹細胞の浮遊状態を保持するとともに細胞同士の衝突を抑制しながら培養を行う方法が開示されている。
　特許文献１には、細胞を液体培地中で旋回培養しながら培養して、細胞の凝集塊を作製する技術が開示されている。
　特許文献２には、多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約２００μｍ以上３００μｍ以下となるまで浮遊培養する方法が開示されている。
　特許文献３には、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）等のリゾリン脂質を含む培地中で細胞を浮遊培養することにより、細胞の凝集を抑制する技術が開示されている。
　特許文献４には、網膜細胞又は網膜組織の製造方法において、ヒト多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞の凝集塊を形成させる技術が開示されている。
　特許文献５には、多能性幹細胞などの細胞又は組織を浮遊状態で均一に分散させることが可能である、アニオン性官能基を有する高分子化合物の構造体（脱アシル化ジェランガム）に関する技術が開示されている。
特開２００３－３０４８６６号公報 国際公開第２０１３／０７７４２３号 国際公開第２０１６／１２１７３７号 国際公開第２０１６／０６３９８６号 国際公開第２０１４／０１７５１３号
Ｏｌｍｅｒ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ　Ｃ，Ｖｏｌｕｍｅ　１８（１０）：７７２－７８４（２０１２） Ｕｎｇｒｉｎ　ＭＤ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，３（２），ｅ１５６５（２００８） Ｏｔｓｕｊｉ　ＧＴ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ　２：７３４－７４５（２０１４）
　本発明者らは、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着が多能性幹細胞等の接着性細胞を浮遊培養するうえで重要な機構であることを見出した。つまり、浮遊培養の技術に求められることは、細胞の膜タンパクや細胞表面のカドヘリンなどの結合に障害を与えることなく、適度な大きさの細胞凝集塊を作製しなければならないという課題が存在する。しかしながら、非特許文献１から３及び特許文献１から２、４から５に開示された浮遊培養技術には、以下の問題がある。
　非特許文献１の方法では剪断応力により細胞死が生じやすいという問題がある。
　非特許文献２の方法では大規模化が困難であることや、培地の交換が困難である等の問題がある。
　非特許文献３の方法では培養時の培地の移動が少ないため酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。
　特許文献１では細胞塊の大きさを適度な大きさに制御するための手段は開示されていない。
　特許文献２では細胞塊同士の接着を防ぐための手段として培地に水溶性高分子を添加して粘性を高めることが記載されている。このため非特許文献３と同様に、酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。
　特許文献４では、細胞凝集塊の大きさをコントロールする技術が提供されていない。
　特許文献５では、高分子化合物の構造体を培地に添加する必要があるため、培養後に細胞と構造体を分離する必要がある。
　そこで本発明者らは、上記課題を解決するために、特許文献３においてリゾリン脂質を含む培地中で細胞を浮遊培養することにより、細胞の凝集を抑制し、適度な大きさの凝集塊を細胞に障害を与えることなく生産することが可能な浮遊培養の技術を開発した。
　ところで、特許文献３では細胞凝集を抑制する成分としてリゾリン脂質のみが開示されている。仮に、リゾリン脂質以外にも、浮遊培養において培地中に存在することにより細胞の凝集を抑制又は促進する成分が提供されれば、細胞凝集塊の大きさを、機械学的／物理学的な手段に依らずに、より適切に制御することが可能になると本発明者らは考えた。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞周期停止剤が、浮遊培養において培地中に存在することにより細胞の凝集を抑制する作用を奏することを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は、以下に列挙する特徴を包含する。
（１）細胞周期停止剤を含む、多能性幹細胞の浮遊培養に用いるための多能性幹細胞凝集抑制剤。
（２）上記細胞周期停止剤の濃度が５５．０ｍｇ／ｍＬ以上１．１ｇ／ｍＬ以下、又は６０ｍＭ以上１５Ｍ以下である、（１）に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（３）上記細胞周期停止剤が、培養時に希釈されて培地中における濃度を３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下、又は３ｎＭ以上３００ｍＭ以下とすることができる濃縮形態である、（１）又は（２）に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（４）上記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（５）上記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（２，３，５－Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＩＢＡ）、アンサミトシンＰ－３（Ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ－３）、サイトカラシンＡ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＥ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｅ）、インダノシン（Ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ラトランクリンＢ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ｂ）、ウイスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１）から（４）のいずれかに記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（６）上記Ｇ１期停止剤がコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（４）に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（７）上記Ｇ１／Ｓ期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）である、上記（４）に記載の多能性幹細胞抑制剤。
（８）上記Ｇ２期停止剤が、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、及びドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（４）に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（９）上記Ｇ２／Ｍ期停止剤が、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、及びノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（４）に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（１０）上記Ｍ期停止剤がジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）である、上記（４）に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
（１１）細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞凝集塊の製造方法。
（１２）上記培地中における上記細胞周期停止剤の濃度が３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下、又は３ｎＭ以上３００ｍＭ以下である、上記（１１）に記載の製造方法。
（１３）上記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１１）又は（１２）に記載の製造方法。
（１４）上記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（２，３，５－Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＩＢＡ）、アンサミトシンＰ－３（Ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ－３）、サイトカラシンＡ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＥ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｅ）、インダノシン（Ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ラトランクリンＢ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ｂ）、ウイスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１１）から（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（１５）上記Ｇ１期停止剤がコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１３）に記載の製造方法。
（１６）上記Ｇ１／Ｓ期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）である、上記（１３）に記載の製造方法。
（１７）上記Ｇ２期停止剤が、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、及びドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１３）に記載の製造方法。
（１８）上記Ｇ２／Ｍ期停止剤が、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、及びノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（１３）に記載の製造方法。
（１９）上記Ｍ期停止剤がジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）である、上記（１３）に記載の製造方法。
（２０）上記（１１）から（１９）のいずれかに記載の製造方法により得られた多能性幹細胞凝集塊。
（２１）多能性幹細胞の細胞凝集塊と、培地と、３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下、又は３ｎＭ以上３００ｍＭ以下の濃度の細胞周期停止剤とを含む、多能性幹細胞培養組成物。
（２２）上記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２１）に記載の多能性幹細胞培養組成物。
（２３）上記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（２，３，５－Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＩＢＡ）、アンサミトシンＰ－３（Ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ－３）、サイトカラシンＡ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＥ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｅ）、インダノシン（Ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ラトランクリンＢ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ｂ）、ウイスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２１）又は（２２）に記載の多能性幹細胞培養組成物。
（２４）さらに増殖因子を含む、上記（２１）から（２３）のいずれかに記載の多能性幹細胞培養組成物。
（２５）細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の凝集を抑制する方法。
（２６）上記培地中における上記細胞周期停止剤の濃度が３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下、又は３ｎＭ以上３００ｍＭ以下である、上記（２５）に記載の方法。
（２７）上記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２５）又は（２６）に記載の方法。
（２８）上記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（２，３，５－Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＩＢＡ）、アンサミトシンＰ－３（Ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ－３）、サイトカラシンＡ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＥ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｅ）、インダノシン（Ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ラトランクリンＢ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ｂ）、ウイスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２５）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９）上記Ｇ１期停止剤がコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２７）に記載の方法。
（３０）上記Ｇ１／Ｓ期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）である、上記（２７）に記載の方法。
（３１）上記Ｇ２期停止剤が、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、及びドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２７）に記載の方法。
（３２）上記Ｇ２／Ｍ期停止剤が、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、及びノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（２７）に記載の方法。
（３３）上記Ｍ期停止剤がジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）である、上記（２７）に記載の方法。
（３４）培地と、３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下、又は３ｎＭ以上３００ｍＭ以下の濃度の細胞周期停止剤を含む、多能性幹細胞培養培地。
（３５）上記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、上記（３４）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（３６）上記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（２，３，５－Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＩＢＡ）、アンサミトシンＰ－３（Ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ－３）、サイトカラシンＡ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＥ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｅ）、インダノシン（Ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ラトランクリンＢ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ｂ）、ウイスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、上記（３４）又は（３５）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（３７）上記Ｇ１期停止剤がコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（３５）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（３８）上記Ｇ１／Ｓ期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）である、上記（３５）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（３９）上記Ｇ２期停止剤が、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、及びドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（３５）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（４０）上記Ｇ２／Ｍ期停止剤が、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、及びノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）から選択される少なくとも１つの物質である、上記（３５）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（４１）上記Ｍ期停止剤がジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）である、上記（３５）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（４２）さらに増殖因子を含む、上記（３４）から（４１）のいずれかに記載の多能性幹細胞培養培地。
（４３）細胞凝集塊を作製するための、上記（３４）から（４２）のいずれかに記載の多能性幹細胞培養培地。
（４４）上記細胞凝集塊の７０％以上（重量基準）において、最も細胞凝集塊の幅の広い部分の寸法が５００μｍ以下、好ましくは３００μｍ以下である、上記（１１）から（１９）のいずれかに記載の製造方法、上記（２０）に記載の多能性幹細胞凝集塊、上記（２１）から（２４）のいずれかに記載の多能性幹細胞培養組成物、又は上記（４３）に記載の多能性幹細胞培養培地。
（４５）上記細胞凝集塊の７０％以上（重量基準）において、最も細胞凝集塊の幅の広い部分の寸法が４０μｍ以上、好ましくは１００μｍ以上である、上記（１１）から（１９）及び（４４）のいずれかに記載の製造方法、上記（２０）又は（４４）に記載の多能性幹細胞凝集塊、上記（２１）から（２４）及び（４４）のいずれかに記載の多能性幹細胞培養組成物、又は上記（４３）又は（４４）に記載の多能性幹細胞培養培地。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１７－２５４８２９号の開示内容を包含する。
　本発明の多能性幹細胞凝集抑制剤（有効成分；少なくとも１種の細胞周期停止剤）の一実施形態は、浮遊培養時の多能性幹細胞の凝集を抑制するために培地中に配合することができる。
　本発明の多能性幹細胞の凝集の抑制方法の一実施形態によれば、上記多能性幹細胞凝集抑制剤の存在下での浮遊培養において多能性幹細胞の凝集を抑制することができる。
　本発明の細胞凝集塊の製造方法の一実施形態によれば、細胞凝集塊を高収量で製造することができる。
　本発明の細胞凝集塊の一実施形態によれば、適度な寸法の細胞凝集塊を有し、生細胞率が高い。
　本発明の細胞培養組成物の一実施形態は、細胞凝集塊を高収量で製造するために用いることができる。
この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、図に示した濃度の細胞周期停止剤、すなわちコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、デメコルシン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、を含む培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。対照は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、上記細胞周期停止剤を含まない培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像である。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、図に示した濃度の細胞周期停止剤、すなわちラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）又はドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、を含有する培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。対照は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、上記細胞周期停止剤を含まない培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像である。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、細胞周期停止剤を含有しない培地中（陰性対照）、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）（０．８μｇ／ｍＬ（２．１μＭ））を含有する培地中（陽性対照）、あるいはサイトカラシンＢ（１μＭ）を含有する培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。各画像データ上のスケールバーは５００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目までの位相差顕微鏡による観察像を示す。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、サイトカラシンＤ（２０ｎＭ）を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目までの位相差顕微鏡による観察像を示す。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、ジャスプラキノライド（２０ｎＭ）を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目までの位相差顕微鏡による観察像を示す。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、デメコルチン（１０ｎｇ／ｍＬ（２６．９ｎＭ））を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目までの位相差顕微鏡による観察像を示す。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、ＤＭＳＯ（１％（０．１４Ｍ））を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目までの位相差顕微鏡による観察像を示す。各画像データ上のスケールバーは２００μｍである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、サイトカラシンＤ（２０ｎＭ）、ジャスプラキノライド（２０ｎＭ）、デメコルチン（１０ｎｇ／ｍＬ（２６．９ｎＭ））又はＤＭＳＯ（１％（０．１４Ｍ））を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目までのグルコース消費量を示すグラフである。対照は、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を含有する培地中で培養したときのグルコース消費量である。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞（播種細胞数８×１０５細胞／ウェル）を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、サイトカラシンＤ（２０ｎＭ）、ジャスプラキノライド（２０ｎＭ）、デメコルチン（１０ｎｇ／ｍＬ（２６．９ｎＭ））又はＤＭＳＯ（１％（０．１４Ｍ））を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製し、その後継続して浮遊培養したときの培養５日目の細胞収量を示すグラフである。対照は、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を含有する培地中で培養したときの細胞収量である。 ヒトｉＰＳ細胞（播種細胞数８×１０５細胞／ウェル）を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、サイトカラシンＤ（２０ｎＭ）を含有する培地中で浮遊培養したときの培養５日目の細胞の、未分化マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇ）陽性率の測定結果を示す。 ヒトｉＰＳ細胞（播種細胞数８×１０５細胞／ウェル）を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、ジャスプラキノライド（２０ｎＭ）を含有する培地中で浮遊培養したときの培養５日目の細胞の、未分化マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇ）陽性率の測定結果を示す。 ヒトｉＰＳ細胞（播種細胞数８×１０５細胞／ウェル）を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、デメコルチン（１０ｎｇ／ｍＬ（２６．９ｎＭ））を含有する培地中で浮遊培養したときの培養５日目の細胞の、未分化マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇ）陽性率の測定結果を示す。 ヒトｉＰＳ細胞（播種細胞数８×１０５細胞／ウェル）を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、ＤＭＳＯ（１％（０．１４Ｍ））を含有する培地中で浮遊培養したときの培養５日目の細胞の、未分化マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇ）陽性率の測定結果を示す。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、サイトカラシンＤ（２０ｎＭ）を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製した際の培養１日目の細胞凝集塊の直径の分布を示したグラフである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、ジャスプラキノライド（２０ｎＭ）を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製した際の培養１日目の細胞凝集塊の直径の分布を示したグラフである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、デメコルチン（１０ｎｇ／ｍＬ（２６．９ｎＭ））を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製した際の培養１日目の細胞凝集塊の直径の分布を示したグラフである。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）の存在下、ＤＭＳＯ（１％（０．１４Ｍ））を含有する培地中で浮遊培養して細胞凝集塊を作製した際の培養１日目の細胞凝集塊の直径の分布を示したグラフである。
　以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
＜１．多能性幹細胞＞
　本発明において使用する多能性幹細胞は、培地中で胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ）又は細胞集体（以下、総称的に「細胞凝集塊」と称する。）を形成する性質を有しており、当該細胞の具体例として、動物由来多能性幹細胞、好ましくは哺乳動物由来多能性幹細胞、より好ましくはヒト由来多能性幹細胞を挙げることができる。
　本明細書中で使用される「多能性幹細胞」は、多分化能と高い自己複製能を併せもつ細胞を指す。ここで多分化能は、三胚葉（すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全てに分化する能力であり、また、高い自己複製能は、無限に増殖する能力である。
　多能性幹細胞の具体例として、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞であるＥＧ細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ　Ｍ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１３７２６－１３７３１（１９９８））、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞（Ｃｏｎｒａｄ　Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ　４５６：３４４－３４９（２００８））、体細胞由来の人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞である。
　ＥＳ細胞は、胚盤胞と呼ばれる初期胚由来の多能性幹細胞である。
　ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化することによって多能性が付与された人工的に樹立された多能性幹細胞である。初期化因子として、例えばＯＣＴ３／４及びＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃ（もしくはＬ－Ｍｙｃ）の組み合わせ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ．１３１：８６１－８７２（２００７））、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮａｎｏｇの組み合わせ（Ｙｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１９１７－１９２０（２００７））などを用いることができる。これらの因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、ウイルスやプラスミドなどのベクターを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質の直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。
　ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。ｉＰＳ細胞として、例えば、公知の、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ　３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株等を使用することができる。ＥＳ細胞として、例えば、公知の、ＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ－１株、ＳＥＥＳ－２株、ＳＥＥＳ－３株、ＳＥＥＳ－４株、ＳＥＥＳ－５株、ＳＥＥＳ－６株、ＳＥＥＳ－７株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。ｉＰＳ細胞を作製する際の細胞の由来は特に限定されないが、例えば、線維芽細胞又はリンパ球等を用いることができる。
　本発明で用いられる多能性幹細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、さらにイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物等の哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。
　本発明の浮遊培養に供するために公知の手法による未分化性を保持した状態での接着培養等の培養によって増殖し作製された多能性幹細胞は、細胞が互いに、及び容器に、付着もしくは接着しているため、例えば剥離剤を用いて細胞を容器から分離する、或いは個々の細胞に分離する必要がある。当該分離の方法は特に限定されないが、剥離剤として、例えばトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素、当該酵素とＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤との混合物等が挙げられる。酵素剥離剤の例は、トリプシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標登録；サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）、コラゲナーゼなどである。分離された多能性幹細胞やその細胞集団は、必要に応じて凍結保存し、本発明による細胞増殖のための浮遊培養に供するときに解凍して所定量を使用することができる。
＜２．細胞凝集塊＞
　本明細書における「細胞凝集塊」は、複数の細胞が三次元的に凝集して形成される塊状の細胞集団（「スフェロイド」とも呼ばれる。）である。細胞凝集塊は、典型的には、略球状の形状を有する。同一細胞による凝集は、1つの細胞の増殖によって集塊が形成される場合も含む。細胞凝集の機構としては、限定はしないが、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着等が挙げられる。
　本発明において、細胞凝集塊を構成する多能性幹細胞は、単一の細胞株であってもよいし、或いは複数の細胞株からなっていてもよく、好ましくは単一の細胞株からなるのがよい。或いは、例えばヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。ここで多能性幹細胞マーカーは、ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞とで実質的に共通しており、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等のマーカーを例示することができる。このような多能性幹細胞マーカーを指標にして、当該細胞が未分化状態を維持できていることを確認しながら細胞を増殖し管理することができる。
　多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
　上記検出方法による多能性幹細胞マーカーの陽性率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％以下とすることができる。なお、多能性幹細胞マーカーは未分化マーカーと同義であり、両者は置き換えて使用することができる。
　本発明では、浮遊培養において、培地中に細胞周期停止剤を存在させることによって多能性幹細胞の細胞凝集が抑制される。
　本明細書において「細胞凝集抑制」、「細胞凝集を抑制する」、「細胞の凝集を抑制する」、又はそれと同等の用語は、細胞凝集を抑制し、それにより細胞凝集塊の形成又は増大を抑制することをいう。本明細書において「細胞凝集抑制剤」とは、細胞凝集を抑制する効果を有する物質もしくは薬剤をいい、本発明においては、細胞周期停止剤、例えば細胞骨格を制御して細胞周期を止める物質もしくは薬剤、を含有する組成物である。
　本発明の方法により製造される細胞凝集塊の寸法（「サイズ」ともいう）は特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限としては、例えば９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下である。下限としては例えば４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上である。因みにヒトｉＰＳ細胞１個が約１０μｍの寸法である。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、その内部の細胞に酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
　本発明の方法により製造される細胞凝集塊の集団は、当該集団を構成する細胞凝集塊のうち重量基準で、例えば７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上が上記の範囲の寸法を有するのがよい。
＜３．培養及び培地＞
　本明細書において「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本発明の方法による浮遊培養では、細胞周期停止剤を含有する細胞凝集抑制剤を添加した培養液中で形成される多能性幹細胞の細胞凝集塊の寸法が所定寸法となるように抑制的に調節される。
　「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養液中で凝集した細胞塊として存在する。限定はしないが、本明細書では、細胞を三次元的に培養して大量生産するため方法として使用される。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。本発明では、細胞凝集塊を製造し、またその大きさを調節するために、対象となる培養法は、浮遊培養法である。ただし、維持培養段階等の主要工程以外で使用される培養法は、この限りではない。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。
　本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために調製された液状又は固形状の物質をいう。原則として、細胞の増殖及び／又は維持に不可欠の成分を必要最小限以上包含する。本明細書の培地は、特に断りがない限り、動物由来細胞の培養に使用する動物細胞用の液体培地が該当する。
　浮遊培養される多能性幹細胞のシード細胞は、上記の＜１．多能性幹細胞＞に記載の接着培養などの培養によって得ることができる。例えば所定の細胞株を接着培養によって増殖し、所定細胞数の細胞株を得ることができる。ここで「接着培養」は、通常、細胞を培養容器表面、ポリマー担体上、又はフィーダー細胞（例えば、マウス線維芽細胞）上で培養して、原則単層で増殖させることをいう。浮遊培養による多能性幹細胞の増殖のための培養培地は、培養環境の影響を受けやすく細胞の品質（例えば未分化）を維持するために適したものを選択する必要がある。品質の安定性を保ち病原体等の有害物を排除するために、無血清培養培地を使用することが好ましく、種々の無血清合成培地が市販されている、又は文献等にも記載されているので、そのような培地を本発明の培養において使用することができる（例えば、菅三佳と古江美保，生物工学９２巻４８７－４９０頁，２０１４年（日本生物工学会）；Ｒ．Ｉａｎ　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓｉｘｔｈ　Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０１０）。本発明で用いる培地は多能性幹細胞の浮遊培養に適したものであることが好ましく、典型的には、動物細胞用の基礎培地と添加剤を含む液体培地である。
　本明細書において「基礎培地」とは、様々な動物細胞用培地の基礎となる培地をいう。単体でも培養は可能であり、また様々な培養添加物を加えて、目的に応じた各種細胞に特異的な培地に調製することもできる。本明細書で使用する基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２　Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地とを好ましくは６０／４０から４０／６０までの重量比、より好ましくは５５／４５から４５／５５までの重量比、最も好ましくは等量（５０／５０の重量比）で混合した培地を用いる。
　本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地（無血清培地）であるか又は血清代替品（Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む培地である。血清代替品の例としては、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ）を挙げることができる。
　本発明で用いる培地中の添加剤は、限定されるものではないが、例えば以下に列挙する成分を含むことができる。
　当該添加剤として、より好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含み、より好ましくはこれらの全部を含む。Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムは、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ－アスコルビン酸は、２－リン酸アスコルビン酸マグネシウムなどの誘導体の形態で培地に添加してもよい。セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウムなど）の形態で培地に添加してもよい。インスリン及びトランスフェリンは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。インスリン、トランスフェリン、及びセレンは、試薬ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－セレン）の形態で培地に添加してもよい。ＩＴＳは、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムを含む、細胞増殖促進用の添加剤である。
　上記の添加剤を含む培地として、例えば、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含む市販の培地を使用することができる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ　ＩＩ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦ　Ｄｒｙ　Ｐｏｗｄｅｒｅｄ　Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）等を用いることができる。ＳＴＥＭＰＲＯＴＭｈＥＳＣ　ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）なども好適に用いることができる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。
　本発明で用いる培地にはさらに、好ましくは少なくとも１つの増殖因子を含む。増殖因子としては、限定するものではないが、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ）、及びＩＧＦＢＰ－７からなる群から選択される１つ以上を含むことが好ましい。ＬＩＦは、分化抑制作用があるため、その所定量を培地に添加することが好ましい。また、好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１である。
　本発明で用いる培地として最も好ましいものは、後述する細胞周期停止剤以外の成分として、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの上記増殖因子を含む無血清培地であり、特に好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（例えばＬＩＦ、ＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。このような培地としては、限定されるものではないが、ＲＯＣＫ阻害剤（＜５．Ｒｈｏ－キナーゼ阻害剤＞参照）を添加した、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭ培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が好適に使用できる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭ培地は、ライフテクノロジーズジャパン株式会社から市販されている、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であるＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＨＡＭ）１：１と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭサプリメント（Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、ＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１を含む）とを混合して調製することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞の細胞死を抑制する効果を有するため、その所定量を培地に添加することが好ましい。
　本発明で用いる培地はさらに、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等の更なる成分を含有してもよい。抗生物質としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。
＜４．細胞周期停止剤＞
　本発明によれば、多能性幹細胞を浮遊培養するとき、当該幹細胞の細胞凝集を抑制するために少なくとも１つの任意の細胞周期停止剤、例えば細胞骨格を制御して細胞周期を止める物質もしくは薬剤、を培地に添加することが特徴である。細胞凝集によって凝集塊寸法が大きくなりすぎると、凝集塊内部に酸素や栄養成分等が十分に供給されない状態となり、その結果、細胞の増殖が著しく抑制される。このため、細胞増殖が実質的に阻害されない又は阻害されにくい凝集塊寸法になるように培養条件を制御することが重要である。本発明では、そのような細胞凝集を抑制するために細胞周期停止剤を培地に所定量添加することが有効である。
　細胞周期は、一般的に知られるように、４つの段階、すなわちＤＮＡ複製前の準備期であるＧ１期、ＤＮＡ複製期であるＳ期、細胞分裂前の準備期であるＧ２期、及び細胞分裂期であるＭ期からなる。本発明によれば、細胞周期を停止させることが可能である物質もしくは薬剤は、多能性幹細胞の凝集を抑制することができる。
　細胞周期停止剤には、浮遊培養において多能性幹細胞の凝集を抑制することが可能であるすべての細胞骨格制御剤、言い換えれば細胞骨格を制御して細胞周期を止める物質もしくは薬剤、が含まれ、アクチン重合阻害剤、アクチン線維の脱重合阻害剤、チューブリン重合阻害剤、チューブリン線維の脱重合阻害剤などが非限定的な例として挙げられる。これらの停止剤として、種々の物質（もしくは薬剤）が知られており、それらが作用する細胞周期停止時期（Ｇ１期、Ｇ２期、Ｇ１／Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、Ｍ期等）は物質（もしくは薬剤）に依存的である。したがって、本発明の一実施形態によれば、細胞周期停止剤は、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つ（すなわち、１以上）の物質（もしくは薬剤）である。
　本発明で使用可能な細胞周期停止剤を非限定的な例として以下に列挙する。
　コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（２，３，５－Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＩＢＡ）、アンサミトシンＰ－３（Ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ　Ｐ－３）、サイトカラシンＡ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＥ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｅ）、インダノシン（Ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ラトランクリンＢ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ｂ）、ウイスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）、カルペプチン（Ｃａｌｐａｉｎ阻害剤；Ｇ１／Ｓ）、カルパイン阻害剤Ｉ（Ｃａｌｐａｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｉ；Ｇ１／Ｓ）、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アフィジコリン（Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、５，６－ジクロロ－1－β－Ｄ－リボフラノシルベンズイミダゾール（５，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－1－β－Ｄ－ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、エメチン（Ｅｍｅｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、インドール－３－カルビノール（Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｉｎｏｌ）、ＫＮ－９３、Ｌ－ミモシン（Ｌ－Ｍｉｍｏｓｉｎｅ）、オカダ酸（Ｏｋａｄａｉｃ Ａｃｉｄ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（Ｃｄｋ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（例えば、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＮＳＣ６２５９８７、ファスカプリシン（Ｆａｓｃａｐｌｙｓｉｎ）、エチル－（６－ヒドロキシ－４－フェニルベンゾ［４,５］フロ［２,３－ｂ］）ピリジン－３－カルボキシレート（Ｅｔｈｙｌ－（６－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏ［４,５］ｆｕｒｏ［２,３－ｂ］）ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ））、ｃ－Ｍｙｃ阻害剤（ｃ－Ｍｙｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（例えば、１００５８－Ｆ４；（Ｚ，Ｅ）－５－（４－エチルベンジリジン）－２－チオキソチアゾリジン－４－オン（（Ｚ，Ｅ）－５－（４－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌｉｄｉｎｅ）－２－ｔｈｉｏｘｏｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ－４－ｏｎｅ））、シクロホスファミド・一水和物（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ　Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ＭＤＭ２アンタゴニスト（ＭＤＭ２　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）（例えば、ナトリン－３（Ｎｕｔｌｉｎ－３）、ＮＳＣ６６８１１、２－ベンジル－３－（４－クロロフェニル）－３－(３－ヒドロキシプロポキシ)－２,３－ジヒドロイソインドール－１－オン(２－Ｂｅｎｚｙｌ－３－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－(３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ)－２,３－ｄｉｈｙｄｒｏｉｓｏｉｎｄｏｌ－１－ｏｎｅ）)、ｐ２１活性化キナーゼ阻害剤（ｐ２１－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（例えば、ＰＡＫ阻害剤(ＰＡＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)、ＰＡＫ１８（Ｚｈａｏ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６；９：２３４－２４２；Ｈ２Ｎ－ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ－Ｇ－ＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲＳ－ＣＯ２Ｈ（配列番号１）)、Ｒａｓ／Ｒａｃトランスフォメーションブロッカー（Ｒａｓ／Ｒａｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂｌｏｃｋｅｒ）（例えば、ＳＣＨ５１３４４；６－メトキシ－４－（２－（（２－ヒドロキシエトキシル）－エチル）アミノ）－３－メチル－１Ｈ－ピラゾロ [３,４－ｂ]キノリン（６－Ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（２－（（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙｌ）－ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｏ[３,４－ｂ]ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ））、４－フェニル酪酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　４－Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＳＴＡＴ３阻害剤（ＳＴＡＴ３　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（例えば、Ａｃ－ＰｐＹＬＫＴＫ－ＯＨ（配列番号２）、ＰｐＹＬＫＴＫ－ｍｔｓ（配列番号３、Ｔｕｒｋｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：４５４４３－４５４５５）、Ｐ３－ＡＨＮＰ－ＳＴＡＴ３ＢＰ（Ｈ－ＹＧＲＫＫＲＲＱＲ－Ｇ－ＦＣＤＧＦＹＡＣＹＫＤＶ－ＰｐＹＬ－ＯＨ，サイクリック（Ｃｙｃｌｉｃ）（配列番号４）、Ｔａｎ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００６：６６（７）：３７６４－３７７１）、６－ニトロベンゾ［ｂ］チオフェン－１，１－ジオキシド；ＳＴＡＴ３阻害性化合物（６－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－１，１－ｄｉｏｘｉｄｅ；Ｓｔａｔ ｔｈｒｅｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ））、サイクリンＤ１阻害剤、或いは、それらの塩またはそれらの誘導体。
　本明細書における「塩」は、多能性幹細胞の凝集抑制効果を示す塩であって酸又は塩基（無機酸もしくは無機塩基、又は有機酸もしくは有機塩基を含む）から形成される塩であり、上記の物質もしくは化合物が塩基性である場合、無機酸もしくは有機酸から塩を形成することができるし、或いは、上記物質もしくは化合物が酸性である場合、無機塩基もしくは有機塩基から塩を形成することができる。無機酸及び有機酸の例には、非限定的に、塩酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸、酢酸、コハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、酒石酸、マレイン酸等の有機酸などが含まれる。また、無機塩基及び有機塩基の例には、非限定的に、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、ジエタノールアミン、エチレンジアミン等のアミン、リジン、アルギニン等のアミノ酸などが含まれる。
　上記細胞周期停止剤のうち、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤及びＭ期停止剤の非限定的な例を以下に示す。
　Ｇ１期停止剤は、例えばコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
　Ｇ１／Ｓ期停止剤は、例えばサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）を含む。
　Ｇ２期停止剤は、例えばサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、又はドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）を含む。
　Ｇ２／Ｍ期停止剤は、例えばポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、又はノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を含む。
　Ｍ期停止剤は、例えばジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）を含む。
＜５．Ｒｈｏ－キナーゼ阻害剤＞
　Ｒｈｏ－キナーゼ（ＲＯＣＫ，Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）のキナーゼ活性を阻害する物質（「ＲＯＣＫ阻害剤」と称する。）は、多能性幹細胞の浮遊培養において当該細胞の細胞死を抑制する目的で培地中に添加されることが好ましい。
　ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（４－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－ピリジン－４－イルシクロヘキサン－１－カルボキサミド又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：９７６－９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５：２７３－２８４（２０００）参照）、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５－２３２（２００２）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Ｕｅｎａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８９：９９０－９９４（１９９７）参照）、Ｗｆ－５３６（（＋）－（Ｒ）－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）ベンズアミド１塩酸塩）（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９－３２４（２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られており、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体もＲＯＣＫ阻害剤として使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。ＲＯＣＫ阻害剤としては、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、特に好ましくは、Ｙ－２７６３２及びＨ－１１５２から選択される１以上であり、最も好ましくは、Ｙ－２７６３２である。Ｙ－２７６３２及びＨ－１１５２は、それぞれ、二塩酸塩の形態で用いられてもよい。
　上記の、Ｙ－２７６３２、すなわち４－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－ピリジン－４－イルシクロヘキサン－１－カルボキサミドの構造式は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記のＨ－１１５２、すなわち（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンの構造式は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
＜６．多能性幹細胞の凝集を抑制する方法＞
　本発明の別の態様は、細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の凝集を抑制する方法である。
　以下では、細胞周期停止剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程の具体的な実施形態について説明する。以下の操作は、コンタミネーションを防ぐために、無菌的な環境や、滅菌された装置、器具等を使用して行う必要がある。
　浮遊培養を実施する前に、所定細胞数（例えば１０４～１０６個）の多能性幹細胞を用意する必要がある。そのために、浮遊培養に用いる多能性幹細胞は、予め常法により、未分化性を保持したまま維持培養することによって所定細胞数とすることができる。本明細書における上記維持培養の工程は、浮遊培養の工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化性を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。
　維持培養としては、細胞を培養容器表面、ポリマー担体等の培養基材に接着させながら培養する接着培養を用いることができる。維持培養しておいた細胞は、例えば既知の剥離剤（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ＡｃｕｔａｓｅＴＭ等）で培養基材から剥離又は細胞同士を剥離させ、十分に分散させてから浮遊培養に用いる。細胞を分散させるためにストレーナーを通過させて単細胞にまで分散させることができる。
　上記の維持培養によって集められた所定数の多能性幹細胞は、以下のとおり本発明の浮遊培養工程、及び、必要であれば当該細胞の回収工程にかける。
　細胞周期停止剤、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
　上記工程での培地中の細胞周期停止剤の濃度は、細胞の凝集を抑制することができるように、細胞の種類、細胞数、培地の種類等の諸条件に応じて適宜調整することができる。上記工程での培地中の細胞周期停止剤の濃度は当該阻害剤の種類によって異なり、浮遊培養において多能性幹細胞の凝集が抑制される濃度範囲を適宜選択することができる。この濃度は、限定されるものではないが、下限が、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上、５０μｇ／ｍＬ以上、７０μｇ／ｍＬ以上、１００μｇ／ｍＬ以上などであり、及び、上限が、例えば５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３５ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２５ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１５ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下などとすることができ、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲とすることができる。或いは、下限が、例えば３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、８０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、１００μＭ以上などであり、及び、上限が、例えば８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下などとすることができ、例えば３ｎＭ以上３００ｍＭ以下とすることができる。
　上記工程での培地には、多能性幹細胞の細胞死を抑制するために、上記のＲＯＣＫ阻害剤を添加することが好ましい。培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、多能性幹細胞の凝集抑制に影響を与えないレベルであることが望ましく、下限としては、限定されるものではないが、例えば３．３ｎｇ／ｍＬ以上、３３ｎｇ／ｍＬ以上、３３０ｎｇ／ｍＬ以上、８００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、又は１０μｇ／ｍＬ以上であり、一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば限定されるものではないが、例えば３．４ｍｇ／ｍＬ以下、３４０μｇ／ｍＬ以下、３４μｇ／ｍＬ以下、１４μｇ／ｍＬ以下などである。或いは、前記濃度の下限は、限定されるものではないが、例えば１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１μＭ以上、２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上などであり、上限としては、限定されるものではないが、例えば１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下などである。或いは、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２・二塩酸塩、Ｈ－１１５２・二塩酸塩、ＨＡ１０７７７・二塩酸塩及びＷｆ－５３６・一塩酸塩のいずれかであるとき、下限が、例えば２７０ｎｇ／ｍＬ以上４００ｎｇ／ｍＬ以下の範囲、１．３μｇ／ｍＬ以上２．０μｇ／ｍＬ以下の範囲、２．２μｇ／ｍＬ以上３．２μｇ／ｍＬ以下の範囲などであり、及び、上限が、例えば２．８μｇ／ｍＬ以上４．０μｇ／ｍＬ以下の範囲、３．４μｇ／ｍＬ以上４．７μｇ／ｍＬ以下の範囲、４．２μｇ／ｍＬ以上５．９μｇ／ｍＬ以下の範囲、１４μｇ／ｍＬ以上２０μｇ／ｍＬ以下の範囲などとすることができる。
　このため、本発明において多能性幹細胞の凝集が抑制されたと判定する基準として、細胞周期停止剤を含まず且つＲＯＣＫ阻害剤を含むことを除いて他の成分を同じくする培地での浮遊培養における細胞凝集の程度（例えば顕微鏡観察による。）を比較対照とすることができる。
　上記工程に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような細胞接着性が低い容器を得るために、容器の内表面を例えば生体適合性物質、ポリマー物質等で親水性表面処理されてもよい。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できるが特に限定はされない。
　培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ウェル状、ディッシュ状、フラスコ状（例えばスピナーフラスコ）、ボトル状（例えばローラーボトル）、多層状（例えばセルファクトリー）等の形状の培養容器、ラジアルフロー型リアクター、中空糸型リアクター（素材の例、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートしたポリエチレン、セルロース・アセテート等）、プラスチックバック型リアクター（例えば、エチレン酢酸ビニルを材料としたＣｕｌｔｉＬｉｆｅＴＭ　Ｓｐｉｎバッグ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＴＦＥ－ＨＦＰ共重合体（ＦＥＰ）を材料としたＶｕｅＬｉｆｅ　ＦＥＰ　Ｂａｇ　３２－Ｃ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カルチャーバッグＡ－１０００ＮＬ（ニプロ）等）などのバイオリアクター、好ましくは大量培養に適するバイオリアクター、などが挙げられる。いずれのバイオリアクター又は容器であっても多能性幹細胞へのせん断応力をできる限り低減もしくは抑制し、細胞死をできる限り低減する方式が好ましい。
　浮遊培養は静置培養であってもよいし、培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは培地が流動する条件での培養である。培地が流動する条件での培養としては、細胞の凝集を抑制するように培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を抑制するように培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。
　旋回培養は、培地と細胞と細胞周期停止剤を含む細胞培養組成物を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円、８の字等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより、或いは旋回と搖動、または旋回と振盪を組み合わせることにより行うことができる。旋回速度は特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ以下、例えば１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、は９０ｒｐｍ以下などとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ以上、例えば１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、９０ｒｐｍ以上などとすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上などとすることができる。また、旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２５ｍｍ以下などとすることができる。さらにまた、旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が上記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上などであり、及び、上限は例えば１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下などとすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することができる。
　揺動培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う培養である。揺動培養は、培地と細胞と細胞周期停止剤とを含む細胞培養組成物を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１往復を１回とした場合、下限は１分間に、例えば２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上であり、一方、上限は１分間に、例えば１５回以下、２０回以下、２５回以下、又は５０回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち誘導角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、下限は、例えば０°以上、１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、８°以上など、一方、上限は、例えば１０°以下、１２°以下、１５°以下、１８°以下、２０°以下などとすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
　更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
　スピナーフラスコ状の培養容器を用いた培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。回転数は例えば１０ｒｐｍ以上１００ｒｐｍ以下とすることができるが、特に限定されない。
　バイオリアクターは、振盪、搖動、回転などの攪拌システムを装備したタンク、カラム、バックなどの形状の容器を含み、さらに培地供給・排除システム、酸素／二酸化炭素供給システム、温度、培地成分、ガス成分等の計測センサーを含む監視システム、細胞回収システムなどを含み、全体が自動化されていることが好ましい。また、培養の様式は、バッチ式、半連続式又は連続式のいずれでもよい。
　浮遊培養における細胞の培地中での播種密度（浮遊培養の開始時の細胞密度）は適宜調整することが可能であり、以下のものに限定されないが、下限として、例えば０．０１×１０５個細胞／ｍＬ以上、０．１×１０５個細胞／ｍＬ以上、１×１０５個細胞／ｍＬ以上などである。播種密度の上限としては、例えば２０×１０５個細胞／ｍＬ以下、１０×１０５個細胞／ｍＬ以下などである。播種密度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。例えば、０．１×１０５個細胞／ｍＬ、０．２×１０５個細胞／ｍＬ、０．３×１０５個細胞／ｍＬ、０．４×１０５個細胞／ｍＬ、０．５×１０５個細胞／ｍＬ、０．６×１０５個細胞／ｍＬ、０．７×１０５個細胞／ｍＬ、０．８×１０５個細胞／ｍＬ、０．９×１０５個細胞／ｍＬ、１×１０５個細胞／ｍＬ、１．５×１０５個細胞／ｍＬ、２×１０５個細胞／ｍＬ、３×１０５個細胞／ｍＬ、４×１０５個細胞／ｍＬ、５×１０５個細胞／ｍＬ、６×１０５個細胞／ｍＬ、７×１０５個細胞／ｍＬ、８×１０５個細胞／ｍＬ、９×１０５個細胞／ｍＬ、１０×１０６個細胞／ｍＬでもよい。
　浮遊培養の際の細胞培養組成物の量は、使用する培養容器又はバイオリアクターの内容量によって適宜調整することができるが、非限定的に、例えば１ｍＬ以上１００Ｌ以下である。或いは、ウェルプレート、三角フラスコ及び培養バッグの場合、非限定的に、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ２）を使用する場合は、例えば０．５ｍｌ／ウェル以上、１．５ｍｌ／ウェル以下とすることができ、例えば１．３ｍｌ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ２）を使用する場合は、例えば１．５ｍＬ／ウェル以上、２ｍＬ／ウェル以上、３ｍＬ／ウェル以上などとすることができ、例えば６．０ｍＬ／ウェル以下、５ｍＬ／ウェル以下、４ｍＬ／ウェル以下などとすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、例えば１０ｍＬ／容器以上、１５ｍＬ／容器以上、２０ｍＬ／容器以上、２５ｍＬ／容器以上、２０ｍＬ／容器以上、２５ｍＬ／容器以上、３０ｍＬ／容器以上などとすることができ、例えば５０ｍＬ／容器以下、４５ｍＬ／容器以下、４０ｍＬ／容器以下などとすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、例えば１００ｍＬ／容器以上、１０５ｍＬ／容器以上、１１０ｍＬ／容器以上、１１５ｍＬ／容器以上、１２０ｍＬ／容器以上などとすることができ、例えば１５０ｍＬ／容器以下、１４５ｍＬ／容器以下、１４０ｍＬ／容器以下、１３５ｍＬ／容器以下、１３０ｍＬ／容器以下、１２５ｍＬ／容器以下などとすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、例えば２５０ｍＬ／容器以上、２６０ｍＬ／容器以上、２７０ｍＬ／容器以上、２８０ｍＬ／容器以上、２９０ｍＬ／容器以上などとすることができ、例えば３５０ｍＬ／容器以下、３４０ｍＬ／容器以下、３３０ｍＬ／容器以下、３２０ｍＬ／容器以下、３１０ｍＬ／容器以下などとすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、例えば５００ｍＬ／容器以上、５５０ｍＬ／容器以上、６００ｍＬ／容器以上などとすることができ、例えば１０００ｍＬ／容器以下、９００ｍＬ／容器以下、８００ｍＬ／容器以下、７００ｍＬ／容器以下などとすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、例えば１０００ｍＬ／容器以上、１１００ｍＬ／容器以上、１２００ｍＬ／容器以上、１３００ｍＬ／容器以上、１４００ｍＬ／容器以上、１５００ｍＬ／容器以上などとすることができ、例えば２０００ｍＬ／容器以下、１９００ｍＬ／容器以下、１８００ｍＬ／容器以下、１７００ｍＬ／容器以下、１６００ｍＬ／容器以下などとすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、例えば１００ｍＬ／バッグ以上、２００ｍＬ／バッグ以上、３００ｍＬ／バッグ以上、４００ｍＬ／バッグ以上、５００ｍＬ／バッグ以上、６００ｍＬ／バッグ以上、７００ｍＬ／バッグ以上、８００ｍＬ／バッグ以上、９００ｍＬ／バッグ以上、１０００ｍＬ／バッグ以上などとすることができ、例えば２０００ｍＬ／バッグ以下、１９００ｍＬ／バッグ以下、１８００ｍＬ／バッグ以下、１７００ｍＬ／バッグ以下、１６００ｍＬ／バッグ以下、１５００ｍＬ／バッグ以下、１４００ｍＬ／バッグ以下、１３００ｍＬ／バッグ以下、１２００ｍＬ／バッグ以下、１１００ｍＬ／バッグ以下などとすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、例えば５００ｍＬ／バッグ以上、１Ｌ／バッグ以上、２Ｌ／バッグ以上、３Ｌ／バッグ以上、４Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上などとすることができ、例えば１０Ｌ／バッグ以下、９Ｌ／バッグ以下、８Ｌ／バッグ以下、７Ｌ／バッグ以下、６Ｌ／バッグ以下などとすることができる。例えば２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、例えば１Ｌ／バッグ以上、２Ｌ／バッグ以上、３Ｌ／バッグ以上、４Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上、６Ｌ／バッグ以上、７Ｌ／バッグ以上、８Ｌ／バッグ以上、９Ｌ／バッグ以上、１０Ｌ／バッグ以上などとすることができ、例えば２０Ｌ／バッグ以下、１９Ｌ／バッグ以下、１８Ｌ／バッグ以下、１７Ｌ／バッグ以下、１６Ｌ／バッグ以下、１５Ｌ／バッグ以下、１４Ｌ／バッグ以下、１３Ｌ／バッグ以下、１２Ｌ／バッグ以下、１１Ｌ／バッグ以下などとすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、例えば１Ｌ／バッグ以上、２Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上、１０Ｌ／バッグ以上、１５Ｌ／バッグ以上、２０Ｌ／バッグ以上、２５Ｌ／バッグ以上などとすることができ、例えば５０Ｌ／バッグ以下、４５Ｌ／バッグ以下、４０Ｌ／バッグ以下、３５Ｌ／バッグ以下、３０Ｌ／バッグ以下などとすることができる。細胞培養組成物の量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。或いは、別のより大きな容量のバイオリアクターを使用する場合には、上に例示した上限の細胞培養組成物の量より多いものとすることができ、その大きさはバイオリアクターの容量によって変化しうる。
　使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、例えば２ｍＬ以上２００Ｌ以下であり、或いは、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ２以上、０．６５ｃｍ２以上、０．６５ｃｍ２以上、１．９ｃｍ２以上、３．０ｃｍ２以上、３．５ｃｍ２以上、９．０ｃｍ２以上、９．６ｃｍ２以上などの培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ２以下、５００ｃｍ２以下、３００ｃｍ２以下、１５０ｃｍ２以下、７５ｃｍ２以下、５５ｃｍ２以下、２５ｃｍ２以下、２１ｃｍ２以下、９．６ｃｍ２以下、３．５ｃｍ２以下などの培養容器を用いることができる。或いは、別のより大きな容量のバイオリアクターを使用する場合には、上に例示した上限の底面積より大きいものとすることができ、その大きさはバイオリアクターの形状によって変化しうる。
　上記脂質の存在下での細胞の浮遊培養の温度、時間、ＣＯ２濃度等の条件は特に限定されない。培養温度は、限定されるものではないが、下限としては、例えば２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３５℃以上などであり、また上限としては、例えば４５℃以下、４０℃以下などであり、好ましくは３７℃である。培養時間は、限定されるものではないが、下限としては、例えば０．５時間以上、１２時間以上、１日以上、２日以上などであり、また上限としては、例えば７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下などである。培養時のＣＯ２濃度は、限定されるものではないが、下限としては、例えば４％以上、４．３％以上、又は４．５％以上であり、また上限としては、例えば１０％以下、８％以下、７％以下、又は６％以下であり、好ましくは５％である。浮遊培養は継代を伴ってもよい。培養条件がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。培養条件がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。
　また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、又は１日に１回以上で行えばよい。培地交換の好ましい頻度は、例えば１日に１回以上である。培地交換は、後述する回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。浮遊培養工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。或いは培地を流動させる培養装置を用いるときには連続的にもしくは定期的に、培地交換を行うことができる。この頻度の培地交換は、多能性幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換の方法は特に限定されないが、細胞と培地とを多孔質膜を介して分離し、新鮮培地を補充する方法、培地を流動させる場合には循環系から古い培地を排出し、新鮮培地を連続的又は一定時間間隔で補充する方法などである。遠心分離によって細胞と培地を分離する方法もあるが、細胞死を抑制する必要がある。
　浮遊培養工程に用いる細胞は、予め維持培養工程により培養され、回収工程により回収され、必要に応じて単細胞化された細胞であることが好ましい。維持培養工程、回収工程、単細胞化については、後述する通りである。
　浮遊培養工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。
（維持培養工程）
　「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化性を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、細胞を培地中で浮遊させながら培養する浮遊培養であってもよい。
　維持培養工程では、当該分野で既知の動物細胞培養法により、対象となる細胞を培養すればよい。接着培養又は浮遊培養を問わない。
　維持培養工程で使用する培地、細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
　維持培養工程で使用する培養容器、細胞の播種密度、培養条件は、浮遊培養工程に関して既述の通りである。
　維持培養工程における、培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよい。
　「静置培養」とは、培養容器内で培地を静置した状態で培養することをいう。接着培養では、通常、この静置培養が採用される。
　「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の具体的な実施形態は、浮遊培養工程に関して既述の通りである。
　維持培養工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。
　維持培養工程の好適な一態様は、上記細胞周期停止剤を含有する細胞凝集抑制剤の存在下での浮遊培養工程により形成された細胞凝集塊を更に培養する維持培養工程である。この態様の維持培養工程での培養方法は特に限定されないが、例えば上記細胞周期停止剤を含有する細胞凝集抑制剤を含まない培地中で細胞凝集塊を浮遊培養する工程が挙げられる。この維持培養に用いる培地としては、上記細胞周期停止剤を含有する細胞凝集抑制剤を含まない以外は上記と同様の培地を用いることができ、培養の条件としては浮遊培養工程と同様の条件を用いることができる。この態様の維持培養工程では、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は細胞種により異なるが、例えば５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、又は１日に１回以上の頻度で、好ましくは１日に１回以上の頻度で、培地交換作業を含むことができる。この頻度の培地交換は、幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換の方法は特に限定されないが、例えば細胞凝集塊を含む細胞培養組成物を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、その後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度プレート等の培養容器に細胞凝集塊分散培地を戻すことで細胞凝集塊を継続して培養することができる。この態様の維持培養工程の培養期間は特に限定されないが、例えば３日以上７日以下の期間である。細胞凝集塊に対して上記細胞周期停止剤を含有する細胞凝集抑制剤を含まない培地中で上記の条件において更に浮遊培養することにより、適切な寸法の細胞凝集塊を得ることができる。
　維持培養工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（例えばＰＢＳバッファなど）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。
（回収工程）
　「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程であり、本発明の方法における目的の細胞凝集塊を回収する工程である。
　本明細書において「細胞の回収」又は単に「回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。細胞培養方法は、一般に浮遊培養方法と接着培養方法に大別できる。以下、それぞれの培養方法後の細胞の回収方法について説明をする。
（浮遊培養方法後の回収方法）
　細胞を浮遊培養法で培養した場合、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することによって達成できる。また、細胞の回収方法としてはフィルターや中空糸分離膜等の使用を選択することもできる。
　静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態で５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない回転速度と処理時間で行えばよい。例えば、回転速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば５００ｒｐｍ以上、８００ｒｐｍ以上、又は１０００ｒｐｍ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００ｒｐｍ以下、１５００ｒｐｍ以下、又は１６００ｒｐｍ以下であればよい。また処理時間の下限は、上記回転速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上であればよい。また、上限は、上記回転により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば６分以下、８分以下、又は１０分以下であればよい。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば前述の維持培養工程における工程後の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ（例えばＰＢＳバッファなど）、生食、又は培地（例えば基礎培地）を使用すればよい。
（接着培養後の回収方法）
　接着培養法で細胞を培養した場合、培養後、多くの細胞は培養容器や培養担体等の外部マトリクスに接着した状態で存在する。したがって、培養容器から培養液を除去するには、培養後の容器を静かに傾けて液体成分を流し出せばよい。外部マトリクスに接着した細胞が培養容器内に残るため、培養液と細胞を容易に分離することができる。
　その後、必要に応じて外部マトリクスに接着した細胞表面を洗浄することもできる。洗浄液には、バッファ（例えばＰＢＳバッファなど）、生食、又は培地（例えば基礎培地）を使用すればよい。ただし、これらに限定はされない。洗浄後の洗浄液は、培養液と同様の操作で除去すればよい。この洗浄工程は、複数回繰り返してもよい。
　続いて、外部マトリクスに接着した細胞集団を外部マトリクスから剥離する。剥離方法は、当該分野で公知の方法で行えばよい。通常は、スクレ―ピング、タンパク質分解酵素を有効成分とする剥離剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、又は剥離剤とキレート剤の混合物等が使用される。
　スクレ―ピングは、スクレーパー等を用いて外部マトリクスに付着した細胞を機械的手段によって剥ぎ取る方法である。ただし機械的操作により細胞が損傷を受けやすいため、回収後の細胞をさらなる培養に供する場合には、外部マトリクスに固着している細胞の足場部分を化学的に破壊又は分解し、外部マトリクスとの接着を解除する剥離方法が好ましい。
　剥離方法では、剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。各剥離剤の濃度及び処理時間は、細胞の剥離又は分散で用いられる常法の範囲で使用すればよい。例えば、トリプシンの場合、溶液中の濃度の下限は、細胞を剥離できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、０．０４％以上、０．０５％以上、０．０８％以上、又は０．１０％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５％以下、０．２０％以下、０．２５％以下、又は０．３０％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限はトリプシンの作用によって外部マトリクスから細胞が十分に剥離される時間であれば特に限定はされず、例えば１分以上、２分以上、３分以上、４分以上又は５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば８分以下、１０分以下、１２分以下、１５分以下、１８分以下、又は２０分以下であればよい。他の剥離剤又はキレート剤の場合も、概ね同様に行えばよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の濃度及び処理時間で行うことができる。
　外部マトリクスから剥離した細胞は、遠心分離により剥離剤を含む上清を除去する。遠心条件は、上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様でよい。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法も上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様に行えばよい。
　本工程後に得られた細胞は、単層細胞片や細胞凝集塊等の細胞集合体を一部に包含し得る。一方、回収した細胞は、必要に応じて単一細胞化することもできる。
（単一細胞化）
　本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
　単一細胞化は、上記の剥離方法で使用する剥離剤及び／又はキレート剤の濃度を高めにする、及び／又は剥離剤及び／又はキレート剤での処理時間を長くすればよい。例えば、トリプシンの場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５％以上、０．１８％以上、０．２０％以上、又は０．２４％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．２５％以下、０．２８％以下、又は０．３０％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば５分以上、８分以上、１０分以上、１２分以上、又は１５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば１８分以下、２０分以下、２２分以下、２５分以下、２８分以下、又は３０分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。
　単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様に行えばよい。
＜７．多能性幹細胞凝集抑制剤＞
　本発明の他の一態様は、細胞周期停止剤を含む、多能性幹細胞の浮遊培養に用いるための多能性幹細胞凝集抑制剤である。
　本発明の多能性幹細胞凝集抑制剤は、浮遊培養系において細胞の凝集を適度に抑制し、略均一な大きさの細胞凝集塊を形成するために用いることができる。本発明の多能性幹細胞凝集抑制剤を用いた幹細胞の浮遊培養では、幹細胞の未分化性を維持することができる。
　本発明における多能性幹細胞凝集抑制剤の形態は特に限定されず、細胞周期停止剤自体であってもよいし、細胞周期停止剤と他の成分とを組み合わせた組成物であってもよい。
　他の成分の種類は特に限定はしないが、例えば溶媒、賦形剤、及び／又は他の薬理効果や作用効果を有する化合物などが挙げられる。これらは天然物、又は非天然物を問わない。また、前記組み合わせの結果得られる組成物は、自然界に存在する天然組成物であってもよいし、人工組成物であってもよい。人工組成物は、構成成分のうち少なくとも１つが非天然物であればよい。非天然物の例として合成化合物が挙げられる。細胞凝集抑制剤に含まれ得る合成化合物の具体例としては、後述の実施例で細胞死抑制用に使用したＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２等）などが挙げられる。
　上記組成物の形態は特に限定されない。上記組成物は例えば浮遊培養に用いる培地の形態であってもよいし、培地の調製時に配合される添加用組成物の形態であってもよい。
　本発明における多能性幹細胞凝集抑制剤の好ましい実施形態は、細胞周期停止剤を含有する培地又はリン酸緩衝液等の緩衝液である。培地中の細胞周期停止剤の濃度としては、＜６．多能性幹細胞の凝集を抑制する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中の細胞周期停止剤の濃度が例示できる。
　本発明における多能性幹細胞凝集抑制剤の別の実施形態は、細胞周期停止剤を液状又は固形状媒体中に含有する液状又は固形状組成物である。上記液状又は固形状組成物は、浮遊培養用の培地を調製する際に添加される添加物である。この実施形態の多能性幹細胞凝集抑制剤は、調製される培地中での細胞周期停止剤の最終濃度が、＜６．多能性幹細胞の凝集を抑制する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中の細胞周期停止剤の濃度となるように濃縮（もしくは濃厚）形態に調製されていることが好ましい。この実施形態の多能性幹細胞凝集抑制剤中での細胞周期停止剤の濃度は特に限定されないが、例えば、細胞周期停止剤の、浮遊培養時の培地中での好ましい濃度として挙げた上記濃度の、例えば１倍以上、２倍以上、１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上、１００００倍以上などであり、多能性幹細胞凝集抑制剤を溶解するための溶媒（例えばＤＭＳＯ、ＥｔＯＨ、バッファ等）に対する溶解度に依存するが、非限定的に、例えば５５．０ｍｇ／ｍＬ以上１．１ｇ／ｍＬ以下が例示できる。一つの実施形態における上記細胞周期停止剤の濃度の下限は、細胞凝集抑制効果が得られる濃度であれば特に限定されないが、例えば６０ｍｇ／ｍＬ以上、７０ｍｇ／ｍＬ以上、８０ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１１０ｍｇ／ｍＬ以上、１３０ｍｇ／ｍＬ以上、１４０ｍｇ／ｍＬ以上、１５０ｍｇ／ｍＬ以上、１６０ｍｇ／ｍＬ以上、１８０ｍｇ／ｍＬ以上、２００ｍｇ／ｍＬ以上、３００ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以上などであり、及び、上限が、例えば６００ｍｇ／ｍＬ以下、７００ｍｇ／ｍＬ以下、８００ｍｇ／ｍＬ以下、９００ｍｇ／ｍＬ以下、１ｇ／ｍＬ以下などとすることができる。或いは、例えば６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１１０ｍＭ以上、１３０ｍＭ以上、１４０ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、１６０ｍＭ以上、１８０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上などであり、及び、上限として、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば１５Ｍ以下、１０Ｍ以下、５Ｍ以下、１Ｍ以下などとすることができ、例えば６０ｍＭ以上１５Ｍ以下の範囲とすることができる。
　多能性幹細胞凝集抑制剤は、細胞周期停止剤に加えて、添加剤として、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等も含有していてもよい。抗生剤は特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙がられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、ｄｌ－カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、２－ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、ｌ－メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ－ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢおよびその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥおよびその誘導体、αリポ酸およびその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、およびこれらの混合物などが挙げられる。
　多能性幹細胞凝集抑制剤は、増殖因子を含有してもよく、例えばＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１の１種以上の増殖因子を含有してもよい。
＜８．細胞凝集塊の製造方法、及び、それにより製造された細胞凝集塊＞
　本発明の他の一態様は、限定されないが、例えば以下に示す濃度の細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法である。
　上記培地中の細胞周期停止剤の濃度は、下限が、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上、５０μｇ／ｍＬ以上、７０μｇ／ｍＬ以上、又は１００μｇ／ｍＬ以上であり、及び、上限が、例えば５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３５ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２５ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１５ｍｇ／ｍＬ以下、又は１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲とすることができる。或いは、下限が、例えば３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、８０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、又は１００μＭ以上であり、及び、上限が、例えば８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、又は４０ｍＭ以下とすることができ、例えば３ｎＭ以上３００ｍＭ以下とすることができる。
　本発明の方法によれば、適度な寸法の細胞凝集塊を、幹細胞の未分化性を維持したまま高収量で製造することができる。具体的には、後述の実施例のウェル内での製造実験では、細胞周期停止剤を含まない対照培地中での培養と比べて本発明の製造方法ではグルコース消費量が培養５日目で約１．３倍以上高くなり（図３参照）、また、細胞収量も播種細胞数の５倍以上増加する（図４参照）。
　細胞周期停止剤、培地及び細胞、並びに上記工程での培地中の細胞周期停止剤の濃度の具体的な実施形態は上述の通りである。
　上記工程の具体的な実施形態は、＜６．多能性幹細胞の凝集を抑制する方法＞の欄で説明した、多能性幹細胞の凝集を抑制する方法における「細胞周期停止剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
　本発明のさらに別の態様は、上記の細胞凝集塊の製造方法により得られた細胞凝集塊である。
　本発明のこの態様に係る細胞凝集塊は適度な寸法を有し、生細胞率が高い（図１Ａから１Ｃ及び図２Ｂから２Ｅ参照）。本発明の方法によって作製可能な多能性幹細胞の細胞凝集塊の寸法範囲は、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限の範囲は、例えば４００μｍ以上５００μｍ以下、３００μｍ以上４００μｍ以下、又は２００μｍ以上３００μｍ以下である。最も幅の狭い部分の下限の範囲は、例えば５０μｍ以上７０μｍ以下、７０μｍ以上１００μｍ以下、１００μｍ以上１５０μｍ以下、又は１００μｍ以上２００μｍ未満である。本発明の方法によって作製可能な多能性幹細胞の細胞凝集塊の好ましい寸法範囲は、例えば約１００μｍ以上約３００μｍ以下である。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、その内部の細胞に酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。さらにまた、細胞凝集塊を構成する細胞が未分化性を維持している。
　本発明のこの態様に係る細胞凝集塊は、細胞周期停止剤を含む培地中で浮遊培養により作製されたものであるという特徴とともに、好ましくは、＜２．細胞凝集塊＞の欄に記載の特徴を備える。
＜９．細胞培養組成物＞
　本発明の他の一態様は、多能性幹細胞の細胞凝集塊と、培地と、限定されないが、例えば以下に示す濃度の細胞周期停止剤とを含む、細胞培養組成物である。
　上記培地中の細胞周期停止剤の濃度は、下限が、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上、５０μｇ／ｍＬ以上、７０μｇ／ｍＬ以上、又は１００μｇ／ｍＬ以上であり、及び、上限が、例えば５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３５ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２５ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１５ｍｇ／ｍＬ以下、又は１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲とすることができる。或いは、下限が、例えば３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、８０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、又は１００μＭ以上であり、及び、上限が、例えば８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、又は４０ｍＭ以下とすることができ、例えば３ｎＭ以上３００ｍＭ以下とすることができる。
　本発明のこの態様に係る細胞培養組成物は、多能性幹細胞の細胞凝集塊を高収量で製造するために用いることができる。また、当該細胞培養組成物を使用することによって、幹細胞の未分化性が維持された且つ上記の適度な寸法の細胞凝集塊を製造するために用いることができる。
　細胞周期停止剤、培地及び多能性幹細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
　上記細胞培養組成物から多能性幹細胞の細胞凝集塊を製造する工程は、上記細胞培養組成物中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む。この工程の具体的な実施形態は、＜６．多能性幹細胞の凝集を抑制する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を抑制する方法における「多能性幹細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
　上記細胞培養組成物は、細胞周期停止剤を培地に添加した後に多能性幹細胞を添加することにより調製してもよいし、多能性幹細胞を培地に混合した後に細胞周期停止剤を添加することにより調製してもよいが、好ましくは細胞周期停止剤を培地に添加した後に多能性幹細胞を添加することにより調製する。細胞周期停止剤を培地に添加する際、安定化剤を添加することもできる。当該安定化剤は、細胞周期停止剤の液体培地中での安定化、活性維持、培養容器等への吸着防止等に寄与する物質であって、且つ、多能性幹細胞凝集抑制を妨害しない物質であれば特に限定されない。また、上記細胞培養組成物は、細胞周期停止剤を含む培地（上記安定化剤を更に含んでいてもよい）を凍結して保存し、その後に解凍してから多能性幹細胞を添加することにより調製してもよい。
＜１０．多能性幹細胞培養培地＞
　本発明の他の一態様は、培地と、限定されないが、例えば以下に示す濃度の細胞周期停止剤とを含む、多能性幹細胞培養培地である。
　上記培地中の細胞周期停止剤の濃度は、下限が、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上Ｌ、１μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上、５０μｇ／ｍＬ以上、７０μｇ／ｍＬ以上、又は１００μｇ／ｍＬ以上であり、及び、上限が、例えば５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３５ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２５ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１５ｍｇ／ｍＬ以下、又は１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、例えば３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲とすることができる。或いは、下限が、例えば３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、８０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、又は１００μＭ以上であり、及び、上限が、例えば８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、又は４０ｍＭ以下とすることができ、例えば３ｎＭ以上３００ｍＭ以下とすることができる。
　本発明のこの態様に係る多能性幹細胞培養培地は、浮遊培養により多能性幹細胞から細胞凝集塊を高収量で製造するための培地として用いることができる。また、当該細胞培養培地を使用することによって、幹細胞の未分化性が維持された且つ上記の適度な寸法の細胞凝集塊を製造するために用いることができる。
　細胞周期停止剤、培地及び多能性幹細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
　上記多能性幹細胞培養培地から多能性幹細胞の細胞凝集塊を製造する工程としては、上記多能性幹細胞培養培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程が挙げられる。この工程の具体的な実施形態は、＜６．多能性幹細胞の凝集を抑制する方法＞の欄で説明した、多能性幹細胞の凝集を抑制する方法における「細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
　上記多能性幹細胞培養培地は、一実施形態において、使用前まで凍結して保存し、使用時に解凍(融解)して使用することができる。
　以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は、当該実施例に制限されないものとする。
［実施例１］ヒトｉＰＳ細胞の維持培養
　ヒトｉＰＳ細胞は、ＴｋＤＮ４－Ｍ株（東京大学医科学研究所、東京、日本）を使用した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）をコートした細胞培養用ディッシュ上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、培地はＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して維持培養した。継代時の細胞剥離剤としては、ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。また、細胞播種時のみ、Ｙ－２７６３２（和光純薬工業株式会社、日本）を１０μＭの濃度になるように培地に添加した。培地交換は毎日実施した。実験には継代数５０回までのヒトｉＰＳ細胞を使用した。
［実施例２］細胞凝集アッセイによる凝集抑制効果の確認
　細胞周期停止剤添加による細胞の凝集抑制効果について検討した。
＜方法＞
　実施例１の手順で培養したヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅＴＭで３～５分間処理して剥離し、単細胞まで分散した。この細胞を最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭ培地に懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように調製した。この細胞懸濁液に、最終濃度１０μＭとなるようにＹ２７６３２（和光純薬工業株式会社）を添加するか、あるいは最終濃度１０μＭのＹ２７６３２を加える。別途Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ（和光純薬工業株式会社、０３９－０３８５１）を最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ（２５ｍＭ）、またはＤｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ（和光純薬工業株式会社、０４９－１６９６１）を最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ（２６．９ｍＭ）、またはＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ（和光純薬工業株式会社、０３７－１７５６１）を最終濃度０．５１ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）、またはＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ（和光純薬工業株式会社、０３０－１７５５１）を最終濃度２．４０ｍｇ／ｍＬ（５ｍＭ）、またはＶｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ（和光純薬工業株式会社、０３７－１７５６１）を最終濃度４．５５ｍｇ／ｍＬ（５ｍＭ）、またはＧｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ（和光純薬工業株式会社、０３７－１７５６１）を最終濃度１７．６ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）、またはＤＭＳＯ（和光純薬工業株式会社、０４１－２９３５１）は原液の濃度、またはＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ（和光純薬工業株式会社、１２５－０４３６３）を最終濃度０．４２ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）、またはＰｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ（和光純薬工業株式会社、１６１－２０９０１）を最終濃度２０．７ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ）、またはＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ（和光純薬工業株式会社、２２２－０１６４１）を最終濃度５．４ｍｇ／ｍＬ（５ｍＭ）、またはＮｏｃｏｄａｚｏｌｅ（和光純薬工業株式会社、１４０－０８５３１）を最終濃度５ｍｇ／ｍＬ（１６．７ｍＭ）、またはＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ（Ｃａｙｍａｎ、１１７０５）を最終濃度０．１４ｍｇ／ｍＬ（０．２ｍＭ）、またはＤｏｃｅｔａｘｅｌ（和光純薬工業株式会社、０４７－３１２８１）を最終濃度４．０４ｍｇ／ｍＬ（５ｍＭ）になるように細胞凝集抑制剤の濃度を調整し、前記調整した細胞凝集抑制剤を前記細胞懸濁液にＣｏｌｃｈｉｃｉｎｅの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、またはＤｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、またはＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄの最終濃度が２０ｎＭ、またはＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂの最終濃度が１μＭ、またはＶｉｎｂｌａｓｔｉｎｅの最終濃度が２μＭ、またはＧｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎの最終濃度が５０μＭ、またはＤＭＳＯの最終濃度が０．３％（ｖ／ｖ）、またはＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａの最終濃度が８０ｎＭ、またはＰｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎの最終濃度が８０ｎＭ、またはＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅの最終濃度が８０ｎＭ、またはＮｏｃｏｄａｚｏｌｅの最終濃度が４０ｎｇ／ｍＬ、またはＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅの最終濃度が１６ｎＭ、またはＤｏｃｅｔａｘｅｌの最終濃度が８０ｎＭとなるように添加した上で、浮遊培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に１．３ｍｌ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を行った。培養を開始して翌日（培養１日目）に位相差顕微鏡にて画像を取得した。
＜結果＞
　上記浮遊培養後（培養１日目）の顕微鏡観察像を図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す。観察の結果、Ｙ２７６３２のみを添加した条件（対照）では１ｍｍ以上の大きな細胞凝集塊が形成されたのに対して、細胞周期停止剤を添加した条件では直径５００μｍ以下の細胞凝集塊が形成された。
 [実施例３］細胞周期停止剤存在条件での凝集塊形成後の細胞増殖能、並びに未分化能への影響
　ヒトｉＰＳ細胞の浮遊培養を行いグルコース消費量、細胞収量及び未分化マーカーの陽性率を測定し、細胞周期停止剤が与える細胞への影響を解析した。
＜方法＞
　実施例２と同様に細胞懸濁液を調製し、別途Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ（同上）を最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ（２６．９ｍＭ）、またはＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ（同上）を最終濃度０．５１ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）、またはＤＭＳＯ（同上）は原液の濃度、またはＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ（Ｃａｙｍａｎ、１１７０５）を最終濃度０．１４ｍｇ／ｍＬ（０．２ｍＭ）になるように細胞凝集抑制剤の濃度を調整し、前記調整した細胞凝集抑制剤を前記細胞懸濁液にＤｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、またはＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄの最終濃度が２０ｎＭ、またはＤＭＳＯの最終濃度が１％（ｖ／ｖ）、またはＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅの最終濃度が２０ｎＭとなるように添加した上で、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社、日本）に４ｍｌ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ、日本）上で９０ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を行った。培養翌日（培養１日目）以降、毎日新鮮な培地（最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭ培地）に培地交換し、培養５日後まで培養を続けた。培養中、毎日位相差顕微鏡により画像を取得とした。培養１日目に取得した画像中の１８２～２５２個の細胞凝集塊を観察し、顕微鏡写真のスケールと比較して各細胞凝集塊の最も広い部分の幅（「φ」とする）を求め、その分布を調べ、平均値±標準偏差を算出した。培地交換時に回収した培養上清に含まれるグルコースの濃度を、バイオセンサーＢＦ－５ｉＤ（王子計測機器株式会社）で測定し、グルコース消費量を計算した。
　また、培養５日目に細胞凝集塊を回収し、ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭにより分散後、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８ＴＭ培地に懸濁した。この細胞懸濁液の一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。上記細胞懸濁液を３００ｇで３分間遠心分離後、上清を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁後、ボルテックスで攪拌しながら冷メタノール３ｍＬを添加し、－２０℃で一晩以上透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳにより細胞を再懸濁して室温で３０分から１時間ブロッキングした。さらにその後、蛍光標識済抗ＳＯＸ２抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５６１１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗ＯＣＴ４抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５３７０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗Ｎａｎｏｇ抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６７４０１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）により４℃で３０分から１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭフローサイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて解析した。
　さらにまた、培養５日目に細胞収量を測定した。細胞収量の測定は次の手順で行った。すなわち、形成した細胞凝集塊をＡｃｃｕｔａｓｅＴＭで５分～１０分処理し、ブルーチップでのピペッティングによって細胞を単分散させ、トリパンブルー染色した後、血球計算盤を用いて細胞数を係数し、細胞収量を測定した。
＜結果＞
　図２Ａから２Ｅは、培養１日目から５日目までに観察した顕微鏡写真である。図２Ａ（対照）と比べて、図２Ｂから２Ｅでは、播種後から培養１日目にかけて細胞凝集塊が形成されており、培養を継続することで徐々に細胞が増殖し、細胞凝集塊が大きくなり、ほぼ均一で適度な寸法になった。
　図６Ａ～Ｄは、培養１日目の細胞凝集塊サイズ（細胞凝集塊の直径、もしくは最も細胞凝集塊の幅の広い部分のサイズ）の分布図である。また表１～表４には培養１日目のある一定サイズ別の細胞凝集塊の個数およびその割合を示す。各培養条件における培養１日目の凝集塊サイズの平均値±標準偏差を算出した結果、Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ添加では１３２．５±３４．８μｍ、Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ添加では１６２．７±３７．２μｍ、Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ添加では１８４．９±４４．９μｍ、ＤＭＳＯ添加では１６４．８±３１．８μｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ添加では、細胞凝集塊全個数に対する、細胞凝集塊サイズ（直径）が４０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が６０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９６％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が８０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は８８．１％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が１００μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は８０．６％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ添加では、細胞凝集塊全個数に対する、細胞凝集塊サイズ（直径）が４０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が６０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９８．１％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が８０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９６．２％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が１００μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９５．７％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ添加では、細胞凝集塊全個数に対して、細胞凝集塊サイズ（直径）が４０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が６０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９７．３％であった。また、前記細胞凝集塊のサイズ（直径）が８０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９３．５％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が１００μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９２．４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　ＤＭＳＯ添加では、細胞凝集塊全個数に対して、細胞凝集塊のサイズ（直径）が４０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊のサイズ（直径）が６０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊のサイズ（直径）が８０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９８．５％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が１００μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９６．０％であった。
　グルコース消費量を図３に、培養５日目の細胞収量を図４にそれぞれ示す。グルコース消費量は細胞周期停止剤を添加した条件では添加していない条件に比べて消費量がより多く、細胞が増殖していることが示唆された。実際に培養５日目には播種細胞数の５倍以上に増殖していることが明らかになった。
　未分化マーカーの陽性率の測定結果を図５Ａから５Ｄに示す。各条件で細胞凝集塊を作製し、その後も浮遊培養にて増殖した細胞において、マーカーであるＳＯＸ２陽性細胞が９９％以上、ＯＣＴ４陽性細胞が９７％以上、Ｎａｎｏｇ陽性細胞が９９％以上であり、細胞周期停止剤添加によって形成されたヒトｉＰＳ細胞の凝集塊は未分化性を維持していることが確認された。
　本発明により、多能性幹細胞の浮遊培養において未分化性を保ち、１０００μｍ（１ｍｍ）を超える寸法の細胞凝集塊の形成を抑制し、細胞生存率の高い、及び適度な寸法（５００μｍ以下）の細胞凝集塊を収率よく製造することが可能である。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、これらの細胞を種々の生体細胞に分化誘導することができるため、再生医療のために供給することを可能にする。
配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (23)

  1. 　細胞周期停止剤を含む、多能性幹細胞の浮遊培養に用いるための多能性幹細胞凝集抑制剤。
  2. 　前記細胞周期停止剤の濃度が５５．０ｍｇ／ｍＬ以上１．１ｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  3. 　前記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  4. 　前記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１から３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  5. 　前記Ｇ１期停止剤がコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される少なくとも１つの物質である、請求項３に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  6. 　前記Ｇ１／Ｓ期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）である、請求項３に記載の多能性幹細胞抑制剤。
  7. 　前記Ｇ２期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、及びドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）から選択される少なくとも１つの物質である、請求項３に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  8. 　前記Ｇ２／Ｍ期停止剤がポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、及びノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）から選択される少なくとも１つの物質である、請求項３に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  9. 　前記Ｍ期停止剤がジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）である、請求項３に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
  10. 　細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞凝集塊の製造方法。
  11. 　前記培地中における前記細胞周期停止剤の濃度が３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  13. 　前記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記Ｇ１期停止剤がコルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１２に記載の製造方法。
  15. 　前記Ｇ１／Ｓ期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）である、請求項１２に記載の製造方法。
  16. 　前記Ｇ２期停止剤がサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、及びドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１２に記載の製造方法。
  17. 　前記Ｇ２／Ｍ期停止剤がポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、及びノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１２に記載の製造方法。
  18. 　前記Ｍ期停止剤がジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）である、請求項１２に記載の製造方法。
  19. 　請求項１０から１８のいずれか１項に記載の製造方法により得られた多能性幹細胞凝集塊。
  20. 　多能性幹細胞の細胞凝集塊と、培地と、３ｎｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の細胞周期停止剤とを含む、多能性幹細胞培養組成物。
  21. 　前記細胞周期停止剤が、Ｇ１期停止剤、Ｇ１／Ｓ期停止剤、Ｇ２期停止剤、Ｇ２／Ｍ期停止剤、及びＭ期停止剤から選択される少なくとも１つの物質である、請求項２０に記載の多能性幹細胞培養組成物。
  22. 　前記細胞周期停止剤が、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｄ）、サイトカラシンＢ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、デメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ジャスプラキノライド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ラトランクリンＡ（Ｌａｔｏｒｕｎｃｕｌｉｎ　Ａ）、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、請求項２０又は２１に記載の多能性幹細胞培養組成物。
  23. 　さらに増殖因子を含む、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞培養組成物。
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