JP2018531610A - 細胞周期ブロックは、人工多能性幹細胞の生成効率を改善する - Google Patents
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Abstract
人工多能性幹細胞(iPSC)を生成するための方法であって、細胞の細胞周期を停止させ、次いで、該細胞を形質転換してiPSCにすることによる方法が開示される。例えば、人工多能性幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、細胞を提供することであって、ここで該細胞は、幹細胞ではないこと;該細胞の細胞周期を停止させること;および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成すること、を包含する方法が提供される。
Description
関連出願の引用
本願は、2015年11月2日に出願した米国仮出願第62/249,520号に対する優先権の利益を主張する。米国仮出願第62/249,520号は、その全体が本明細書に参考として援用される。
本願は、2015年11月2日に出願した米国仮出願第62/249,520号に対する優先権の利益を主張する。米国仮出願第62/249,520号は、その全体が本明細書に参考として援用される。
背景
幹細胞は、稀であり、かつ相当数で成体組織から単離することは困難である。2006年に、山中伸弥が率いる研究チームが、分化した成体細胞をどのようにして再プログラミングして、多能性を含めた、幹細胞の特性のうちの多くを示させ得るかを記載する論文を発表した(Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126:663−676 (2006))。これらの「人工多能性幹細胞」(iPSC)は、本質的に無限に複製し得、そしてそれらは、3種の胚性胚葉に由来する細胞タイプのうちのいずれかへと分化して、ヒト身体における潜在的に任意の細胞を形成し得る。従って、iPSC方法論の開発は、個別化医療および再生医療に新たな道を開いた。iPSCを生成するための方法論は、十分に規定されている;しかし、それらの効率は低い。従って、iPSC生成の効率を向上させるための方法が望ましい。
幹細胞は、稀であり、かつ相当数で成体組織から単離することは困難である。2006年に、山中伸弥が率いる研究チームが、分化した成体細胞をどのようにして再プログラミングして、多能性を含めた、幹細胞の特性のうちの多くを示させ得るかを記載する論文を発表した(Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126:663−676 (2006))。これらの「人工多能性幹細胞」(iPSC)は、本質的に無限に複製し得、そしてそれらは、3種の胚性胚葉に由来する細胞タイプのうちのいずれかへと分化して、ヒト身体における潜在的に任意の細胞を形成し得る。従って、iPSC方法論の開発は、個別化医療および再生医療に新たな道を開いた。iPSCを生成するための方法論は、十分に規定されている;しかし、それらの効率は低い。従って、iPSC生成の効率を向上させるための方法が望ましい。
Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126:663−676 (2006)
概要
いくつかの局面において、本発明は、人工多能性幹細胞(iPSC)を生成するための方法に関し、該方法は、細胞を提供すること;該細胞の細胞周期を停止させること;および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成することを包含する。本方法はまた、複数の人工多能性幹細胞を生成するために用いられ得る。
いくつかの局面において、本発明は、人工多能性幹細胞(iPSC)を生成するための方法に関し、該方法は、細胞を提供すること;該細胞の細胞周期を停止させること;および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成することを包含する。本方法はまた、複数の人工多能性幹細胞を生成するために用いられ得る。
いくつかの局面において、本発明は、複数の人工多能性幹細胞を生成するための方法に関し、該方法は、複数の細胞を提供すること;該複数の細胞のサブセットを選択することであって、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の1もしくはこれより多くの期の細胞が富化されていること;および細胞の該サブセットを形質転換し、それによって、該複数の人工多能性幹細胞を生成することを包含する。
詳細な説明
注目すべきことには、本発明者らは、細胞群の細胞周期を同期化すると、その後の形質転換工程の後に人工多能性幹細胞(iPSC)のより高い収量が生じることを発見した。同期化は、例えば、細胞の細胞周期を停止させることによって、または細胞周期の1もしくはこれより多くの期が富化された細胞を、複数の細胞から選択することによって、達成され得る。
注目すべきことには、本発明者らは、細胞群の細胞周期を同期化すると、その後の形質転換工程の後に人工多能性幹細胞(iPSC)のより高い収量が生じることを発見した。同期化は、例えば、細胞の細胞周期を停止させることによって、または細胞周期の1もしくはこれより多くの期が富化された細胞を、複数の細胞から選択することによって、達成され得る。
いくつかの局面において、本発明は、人工多能性幹細胞を生成するための方法に関し、この方法は、細胞を提供すること;該細胞の細胞周期を停止させること;および該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成することを包含する。該細胞は、好ましくは、幹細胞ではない(例えば、該細胞は、分化した細胞であり得る)。この方法はまた、複数の人工多能性幹細胞を生成するために使用され得る。
いくつかの局面において、本発明は、複数の人工多能性幹細胞を生成するための方法に関し、この方法は、複数の細胞を提供すること;該複数の細胞のサブセットを選択することであって、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の1もしくはこれより多くの期の細胞が富化されていること;および細胞の該サブセットを形質転換し、それによって、該複数の人工多能性幹細胞を生成することを包含する。好ましい実施形態において、該細胞は、幹細胞ではない。該複数の細胞は、幹細胞を含み得、そしてこのような複数はまた、幹細胞ではない細胞を含む(例えば、該複数はまた、分化した細胞を含む)。
I.細胞
該細胞は、真核生物細胞(例えば、後生動物細胞)であり得る。該細胞は、哺乳動物細胞であり得る。該細胞は、齧歯類、ウサギ目動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、または霊長類に由来し得る。例えば、該細胞は、ヒト細胞であり得る。好ましい実施形態において、該細胞は、体細胞である。好ましい実施形態において、該細胞は、二倍体細胞である。
該細胞は、真核生物細胞(例えば、後生動物細胞)であり得る。該細胞は、哺乳動物細胞であり得る。該細胞は、齧歯類、ウサギ目動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、または霊長類に由来し得る。例えば、該細胞は、ヒト細胞であり得る。好ましい実施形態において、該細胞は、体細胞である。好ましい実施形態において、該細胞は、二倍体細胞である。
該細胞は、分化した細胞であり得る。該細胞は、外胚葉、内胚葉、または中胚葉に由来し得る。該細胞は、上皮、結合組織、筋組織、または神経組織から始まり得る(originate)。該細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)または線維芽細胞であり得る。該細胞は、リンパ球であり得る。いくつかの実施形態において、該細胞は、脂肪細胞である。
II.細胞周期を停止させること
いくつかの局面において、本発明は、該細胞の細胞周期を停止させることを包含する方法に関する。該細胞の細胞周期を停止させることは、有糸分裂を阻害する任意の公知の方法を包含し得る(例えば、Banfalvi, Gaspar, Cell Cycle Synchronization (Humana Press, 2011);およびPCT特許出願公開番号WO 2010/118709(本明細書に参考として援用される)を参照のこと)。細胞周期の有糸分裂期(M期)にある細胞は、形質導入および/またはトランスフェクションをより受け入れやすい。従って、いくつかの好ましい実施形態において、細胞周期を停止させることは、(例えば、該細胞と薬剤(例えば、コルヒチン、コルセミド、ラゾキサン、またはノスカピン)とを接触させることによって)細胞周期をM期で停止させることを包含する。それにもかかわらず、細胞周期を停止させることは、間期(例えば、G0期、G1期、S期、またはG2期)で細胞周期を停止させることを包含し得る。例えば、細胞は、(例えば、チミジン、例えば、4mM チミジンを16〜24時間を使用して)G1/S期で停止され得、該方法は、該細胞を形質転換する前に、該細胞を停止から解放した後のある期間にわたって(例えば、該細胞が形質転換される場合に、該細胞がM期にあるように、チミジンブロックからの開放後12時間)、該細胞をインキュベートすることを包含し得る。
いくつかの局面において、本発明は、該細胞の細胞周期を停止させることを包含する方法に関する。該細胞の細胞周期を停止させることは、有糸分裂を阻害する任意の公知の方法を包含し得る(例えば、Banfalvi, Gaspar, Cell Cycle Synchronization (Humana Press, 2011);およびPCT特許出願公開番号WO 2010/118709(本明細書に参考として援用される)を参照のこと)。細胞周期の有糸分裂期(M期)にある細胞は、形質導入および/またはトランスフェクションをより受け入れやすい。従って、いくつかの好ましい実施形態において、細胞周期を停止させることは、(例えば、該細胞と薬剤(例えば、コルヒチン、コルセミド、ラゾキサン、またはノスカピン)とを接触させることによって)細胞周期をM期で停止させることを包含する。それにもかかわらず、細胞周期を停止させることは、間期(例えば、G0期、G1期、S期、またはG2期)で細胞周期を停止させることを包含し得る。例えば、細胞は、(例えば、チミジン、例えば、4mM チミジンを16〜24時間を使用して)G1/S期で停止され得、該方法は、該細胞を形質転換する前に、該細胞を停止から解放した後のある期間にわたって(例えば、該細胞が形質転換される場合に、該細胞がM期にあるように、チミジンブロックからの開放後12時間)、該細胞をインキュベートすることを包含し得る。
方法は、複数の細胞の細胞周期を停止させることを包含し得、このような実施形態に関して、語句「細胞周期を停止させること」は、「細胞周期を同期化すること」と同義である。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、特定の期で細胞周期を休止させない。そしてなお、細胞周期は、形質転換が、細胞周期を停止させることなしでよりも効率的であるように、阻害される。例えば、アフィジコリンおよびノコダゾールは、形質転換効率を増大させるために有用である、G2/M期で細胞を停止させるために使用され得る。細胞周期を停止させることは、間期、G0期、G0/G1期、G1期初期、G1期、G1期後期、G1/S期、S期、G2/M期、またはM期で細胞周期を停止させることを包含し得る。
血清飢餓または栄養素飢餓によって細胞周期を停止させることは、当該分野で周知であり、細胞周期を、例えば、G1期またはG0期で停止させるために使用され得る(例えば、米国特許第8,993,328号を参照のこと;本明細書に参考として援用される)。いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、細胞増殖を制限する血清濃度および/またはアミノ酸濃度を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含する。該細胞は、細胞増殖を制限する血清濃度および/またはアミノ酸濃度を含む培地中で、約1時間〜約10日間、例えば、約1日間〜約7日間、例えば、約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間にわたってインキュベートされ得る。該期間は、例えば、異なる細胞および異なる細胞培養条件が種々の持続期間の細胞周期を生じるので、種々の要因に依存し得る。該培地は、例えば、約0%〜約10%(例えば、約0.1%〜約5%、約0.1%〜約2%、または約0.1%〜約1.0%)の血清濃度を有し得る。該培地は、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、または約1%未満の血清濃度を有し得る。該培地は、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、または約1.0%の血清濃度を有し得る。該培地は、無血清培地(すなわち、血清を含まない培地)であり得る。次いで、細胞周期は、例えば、該細胞と第2の血清濃度(すなわち、細胞増殖を制限する血清濃度よりも高い血清濃度)を含む培地とを接触させることによって、再開され得る。従って、該方法は、第2の血清濃度および/または第2のアミノ酸濃度を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含し得、ここで例えば、該第2の血清濃度および/または第2のアミノ酸濃度は、該細胞増殖を制限する血清濃度またはアミノ酸濃度よりも高い。該第2の血清濃度は、約2%〜約35%(例えば、約5%〜約30%、または約10%〜約25%)であり得る。該第2の血清濃度は、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、または約25%であり得る。該血清は、例えば、ウシ胎仔血清であり得る。
細胞周期を停止させることは、該細胞と薬剤とを接触させることを包含し得る。該細胞と薬剤とを接触させることは、該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含し得る。該薬剤は、低分子または生体分子であり得る。本明細書で使用される場合、用語「低分子(small molecule)」とは、5,000amu未満(例えば、約30〜約1000amu、約40amu〜約800amu、または約50amu〜約750amu)の分子量を有する分子をいう。用語「生体分子(biomolecule)」とは、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、および/または炭水化物を包含する分子をいう。生体分子は、例えば、サイトカイン(例えば、トランスフォーミング増殖因子β)であり得る。該薬剤は、転写因子、酵素(例えば、キナーゼまたはホスホリラーゼ)、または細胞経路のインヒビターであり得る。例えば、該薬剤は、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、サイクリン依存性キナーゼ4インヒビター、サイクリン依存性キナーゼ6インヒビター、DNAポリメラーゼインヒビター、HMG CoAレダクターゼインヒビター、ヌクレオチド生合成のインヒビター、または微小管重合のインヒビターであり得る。
好ましい実施形態において、該薬剤は、細胞周期の可逆的インヒビターであり、例えば、該細胞は、該薬剤が該薬剤を含む培地から除去された後に、その細胞周期を再開し得る。好ましい実施形態において、該薬剤は、非毒性であり、例えば、該細胞に対して非毒性である該薬剤濃度は、該細胞の細胞周期を停止させるために十分である。好ましい実施形態において、該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることは、該細胞に対して非毒性である濃度の該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含する。該薬剤は、アベマシクリブ、アミノプテリン、アフィジコリン、ブレビスタチン、ブチレート、カチノン、コルセミド、コルヒチン、コンパクチン、サイトカラシンD、シトシンアラビノシド、フルオロデオキシウリジン、ヒドロキシウレア、ロバスタチン、メトトレキサート、メビノリン、MG132、ミモシン、ノコダゾール、ノスカピン、パルボシクリブ、パントポン、ラゾキサン、リベロマイシンA、RO−3306、ロスコビチン、リボシクリブ、ビンクリスチン、またはボルシクリブであり得る。
薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることは、該薬剤を含む培地中で、該細胞を、約1時間〜約10日間(例えば、約2時間〜約7日間、例えば、約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間)にわたってインキュベートすることを包含し得る。該期間は、例えば、異なる細胞および異なる細胞培養条件が種々の持続期間の細胞周期を生じるので、種々の要因に依存し得る。
いくつかの実施形態において、該方法は、例えば、該薬剤を含む培地中で該細胞をインキュベートすることの後に、該薬剤を含まない培地中で該細胞をインキュベートして細胞周期を再開させることを包含する。例えば、該方法は、ダブルチミジンブロック後に、例えば、該細胞が形質転換の間にM期にあるように、該薬剤を含まない培地中で該細胞を約4時間〜約24時間にわたってインキュベートすることを包含し得る。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、CEK相互作用タンパク質(cip)経路、キナーゼ阻害性タンパク質(kip)経路、キナーゼ4インヒビター(INK4a)経路、または選択的リーディングフレーム(ARF)経路を調節することを包含する。例えば、cip/kipファミリーメンバーであるp21、p27、およびp57は、細胞周期をG1期で停止させる。トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)は、p27を活性化するために使用され得る。同様に、INK4a/ARFファミリーは、p16INK4aを含み、これは、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)に結合して、細胞周期をG1期で停止させる。いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、p14ARF、p16INK4a、p18、p19、p21、p27、p53、またはp57を活性化することを包含する(例えば、米国特許第6,033,847号を参照のこと;本明細書に参考として援用される)。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、サイクリンD経路を調節することを包含する。細胞周期を停止させることは、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)またはサイクリン依存性キナーゼ6(CDK6)を阻害することを包含し得る。細胞周期を停止させることは、該細胞とサイクリン依存性キナーゼインヒビターとを接触させることを包含し得る。該サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、例えば、サイクリン依存性キナーゼ4インヒビターまたはサイクリン依存性キナーゼ6インヒビターであり得る。パルボシクリブは、CDK4およびCDK6の両方の選択的インヒビターである。いくつかの実施形態において、該サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、パルボシクリブ、リボシクリブ、ボルシクリブ、またはアベマシクリブである(PCT特許出願公開番号WO 2014/109858もまた参照のこと;本明細書に参考として援用される)。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することを包含する。該細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することは、該細胞とヌクレオチド生合成のインヒビターとを接触させることを包含する。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、ヒドロキシウレアまたはチミジンを含む培地中で該細胞をインキュベートすることを包含する。ヒドロキシウレアおよびチミジンは、DNAの主要な構造単位である遊離デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート(dNTP)の減少を引き起こす。DNA複製の阻害は、細胞をG1期とS期との間の移行に停止させる。この方法の利点としては、複製インヒビターへの反復曝露によって同質の同期化した細胞集団に達する可能性および複製インヒビターが安価であるという事実が挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞において微小管重合を阻害することを包含する。微小管重合を阻害することは、該細胞と微小管重合のインヒビター(例えば、ノコダゾール)とを接触させることを包含し得る。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞においてHMG CoAレダクターゼを阻害することを包含する。HMG CoAレダクターゼを阻害することは、該細胞とHMG CoAレダクターゼインヒビター(例えば、ロバスタチン)とを接触させることを包含し得る。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞においてDNAポリメラーゼを阻害することを包含する。DNAポリメラーゼを阻害することは、該細胞とDNAポリメラーゼインヒビター(例えば、アフィジコリン)とを接触させることを包含し得る。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞と、アベマシクリブ、アミノプテリン、アフィジコリン、ブレビスタチン、ブチレート、カチノン、コルセミド、コルヒチン、コンパクチン、サイトカラシンD、シトシンアラビノシド、フルオロデオキシウリジン、ヒドロキシウレア、ロバスタチン、メトトレキサート、メビノリン、MG132、ミモシン、ノコダゾール、ノスカピン、パルボシクリブ、パントポン、ラゾキサン、リベロマイシンA、RO−3306、ロスコビチン、リボシクリブ、ビンクリスチン、またはボルシクリブとを接触させることを包含する。
いくつかの実施形態において、細胞周期を停止させることは、該細胞を低温でインキュベートすることを包含する。該低温は、例えば、約35℃未満、34℃未満、33℃未満、32℃未満、31℃未満、または30℃未満であり得る。該低温は、約20℃〜約35℃(例えば、約27℃〜約33℃)であり得る。該低温は、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、または約33℃であり得る。該細胞は、約1時間〜約10日間(例えば、約1日間〜約7日間、例えば、約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間)にわたって低温でインキュベートされ得る。該期間は、例えば、種々の細胞および種々の細胞培養条件が種々の持続期間の細胞周期を生じるので、種々の要因に依存し得る。
ある特定の実施形態において、該方法は、血清飢餓または栄養素飢餓を含め、本明細書で記載される方法のうちの1つより多くを使用して細胞周期を停止させること、該細胞と薬剤とを接触させること、該細胞と1より多くの薬剤とを接触させること、細胞経路を調節すること、および該細胞を低温でインキュベートすることを包含する。
III.細胞周期の1つの期で細胞を選択すること
いくつかの局面において、本発明は、該複数の細胞のサブセットを選択することを包含する方法に関し、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の1もしくはこれより多くの期の細胞が富化されている。該方法は、例えば、該サブセットを選択することの前に本明細書で記載される任意の方法を使用して、該複数の細胞に関して、細胞周期を停止させることをさらに包含し得る。同様に、該方法は、細胞の該サブセットに関して、例えば、該サブセットを選択することの後に本明細書で記載される任意の方法を使用して、細胞周期を停止させることをさらに包含し得る。
いくつかの局面において、本発明は、該複数の細胞のサブセットを選択することを包含する方法に関し、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の1もしくはこれより多くの期の細胞が富化されている。該方法は、例えば、該サブセットを選択することの前に本明細書で記載される任意の方法を使用して、該複数の細胞に関して、細胞周期を停止させることをさらに包含し得る。同様に、該方法は、細胞の該サブセットに関して、例えば、該サブセットを選択することの後に本明細書で記載される任意の方法を使用して、細胞周期を停止させることをさらに包含し得る。
該方法は、G0期、G0/G1期、G1期初期、G1期、G1期後期、G1/S期、S期、G2/M期、またはM期の細胞が富化されている該複数の細胞のサブセットを選択することを包含し得る。ある特定の好ましい実施形態において、該方法は、M期の細胞が富化されている細胞のサブセットを選択することを包含する。
該方法は、細胞の集団と色素とを接触させることを包含し得、ここで細胞の該サブセットを選択することは、該色素の類似の量を含む細胞を選択することを包含する。本明細書で使用される場合、用語「色素(dye)」とは、赤外線波長、可視光線波長、または紫外線波長で光を吸収し得るかまたは光を発し得る分子または粒子(例えば、発色団または発蛍光団)をいう。例えば、該色素は、フルオレセイン、Alexa Fluor(登録商標)488、フィコエリトリン、R−フィコエリトリン、Texas Red(登録商標)、シアニン5(Cy5)、ビスベンゾイミダゾール(Hoechst 33342)、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)、アクチノマイシン、ミトラマイシン、アントラキノン、TO−PRO−3、またはヨウ化プロピジウムを含み得る。該色素は、細胞構成要素(例えば、核酸、2本鎖核酸、DNA、クロマチン、または微小管)に結合し得る(例えば、特異的に結合し得る)。該色素は、細胞の表面上にある分子に結合し得る。該色素は、インターカレート剤(例えば、ヨウ化プロピジウム)であり得る。ある特定の実施形態において、細胞周期の1つのステージにある細胞は、細胞周期の異なるステージにある細胞よりも多くの、該色素に特異的に結合する分子(例えば、DNAまたは微小管)を含み、その結果、該色素は、異なるステージにある細胞の識別を可能にする。例えば、DNAに結合する色素は、細胞周期の異なるステージにある細胞の識別を可能にする。なぜならG2期およびM期の細胞は、G0またはG1期の細胞の2倍という多くのDNAを含み、S期の細胞は中間のDNA量を含むからである。
いくつかの実施形態において、該方法は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を含む(例えば、PCT特許出願公開番号WO 2014/109713およびWO 2010/118709(その各々が本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞の集団と色素とを接触させることを包含しない。例えば、FACSシステムの前方散乱および側方散乱チャネルは、細胞周期の異なるステージで細胞を識別するために使用され得る(例えば、「蛍光活性化セルソーティング」は、蛍光よりむしろ前方散乱および側方散乱に依拠し得る)。同様に、遠心エルトリエーションおよび有糸分裂シェイクオフ(mitotic shake-off)のような方法は、色素に依拠しない。
該複数の細胞のサブセットを選択することは、遠心エルトリエーションを含み得る(例えば、PCT特許出願公開番号WO 2013/067038およびWO 2003/093469を参照のこと;その各々が本明細書に参考として援用される)。遠心エルトリエーションシステムは、遠心力および対向するバルク媒体フローが、より小さな細胞が頂部にあり、より大きな細胞が底部にある勾配を作り出す専用の遠心分離ローターからなる。そのローター速度または媒体フローは、サイズ分離した細胞の勾配が、頂部に向かって押し出され、勾配の頂部にあるより小さな細胞が最終的にはエルトリエーションチャンバから収集容器へと押し出されるように操作される。ローター速度および媒体フローをさらに操作すると、徐々により大きな細胞がエルトリエーションチャンバから押し出される。G1細胞は、有糸分裂細胞またはG2後期細胞のサイズのおよそ半分であるので、遠心エルトリエーションは、細胞周期におけるそれらの位置に従って細胞を選択するために使用され得る。
該複数の細胞のサブセットを選択することは、有糸分裂シェイクオフを含み得る(例えば、PCT特許出願公開番号WO 2010/118709;米国特許第5,710,022号;および米国特許出願公開番号2005/0273870を参照のこと;これらの各々は本明細書に参考として援用される)。有糸分裂シェイクオフは、球形の有糸分裂(M)期細胞の選択を可能にする。これは、G0期、G1期、S期、およびG2期の細胞ほどしっかりとは表面に接着しない。従って、接着性細胞の振盪培養は、他の期にある細胞からのM期細胞の分離を可能にする。
IV.細胞を形質転換すること
該方法は、該細胞を形質転換して、人工多能性幹細胞を生成することを優先的に包含する。該細胞を形質転換することは、該細胞を1もしくはこれより多くのタンパク質、1もしくはこれより多くの核酸、1もしくはこれより多くのベクター、および/または1もしくはこれより多くの低分子で形質転換することを包含し得る。
該方法は、該細胞を形質転換して、人工多能性幹細胞を生成することを優先的に包含する。該細胞を形質転換することは、該細胞を1もしくはこれより多くのタンパク質、1もしくはこれより多くの核酸、1もしくはこれより多くのベクター、および/または1もしくはこれより多くの低分子で形質転換することを包含し得る。
人工多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、およびNanog遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子で形質導入することを包含し得る(例えば、米国特許出願公開番号2009/0227032を参照のこと;本明細書に参考として援用される)。例えば、人工多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、およびNanog遺伝子で形質導入することを包含し得る。該方法は、該細胞を、Kruppel様因子4(Klf4)、オクタマー結合転写因子3/4(Oct−3/4)、オクタマー結合転写因子4(Oct−4)、SRY(性決定領域Y)−ボックス2(Sox2)、および/もしくはc−Mycの遺伝子で形質導入することを包含し得る。多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Oct3/4、Oct4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c−Myc、L−Myc、N−Myc、TERT、SV40ラージT抗原、HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Glis1、Esrrb、および/もしくはEsrrgの遺伝子で形質導入することを包含し得る。ある特定の好ましい実施形態において、多能性幹細胞を生成することは、該細胞を、Klf4、Oct−3/4、Oct−4、Sox2、およびc−Mycの遺伝子で形質導入することを包含する。
該細胞を形質導入することは、該細胞を、少なくとも1種のベクターで形質導入することを包含し得、例えば、ここで上記少なくとも1種のベクターは、Klf4、Oct−3/4、Oct−4、Sox2、および/もしくはc−Mycの遺伝子を含む。該ベクターは、プラスミド、ウイルス、転移因子(transposable element)、またはナノ粒子を含み得る。該ベクターは、例えば、プラスミドベクターもしくはウイルスベクター(例えば、センダイウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター)であり得る。上記細胞を形質導入する工程は、上記細胞を、少なくとも1種のセンダイウイルスベクターで形質導入する工程を包含し得、例えば、ここで上記少なくとも1種のセンダイウイルスベクターは、Klf4、Oct−3/4、Oct−4、Sox2、および/もしくはc−Mycの遺伝子を含む。
多能性幹細胞を細胞から生成するための方法は、当該分野で周知であり、米国特許出願公開第2011/0223669号および同第2013/0065311号(これらの各々は、本明細書に参考として援用される)に記載されるものを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞を、グリコーゲンシンターゼキナーゼインヒビター、TGFPレセプターインヒビター、サイクリックAMPアゴニスト、S−アデノシルホモシステインヒドロラーゼインヒビター、およびヒストンアセチル化を促進する薬剤のうちの少なくとも1種で形質転換することを包含する。
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞を、低分子(例えば、バルプロ酸、BIX−01294、SB431412、またはPD0325901)で形質転換することを包含する。該方法は、該細胞を、バルプロ酸、BIX−01294、SB431412、およびPD0325901で形質転換することを包含し得る。多能性幹細胞を、核酸ではなく低分子を使用して体細胞から生成するための方法もまた、当該分野で公知である(例えば、PCT特許出願公開番号WO 2015/003643(参考として援用される);およびHou, P.ら, Science 341:651−54 (2013)を参照のこと)。1もしくはこれより多くの低分子は、本明細書で記載される遺伝子もしくはそれらの遺伝子生成物のうちの1もしくはこれより多くの代わりに、またはこれらと組み合わせて、使用され得る。
いくつかの実施形態において、該方法は、該細胞を、1もしくはこれより多くのマイクロRNAで形質転換することを包含する(例えば、米国特許第8,852,941号を参照のこと;本明細書に参考として援用される)。
いくつかの実施形態において、該方法は、人工多能性幹細胞を分化させることを包含する。該方法は、該iPSCを線維芽細胞、B細胞、T細胞、造血細胞、マクロファージ、単球、単核細胞、樹状細胞、単球、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓の細胞、心筋細胞、食道の細胞、胃の細胞、膵臓の細胞、肝細胞、卵丘細胞、または生殖母細胞へと分化させることを包含し得る。幹細胞(例えば、iPSC)を分化させるための方法は、当該分野で周知である(例えば、米国特許出願公開番号2009/0227032を参照のこと;本明細書に参考として援用される)。
例示
実施例1.末梢血単核細胞の採取
実施例1.末梢血単核細胞の採取
12mL LeucoSepTMチューブに、3mL LeucoSepTM分離培地(Greiner Bio One)を満たす。そのチューブを、30秒間、1000rcfで、室温において遠心分離して、そのチューブの中の分離培地を多孔性バリアの下に配置する。
4mLのリン酸緩衝食塩水(PBS;カルシウムおよびマグネシウムを含まない)を、15mL コニカルチューブに添加する。4mL バキュテイナー中のヒト血液を、10回転倒混和して、血液を混合する。次いで、その血液を、上記PBSを含むコニカルチューブに添加し、その血液およびPBSを混合する。次いで、その血液およびPBS混合物を、LeucoSepTMチューブの中に注ぐ。
そのLeucoSepTMチューブを、Labnet Centrifugeで室温において30分間、1250rcfで(またはBeckmanスイングバケット遠心分離機で2100rpmにおいて)遠心分離する。その富化された細胞画分(リンパ球および末梢血単核細胞を含む)を、多孔性バリアの上の血漿上清および富化された細胞画分の両方を新しい15mL 遠心分離チューブに注ぐことによって集める。その細胞を、500rcfで10分間、Labnet遠心分離機で(または1100rpmにおいて10分間、Beckman遠心分離機で)ペレットにし、その上清を廃棄する。
上記ペレットを、1mLの凍結用培地(熱不活性化牛胎仔血清中10% DMSO)の中で再懸濁する。その1mLサンプルを、2つの0.5mLアリコートに分け、−80℃冷凍庫中で凍結する。各0.5mLのアリコートは、およそ1,000,000個の末梢血単核細胞を含む。
実施例2.末梢血単核細胞の形質導入
末梢血単核細胞の0.5mLのアリコートを、0.5mLの拡大培地で洗浄し、そして15mL コニカルバイアル中に入れる。該細胞を、250rcfにおいて7分間ペレットにし、およそ100μLの培地をチューブの中に残して、その上清を廃棄する。
末梢血単核細胞の0.5mLのアリコートを、0.5mLの拡大培地で洗浄し、そして15mL コニカルバイアル中に入れる。該細胞を、250rcfにおいて7分間ペレットにし、およそ100μLの培地をチューブの中に残して、その上清を廃棄する。
0.4mL StemPro−34 Lance Media;5μL hKOS;5μL hc−Myc;3μL h−Klf4;2μL 水中ポリブレン(1mg/mL希釈物);およびポリブレン試薬(10mg/mL)を含む形質導入培地を調製する。
凍結したCytoTuneウイルスバイアルを、37℃のバスの中に8秒間入れ、試薬を融解させ、次いで、4℃の冷ブロックに置く。そのウイルスを、PBMC拡大培地へと混合する。
次いで、その形質導入培地を、15mL コニカルバイアルの中に入れて、その細胞ペレットを再懸濁する。上記形質導入培地および細胞を、24ウェルプレートのうちの1ウェルに入れ、37℃において、5% CO2加湿雰囲気中で一晩インキュベートする。
参考による援用
本明細書で引用される特許、公開された特許出願、および非特許参考文献の各々は、それらの全体において参考として援用される。
本明細書で引用される特許、公開された特許出願、および非特許参考文献の各々は、それらの全体において参考として援用される。
均等物
当業者は、慣用的実験法のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
当業者は、慣用的実験法のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
Claims (40)
- 人工多能性幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、
細胞を提供することであって、ここで該細胞は、幹細胞ではないこと;
該細胞の細胞周期を停止させること;および
該細胞を形質転換し、それによって、該人工多能性幹細胞を生成すること、
を包含する方法。 - 前記細胞周期を停止させることは、細胞増殖を制限する血清濃度またはアミノ酸濃度を含む培地中で前記細胞をインキュベートすることを包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、CEK相互作用タンパク質(cip)経路、キナーゼ阻害性タンパク質(kip)経路、キナーゼ4インヒビター(INK4a)経路、または選択的リーディングフレーム(ARF)経路を調節することを包含する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、p14ARF、p16INK4、p21、p27、p53、またはp57を活性化することを包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、サイクリンD経路を調節することを包含する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、サイクリン依存性キナーゼ4またはサイクリン依存性キナーゼ6を阻害することを包含する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞とサイクリン依存性キナーゼインヒビターとを接触させることを包含する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、サイクリン依存性キナーゼ4インヒビターまたはサイクリン依存性キナーゼ6インヒビターである、請求項7に記載の方法。
- 前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、パルボシクリブ、リボシクリブ、ボルシクリブ、またはアベマシクリブである、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、チミジンを含む培地中で前記細胞をインキュベートすることを包含する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞において微小管重合を阻害することを包含する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 微小管重合を阻害することは、前記細胞と微小管重合のインヒビターとを接触させることを包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することを包含する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞においてヌクレオチド生合成を阻害することは、該細胞とヌクレオチド生合成のインヒビターとを接触させることを包含する、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞においてHMG CoAレダクターゼを阻害することを包含する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- HMG CoAレダクターゼを阻害することは、前記細胞とHMG CoAレダクターゼインヒビターとを接触させることを包含する、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞においてDNAポリメラーゼを阻害することを包含する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- DNAポリメラーゼを阻害することは、前記細胞とDNAポリメラーゼインヒビターとを接触させることを包含する、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞と、ロバスタチン、コンパクチン、メビノリン、ミモシン、アフィジコリン、アミノプテリン、ヒドロキシウレア、コルヒチン、コルセミド、ラゾキサン、ロスコビチン、ビンクリスチン、カチノン、パントポン、アミノプテリン、メトトレキサート、フルオロデオキシウリジン、ブチレート、シトシンアラビノシド、MG132、RO−3306、ノスカピン、ブレビスタチン、リベロマイシンA、サイトカラシンD、またはノコダゾールとを接触させることを包含する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、前記細胞を低温でインキュベートすることを包含する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、約27℃〜約33℃でインキュベートされた細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞周期を停止させることは、間期、G0期、G0/G1期、G1期初期、G1期、G1期後期、G1/S期、S期、G2/M期、またはM期において該細胞周期を停止することを包含する、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前期細胞周期は、M期で停止される、請求項22に記載の方法。
- 複数の人工多能性幹細胞が生成される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の人工多能性幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、
複数の細胞を提供することであって、ここで該細胞は、幹細胞ではないこと;
該複数の細胞のサブセットを選択することであって、ここで細胞の該サブセットは、細胞周期の1もしくはこれより多くの期の細胞が富化されていること;および
細胞の該サブセットを形質転換し、それによって、該複数の人工多能性幹細胞を生成すること
を包含する方法。 - 細胞の前記サブセットは、G0期、G0/G1期、G1期初期、G1期、G1期後期、G1/S期、S期、G2/M期、またはM期において富化されている、請求項25に記載の方法。
- 前記複数の細胞と核酸に結合する色素とを接触させることをさらに包含し、ここで細胞の前記サブセットを選択することは、類似の量の該色素を含む細胞を選択することを包含する、請求項25または26に記載の方法。
- 前記細胞は、蛍光活性化セルソーティングによって選択される、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、遠心エルトリエーションまたは有糸分裂シェイクオフによって選択される、請求項25または26に記載の方法。
- 前記細胞を形質転換することは、該細胞を、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、およびNanog遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子で形質導入することを包含する、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を形質転換することは、該細胞を、Oct3/4、Oct4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c−Myc、L−Myc、N−Myc、TERT、SV40ラージT抗原、HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Glis1、Esrrb、およびEsrrgからなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子で形質導入することを包含する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を形質転換することは、該細胞を、Klf4、Oct−3/4、Oct−4、Sox2、およびc−Mycからなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子で形質導入することを包含する、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞を形質導入することは、該細胞を、少なくとも1種の遺伝子を含むベクターで形質導入することを包含する、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターは、プラスミド、ウイルス、転移因子、またはナノ粒子を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記ベクターは、ウイルスを含み、該ウイルスは、センダイウイルスもしくはアデノウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記細胞を形質転換することは、該細胞とバルプロ酸、BIX−01294、SB431412、またはPD0325901とを接触させることを包含する、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を形質転換することは、該細胞と、グリコーゲンシンターゼキナーゼインヒビター、TGFPレセプターインヒビター、サイクリックAMPアゴニスト、S−アデノシルホモシステインヒドロラーゼインヒビター、およびヒストンアセチル化を促進する薬剤のうちの少なくとも1種と接触させることを包含する、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、体細胞である、請求項1〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項1〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、ヒト細胞である、請求項39に記載の方法。
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