JP2001509017A - イーストトランスクリプトームのキャラクタリゼーション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞周期間で異なって発現されるイースト遺伝子について記載する。それらを使用して真核細胞の細胞周期を研究し、影響を及ぼし、そしてモニタリングすることができる。それらを使用して、細胞周期の調節に関係するヒトホモログを得ることができる。それらを使用して抗真菌剤を同定することができる。種々の条件下で細胞のトランスクリプトームをインテロゲーション（interogation）するために、それらを固相支持体上のアレイ中に生成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 イーストトランスクリプトームのキャラクタリゼーション発明の属する技術分野 本発明はイーストゲノムの発現される遺伝子のキャラクタリゼーションに関す る。より明確には、本発明はこれまでに確認されていない遺伝子の同定および使 用に関する。発明の背景 生物の表現型が主としてそこに発現される遺伝子によって決定することは自明 の事柄である。これらの発現遺伝子は“トランスクリプトーム（transcriptome ）”と表され、それぞれの発現遺伝子の独自性とその発現レベルを決められた数 の細胞に伝達する。本質的に静的実体であるゲノムと異なり、トランスクリプト ームは外部要因および内部要因の両方によって調節されうる。従ってトランスク リプトームは、生物のゲノムとその身体的特徴の間の動的リンクとして働く。 上に定義するトランスクリプトームは真核生物または原核生物のいずれでもキ ャラクタリゼーションされておらず、これは主に技術的限界のためである。しか しながら、遺伝子の発現パターンの概括的な特徴のいくつかは、２０年前、ＲＮ Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション測定によって明らかとなった（Bishopら，19 74；HerefordおよびRosbash，1977）。従って多くの生物において少なくとも３ つのクラスの転写物が、高レベル、中レベル、または低レベルの発現のいずれか に同定できることが見出され、細胞当たりの転写物の数が算定された（Lewin，1 980）。当然これらのデータによっては、それぞれのクラスのメンバーである特 定の遺伝子についての情報はほとんど提供されなかった。個々の遺伝子の発現レ ベルに関するデータは、新しい遺伝子が発見されるに従って蓄積されてきた。し かしながら、特定の遺伝子の完全な発現レベルが測定され、同一タイプの細胞の 他の遺伝子との比較が行われた例はごくわずかである。 従って、細胞のトランスクリプトームの説明によって、細胞生物学および生化 学の膨大な観点を理解するのに有用な新しい情報が提供される。発明の概要 本発明の目的は、細胞周期進行に関係する遺伝子を提供することである。 本発明の別の目的は、遺伝子を使用して細胞周期に影響を及ぼす方法を提供す ることである。 本発明の目的は、抗真菌剤の候補となるもののスクリーニング方法を提供する ことである。 本発明の別の目的は、細胞周期進行に関係するイースト遺伝子のヒトホモログ を得る方法を提供することである。 本発明の別の目的は、細胞周期における段階を確認するためのプローブを提供 することである。 本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載する態様の一つまたはそれ以上 で技術を提供することで達成される。本発明のある態様は、単離したＤＮＡ分子 を提供する。これは、表３または４に明記するＮＯＲＦ遺伝子の群から選択され た細胞周期進行に関係するイースト遺伝子を含む。 本発明の別の態様は、イースト遺伝子の使用法を提供する。この方法は細胞周 期に影響を及ぼすためのものである。この方法は以下の段階を含む： 細胞にイースト遺伝子を含む単離ＤＮＡ分子を投与するが、その遣伝子は細胞 周期進行に関係し、表１、２、３、および４に明記する差異発現遺伝子（differ entially expressed genes）から選択される。 本発明の更に別の態様は、抗真菌剤の候補となるもののスクリーニング方法を 提供する。この方法は以下の段階を含む： 試験物質をイースト細胞に接触させ； 表１、２、３、および４に明記するイースト遺伝子の群から選択される細胞 周期進行に関係するイースト遺伝子の発現をモニタリングする（ここで、イース ト遺伝子の発現を変化させる試験物質は抗真菌剤の候補となるものである）。 本発明の更に別の態様は、細胞周期進行に関係するヒト遺伝子を同定する方法 を提供する。この方法は以下の段階を含む： イースト遺伝子の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むプローブを ハイブリダイズするが、その遺伝子は対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる 群から選択される少なくとも２つの段階の間で異なって発現される。ここで、イ ースト遺伝子は表１、２、３、または４に明記するものである。 また本発明は単離ＤＮＡ分子を提供するが、これは細胞周期における段階を確 認するためのプローブを含み、ここでプローブは、表３または４に明記するＮＯ ＲＦ遺伝子の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む。 本発明のこれらおよび他の態様は以下に記載する詳細な説明を読むことにより 当業者に明らかとなるが、これによりこれまでに確認されていない遺伝子、およ び生物レベルでの全体的な遺伝子発現についての情報が入手できるようになる。 われわれはトランスクリプトームについての初めての記述を提供するが、これは Ｓ．セレベシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞で決定した。この生物を選択 したのは、真核生物の細胞機能の基礎となる生化学的および生理学的パラメータ ーを明白にするために広く使用されており、また全てのゲノムがヌクレオチドレ ベルで明らかになっている唯一の真核生物だからである（Goffeauら，1996）。図面の簡単な説明 図１ ＳＡＧＥ法およびゲノム分析の図式 イースト遺伝子の発現パターン分析へのＳＡＧＥの適用では、３’の大部分のＮ ｌａIII部位を使用してそれぞれの転写物の特異部分を確定し、ＢｓｍＦＩ部位 を有するリンカーをライゲーションするための部位を提供した。II型酵素Ｂｓｍ ＦＩはその非パリンドローム認識部位から一定区間離れた箇所で開裂するが、そ の後これを使用して、ＮｌａIII部位を含む１５ｂｐのＳＡＧＥタグ（黒矢印で 示す）を生成した。濃縮したＳＡＧＥタグを自動でシーケンシングすることによ り、シーケンシング・ゲル当たり約１０００タグの同定をルーチンで行えた。シ ーケンシングの後、それぞれのＳＡＧＥタグの存在度を算定し、それぞれのタグ を使用してイーストゲ ノム全体を調査し、それに相当する遺伝子を同定した。下段は染色体１５の狭い 範囲を示す。灰色矢印は全ての可能性のあるＳＡＧＥタグ（ＮｌａIII部位）を 示し、黒矢印は３’の大部分のＳＡＧＥタグを示す。それぞれの可能性のあるタ グに観察されたタグの総数をタグの上（＋鎖）または下（−鎖）に示す。予想通 り、観察されたＳＡＧＥタグは発現遺伝子の３’末端と会合した。 図２ イーストの遺伝子発現のサンプリング 確認されたタグの増加量分析により、特異的発現遺伝子の数はプラトーになるこ とが明らかとなった。三角は既知の機能を有する遺伝子を、四角は配列情報に基 づいて予測される遺伝子を、そして丸は遺伝子全体を示す。 図３ Virtual Rot （ａ）イーストトランスクリプトームにおける存在度のクラス 転写物の存在度を横座標に逆の順にプロットし、総転写物の量（fraction）は少 なくともその存在度で縦軸にプロットした。点線は曲線の３つの成分、１、２、 および３を示す。これは再会合速度論から得られるＲｏｔ曲線と類似しており、 初期のＲＮＡ濃度および時間での産物が横座標に、そして過剰量のｍＲＮＡとハ イブリダイズする標識したｃＤＮＡの割合を縦座標にプロットしてある。 （ｂ）Virtual RotとRotの成分の比較。 Virtual Rot成分からの変化（transitions）およびデータは図−３Ａのデータか ら算出し、Rot成分のデータはHerefordおよびRosbabh，1977から得た。 図４ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体発現マップ 個々のイースト遺伝子は、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）開始座 標によってそれぞれの染色体上に位置する。それぞれの遺伝子に相当するタグの 存在度のレベルを垂直軸に示し、＋鎖からの転写を横座標の上に、−鎖からの転 写を下にしめす。拡大した染色体の末端の黄色いバンドは翻訳の最中のテロメア 領域を表す（詳しくはテキストを参照されたい）。 図５ 代表遺伝子のノザンブロット分析 ＴＤＨ２／３、ＴＥＦ１／２、およびＮＯＲＦ１は３つの状態全てに比較的同程 度に発現し（レーン１、Ｇ２／Ｍ期停止；レーン２、Ｓ期停止；レーン３、対数 期）、ＲＮＲ４、ＲＮＲ２、およびＮＯＲＦ５はＳ期停止細胞に高度に発現して いる。ＳＡＧＥで観察された発現レベル（タグの数）を各レーンの下に示したが 、蛍光イメージ分析によるノザンブロットの定量と高い相関関係があった（ｒ² ＝０．９７）。 表１ 高度に発現された遺伝子 “タグ”はＮｌａIII部位に隣接する１０ｂｐのＳＡＧＥタグを表す；“遺伝子 ”は、遺伝子または特定のタグに相当する遺伝子を表す（特異的タグと一致する 複数の遺伝子は関連するファミリーに由来し、同一性は平均９３％である）；“ 遺伝子座”および“記述”にはそれぞれ、遺伝子座の名称と各ＯＲＦの機能の種 類を示す；“コピー／細胞”はＳＡＧＥライブラリー中のそれぞれの転写物の存 在度を表すが、細胞当たりの総転写物が１５，０００で、６０，６３３の転写物 が確認されたと仮定している。 表２ 推定されているコード配列の発現 表のカラムは表１と同様である。 表３ ＮＯＲＦ遺伝子の発現 ＳＡＧＥタグ、遺伝子座、およびコピー／細胞は表−１と同様である；“Ｃｈｒ ”および“タグＰｏｓ”は染色体とそれぞれのタグの位置を示す；“ＯＲＦサイ ズ”は示されたタグに相当するＯＲＦのサイズを示す。それぞれの場合で、タグ はＮＯＲＦの３’の２５０ｂｐ以内もしくは未満の位置にある。詳細な説明 本発明の発見は、ある種のこれまで知られていない遺伝子（ＮＯＲＦ）がイー ス トに存在し、発現されることである。これらの遺伝子は、他のこれまでに同定さ れた遺伝子や仮定された遺伝子と同様、細胞周期の段階を研究し、モニターし、 影響を及ぼすために使用できる。本発明はある情報を提供し、それによれば遺伝 子は細胞周期の間に異なって発現される。差異発現遺伝子は細胞周期の段階のマ ーカーとして使用できる。また、それを使用して細胞周期の段階における変化に 影響を及ぼすこともできる。更に、それを使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼ すことにより細胞周期に作用を与える薬剤のスクリーニングをすることもできる 。また、それら真核生物遺伝子のヒトホモログが存在すると推測され、イースト 遺伝子をプローブまたはプライマーとして使用してヒトホモログを同定すること ができる。 ＮＯＲＦと呼ばれる新しい遺伝子（これまでオープンリーディングフレームは 割り当てされなかった）が見出されている。それらはＳＡＧＥタグによって特異 的に同定される。更にそれらの完全なヌクレオチド配列は知られており、一般の 人々に入手可能である。一般に、それらはサイズが小さいため、これまで遺伝子 として同定されなかった。しかしながら、今やそれらは発現されることが見出さ れた。 差異発現イースト遺伝子は、異なる増殖期、特に対数期、Ｓ期、およびＧ２／ Ｍ中で、その発現が統計学的に有意に異なるものである（９５％より高い信頼度 まで）。好ましくは、差異は１０％、２５％、５０％、または１００％より大き い。そのような差異発現特性を有することが見出された遺伝子は以下のものであ る：ＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、２７、ＴＥＦ１／ＴＥ Ｆ２、ＥＮ０２、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＧＫ１、ＣＵＰ１Ａ／ＣＵＰ１Ｂ、Ｐ ＹＫ１、ＹＫＬ０５６Ｃ、ＹＭＲ１１６Ｃ、ＹＥＬ０３３Ｗ、ＹＯＲ１８２Ｃ、 ＹＣＲ０１３Ｃ、リボヌクレオチドレダクターゼ２および４、そしてＹＪＲ０８ ５Ｃ。 本発明にかかるＤＮＡ分子はゲノムまたはｃＤＮＡであってもよい。好ましく はそれらは単離され、膜成分、タンパク質、および脂質のような他の細胞成分を 含有しない。それらは細胞で生成させて単離するか、またはＰＣＲもしくは自動 合成装置を使用して合成することができる。既知の配列を有するＤＮＡを得るた めの技術のいずれを使用してもよい。ＤＮＡの精製および単離の方法は慣例のも のであり、当該分野で知られるものである。 細胞にイースト遺伝子を投与するために、当該分野で知られるＤＮＡ送達（de livery）技術のいずれを使用してもよいが、それに限定されるものではない。そ れらにはリポソーム、トランスフェクション、形質導入、形質転換、ウィルス感 染、エレクトロポレーションがある。特定の目的および特性のためのベクターは 、当業者がその既知の特性で選択することができる。遺伝子の宿主として使用で きる細胞はイーストおよび他の真菌類、ヒトを含む哺乳動物細胞、および細菌細 胞がある。 抗真菌剤を同定するためにここに記載するイースト細胞を使用することができ る。差異発現遺伝子の発現は当該分野で知られる方法でモニタリングすることが できる。試験物質がそのような差異発現遺伝子の発現に影響を及ぼす場合、それ は真菌類の増殖特性に作用する薬剤の候補となるものであり、抗真菌剤として有 用でありうる。 差異発現遺伝子は細胞周期進行に関係するらしいので、これらの遺伝子は種間 で保存されていると考えられる。本発明で同定された差異発現遺伝子を使用して 、ヒトおよび他の哺乳動物におけるホモログを同定することができる。異なる種 間の相同遺伝子を同定する方法は当該分野でよく知られている。簡潔に言えば、 ハイブリダイゼーションの厳密性を低下させ、完全に一致しない配列がハイブリ ダイズできるようにする。これは特にサザンブロット、ノザンブロット、コロニ ーハイブリダイゼーション、またはＰＣＲに関連してもよい。当該分野で知られ るハイブリダイゼーション技術のいずれを使用してもよい。 本発明にかかるプローブは単離ＤＮＡ分子であり、これは特定のＮＯＲＦ遺伝 子または他の差異発現遺伝子の少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、１ ４、１６、１８、２０、または２５個の連続するヌクレオチドを有する。プロー ブは標識されていても、いなくてもよい。それらをＰＣＲのプライマーとして、 あるいはサザンブロットまたはノザンブロットに使用してもよい。好ましくはプ ローブは固相支持体に固定される。更に好ましくは、それらはアレイ上にあり、 複数のプローブを一つの生物学的サンプルに同時にハイブリダイズさせることが できる。プローブをアレイ上にスポットするか、またはアレイ上でｉｎ ｓｉｔ ｕで合成すること ができる。Lockhartら，Nature Biotechnology，Vol.14，1996年12月，“高密度 オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションによる発現のモニタリン グ（Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleoti de arrays）”を参照されたい。一つのアレイに１００、５００、または１，０ ００より多くの異なるプローブを個別の配置で含有させることができる。 上記は本発明の概要である。以下の具体例を参照することにより更に完全な理 解が得られるが、それらは例証のみを目的としてここに示されるものであり、本 発明の範囲を制限することを意図するものではない。 実施例 概要 われわれは、イーストゲノムから発現された遺伝子組（ここではトランスクリプ トームと呼ぶ）を、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）を使用して分析した。６０ ，６３３の転写物を分析したところ、細胞当たりの転写物が０．３から２００以 上の範囲の発現レベルである４，６６５の遺伝子が明らかとなった。これらの遺 伝子のうち、１，９８１は既知の機能を有し、２，６８４はこれまでにキャラク タリゼーションされていないものであった。位置に関する情報と遺伝子発現デー タを統合することにより染色体発現マップが得られ、転写活性の物理的領域（ph ysical region）が同定され、そして配列情報のみでは予測できなかった遺伝子 が同定された。これらの研究により、イーストにおける包括的な遺伝子発現パタ ーンへの洞察が得られ、真核生物におけるゲノム全体にわたる発現の研究の可能 性が示される。 結果 ＳＡＧＥ法の特徴と理論的根拠 近年、遺伝子発現の高情報量評価（high throughput evalution）についてのい くつかの方法が記載されてきた（Nguyenら，1995；Schenaら，1995；Velculescu ら，1995）。われわれはＳＡＧＥ（遺伝子発現連続分析；Serial Analysis of G ene Expression）を使用したが、これは、それぞれの転写物のハイブリダイゼー ション プローブを必要とせずに定量的な遺伝子発現データが得られるからである。ＳＡ ＧＥ法は２つの基本原理に基づく（図１）。第一に、短い配列タグ（９〜１１ｂ ｐ）が転写物を特異的に同定するための十分な情報を含み、その転写物中の定め られた位置に由来するものと規定される。第二に、多くの転写タグを一つの分子 中に連鎖させた後にシーケンシングし、複数のタグの同一性を同時に明らかにす る。いずれの割合の転写物の発現パターンでも、個々のタグの存在度を測定し、 それぞれのタグに相当する遺伝子を同定することによって定量的に評価すること ができる。 ゲノム全体にわたる発現 正常な増殖および細胞周期進行に関係する遺伝子の表現を最大化するために、Ｓ ＡＧＥライブラリーを以下の３つの状態でイースト細胞から得た：対数期、Ｓ期 停止、およびＧ２／Ｍ期停止。全体で、総計６０，６３３転写物に相当するＳＡ ＧＥタグを同定した（対数期細胞からの２０，１８４、Ｓ期停止細胞からの２０ ，０３４、そしてＧ２／Ｍ期停止細胞からの２０，４１５を含む）。これらのタ グのうち、５６，２９１タグ（９３％）は完全にイーストゲノムと一致し、８８ タグはミトコンドリアゲノムと一致し、そして９１タグは２ミクロンのプラスミ ドと一致した。 イーストトランスクリプトームを定義するのに必要なＳＡＧＥタグの数は、低 存在度ｍＲＮＡ分子を検出するのに必要とされる信頼度に依存する。これまでに 得られた推定値を細胞当たり１５，０００ｍＲＮＡ分子と仮定すると（Hereford およびRosbash，1977）、２０，０００タグは、細胞当たり１つのコピーで存在 するｍＲＮＡでも、１．３倍をカバーしている（モンテカルロシミュレーション によって測定）。対数期細胞から得た２０，１８４タグを分析し、３，２９８の 特異的遺伝子を同定した。細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数を個別に確認するた めに、われわれはＳＵＰ４４／ＲＰＳ４の発現レベルを比較したが、これはハイ ブリダイゼーション定量実験によって完全なｍＲＮＡレベルが確実に測定されて いる遺伝子の一つで（IyerおよびStruhl，1996）、ＳＡＧＥによって発現レベル を測定した。ＳＵＰ４４／ＲＰＳ４をハイブリダイゼーションによって測定した ところ７５＋／−１０コピー／細胞であり（IyerおよびStruhl，1996）、６３コ ピー／細胞とい うＳＡＧＥのデータとよく一致し、細胞当たり１５，０００ｍＲＮＡ分子である という算定がほぼ正確であることを示唆した。Ｓ期停止およびＧ２／Ｍ期停止細 胞からのＳＡＧＥタグの分析により、膨大な発現遺伝子と同様、この遺伝子も同 様の発現レベル（５２〜５５コピー／細胞）であることが明らかとなった。１％ 未満の遺伝子はこれら３つの状態間で劇的に異なるレベルで発現されるので（下 記参照）、全てのライブラリーから得られたＳＡＧＥタグを合一して使用し、全 体的な遺伝子発現パターンを分析した。 確認されたタグの増加量分析により、特異的転写物の数は〜６０，０００タグ でプラトーになることが明らかになった（図２）。これは、更なるＳＡＧＥタグ の生成によって更なる遺伝子はほとんど得られず、細胞当たり１転写物しか発現 されない遺伝子で、６万の転写物が４倍の過剰量示すという事実と一致すること を示唆した。同様に、モンテカルロシミュレーションでは、発現レベルが細胞当 たり１コピーであれば、６０，０００タグの分析により、その時点の転写物９７ ％につき少なくとも１つのタグを同定するであろう。 イーストゲノムと完全に一致した５６，２９１タグは４，６６５の異なる遺伝 子を表した。この数はＲＮＡ−ＤＮＡ再会合速度論によって得られた、発現遺伝 子が３０００〜４０００であるという算定値と一致する（HerefordおよびRosbas h，1977）。これらの発現遺伝子はキャラクタリゼーションされた機能を有する 遺伝子の８５％（２，３４０中１，９８１）、そしてイーストゲノムの分析から 推定される遺伝子全体の７６％（６，１２１中４，６６５）を含有した。これら の数は、試験した生理学的状態が限られており、かつゲノム配列分析に基づいて 単独で推定された遺伝子が多数あるときには、イーストトランスクリプトームの 比較的完全なサンプリングと一致する。 遺伝子当たりの転写物発現は細胞当たり０．３〜２００コピー以上まで様々で あった。遺伝子発現レベルの分布の分析により、これまでの研究で再会合速度論 を使用して観察されたのと同様の存在度のクラスが明らかとなった。ＳＡＧＥで 観察された遺伝子の“virtual Rot”（図３Ａ）は、トランスクリプトームの３ つの主要成分と同定され、３等級の範囲にわたる存在度を有した。ＲＮＡ−ｃＤ ＮＡ再会合速 度論で得られたRot曲線は、同様の範囲の存在度にわたって分布する３つの主要 成分も含有した（HerefordおよびRosbash，1977）。特定のクラスのＲＮＡおよ びｃＤＮＡの再会合速度論は膨大な実験変数に影響されるが、Rotおよびvirtual Rot分析間には顕著な類似性があった（図３Ｂ）。Rot分析は低存在度の転写物 の全てを検出し得ないので（Lewin，1980）、ＳＡＧＥでより多くの総数の発現 遺伝子かつ、低存在度の転写物のクラスに属するより多くのトランスクリプトー ムが明らかになっても不思議ではない。 ゲノムマップを伴う発現情報の統合 ＳＡＧＥ発現データを現存する位置情報と統合して染色体発現マップを作成す ることができる（図４）。これらのマップは、イーストゲノムの配列とスタンフ ォードイーストゲノムデータベース（Stanford Yeast Genome Database）から得 られたＯＲＦの位置コーディネイト（position coordinates）を用いて作成した 。物理的に近く、かつ同等の高レベルの発現をもつことがわかった少数の遺伝子 があったが、いずれの染色体上でも特に高発現又は低発現したクラスターはない ように見えた。共制御された互いに異なるプロモーターをもち、染色体１４上の すぐ隣にあるヒストンＨ３とＨ４のような遺伝子（Smith and Murray，1983）は 、非常によく似た発現レベルをもっていた（細胞当たりそれぞれ５及び６コピー ）。染色体中の転写物の分布は、全体としての転写が均一に分散しており、合計 の転写物レベルは染色体のサイズとほぼ直線的に関係していた（ｒ²＝０．８５ 、データ示さず）。しかしながら、非テロメア領域では遺伝子当たり１２．４タ グであるのと比較して、テロメアの１０ｋｂ以内の領域は遺伝子当たり平均３． ２タグを含み、どれも低く転写されていた（undertranscribed）（図４）。これ は、以前にイーストにおいて”テロメア・サイレンシング”として記載された観 察（Gottschling et al.,1990）と一致する。最近の研究では、テロメア末端か ら４ｋｂまではテロメア位置効果があると報告されている（Renauld et al.,199 3）。 遺伝子発現パターン 表１は、３０の最も高度に発現された遺伝子を列挙したものであり、その全て は細胞当たり６０ｍＲＮＡコピー以上で発現する。予期した通り、これらの遺伝 子の ほとんどは、エネルギー代謝及びタンパク質合成に関与するよくキャラクタリゼ ーションされた酵素と対応し、３つの成長状態の全てにおいて同様のレベルで発 現した（図５の例）。ENO2（McAlister and Holland,1982）、PDC1（Schmitt et al.,1983）、PGK1（Chambers et al.,1989）、PYK1（Nishizawa et al.,1989） 及びADH1（Denis et al.,1983）を含むこれらの遺伝子のいくつかは、本研究で 用いられたようなグルコースの豊富な生育条件では劇的に誘導されることが知ら れている。これとは対照的に、GAL1/GAM7/GAL10クラスター（St John and Davis ,1979）及びGAL3（Bajwa et al.,1988）のようなグルコース抑制性遺伝子は非常 に低レベルで発現する（細胞当たり０．３又はそれ以下のコピー）ことが観察さ れた。本研究で用いられたイースト株で予期されたように、ａ因子遺伝子（MFA1 ,MFA2）（Michaelis and Herslowitz,1988）のような接合型ａ特異的遺伝子及び α因子受容体（STE2）（Burkholder and Hartwell,1985）は全て、かなりのレベ ルで発現することが観察され（細胞当たり２−１０コピーの範囲）、一方接合型 α特異的遺伝子(MFα1,MFα2,STE3)(Hagen et al.,1986;Kurjan and Herskowitz ,1982;Singh et al.,1983)は極めて低いレベルで発現することが観察された（細 胞当たり０．３コピー以下）。 表１に記載の高発現遺伝子のうちの３つはこれまでにキャラクタリゼーション されていない。そのうちの１つは、以前にゲノム配列分析だけから同定されてい た、予測されたリボソーム機能をもつＯＲＦを含んでいた。全てのＳＡＧＥデー タの分析は、検出可能なレベルで転写されたキャラクタリゼーションされていな いＯＲＦに対応する２６８４のこのような遺伝子が存在することを示唆していた 。これらの転写物のうちで最も多い３０個は３０倍以上観察され、細胞当たり少 なくとも８転写物に対応した（表２）。別の２つの高発現されたキャラクタリゼ ーションされていない遺伝子は、イーストゲノム配列の分析から予測されなかっ たＯＲＦ（ＮＯＲＦ＝Nonannotated ORF：注釈されないＯＲＦ）に対応した。Ｓ ＡＧＥデータの分析は、検出可能なレベルで転写された約１６０のＮＯＲＦ遺伝 子があることを示唆した。これらの転写物のうちで最も多い３０個は少なくとも ９倍観察された（表３及び図５の例）。 おもしろいことに、ＮＯＲＦ遺伝子のうちの１つ（ＮＯＲＦ５）は、Ｓ期分裂 停止細胞のみで発現し、分析した３つの状態中でその量が最も変化に富む転写物 に対応していた（＞４９倍、図５）。Ｓ期分裂停止細胞とその他の状態との比較 により、RNR2及びRNR4転写物では９倍以上の上昇があることもわかった（図５） 。これらのリボヌクレオシドレダクターゼ遺伝子の誘導は、Ｓ期における分裂停 止細胞に用いられたヒドロキシ尿素処理によるものであるらしい（Elledge and Davis,1989）。同様に、Ｇ２／Ｍ分裂停止細胞の比較から、RBL2とダイニン軽鎖 の上昇を同定したが、これらはどちらも微小管関連タンパク質である(Archer et al.,1995;Dick et al.,1996)。ＲＮＡ誘導と同様に、これらの上昇したレベル は、Ｇ２／Ｍ期における分裂停止細胞に用いられたノコダゾール処理と関連して いるようである。状態によって比較的小さな違いはたくさんあったが（例えば、 NORF1、図５）、３つの状態を総合的に比較すると、劇的な違いは驚くほど少な いことが判明し、分析した３つの異なる状態の間で、１０倍以上の量の変化があ ったのは２９の転写物のみであった。 検討 イースト転写物の分析から、細胞の生命を規定するＲＮＡ成分についてのユニ ークな観察が得られる。我々は、遺伝子発現レベルの大きさが３桁のオーダーで 変化し、エネルギー代謝とタンパク質合成に関与する転写物が最も高度に発現す ることを観察した。ＤＮＡ複製（例えばPOL1及びPOL3)、動原体タンパク質（NDC 10及びSKP1）及びその他の多くの興味深いタンパク質に必要な酵素をコードする 転写物のような鍵となる転写物は、平均で細胞当たり１又はそれ以下のコピー数 で存在した。これらの量は、発現された遺伝子の最大数は細胞当たり１又は２コ ピーで存在することを示している、再結合速度論（reassociation kinetics）か ら以前に得られた定性データと一致した。これらの観察は、イーストの遺伝子発 現には低い転写物コピー数で十分なことを示しており、またイーストはＲＮＡの 量を厳しく制御するメカニズムを持っていることを示している。 染色体発現マップを合成することにより、ゲノムの位置によって組織化されて いる遺伝子の発現レベルのカタログ化が得られる。Ｓ．セレベシエの１６の染色 体を 通じて遺伝子発現のバランスがよくとれていることは驚くべきことではない。ほ とんどの遺伝子は独立した制御エレメントをもっているので、よく似た高レベル の発現をもつ物理的に近い遺伝子が多数あることを見出すことは驚きであったろ う。Ｈ３／Ｈ４ペアのように、共制御された互いに異なるプロモーターをもつこ とが知られている少数の遺伝子のうちで、ＳＡＧＥデータは調和した発現レベル を確認した。転写的には抑制されていることが知られているテロメア末端のよう な領域については、ＳＡＧＥデータは低レベルの発現を確認した。グルコースで 誘導される糖分解酵素の高レベル、グルコースで抑制されるGAL遺伝子の低レベ ル、接合型ａ特異的遺伝子の発現、及び接合型α遺伝子の低発現などのように、 その他の予測される発現パターンが観察された。最後に、ＮＯＲＦ遺伝子と対応 するタグの同定は、系統的な配列分析に用いられる基準では検出できないイース トゲノムによてコードされる小さいタンパク質がかなりの数存在することを示唆 している。イーストゲノム配列を、３００ｂｐ以上（１００アミノ酸又はそれ以 上のタンパク質をコードする）の全てのＯＲＦに対して注釈した。従って、この カットオフ以下のタンパク質をコードする遺伝子は一般に注釈されていない。こ のクラスの遺伝子は、突然変異誘発のための標的サイズが小さいために、突然変 異コレクションに提示されることが少なく、そして小さいサイズの場合には、新 規な機能をもつタンパク質をコードするかも知れない。よって、これらのＮＯＲ Ｆ遺伝子を系統的にノックアウトすることは大変興味あることである。 生理学的状態を変えて得られる遺伝子発現パターンを比較すると、種々のプロ セスに重要な遺伝子についての洞察が得られる。種々の生理学的状態から得られ るトランスクリプトームを比較することによって、その発現が通常の栄養増殖（ vegetative growth）に必要な遺伝子からなる最小セットと、特定の環境刺激に 応答する時のみ、又は特定のプロセス中にのみ発現する遺伝子からなる別のセッ トを提供するはずである。例えば、最近の研究によって、原核細胞生命にとって 必要な２５０遺伝子の最小セットが同定された（Mushegian and Koonin,1996） 。イーストゲノムを試験したところ、これらのうちの１９６について相同な遺伝 子が容易に同定され、その９０％以上がＳＡＧＥ分析で発現することが観察され た。イース ト転写物と、その他の生物由来のトランスクリプトームを詳細に分析することに より、真核細胞生命に必要な遺伝子の最小セットを最終的に作成することができ るであろう。 その他のゲノムにわたる分析と同様に、イーストトランスクリプトームのＳＡ ＧＥ分析にはいくつかの限界がある。まず第一に、少数の転写物にはNlaIII部位 がないことが予測され、それゆえこの分析では検出されないであろう。第二に、 我々の分析は、細胞当たり少なくとも０．３コピーの頻度で見出される転写物に 限定された。細胞サイクルのごく短時間でのみ発現された転写物、あるいは細胞 集団のごく一部でのみ発現された転写物はこの分析では高い信頼度で検出できな いであろう。最後に、ｍＲＮＡ配列データはイーストについては実際には入手で きないし、従って、いくつかのＳＡＧＥタグは対応の遺伝子と明白にマッチさせ ることができない。重複する遺伝子、又は異常に長い３’非翻訳領域をもつ遺伝 子に由来するタグは同定を間違えるかも知れない。イーストｍＲＮＡ分子中の３ ’ＵＴＲ配列が徐々に得られるようになると、曖昧さを解決する助けになるはず である。 これらの限界があるかも知れないが、それでも本明細書に記載の分析が、ヌク レオチドレベルで正確に定義された遺伝子発現の全体的及び部分的な像をもたら すことは明らかである。これらのデータは、イーストゲノム自体の配列と同様に 、将来多くの実験を解釈するために必要不可欠な簡単、かつ基本的な情報を提供 する。種々のゲノムプロジェクトとともに、ＥＳＴ配列決定からｍＲＮＡ配列が 入手できることにより、ヒトを含む様々な生物由来のトランスクリプトームの定 義をすぐに可能にするであろう。本明細書で記録したデータは、ヒト細胞トラン スクリプトームの合理的に完全な像を描くには、ここで評価したよりも約１０− ２０倍多いタグを必要とするだけであり、その数は少数の自動配列決定機で実際 に達成しうる範囲内のものである。高等真核生物の全体的発現パターンの分析は 、一般には、ここでＳ．セレベシエについて報告したのと同様であることが予測 できる。しかしながら、異なる細胞中、及び異なる個体由来のトランスクリプト ームの分析によって、正常な発生、及び疾患状態にある遺伝子機能についての多 くの情報をもたらすはずである。 実験方法 イースト細胞の培養 全ての実験の転写物はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ ｕ ｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｌｅｕ２−Δ１ ｈｉｓ ３−Δ２００ ｔｒｐ１−Δ６３）から得た（SikorskiおよびHieter，1989）。 対数的に増殖する細胞は、イースト細胞を高ＹＰＤ（Roseら，1990）培地（６ｍ Ｍウラシル、４．８ｍＭアデニン、および２４ｍＭトリプトファンを追加したＹ ＰＤ）中、３０℃で初期の対数期（３ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）まで増殖させて得た 。細胞周期のＧ１／Ｓで停止させるためには、ヒドロキシ尿素（０．１Ｍ）を初 期の対数期細胞に添加し、培養液を更に３０℃で３．５時間インキュベートした 。細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止させるためには、ノコダゾール（１５μｇ／ｍｌ ）を初期の対数期細胞に添加し、培養液を更に３０℃で１００分間インキュベー トした。回収した細胞を水で１度洗浄し、−７０℃で凍結した。回収した細胞の 増殖状態は顕微鏡およびフローサイトメトリー分析によって確認した（Basraiら ，1996）。 ＲＮＡの単離およびノザンブロット分析 総イーストＲＮＡは過去に記載されている熱フェノール法（Leedsら，1991）で 調製した。ｍＲＮＡは、メッセージメーカーキット（MessageMaker Kit;Gibcol BRL社）を使用し、製品の取扱説明書に従って得た。ノザンブロット分析は過去 に記載されている（El-Deiryら，1993）ように、イーストゲノムＤＮＡからＰＣ Ｒで増幅したプローブを使用して実施した。 ＳＡＧＥのプロトコール ＳＡＧＥ法は、以下に示す点を除いては過去に記載されている（Velculescuら， 1995）ように実施した。ポリＡ ＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換は、ＢＲＬ合 成キットを用い、ビオチン−５’−Ｔ₁₈−３’プライマーを含有させた以外は製 品の取扱説明書を使用して行った。ｃＤＮＡをＮｌａIII（アンカー酵素）で開 裂した。 ＮｌａIII部位は、任意に選択した３つのイースト染色体（１、５、１０）で、 ３０９塩基対毎に一度発生することが観察され、９５％のイースト転写物がＮｌ ａIIIを使用したＳＡＧＥ法で検出できると推測された。ストレプトアビジン被 覆磁気ビーズ（Dynal社）上に３’ｃＤＮＡフラグメントを捕捉させた後、結合 したｃＤＮＡを２つのプールに分割し、ＢｓｍＦＩの認識部位を含有する以下の リンカーのいずれか一つをそれぞれのプールにライゲートさせた：リンカー１、 ５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡ ＡＴＡＧＧＧＡＣＡＴＧ−３’（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：１）５’−ＴＣＣＣＴＡ ＴＴＡＡＧＣＣＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣ［ａｍｉｎ ｏ ｍｏｄ．Ｃ７］−３’（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：２）；リンカー２、５’−Ｔ ＴＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＧ ＡＣＡＴＧ−３’（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：３）５’−ＴＣＣＣＣＧＴＡＣＡＴＣ ＧＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧ［ａｍｉｎｏ ｍｏｄ．Ｃ７ ］−３’（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：４）。 ＢｓｍＦＩ（タグ酵素）は認識部位から１４ｂｐ離れた位置で開裂し、Ｎｌａ III部位はＢｓｍＦＩと１ｂｐ重複するので、１５ｂｐのＳＡＧＥタグをＢｓｍ ＦＩで遊離させ、ＳＡＧＥタグの突出部分をクレノウで埋め、２つのプールから 得たタグを合一して互いにライゲートした。ライゲーション産物を希釈した後Ｐ ＣＲで２８サイクル増幅したが、これには５’−ＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣ ＡＧＴＡＣＡ−３’（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：５）および５’−ＣＴＧＣＴＣＧＡ ＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴ−３’（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：６）をプライマーとし て使用した。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で分 析し、テールとテールでライゲートした２つのタグ（２重タグ；ditag）を含有 するＰＣＲ産物を分取した。次いでＰＣＲ産物をＮｌａIIIで開裂し、２タグを 含有するバンドを分取し、自己ライゲートさせた。ライゲーションの後、連鎖さ せた産物をＰＡＧＥで分離し、５００ｂｐと２ｋｂの間の産物を分取した。これ らの産物をｐＺｅｒｏ(Invitrogen社)のＳｐｈＩ部位でクローニングした。コロ ニーは、プライマーとしてクローニング部位の外側に位置するＭ１３フォワード およびＭ１３リバース配列を用いた ＰＣＲによって、挿入断片のスクリーニングをした。 選択したクローンから得たＰＣＲ産物をＴａｑＦＳ ダイプライマーキット（ TaqFS DyePrimer kits；Perkin Elmer社）でシーケンシングし、分析したが、こ れには３７７ＡＢＩ自動シーケンサー（Perkin Elmer社）を使用し、製品の取扱 説明書に従った。成功したシーケンシング反応はそれぞれ、平均２６タグである ことが確認された；シーケンシング反応の成功率は９０％で、これはシーケンシ ングゲル当たり平均約８５０タグに相当する。 ＳＡＧＥのデータ分析 シーケンスファイルをＳＡＧＥプログラムグループによって分析したが（Velcul escuら，1995）、適当な間隔のあいたアンカー酵素部位を同定し、間にある２つ のタグを抜き出し、データベースに記録した。 得られた６８，６９１タグは、特異的２重タグからの６２，９６５タグおよび反 復２重タグからの５，７２６タグを含有した。過去に記載されているように（Ve lculescuら，1995）、後者は定量の潜在的なＰＣＲバイアスを回避するために一 度だけ計数した。６２，９６５タグのうち２，３３２タグはリンカー配列に相当 し、更なる分析から除外した。残りのタグのうち、４，３４２タグは割り当てで きず、これは配列エラー（タグ内、またはイーストゲノム配列内）によるものと 考えられた。これら全てがタグの配列エラーによるとすれば、これは塩基対当た り約０．７％の配列エラー率に相当し（１０ｂｐのタグで）、われわれが自動シ ーケンシング条件下で予測していたのとあまり差異がなかった。しかしながら、 割り当てられなかったタグの中には、タグの最後の５塩基対のＡの頻度が予想よ りかなり高いものがあり（最も存在度の高い割り当てされなかったタグ５２のう ちの５つ）、これらのタグがポリＡテールから数塩基対以内にアンカー酵素部位 を含有する転写物から生ずることを示唆する。ゲノムにおけるＮｌａIII部位の 頻度から（３０９塩基対中１つ）、約３％の転写物はそのポリＡテールの１０ｂ ｐ以内にＮｌａIII部位を含有すると推定される。 イーストｍＲＮＡ配列について入手できるデータは非常に少なく、現在までの 試 みでは高度に保存されたポリアデニル化シグナルを同定することができなかった ため（ImigerおよびBraus，1994；ZaretおよびSherman，1982）、われわれは１ ４ｂｐのＳＡＧＥタグ（すなわちＮｌａIII部位および隣接する１０ｂｐ）を使 用してイーストゲノムを直接調査した（１９９６年８月７日にスタンフォードイ ーストゲノムｆｔｐサイト(genome-ftp.stanford.edu)から入手したイーストゲ ノム配列）。コード領域だけがイーストゲノムにannotateされ、ＳＡＧＥタグは 遺伝子の３’非翻訳領域に由来するため、ＳＡＧＥタグがＯＲＦまたはＯＲＦの ３’の５００ｂｐ領域と一致する場合、特定の遺伝子に相当するとみなされる（ 遺伝子座名、遺伝子名、およびＯＲＦ染色体座標はスタンフォードイーストゲノ ムｆｔｐサイトから入手し、ＯＲＦの種類は１９９６年８月１４日にＭＩＰＳ ｗｗｗサイト（http://www.mips.biochem.mpg.de/）から入手した）。ＯＲＦが ３文字の遺伝子名と合う場合は既知の機能を有する遺伝子とみなし、そのような 名称のないＯＲＦはキャラクタリゼーションされていないとみなした。 予想通り、ＳＡＧＥタグはゲノムの転写部分と高度に非ランダムに一致し、Ｏ ＲＦまたはそれらに隣接する３’領域に正しい向きで８８％一致した（カイ二乗 したＰ値＜１０^-30）。１より多くのタグが正しい向きで特定のＯＲＦに一致す る場合、存在度は一致するタグの合計になると算定される（図２、図３、および 図４）。ＯＲＦと不正確な向きで一致するタグは存在度の算定に使用しない。タ グがゲノムの１より多い領域で一致する場合（例えばＯＲＦおよび非ＯＲＦ領域 ）一致するＯＲＦだけを検討した。場合によっては、タグの１５番目の塩基を使 用して曖昧さを解決した。図４には、一度だけゲノムと一致するタグのみを使用 した。 ＮＯＲＦ遺伝子の同定には、既に同定されたＯＲＦの３’の５００ｂｐ以上の ゲノム部分と一致し、ＳＡＧＥライブラリーに少なくとも２回観察されたタグだ けを考察した。 参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＥＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 キンズラー，ケネス・ダブリュー アメリカ合衆国メリーランド州21234，バ ルティモア，ハルステッド・ロード 1348

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 表３および４に明記するＮＯＲＦ遺伝子の群から選択される細胞周期進行 に関係するイースト遺伝子を含む単離ＤＮＡ分子。 ２． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期のい ずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも１０％の差異がある 、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 ３． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期のい ずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも２５％の差異がある 、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 ４． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期のい ずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも５０％の差異がある 、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 ５． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期のい ずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも１００％の差異があ る、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 ６． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期のい ずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に統計学的に有意な差異がある（ ９５％より高い信頼度）、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 ７． ＮＯＲＦがＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、および２ ７からなる群から選択される、請求項６記載の単離ＤＮＡ分子。 ８． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の少 なくとも１つの段階でＮＯＲＦ遺伝子が発現されない、請求項１記載の単離ＤＮ Ａ分子。 ９． ゲノムである、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 １０． ｃＤＮＡである、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。 １１． イースト遺伝子を使用して細胞周期に影響を及ぼす方法であって、以下 の段階： 細胞にイースト遺伝子を含む単離ＤＮＡ分子を投与するが、その遺伝子は細胞 周期進行に関係し、表１、２、３、および４に明記する差異発現遺伝子から選択 される、 を含んでなる上記方法。 １２． 細胞がイースト細胞である、請求項１１記載の方法。 １３． 細胞が真菌細胞である、請求項１１記載の方法。 １４． 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１記載の方法。 １５． イースト遺伝子がＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、 および２７からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。 １６． イースト遺伝子がＴＥＦ１／ＴＥＦ２、ＥＮ０２、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２ 、ＰＧＫ１、ＣＵＰ１Ａ／ＣＵＰ１Ｂ、およびＰＹＫ１からなる群から選択され る、請求項１１記載の方法。 １７． イースト遺伝子がＹＫＬ０５６Ｃ、ＹＭＲ１１６Ｃ、ＹＥＬ０３３Ｗ、 ＹＯＲ１８２Ｃ、ＹＣＲ０１３Ｃ、およびＹＪＲ０８５Ｃからなる群から選択さ れる、請求項１１記載の方法。 １８． 抗真菌剤の候補となるものをスクリーニングする方法であって、以下の 段階： 試験物質をイースト細胞に接触させ； 表１、２、３、および４に明記するイースト遺伝子の群から選択される細胞周 期進行に関係するイースト遺伝子の発現をモニタリングする、 を含んでなり、ここで、イースト遺伝子の発現を変化させる試験物質は抗真菌剤 の候補となるものである上記方法。 １９． イースト遺伝子がＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、 および２７からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。 ２０． イースト遺伝子がＴＥＦ１／ＴＥＦ２、ＥＮ０２、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２ 、ＰＧＫ１、ＣＵＰ１Ａ／ＣＵＰ１Ｂ、およびＰＹＫ１からなる群から選択され る、請求項１８記載の方法。 ２１． イースト遺伝子がＹＫＬ０５６Ｃ、ＹＭＲ１１６Ｃ、ＹＥＬ０３３Ｗ、 Ｙ ＯＲ１８２Ｃ、ＹＣＲ０１３Ｃ、およびＹＪＲ０８５Ｃからなる群から選択され る、請求項１８記載の方法。 ２２． 細胞周期進行に関係するヒト遺伝子を同定する方法であって、以下の段 階： イースト遺伝子の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むプローブを ハイブリダイズするが、その遺伝子は対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる 群から選択される少なくとも２つの段階の間で異なって発現される、 を含んでなり、ここでイースト遺伝子は表１、２、３、または４に明記されるも のである上記方法。 ２３． イースト遺伝子がＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、 および２７からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。 ２４． イースト遺伝子がＴＥＦ１／ＴＥＦ２、ＥＮ０２、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２ 、ＰＧＫ１、ＣＵＰ１Ａ／ＣＵＰ１Ｂ、およびＰＹＫ１からなる群から選択され る、請求項２２記載の方法。 ２５． イースト遺伝子がＹＫＬ０５６Ｃ、ＹＭＲ１１６Ｃ、ＹＥＬ０３３Ｗ、 ＹＯＲ１８２Ｃ、ＹＣＲ０１３Ｃ、およびＹＪＲ０８５Ｃからなる群から選択さ れる、請求項２２記載の方法。 ２６． プローブが表３または４に明記されるＮＯＲＦ遺伝子の少なくとも１４ の連続するヌクレオチドを含む、細胞周期における段階を確認するためのプロー ブ。 ２７． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の いずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも１０％の差異があ る、請求項２６記載のプローブ。 ２８． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の いずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも２５％の差異があ る、請求項２６記載のプローブ。 ２９． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の いずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも５０％の差異があ る、請求項２６記載のプローブ。 ３０． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の いずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に少なくとも１００％の差異が ある、請求項２６記載のプローブ。 ３１． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の 少なくとも１つの段階でＮＯＲＦ遺伝子が発現されない、請求項２６記載のプロ ーブ。 ３２． 対数期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期からなる群から選択される細胞周期の いずれか２つの段階の間でＮＯＲＦ遺伝子の発現に統計学的に有意に異なる（９ ５％より高い信頼度）、請求項２６記載のプローブ。 ３３． 遺伝子がＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、および２ ７からなる群から選択される、請求項３２記載のプローブ。 ３４． 該発現モニタリング段階が固相支持体に固定された核酸分子を使用して 実施される、請求項１８記載の方法。 ３５． 核酸分子がアレイ上にある、請求項３４記載の方法。 ３６． 該イースト遺伝子の一部を含むプローブが固相支持体上のアレイにある 、請求項１９記載の方法。 ３７． 少なくとも１つのプローブが表３または４に明記されるＮＯＲＦ遺伝子 の少なくとも１４の連続するヌクレオチドを含む、固相支持体上のプローブのア レイ。 ３８． ＮＯＲＦ遺伝子がＮＯＲＦ Ｎｏ．１、２、４、５、６、１７、２５、 および２７からなる群から選択される、請求項３７記載のアレイ。 ３９． 異なる配列のプローブを少なくとも１００個含有する、請求項３７記載 のアレイ。 ４０． 異なる配列のプローブを少なくとも５００個含有する、請求項３７記載 のアレイ。 ４１． 異なる配列のプローブを少なくとも１，０００個含有する、請求項３７ 記載のアレイ。