KR100858675B1 - 낭포형성 확인용 바이오마커 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 낭포형성 확인용 바이오마커 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 유전자의 발현정도 분석은 낭포가 형성된 신장에서 RNA를 추출한 다음, 추출한 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성한 후, 생성된 cDNA를 서열번호 1 및 서열번호 2의 DNA 단편 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 Dab2 유전자를 증폭시키거나, 서열번호 3 및 서열번호 4의 DNA 단편 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 S100a9 유전자를 증폭시킨 다음, 증폭된 Dab2 유전자와 S100a9 유전자의 발현정도를 분석하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해, 낭포형성 확인용 바이오마커 유전자로 Dab2 유전자와 S100a9 유전자가 제공되며, 낭포형성 확인용도로 Dab2 유전자와 S100a9 유전자를 이용하여 유전자 발현 정도를 분석하는 방법이 제공된다.

바이오마커, Dab2, S100a9, 유전자, 낭포형성

Description

낭포형성 확인용 바이오마커 유전자{BIOMARKER GENE FOR CONFIRMATION OF CYST FORMATION}

도 1은 낭포형성 관련 유전자 발굴을 위한 모델구축을 나타낸 그래프.

도 2는 마이크로어레이 분석을 통한 유전자 발현변화를 나타낸 그래프.

A : 원자료 그래프

B : lowess 정규화 그래프

C : 척도 보정 정규화 방법을 이용한 원자료 그래프

D : 척도 보정 정규화한 그래프

도 3은 군집분석을 통하여 유전자 발현을 비교 분석한 그래프.

A : 계측적 군집 분석결과

B : Line Plot으로 나타낸 결과

도 4는 역전사연쇄중합반응을 통하여 낭포형성 관련 유전자인 Dab2와 S100a9의 발현 양상을 나타낸 사진.

본 발명은 낭포형성 확인용 바이오마커 유전자에 관한 것이다.

상염색체 우성 다낭신(Autosomal dominant polycystic kidney disease : ADPKD)은 인종 및 지역에 관계없이 전 세계적으로 분포하며, 성인에서 가장 흔한 유전성 신질환으로서 양측 신장 및 간에 다발성 낭포를 형성하며, 발생 빈도는 전체 인구 약 1,000명 중 1명 정도로 알려져 있다.

이 질환은 낭포가 커짐에 따라 출혈, 통증, 요로 감염등 여러 신장 합병증을 일으킬 뿐만 아니라, 환자의 50 %이상에서는 신기능이 서서히 감소하여 말기 신부전증으로 진행된다.

미국 통계자료에 의하면, 낭포가 형성되는 60 세까지 상염색체 우성 다낭신 질환 환자의 약 45 %가 말기신부전으로 진행하며, 일본의 경우에서도 65 ~ 69세의 환자 49 %에서 말기 신부전에 이른다고 보고되었다.

우리나라의 경우에서도 전체 혈액 투석 환자의 약 2 %가 상염색체 우성 다낭신에 의한 것으로 보고된 바 있으나 실제는 더 비율이 높을 것으로 예상된다.

또한, 간, 췌장, 비장 등의 장기에서도 낭포를 형성하며, 판막성 심질환, 뇌동맥류, 대장게실 등 전신성 증상을 수반한다.

1985년 처음으로 상염색체 우성 다낭신이 16번 염색체의 단완 (Short arm)에 위치한 마커와 연관이 있음이 보고된 이후, PKD1과 PKD2가 원인유전자임이 보고된 바 있다.

상염색체 우성 다낭신 질환에 있어 돌연변이 발생 빈도는 PKD1의 경우 80 ~ 90 %이고, PKD2는 10 ~ 15 %정도 일어나는 것으로 알려져 있다.

상염색체 우성 다낭신 질환의 원인유전자인 PKD1은 1994년 European Polycystic Kidney Disease Consortium에 의해 처음에 발견되었으며, 16p13.3에 위치하는 52 Kb의 DNA로서 46 개의 엑손에 14148bp의 mRNA 전사물(transcript)과 4,303여개의 아미노산으로 구성된 단백질 산물을 생성한다.

또 다른 원인 유전자인 PKD2 유전자는 1996년 발견되었으며, 14q21 ~ 23에 위치하며, 3Kb정도의 해독틀(Open Reading Frame)을 지닌 5Kb의 염기 서열이 밝혀졌다.

현재 PKD2 돌연변이에 의한 환자는 PKD1 돌연변이에 의한 환자보다 임상상의 발현이 늦고, 고혈압, 뇌동맥류 파열, 탈장, 요로 감염 등의 발생 빈도가 낮았으며, 말기신부전으로 진행이 늦어 환자의 생존률이 긴편이다.

현재까지 상염색체 우성 다낭신 질환에 대한 진단 방법으로는 신부전 등의 임상상의 현상 및 원인 유전자의 돌연변이를 분석을 통한 환자의 가계도 분석이 전부이다.

원인 유전자의 돌연변이로는 현재까지 3 개의 상염색체 우성 다낭신 질환가계에서 PKD2 유전자와 관련된 무의미 돌연변이 (nonsense mutation)가 관찰되었다.

특히 PKD1 유전자에는 동일한 염색체(16p13.1)내에서 3.8Kb 정도의 반복 서열을 가지고 있어 유전자 돌연변이를 직접 검색하는데 큰 어려움이 있다.

이러한 중복 부위는 PKD1과 95%이상의 동질성을 가지는 3개의 유전자를 암호화하고 있다.

이와 같이 별개의 게놈분야(genomic area) 사이에 이러한 상동성이 존재함으로서 혼성화(hybridization) 방법이나 PCR 방법을 사용한 분석에서 두 영역이 동시에 나타나게 된다.

이러한 난점으로 중복 부위의 돌연변이 검출이 지연되어 낭포 형성 진단에 있어 매우 어려운 실정이다.

그리고 상염색체 우성 다낭신은 질병 발현 초기에 특별한 증상이 없기 때문에 임상적으로 증상이 나타난 경우 대부분 신부전으로 진행한 경우이며, 이미 낭포가 심하게 형성이 되어 있는 상태이기 때문에 신장이식 혹은 투석이외에는 치료 방법이 전무하다.

또한 낭포 형성 정도를 판단하기 위해서는 고가의 장비인 MRI 분석이외에는 다른 방법이 없으며, 유전자 수준에서 낭포형성 정도를 분석할 수 있는 바이오마커는 없었다.

따라서, 유전자 발현에 의해 낭포형성 정도를 판단할 수 있는 바이오마커 유전자에 대한 연구가 필요한 실정이다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여, 유전자 수준에서 낭포형성 확인을 위한 바이오마커 유전자를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 낭포형성 정도 확인을 위해 바이오마커 유전자로 Dab2 유전자와 S100a9 유전자를 이용하여 유전자 발현 정도를 분석하는 방법을 제공하는데 그 목 적이 있다.

본 발명은 낭포형성 확인용 바이오마커 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 바이오마커 유전자는 Dab2 유전자(서열번호 5)와 S100a9 유전자(서열번호 6) 중 선택된 1 종 이상으로 구성된 유전자로서, 낭포 형성 시 유전자의 발현이 증가하는 것이 특징인 낭포형성 확인용도의 바이오마커 유전자이다.

또한, 본 발명의 낭포형성 확인용 바이오마커 유전자의 발현 정도를 분석하는 방법은 낭포가 형성된 신장에서 RNA를 추출한 다음, 추출한 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성한 후, 생성된 cDNA를 서열번호 1 및 서열번호 2의 DNA 단편 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 Dab2 유전자를 증폭시키거나, 서열번호 3 및 서열번호 4의 DNA 단편 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 S100a9 유전자를 증폭시킨 다음, 증폭된 Dab2 유전자와 S100a9 유전자의 발현정도를 분석하는 것으로 구성된다.

상염색체 우성 다낭신은 전 세계적으로 매우 유병률이 높은 유전질환으로서 양측 신장에 다발성 낭포를 형성하며, 말기 신부전등의 합병증을 유발한다.

상염색체 우성 다낭신은 현재 그 진단하기 위해서는 환자의 가계도 원인 유전자 돌연변이 분석을 통한 진단 방법이 있으며, 낭포 형성 정도를 판별하기 위해서는 고가의 장비인 MRI 분석을 하는 방법 이외에는 거의 전무하다.

그러나 원인 유전자의 돌연변이 유발 부위가 상동성이 매우 높아 그 돌연변 이를 판별하기 어려우며, 환자 가계도 분석을 하여야 하기 때문에 실질적으로 분석이 어려우며, 낭포 형성 정도 판별 또한 고가의 장비를 활용하여야 하기 때문에 경제적 손실이 매우 크다.

따라서 본 발명의 발명자들은 상염색체 우성 다낭신 질환 판별방법으로 유전자 수준에서 간단하게 발현을 분석하여 빠르고 손쉽게 신장 낭포 형성 여부를 확인하고, 형성 정도를 판별할 수 있는 방법을 개발하기 위해 많은 연구와 시행착오를 겪었으며, 이를 통해 본 발명을 완성하게 되었다.

낭포 형성 여부 및 형성 정도를 판별할 수 있는 유전자 발굴을 위하여 원인 유전자인 PKD2 과발현 동물 모델에서 6 개월, 12 개월, 18 개월령의 동물 모델 신장을 채취한 후 H&E 염색법을 통하여 개월수 증가에 따라 신장의 낭포의 크기가 증가함을 확인하였다 (도 1).

낭포가 형성된 신장에서 총 RNA를 추출한 후 올리고(oligo) DNA 칩에 혼성화를 실시하여 유전자의 발현 변화정도를 관찰하였다.

DNA 칩의 혼성화 결과는 표준화를 거쳐 분석을 실시하여 나타내었다(도 2).

낭포 형성 및 형성에 영향을 미치는 유전자 발현 정도를 비교 분석하기 위하여 계층적 군집분석방법(hierachical clustering method)을 통하여 군집 분석을 실시하여 나타내었으며, 유전자의 발현 패턴의 유사성에 따라 총 9개의 군으로 나누어 나타내었다(도 3).

이는 유전자 수준에서 발현 양상을 분석함으로써 낭포 형성 및 형성정도를 예측해 볼 수 있음을 보여준다.

특히, Dab2와 S100a9는 개월수가 지남에 따라 발현이 증가하는 유전자로서, 유전자 수준에서 발현정도를 분석하여 낭포 형성 및 형성 정도를 판단할 수 있는 주요한 정보를 제공할 것이다.

본 발명에서는 Dab2와 S100a9의 바이오마커 (Biomarker)로서의 가능성을 확인하기 위하여 6, 12, 18개월의 형질전환동물과 나이가 같은 대조군에서 추출한 RNA를 이용하여 역전사 연쇄중합반응 (RT-PCR)을 수행하였다.

총 RNA 추출방법은 구아니딘을 사용하는 방법, Trizol 시약을 사용하는 방법, 상업적으로 판매하는 RNA 추출키트를 사용하는 방법 등이 있으나, 본 연구에서는 RNA 추출의 효율성을 높이기 위하여 상업적으로 판매하는 kit를 사용하여 총 RNA를 추출하였다.

역전사연쇄중합반응 (RT-PCR)이란 본 연구 분야에서 잘 알려진 방법으로서 oligo dT12-18 프라이머를 사용하여 RNA중에서 메신저 RNA만을 선별적으로 이에 상응하는 cDNA (complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 역전사효소 (reverse trasncriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하여, cDNA를 이용하여 특정 부위를 증폭시키는 과정이다.

따라서 RNA를 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 생성하고 여기에 낭포 형성 및 형성 정도를 판단할 수 있는 유전자를 증폭하기 위한 특이적인 DNA 서열 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시킴으로써 낭포 형성과 발달에 연관된 유전자를 수득할 수 있었다.

아래의 표 1에 낭포 발달에 특이적으로 변화하는 Dab2와 S100a9의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 나타내었다.

<표 1> 낭포(cyst)형성 여부 및 형성 정도를 판별할 수 있는 바이오 마커인 Dab2 와 S100a9의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍

유전자	NCBI No.	염기서열	서열번호
Dab2	NM_023118	TCC AAC ATC TTC AGC AAA CGA CTT	1
		GTG GCC AGA ACA GAG GAC ATC A	2
S100a9	NM_009114	AGC GCA GCA TAA CCA CCA TCA	3
		GCC ATC AGC ATC ATA CAC TCC TCA	4

증폭한 각 마커 유전자에 대한 DNA 단편은 아가로오스 겔에 걸어 확인하여 나타내었다(도 4).

그리고 도 4에서 나타난 결과가 도 4에서 나타난 결과와 동일한 양상을 보이는 것으로 확인된 바, 이것은 이들 두 유전자가 낭포 형성 정도를 판단하는데 있어 주요한 바이오마커 (biomarker)로서 사용될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 낭포형성 확인용도의 바이오마커 유전자에 대하여 아래의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 낭포형성 관련 유전자 발굴을 위한 모델구축

본 발명에서는 시간이 경과됨에 따라 상염색체 우성다낭신의 주요 동물 모델인 PKD2 과발현 마우스의 시기별 낭포의 평균 크기를 측정하였으며, 이를 비교하여 그 결과를 아래의 표 2와 도 1에 나타내었다.

<표 2> PKD2 과발현 형질전환 마우스의 시기별 낭포 형성 정도 비교 분석

개월수	형성된 낭포 사이즈(㎛)	마우스 수
6	116.056	5
12	169.2035	3
18	184.7882	8

표 2와 도 1에 나타나 있듯이 개월수가 지날 수록 낭포의 크기가 증가함이 확인되었다.

<실시예 2> 6, 12, 18개월령의 PKD2 과발현 형질전환 마우스와 각 마우스의 한배 야생형 마우스 신장에서 총 RNA의 추출

PKD2 과발현 형질전환 마우스와 대조군의 신장에서 총 RNA를 추출하였다.

Quiagen kit 방법을 사용하여 총 RNA를 분리하였다.

이때 사용한 모든 용액은 0.1% 디에틸피로카보네이트 처리수 (diethyl pryrocarbonate-treaed water , DEPC-dH2O)로 RNA 분해효소 활성 (RNase activity)을 저해하기 위해 처리하였다.

마우스로부터 신장을 잘 분리한 후, 액체질소를 부어 완전히 얼리고, 30 mg의 조직을 막자사발을 이용하여 곱게 갈아주었다.

곱게 갈은 신장은 Quiagen RNeasy mini kit의 RLT 완충용액(buffer) 600 ㎕를 넣고 잘 섞어서 같이 갈아주었다.

동량의 70 % 에탄올을 넣어주고 잘 섞은 후 Quagen RNeasy mini kit의 컬럼(column)을 조심스럽게 용액에 넣은 후, 원심분리기에 넣고 돌려서 걸러주면 총 RNA는 컬럼(column) 위에 걸러지게 되었다.

세척을 위하여 RW1 용액 700 ㎕을 조심스럽게 컬럼(column)위에 넣고 원심분 리기에 넣고 돌리는 것을 2 회 실시하였다.

RNA 수득을 위하여 DEPC-dH2O 용액을 컬럼(column)에 넣고 원심분리기에 돌려서 총 RNA를 추출하였다.

추출한 RNA는 -70℃에서 보관하였으며, RNA 농도는 동일한 조건하에서 260nm(RNA;1 OD 260=40㎍ of RNA/㎖)와 280nm의 흡광도를 측정하였다.

<실시예 3> 6, 12, 18개월령의 PKD2 과발현 형질전환 마우스와 각 마우스의 한배 야생형 마우스 신장에서 총 RNA를 이용한 DNA 단편의 제조

실시예 2에서 6, 12, 18개월령의 PKD2 과발현 형질전환 마우스 각 대조군 마우스 신장에서 추출한 총 RNA를 이용하여 cRNA로 전이(in vitro translation)시킨 후 형광물질이 표지된 cDNA를 제조하였다.

총 RNA 2 ㎍에 T7 올리고 (dT) 프라이머과 희석된 박테리아 mRNA 대조군을 넣고 70 ℃에서 10분간 RNA를 변성시킨 다음, 바로 얼음에 방치하였다.

첫번째 가닥(first strand) 반응 구성 요소들을 넣고 42 ℃에서 2 시간동안 반응시킨 후 두번째 가닥(second strand) 반응 구성 요소들을 넣고 16 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다.

30 ㎕ EB 용액을 이용하여 정제하였다.

정제한 cDNA를 9.5 ㎕로 농축한 후 biotinylated UTP, ribonucleotides, 10×T7 enzyme mix를 넣고 37 ℃에서 14 시간동안 반응하였다.

만들어진 cRNA를 정제하고, cDNA를 50 ㎕ nuclease-free water에 녹였다.

2 ㎕를 50 배 희석한 후 cRNA를 260 nm의 흡광도에서 측정하였다.

이때 증폭된 cRNA는 ~1200 nt정도이다.

<실험예 1> DNA 단편 및 올리고(Oligo) DNA 칩과의 혼성화 (hybridization) 실험

본 발명의 실시예 3에서 추출한 총 RNA를 이용하여 제조한 cDNA 단편과 20,000개의 공지된 유전자 올리고(oligo) DNA칩과 혼성화 반응을 실시하였다.

실시예 3에서 제조한 10 ㎍ cRNA에 5 ㎕ 단편화(fragmetation) 용액을 넣고 94 ℃에서 20 분정도 반응시켜서 파쇄한 후 78 ㎕의 혼성화 용액 A component와 130 ㎕ 혼성화 용액 component B을 넣고 90 ℃에서 5 분간 반응시킨 후 즉시 얼음에 5 분에서 30 분간 방치하였다.

제조한 혼성화 용액은 올리고(Oligo) DNA 칩의 용액 투입구에 천천히 잘 넣어 준 후 300 rpm의 진동 혼성화 챔버 (shaking Hybridization chamber)에서 37 ℃에서 18 ~ 24 시간동안 혼성화시켰다

혼성화가 종료되면 oligo DNA 칩을 TNT 용액에 담갔다가 다시 예열된 TNT 용액에 넣고 정확하게 1 시간동안 반응시켰다.

oligo DNA 칩을 Cy-5 streptavidin 용액에 넣고 상온에서 30 분 정도 반응을 시켰다.

반응이 끝나면 TNT 용액에 5 분동안 4 회 세척한 후 마지막으로 0.1×SSC/0.05 % Tween 용액에서 30 초간 헹구었다.

즉시 원심분리하여 물기를 제거하고 GenePix 4000B 스캐너에서 스캔하였다.

<실험예 2> Oligo칩 데이터의 산점도 분석을 통한 유전자 발현 양상 조사

Oligo 칩에서 낭포형성과정 분석을 위한 올리고뉴클레오타이드 칩(oligoneucleotide chip, CodeLink bioarray chip)은 총 6개의 슬라이드(slide)들을 각각 한번씩 측정한 것으로, 각 슬라이드 마다 총 19,428개의 유전자들이 포함되어 있고, 각각의 6개월, 12개월, 18개월의 시기별로 낭포가 형성되어 있지 않는 대조군(control)과 낭포가 형성되며, 개월수가 지남에 따라 낭포 형성이 심해지는 군으로 나누어져 있다.

대량의 유전자 발현 분석에 있어서는 먼저 발현에 대한 형광강도의 측정결과를 필터링(filtering)하였다.

스캐너의 형광 측정 시 반점(spot)의 모양이 불규칙적이거나, 배경(background)에 비해 형광강도가 일정 수준 이상 높지 않거나, 칩(chip) 제작시 혹은 분석과정 중에 오염되고(contaminated) 문제가 발생한 경우 등, 질(quality)이 좋지 않은 자료(data) 값은 결측값(missing value)으로 처리하였다.

자료 분석을 위해서는 각각의 시기에 해당하는 낭포를 형성하지 않는 마우스의 데이터를 대조군(control)으로 간주하고 낭포를 형성하는 마우스의 형광강도에 대한 대조군의 형광강도의 발현 비율을 구하였다(6개월 PKD2 과발현 마우스 신장으로서 낭포가 형성되어 있는 샘플/6개월 한배의 PKD2 과발현 야생형 마우스 신장으로서 낭포가 형성되어 있지 않는 샘플, 12, 18개월도 6개월령과 동일).

이를 위해서, 첫 번째로 이 어레이(array) 자료의 결과들을 자료 빈도에 따라 가중치(weight)를 달리 주는(intensity dependent) lowess 방법으로 정규화(lowess normalization)하였다. 관련된 정규화 식은 다음과 같다:

[수정된(adjusted) log ratio = log₂(R/G)-c(A)]

여기서 c(A)는 적합된(fitted) lowess 곡선(curve)이다.

도 2 A 와 B는 6개월의 대한 정규화그림 예이다.

도 2 A에 비해 lowess 정규화 방법으로 보정한 도 2 B에서 자료의 M값이 0을 중심으로 대칭되게 고루 퍼져있는 것을 볼 수 있다.

두 번째로는 각 슬라이드 마다의 중간값(median), 최소값, 최대값 등의 척도(scale)의 차이를 보정하는 정규화 방법(scale adjustment normalization)을 이용하였다 (도 2 C, D).

원 자료 상자그림(box plot)인 도 2C에 비해 척도 보정 정규화한 상자그림 도 2D에서 각 슬라이드의 중간값, 최소값, 최대값 및 사분위수 범위(interquartile range: IQR) 등이 거의 일치함을 확인할 수 있었다.

이상의 두 가지 정규화 방법을 통하여 각각의 독립된 실험을 비교할 수 있는 자료로 변환시키고자 하였다.

이후의 분석에 유의한 영향을 줄 수 있는 결측값들에 대한 처리로서, 첫 번째로, 각 유전자에 대하여, 총 12개의 정규화된 자료 값들 중 50 % 이상이 결측값인 경우, 이 유전자는 이후 분석에서 제외하였는데, 이를 통하여 7,428개(총 10,399개의 유전자 가운데)의 informative 유전자들을 포함한 자료를 얻게 되었다.

두 번째로, 결측값이 50 % 미만인 informative 유전자들에 대하여, 널리 알려져 있는 결측값 imputation 방법 중의 하나인 K-Nearest Neighbor (KNN) 방법(k = 10)을 통하여 결측값들을 가능한 한 정확하게 추정(estimate)하고자 하였다.

상기의 자료분석에서는 공용 소프트웨어인 R-Bioconductor (Limma)를 이용하였다.

<실험예 3> 군집분석 (Clustering analysis)를 이용한 유전자 발현 비교 분석

시기가 지날수록 계속해서 증가되거나 감소되는 유전자 발현 비교 분석을 위해서는 군집분석(cluster analysis)은 계층적 군집분석방법(hierachical clustering method)을 이용하였다.

군집되는 객체들 간의 거리의 척도를 위해서는 Pearson's Correlation을, 두 군집의 연결을 위해서는 일체적 방법(complete method)을 사용하였다.

도 3은 계층적 군집분석 결과를 보여준다.

또한 시기별로 변화하는 유전자를 찾기 위하여 시기에 따른 양상이 비슷한 군집을 9개로 분리하여 Line Plot으로 나타내었다(도 3B).

이를 통해 개월수에 따라 계속해서 증가하거나 감소하는 유전자를 선별하였다.

여기서는 상용 소프트웨어인 GeneSight 3.5가 이용되었다.

<실험예 4 > 역전사연쇄중합반응(RT-PCR)을 통한 낭포형성 여부 및 형성정도를 판단할 수 있는 유전자의 발현 양상 분석

본 발명의 실시예 2에서 PKD2 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스 신장으로부터 추출한 RNA를 역전사하여 낭포 형성 여부 및 형성 정도 판별 관련 유전자를 동정하였다.

RNA 2㎍을 DEPC-처리수에 녹인 후, 1㎕의 oligo(dT)12-18와 10mM의 dNTP 1㎕을 넣고, 70 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 곧바로 얼음에서 냉각시켰다.

상기 시료에 5×완충용액(reaction buffer) 5㎕, RNase inhibitor (Invitrogen, U.S.A) 0.5㎕을 넣고 42 ℃에서 1 분간 반응시킨 다음, AMV reverse transcriptase (Intron, No. 27021)을 1 ㎕을 넣고 다시 42 ℃에서 60 분간 배양하고, 70 ℃에서 10분을 반응하여 잔류단백질을 불활성화시켰다.

이렇게 만들어진 cDNA는 10×완충용액 3㎕, 10mM dNTP 3㎕, 2 종류의 낭포 형성 여부 및 형성 정도 판별 관련 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머 쌍 (50 pmole) 각각 1㎕, cDNA 1㎕, Taq polymerase (Bioneer, Korea, 5U/㎕) 0.5 ㎕ ac 나머지는 증류수로 30 ㎕가 되도록 첨가한 후, 94 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 94 ℃에서 1 분간, 58 ℃에서 1 분간, 72 ℃에서 1 분간 과정을 30 주기로 수행하였다.

72 ℃에서 10 분간 신장시킨 다음 1 % 아가로오스 겔에서 확인하였다.

이때 GAPDH를 마커로 하여 낭포 형성 여부 및 형성 정도 판별 관련 유전자의 발현을 비교하여 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 낭포형성 관련 바이오 마커 유전자로 Dab2와 S100a9 유전자가 적합함을 알 수 있었으며, 발현양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

이것은 이들 두 유전자가 낭포 형성 정도를 판단하는데 있어 주요한 바이오마커 (biomarker)로서 사용될 수 있음을 의미한다.

본 발명에 의해, 낭포형성 확인을 위한 바이오마커 유전자로 Dab2 유전자와 S100a9 유전자가 제공된다.

또한, 낭포형성 확인용도로 Dab2 유전자와 S100a9 유전자를 이용하여 유전자 발현 정도를 분석하는 방법이 제공된다.

<110> Sookmyung Women's University Industry Cooperation Foundation <120> BIOMARKER GENE OF CYST FORMATION CONFIRMATION USE <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> NCBI No.NM_023118 <400> 1 tccaacatct tcagcaaacg actt 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> NCBI No.NM_023118 <400> 2 gtggccagaa cagaggacat ca 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> NCBI No.NM_009114 <400> 3 agcgcagcat aaccaccatc a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> NCBI No.NM_009114 <400> 4 gccatcagca tcatacactc ctca 24 <210> 5 <211> 4497 <212> DNA <213> Mus musculus disabled homolog 2 (Drosophila) (Dab2) <400> 5 ggccacattc ctggagagtc ctcagagcca gcatctgatt agaaccatat ctctaccggg 60 agtggccgcg cggctattta agtggcgttc tccgcgtcct cggcgctgca gccttgaggc 120 ttcgggcgcg gggaagtcat gctggctcca cagaagcact agctagtccg tgtactttgt 180 gggttctgtc cttttgagac ctgcccgtcg gggattggct ggtatcagtg actgtctact 240 gctggatttt ctgcttgcct tcccgtcatg tctaacgaag tagaaacaag cacaaccaat 300 ggccagcctg accaacaggc tgccccgaaa gcgccatcaa agaaggagaa gaagaaaggt 360 tctgaaaaga cagacgagta cttgttggcc aggttcaaag gtgatggtgt aaaatacaag 420 gccaagctaa tcggtattga tgatgtgcct gatgctcgag gagacaaaat gagtcaggat 480 tctatgatga aactcaaggg aatggcagca gctggtcgct ctcagggaca acacaagcaa 540 agaatctggg tcaacatttc cttgtctggc ataaaaatca ttgatgagaa aactggggta 600 attgaacatg aacatccagt aaataagatt tccttcattg ctcgtgatgt gacagacaac 660 agagcatttg gttatgtgtg tggaggtgaa ggccagcatc aattttttgc tataaaaaca 720 gggcaacagg ctgaaccatt agtcgtcgat cttaaagacc tttttcaagt tatctataat 780 gtaaagaaaa aggaagaaga taagaaaaag gttgaagaag ccaacaaagc agaagagaat 840 ggaagtgagg ccctaatgac ccttgatgat caagctaaca aattgaagct gggtgttgac 900 cagatggatt tgtttgggga catgtctaca cctcctgacc taaatagtcc aacagaaagc 960 aaagatatcc tgttagtgga tctaaactct gaaatcgaca ccaatcagaa ctctttaaga 1020 gaaaatccat tcttaacaaa tggagtcacc tcctgttctc tccctcgacc aaagcctcag 1080 gcatccttct tgcctgagaa cgccttttct gccaatctca acttctttcc cacccctaac 1140 cctgatcctt tccgtgatga tccctttgca cagccagacc aatcggcacc ctcttcgttt 1200 gattctctca catctccaga tcagaagaaa gcgagtctga gtagctcgtc tactccacag 1260 agtaaagggc ccctgaacgg tgatactgat tactttggtc agcaatttga ccagctctct 1320 aaccggactg gcaaaccgga agctcaggga ggcccgtggc cctacccaag ttcgcagacc 1380 cagcaagcag tgagaactca aaatggggta tctgaaagag aacagaacgg cttccatatc 1440 aaatcttccc cgaacccttt tgtgggaagc cctcccaaag gactatcggt accgaatggc 1500 gtaaagcagg acttggaaag ttctgtccag tcctcagcac atgactccat agccattatc 1560 ccacctccac aaagtaccaa accaggaaga ggcagaagga ctgctaagtc ttcagcaaac 1620 gacttgcttg cttcagacat ctttgcctca gaacctccag gccagatgtc ccccacagga 1680 caacctgcag tcccgcagtc gaactttctg gatctcttca aaggcaatgc tcctgcccca 1740 gtggggcccc ttgtaggtct aggtacggtc ccagtaacac ccccccaagc aggaccctgg 1800 acgcctgttg tctacagtcc ttcgacaact gtggtcccag gagccataat aagtggccag 1860 cctcccagtt ttggccagcc actcgttttt ggtacaaccc cagcagtaca agtctggaat 1920 cagtctccat catttgcaac cccagcttcc cctccacccc ccacagtttg gtgtcctacc 1980 acatctgtgg cgcccaacgc ttggtcatcc acaagccctc tggggaatcc ttttcagagt 2040 aataatatct ttccacctcc caccatgtcc actcagtcct ctcctcagcc tatgatgtcc 2100 tctgttctgg ccacaccgcc tcaaccacct ccccgaaatg gcccactaaa ggacattccc 2160 agtgacgctt tcactggctt agaccccctt ggggataaag aggtcaagga agtgaaagaa 2220 atgtttaagg acttccagct gcggcagcca cctcttgttc cctcaaggaa gggggagacg 2280 cctccctctg ggacttcaag cgccttctcc agttacttca acaataaagt tggcattcct 2340 caggagcatg tagaccatga tgattttgat gccaatcaac tgttgaacaa gattaacgaa 2400 ccaccaaagc cagccccgag acaaggtgtc ctcttgggta ccaagtctgc tgacaattca 2460 ctcgagaacc ctttctccaa agggttcagc tcatcaaacc cctctgtggt ttctcagcct 2520 gcatcttctg atccccacag gagccctttc ggaaatcctt ttgcctagct tctgaagttg 2580 taatgatgac tatccagatg agcaaaagac tggctttggt caagaatgaa gcagacagcc 2640 agaaacatgt tgacctctgt cctcgctcca gctttgacgt attatctgtt accctatttg 2700 ttttggcctc ttgtacttgt aaaatgcctt tcattttcct gtctaggcta aagctaaact 2760 taaactatgg ctttacgtaa attaagctcc taaactctct agctccaata taaatgaagt 2820 agcttcccta tcaaatcctt gtctgttgtg cccccttgaa acttccagaa tattctccat 2880 tctaccctcc atttgggagg agcggctacc tttaccctta atatcacact gccttgagtc 2940 aatgtccaaa tactcatagc tctcaaagtc atttggggtt cctggtgtgc ggcctaaacc 3000 taaagcatcc tattaatagg gaagtaagac accttgcttc ctatgtccac tcagaaagaa 3060 ttttatttaa taaaatgaaa gcaagactaa cttctcaaat ccacccaagg accattttga 3120 gatggtcgtt tctcagctaa ctgcaccatt taccaatcct gccccaagtg gtgcttacat 3180 ttgacttgaa gaagagaaag agctaactca aaacacaagg cattattcaa agctaataaa 3240 acaatttctc cctggggccc cacattgttt tcattccaga tacgttgcag ctgtttgacc 3300 ctgatgacat tatgccctac attttccttg aagatcctga ttttatttca tgtgattttt 3360 gtttctcaat aaagatgatt attgtgtgca ttactaaaaa ataataaagt ataatttctc 3420 tcattctggt gatctctccc aggacctagg ctgttccatt ttcaatctct tgctggctgt 3480 tttaaatgag aggaaagcat tctttatctc tccctgtctt tctctctttc tctttcagtt 3540 cattttgctc ctgggtttat ataaacagtg cctccctttt accaggaatg gatttttcac 3600 ggggcaaaaa gcattaaatg tttcacagat ctgaagtgca cgcacccact ccagtcattg 3660 ttagtccagg ggctagactt ctggaaggtg caccttcttc attctcccta tggcttgggg 3720 gacttagact gaagtttcat agagcaattt aacacagtag gggaactgga ttctgctcag 3780 cagtgaagga ctgtattctg aaagctaaat gtgactatgc tagacacact gggtccttac 3840 tggatgacta ggcctttatc aagtaactgg aaaactttct tgaagccaca atcatggaca 3900 aatatttggg gttatcattg aaaaatctgc ctgaaatata ttcctcatag ccttggaaac 3960 ctacacagta cattttcatt tccaggcttt ttgttataca gagctgaagg gtttgttcct 4020 gccaagttgt gttttttttt tttagtttat gttgagtatt ttttgtcaat gttatctctt 4080 gacccaaaat gctcaggtcc ttgtgggtgt tagtccaatc ttaccttttg ttggaagaga 4140 atgactgctc aggttttaaa caaggcgcta gccttgtgag cctctgttaa ttagccccaa 4200 gtgatccaag ctgaagtcct gtgggtttct gtttaatgct agtggttaat tatctatgat 4260 atgtgtttct tttttcctgt ctgacttcct actcagtcat tatgaacaga cttgaaatca 4320 tactttaaaa atttcaaata cctgaagatg tgctaaagtg aaggtaactc tttctagata 4380 gtcgagtttt tgaaagtaat gatcagccac acaactgttt tgtatgtact tgtcttcttg 4440 tgcacttttc tgtatgcaaa caaatctata aatttacgca ttcaataaac tggaatg 4497 <210> 6 <211> 488 <212> DNA <213> Mus musculus S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) (S100a9) <400> 6 aacatctgtg actctttagc cttgagcaag aagatggcca acaaagcacc ttctcagatg 60 gagcgcagca taaccaccat catcgacacc ttccatcaat actctaggaa ggaaggacac 120 cctgacaccc tgagcaagaa ggaattcaga caaatggtgg aagcacagtt ggcaaccttt 180 atgaagaaag agaagagaaa tgaagccctc ataaatgaca tcatggagga cctggacaca 240 aaccaggaca atcagctgag ctttgaggag tgtatgatgc tgatggcaaa gttgatcttt 300 gcctgtcatg agaagctgca tgagaacaac ccacgtgggc atggccacag tcatggcaaa 360 ggctgtggga agtaattaag aggtcagcca tgtgactgct gcccaaccaa gtctaaaggg 420 aatggcttac tcaatggcct ttgttctggg aaatgataag ataaataata aataagtctt 480 tatccatt 488

Claims (3)

1. 삭제
2. 유전자의 발현정도를 분석하는 방법에 있어서,

   낭포가 형성된 신장에서 RNA를 추출한 다음, 추출한 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성한 후, 생성된 cDNA를 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 5의 Dab2 유전자를 증폭시킨 후, 증폭된 Dab2 유전자의 발현정도를 분석하는 것으로 구성된,

   낭포형성 확인용 바이오마커 유전자의 발현 정도를 분석하는 방법.
3. 유전자의 발현정도를 분석하는 방법에 있어서,

   낭포가 형성된 신장에서 RNA를 추출한 다음, 추출한 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성한 후, 생성된 cDNA를 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 6의 S100a9 유전자를 증폭시킨 다음, 증폭된 S100a9 유전자의 발현정도를 분석하는 것으로 구성된,

   낭포형성 확인용 바이오마커 유전자의 발현 정도를 분석하는 방법.

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