KR20200038659A - 대식세포 특이적 바이오마커 패널 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

대식세포 특이적 바이오마커 패널 및 상기 패널을 이용한 암의 예후예측 방법에 관한 것으로, 상기 패널은 정상 대조군의 단일세포 전사체를 참조 유전체로 활용하여 종양 관련 대식세포의 성질 분석이 가능하다. 또한, 바이오마커 패널은 종양 관련 대식세포에 특이적인 바이오마커 패널로서, 암의 진단, 예후 예측 및 항암 치료제의 발굴 등에 활용될 수 있다.

Description

대식세포 특이적 바이오마커 패널 및 이의 용도{Macrophage-specific biomarker panel and uses thereof}
대식세포 특이적 바이오마커 패널 및 상기 패널을 이용한 암의 예후예측 방법에 관한 것이다.
거대(bulk) 종양의 유전자 발현 프로파일링은 간질, 면역 및 내피 세포 침윤뿐만 아니라 종양의 혼합을 특징으로 하는 비 종양 구획의 특징을 반영한다. 이러한 혼합물은 종양 미세 환경을 형성하고 종양 발생, 진행 및 치료 저항에 결정적인 역할을 한다. 미세 환경 유전자 발현 시그니처는 본질적인 종양 아형과 독립적으로 예후 가치를 나타낼 수 있다.
종양-관련 대식세포(Tumor-associated macrophage, TAM)는 종종 종양의 진행과 전이를 촉진시킨다. 현재, 종양-관련 대식세포의 예후 및 치료 적용에 대한 많은 연구가 진행 중에 있다. 한편, 대식세포에는 두 가지 주요 하위유형이 있는데, 하나는 전 염증성 특징을 나타내는 고전적인 대식세포(M1형)이고 다른 하나는 면역 억제 표현형을 나타내는 대체 대식세포(M2형)이다. M2형 대식세포의 면역 억제 기능에 기초하여 종양-관련 대식세포 침입(invasion)의 영향을 조사하기 위해 사용되는 일반적인 방법은 M2형 대식세포의 CD163와 M1형 대식세포의 HLA-DR 또는 iNOS와 같은 표준 마커를 검출함으로써 M1/M2 비율과 M2형 대식세포의 비율을 비교하는 것이다. 그러나, 마커 기반 접근법은 분극 수준을 반영하거나 해당 마커를 발현하는 다른 세포를 구별하는데 제한이 있다는 문제점이 있다.
일 양상은 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 바이오마커 패널을 제공하는 것이다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에서 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및 상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 암의 예후 예측 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에서 단일세포 전사체 프로파일을 생성하는 단계; 및 상기 프로파일로부터 차별 발현 유전자(Differentially expressed genes, DEGs)를 추출하는 단계를 포함하는 M2 대식세포 특이적 바이오마커 패널의 구축 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 바이오마커 패널을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 바이오마커 패널은 CCL18, CCL13, CCL23, F13A1, CD302, CD209, SEPP1, MAF, AC006129.4, ACE, AHCY, AP1B1, ARHGAP26, ARRDC4, CCDC152, CCL26, CD200R1, CITED2, COTL1, CR1, DACT1, FCER2, FRMD4A, GGTA1P, ITSN1, MARCH2, MBOAT1, MRC1L1, PLTP, PRKACB, PTGS1, SLA, SLC47A1, STAB1, THBD, TRIB1 및 VSIG4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서 내 용어 "바이오마커 패널"은 폐암 진단을 위한 바이오마커의 임의의 조합을 사용하여 구성된 것으로서, 상기 조합은 전체 세트, 또는 그의 임의의 서브세트 또는 서브조합을 의미할 수 있다. 즉, 바이오마커 패널은 바이오마커 한 세트를 의미할 수 있으며, 측정되는 임의 형태의 바이오마커를 의미할 수 있다. 따라서, CD163가 바이오마커 패널의 일부일 경우, 예를 들어, CD163 mRNA 또는 CD163 단백질이 상기 패널의 일부인 것으로 간주할 수 있다. 개별 바이오마커가 진단제로서 유용한 반면, 때로는 특정 상태를 결정하는데 있어서 단독으로 단일의 바이오마커보다는 바이오마커 조합이 더 큰 값을 제공할 수 있다. 구체적으로, 시료 중 복수 개의 바이오마커를 검출하는 것이 시험의 감도 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 바이오마커 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 바이오마커 유형을 포함할 수 있다. 　다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 최소 개수의 바이오마커로 구성되어 최대량의 정보를 생성한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 바이오마커 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6 개 이상의 바이오마커 유형으로 구성된다. 바이오마커 패널이 "바이오마커 한 세트"로 구성될 경우, 상기 세트를 이루는 것 이외에는 어떤 바이오마커도 존재하지 않는다. 일 구체예에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 1개의 바이오마커로 구성된다. 다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 2개의 바이오마커로 구성된다. 다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 3개의 바이오마커로 구성된다. 다른 구체예에서, 바이오마커 패널은 본원에 개시된 4개 이상의 바이오마커로 구성된다. 본 발명의 바이오마커는 위암 진단에서 통계학상 유의적인 차이를 나타낸다. 일 구체예에서, 이러한 바이오마커를 단독으로, 또는 조합하여 사용하는 진단 시험은 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 및 약 100%의 감도 및 특이성을 나타낸다.
상기 바이오마커는 단일세포 전사체 데이터로부터 획득된 것일 수 있다. 또한, 상기 바이오마커는 대식세포에 특이적으로 발현되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 대식세포는 유사관련 종양 대식세포일 수 있으며, M2형 대식세포일 수 있다. 일 실시예에서는 M2 또는 종양-관련 대식세포에서 M2 특이적 유전자가 단독으로 발현되는 것을 확인하고 이를 M2 특이적 시그니처 유전자로 명명하였다. 반면, M1 특이적 유전자의 발현은 상기 종양-관련 대식세포에서 단독으로 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 대부분의 M2 특이적 시그니처 유전자는 다른 세포 유형과 비교하여 대식세포에서 더 많이 발현되었지만 M1 특이적 시그니처 유전자의 발현 양상은 대식세포와 다른 세포 유형 간에 차이가 없었음을 확인할 수 있었다. 따라서, M2 특이적 시그니처 유전자 패널은 벌크 프로파일에서 대식세포의 M2 표현형을 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 패널은 암을 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 암은 위암일 수 있으며, 예를 들어, 진행성 위암, 전이성 위암 또는 조기 위암일 수 있다.
상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이오마커 유전자의 mRNA 수준을 측정하기 위한 제제일 수 있으며, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이오패널은 적어도 10종의 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 각각의 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드는 각각 CD302, CD209, MS4A6A, MS4A4A, CCL23, CCL18, CCL13, LIPA, SEPP1 및 MAF에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있으며, 예를 들어, 상기 바이오마커 중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이오패널은 적어도 10종의 항체를 포함하며 이 항체들은 각각 CD302, CD209, MS4A6A, MS4A4A, CCL23, CCL18, CCL13, LIPA, SEPP1 및 MAF에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에서 CD302, CD209, MS4A6A, MS4A4A, CCL23, CCL18, CCL13, LIPA, SEPP1 및 MAF로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및 상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 암의 예후 예측 방법을 제공한다. 상기 바이오마커의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 암은 위암일 수 있다. 예를 들어, 상기 위암은 진행성 위암, 전이성 위암 또는 조기 위암일 수 있다. 또한, 상기 패널은 M2 대식세포 특이적인 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 개체로부터 분리된 시료에서 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 바이오마커의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 개체는 암의 진단을 하기 위한 대상이 되며, 예를 들어 암의 가능성을 예측하기 위한 대상, 암의 상태를 진단하기 위한 대상, 예후 예측을 판단하기 위한 대상, 암 예방 또는 치료용 약제의 투여량을 결정하기 위한 대상, 암의 진행에 따른 치료 방법을 결정하기 위한 대상 등을 의미한다. 상기 개체는 척추동물인 것일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 포유동물인 것일 수 있고, 예를 들면 인간(Homo sapiens)일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.
상기 바이오마커 수준의 측정은 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 바이오마커 유전자의 mRNA 수준을 측정하거나 또는 단백질 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 mRNA 수준 측정은 암을 진단하기 위하여 개체의 시료에서 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것이다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있다. 또한, 상기 단백질 수준 측정은 암을 진단하기 위하여 개체의 시료에서 암 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정할 수 있다. 상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 2 이상의 바이오마커가 대조군에 비하여 차별적으로 발현되는 경우, 암의 예후가 불량한 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 2 이상의 바이오마커에 대한 시그니처 수준이 대조군보다 높은 경우, 암의 예후가 불량한 것으로 판단할 수 있다.
본 명세서 내 용어 "시그니처(signature)"는 주어진 진단 테스트에 대한 바이오마커의 사인(sign)으로서, 일련의 마커를 포함하며 각각의 마커는 관심 집단에서 서로 다른 레벨을 가진다. 상기 서로 다른 레벨은 두 개 또는 그 이상의 군에서의 개체에 대한 마커 레벨의 상이한 평균, 또는 두 개 또는 그 이상의 군에서의 상이한 변화, 또는 두 가지 모두의 조합을 의미할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에서 단일세포 전사체 프로파일을 생성하는 단계; 및 상기 프로파일로부터 차별 발현 유전자(Differentially expressed genes, DEGs)를 추출하는 단계를 포함하는 M2 대식세포 특이적 바이오마커 패널의 구축 방법을 제공한다. 상기 바이오마커 패널의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 일 실시예에서, M1 및 M2 형 대식세포에 대한 정확한 프로파일을 만들기 위해, in vitro에서 혈액 유래 단핵 세포로부터 분화된 M1 및 M2 세포의 단일세포 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 이러한 단일세포 전사체를 비교하여 M2 특이적 바이오마커 패널을 구성하여 TAM의 M2 표현형을 평가함으로써 벌크(bulk) 종양 샘플의 예후를 예측할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 개체로부터 분리된 시료에서 단일세포 전사체 프로파일을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 단일세포는 말초혈액 단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cell)로부터 분리된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 프로파일로부터 차별 발현 유전자를 추출하는 단계를 포함한다. 상기 추출된 유전자 중 2 이상의 개체에서 중첩되는 유전자를 추가로 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 차별 발현 유전자 추출은 EdgeR 및 DESeq2를 사용하여 추출할 수 있다. 또한, 상기 차별 발현 유전자가 2 이상 반복적으로 추출되는 경우, 대식세포 특이적 유전자인 것으로 판단할 수 있다. 상기 방법은 종양의 전사체 이질성의 수준과 종양 및 미세환경 유전자 발현의 정확한 특성을 파악함으로써 암의 예후와 치료를 위한 더 나은 분자 표적을 확인하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 단일세포 RNA-시퀀싱을 이용하여 종양 침윤 면역 세포의 특성을 규명함으로써 면역 억제를 극복하고 자발적 면역 감시를 활성화하기 위한 더 나은 전략을 제공할 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 구축된 바이오마커 패널을 제공한다. 상기 바이오마커 패널은 M1 대식세포 특이적 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 M1 대식세포 특이적 유전자는 CCR7, IL15RA, CXCL11, CXCL10, CXCL9, CCL5, CCL15, TNFSF10, BIRC3, SLC2A6, SLC31A2, IDO1, PSME3, PSMB9, APOL3, APOL1, APOL2, APOL6, IRF1 또는 이의 조합일 수 있다. 또한 상기 바이오마커 패널은 M2 대식세포 특이적 유전자를 포함할 수 있다. 상기 바이오마커 패널은 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2, LIPA또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 또한, CCL18, CCL13, CCL23, F13A1, CD302, CD209, SEPP1, MAF, AC006129.4, ACE, AHCY, AP1B1, ARHGAP26, ARRDC4, CCDC152, CCL26, CD200R1, CITED2, COTL1, CR1, DACT1, FCER2, FRMD4A, GGTA1P, ITSN1, MARCH2, MBOAT1, MRC1L1, PLTP, PRKACB, PTGS1, SLA, SLC47A1, STAB1, THBD, TRIB1, VSIG4 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 바이오마커 패널은 종양-관련 대식세포의 표현형을 평가할 수 있다. 예를 들어, 종양-관련 대식세포에서 특이적으로 발현되는 유전자가 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA또는 이의 조합일 경우, 상기 대식세포의 표현형이 M2 형인 것으로 판단할 수 있다.
일 양상에 패널은 정상 대조군의 단일세포 전사체를 참조 유전체로 활용하여 종양 관련 대식세포의 성질 분석이 가능한 바이오마커 패널로서, 종양 관련 대식세포에 특이적이므로 암의 진단, 예후 예측 및 항암 치료제의 발굴 등에 활용될 수 있다.
도 1은 정상 PBMC에서 유래된 M1 및 M2 대식세포의 단일 세포 전사체의 구축을 나타내는 그림이다.
도 2는 M1 및 M2 단일 세포 전사체에서 시그니처 유전자 추출을 나타내는 그림이다.
도 3은 단일 세포 수준에서 TAM의 M2 표현형을 평가한 그래프이다.
도 4는 M1 및 M2 특이 유전자의 독점(Exclusiveness)을 나타낸 그림이다.
도 5는 위암의 전체 생존율에서 M2 특이적 바이오 마커 패널의 예측력을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. M1 및 M2 단일세포 전사체 프로파일의 생성
1-1. 건강한 공여자 표본 준비
삼성 의료원의 기관검토위원회(Review Board of Samsung Medical Center)의 승인을 받아 수행하였다. 또한, 모든 공여자는 표본 수집에 대한 정보에 근거한 동의서 및 유래된 유전 물질의 상세한 분석을 제공하였다.
Ficoll-PaqueTM를 사용하여 2명의 건강한 공여자의 전혈 샘플로부터 신선한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. MACS human CD14 MicroBeads (130-050-201, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany), Pre-Separation Filters (130-041-407, Miltenyi), 및 LS columns (130-041-401, Miltenyi)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 CD14+ 단핵구를 분리하였다. M0 대식세포를 유도하기 위하여, 분리된 CD14+ 단핵구를 FBS가 코팅된 24-웰 플레이트에 1x 105 세포/㎝2의 밀도로 접종하였다. 종자 세포(seeded cell)를 20% FBS 및 100 ng/㎖ M-CSF (574802, Biolegend, San Diego, CA, USA)가 공급된 RPMI1640 배지에서 7일 동안 배양하였다. 7일째에, M-CSF 함유 배지를 제거하고, M1에 대해 LPS (L4524, Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ng/㎖ 및 IFN-γ (570202, Biolegend) 20ng/㎖; 및 M2에 대해 IL-4 (574002, Biolegend) 20ng/㎖ 및 IL-10 (571002, Biolegend) 20ng/㎖을 갖는 적절한 자극 배지(stimulating media)를 공급하였다. 48시간 동안 추가 배양한 후, 세포를 부드러운 스크래퍼(scraper)로 수거하였다.
이후, FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석을 위해 세포의 일부를 PE / Cy7 항 인간 CD14 항체 (325618, Biolegend), FITC 항 인간 CD80 항체 (305206, Biolegend) 및 PE 항 인간 CD163 항체 (333606, Biolegend)로 삼중 염색하였다. 도 1b는 대식세포 마커의 발현 수준을 FACS 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 단핵구의 경우 흑색, M1 대식세포의 경우 파란색, M2 대식세포의 경우 빨간색을 나타낸다. 도 1b에 나타난 바와 같이, M1 특이적 마커인 CD80은 M1 극성 대식세포에서만 발현되는 것을 확인할 수 있었고, M2 특이적 마커인 CD163은 M1에서보다 M2 극성 대식세포에서 더 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 단일세포 분리(isolation) 및 cDNA 증폭
상기 실시예 1-1에서 준비한 총 50,000개의 세포를 C1TM 단일 세포 자동 준비 시스템 (100-5760, Fluidigm, San Francisco, CA, USA)에서 개별적으로 통합된 유체 회로 mRNA 시퀀싱 칩에 로딩하였다. 적용된 칩 유형은 각 샘플의 크기 분포 및 평균 세포 크기에 의해 결정된다. 단일세포 로딩을 확인하기 위해 현미경으로 적재된 칩을 검사하였다. 제조사의 지시에 따라 SMARTer Ultra Low RNA Kit (634936, Clontech, Mountain View, CA, USA)을 사용하여 세포 용해, cDNA 합성 및 증폭을 하였다.
Qubit® 2.0 형광 측정기 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)와 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 증폭된 cDNA를 정량하고 검정하였다. 이후, 성공적으로 증폭된 단일세포 cDNA (M1 97개, M2 45개, 진행성 위암 cDNA 180개)를 각각 RNA 염기 서열 분석에 사용하였다. RNeasy Plus Micro 키트 (74034, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 풀링(pooled)된 세포 (~ 1 Х 105 세포) 또는 종양 조직에서 벌크 RNA를 추출하고 단일세포에서 사용된 것과 동일한 조건으로 SMARTer Ultra Low RNA Kit로 10 ng의 total RNA를 증폭하였다.
1-3. RNA-시퀀싱 및 데이터 처리
증폭된 cDNA를 사용하여 Nextera XT DNA 샘플 준비 키트 (FC-131-1024, Illumina)로 시퀀싱 라이브러리를 제작하였으며 TruSeq Rapid PE 클러스터 키트의 100-bp 쌍 모드에서 HiSeq2500 시스템을 사용하여 시퀀싱하였다. 어레이 컨트롤 RNA 스파이크-인(spike-in)의 발현값을 평가하기 위해, 인간 게놈 참조 서열 (hg19)과 GENCODE 19 주석으로 3개의 대조군 RNA 스파이크-인 (ThermoFisher)을 병합하여 참조 서열 및 상응하는 주석을 생성하였다. STAR_2.4.0b (기본 매개 변수)의 2-패스 모드를 사용하여 참조 서열에 정렬함으로써 RNA를 판독하였다. 또한, RSEM v1.2.17 (기본 매개 변수)을 사용하여 백만 분의 1 (transcript per million, TPM) 당 전사체로 상대적 유전자 발현을 정량화하였다. 각각의 유전자에 대한 이소폼(isoform) 발현 수준을 합하여 TPM 값을 도출하였다. RNA-SeQC를 사용하여 정렬된 단일 세포 RNA-seq 판독의 품질 관리를 평가하였다. 낮은 품질의 서열화 값을 갖는 세포를 제거하기 위해, 다음과 같이 4 개의 필터링 기준을 적용하였다; 1) 총 판독 횟수, 2) 맵핑(mapping) 속도, 3) 검출된 유전자의 수, 및 4) 유전자간 부위의 비율.
도 1c는 건강한 공여자 대식세포의 단일세포 전사체 데이터를 PCA를 통해 군집 분석한 결과이다. 도 1c에 나타난 바와 같이, 세포들은 M1 또는 M2 성질에 의해 구분되었고(PC1) 각 객체에 의한 차이도 M1 및 M2 구분에 크게 작용하는 것을 확인할 수 있었다(PC2).
도 1d는 단일세포에서 대식세포 마커의 유전자 발현 수준을 나타내는 것으로서, 표현 수준은 log2(TPM/10+1)를 사용하여 계산하였으며 굵은 검은 선은 중간 값을 나타낸다. 도 1d에 나타난 바와 같이, 대식세포의 일반적인 마커의 RNA 발현 수준은 M1 세포에서 CD80의 발현이 높고, M2 세포에서는 CD163의 발현이 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, M1 및 M2 세포가 적절히 분화되었음을 알 수 있다.
실시예 2. M1 및 M2 특이적 시그니처 유전자 패널의 제작
다양한 상태의 대식세포 유전자 발현 프로파일이 마이크로 어레이 기반의 데이터에 의해 확립되었고 M1과 M2 개체군 사이에 차별 발현 유전자 (the differentially expressed genes, DEG)가 공지된 바 있다. 단일 세포 분해능으로 M1과 M2의 신뢰할 수 있는 차별 발현 유전자를 반복적으로 추출하여 M1형 또는 M2형 대식세포 시그니처 유전자 패널을 구축하였다. 먼저, 도 2a에 나타난 바와 같이, 2명의 건강한 공여자에 대해 두 가지 다른 방법으로 도출한 유전자 중 중첩된 차별 발현 유전자를 먼저 선택하고(좌), 이후 각 공여자로부터 교차된 M1 또는 M2 유전자를 선택하였다(우). 구체적으로, 단일 세포 전사체 데이터에 적합한 알고리즘을 제공하는 R 패키지인 'edgeR'및 'DESeq2' 를 사용하여 M1 및 M2 세포의 RSEM에서 예상되는 카운트를 LRT로 비교하여 단일 세포 데이터에서 차별 발현 유전자를 추출하였다. EdgeR을 사용할 때는 TMM 정규화를 수행한 후, LRT 테스트를 진행하였다. log10 (배수-변화)> 2 및 p-값 <0.05 인 유전자를 각 방법으로 얻은 후, 중첩된 유전자를 각 공여자에서 신뢰할 수 있는 차별 발현 유전자로 간주하였다. 그 다음, 각 공여자로부터 유래된 차이를 고려하여, 반복적으로 추출된 유전자를 M1 세포 특이적(155개) 및 M2 세포 특이적 표지 유전자(43개)로서 최종적으로 선택하였다. 이후, M1에 대한 155개의 유전자 및 M2에 대한 43개의 유전자를 시그니처 유전자 패널로서 추가 분석에 사용하였다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 벌크 프로파일링에서 공지된 차별 발현 유전자 세트와 비교하여, M1 특이적 유전자에서 19개(54개의 유전자 중 19개)와 M2 특이적 유전자에서 10개(43개의 유전자 중 10개)의 유전자만이 단일 세포 프로파일에서 차별 발현 유전자로서 일관되게 반복적으로 검출되었다. 즉, 상기 29개의 유전자의 차별적인 발현을 지속적으로 관찰하면 벌크 및 단일 세포 수준에서 새로운 마커를 제공할 수 있다.
실시예 3. 종양 유형에 따른 종양-관련 대식세포의 이질적 분극 수준 확인
많은 연구에서 M2 유사 종양-관련 대식세포와 낮은 생존율 사이에 높은 상관 관계가 있음이 입증되었으며, 대장암(colorectal cancer, CRC)과 같은 일부 종양 유형에서는 반대의 결과가 보고되었다. 따라서, 수집된 단일세포 데이터를 이용하여 진행성 위암 (advanced gastric cancer, AGC), 유방암 (breast cancer, BC) 및 대장암의 세 가지 종양 유형에서 종양-관련 대식세포의 M2 유사 분극 수준을 비교하였다. 다수의 종양-관련 대식세포를 조사하기 위해 진행성 위암 환자의 전이 샘플에서 진행성 위암의 단일 세포 종양-관련 대식세포를 새로 수집하였다. 구체적으로, 진행성 위암(advanced gastric cancer, AGC)으로 진단받은 5명의 환자 중 4명의 복수(Peritoneal ascites) 및 1명의 뇌척수액 (AGC04CSF)을 치료 목적으로 수집하였다. 진행성 위암에서 추출한 총 5개의 샘플을 단일세포 RNA 시퀀싱에 사용하였다. 진행성 위암 환자의 복수 또는 뇌척수액의 세포를 원심 분리하여 수집하였다. Ficoll-PaqueTM PLUS (17-1440-02, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 분리에 의해 죽은 세포를 제거하였다.
이후, M1- 또는 M2-형 대식세포 및 M1- 또는 M2- 시그니처 패널에 대한 기준 전사체를 사용하여 종양-관련 대식세포의 M2-성(M2-ness)을 평가하였다. 각 세포의 M1- 또는 M2- 시그니처 스코어는 패널 유전자의 발현 수준을 평균값을 취하여 계산하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 세 가지 종양 유형의 종양-관련 대식세포는 M1 및 M2 시그니처를 동시에 발현하였다. 그러나, 각 종양-관련 대식세포는 이질적(heterogeneous)인 정도의 시그니처 스코어를 나타냈으며 즉, 분극 수준이 이질적이었으며 M1 및 M2 시그니처가 서로 비슷한 수준으로 발현하여 중간 수준의 M2-성을 나타냈다. 상기 실시예 2에서 제작한 패널을 사용할 경우(도 3a), 종양-관련 대식세포에서 M2-분극의 이질적 수준이 벌크-발현 프로파일링(도 3b) 또는 큐레이션(도 3c)에 의해 구축된 시그니처 유전자 패널 사용할 경우보다 명확하게 관찰되었다. 일반적으로 유방암과 대장암의 종양-관련 대식세포는 거의 M1-성과 M2-성이 유사한 중간의 표현형을 나타내지만, 대부분의 진행성 위암의 종양-관련 대식세포는 M2-성이 M-1성에 비해 상대적으로 높은 M2-편향된 극성의 대식세포이다. 따라서, 전이성 복수(metastatic ascites)에서 진행성 위암의 종앙-관련 대식세포의 M2-편향된 표현형은 복강 대식세포의 잘 알려진 M2 성향과 일치함을 알 수 있다.
실시예 4. M2 특이적 바이오마커 패널을 이용한 생존율 예측
M1 또는 M2 시그니처 유전자 패널을 사용하여 벌크 프로파일에서 종양-관련 대식세포의 특성을 평가할 때, 대식세포를 제외한 다른 세포 유형의 신호를 고려해야 한다. 시그니처 유전자가 대식세포에서만 독점적으로 발현되는지 여부를 시험하기 위해, 3가지 종양 유형(대장암, 유방암, 진행성 위암)에 대하여 종양 세포, 대식세포, 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL) 및 간질 세포(stormal cell)의 단일 세포 전사체 프로파일을 비교하였다. 유방암과 대장암의 세포 유형은 이전 연구에서 정의된 바와 같이 결정되었다. Chung et al.에서 기술된 바와 같이 유추된 카피 수 변화 패턴 및 표준 마커 발현에 의해 새로 수집된 진행성 위암 세포의 세포 유형을 동정하였다.
도 4는 M1 및 M2 특이 유전자의 독점(Exclusiveness)을 나타낸 그림이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 3가지 종양 유형 및 정상적인 대식세포의 각 세포 유형의 평균 발현 값은 정상 M2 또는 종양-관련 대식세포에서 M2 특이적 유전자가 단독으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, M1 특이적 유전자의 발현은 단독으로 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 대부분의 M2 특이적 시그니처 유전자는 다른 세포 유형과 비교하여 대식세포에서 더 많이 발현되었지만 M1 특이적 시그니처 유전자의 발현 양상은 대식세포와 다른 세포 유형 간에 차이가 없었음을 확인할 수 있었다. 따라서, M2 특이적 시그니처 유전자 패널은 벌크 프로파일에서 대식세포의 M2 표현형을 평가하는데 사용될 수 있다.
위암 환자에서 M2 특이적 바이오 마커 패널의 예후 가치를 평가하는 추가 분석을 수행하였다. Cancer Genome Atlas (TCGA, 2017년 갱신)로부터 TCGA 위암 (STAD)의 발현 데이터 (RNA sequencing, level 3)를 획득하여 병리학적 단계 및 생존 정보에 관한 임상 정보를 가진 378개의 표본만을 추후 분석에 사용하였다. log2(TPM/10+1)에 의해 각 유전자의 발현 수준을 계산하였다. 구체적으로, 이상점(outlier)의 영향을 현저하게 줄이고 주목할만한 기능에 초점을 맞추기 위해 Tirosh et al.와 같이, log2 변환 전에 TPM 값을 10으로 나누었다. 종양 세포와 비 종양 세포를 확인하기 위해 RNA-seq 데이터에서 유전자 복제를 추정한 후, 추가 분석에서 1,000개 미만의 유전자를 발현한 18개의 세포를 제거하였다. 이후, 전사체 분석을 위해 매회 10개 이상의 세포에서 발현된 log2(TPM/10+1)>1의 유전자만 사용하였다. 또한, 시그니처 유전자에 대한 log2(TPM/10+1)의 평균값으로 시그니처 수준을 계산하였다. 25번째 및 75번째 백분위 수에 의해 Kaplan-Meier 분석을 위한 '상위' 그룹과 '하위' 그룹을 결정하였다. R 패키지 'OIsurv'에서 Kaplan-Meier 공식을 사용하여 생존 곡선과 유의성을 추정하였다.
종양 진행에 대한 M1 및 M2 대식세포의 반대 작용에 대한 일반적인 아이디어를 고려하여 M1 및 M2 시그니처를 반영하는 인자(M2 시그니처 - M1 시그니처)를 평가하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, M2 특이적 바이오 마커 패널을 사용하여 계산된 M2 시그니처가 높은 상위 그룹은 하위 그룹보다 위 선암 (TCGA STAD, n=378)에서의 예후가 불량함을 확인할 수 있었다. 반면, 대식세포의 일반적인 마커 CD68 및 CD163의 발현이나 M1 시그니처가 높은 상위 그룹은 하위 그룹과 비교하여 예후의 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, CD68 및 CD163과 같은 대식세포의 두 개의 표준 마커 및 M1 시그니처는 위암의 전반적인 생존율 예측에 부적합함을 알 수 있다.

Claims (18)

  1. CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 바이오마커 패널.
  2. 청구항 1에 있어서, CCL18, CCL13, CCL23, F13A1, CD302, CD209, SEPP1 및 MAF로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함하는 것인 바이오마커 패널.
  3. 청구항 1에 있어서, AC006129.4, ACE, AHCY, AP1B1, ARHGAP26, ARRDC4, CCDC152, CCL26, CD200R1, CITED2, COTL1, CR1, DACT1, FCER2, FRMD4A, GGTA1P, ITSN1, MARCH2, MBOAT1, MRC1L1, PLTP, PRKACB, PTGS1, SLA, SLC47A1, STAB1, THBD, TRIB1 및 VSIG4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함하는 것인 바이오마커 패널.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오마커는 단일세포 전사체 데이터로부터 획득된 것인 바이오마커 패널.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오마커는 대식세포에서 특이적으로 발현되는 것인 바이오마커 패널.
  6. 청구항 1에 있어서, 암을 진단하기 위한 것인 바이오마커 패널.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 수준을 측정하는 제제는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것인 바이오마커 패널.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 수준을 측정하는 제제는 항체인 것인 바이오마커 패널.
  9. 개체로부터 분리된 시료에서 CD163, MS4A4A, MS4A6A, S100A4, DAB2 및 LIPA로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이오마커 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 바이오마커 수준을 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 암의 예후 예측 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, CCL18, CCL13, CCL23, F13A1, CD302, CD209, SEPP1 및 MAF로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, CCL18, CCL13, CCL23, F13A1, CD302, CD209, SEPP1 및 MAF로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, AC006129.4, ACE, AHCY, AP1B1, ARHGAP26, ARRDC4, CCDC152, CCL26, CD200R1, CITED2, COTL1, CR1, DACT1, FCER2, FRMD4A, GGTA1P, ITSN1, MARCH2, MBOAT1, MRC1L1, PLTP, PRKACB, PTGS1, SLA, SLC47A1, STAB1, THBD, TRIB1 및 VSIG4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 2 이상의 바이오마커가 대조군에 비하여 차별적으로 발현되는 경우, 예후가 불량한 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 2 이상의 바이오마커에 대한 시그니처 수준이 대조군 보다 높은 경우, 예후가 불량한 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 암은 위암인 것인 방법.
  16. 개체로부터 분리된 시료에서 단일세포 전사체 프로파일을 생성하는 단계; 및
    상기 프로파일로부터 차별 발현 유전자(Differentially expressed genes, DEGs)를 추출하는 단계를 포함하는 M2 대식세포 특이적 바이오마커 패널의 구축 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 2 이상의 개체에서 중첩되는 차별 발현 유전자를 추가로 추출하는 것인 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 차별 발현 유전자가 2 이상 반복적으로 추출되는 경우, M2 대식세포 특이적 유전자인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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