KR20210144353A - 단일세포 전사체 분석에 기반한 대장암의 예후 예측 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암의 예후를 예측할 수 있는 바이오마커에 관한 것으로, 대장암 조직 내의 특정 대식세포에서 CD68 대비 SPP1의 발현 수준을 측정하면 대장암의 예후를 예측할 수 있다.

Description

단일세포 전사체 분석에 기반한 대장암의 예후 예측 방법{Method for Predicting Colorectal Cancer Prognosis Based on Single Cell Transcriptome Analysis}

본 발명은 대장암 조직의 대식세포 전사체 데이터 분석에 기반한 대장암의 예후 예측 방법에 관한 것이다.

암세포는 종양의 성장을 도와주는 다양한 인자, 세포 등이 존재하는 환경에서 성장하며, 이를 암 미세환경이라고 한다. 이들 세포 중에서 종양-특이적 대식세포 (Tumor-associated macrophage, TAM)는 종종 종양의 진행과 전이를 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 현재 종양-특이적 대식세포를 암의 예후 및 치료에 적용하려는 연구가 진행되고 있다. 종양-특이적 대식세포를 연구하는 기술 중의 하나로 단일세포 전사체 분석(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)이 있다.

단일세포 전사체 분석은 다양한 세포를 포함하는 샘플에서 1개의 세포를 분리해 전사체를 분석하는 기술이며, 다양한 세포를 포함하는 샘플에서 RNA 발현 수준의 평균값을 분석하는 기존의 방법과 비교하여 개별 세포의 RNA 발현 양상을 확인할 수 있으므로 개별 세포의 이질성을 확인하는 데 유용한 기술이다.

본 발명자들은 대장암 조직 내의 단일세포 전사체 데이터를 기반으로 특정 대식세포에서 발현 수준이 변화하는 유전자를 발굴하였고, 상기 유전자가 대장암의 예후 예측에 활용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 국내 공개 특허 제10-2020-0037640호 2. 국내 공개 특허 제10-2020-0038659호

1. Nat Med. 2015 Nov;21(11):1350-6. (2015.10.12)

본 발명의 목적은 SPP1 (secreted phosphoprotein 1)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암의 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 SPP1의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암의 예후 예측용 조성물을 제공한다

본 명세서에 사용된 용어, "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함한다. 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약물 저항성 등의 병의 진행 또는 사망률(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.

예를 들어, 본 발명에서 대장암 환자의 예후가 불량하다는 것은 대장암 세포의 전이가 발생할 수 있고, 대장암 치료제에 대한 내성이 발생할 수 있으며, 대장암 발병 또는 진단 후에 환자가 조기에 사망할 수 있음을 의미한다(도 4).

본 명세서에 사용된 용어, "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 대장암으로 진단받은 환자의 병의 경과(생존 기간, 병의 진행, 개선, 대장암의 재발, 종양 성장, 약물 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명에서, 상기 SPP1 유전자는 오스테오폰틴(osteopontin)으로도 불리우며, 세포외 구조 단백질(extracellular structural protein)의 일종으로 이름에서 알 수 있듯이 뼈에서 많이 발현되나, 다른 조직에서도 발현된다.

본 발명에서, "SPP1의 발현 수준"이란 SPP1 유전자에서 발현된 mRNA 또는 단백질 수준을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 SPP1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 SPP1에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer); 또는 상기 SPP1의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 화합물일 수 있다.

예를 들어, SPP1 단백질의 수준을 측정하고자 할 때에는 SPP1 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 항체, 항체 결합 단편 등을 이용할 수 있고, SPP1의 mRNA 수준을 측정할 때에는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 SPP1의 발현 수준은 대상체(대장암 환자)에서 분리된 대장암 조직에서 측정될 수 있으며, 대장암 조직에서 분리한 대식세포에서 측정하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 대장암 조직에 포함된 대식세포들을 단일세포 전사체 데이터에 기반하여 분류하였다. 그 결과, 대장암 조직 내의 특정 대식세포 그룹에서 SPP1 유전자의 발현 수준이 높고(도 2), 이러한 경향이 대장암의 불량한 예후와 관련이 있음을 확인하였다(도 4). 정상 조직 내의 대식세포는 SPP1 유전자를 거의 발현하지 않은 반면, 대장암 조직 내의 특정 대식세포는 높은 수준으로 SPP1 유전자를 발현하면서 염증 반응 유도 유전자를 발현하거나(도 2의 클러스터 3 및 7) 또는 염증 반응 저해 유전자를 발현하였다(도 2에서 클러스터 0 및 2).

본 발명의 다른 향상은 하기 단계를 포함하는 대장암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:

(a) 대상체에서 분리된 대장암 조직에서 SPP1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 SPP1의 발현 수준을 동일한 대장암 조직에서 측정한 CD68의 발현 수준과 비교하는 단계.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 (c) 상기 CD68의 발현 수준 대비 SPP1의 발현 수준이 높으면 대장암의 예후가 불량한 것으로 판단하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명자들은 대장암 조직 내의 특정 대식세포 그룹에서 SPP1의 발현 수준이 높고(도 2), 상기 대식세포 그룹에서 SPP1의 발현 수준이 CD68보다 높으면 대장암 진단 후의 생존 기간이 유의미하게 감소하여 대장암의 예후가 불량한 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

본 발명의 일 예에 따라, 대장암 조직 내의 특정 대식세포에서 SPP1 유전자의 발현 수준을 측정하면 대장암의 예후를 예측할 수 있다.

도 1은 대장암 조직, 대장암 조직 주변의 정상 조직에서 조직 내 대식세포를 세포 유형에 따라 분류하여 대식세포 클러스터를 표시한 결과이다.
도 2는 도 1의 대식세포 클러스터에서 전-염증성 유전자(Pro-infla), 항-염증성(Anti-infla), SPP1(SPP1+), 기질세포 특이적 유전자(cDC) 및 세포 주기 관련 유전자(Cell cycle)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 대장암 조직 내의 대식세포 전사체 데이터에서 CD68 대비 SPP1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 대장암 조직 내의 대식세포 전사체 데이터에서 확인한 CD68 대비 SPP1의 발현 수준과 대장암 진단 후 생존 가능성과의 연관성을 확인한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 대장암 조직 내 대식세포 특이적 마커 발굴

종양 미세환경(microenvironment)에 존재하는 세포들이 종양의 성장 촉진 및 저해와 연관성이 있다는 사실은 종양 연구분야에서 이미 잘 알려져 있으며, 종양 특이적 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM)는 종양의 성장에 영향을 미치는 중요한 세포이다. 단일세포 시퀀싱을 통해 종양 미세환경에 존재하는 세포들에 대한 전사체 프로파일링이 가능하며, 본 발명자들은 대장암 종양조직 내 미세환경에 존재하는 대식세포들의 전사체를 프로파일링하였다.

삼성서울병원 기관검토위원회(Review Board of Samsung Medical Center)의 승인을 받아 병원에 내원한 대장암 환자 23명으로부터 종양 조직과 종양 근처의 정상 조직 샘플을 대상으로 조직 내 대식세포에 대한 단일세포 전사체 데이터를 획득하였다. 상기 전사체 데이터는 전사체에서 3’쪽에 있는 100 bp만 읽은 데이터 (3’single-cell RNA-seq)이며, 각 샘플당 약 3000여 개 세포에 대한 전사체 데이터를 확보하였다. 차원 축소 분석으로 60,000여개의 세포를 비슷한 세포 유형으로 그룹화하고, 대식세포에서 주로 발현하는 마커 유전자인 CD14, CD68 및 CD86의 발현 수준을 확인한 결과 대식세포만 선별이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

대식세포의 선별 후, 대식세포의 하위 세포 유형을 구분하기 위해 동일하게 차원 축소를 통해 비슷한 하위 세포군으로 다시 묶은 결과, 총 12개의 그룹으로 세포들을 묶을 수 있었다(도 1). 각 그룹별 마커 유전자를 확인한 결과 클러스터 1, 3, 4 및 10은 염증 유발 대식세포(pro-inflammatory macrophages)이고, 클러스터 11은 활발하게 증식하는 대식세포 (proliferating macrophages)이며, 클러스터 6은 수지상세포(conventional dendritic cells, CDC)인 것을 알 수 있었다. 이후 나머지 그룹의 하위 세포 유형을 구분하기 위해서 각 그룹별 특이적인 유전자들을 확인하였다.

그 결과, 대식세포의 특정 하위 유형(클러스터 0, 2, 3, 7 및 9)에서 많이 발현되는 SPP1 유전자를 발굴하였다. SPP1 유전자가 대장암 조직 내의 특정 대식세포에서만 특이적으로 발현하는 유전자인지 확인하기 위해 대장암 조직과 정상 조직의 단일세포 데이터에서 종양 세포, 상피 세포, 대식세포, T 림프구, B 림프구 및 수지상세포의 SPP1 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 확인 결과 SPP1 유전자는 종양 조직 내의 특정 대식세포에서만 특이적으로 발현 수준이 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

도 1에서 0 내지 11의 숫자는 대식세포 클러스터를 나타낸다.

도 2에서 도면 상단의 signature score는 해당 대식세포 클러스터가 염증을 유도하는지 또는 저해하는지 여부에 대한 스코어를 계산한 것이다. 염증 유도에 대한 스코어는 IL1BIL6, S100A8 및 S100A9 유전자의 평균 발현값이며, 염증 억제에 대한 스코어는 CD163, SEPP1, APOE 및 MAF 유전자의 평균 발현값이다.

또한, 도 2에서 CMS (Consensus Molecular Subtype)는 대장암의 분자적 특성을 설명하는 지표 중의 하나로 전장 전사체 데이터(WTS)를 이용해 확인할 수 있다 (비특허문헌 1): CMS 1은 MSI-H 샘플이 주를 이루고, 면역 반응이 활성화된 세포들로 주로 구성된 대장암 조직; CMS 2는 Wnt-signaling이 활성화된 대장암 조직; CMS 3은 KRAS 돌연변이가 주를 이루는 대장암 조직; 및 CMS 4는 TGF-beta 시그널링 또는 혈관 형성에 관련한 유전자의 발현이 활발한 대장암 조직.

실시예 2: SPP1 유전자의 대장암 예후 예측 활용 가능성 확인

상기 실시예 1에서 발굴한 SPP1 유전자의 발현 수준이 대장암의 예후 예측에 활용될 수 있는지 확인하였다.

임상 정보가 포함된 공공 데이터인 암유전체지도(The Cancer Genome Atlas; 이하, TCGA로 기재함)로부터 대장암 조직의 RNA-seq 데이터를 다운로드하고, 조직 내의 대식세포에서 SPP1의 발현 수준을 확인하였다. 이후 SPP1의 발현 수준과 대장암의 예후와의 연관성을 확인하기 대부분의 종양 대식세포에서 발현되는 CD68의 발현 수준 대비 SPP1의 발현 수준이 높은 그룹과 낮은 그룹으로 구분하였다(도 3).

두 그룹 간의 생존 분석을 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 곡선 분석과 로그 순위법 (log-rank test)으로 수행한 결과, SPP1의 발현 수준과 대장암의 예후가 유의미한 수준에서 연관성이 있는 것을 알 수 있었다. 구체적으로 대식세포에서 CD68의 발현 수준 대비 SPP1의 발현 수준이 낮으면 대장암 진단 후 생존 가능성(생존 기간)이 유의미하게 감소하는 것을 알 수 있었다 (p=0.003; 도 4).

지금까지의 실험 결과를 통하여 대장암 조직 내의 대식세포 중에서 특정 하위 그룹에서만 높은 수준으로 발현되는 SPP1을 대장암의 예후 예측용 바이오마커로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (7)

1. SPP1 (secreted phosphoprotein 1)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암의 예후 예측용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 SPP1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 SPP1에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer); 또는 상기 SPP1의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 화합물;인 것인, 대장암의 예후 예측용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 SPP1의 발현 수준은 대상체에서 분리된 대장암 조직에서 측정되는 것인, 대장암의 예후 예측용 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 대장암 조직은 대장암 조직에서 분리한 대식세포인 것인, 대장암의 예후 예측용 조성물.
   
5. (a) 대상체에서 분리된 대장암 조직에서 SPP1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 SPP1 유전자의 발현 수준을 동일한 대장암 조직에서 측정한 CD68의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 대장암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 CD68의 발현 수준 대비 SPP1의 발현 수준이 높으면 대장암의 예후가 불량한 것으로 판단하는 단계;를 추가로 포함하는 것인, 대장암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 대장암 조직은 대장암 조직에서 분리한 대식세포인 것인, 대장암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.

Images