CN108893540A - circRNA_14707及其在分子辅助育种中应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及circRNA_14707及其在分子辅助育种中应用。本发明对大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织中circRNA表达情况进行高通量测序并结合实验室之前的miRNA和mRNA进行整合分析，结果显示，circRNA_14707及其相关的miRNA两组中差异表达均非常明显，可作为猪皮下脂肪含量检测的分子标志物，在预测或辅助预测猪肉品质、选育具有不同肌肉品质猪等领域具有很好的应用前景。

Description

circRNA_14707及其在分子辅助育种中应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及circRNA_14707及其在分子辅助育种中应用。

背景技术

circRNA是一类由特殊选择性剪切产生的环形内源性分子，呈共价闭合的环形结构，普遍存在于动植物组织和细胞中，含量丰富，且具有稳定性，保守性和组织特异性。研究已证实circRNA参与动物经济性状调控。Liang等在贵州迷你猪骨骼肌组织鉴定得到149circRNAs，参与肌肉发育、肌肉收缩、染色质修饰等生物学过程，揭示circRNA参与肌肉发育和肌肉收缩调控。但是，circRNA是否参与脂肪沉积与代谢，仍不清楚。

随着生物技术的迅速发展，利用高通量测序等先进生物技术和信息技术手段，建立起了常规育种与分子育种相结合的平台，使育种工作实现了由经验向科学的根本性转变，大幅度的提高了育种效率。大白猪，作为典型的瘦肉型猪，有较低的皮下脂肪含量。而莱芜猪肉色鲜红，优质优良，持水性良好，脂肪含量可高达10.32％。二者在脂肪沉积方面的显著差异为脂肪代谢的机制研究提供了良好模型。

本发明对大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织中circRNA表达情况进行高通量测序并结合实验室之前的miRNA和mRNA进行整合分析，结果显示，circRNA_14707通过与相应miRNA结合在脂肪沉积和脂质代谢中发挥重要作用，为动物遗传育种的研究提供了新靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与猪皮下脂肪相关的circRNA，命名为circRNA_14707，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

优选的，circRNA_14707序列为SEQ ID NO.1。

一种检测猪皮下脂肪含量的方法，包括：(1)选取猪皮下脂肪组织；(2)检测样品中circRNA_14707和/或其相关基因的表达量。

优选的，相关基因为ssc-miR-1285、ssc-miR-874、或ssc-miR-874靶基因SMAD7和SCD。

本发明的目的在于提供一种检测皮下脂肪的试剂，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA_14707的表达水平。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。

优选的，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circRNA_14707的表达水平。

优选的，试剂含有与circRNA_14707杂交的探针或扩增circRNA_14707的特异性引物。

更优选的，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

优选的，样品为猪皮下脂肪组织。

所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

本发明的目的在于提供下述任意一项应用：

circRNA_14707在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

circRNA_14707在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

circRNA_14707在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

上述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

本发明的目的在于提供一种检测皮下脂肪的试剂，检测circRNA_14707相关基因的表达水平，相关基因为ssc-miR-1285、ssc-miR-874、或ssc-miR-874靶基因SMAD7和SCD。

优选的，试剂通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测circRNA_14707相关基因的表达水平。

进一步，所述试剂包含特异性扩增ssc-miR-1285的引物；或特异性扩增ssc-miR-874的引物；或特异性扩增SMAD7的引物；或特异性扩增SCD的引物。

本发明的目的在于提供下述任意一项应用：

上述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

定义：

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个RNA或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列；当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

环状RNA(circular RNA，circRNA)，亦称环形RNA，是最近几年研究确认的一种新型的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)分子。根据RNA构成的不同，环状RNA可分为三类：外显子环状RNA(exon circular RNA，ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸结合的多核苷酸探针。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。

测序技术主要为高通量测序技术(High-throughput sequencing)，又称下一代测序技术(next generation sequencing)，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

附图说明

图1是皮下脂肪差异表达circRNA分类图

图2是circRNA_14707-miRNA-mRNA互作网络图

图3是荧光定量验证候选基因差异表达图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 circRNA测序及差异表达circRNA挑选

1.1实验动物：

该试验以脂肪沉积存在明显差异的大白猪和莱芜猪为材料，饲养于莱芜市大千农牧有限公司，在相同饲养条件和环境下生长育肥，参照营养需要标准(National ResearchCouncil,NRC,1998)饲喂日粮，选择180日龄、种内体重接近的大白猪(约100kg)和莱芜猪(约35kg)各3只，且健康、体质优良。

1.2样品采集：

屠宰实验猪后，迅速将皮下脂肪组织分离。为减少RNA的降解，所有过程在冰上进行。之后用消毒剪刀将组织剪成小块，分别装入5mL冻存管，放入液氮冷冻，后转移至-80℃冰箱保存，用于提取总RNA。实验设置分为2组，分别对大白猪皮下脂肪组织(D_PX)与莱芜猪皮下脂肪组织(L_PX)中的circRNA进行鉴定及分析，每个样本设置3个生物学重复。

1.3样品总RNA的提取及质控：

取出等量低温保存的脂肪组织，使用QIAGEN抽提试剂盒提取RNA，提取的总RNA保存于-80℃冰箱。用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定RNA样品的浓度和OD260nm/OD280nm比值，比值在1.9～2.1间，Bioanalyzer 2100检测总RNA的质量，且RIN≥7、28S/18S≥0.7，用RNase-free DNaseⅠ除去基因组DNA污染。

1.4 circRNA测序建库：

(1)Ribo-zero kit去除rRNA及RNA的片段化；(2)核糖核酸酶R去除线性RNA；(3)双链cDNA的合成与纯化；(4)末端修复，加A碱基；(5)测序接头连接；(6)DNA片段富集纯化；(7)文库的质检；(8)本试验共建立6个cDNA文库(大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织cDNA文库)，分别为D_PX_1、D_PX_2、D_PX_3、L_PX_1、L_PX_2、L_PX_3，文库质检合格后，运用IlluminaHiSeqTM2500测序平台进行双端测序，对文库进行测序分析，下机得到的数据是原始测序数据(raw reads)。1.5原始数据质控及过滤：

主要应用NGSQCToolkit进行质控并去除接头，后续的分析以clean reads为基础。具体步骤如下：

(1)首先过滤低质量的reads，质量阈值设置为20，过滤长度阈值设置为70％。

(2)然后从5’端及3’端去除低质量碱基，质量阈值设置为20。

(3)最后切除reads中含N部分序列，长度阈值设置为35bp。

表1原始数据质量控制结果

1.6circRNA鉴定：

使用BWA软件与参考基因序列比对，生成SAM文件，对文件中的CIGAR值进行分析，并从SAM文件扫描PCC信号(paired chiastic clipping signals)。CIGAR值在junctionread的特征为xS/HyM或者xMyS/H，其中x,y代表碱基数目，M是mapping，S是soft clipping，H是hard clipping。关于双端Reads，CIRI算法考虑一对reads，其中一条mapping到circRNA上，另一条也需mapping到circRNA的区间内。关于单外显子成环，或“长外显子1-短外显子-长外显子2”成环，CIGAR值应该是xS/HyMzS/H以及(x+y)S/HzM或者xM(y+z)S/H，CIRI软件能够将这两种情况分开。关于splicing信号(GT，AG)CIRI会考虑其它弱splicing信息例如(AT-AC)。算法：从GTF/GFF文件中抽取外显子边界位置，用已知边界来过滤假阳性。

1.7 circRNA注释：

将circRNA与基因元件进行比较，获取circRNA在基因组上的位置信息。利用circRNA位置信息与已知数据库中的蛋白编码基因注释信息，对circRNA进行注释，获取序列信息。

1.8 circRNA分布统计：

统计各个组织中circRNA的数目情况。统计预测到的所有circRNA长度分布情况，在基因组染色体上的分布情况，circRNA外显子数目情况。

1.9circRNA表达水平定量：

利用RPM(spliced reads per millon reads)对circRNA进行定量，其中RPM计算公式如下：RPM＝number of circular reads/number of total reads(units inmillion)其中：number of circular reads表示比对到circRNA的back-splicedjunctions区域的reads数，该数值来源于circRNA预测软件中提供的支持circRNA成环的reads数目；number of total reads(units in million)表示每个样本测序数据中(clean_data)reads数目(单位为millon)。

1.10生物学重复样品间相关性分析：

样品间circRNA表达水平相关性可以用来检验实验可靠性和样本选择合理性。相关系数越接近于1，说明样品间表达模式相似度则越高。当样本数目较多时(≥3)，circRNA的表达量情况，采用R语言中的cor函数及corrplot包，计算样本间的pearson相关系数，并绘制热图进行展示。

1.11样品组间差异circRNA筛选：

由于实验有生物学重复，运用DESeq包(Huber&Anders,2014)，是基于reads count进行差异分析的R包，用负二项分布检验的方式对reads数进行差异的显著性检验，估算转录本表达量的方式采用basemean值来估算表达量，计算差异倍数。筛选差异的条件为p<0.05且|FoldChange|>2。

在莱芜猪和大白猪皮下脂肪组织(L_PX vs D_PX)中共鉴定得到29763个circRNAs，对其进行差异表达分析(按照|FoldChange|≥2.0和P-value<0.05严格筛选)，在皮下脂肪组织中共鉴定得到275个差异表达circRNAs(70个上调，205个下调)。在70个上调的circRNA中，有17个intergenic circRNA，3个exonic circRNA，49个sense-overlappingcircRNA和1个antisense circRNA；在205个下调的circRNA中，有7个exonic circRNA，21个intergenic circRNA，174个sense-overlapping circRNA和3个antisense circRNA(见图1)。其中，sense-overlapping的circRNA_14707进入我们的后续研究范围。

实施例2 circRNA深度分析

2.1差异表达circRNA功能分析：

得到差异表达circRNA之后，利用circRNA来源基因的信息，我们对差异表达circRNA进行GO富集分析。统计每个GO条目中所包括的差异circRNA个数，并用超几何分布检验方法计算每个GO条目中差异circRNA富集的显著性。利用KEGG数据库对差异circRNA来源基因进行Pathway分析，可以找到富集差异circRNA来源基因的Pathway条目，寻找潜在的不同样品的差异circRNA可能和哪些细胞通路的改变有关。

2.2 circRNA-miRNA-mRNA互作网络图

选择在莱芜皮下脂肪组织下调的circRNA_14707进行后续的分析，结合生物学信息学分析和本实验室前期做过的大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织miRNA和mRNA的测序结果进行整合分析，挑选出了与circRNA_14707结合的ssc-miR-1285、ssc-miR-874，且这些miRNA在大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织差异表达，进一步分析ssc-miR-1285、ssc-miR-874调控的靶基因及其表达情况，将分析的数据进行整理，构建了circRNA_14707-miRNA-mRNA互作网络图(见图2)。图中的其它miRNA也是circRNA_14707的潜在靶向，我们对图中miRNA调控的一些靶基因也进行了qRT-PCR验证，结果见实施例3。

实施例3实时荧光定量PCR验证

选择circRNA_14707，circRNA_14707靶基因中对的2个miRNA(ssc-miR-874、ssc-miR-1285)和SCD基因、SMAD7基因，每个设置20个生物学重复(大白猪和莱芜猪各20例)，分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因和5S rRNA为内参，qRT-PCR方法用于验证基因的表达水平。

3.1引物设计：

circRNA_14707扩增：

正向引物：5’-TCACCTCCGAAGACTCCAGAA-3’(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-GCTTCCACCTCGCATTTTGC-3’(SEQ ID NO.3)

SCD扩增：

正向引物：5’-CCTTTATTCTTCTCTAACCCGT-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-TCAGTGAGCAGAGACTTGTG-3’(SEQ ID NO.5)

SMAD7扩增：

正向引物：5’-CAGCTCTACAAGAAGCCGA -3’(SEQ ID NO.6)

反向引物：5’-AAGAGAAAGGACGATGGCA -3’(SEQ ID NO.7)

ssc-miR-1285扩增：

特异引物：5’-CTGGGCAACATAGCGAGACCCCGT-3’(SEQ ID NO.8)

ssc-miR-874扩增：

特异引物：5’-CTGCCCTGGCCCGAGGGACCGAC-3’(SEQ ID NO.9)

3.2反转录体系：

将下列物质加入0.5ml的离心管中：RNA 5μl；Oligo(dT)2μl；dd H2O(DEPC处理)4.5μl；

以上首先70℃孵育5min，然后迅速放在冰上。

5×Buffer 5μl；dNTP(10mM)2μl；Ribonuclease inhibitor 0.5μl；M-MLV RT 1μl；以上20μl体系42℃孵育60min，然后70℃10min。

3.3Real-time RCR反应

(1)将所得的cDNA与下列物质配成20μl体系加入0.2ml的离心管中混匀。Real-Time PCR体系：cDNA2μl；引物1(10pmol/μl)0.5μl；引物2(10pmol/μl)0.5μl；SYBR mix 10μl；dd H2O 7μl。

(2)Real-Time PCR程序设置：94℃预变性10min；94℃15s，60℃60s，45个循环；72℃10min。

miRNA扩增体系及步骤参考miScriptGreen PCR Kit说明书。

3.4结果统计分析：

为了验证测序分析结果，选取目标分子circRNA_14707、ssc-miR-874、ssc-miR-1285p和SCD、SMAD7，进行验证。2^-△△Ct法分析每组样本间基因的相对表达情况，用t-检验统计分析相对表达量，数据结果展示为平均数±标准差(Mean±SD)，P<0.05为差异显著。

结果显示，circRNA_14707、ssc-miR-1285、SMAD7在瘦肉型大白猪皮下脂肪组织显著上调表达，SCD、ssc-miR-874在脂肪含量较高的莱芜猪皮下脂肪组织显著上调表达，具体结果见图3。荧光定量PCR结果与测序结果一致。显示circRNA_14707、ssc-miR-1285、SMAD7、SCD、ssc-miR-874可以作为猪皮下脂肪含量检测的分子标志物，在预测或辅助预测猪肉品质、选育具有不同肌肉品质猪等领域具有很好的应用前景。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> circRNA_14707及其在分子辅助育种中应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40959

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

gctctgagca aaatgcgagg tggaagcagg tggggagacc cagtctctgc ctgcaaggac 60

cccgaggtca caaccactga cgggacagta tgattggaac tctagccctc gggggacagt 120

tgacccttga agacctggta gacgttacca aggaggatgg cacccaatgc agagaaacca 180

cttgaagaag gtccagaggc tcggttagta catgaaaagc agttcagggt acaggggaga 240

ggatgacgga agatggcaag gtatgtggag gcatctggtc tgcctccata cctgtgtcca 300

ggtggcaggc ccactgacct cggtggagta agtcagctaa gtatcatatg atagcacctc 360

tatgtggact cgaataaaga atgatacaac agagcttttt tataaaacag aaacagactc 420

ctagatttca aaaccagtct tatggtcgcc ataggggaaa ccgttgtggg aagggaagaa 480

tcgggagggt gacaatgaca tggacatgcc actgtataaa acagatgatt gatgagaagc 540

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accaagggat acagagaaaa ggaaagggtg cagaggaaga aaccagaagc gagtgatgtc 780

tgaggagcta agggggggca cagacgcaga ggagggtcgg cagtcccgta gaaagccctt 840

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cttggtttga gctaagaccc tagctctttt acccatcatt gcttttgcat ccatcagtgg 2400

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aacaagaaca aaaaaaaaaa accactcgtg cataccaggg agttcagtga actccaagaa 3660

actctttgag gatgataaaa tagagacaca ggatgatgaa tggcttccca gtcaagcaaa 3720

tataaagtca aggtctcctg aaggtggtca gaacctaggg ctagagccct taataacgtg 3780

catcacaact ccaatggcgt attctcttcc aaaattcagc tgagcttgtt tttcatatga 3840

ttcctgcaga ccacaaaaat gcaaagattt tacaagcatg taagaatcaa tgcaactaat 3900

tcttaactgt tgaccataag aacctcagtg atataagaac tatatgtatt tctaagcact 3960

ggggttttca tctttaacaa actagaacaa agtaaattat acaacatata aacttaaagg 4020

cacatcgttt agtgtaaaca caatatactg aataaaagtg tttataatga ttgtgtggct 4080

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gaagtttaaa actttttttt tgtctttttt ttttttgcta tttcttgggc tgctcctgcg 4200

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ggttaaaaat ggcagaatca tgggcaagac tatggagaaa ctataccaag gaagggtcaa 4500

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gaaaaggtgg gaacaagaca tccctcaggg aaatcccatt tcttctccac ctccccgcca 4740

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tccgggacag attcttccac agatgggctg tgaacagtgt ggcagctgga acacaacgct 5100

agaacctatt cccagtgtgc tctggaccat ttcctagtgt gttgttggag caaccatggc 5160

agcacttgag ctagaagaag aaaggctgat taaaacaagg tcttgggaag gttacttcca 5220

ggcatagcct ccctgagcat aagccccagc ctcatttcct gcctgggatc tggaatccca 5280

atcagcagtc tggaggttgc tgtgtgagga gtgggggaca cacacatgcc agggccaaaa 5340

gaaccccacg ccctcttggg caggaggagg aaatgccacg tgactgttga gcatggaggt 5400

ttaatcccca gcctcccctc taccagctgg gtgagcttgg ttgaatcagt gagtcaaaga 5460

agccaactgt atactagtcc catgttcttt acttctgagc agcaggccag gacacataag 5520

ctccaagccc atcagcacca tacttatttt cacacaccaa gttgttttaa atcatgcccc 5580

aacacatgga ttttcagcca tttagagtct gtttatcatt ctccaaaacg tcacacagca 5640

tctgctagcc atagataaga caaacatccg gctgtgaaag acctcaagcc acagcgcctg 5700

ccggtgccct ctgatgcaga ggctcccacc atgctgctga gtaatgccac ctggacccac 5760

aagccctctg ccattcccct ctaccgcagc agagcccttg ctctcatcac cctgggtgat 5820

ggtccctgtg ctgtagcttc tagaaggtct catattgtga ggcacgtccc ttaccaaaca 5880

cctggcagag tgcaccctgg tagagctcat tgtggatacc tgccagctca tggctacatt 5940

gcacatgatc accccccaag tccgtcaaat gttacttctt ggtcaggtga cccaacactt 6000

cggactccat gtccttgtct gaaaaatgaa aacccattgg gaggatcaaa ttgcatcaac 6060

gccaatcagc tgaagcacca cctggcccat tagggtctgt agtgtggaac agagcattgg 6120

tacaggacgc ctccttggtc tctcccccac acagatctgc ttcccgtcca ccctttcctt 6180

ttcattgtct cattctttgt tgcaccagac ctgactcaca ggccacagtg atcatgcatc 6240

tgaccaaggc ctcgacactg cggtattctg ggagaatcag agaccctggg tcaagaagga 6300

caggggtcct cacgtaggta cggtatttat ttcttacgaa ggaaacaagc accaagagta 6360

gcctcttctg cagcatgaaa acggggttgg cctcatggaa gtcactggag aacaaagttt 6420

caagatggca gacatgcttt tctgtactag gtgtctaggc gtggggaaga tggggagagg 6480

aaatgccatc ttcccctagg cactgtgagc ccaagagctt gcctacccta actttcttcc 6540

atgcaggaag cctcttttgg ggagcgcctg tgtggcacca gggcccttgt gaaatctggg 6600

tttgattttg ttcctgctct agaggttggt ctactgccac ctagaggcca cctcaggaac 6660

tgcagggctg ggcagagggt ctctagcctt tcccgactct caaaaaccct tatctaaaga 6720

gccacctgga gtgggacttg gaacccacag agcactgacc ctcactgttc atgcccgtct 6780

gcctgattct ccctctgcct ctcccacttg catactagtg cttgcacttt gtttctgaaa 6840

acaaagagta aaaaccagag agagaagcag ctgctgaggg ggacattccc gaggctagaa 6900

gggaattcta gagatcccac cagctgaaac cgtcacagcc aaccactgta actgatcagg 6960

gccctgtggg gttcctgggc acaaaagcct ttccgggtcc cccattcctt gtttttagga 7020

aatgggcctc attcagcctc cacggcctcc cctgagttcc aaggggcaag ttcagacagt 7080

tgtggtcggg gaagggagag gatgcagaga caagggagga acagtcaaga aatgacagtc 7140

gattttctac tgtttgtcag actgacccag tcacacatac atataccttc tttttctcac 7200

attatttccc atcaggctcc atcacaagtg actagatact gttcccagtg ctacacagaa 7260

ggatctcatt gcttacccac tccaaaggca atagtttgca tctattaacc ccagactccc 7320

agtatgactg ggtcactttg ctgtacagca gaaagttgac agaacactgt aaaccagctg 7380

tagtggaaaa aaataaaaat cactagaaaa aagaaaaaga aagaaggaaa caatagcaca 7440

gccttggggc agaatcctgg ttccccctca aggggcacat agaatgacag atgcattcta 7500

tacacataag agaaaagtta tattccttat gcttctttta gggaggaata cttgaaaact 7560

gaacagcttg gtgtccttcc tggtccttct ccctggcttc atttcgccct aaacacaatc 7620

acccataagc taaagattag gcatcctgaa cacgattgcc tgtgagttag acgattagca 7680

cttgattttt tcaggaattt acccagttct aatctctgat caatatgtcc tcttcccaag 7740

tactgttatt ctaggcaata acccagaaaa ccaccttcgc aatcaggccg agatctcctg 7800

acaccagctt tgatggcaaa gattttcccc tagagacgga aggatgcatt ttttccccaa 7860

tcctggtccc catctgaaag cttgtttttc tgctttttac cataaaactc cccacagttc 7920

tcccaaggag gcacagtcct taaggtatta gcctgctgta gccttctttg cctggcaaag 7980

caattaaaaa tatctttttc tccttcaccc caaactctgt ctctgtttct attcagcact 8040

agtggacaga ggctgggttt tggcagcaat aagggtcatc taccaaaaac aacaacttac 8100

atcacacata atggcaaaaa ctggatcctc cccctggaat tagggacaaa acgaagaaac 8160

ctagtcttac caacttattc aacatcatcc tggaagtcct agccatccca gtgaaaaaga 8220

aatgaaaata catagactgg gagttcccat cgtggctcag tggaaacgaa tctcactagt 8280

atccataagg atgcaggttt gattccctgg ccctcgctca gtgggttaag gatctggcct 8340

tgctatgagc tgtggtgcag gttgcagatg tggcttggat ctggtgttgc agtggctgtg 8400

gtgtagccca gcagctgtag ctacgattcg aaccctagcc tgggaacttc catatgctgc 8460

aggtgtggcc ctaaaaaagc aaacaaacaa acaaacaaat agactggaaa ggaagaaata 8520

aaactgtctt tacgcacaga tgacctgtac agaaaattct aaagactcta caagagaaat 8580

ctatagacct aatgcacaag tttggagaga cctcagcatg agaggcacta gaaagaccat 8640

aactggaaaa gagaagtgtt ttaaataaca tttataattg cctcgaaaag ccaaacacta 8700

ggtatagatg tacagaaaac acgctggatc tgcatgttga gaacgccaag actctgaaga 8760

aagaactccg aagatgaatg aaaggagagg tgtaccatgt tcatggatgg gaagacccaa 8820

cgcagtaaag gcatcggttc tcctcaggtt gatctgcaga ctgactgccg ttctaagcaa 8880

aatcccggaa agacttttcc tagaggtaga caagctgact ttgaaattta catgtaaaga 8940

tgtaagaacg agagcagctt acacattttg aaaaaagaat aaagtgtgaa aatcacatta 9000

cccaacttaa aaacttactc tgaagttgca gcaatgaaga ctgtgtggtc ctggggaagg 9060

acaggttcag agatggacag aacaggtcag agcccagaaa tagaccctca ggcatgtggt 9120

gaactgattt tgacagggta caaagtcaat tcagagaaag gcgtcttctc aacaaatagt 9180

gtgggagcga ctggattttc atgtgcaaaa atatcttgtt ctaaacctca taacttaggc 9240

aaagattaac tcagaattgg gcataggtct aagtataaaa tataaaatgt ttagattaaa 9300

acatagggga aaatcttacc aacctagagt taggaaagga gttcacagat ttgacaggag 9360

aagtaaactc catcaaaggt aaaagcctgc atcccgatgt tcgcagagct gacaggaggg 9420

atgcctggaa agcagtctgg gagcatctga taaaattgaa atgatacaga gtctttgacc 9480

cagaacgttc tctctgggag tgaagccacc cccccggaaa gcagcatcta tccaagaaga 9540

tgcatagtgc ggctggcgca gcatggctgg tggtggcaga atccggacca cgtgcatggc 9600

cacgcagaga gtgcagctgg cacccactag cacagccctg gcacctggca ccgtgcaagg 9660

ctgaccccaa gctccaggca ccaagaagca gcagggggct acctgggcgg ggggtggtga 9720

tggaagaggg ggaggggagg ctctgagacc ttgtgttgca ggcggagacc cctggtgtgc 9780

accccagcag tgtacggctc gcgtggaccc acacgggcac agaggatctg ccaggaaaca 9840

cgctttttgg ccagggtgca actgcgtgtg gaggtgggag aaggcacagt gcagggccca 9900

caaagggaaa agaagaggcc gtggctttag agccacatga aagaagggag ttcccaatgg 9960

gcctcggtgg gttaagaacc tcactaggac ccatgaggat gcgggttcga tccctggact 10020

tgatcaatgg attaaggatc accccgtgaa ctgtggtgta ggccacgggt gtgactcaga 10080

tccagtgatg ctgtggctgt ggcgcaggct ggcagctctg attgatttga cccctagcct 10140

gggaacttcc atatgctgta ggtatgggct taaaaaaaga aaagaaaaga aaagaaaaag 10200

aaaaacccac atgaaaggag atcctgcagg gcgcagttgg ttaagaattc tactgcattg 10260

gcttgggtcg ctacagaggt gccagttctc cctgcccagc gtggtgagtt aaaggattct 10320

gtgttttggc agctgtggcg tagatggcag ctgtggctcg aattcaatcc ctggcctgag 10380

aacttctaca tgcccccccc cccaattaaa tagattttaa aaataaaata aaaccagctg 10440

aaagaccaca tttctgcata tctgcacact cacaggtgtg gggggtgcac ctgcaaaggg 10500

aaatgaggaa aagacgagcc ccggccagtg gaggtgctgc tcgggtgcct gatttcagca 10560

gagcacaggg aacgcaaggc cctggctctg aagatgctgc tggggggtgg gggtggggga 10620

ggcgcccaac ccagactcgc ggcatcactc ccaccccagg gaaaggccgg cggcagagct 10680

gggacctgcc ctgcgtgctg tccaaagaga cctcagacgc ggcatccagc atcacctgcg 10740

acgcggcgct ggtccttacc ttcagtgacc atggtgtggc tggctgcacg gacgggagca 10800

gatggtggca ccgagcatgg caccgcggga ccaggtgatg cagccttgct ggccagagtg 10860

agagacctag gctcagtcca ggagctggtg gagttcgaga cagacagaga gagacgaaga 10920

cagagagaca gacggacaga gagagacaga gacgggggaa agagacagga ggacagagag 10980

gcagagacag agggagagag acagagacag agagagagag acggatggac agagagacac 11040

agagacagag ggaaagagac aggacagaga ggcagagaca gaaggtgcgg tgtcggaaga 11100

agtcttctgt gactctgtcc ctttggagtg ttatctgggg gtgggactcg tactgaccag 11160

ctgcagctga gcttccggac acagagcgag tgccggctgc ccgcgcatcc cggctgggtc 11220

tcagcgctct tgaggcacag ggctccccgg actcctgctg ggggcctggc agggccgacg 11280

caatccctcg gttttcatca gcaccttcga ctctgcaagg atcagaaaat ccaaagtgac 11340

agctggtcac atggtgcagt gacaaggatg tgtcctggct ggcgtctctt caggacctgc 11400

cagcctgccc caggccggga gcagccggga gagcagagct tggaccagca ccgccacgca 11460

tgcaaaggtc cacacgggca gaatatgtgg agagatggag agcctggcgc ctctgctggg 11520

accaggccag gcagaagtga gccgggcact ctggctacct ggcccctcag ccctcggggg 11580

cctgcctgtg gctgaaaact cacctgccct gcagaggccc ccagactccc ctcactctct 11640

ccaggattcc atggcgtccg gcggcctggt gggtatcact gctgcacgtc cacgtggccg 11700

ggagccagca cccctcaccc ctggaccacc agggagctcc atcatttgta catgacactc 11760

tttttttttt tttttttaaa tggccgcacc cagagcatat ggaagttccc aggctaagga 11820

ctgaatctga gtcttggctg cagcaatgcc agatccttta acccaccgcc ctgggatagg 11880

gatcaaaccc ccaccttcgc agagacccga gccaccgcag tcagactctt aacccactga 11940

gacgccacgc agactcctgt acctgattct taaagagacg tatcccaagc tttcctctcc 12000

acatctttct tcaggatgtc ttgactccgc gcaccccatc agcctgtatc tggtccccga 12060

gctcaggtgc atcagttccc cgcttccctc tgaagcaact gtgttgcctt tctgtccact 12120

tacaaccaca tttccagcaa aaacccatca tttcttacct gcgggctttc gcccacagac 12180

attctggtct tgtcaatcaa ccaagagcgc ctagaaatta tactttcgtt catttaagaa 12240

atacgcattg agcctcttag ccggttccaa gcactgttcc aaaatttagg tgcctctctg 12300

tcccccctct ttatccataa gcccggaggc tgactccgtc ctctgcgggg cagccgtcca 12360

tccaaactcc tgcccacgtt acagacacta tggatcaaca acgggcacag catcttggaa 12420

acgaagcagg tggagagact gctctcaggc gggtcaggtg cgtgggacag gggaggagag 12480

ggatggaggt ataagagagg acagggcttt ttttaaggca tctcggcact gatcttgtga 12540

cctttaatga cactcagaag caatccacac gccgtggttt gggagtaacg gcatccaggt 12600

agtgcggatg aaaagccaat taactatcag gtgaagaaga aggagtttta tttgagccga 12660

actgaggatt ataacccagg aagcagattc tcggaagctc tgagaagtgg tccacctgct 12720

cgtagttgtg ggcacagtcc tatacgtttt ttgagacaaa ggatcgtaca tcaaaacgac 12780

aggctgatat ttcacacaaa gctcccaagg acacctcgtc cagggggcac gtctgaagca 12840

agcagagggt ctccaggacc ccccacaaag ctgggaaatg gggctattct tttttattat 12900

tcttaaagta cagttgactt accatgtcgt gctggtttca ggtgtacagc aaagtgactc 12960

cgttacacac gcgcgtacat ccattccttt tcagatcctt tcccattatg gctgtcacag 13020

gattttgagt atagttccct gtgctgcacc ggagggcctt gttggttgcc tatttgtatg 13080

caggagtgtg tgcgtatgga tcccaactaa cctgctaact tatccctccc ccaccttctt 13140

cccctttgat aacttgtttc ttttctatgt ccatgagtgt acgtctattt tgtaaataag 13200

ttgacttgta ttagattttt agattccgcg tgtaagtgat atcatgtaac atttgtcttt 13260

ttctctgtct gaccgacttc ccttcgtatc ataatctcta gggccatccg tgttgctgca 13320

aacggcatta gttcattctt tttcatagct gagtagtagt ccactgtgtg tgtgtgtgtg 13380

tatacatatg gctgtgtata tatccatatc atatcacatc ttctttatcc agtcctctgt 13440

ccatggacat ttaggttgtt tccatgtctc ggctgttgta aacggtgctg ctatgaacac 13500

tggggtgcag gtgtctttcc catgtatggt tttctccatt tatatgccca ggagtgggac 13560

cccctggatc gtagggtagc tccactttta gtttttgaag aaacccccgt actaaaagaa 13620

cattattcct ttaagaagtg gcaccgctag tgccagaagg agggtgagac actggtcttt 13680

atggcaccca cctctgaggc gctctggtca ctgtgcgatg ctcaggcacc tgcccttcag 13740

ggagggaggg aggaggccca aagggacaca cagaatttca tgtttatttt tttttgtctt 13800

gccttaaaat ggagattgta ttccatccgt agggatgcct ctgccccgga ccttctggct 13860

ctccttcact ccctggacaa tgagtggctt tcgggaaggc ggctttgcaa gtgggggccc 13920

tcgggggacc tctctggaga agagccagtc cctggggaat tttctggggg aacataagcc 13980

acgtgagaac caaggagaca gaagtttgac ccatgggaac cggaggggcc tgaaactgga 14040

cctcttctgc tttcgtggaa agaaccgccc taccgcccgg agccagggtg cctgcagcgt 14100

cccctgcagc ctggccgtga ttcagtgccc gccctccccc cgtccccccg tccccagcct 14160

tcccagaaag tgccagatgt ttaaacccca gctttgcccc cccacccgct ccctctgttc 14220

tccactcaac cgcccgcctg cctcttacaa catattcagt tattttcctc ggcaggtccc 14280

caaagagcag gatttttact gaaaaggaaa ggcccccccc ttcctgactt agcccccgta 14340

aaagccacag caaccagcca ggggacggaa acgagagatg agccaacaag agaagcgagc 14400

agaaaaggca tttattgaac aattccttgc acggtctcaa gaccatttca agttcatggc 14460

ccggaaataa aactcacgga aagaattctc acgcacggtc catccaagca gtctttgctg 14520

ttatctcatt tccctggaag acgcacggaa tctttagcgc acatctctca agcagaaatt 14580

gttccaggta cacttgactc cgaggagctc agcatccctg gctttcccac caggggcgca 14640

ggcgccaagg aaaacgctgt ctctgccggt ttccagagac tttttttttt ttccgaactc 14700

aaatactttg ctatagatcc cagtctcaaa atgcaggtca tgagcataga aacagactta 14760

ttacacaggt tttttaacat ggaatcattt actttaaaat aataacatgt acgccagcat 14820

cggcactgaa gctttagatt attattataa tttttttttt ttttgcctgc tcccctggca 14880

tatggaagtt cctgcgccgg ggatcgaact cgagcctcgg cagccaccta agctgctcca 14940

gtgacagcgt cagagcattc acccactgcg ccacagcagg aaggcctgaa gccctaattt 15000

ccatcgttag tgggctcctg ctttctttct tccttccctc ccttgggtga aagctgcatc 15060

ctccgacgcc tcaagcctct ctcccgcctc tcccgcgagc cacatcttag tgcaaatcca 15120

gctcctctgt cgggggtgag acgcagccgt tcccagctgt ctcgggatga aaagacggcc 15180

gctggccact gtcctggccg accgcctccg gcaatgagtg tcccttggca ttgggggccc 15240

tctgtcaccc acagcccctc gctgcatttt tctccatctt tgatgccctt cttggtgggg 15300

agacaggttg attgctgtgt ccacggagaa cgtctcctga gggactcttt cagggccttc 15360

attaagcccc gtgtgccttc tagctgcttc tctgcctgtt cccgagcctg tgagttgtct 15420

cccctgggag cctcgacccg gtcagagcaa acagcgctcc tgagccacgg ggtctggccg 15480

accgcccact ggtctagaat cgtctcgagc attgttcgaa agccagtttt ccaggccaca 15540

ccgtcctgta gatgaagaag aggagccaga ggcccaggtg gtcaccctcg ggacctgcag 15600

gtggctgcct ggggccaggg gctgccaggc tccggccggg tggctctggc tgcaaagagc 15660

cctccactta ccccaacagg cctgaaatgt caccatgtcc tgtgtgggcc atggcaggag 15720

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taaattcaat gttatataat tataatttta taatttacaa attaaaacct ctatgtttat 15900

ataatctttt tttttttttt gtctttttgt cttttagggc cacacctgtg gcatatggag 15960

tttcccaggc taggggtcca ttcggagctg tagacgccgg cctacaccac agccacagca 16020

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aacccacgga gcaaggccag ggatccaacc tgtgtcctca tggaggctag tcgggttcat 16140

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cgttcaataa atggtcctgg gaaaactgga cagccacatg taagagaatg aaattagaac 16380

acttcctaat gccacacaca agaataaact caaaatggat taaagacctg gatataagac 16440

cagacactat caaactctta gaggaacaca gaggccacac accctctgat gtaaacgaca 16500

gcaacatctt ctcagatcca cctgttggag tcatgacagt aaaaacgaaa ataaacaaat 16560

gggacttaat taaacttaaa agtttctgca cagcaaagga aaccctaaac aaaatgaaaa 16620

gacaacccac agaatgagag aaaatatttg caaatgaatc gactgacaag gcattaatct 16680

ccagaattta taaacacctc ctaccgctca acaccaaaaa agagaacagc cccatcaaaa 16740

aatgggcaga agatctaaac agacagttct ccagagcaga catacagatg ccaaaaacac 16800

atgagaagat gttcagcatc actcgtgatt agagacctgc aagtcaaaac cacgctgccg 16860

taccacttac accggctgga agagtcacgc cgggatttca catccacctg ccaccctccc 16920

atgggtgacg gggtttggaa gttaattctc acagttttaa gggcacccgt gtgactggag 16980

ccggtagggt ggtcccaccc ctgccactcg tgtggtcccc ctccacccct cttaggaaaa 17040

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ccaaggatgc ctctaggcaa tcccatgatg tctctcagcg ctgcttccct cgggcactgc 17220

ccaggctatg aacaggttaa taatacccgc atgcgcgcgg gcacccccta atctggcccc 17280

gaccccacgt ctcctggcag cacggtccgt gacctctggc tgtcctccca gaggacgcct 17340

cgcactgcct tcccctcccc cacacgcaga ccccttcctg cccaaccttc cacggaggga 17400

gaagccgttc gtgtctccgc ctcaagtctc agtttcagtt gtgggtcctt acaccccagg 17460

ctcgaagttc ccggaacgag cgagtccatc agagctgtcc ccctggggtc ctgcttcctc 17520

tttccatctc agcccctcgg gattccccca acgggacagg aagcacagcc atgtacttaa 17580

aatgatgcct gttatatatt tttttaacca aaaacttcta ggggttttgt aatcagaagt 17640

ttccagcata cctggtccag cgatgactac ttccagaagt gaaagcccgc cccagagttt 17700

tggggagacg tcaacgctgt ccgcgtgagg ggctggtggg gtctctcctc tcggtgacag 17760

tccgcctcgg ccttgtgcgg agtgagccgg ttctggagcc cagggtctgg aggcacatgc 17820

tccccaggga ctctcgctcc ttctcttgga cggtccctct gagccccccc ggaagccaac 17880

acaccaacct aactgtgagc aaggcctacc cctcttcctc ctctgtcccc tcgtctaggc 17940

gacccccgtg gagccctgca gagtgagctg aagtcgaggc tttggtggcg tgtgggtctg 18000

agccacacgt tcgtaaaatc ccctggaccc cctgaggtcc aaccccaagg gcacctgtcc 18060

gttgaggatg gacggcagcc acgccaggcc cacatcacga cttggaggct caggatgggc 18120

agtccaggca catgggcact tgaggtcctg tggtcaggcg ctcagtgtct accagggccc 18180

aagggcgccc agggcattgc tcaggtatcg gtaagtccct aacacagaag gcacagcctt 18240

gctccagaag cctagggctc tgccccgcag tttccctccc ggacgccgcc taatacaggc 18300

ggagaattgc atcttcaacc tgactagccg ctgccaactg tctccaaagc ccgtccactc 18360

ccgccagcgg tggataagga ctccattgtc cgcatcttcc cgggaatttg catttggcat 18420

tttgtctcct gaacaagttg ggtctgaaac aggatcccgc tgggacgacg atttgctgcg 18480

ttcctggcga ggcggggtgc gctttcctct gtgaacaact gggtctcctt gtccgtgaac 18540

ccctcgaata ccttggccat tttccactga attggctttt tccctattga tgggcaggaa 18600

tccttttccc ctcttgtgaa ttgatattca gtgtaaatct cacacccctg cagagccaac 18660

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ctgcagcttg acttaccgtt tttttgtttg tttgtttcat gttttgtttt attttttggt 18780

gtcttttttt ttggtttttc ccgtgttttt tttttttttt tttttttttt ttttttgtct 18840

ttttgccttt tctaggccca cttcctcagc atgtggaggt tcccaggcta ggggtccaat 18900

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gcaacctaca ccacagctca cagcaacact ggatcctcga ccgactgagc aaggccaggg 19020

attgaaccca caacctcatg gttcctagtc ggagtcgtta accactgcgc cacgacggga 19080

actcctgact taccgttttg tattggaggc ttttgataaa cagaagtgtg gttttttaat 19140

taccaatctc ctcctatatt ttgctatttt tttgtgactt gtccaagagt cctttcatct 19200

ttatcccgag gctgaaagga tgttctcctg cgtatctttc tcttaaaatg ttgaagtttt 19260

gcggagttcc ccctgtggct cagtgggttt agaacccgac tcgtatccac gaagacgcgg 19320

gtttgatgcc tggcctcgct ctgtgggtta aggattcggc attgctgcaa gctgcggtga 19380

gggctttgga tgtggctcgg atctcgcatt gctgtggctg tggcgtaagc cagcagctgc 19440

ggctccgatt tgacccctag cctgggaacc ttctcatgct gtgggtatgg ccctgaaaag 19500

taaaaaataa ataaatatat aaaaggttaa cgttttgctt ctcacattta ggtctcgcac 19560

gcggccggag tacgtgggga gcaagatccg gatcaaagct gttctttcca agcagaacat 19620

tcatcgaaaa gcccttccct tcctttgccc accggtcagc ggtgccactt ctaggacata 19680

tcgtttctgt aagtgaaggt cagctcctta gctgtcctgt tctcttggtt ttttatctat 19740

tcctgctgca accacatttt tggtaataca attttagcac agtctttcct tccttttttt 19800

ttaatggctg cacctgcaac atgtggaagt tcctggacca ggggtcgaat aggagctgca 19860

gctgagacct actccacagc cacagcgaca agggatctga gttgcccctg tgacctacac 19920

cgcagcttgc agcaatgcca gatccttaac ccacggagcg aggccaggga ttgaacccgc 19980

atcttcttgg agacaatgtc aggtccttaa gctgctgagc cataagggga actccaaaac 20040

cagtctcgaa gtccccgcgg agtctaaatc cgcaagctgg gacgaagaac ccagggaaga 20100

ttctgatggc gcagccaggt gtggctataa agctgccagg atgcctaaaa tacaccccaa 20160

actatcccca cctgcctcct gggacagtgg ccagtctcct gttactgtgt aacaaacacc 20220

cccaaagcaa tggctcaaag caacttgtta ggcttacgca ttctgctctt taggaaaaca 20280

gcacagcaag gcccagcgct tcagcgggag aaactcaggt gctacaagca agtgaagggg 20340

cccccagctg agggctggaa tcatctggaa cctacgtctg ctgctcgggc cgggattcct 20400

gaaaggcttg gctcagccgg gactgtcagg cccgagcctg cccacggcct ctccgtgcgg 20460

ctcaggcctc ctcacagcac ggaagcctgg gggaggctgg atgcttacac gacggggcgg 20520

ggctccaagc cgcgtgtcgg ccgcagcaaa gaaggaagct tctggccttt tacctgcagc 20580

ctcgggagtc ccagagcatc aggtccgcca ccctgcagtg gtgaaaagcc acccagagtt 20640

aagggaagga ggcaggttcc tcccctcttg ataggagaag tgccagaaaa ttcgcagcct 20700

gcctgcaccc cacgcctcca cctccagagg cacccttcca ccaggaacgc gcccgccgtg 20760

tgcctgcctc ccttatggtg gataagtagt aggaagggga gttcctgttg gggttcagtg 20820

ggtgaaaaac ccaacacagt gtctgcaagg atgcaggttc gatccccggc ctccctcagg 20880

gggttaagaa tcccgcgttg ccacaagcgg cgacataagc ccgttgcaac tctgattcga 20940

ctcctgaacc aggaacttcc ataggctgca ggggtggccc taaaaacgag agagggagag 21000

agagagaagg ggtggggagg gagagagaga agcgggggcg gggggcatca accatgttta 21060

ctgcctctat ccctcatctt ccaagaagat ggagacggtg aatctgactt tcgcaggaaa 21120

gctcctcctt tgccctaaac gagatctcat caagccaagg tcctatgtct catgattgag 21180

tggccacaaa acggggaagt cacgagcctc ctgggttccc ctgtgacgaa acatccaaca 21240

gcacagtggg cacagagaaa tgcaggggcg gaggagagga caaccgccgt gagggggagt 21300

cgggggagct ggcaccaagt cctccctgat gcccgcccga aggaggctaa atccagtttc 21360

cccgggcatc gagcaggtcc aggatccacg gacaggatac tgggaggggc ccttgatgtg 21420

tgaatcgggg atggcagctg cagtgggcgc tggcatgaga caccatggtt ggtccatgcc 21480

agtcaagaag aaggctccag gttgcggata aggtctatga agcaggacca aactgggaga 21540

ccgggggagg gtgttcatcc tgatccttaa gcaaggaggc aggggaagct cagacaatgc 21600

cgggctttcc tggattcctg gggggctgcc aacctcccca accggaggtc tcagttttgc 21660

cagtcacagg atgcttgcat ctctatgctg gcaccgtcag gatccgtgag aacgcgctac 21720

gccggtggag tggcggttat agcggctgag ataccaaatg cactgggccc atggaacgga 21780

aacaggaggt gaaccccatt tgatgtctgc aatgcttcat tgtctcactt ccgcccaaag 21840

gatacagact ttgcaggaag ggtctccgga agcacagatt tccactgcag ggggcaaatc 21900

ggaccttgca gggggtaccc ttgaggttaa agatggtgcc agaaaaagag gatcccactc 21960

ccccgctaaa taacacaggg accgtcacaa tatttttcct tctcttattt aggaatatcc 22020

tccagggttt gttcttctta tgaagtagtt tgcacacaca gaaaagcttt cttaatggac 22080

agccacatgt ccaccaccag gtggagtcca attttaactt tttttttttt tttttttgtc 22140

tttttgccat ttcttgggcc actcccgcgg cacatggagg ttcccaggct aggggtccaa 22200

tcggaaccgt agccaccagc ctacaccaga gccacagcaa cgcgggatcc gagccgcgtc 22260

tgcaacctac accacagctc acggcaacac cggattctta acccgctgag caagggcagg 22320

gaccgaaccc gcaaccccat ggttcctagt cagattcgtt aaccactgcg ccacgacggg 22380

aaatccttaa catttttttt aattaaaaaa attttttttc ggccacaggg tgcagctgct 22440

tgatgtggga tctcatttac cagaccaggg atcgaacccc ggccacagca gggaaaacac 22500

tgcatcttca ccaagcccta gaccaccaag tttagcgttt ttaaatacct gttgacatct 22560

tgttttaaaa agcaaccttc caggagttcc cgtcgcggcg cagtggtcaa cgaatccgac 22620

taggaaccat gaggttgcgg gttcagtccc tggccttgct cagtgggtta aggatccggc 22680

gtggctgtga gctgtggtgc aggtcacaga tgtggctcgg atctggcgtg gctgtggctg 22740

tgacataggc cagcggctac agctccgatt ggccccctag cctgggaacc tccatatgcc 22800

acaggtacag ccctgaagag acaaaaagac aaaaaagaaa aataaaaagc agccttccag 22860

acaagcggga agcttcctgt gtcgtcttcc caggcccctc cttcgttagg cgtgtttcgc 22920

tgcaggatcg tttcttacgg cgaaacacgg taacggggag aggatatggg tgtgtacccc 22980

gacgaggccg ggtcagtaga cggagcccta cggtggatgg aacgctgccc cactgttaaa 23040

gggactgaac ccgaggtaca tacaccaagg acgaaaacct tgtgccccac cgggatagat 23100

ccctcaggcc tcagccaccc aagtggctgc agctggattc ttaacccacc accctccacc 23160

acaggaactc tttttttttt tttttttttt ttgtcttttt ggggctgcac ccatacagcc 23220

tggggaagtt cccaggctag gggtccaatc ggagctgtag ctgccggctt acaccacaac 23280

cacgacaact cggtatcaaa gcgagtcttc aacctacatc acagctcatg gcaatgctgg 23340

atcctgaacc cactgagcaa ggccagggat tgaacccgag tcctcatggg tactagttgg 23400

gttccttagt cactgagcct cgatgggaac tcccacagca ggaactctta ctcacttgtt 23460

tatttttatt tttatttttt actttttagg gccacgccca cagcgcaagg aagctcccag 23520

gctaggggtc gaataggagc tgcagctgcc agcctatgcc acagccacag caatgccaga 23580

tctgagccga gtctgtggtc tacacagcag cttgcagcaa tgctggatcc tgaacccact 23640

gagcgaggcc agggatcgaa cctgcgtcgt catggatacc ggtggggttc atttccactg 23700

agtcacaaca ggaactcttc tcatctattt ttttaatctt cttattttat tagcatacag 23760

ttgatttaca atgttgtgcc aatttctgct gtacagcaaa gtgaccccgt cacacatata 23820

cataccttct ttattttatc ttccatcgtg ttctgtggga agagactgga cacagctcca 23880

gtgccggaca gcaggacctc atggcttctc tgttctaaat gtaatagttt gcatctcctg 23940

accccagacc ctccgtctct ccccctccct gccccctccc cccagcaacc acaagcctgt 24000

gttctgcgtc cctcacacct attttaaaac acgtcgcaat agtagaaacc gcttctgaaa 24060

catgcctaag acgtacacgt atgaaggtgc acacaggatc ggtgaggccg gcccctctct 24120

gcccgggctg cctgaggctt tctgcacggg ctgcaggaga taagatgtct gtgataaggg 24180

gacagataat ggctattagg ccacagggtg gggcggggac aggaagttgc agggacaaaa 24240

cagaccgtgg gtttgcagga aggtgacctg ctccacggac agaaaacaaa aaaagccccg 24300

acacctccat gccttggagg ctgaaggagg ggctttgcaa acaggtctgg ctggactaaa 24360

cgtcactcac ggaaggcagc ctcgaggtat tccatcaatg ccaagttctt ccccaccccc 24420

aggggctcgc cacctgccgc catcaccacc tccctgtggc tctgaatcca gaggccaggg 24480

agcagcccca ggtcggatcc ggcccacgtc cctggagctg agattccagc cctgacccca 24540

gcatcagggt ccccccacag ggccttcaca aatgccctaa agaaccccgc caccgacagc 24600

aggagaggga cagcgtgaag gaggtccctc cctgacggag gggaggggcg gtctgagcct 24660

ggcggtctca ctcacctgcc cactgagtct cccgagagcc cagcactgtg atggacccag 24720

gcatgtccac atctgccctc acggaccgtc caggaaccgc tgggaagggg agcagcccca 24780

cccaggttgg acaggctctc agggtccacc ttccgggggc acgcccacca cctgaagaag 24840

tttgaggggc agcggagttt ccttataacc ccccccccag tgcctggggc aggtgggcgg 24900

ggtcgggcag gtgcggggtt tgggcaaggg ggtaccgccc tgagccctgg ggaccctggg 24960

ggttctgggg tttgtcccag tgtgcggagt caggcacagg gcagcgccac cctgggtgtc 25020

aggtgttgac ccagggctgg gcggggagca gggctgatgg aggagggccc ccccccagag 25080

gcgtgggatc cccagcctca gcctccaggg ccttggcttt gtcccctcct tacctgatgc 25140

tcaagcgaca cactgctctg aggtgtccca gggcccagct ccccttgggg acagcgctcc 25200

ctgccagcct gggctgcctg cagccaccca tgcccctcag tgtgcagctc aagaccccgt 25260

ggccctgccc tggtcctggg aagaggttga cattgatctt tagctccaga ggacgggctg 25320

ctgaggctcc aggctccccc cactccccca ggaaggatcc ccgatgctca ccccacaccc 25380

caggggactg gggggctgca aggaaatgca ctggtcccct tcctctgacc tcacgtggct 25440

gctcccgtct gacctcagga aaagccagac ctcagcccac atccgcagtc aggcaggaag 25500

gggacccagc tcagggtccc agggtcccag gaggccgggg ctccccgggg ccagagccag 25560

ggcccacccc agcccccacc tccaggagcc cggagccctg gagctgttcc ggactgtgtc 25620

ccggggcggg ggcgggcgtg ggacctgctc cctcctgggg ggcctgaggg aggctgcttg 25680

gggcaggagg ctgcccatcc gctggggcca cagaagacgc cccctcaccc caacttggag 25740

gaaagttttc aattatcatt tgtcttcatt gtgcgaaggc caggctcact gctgagctgg 25800

gaaatgatct cagaggttgg aaaaacacca taaaatattc aatgtaaaat aaaaatccac 25860

ttgagctgtg tctttctttt cacgaatggc gtaacagttc ttccagaagc cctggacccg 25920

ttcatctctg aaacacactc ccactgcctg ctcctctctc tgggattgag cggggggcag 25980

ctggaggggc agctcttgca gccctggggc tgcggagttt ccatttgctc ctgtgactga 26040

gggctgagcc tagttatttt gggaagggat gttttgagaa aaaaggccta atgctttggg 26100

gagttcccta atggctcagc aggttaagga tcaggtgctg tcccagggga acctcgggtc 26160

gcttcggtgg catgggtcca atccctggcc caggatgatt cattcacacg ctgtgggggc 26220

agccaaaaaa aaaaaaaaaa gagcttaatt ctcgacaact cttttcccag ccatcggagt 26280

ggtagcagag gtaagaaacg ccaccaggtg ccagccctgc accacaagtt gggcacggaa 26340

tggaacacgt gacactcatg aggtcacgta cttgtccaga caaggcccac actggagaga 26400

gggcagagcc aagaggtggc caagggggtc tggtttcggg ggcacgccaa gctccccacc 26460

tgggctccag gccaggcaag acccccgtgc agggaggagg ccagagaaag gaggtggaag 26520

gtatagccgc agacccgggc ccactcgccc acgggcagct tgggcacctg cctggacaaa 26580

gcctgtcctt tattttctgg gtctgatgct tcccctcctg gggcctcctg accccagggg 26640

actgcccctc ccagttagcc aattcctcga ggtagcaaac tgcaggtggc agcagccctg 26700

ctttacaaat gcaaaccaac ccctgcaggg cccccacctg ccttcctcct ggggctccca 26760

tggggcctct atctcttgcc catcagccca cggcagcccc agcccggggc aggtcccaga 26820

ccgcagggcc cctggcctcc tcagcccccg gagatgattc aaaccagcca ggcccaagcc 26880

caagctccca cgcagcccct ccctctggct cctgccggtg tttcccagcc gtggtccccg 26940

gggcacgtcc cctcccctgg agaaccgtga gtgccattct agccacttaa gggcaattgt 27000

cccctgaggg gctggccagg ccattcctga ggccccccgt taagacccgc cttccgctgc 27060

ctggggatga gccctgtccc cactccccgc ctgcccctgg gggacccggc aacctcactt 27120

ccccgccctg ggtctcagag tcaggtgatt ttgtcgtgag gttcaggtgg gacggtggcc 27180

atggaaactg aggagagacc tgttcacaga ttcaaacagg ttcaaggggg ggcctccagt 27240

gaccgcgtcc cccacctccg cccctgcccg gctccctttt cctcagtctc tcccagcatg 27300

agctccttgc tgagtcccca tgtcacccag gatatgacaa aaccagggcc cagcctgcag 27360

acatggactc agagacagag gcgcactttt tgtcggctcg ccccggggcc acagggctgg 27420

gtttaggctg aactgcgtgg agctgcccac caggggagat cagaaatggc caaacgctgg 27480

ccactcgggg tcatccaggg tcctgcggga accgtcagac ttggacccag gcctcccgct 27540

gtgcaaagct caggaagggc gcgtccgaac aaacccggtg ttgcaagagg ggtgaggctg 27600

gagttcagcc ctggtttcca aggatccggg atgagccagt ggctctgaga tggatttggg 27660

gggagctgca gtgggtgatg gcttggcatg agatcctaat tcttctctgc ccgggacagg 27720

aaccggggca gcctggaaga acacaggaat cgcagccact agaccagctc gaggctggaa 27780

gcagcctcgc cctgattctt gccccggtgg ccaaagcaag gttgtttcaa ggcggccgag 27840

actgtgacac aggaatacag cttattgtta gaaactcagc acgacggtgg gagagcacag 27900

agacacagag gcttcgtctg cgtgtctcag acggaaatga agcagtcaca cgtccccaaa 27960

ggagccggga ggctgcgggc gtccccgagg gaggtgattt aaatcactcc catagcacag 28020

ttcttccgtc tttgttcctt ttggccaatg accccgttgc atctttcaca cctgaccaga 28080

cccaggccct ccctgacctg cgtgctcatc ttttggcaaa gaaggattcc agagcagagc 28140

acggcggaaa gtggtccaga cgctcccttt ctgagccccg gtgctgggag gcgagtttca 28200

aggatggact tcacctgatg acaaagccca ggagagtctg aagaaagggc tgcaaaacaa 28260

caggctggcc agacccccga aaccagagga cgttatgcct gaggaaacat acctttaagt 28320

ttctgctctt ttgtaaacca tctgtgcctt gtttactggc cctaactccc tgtcccttac 28380

ctcaagaaag gaattgatta ccttttacta tctttgcctg ctaaactgcc aacgtacctc 28440

cgggagaata gctccccact gtctacatct aaatgggtct ctgatttggc ttctgttttt 28500

cacaagatct tgggcaatat tggtatgcat tatttagcta aaattgtctt aaggttttag 28560

taagtaaata agtaagtttg aggagttata ggtagttatt gataattatt gatttattga 28620

attaagtatt gtaagtatag aaatctatta ataataaagt taaaagtaaa ataggagttc 28680

ccatcgtggc acagtggtta acgaatccga ctaggaacca tgaggttgcg ggttcggtcc 28740

ctgcccttgc tcagcgggtt aagaatccgg cgttgccgag agctgtggtg taggttgcag 28800

acgcggctcg gatcccgcgt tgctgtggct ctggtgtagg ccggtggcta cagctctgat 28860

tggaccccta gcctgggaac ctccatatgc cgtaggagtg gcccaagaaa tagcaaaaaa 28920

aagacaaaaa aaaaaaaagt aaaatagttg ttaggtttat aatcagacga ttgttctaag 28980

aaaacagtat atttgtaact tttacaaagg tcatgtgcgg cttacgtgat ccctagatcc 29040

tgcttgattg ctcttttatg gtgttcaatt ctatttgatg cttttagact gtactttacc 29100

caaatcttgc gctttttttt tttttttttt tgtcttttgt ctttttgttg ttgttgttgt 29160

gaaaggatga aaatataacc taagctaatg agaagcttaa aattgttctg aattccagag 29220

tttgttcctt ataggtaaaa ggttaggttt tttgctgttt taaaatatgc ggaagtaaaa 29280

taggccctga gtacgtgtct ctagacatga aacttcttga aactatttga gataacaaga 29340

acagggagtt tctaactgct tgttcagctt ctgtaaaact gcttgcaaaa gataaaaaga 29400

gaggaggtta atctctaaga caacctcaaa ttggttgcgc cataaagatg ttgaaacgtt 29460

gatacacata tcttggtgac aacatgtctc cccgaaacat gcgcaaatgt gtaactccaa 29520

attaattggt ccacgaagcg tgggctttgt tgtgaacccc ataaaagctg tcccgactcc 29580

acactcgccg ccgcagtcct ctacccctgc gtggtgtatg actgtgggcc ccagcgcgct 29640

tggaataaaa atcctcttgc tgtttgcatc aagaccgctt ctcgtgagtg agtaagggga 29700

gtcgcctctt ccgagcctgg aggttctttt tcttggtctt acatttgggg gctcgtccgg 29760

gatctgtcgc ggccacccct aacacccgag aaccgacttg gaggtaaaaa ggatccttct 29820

tttttaacgt gtctgcatgt accggccggc gtctctgttc tgagtgtctg ttttcagtgg 29880

tgcgcgcttt cggtttgcag ctgtcctctc agaccgtaag gactggggga ctgtgatcag 29940

cagacgtgct aggaggatca caggctgccg ccctggggga cgccctggga ggtggggaga 30000

gccagggacg cctggtggtc tccttctgtc ggtcagagga ccgagttctg ttgttgaagc 30060

gaaagcttcc ccctccacga ccgtccgact cttttgcctg cttgtggaag acgcggacgg 30120

gtcgcgtgtg tctggatctg ttggtttctg ttttgtgtat ctttgttttg tgtgtccttg 30180

tctacagttt taatatggga cagacggtga cgacccctct cctgcttggc tgaggagcca 30240

atggggcaaa gctaccatct ccggtccccc gccgtccccg ccggcggacc gccgcgcgcg 30300

cccacgtgcg gcgtgtcccg tcgcgcgtcg ggaccggggt ccggtgcgga gagcccttcg 30360

tcctgagaaa cggggcgcgg ccggaaagcg cggccgcccc ctcgcccgtc acacaccgca 30420

cgttcgtggg gaacctggtg ctaaaccatc cgtagacgac ctgcttctgg gtcggggttt 30480

cgtacgtagc agaacagctc cctcgctgcg atctattaaa agtcaagccc tctcctctat 30540

ctaccccgag attgaggagc cgccggcttg gccggaaccc caatctgttc ccccaccccc 30600

ttatccggca cagggtgctg cgaggggacc ctctgcccct cctggagctc cgacgatgga 30660

gggacctgct gcagggactc ggagccggaa gggcgccacc ccggagcgga cagacgagat 30720

cgcgacatta ccgctgcgca cgaccctccc ataccgggga gccaattgca gcccctccag 30780

tattggccct tttcctctgc agatctctat aattggaaaa ctaaccatcc ccctttctcg 30840

gaggatcccc aacgcctcac ggggttggtg gagtccctta tgttctccca ccagcctact 30900

tgggatgatt gtcagcagct gctgcagaca ctcttcacaa ctgaggaacg agagagaatt 30960

ctgttagagg ctagaaaaaa tgttcctggg gccgacgggc gacccacaca gttacaaaac 31020

gagattgaca cgagattccc cttgactcgc cccggttagg actacaacac ggcagaaggt 31080

agggagagct tgaaaatcta tcgccaggct ctggtggcgg gtctccgagg tgcctcaaga 31140

cggcccacta atttggctaa ggtaagagaa gtgatgcagg gaccaaatga acccccctct 31200

gtttttcttg agaggctctt agaagccttc aggcggtaca ccccttttga tcccacctca 31260

gaggcccaaa aaagcctcag tggctttggc ctttatagga cagtcagcct tggatattag 31320

aaagaagctt cagagactgg aagggttaca ggaggctgag ttacgtgatc tagtgaagga 31380

ggcagagaaa gtgtattaca aaagggagac agaagaagaa agggaacaaa gaaaagagag 31440

agaaagagag gaaagggagg aaagacgtaa taaacggcaa gagaagaatt tgactaagat 31500

cttggctgca gtagttgaag gaaaaaacaa tagggaaaga gagagagatt ttaggaaaat 31560

taggtcaggc cctagacagt cagggaacct ggactatagg accccactcg acaaggacca 31620

atgtgcatat tgtaaagaaa aaggacactg ggcaagggac tgccccaaga agggaaacaa 31680

gggactgaag gtcttagctc tggaaaaaga taaagactag ggaagacggg gttcggaccc 31740

cctccccgag cccagggtaa ctttaaaggt ggaggggcaa ccagttgagt ttctggttga 31800

taccggagcg aaacattcag tgctactaca gccattaaga aaactaaaag ataaaaaatc 31860

ctgggtgatg ggtgccacag ggcaacaaca gtatccatgg actacccgga gaacagttga 31920

cttgggagtg ggacgggtaa cccactcgtt tctggtcata cctgagtgcc cagcacccct 31980

cttaggtaga gacttattaa ccaaaatggg agcacaaatt tcttttgaac aagggaaacc 32040

agaagtgtct acaaatacca gtggatggcc catatgccta aaggctatcg cagctgtggc 32100

catgctggtc aaggacgctg acaaattgac tttgggacag aatataacgg taatagcccc 32160

ccatacattg aagaacatcg ttcggcagcc cccagaccga tggatgacca acgcccacat 32220

gacccactat caaagcctgc ttctcacaga gagggtcacg ttcgctccac cagccgctct 32280

caaccctgcc actcttctgc ctgaagagac tgataaacca gtgactcatg attaccatca 32340

attattgatt gaggagactg gggtccgcaa ggaccttaca gacataccgc tcactgggaa 32400

gtggacttca ctgaggtaaa gccggctaaa tacggaaaca aatacctatt agtttttgta 32460

gacacctttt caggatgggt agaggcttat cctactaaga aagagacttc aaccgtggtg 32520

gctaaaaaat actgaaagaa atttttccaa gatttggaat acctaaggta atagggtcag 32580

acaatggtcc agcttttgtt gcccaggtaa gtcagggact ggccaagata ttgggaattg 32640

attagaaact acattgtaca tacagacccc aaagctcagg acaggtaaaa agaataaata 32700

aaaccattaa agagaccctc actaaattga ccgcggagac tggcattaat gattgaatag 32760

ctctcctgcc ctttgtgctg tttagggtta aaaacacccc tggacaatat gggttgaccc 32820

cctataaatt gttctacggg ggaccccccc cattgataaa agttacttct gtacatagtg 32880

ctgatacact gctttcccag cctttgttct ccaggctcaa ggcacttgaa tgggtaagac 32940

aacgagcgtg gagacaactc cgggaggcct actcaggaga aggagacttg cagatcccac 33000

atcgtttcca agtaaaagat tcaatctacg ttagactaag tacagtccag atcatggtac 33060

ttagacaaca gtaccaaagc ccgtctagca gggaagctgg ccactagctc taccagttct 33120

aagattagaa ctattaacaa gagaaaaagt ggggaatgaa aggatgaaaa tataacctaa 33180

gctaatgaga agcttaaaat tgttctgaat tccagagttt gttccttata ggtaaaaggt 33240

taggtttttt gctgttttaa aatatgcgga agtaaaatag gccctgagta cgtgtctcta 33300

gacatgaaac ttcttgaaac tatttgagat aacaagaaca gggagtttct aactgcttgt 33360

tcagcttctg taaaactgct tgcaaaagat aaaaagagag gaggttaatc tctaagacaa 33420

cctcaaattg gttgcgccat aaagatgttg aaacgttgat acacatatct tggtgacaac 33480

atgtctcccc gaaacatgcg caaatgtgta actccaaatt aattggtcca cgaagcgtgg 33540

gctttgttgt gaaccccata aaagctgtcc cgactccaca ctcgccgccg cagtcctcta 33600

cccctgcgtg gtgtatgact gtgggcccca gcgcgcttgg aataaaaatc ctcttgctgt 33660

ttgcatcaag accgcttctc gtgagtgatt aaggggagtc gcctcttccg agcctggagg 33720

ttctttttct tggtcttaca gttgttgttg ttgctatttc ttgggccgct cccgcggcat 33780

atggaggttc ccaggctagg ggtcgaattg gtgctgtagc ccccaggcta cgccagagcc 33840

gcagcaacgc gggatccgag ccgtgtctgc aacctacacc acagctcacg gcaacgccgg 33900

atccttaacc cactgagcaa gggcagggac caaacccaca acctcatggt tcctagtcgg 33960

attcgttaac cactgcgcca cgacgggaac tccgcgcttt ttaatcttaa aagcgtatct 34020

ctgttttttg gaaaattttg aggtattgat cttccattgt ttatgtcagt ttaagctttt 34080

cccctttata attcgccttg tccaccagta agctggagac cgcctgcgca ctcctcggga 34140

gtggccgcgt ctccgttctt cttcctgcgc ctgccgcccc tcctcttcgg gacgtgccgc 34200

tgaccgccgg ggcgggaccc cggcacccgg ggtctctgtg cacgtggagc tggggtctcc 34260

ctgagcctga ggatggggag gatgggacct ctttgtcccc tcccggcagg gctcagcccc 34320

ctttggatcc tgtcatcaat caccactgtt tgacaagttc gaggaagaca agtcccagct 34380

gccggccttg ggcctgtgtt atgtctctcc tgaagtgtgg acggggggct gcttgtaaat 34440

gtcggtccca cctgtctcct gcctcgggaa gtgtgaatac aaggctggtt gctgttgtct 34500

atcctggagc ccgtctctct cctgcctcaa ggcctgcggc gatgccgtca cgcgggtggc 34560

ctggctcgaa tccctgacca cccgcttggg tcagctcttc aggctcctgt gccgcggctt 34620

ccccatctgc agtcgggctg gcggcacggc cctctcggag acgctgctgc cggaaacgag 34680

ccgctccacg gagagggctg gcatgtcacc gccgtcacat gtgtgtcctg ggtggccggg 34740

tccaaggtcc ccagacgggg cggcttacgc cgtcgtcgtc tctcctccca cagtttggag 34800

gcagagtctg aaaaggtgtc cagggccctg ctccctgtag aggctccagg ggagggtcct 34860

tcctgcctct tccagcttct ggggctccag gcatccctgg gcctgcggcc gcgtccctcc 34920

ctctctgcct acgtggtcac gtggcccttc ctctgcgtgt ctctcctctc tgtctcttat 34980

aaggacagtt gtcactgtgg gttggatcca cctggagaat ccaggatgac ctcatctcaa 35040

aaccctcact tctgcaaaga cctttctcct gagtgagctt ccagggatga caggggcgag 35100

tgtcctgggg agtcccgctc agccccggac acgcaccttg cagatgcttg ccgctgtcat 35160

tgtcccacgt caagggcgga cgcttctctc aaagttgtgc tgagagtttg tcatgcggga 35220

ggcccgctgg ccaccgtggg cagagggcac gcgctgccct gggagatggg gcatgtgctg 35280

ggccaagggg aaggggcggg cgggcagggc agggcagcct gggcggagcc agctccctgg 35340

gaaggtgacc ttgaggaagg ggggagaaaa ccaggccccc gggcctgtag gccttgcagt 35400

ggggtcccct tcttaaggcc acgtgcggag atgcagggcg ctgggggtct ggggggcttg 35460

ggcaagggca ctcgctccac cggcaggcac ttgtgttatg ggaatgagtt caaagccaaa 35520

tccacttgac aaacagcatc tctgctccta acttctgacc tgcactgaga ccccagggcc 35580

ccagagcagc ccaaaaaagg caggtcccca gcaggaccag ctcagggccg gcagctctgc 35640

agaacaaaat ttgggaaagt attttaaccc caaagaatct gttggcactt gggaccccag 35700

ggtctgaggc cagcaggtgg acagtcaagg gtgggtcctt gggaaaaggg gcaacatctg 35760

ccaccccagg ctgcccactg ccacaccaac cagagaccca ctgcgagatc cagccccggg 35820

ccaggcacga gctgtctgtg cacagtcagt gaatatacgg ggtcaggatg ggagactgag 35880

gcccagaagg accaggtcat tctctccaag ccactcagcc agactcccgg ctcacaggca 35940

cctccgagga ggaaggggag ggctggccca cgcggggaca tcgaggcctg agctcaccct 36000

ctgaacccag gggcccctcc cgcttccagg gaacctccgc tgggtgcccc ggtccagcag 36060

ccaggcccag aggacgcgag aagatttcag gcccgggtca acaggtgaaa aggctggaag 36120

ccccctgccc cagacgctcc ccaggctggc tcaggaaccg ctgaagactc tgggtggggg 36180

gggcattgtg ggactgggaa gtgggcttga ttggttgaaa aaaaaaatcc ccaaaacccc 36240

ttggggccaa agggggactc tgggcacaaa accctctagt cgggtttatt tttgtaataa 36300

aaacacccaa aaatttcatt ttttactaaa atgaaaatat tctgtatatt ttatgtgaac 36360

cctaatacag caaacctttt tacccctaaa ggaaaattgg ttttaaatcc ctctttttcc 36420

ctaaaaaatg tatatttttg gaacctttgg aaaactttaa aaaatggaaa aaaaaaaaac 36480

tcccctgtga ccccccaccc aaaaacggtt ttcgggtttt ccatcccccc cctggaaccc 36540

tggaatgaaa aagtttctgg cccccctcct atcccccccc ttgttttccc caaaaacccc 36600

ctaaagaact ggtgggtctc cccccaaggg cggcaagggt tttccctccc ttcccccaaa 36660

gcttcatgaa ttttgggaaa agaccccccc ccttatattt tttaaaaacc gggatagtgg 36720

ggaaaggccc ctccttctct tggatataaa gaggggcctc tttccaaaat ccccnnnnnn 36780

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngatccc acgttgcagt ggctctggtg 36900

taggctggcg gccacagctc cgattcagcc cctagcctgg gaacctccat atgccgcggg 36960

aggctttctc tttctggaaa agaaaaaaaa aaggaagaaa aaacaaaaca aaacaggaaa 37020

tcatgatttt cccttgaaac tcccttcggc aggaagtcct cacggccacg ctggatttgg 37080

aggacgtcag aagctacagg gcggagattt cctctcgaaa tctggcggcc agcagggtga 37140

gcccctaccc ccgcgtgaag gtggacttcg ccctctcctc ccgagaggac ttgctggagc 37200

cgctgtctga gcccatcgag tggaaatacc acagtcccgc cgaggagatc agcctcggac 37260

ctgcgtgctg gctctgggat tttttaagac gcagccaaca ggcggggttc ttcctgtcac 37320

tgagcggcgg ggtggacagt gcggccaccg cctgcctcgt ctactctatg tgccaccagg 37380

tctgcgaggc tgtgaagcat ggaaatcagg aggtgctggc agacatccgg agcatcgtgc 37440

accagaccgg ctacaccccc cgggaccccc gcgagctctg cggccgcctc ctgaccacct 37500

gctacatggc cagcgagaac tcctcccggg gcacctgcga cagggccagg gagctggccc 37560

agcagatcgg aagccaccac atcgggctca gcatcgaccc agcggtcaag gcggtgatgg 37620

gcatcttcag cctggtgaca ggtcgcagcc cggcgttcgc ggttcacggg gggagcagca 37680

gggagaacct ggcgctgcag aacgtgcagg cacgcgtgag gatggtcgtg gcttacctct 37740

ttgcccagct cagcctctgg tctcggggcg ctccaggcgg acttctcgtg ctcggatctg 37800

ccaacgtgga cgagagcctc ctcggctacc tgaccaagta cgactgctcc agcgccgaca 37860

tcaaccccat aggcgggatc agcaagaccg acctgagagc cttcgtccag ctctgcaggg 37920

agcgcttcca gctgcccgcc ctgcagagca tcttggaagc accggccacc gccgagctgg 37980

agcccttggc cgatggacag gtgtcccaga ccgatgagga ggacatgggg gtgacgtact 38040

cggagctgtc cgtctacggg aggctccgga aggtcgccaa gaccgggccc tacagcatgt 38100

tctgcagact cctggtcctg tggaaggaca cctgcagccc ccggcaggtg gctgacaaag 38160

tgaagcggtt tttctcgaag tattccgcaa acagacacaa aatgaccacg ctgacccctg 38220

cgtaccacgc tgagagctac agcccagacg acaacaggtt cgatcttcgg ccgtttctgt 38280

acaacacccg ctggccttgg cagttccgct gcatagaaaa ccaggtcctg cagctggagc 38340

ggggacagca gcaggatctg gacggcgtgg actgagggcg cccctccccc aaggatgcac 38400

ctgccacttc ggcctcgctg gtgaccagga gccggagcgg ccggcgtcgc ggcgagcctt 38460

tgctgctgca tttcgaggag aagggtcttt tcagtccaga tccctaaaca aagctcgaaa 38520

taaaggacgt gattggattt gattttcgtc tttttagggc cacacctgcg gcatgtggaa 38580

gctcccaggc taggggtcga atcggagctg ccgctgccgg cctgcaccac agccacagca 38640

acacgggatc cgagccacgt ctgcgaccta caccgcaatt cagagcaatg ccggatcccc 38700

gacccacgga gccaggccag ggatcgaacc tgcatcctca tggatactag tcagtttcgt 38760

ttctgctgcc acaacgggaa ctcccaagga tgtgattttt aagtcccccc ttgaagcaag 38820

tgcttccagc ccctccgtcc ctggtgtggg gggcgggggg gtggggtggg ggtgctgggc 38880

tagaatgagt ctccctgcca cgaccccccc tggcaaacaa cctctgtggc tttgcaaggg 38940

ggcccttgct ccttctccct ctgtctttgt aggtgattct tgccactata aaccagcccg 39000

tttccctgat ttctgtctcc tggccgctgt cactgtcatt ctgaggacct aacctgcagg 39060

gatgtacttg ggctctgtct cgtgccaccg ggaaggcttc acctgcacct ggggccaggc 39120

tgcgcggcca ccatctcggc ccgaaggaaa ggccccgggg gttgggggca ggctgcccgc 39180

tgttctcacc aacctcctct gtccacatca gtatcacctc ccgggtcggt accaaggtta 39240

agcagagtgc cgcccatgtg ggaaggagga gccgggctgg gctccggttc tgggcctcct 39300

gggaggtcca gccttgggtc ccagcaacgc cagcccccga ttctgctgga cctgcgggaa 39360

ttcctgggaa tccccaggaa tatttgcaaa ccacatcagc gtggaccttc tgtaggtgag 39420

cccccaaaag ccttacccga gaacctgcta agcaagggaa gtaatttatt ggttgacctg 39480

ctgaacagtc caggtggtag agacagcttc aggtctggct ggacccaggg cttgtggcat 39540

gtccttgcag tttatttctc tccttccctc accctgcctg tctgtgctgg cttcctccat 39600

gctctgcatc ggggggctgt ggctcctgtc ttgcagtctc ccaagttcaa atctggcagg 39660

agatgagcac gtgtaacttc cccgtggctt cagtgcaagc cctggattag ctcagctggg 39720

tcacgtgcct gtttccaaac caattcacaa ccaccccaag gtcccccaga gaggaccagg 39780

agggcttatc agaagtaggg gagatgggag ttcccatggt ggtgcaacag aaacacatac 39840

aactaggaac tacgaggttg tgggttcgat ccctgggctc actcagtggg tgaaggatcc 39900

agcattgcca tgagctgtgg tgtaggtcgc agacacagct cggatgtggt gtggctatgg 39960

ctgtggtgta ggccagcagc tgtagctctg attagacccc tagcccagga acctccatat 40020

gccgcaggca cggccctaaa aagcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaagta ggggaaatga 40080

accccaagtc ctcccaacaa gaatggctgc tgcacacgcc ctcaggccct ggcccaggcc 40140

ctgcgtcctt ccgtctgagt ccatgcttcc tggcgaagct gctgcaggcc ctgggtctgc 40200

aaagcgcgtg cgcagagctt tctcagctcc tgccgcgaca gcaacccctg gggacgtgtt 40260

gatagggctg caccgaaggc tcaggcccaa gacgggggac tgagggcacc gccggctgcg 40320

tgtctccccc cgcagacctc agagcagtct ccccctcccc acgagggccg cgtctttgtg 40380

ctgtcaggtc gcctgccatg aagacaagtg ttcaccagga cacaaagcca cgtcctgctg 40440

tcccgaccgc tgttccagaa gcgcctcagc cttgtgcggc caagccccag tgctgtggtg 40500

tgaatgtggg catcccccaa gttcacgttg aaagcctaag cccccatgtg acagtgctgc 40560

gggcggcagc ccctgggagg tgatggggtc ctgccggggg agccccatga acggggtccg 40620

tgtccttata atacaggccc caggggcccc agcccctctg ccacgtgcaa cccagcgaga 40680

aatctgccgc ccaagctggg agagggcctg gccccgctgt gcgggcactt ggctgtggct 40740

cccggcctgg agagctggga gcagggcatt tctgttgttt gggagttgcc aggcctgtgg 40800

ggttttgtta cagcagccac aggctgagac ccctttgttt tctccggaaa caaagtactt 40860

cactctgcaa ggagaattca ggccttcacc tccgaagact ccagaaggaa gacaaatgaa 40920

acagcagtgg aatctgttct ccgagctgat gtggcccag 40959

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

tcacctccga agactccaga a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 3

gcttccacct cgcattttgc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

cctttattct tctctaaccc gt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

tcagtgagca gagacttgtg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 6

cagctctaca agaagccga 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 7

aagagaaagg acgatggca 19

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 8

ctgggcaaca tagcgagacc ccgt 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 9

ctgccctggc ccgagggacc gac 23

Claims (10)

1.一种与猪皮下脂肪相关的circRNA，命名为circRNA_14707，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

2.一种检测皮下脂肪的试剂，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA_14707的表达水平。

3.权利要求2所述的试剂，其特征在于，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circRNA_14707的表达水平，优选的，试剂含有与circRNA_14707杂交的探针或扩增circRNA_14707的特异性引物。

4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，样品为猪皮下脂肪组织。

5.一种检测猪皮下脂肪含量的方法，包括：(1)选取猪皮下脂肪组织；(2)检测样品中circRNA_14707和/或其相关基因的表达量，所述相关基因为ssc-miR-1285、ssc-miR-874、ssc-miR-874靶基因SMAD7和SCD。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circRNA_14707和/或其相关基因的表达量。

7.下述任意一项应用：

circRNA_14707在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

circRNA_14707在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

circRNA_14707在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

权利要求2-4任意一项所述的试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求2-4任意一项所述的试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求2-4任意一项所述的试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

8.一种检测皮下脂肪的试剂，检测circRNA_14707相关基因的表达水平，其特征在于，相关基因为ssc-miR-1285、ssc-miR-874、ssc-miR-874靶基因SMAD7和SCD。

9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，试剂通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测circRNA_14707相关基因的表达水平，优选的，试剂含有特异性扩增ssc-miR-1285的引物；或特异性扩增ssc-miR-874的引物；或特异性扩增SMAD7的引物；或特异性扩增SCD的引物。

10.下述任意一项应用：

权利要求8-9任意一项所述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求8-9任意一项所述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求8-9任意一项所述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。