CN104561367A - 一种影响猪脂肪沉积性状的 snp 及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术辅助遗传改良领域,特别涉及一种影响猪脂肪沉积性状的SNP。所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组的X号染色体上的从5’端起的第104772170位点的核苷酸,所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第93位点的核苷酸,且该位点的所述核苷酸为Y1;和/或所述SNP标记位于10.2版本国际猪基因组的X号染色体上的从5’端起的第104772205位点的核苷酸,所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第128位点的核苷酸,且该位点的所述核苷酸为Y2;其中,所述Y1、Y2独立地选自T或C。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术辅助遗传改良领域,特别涉及一种影响猪脂肪沉积性状的SNP。
背景技术
脂肪沉积性状是猪生产和育种中最为重要的经济性状指标之一。猪皮下脂肪的含量,如背膘厚度,主要决定胴体品质;而肌内脂肪含量(IMF)主要影响猪肉的嫩度、多汁性及加工后的风味等肉质特征。猪脂肪沉积受到品种(遗传)和环境两大因素的影响。总体而言,中国地方猪品种往往具有较强的脂肪沉积能力,表现在猪胴体脂肪含量高、肌内脂肪含量多,但生长速度缓慢、饲料转化效率低;而国外引进品种由于受到长时间的选育,已经成功降低了背膘厚度,提高了胴体瘦肉率,但猪肉品质有所下降,比如肌内脂肪含量偏低(<1.5%),且易产生劣质的PSE肉(肉色苍白、松软、渗水)。因此,不论国外引进品种还是中国地方品种,其脂肪沉积性状仍亟需改良。
猪脂肪沉积性状属数量性状,受多基因控制。目前,国内外研究小组在猪不同染色体上定位了大量影响猪脂肪沉积相关性状的数量性状位点(QTL;详见猪QTL数据库PigQTLdb,http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)。其中,猪X号染色体(SSCX)近着丝粒区域存在一主效QTL,它可显著影响猪脂肪沉积、胴体和肉质等性状(Mammalian Genome,2007,18:1-4;BMC genetics,2013,14:46)。该QTL效应曾在多个以西方商业猪种和中国地方品种太湖猪(包括二花脸、梅山和枫泾猪)为祖代建立的资源家系中被重复验证。
背膘厚(皮下组织脂肪含量)和肌内脂肪含量是两个具有中等以上强度相关的脂肪沉积性状,单纯从表型上难以将两者分别进行选择。如果能够鉴别这些基因位点,并辨别出它们影响相关表型程度之间的差异性,则可开发出用于某一表型特异性选择的分子标记及相应检测技术,准确改良该表型;比如,瘦肉型猪育种目标之一就是希望采用标记辅助选择技术,在保持背膘厚不变的前提下,适当提高肌内脂肪含量。然而,目前尚缺少有育种价值的与脂肪沉积相关的分子标记,更缺少能针对不同脂肪沉积性状选择的分子标记,这是当前畜牧学、遗传学及育种学研究的热点和难点之一。
因此,开发和利用与上述两种脂肪沉积性状有特异性关联的分子标记进行选种,可克服基于表型选择的局限性,以准确改良猪的指定部位的脂肪沉积性状。
发明内容
本研究前期通过白色杜洛克×二花脸资源家系全基因组扫描和连锁分析,将影响猪脂肪沉积性状的QTL定位于X染色体上微卫星标记SW2456和SW1522之间,并在区域内搜寻到ACSL4、SERPINA7(TBG)、IRS4等几个重要的位置候选基因。在此基础上,本发明采用DNA测序后的比较分析和PCR-RFLP相结合的方法,对猪的QTL置信区间内的基因进行了单核苷酸多态位点(SNPs)筛选,最终在IRS4基因外显子区域筛选到与猪脂肪沉积性状相关SNPs,并在白色杜洛克×二花脸资源家系F2群体、苏太猪(杜洛克和二花脸杂交18代以上的培育品种)中分析该基因多态性与多个表型的相关性,鉴别出特异地与猪不同脂肪沉积性状相关联的分子标记,为今后猪育种的标记辅助选择提供新的检测方法。
因此,本发明之一提供了一种猪的SNP标记,所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组的X号染色体上的从5’端起的第104772170位点的核苷酸,所述核苷酸对应于SEQ IDNO:1上的从5’端起的第93位点的核苷酸,同时其也对应于SEQ ID NO:2上的从5’端起的第93位点的核苷酸,或对应于SEQ ID NO:3上的从5’端起的第93位点的核苷酸,且该位点的所述核苷酸为Y1;和/或
所述SNP标记位于10.2版本国际猪基因组的X号染色体上的从5’端起的第104772205位点的核苷酸,所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第128位点的核苷酸,同时其也对应于SEQ ID NO:2上的从5’端起的第128位点的核苷酸,或对应于SEQ ID NO:3上的从5’端起的第128位点的核苷酸,且该位点的所述核苷酸为Y2;
其中,所述Y1、Y2独立地选自T或C。
本发明之二提供了一种核酸序列,所述核酸序列为包括如上所述的SNP标记的核酸序列,所述核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。举例来说,所述核酸序列只要包括所述的SNP标记,不论其长度是多少bp,例如其长度可以是10bp、15bp、20bp、30bp、50bp、80bp、100bp、120bp、150bp、180bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp等等,均是本发明所要求保护的核酸序列,但所述核苷酸序列并不限于所列举的长度。另外,所述SNP标记一般位于所选定的所述的核酸序列的中心位置或比较靠近中心的位置,例如,在20bp的选定片段中,所述SNP一般在这个20bp的DNA片段中的第7-14位中的一个位置;在1500bp的DNA片段中,所述SNP所处的位置的选择余地大大增大,其可以是在第100-1400位中的一个位置,优选在300-1200位中的一个位置,更优选在500-700位中的一个位置,这样设计的目的是有利于更加准确的检测所述的SNP标记;但是,在检测技术特别灵敏和/或特异性非常强的情况下,所述SNP标记也可以靠近所选定的核酸序列的两端中的一端,甚至是位于第一位或者末位。另外,由于上述的两个SNP位点在核酸序列中间隔34bp,因此,当所设计的核苷酸序列小于或等于35bp时,仅能用于检测其中一个SNP位点。由于所述SNP位于外显子区,而IRS4基因的外显子又位于X染色体上,因此,一般来说,所述核酸序列在为DNA序列时,该核酸序列是从X染色体中截取的一段DNA序列。值得注意的是,IRS4基因非常特殊,该基因仅存在外显子,而不存在内含子,因此,其DNA序列就是其编码序列,也就是说,IRS4基因在转录后不需要剪切而直接构成成熟的mRNA分子。
在一个具体实施方式中,所述核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3中的至少一种。
在一个具体的实施方式中,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列可以共用一对引物,它们的上游引物各自独立的选自SEQ ID NO:13,下游引物各自独立的选自SEQ ID NO:14。
本发明之三提供了一种猪的遗传改良的方法,所述方法包括:确定种猪核心群中的种猪的所述的SNP标记,并根据所述SNP标记做出相应的选择:
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为CC和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为CC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772170位点为CC基因型,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而增加后代猪的肌内的脂肪沉积量。
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为TT和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而降低后代猪的肌内的脂肪沉积量;优选在核心群中选择在所述第104772170位点为TT基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而降低后代猪的肌内的脂肪沉积量;特别优选在核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772170位点为TT基因型,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而降低后代猪的肌内的脂肪沉积量。
在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为CC和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括增加皮下组织中的脂肪沉积量,增加后腿重,减少眼肌面积,以及减少瘦肉率中的至少一种;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为CC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括增加皮下组织中的脂肪沉积量,增加后腿重,减少眼肌面积,以及减少瘦肉率中的至少一种;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772205位点为CC基因型,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括增加皮下组织中的脂肪沉积量,增加后腿重,减少眼肌面积,以及减少瘦肉率中的至少一种。大量的科学研究显示,猪的眼肌面积与猪的瘦肉率具有非常强的正相关性,也就是说,当猪的眼肌面积减少时,猪的瘦肉率也会同时减少;当猪的眼肌面积增加时,猪的瘦肉率也会同时增加。
在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为TT和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括降低皮下组织中的脂肪沉积量,降低后腿重,增加眼肌面积,以及增加瘦肉率中的至少一种;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为TT基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括降低皮下组织中的脂肪沉积量,降低后腿重,增加眼肌面积,以及增加瘦肉率中的至少一种;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772205位点为TT基因型,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括降低皮下组织中的脂肪沉积量,降低后腿重,增加眼肌面积,以及增加瘦肉率中的至少一种。
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,以增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,以增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体为在所述第104772170位点是C,在第104772205位点是C的单倍型,以增加后代猪的肌内的脂肪沉积量。
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,以降低后代猪的皮下组织中的脂肪沉积量;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,以降低后代猪的皮下组织中的脂肪沉积量;特别优选所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体为在所述第104772170位点是T,在第104772205位点是T的单倍型,以降低后代猪的皮下组织中的脂肪沉积量。
在本发明中,由于所述SNP标记位于猪的X染色体上,因而,它们影响猪的相关性状的作用方式与位于常染色体上的SNP标记的作用方式存在一定的差异。例如,本领域的技术人员周知,对于公猪和母猪来说,其具有的X染色体的数目是不一样的,在公猪中仅存在一条X染色体,因此,在公猪中,当提及所述SNP标记在第104772170位点为TT基因型时,其采用了SNP标记位点位于常染色体时的表述方式,实际上所述SNP标记也可以表述为T基因型,但是,后者的表述方式并不常见。而母猪中存在两条X染色体,即便如此,这两条X染色体也不同于常染色体那样均处于活性状态,而是其中的一条X染色体被随机的灭活,这样,虽然基因型在表述上与SNP标记位点位于常染色体时的表述方式相同,但其含义却有不同之处,即在母猪中,仅有一条有活性的X染色体,而另一条灭活的X染色体对于该母猪的表型不起作用。虽然灭活的X染色体对该母猪的表型不起作用,但是存在于所述灭活的X染色体上的基因型会对该母猪产生的后代的基因型有着重要的影响。
此外,常用的检测SNP的方法有:1)基于杂交方法,其至少分为a)利用△Tm法,b)杂交加荧光探针的方法;2)基于酶的方法,其至少分为a)DNA聚合酶法,例如利用DNA聚合酶进行PCR扩增,b)连接酶法,c)限制性内切酶法,d)外切酶FEN法,e)RNase H法;3)电泳法,其至少分为SSCP单链构象多态性和DGGE/TGGE变性梯度凝胶电泳;4)直接测序法。
在一个具体的实施方式中,利用分析所述种猪的核酸序列来确定所述种猪的所述的SNP标记,其中所述核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。其中,分析所述种猪的核酸序列的具体的方法包括PCR-RFLP和PCR-测序以及如上所述的检测SNP的方法中的至少一种。
在一个具体的实施方式中,所述核酸序列选自DNA序列,所述DNA序列位于猪的X号染色体上。例如,所述核酸序列可以选自SEQ ID NO:1。和/或,所述核酸序列选自cDNA序列,例如选自SEQ ID NO:2。和/或,所述核酸序列选自RNA序列,例如选自SEQ IDNO:3。
本发明之四提供了一种确定猪的脂肪沉积能力的方法,所述方法包括:确定猪的所述的SNP标记,并根据所述SNP标记确定猪的脂肪沉积能力:
在所述第104772170位点的基因型为TT型时,所述猪的脂肪沉积能力低于该位点为CC或TC基因型的猪的脂肪沉积能力;优选所述脂肪沉积能力为肌内脂肪沉积能力;特别优选所述猪为公猪,且所述脂肪沉积能力为肌内脂肪沉积能力;
在所述第104772205位点的基因型为TT型时,所述猪的脂肪沉积能力和后腿重低于该位点为CC或TC基因型的猪的脂肪沉积能力,所述猪的眼肌面积高于该位点为CC或TC基因型的猪的眼肌面积;优选所述脂肪沉积能力为皮下组织中的脂肪沉积能力;特别优选所述猪为公猪,且所述脂肪沉积能力为皮下组织中的脂肪沉积能力;
在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型时,所述猪的脂肪沉积能力低于在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的猪的脂肪沉积能力,或在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的猪的脂肪沉积能力;优选所述脂肪沉积能力为皮下脂肪沉积能力;特别优选所述猪为公猪,且所述脂肪沉积能力为皮下脂肪沉积能力。
本发明之五提供了一种根据所述的SNP标记的应用。例如,可以是在种猪脂肪沉积性状中的遗传改良的应用。
本发明之六提供了一种与如上所述的包括所述SNP标记的核酸序列核酸序列能够严谨杂交的核酸序列。该提供的核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。在这里,可以举例来说明“如上所述的包括所述SNP标记的核酸序列”,即所述核酸序列可以选自DNA序列,其位于猪的X号染色体上,且包括所述的SNP标记的核酸序列。例如,所述核酸序列可以选自SEQ ID NO:1。和/或,所述核酸序列选自cDNA序列,例如选自SEQ ID NO:2。和/或,所述核酸序列选自RNA序列,例如选自SEQ ID NO:3。本发明之六提供的核酸序列能够用于种猪在脂肪沉积性状的遗传改良中的应用。
在一个具体的实施方式中,所述核酸序列具有与SEQ ID NO:17的一致性在90%以上,且其编码的蛋白质与如SEQ ID NO:4的蛋白质具有相同的功能,其中,SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸X为苯丙氨酸(Phe)或亮氨酸(Leu)。例如,所述核酸序列可以是根据SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列进行的人工改造的核酸序列,此人工改造的核酸序列可以用于后续的基因工程或遗传工程中,所述人工改造包括密码子的优化,一个或多个位点的定点突变、插入突变或缺失突变,或者类似所列举的这些手段的任意组合。
本发明之七提供了一种如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列在猪脂肪沉积性状中的应用,其中,所述SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸X为苯丙氨酸或亮氨酸。所述应用例如利用鉴定SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸是为苯丙氨酸(Phe)还是为亮氨酸(Leu)来判定种猪的SNP标记:
当SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)时,所述SNP标记为T,当SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为亮氨酸(Leu)时,所述SNP标记为C;SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)的猪的脂肪沉积能力低于SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为亮氨酸(Leu)的猪的脂肪沉积能力。
在种猪核心群中选择在SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为亮氨酸(Leu)的种猪个体,淘汰所述种猪在该位点为苯丙氨酸(Phe)的种猪个体,以逐代提高Leu所对应的DNA上的位点的等位基因C的频率,从而增加肌内的脂肪沉积量;优选在种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为Leu,以逐代提高Leu所对应的DNA上的位点的等位基因C的频率,从而增加肌内的脂肪沉积量。
在种猪核心群中选择在SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)的种猪个体,淘汰所述种猪在该位点为亮氨酸(Leu)的种猪个体,以逐代提高Phe所对应的DNA上的位点的等位基因T的频率,从而降低皮下的脂肪沉积量;优选在种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸为Phe,以逐代提高Phe所对应的DNA上的位点的等位基因T的频率,从而降低皮下的脂肪沉积量。
附图说明
图1PCR-RFLP方法检测多态位点基因型,从Alu I图可以看出,使用Alu I限制性内切酶酶切所述的PCR产物,当突变位点为C时,酶切后的片段为111bp和152bp;当突变位点为T时,酶切后的片段为263bp(即该PCR片段不能被酶切)。从BsmF I图可以看出,使用BsmF I限制性内切酶酶切所述的PCR产物,当突变位点为C时,酶切后的片段为159bp和104bp,当突变位点为T时,酶切后的片段为104bp、91bp和68bp。
图2半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析不同组织中IRS4基因表达情况,基因组织表达的17种组织为:1肾上腺、2肾、3肺、4垂体、5卵巢、6板油、7前列腺、8睾丸、9心脏、10胸腺、11附睾、12小肠、13胃、14肝脏、15下丘脑、16甲状腺和17膀胱。所设计的引物序列如表3所示,采用GAPDH为反应内参,当IRS4基因在组织中有表达时,RT-PCR扩增产物电泳显示条带大小应为283bp。本图结果表明IRS4基因在垂体和下丘脑中高度表达,在其它组织中弱表达或不表达。
图3用荧光定量PCR方法检测IRS4基因错义突变位点g.104772170T>C不同基因型(CC及CT基因型)的母猪下丘脑组织中的IRS4表达差异情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。
实施例1
1、实验动物
本发明所使用的实验猪群体共有2个:白色杜洛克(白杜)猪×二花脸猪F2资源群体和苏太猪(50%杜洛克猪和50%太湖猪血缘)群体。
其中,F2资源家系群体是以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪杂交,产生9头F1公猪和59头F1母猪,再由这些F1代个体随机交配(避免全同胞交配)产生1912个F2个体而成的。
苏太猪是一个中国培育品种,它是由中国太湖猪和西方杜洛克猪种通过超过18个世代的培育而获得的猪种(各含50%杜洛克猪和50%太湖猪和的血缘)。在本发明中,4头苏太公猪与55头苏太母猪交配获得461头后代,其中的435头在240±5日龄屠宰并记录脂肪沉积相关表型数据。
2、实验方法
试验动物均在达到240±5日龄时,按生猪标准化屠宰程序进行屠宰,同时进行相关表型的测定。表型测定由专人负责以减少系统误差,所测定的性状包括:四点背膘厚(Backfatthickness,BFT)、肌内脂肪含量(Intramuscular fat,IMF)、眼肌面积(Loin eye area,LEA)和后腿重(Ham weight,HW)。用游标卡尺测定屠宰个体右边胴体四点背膘(肩部背膘为颈椎与胸椎结合处背膘的厚度,胸部背膘为第6-7胸椎处背膘的厚度;腰部背膘为最后肋骨处背膘的厚度;臀部背膘为腰荐结合处的背膘厚度)。肌内脂肪含量测定使用索氏脂肪抽提法进行测定。眼肌面积的测量采用硫酸方格纸描绘,并用Leica软件进行画图面积计算。后腿重采用电子天平进行称量。
3、IRS4基因中的SNPs鉴别及多态性检测方法的建立
参考NCBI所提供的猪IRS4基因序列(GenBank:FN424076.1),自行设计4对测序引物(见表1),扩增片段覆盖IRS4基因约3300bp的序列,引物的设计采用Premier5.0软件。
选取资源家系祖代2头杜洛克和4头二花脸个体的DNA为模板,利用表1中的4对引物,分别进行PCR扩增。采用改良型的降落PCR(Touch down PCR)扩增程序进行扩增。PCR反应体系为25μl,其中包括40ng基因组DNA、0.2mM dNTPs、0.2μM/L的引物(见表1)、1.5mM Mg2+,1×PCR缓冲液和2U TaqDNA聚合酶(Takara)。降落PCR程序设计为:94℃预变性5分钟(min);然后进入PCR扩增程序,94℃变性30秒(s),68℃-54℃30s,72℃50s,每降一度循环2次,共28个循环;94℃30s,53℃30s,72℃30s,19次循环;72℃延伸1min,最后降至4℃。将扩增所得到的24个PCR样品经2%琼脂糖凝胶电泳检测后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果采用DNAStar软件包的Seqman程序进行分析。通过序列对比方法,分别在X染色体104772170和104772205(Suscorfa 10.2)搜寻到2个突变位点。其中,g.104772170T>C是IRS4基因外显子区域错义突变,该位点突变导致相应的氨基酸由苯丙氨酸(Phe)转变为亮氨酸(Leu),g.104772205T>C是IRS4基因外显子区域的同义突变,该突变与所鉴别到的错义突变相距35bp。
表1 IRS4基因引物信息
使用PCR-RFLP方法检测多态位点基因型,使用Primer5.0软件设计引物(见表2),在IRS4基因2个多态位点附近区域进行扩增。PCR反应体系为:25μl的反应体系中包含40ng基因组DNA、0.2mM dNTPs、0.2μM的引物、1.5mM Mg2+,1×PCR缓冲液和2UTaqDNA聚合酶(Taraka)。PCR程序设计同样为降落PCR:94℃预变性5min,94℃变性30s,68℃-54℃30s,72℃50s,每降一度循环2次;94℃30s,53℃30s,72℃30s,19次循环;72℃延伸1min,最后降至4℃。扩增产物用于酶切基因判型,选用酶切序列包括至少一个突变碱基的的核酸内切酶分别对PCR扩增产物进行酶切。15μl的酶切反应体系中包含PCR产物5μl,限制性内切酶2U,10×缓冲液1.5μl和去离子水8.3μl,核酸内切酶Alu I的最适酶切温度为65℃,核酸内切酶BsmF I的最适酶切温度为37℃,将酶切反应体系在所选内切酶的最适温度下温育6小时(h),反应产物经4.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,从而判断这2个位点的基因型(见附图1,表2)。
表2 PCR-RFLP方法判定IRS4基因外显子SNPs基因型
4、IRS4基因SNPs在两个实验群体的多态性分布情况
使用上述SNP分型方法,在资源家系F2群体中检测这2个SNP的多态性分布情况见表3。通过表3可知:
1)g.104772170T>C位点:在资源家系中,2头祖代白杜公猪为TT纯合子,17头祖代二花脸母猪中除3头为CT杂合子外,其余都为CC纯合子。在该位点上,资源家系F2代类似祖代二花脸猪,以C等位基因为主等位基因(major allele);而苏太猪则以来源于杜洛克的T等位基因为主,推测这可能与苏太猪胴体性状受到过人工选育有关。
2)g.104772205T>C位点:等位基因C和T分别在白杜和二花脸中固定;同时它们分别是F2个体和苏太猪的主等位基因,所以这两个祖代品种相近的实验群体之间存在多态位点等位基因频率的显著差异。这种差异与苏太猪经历偏杜洛克瘦肉型方向选育且该位点与脂肪沉积性状强关联有关。
表3 IRS4基因多态位点在两个实验群体中的多态性分布
5、IRS4基因的组织表达分析
利用半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析不同组织中IRS4基因表达情况(见附图2中的(a)IRS4),基因组织表达的17种组织为:肾上腺;肾;肺;垂体;卵巢;板油;前列腺;睾丸;心脏;胸腺;附睾;小肠;胃;甘油;下丘脑;甲状腺;膀胱;所设计的引物序列如表4所示的RT-PCR-FP和RT-PCR-RP,用于扩增区域包含此两个突变位点的外显子,并采用GADPH看家基因作为反应内参(见附图2中的(b)GADPH)。
实验结果表明(见附图2的(a)ISR4)):在猪的17种不同组织cDNA样品中,IRS4基因在垂体、下丘脑高度表达,在卵巢、板油、睾丸、甲状腺中弱表达,在其它组织中微弱或不表达。
根据错义突变位点g.104772170T>C的分型结果,选取CC和CT基因型F2母猪各6头(无TT型母猪样品),利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析IRS4基因在下丘脑组织中的表达差异情况(见附图3),所设计的引物同样用于扩增区域包含此两个突变位点的外显子,引物信息如表2所示的PF5和PR5。
qRT-PCR的结果显示(见附图3),CC基因型个体IRS4平均表达量高于CT型,分别为2.07±4.45和0.95±0.43,但两者差异还达不到显著水平(P=0.15)。这可能是由于检测个体数偏少,且同种基因型个体基因表达差异也较大的缘故。
表4 RT-PCR引物信息
6、IRS4基因多态位点与脂肪沉积表型的关联性分析
为确定IRS4基因多态性与猪生产性能是否显著相关,本发明分析了猪IRS4基因外显子区域内的两个多态位点g.104772205T>C和g.104772170T>C不同基因型与猪脂肪沉积和产肉性状的相关性。采用SAS软件的MIXED过程确定分析模型中分别需要考虑的固定效应和协变量,结果将性别和批次作为固定效应,而将胴体重作为协变量,用基因型亲缘系数剔除多基因效应。对SNP多态性基因型与表型进行关联分析,分析模型为加性效应模型,模型如下:
y=μ+sex+batch+Cw+gkin+snp+e
其中y表示表型值,μ为群体平均值,sex和batch分别表示性别和批次,为固定效应,C胴体重回归系数,w为胴体重协变量,gkin表示基于基因型的个体间亲缘关系,snp为候选基因SNP效应,e表示残差。基因位点与表型之间的关联性是基于模型进行判别,如果关联性P值达到或超过显著水平的临界值,说明该位点为显著关联位点。两个群体不同基因型与生产性状间的统计分析结果分别见表5和表6。
由表5、6可以看出在资源家系F2群体中发现g.104772170T>C和g.104772205T>C与四点背膘厚、肌内脂肪含量、眼肌面积(与瘦肉率强相关的指标之一)和后腿重(反映产肉量高低的指标之一)都呈现很强相关性(P<0.01)。在苏太猪群体中,SNP g.104772170T>C与肌内脂肪含量强相关,而另一SNP g.104772205T>C与除肌内脂肪含量外的其它性状都强相关。因此,将表5和表6综合进行分析,可以得出IRS4基因内的这两个突变点均可以用来作为猪脂肪沉积性状选育的分子标记,其中,g.104772170T>C主要作为肌肉组织中脂肪沉积的分子标记,而g.104772205T>C则作为皮下组织中脂肪沉积的分子标记。
7、IRS4单倍型与脂肪沉积表型的关联性分析
根据资源家系g.104772170T>C和g.104772205T>C的基因型结果(见表3),计算发现这两个位点处于强连锁状态(r2=0.91),并判定它们组成C-C、T-T、T-C共3种单倍型。其中T-C、C-C单倍型来源于二花脸母猪,T-T单倍型则全部来源于白色杜洛克公猪。苏太群体同样只含有C-C、T-T、T-C这3种单倍型。
在F2和苏太猪群体中,通过单倍型与表型的关联分析,结果表明(见表7),源自二花脸猪的T-C、C-C单倍型均能增加脂肪沉积,相当于QTL增加表型的Q等位基因;而
表5 资源家系F2群体公猪中两个多态位点与表型性状的相关性
注:*代表P<0.05;**代表P<0.01;***代表P<0.001***;NS代表P>0.05。
表6 苏太猪群体公猪中两个多态位点与表型性状的相关性
注:*代表P<0.05;**代表P<0.01;***代表P<0.001***;NS代表P>0.05。
T-T单倍型则作用相反,可减少脂肪沉积,相当于q等位基因。由于T-C和C-C单倍型效应相近,所以同义突变g.104772205T>C位点较错义突变g.104772170T>C与QTL等位基因分离特征更一致。值得一提的是,虽然在苏太公猪与苏太全群中,三种基因型间效应差异的显著性水平有所不同,但总的差异趋势基本一致,即C-C和T-C单倍型平均背膘厚(皮下脂肪沉积量)大于T-T单倍型,而C-C单倍型个体的肌内脂肪含量同时高于另两种单倍型(P<0.05)。在公猪和全群中得到不同显著性水平可能是由于三种基因型分布频率差异以及基因型与性别存在一定程度的互作所致。
表7 在F2与苏太群体中单倍型与脂肪沉积性状的关联分析
注:表中数值为最小二乘均值±标准误,肩标不同小写字母(a,b)表示差异显著(P<0.05),肩标不同大写字母(A,B)表示差异极显著(P<0.01)。
Claims (10)
1.一种猪的SNP标记,所述SNP标记为10.2版本国际猪基因组的X号染色体上的从5’端起的第104772170位点的核苷酸,所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第93位点的核苷酸,同时其也对应于SEQ ID NO:2上的从5’端起的第93位点的核苷酸,或对应于SEQ ID NO:3上的从5’端起的第93位点的核苷酸,且该位点的所述核苷酸为Y1;和/或
所述SNP标记位于10.2版本国际猪基因组的X号染色体上的从5’端起的第104772205位点的核苷酸,所述核苷酸对应于SEQ ID NO:1上的从5’端起的第128位点的核苷酸,同时其也对应于SEQ ID NO:2上的从5’端起的第128位点的核苷酸,或对应于SEQ ID NO:3上的从5’端起的第128位点的核苷酸,且该位点的所述核苷酸为Y2;
其中,所述Y1、Y2独立地选自T或C。
2.一种核酸序列,所述核酸序列为包括如权利要求1所述的SNP标记的核酸序列,所述核酸序列选自DNA序列、cDNA序列和RNA序列中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的核酸序列,其特征在于,所述核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的至少一种。
4.一种猪的遗传改良的方法,所述方法包括:确定种猪核心群中的种猪的如权利要求1所述的SNP标记,并根据所述SNP标记做出相应的选择:
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为CC和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为CC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772170位点为CC基因型,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为TT和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而降低后代猪的肌内的脂肪沉积量;优选在核心群中选择在所述第104772170位点为TT基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而降低后代猪的肌内的脂肪沉积量;特别优选在核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772170位点为TT基因型,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而降低后代猪的肌内的脂肪沉积量;
在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为CC和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括增加皮下组织中的脂肪沉积量,增加后腿重,减少眼肌面积,以及减少瘦肉率中的至少一种;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为CC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为TT和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括增加皮下组织中的脂肪沉积量,增加后腿重,减少眼肌面积,以及减少瘦肉率中的至少一种;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772205位点为CC基因型,以逐代提高该位点的等位基因C的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括增加皮下组织中的脂肪沉积量,增加后腿重,减少眼肌面积,以及减少瘦肉率中的至少一种;
在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为TT和TC基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括降低皮下组织中的脂肪沉积量,降低后腿重,增加眼肌面积,以及增加瘦肉率中的至少一种;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772205位点为TT基因型的种猪个体,淘汰在该位点为CC和TC基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括降低皮下组织中的脂肪沉积量,降低后腿重,增加眼肌面积,以及增加瘦肉率中的至少一种;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体在所述第104772205位点为TT基因型,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而使后代猪获得相应的性状,所述性状包括降低皮下组织中的脂肪沉积量,降低后腿重,增加眼肌面积,以及增加瘦肉率中的至少一种;
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,以增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,以增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;特别优选在所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体为在所述第104772170位点是C,在第104772205位点是C的单倍型,以增加后代猪的肌内的脂肪沉积量;
在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型2 -->
的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,以降低后代猪的皮下组织中的脂肪沉积量;优选在所述种猪核心群中选择在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型的种猪个体,淘汰在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,和在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的种猪个体,以降低后代猪的皮下组织中的脂肪沉积量;特别优选所述种猪核心群中选择公猪个体,且所述公猪个体为在所述第104772170位点是T,在第104772205位点是T的单倍型,以降低后代猪的皮下组织中的脂肪沉积量。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,利用分析所述种猪的核酸序列来确定所述种猪的如权利要求1所述的SNP标记,其中所述核酸序列选自如权利要求2或3所述的核酸序列。
6.一种确定猪的脂肪沉积能力的方法,所述方法包括:确定猪的如权利要求1所述的SNP标记,并根据所述SNP标记确定猪的脂肪沉积能力:
在所述第104772170位点的基因型为TT型时,所述猪的脂肪沉积能力低于该位点为CC或TC基因型的猪的脂肪沉积能力;优选所述脂肪沉积能力为肌内脂肪沉积能力;特别优选所述猪为公猪,且所述脂肪沉积能力为肌内脂肪沉积能力;
在所述第104772205位点的基因型为TT型时,所述猪的脂肪沉积能力和后腿重低于该位点为CC或TC基因型的猪的脂肪沉积能力,所述猪的眼肌面积高于该位点为CC或TC基因型的猪的眼肌面积;优选所述脂肪沉积能力为皮下组织中的脂肪沉积能力;特别优选所述猪为公猪,且所述脂肪沉积能力为皮下组织中的脂肪沉积能力;
在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为T的单倍型时,所述猪的脂肪沉积能力低于在所述第104772170位点为T,在第104772205位点为C的单倍型的猪的脂肪沉积能力,或在所述第104772170位点为C,在第104772205位点为C的单倍型的猪的脂肪沉积能力;优选所述脂肪沉积能力为皮下脂肪沉积能力;特别优选所述猪为公猪,且所述脂肪沉积能力为皮下脂肪沉积能力。
7.一种根据权利要求1所述的SNP标记的应用。
8.一种与权利要求2或3所述的核酸序列能够严谨杂交的核酸序列。
9.根据权利要求8所述的核酸序列,其特征在于,所述核酸序列与SEQ ID NO:17的一致性在90%以上,且其编码的蛋白质与如SEQ ID NO:4的蛋白质具有相同的功能,其中,所述SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸X为苯丙氨酸或亮氨酸。
10.一种如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列在种猪脂肪沉积性状中的遗传改良的应用,其中,所述SEQ ID NO:4的第432位的氨基酸X为苯丙氨酸或亮氨酸。
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