CN105255870A - 一种与猪背膘厚性状相关的snp分子标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记及其检测方法。对不同猪品种MARK4基因外显子区进行检测，发现MARK4基因3’UTR区第55位碱基(mRNA全长第2581位碱基)存在1处SNP位点(G-A)，等位基因A与低背膘性状呈正相关，而等位基因G与高背膘性状呈正相关。本发明提供了检测该SNP分子标记的方法，利用核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1-2所示的引物对扩增待测猪基因组DNA并用pstI酶切，若酶切产物为251bp，突变处碱基为A，若酶切产物为218bp，则突变处碱基为G。本发明方法能够早期、快速、低成本、有效的预测猪背膘厚度，可做为一个有用的分子标记应用于猪种的遗传改良。

Description

一种与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记及其检测方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与猪背膘厚性状相关的分子标记，具体地，涉及与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记、其应用以及检测该分子标记的方法。

背景技术

纵观全球，猪肉消费在所有肉类消费总量中比例最高约为37％，且在2012-2014年间猪肉消费总量每年仍以约1.1％比例上升(http://www.fao.org/ag/againfo/themes/en/meat/background.html)。中国是世界上猪肉生产和消费的大国，据统计目前中国生产和消费的生猪数量几乎占据世界消费总量的一半(http://www.economist.com/news/christmas-specials/21636507-chinas-insatiable-appetite-pork-symbol-countrys-rise-it-also，2014/12/20)。然而随着人们生活水平的提高，猪肉品质也成为了人们食用猪肉的重要考量标准。目前大多人对食用猪肉的偏好和需求逐渐从高脂肪型猪肉转向低脂肪型。这种需求的转变必然带动市场需求的调整，以致于家猪遗传改良工作方向的重心转向为低脂肪型猪的选择。脂肪性状如背膘厚是由多基因控制的数量性状，由基因型效应和环境效应共同作用引起。同时猪背膘厚性状属于高遗传力性状与瘦肉率和日增重性状相关(Newcometal.2004)，对背膘厚性状进行选择一方面可以有效的选择高瘦肉率(即低脂肪型)的个体，满足人们对低脂肪型(高瘦肉率)猪肉的偏好；另一方面可有效的选择生长速度快的个体，满足人们对猪肉需求的日益增加。研发出快速、简便、有效的猪背膘厚性状的分子遗传标记，可以应用于大群体的检测，增加背膘厚性状的选择压，加快遗传改良工作进程。

MARK4基因属于AMPK相关激酶家族成员之一，这个激酶家族主要致力于动态生物学功能调节作用，包括血糖和能量动态平衡(Sunetal.2012)。MARK4旁系同源成员如MARK2、MARK3等也作用于相似的生理过程，包括血糖动态平衡和能量代谢等(Hurovetal.2007)。已有研究报道MARK4基因敲除小鼠表现贪食，多动和代谢亢进，通过上调棕色脂肪的活性预防由食物引起的肥胖和相关代谢并发症。MARK4缺陷型小鼠可以缓解由胰岛素抵抗引起的肥胖相关疾病。同时也可以通过上调AMPK基因的活性显著的提高小鼠对葡萄糖的代谢动态平衡(Sunetal.2012)。说明MARK4基因在能量代谢和葡萄糖动态平衡通路中起到关键性的作用。MARK4及其家族成员在小鼠模型上的功能研究较为透彻，而在猪上的功能至今仍未有报道，从申请人前期研究来看，MARK4基因所在基因组的区段正是NCBI数据库内猪基因组的未完成区使得该基因在猪基因组上至今未能确切定位，也致使这个基因在猪上的功能研究滞后与其他物种。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记。

本发明的第二个目的是提供检测该SNP分子标记的方法。

本发明的第三个目的是提供上述SNP分子标记的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先以268个表型数据完整的杜洛克猪为研究对象，其他中国地方猪种(个体间无亲缘关系)包括33个金华猪(平均背膘厚30.9±0.6mm)、25个内江猪(平均背膘厚31.4±0.3mm)、13个二花脸猪(6～7肋背膘厚36.7mm)、32个五指山猪(6～7肋背膘厚48mm)、29个八眉猪(背膘厚34.6±1.1mm)、26个藏猪(平均背膘厚36.10±2.1mm)作为高背膘厚品种验证群体同时30头长白猪(平均背膘厚10～20mm)、30头大白猪(平均背膘厚10～17mm)作为低背膘厚品种验证群体(实验用猪背膘厚数据来自于《中国畜禽遗传资源志·猪志》2011年5月)，利用PCR技术测序了猪MARK4基因区段部分碱基序列，通过对不同猪种MARK4基因的部分区段的序列分析，序列结果采用chromasProv1.41软件进行分析寻找SNP突变位点，筛选出影响猪背膘厚的SNP位点，发现在MARK4基因的3’UTR区第55位碱基(mRNA全长第2581位碱基)存在G-A突变。

对表型记录详细的杜洛克猪进行了大规模的SNP分型工作，发现GG基因型群体的平均背膘厚度略高于GA群体平均背膘厚，显著高于AA型群体平均背膘厚。然后采用R语言中GenABLE软件包的线性模型进行了分析发现，这一SNP位点显著关联与个体校正100KG背膘厚和校正115KG背膘厚。采用中国地方猪种金华猪、内江猪、二花脸猪、五指山猪、八眉猪和藏猪为高脂肪型猪种与低脂肪型杜洛克猪、大白猪和长白猪进行该SNP等位基因频率分析，发现等位基因A在中国地方猪种中为等位基因频率极低均低于0.05(除八眉猪0.14外)，而在杜洛克群体中为优势等位基因频率高达0.57，而在大白猪和长白猪基因频率均在0.90左右。上述结果进一步证实了发明人之前的关联分析结果：即这一SNP位点与猪背膘厚显著关联，其等位基因A与低背膘呈正相关，而等位基因G则与高背膘厚正相关。

具体地，本发明提供的一种与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记，位于猪MARK4基因的3’UTR区第55位碱基或mRNA全长第2581位碱基，该位点碱基为A或G。

进一步地，本发明提供的上述与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记由核苷酸序列如SEQIDNO.3～4所示的引物对通过PCR扩增获得。

本发明提供了上述SNP分子标记在检测猪背膘厚性状中的应用，当SNP分子标记的基因型为GG时，待测猪为高背膘厚个体，当SNP分子标记的基因型为AA时，待测猪为低背膘厚个体。

进一步地，本发明提供了上述SNP分子标记在猪改良育种中的应用。

更进一步地，本发明提供了上述SNP分子标记在选育低背膘猪种或低脂肪型猪种中的应用。

本发明提供了用于检测上述SNP分子标记的基因型的引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～2所示。

本发明提供一种检测与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记的方法，通过在位于猪MARK4基因的3’UTR区第55位碱基或mRNA全长第2581位碱基突变位置上游利用特异性引物引入突变创造pstI内切酶位点，利用PCR-RFLP方法检测SNP分子标记基因型。

具体地，本发明检测与猪背膘厚度性状相关的SNP分子标记的方法是采用核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所述的引物对PCR扩增待测猪基因组DNA，再对PCR产物用pstI内切酶进行酶切，若酶切产物为251bp，突变处碱基为A，若酶切产物为218bp，则突变处碱基为G。

在本发明的实施例中，上述PCR方法的反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃10min。

含有核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所述的引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供了SEQIDNO.1-2所述的引物对或含有该引物对的试剂盒在猪种质资源改良中的应用。

本发明提供了SEQIDNO.1-2所述的引物对或含有该引物对的试剂盒在选育低背膘猪种中的应用。

本发明的有益效果在于：首次公开了与猪背膘厚度性状相关的SNP分子标记，用于区别低背膘厚与高背膘厚猪个体，适用于中国猪种和国外猪种，适应猪种范围广。本发明的检测SNP分子标记的方法能够早期、快速、低成本、有效的预测猪背膘厚度，在猪种改良方面具有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。

附图说明

图1为不同猪种突变位置序列比对。

图2A、图2B、图2C、图2D分别为二花脸猪、金华猪、杜洛克猪、大白猪MARK4基因的3’UTR区第55位碱基突变位置处测序峰图。

图3为pstI创造内切酶分析示意图。

图4为三种基因型pstI酶切后琼脂糖电泳结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例中所用的各品种猪种质资源来自各个原产地地区的保种场，如二花脸来自于江苏省二花脸保种场，实施例中的杜洛克猪来源于广州温氏集团。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记的获得

以268个表型数据完整的杜洛克猪为研究对象，其他中国地方猪种(个体间无亲缘关系)包括33个金华猪、25个内江猪、13个二花脸猪、32个五指山猪、29个八眉猪、26个藏猪作为高背膘厚品种群体；30个大白猪和29个长白猪为低背膘品种群体，为上述验证，利用PCR技术测序了猪MARK4基因区段部分碱基序列，补充了部分基因组序列。

根据NCBI公布的预测猪MARK4基因序列(XM_005658175)和人的MARK4基因序列(NM_001199867)设计引物扩增猪MARK4基因mRNA序列，本实施例的引物序列见表1，扩增猪MARK4基因一段长为1106bp的片段。

表1MARK4基因SNP检测特异性引物

根据反转录PCR技术和RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)技术扩增出猪MARK4mRNA全长3527bp，其中编码区2259bp；5’非编码区267bp；3’非编码区1001bp。通过比对将3527bp比对到猪的基因组数据库，除了5’非编码区的51bp未比对外，其余所有序列均比对到猪基因组上，共分析出该基因包括16个外显子。通过设计不同区段引物，逐一在不同猪品种间(包括杜洛克、二花脸、金华猪等)进行每个外显子的SNP的筛选，采用各个软件(chromasProv1.41、VectorNTI.Advance11等)结合比对和关联统计分析筛选，发现一处疑似影响猪背膘厚度的SNP位点，位于3’UTR区第55个碱基(mRNA序列第2581位碱基)发现G-A突变(见图1)。根据测序峰图确认该位置确实存在G/A的突变(见图2A-图2D)。

对表型记录详细的杜洛克猪进行了大规模的SNP分型工作，发现GG基因型群体的平均背膘厚度略高于GA群体平均背膘厚，显著高于AA型群体平均背膘厚。采用R语言中GenABLE软件包的线性模型进行了分析发现，这一SNP位点显著关联与个体校正100KG背膘厚和校正115KG背膘厚。采用中国地方猪种金华猪、内江猪、二花脸猪、五指山猪、八眉猪和藏猪为高脂肪型猪种与低脂肪型杜洛克猪、大白猪和长白猪进行该SNP等位基因频率分析，发现等位基因A在中国地方猪种中基因频率极低，均低于0.05(除八眉猪0.14外)，而在杜洛克群体中为优势等位基因频率高达0.57；在长白猪和大白猪群体中为优势等位基因频率高达0.90。这一结果进一步证实了上述的关联分析观点：本发明在猪MARK4基因mRNA序列第2581位碱基的G-A突变的SNP位点与猪背膘厚性状显著关联，其中等位基因A与低脂肪型正相关，等位基因G则与高脂肪型正相关。

实施例2检测与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记方法的建立

1、利用RFLP限制性内切酶检测SNP位点群体水平

根据实施例1的研究结果以及序列的特性选择利用限制性内切酶长度多态性(RFLP,RestrictionFragmentLengthPolymorphism)对实施例1的SNP分子标记进行群体水平检测。在突变位置上游利用特异性引物引入突变创造pstI内切酶位点(见表2)，该位置碱基为G时则能被pstI酶切，为A时则不能被pstI酶切，借此用于分型(如图3)。利用表2引物进行PCR扩增。为防止pstI酶切时由人为失误造成的假阳性或体系的不稳定出现的分析错误，本实施例在设计下游引物时保留产物中原有的pstI内切酶位点，用于判定酶切状态正常，当突变处为A时经pstI酶切后产物大小应由287bp减少到251bp，当突变处为G时经酶切后产物大小应由287bp减少到218bp。

表2利用pstI酶切检测G/A突变特异性引物

表3pstI酶切反应体系

经过酶切之后将20μl酶切产物用于4％的琼脂糖凝胶电泳100v，50min后，可根据电泳条带位置具体进行分型如图4。结果发现该位置G基因型在中国地方猪种中频率较高,而A基因型在国外猪种中如杜洛克猪种中频率较高，具体分布频率如下表4:

表4不同背膘厚猪种间MARK4等位基因频率分布

2、群体水平关联分析

选取268个杜洛克猪的校正100kg背膘厚，115KG背膘厚表行数据进行整理分析发现，AA基因型的个体校正背膘厚平均水平低于AG型和GG型，而AG型个体校正背膘厚的平均水平低于GG型，如表5所示。

表5杜洛克猪群体不同基因型对应的表型统计量

将个体的基因型与表型之间进行关联分析，发现本发明的SNP分子标记的突变位点显著关联校正猪100KG背膘厚和校正115KG背膘厚，且A等位基因在杜洛克、大白猪等瘦肉型猪品种分布频率较高，显著高于中国脂肪型猪品种如金华猪、内江猪、二花脸、八眉猪等。由此可见，A/G位点与猪背膘厚显著相关，可作为标记用于选育低背膘猪群体改良工作。

依托R语言环境，利用GenABEL软件包，建立线性模型，分析杜洛克猪该SNP基因型和校正100KG背膘厚和校正115KG背膘厚之间关系，经分析后发现该SNP基因型与校正100KG背膘厚和校正115KG背膘厚表型之间符合线性模型Y＝0.2322X-0.4315,p＝0.009826和Y＝0.2324X-0.4319,p＝0.009756；均小于0.05达到显著水平。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记，其特征在于，位于猪MARK4基因的3’UTR区第55位碱基或mRNA全长第2581位碱基，该位点碱基为A或G。

2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，由核苷酸序列如SEQIDNO.3～4所示的引物对PCR扩增获得。

3.权利要求1或2所述的SNP分子标记在检测猪背膘厚性状中的应用，当SNP分子标记的基因型为GG时，待测猪为高背膘厚个体，当SNP分子标记的基因型为AA时，待测猪为低背膘厚个体。

4.权利要求1或2所述的SNP分子标记在猪改良育种中的应用。

5.用于检测权利要求1或2所述SNP分子标记的基因型的引物对，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～2所示。

6.一种检测与猪背膘厚性状相关的SNP分子标记的方法，其特征在于，在位于猪MARK4基因的3’UTR区第55位碱基或mRNA全长第2581位碱基突变位置上游利用特异性引物引入突变创造pstI内切酶位点，并进而采用PCR-RFLP方法检测SNP分子标记的基因型。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，采用权利要求5所述的引物对PCR扩增待测猪基因组DNA，对PCR产物用pstI内切酶进行酶切，若酶切产物为251bp，突变处碱基为A，若酶切产物为218bp，则突变处碱基为G。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR方法的反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃10min。

9.含有权利要求5所述引物对的试剂盒。

10.权利要求5所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在猪种质资源改良中的应用。