CN111705144A - 一个与猪背膘厚关联的znf2基因内sine转座子多态分子标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物遗传育种领域和分子标记选育领域，具体涉及一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记及其检测方法，含有该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来自ZNF2基因，SEQ ID NO:1序列的251到564位点存在一个正向SINE转座子的插入多态。本发明的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记可用于猪个体的选育(背膘厚性状)，也可在配种时提供分子依据。该新的分子标记将有力的辅助背膘厚性状的选育，加快育种进度，减少育种成本，提高经济效益。本发明的ZNF2基因内SINE转座子插入多态为筛选猪的背膘厚提供了一个新的分子标记。

Description

一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记 及其检测方法

技术领域

本发明属于动物遗传育种领域和分子标记选育领域，具体涉及一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记及其检测方法。

背景技术

逆转录转座子广泛分布于哺乳动物的基因组中，占基因组序列的40％-50％，且在基因组上具备较强的移动能力，同时在基因中普遍存在插入或缺失状态，为开发逆转录转座子分子标记提供了生物学基础。很多研究表明基因中逆转录转座子的插入或缺失会影响该基因的生物学活性，例如在人体中L1插入凝血因子VIII基因导致了人类的血友病(Kazazian HH et al.1988)以及ERV插入APOB基因(载脂蛋白B)导致了人体胆固醇缺乏症(Schütz E et al.2016)；在动物中SINE插入马的MSTN基因(肌肉生长抑制素)并抑制了其表达，从而促进了马的骨骼肌生长(Rooney MF et al.2018)。

逆转录转座子插入多态(Retrotransposons insertion polymorphism，RIP)是指在同源染色体的相同位置上逆转录转座子存在不同的插入或缺失状态，使该位点存在不同的基因型，产生共显性标记。操作上仅需在逆转录转座子插入位置的上下游设计正反向引物，然后以个体基因组DNA为模板进行PCR检测。RIP相比较于其他分子标记具有操作简单；成本低廉；共显性；适合大群体的批量分析及多态性高等优点，具有良好的商业应用价值，主要表现在RIP分子标记可辅助猪的育种和配种工作，加快育种进程。

在猪场生产育种过程中，背膘厚是配种育种过程中需要优先考量的一个重要性状，与瘦肉率高度相关。锌指蛋白2基因(ZNF2)与动物机体免疫相关并且在甲状旁腺等多器官发育过程起着重要的作用。此外有研究表明过表达的ZNF2能够在小鼠体内驱动新生隐球菌的菌丝形成，进而造成新生隐球菌毒力的完全丧失(Linqi Wang et al.2012)对机体免疫构成影响。但目前对ZNF2基因中是否存在逆转录转座子插入多态位点及该多态位点对背膘厚的影响未见报道，本发明结合课题组已有的转座子插入多态分子标记挖掘技术，通过在12个猪品种中进行PCR检测，最终在ZNF2基因中找到一个SINE转座子的插入多态位点，再在459个大白猪个体中进行PCR检测并与大白猪群体的生产性能数据关联分析后发现此分子标记与猪的校正背膘厚呈显著性相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记及其检测方法，通过挖掘获取与猪背膘厚相关的逆转录转座子插入多态分子标记，再将该标记应用于猪的背膘厚性状的选育中，以加快育种进度。

本发明的的技术方案如下：

一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记，含有该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来自ZNF2基因(GENE ID:100620765，NCBI)，SEQ IDNO:1序列的251到564位点存在一个正向SINE转座子的插入多态，该位点的SINE多态存在插入或缺失状态。

所述的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记位点在ZNF2基因(Gene ID:100620765，NCBI)的第1486到1799位。

一种与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记的检测方法，包括以下步骤：

(1)在SEQ ID NO:1序列中SINE位置的两侧序列中设计上下游检测引物；

(2)以猪的耳样提取的DNA为模板进行PCR扩增并获得产物；

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果图确定该位点的多态性和基因型；

(4)将不同猪个体的基因型与猪的校正背膘厚等数据进行关联分析，从而验证ZNF2基因内SINE转座子多态标记位点能否作为筛选猪校正背膘厚的新的分子标记。

进一步的，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQID NO:3所示，且不限于这对引物，在SEQ ID NO:1的第251到564位点(SINE多态位点)的两侧区域设计正反向引物均可。

进一步的，所述基因型预计为SINE^+/+，SINE^-/-和SINE^+/-。

进一步的，SINE^+/+基因型在744bp处出现特异性条带；SINE^+/-基因型同时在744bp和430bp处出现特异性条带；SINE^-/-基因型在430bp处出现特异性条带。

进一步的，PCR反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒，变性至延伸35个循环，72℃延伸5分钟。

一种猪选育的方法，其特征在于，检测猪个体ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记，以确定猪个体基因型是SINE^+/+，SINE^-/-或SINE^+/-，由于SINE在ZNF2基因中的插入会增加背膘厚，因此可根据选育需求筛选所需的基因型。

一种鉴定猪品种背膘厚的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有前述检测方法中采用的引物。

本发明也提供了所述的与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记在猪背膘厚性状筛选中的应用。本发明的有益效果如下：

本发明发现了一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记，在该标记位点的上下游设计检测引物，然后在12个品种的猪中进行群体多态性PCR检测，PCR产物进行电泳分析，这样能够快速精准低成本的检测出该标记位点的多态性。确定该位点存在多态性后，再以459个有生产性能数据的大白猪个体的基因组DNA为模板进行PCR检测，PCR产物再进行电泳检测分析，最后将不同个体的基因型与其生产性状(校正背膘厚等)进行关联分析，发现杂合转座子有插入基因型(SINE^+/-)的个体的背膘厚显著高于纯合转座子无插入基因型(SINE^-/-)的个体，继而方便筛选猪的背膘厚，为选种选育工作提供了便利。

附图说明

图1为ZNF2-RIP1分子标记进行基因分型检测原理示意图；

图2为基因型预计电泳结果示意图；

图3为ZNF2-RIP1在12个品种猪中的多态性检测；

图4为部分大白个体中ZNF2-RIP1标记的基因分型检测。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

以下是结合在猪群体中的多态检测和分析对本发明进行详细说明：

本发明的与猪背膘厚相关的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记来自ZNF2基因(GENE ID:100620765，NCBI)，SINE转座子位于ZNF2基因的第1486到1799位点。含有SINE转座子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，正向的SINE序列位于SEQ ID NO:1的第251到564位点，该位点在猪的多品种中存在插入或缺失情况。

ZNF2基因内SINE转座子位点的多态性检测方案具体如下：

(1)在SEQ ID NO:1序列中SINE位置的两侧序列中设计上下游检测引物；

(2)以猪的耳样提取的DNA为模板进行PCR扩增并获得产物；

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果图确定该位点的多态性和基因型；

(4)将不同猪个体的基因型与猪的校正背膘厚等数据进行关联分析，从而验证ZNF2基因内SINE转座子多态标记位点能否作为筛选猪校正背膘厚的新的分子标记。

需要进一步说明步骤(1)中，PCR扩增所用的上下游引物序列如SEQ ID NO:2-3所示；步骤(3)中，基因型预计有3种情况(SINE^+/+，SINE^-/-或SINE^+/-)。

本发明获取与猪背膘厚相关的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记的操作过程包含以下步骤：

1、提取12个品种猪耳样的基因组DNA

本发明中用到的多品种猪耳样中大白猪的耳样来自安徽省某种猪育种公司，该大白猪群体处于相同的日粮水平，采集其耳样并收集其生产性能数据，于-80℃保存。使用TAKARA的MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa，大连，中国)试剂盒提取猪的基因组DNA。主要步骤如下：(1)取2～25mg动物组织，用剪刀剪碎。(2)加180μl Buffer GL、20μl蛋白酶K和10μl RNase A(10mg/ml)，吸打混匀，于56℃水浴至组织裂解。(3)向裂解液中加入200μl无水乙醇和200μl Buffer GB，充分吸打混匀。(4)将SpinColumn安置于Collection Tube上，将(3)中溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液。(5)向Spin Column中加500μl的Buffer WA，12000rpm离心1分钟，弃滤液。(6)向Spin Column中加700μl的Buffer WB，12000rpm离心1分钟，弃滤液，再重复步骤(6)一次。(7)将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟。(8)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-200μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置5分钟。(9)12000rpm离心2分钟洗脱DNA。获取的猪基因组DNA通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度和质量的检测并于-20℃保存。

2、PCR检测

根据ZNF2基因序列，在逆转录转座子多态标记位点的上下游设计引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示，根据表1的PCR反应体系配置混合液，在PCR反应条件下(95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒，变性至延伸35个循环，72℃延伸5分钟)进行扩增，SINE纯合有插入(SINE^+/+)和纯合无插入(SINE^-/-)产物大小分别为744bp和430bp，杂合有插入(SINE^+/-)两种大小的产物同时存在。所述正反向引物的序列如下：

正向引物序列为：5’-CATGTTTCCAGGGCAAGACT-3’(SEQ ID NO:2)；

反向引物序列为：5’-CTCTCCAGTAGCTTCTTCCATA-3’(SEQ ID NO:3)

表1.PCR反应体系

3、琼脂糖凝胶电泳检测

步骤如下：(1)制备1.5％(m/v)的琼脂糖凝胶。称取1.5g琼脂糖倒入三角烧瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置于微波炉中加热约2分钟使之完全溶解，待冷却至50℃-60℃时将琼脂糖溶液倒入插有胶梳的制胶板中，并检查有无气泡存在。室温放置，完全凝固后拔出胶梳。(2)用10μl上样枪吸取6μl DNA Maker DL2000加入凝胶孔作为参照，再吸取6μl的PCR扩增产物加入凝胶孔。(3)盖上电泳槽盖，将电泳仪的电压调至130V，观察指示带的迁移位置，决定是否结束电泳。(4)电泳结束后将凝胶置于盛有溴化乙锭溶液的盒中，染色10分钟，然后使用凝胶电泳成像仪拍照保存。

4、基因分型

根据图3拍摄的电泳结果照片，判定ZNF2-RIP1位点在不同品种猪中存在多态性。根据图4拍摄的电泳结果照片，统计被检测的大白群体中该位点的基因型，经检测该位点在459个大白个体中仅有两种基因型(426个个体的基因型为SINE-/-和33个个体的基因型为SINE+/-)，如果个体的基因型是SINE^+/-(杂合插入)，则能扩出一条含有SINE的较大条带(744bp)和一条不含有SINE的较小条带(430bp)(设计的引物在UCSC中的杜洛克参考基因组中进行电子PCR结果正常且为单一产物，但实际在大白群体中杂合插入基因型会出现两条杂带，推测在有插入的群体中存在与引物相似的序列，重新设计引物检测并无明显改善)。而如果该样本的基因型是SINE^-/-(两条染色体均无SINE插入)，则只扩增出一条较小条带(430bp)。如果该样本的基因型是SINE^+/+(两条染色体均有SINE插入)，则只扩增出一条条带(744bp)。

5、与大白猪群体的生产繁殖性能进行关联分析

选取ZNF2-RIP1分子标记在459个大白猪群体中进行多态性检测，发现在大白群体中该标记位点仅有两种基因型(SINE^+/-和SINE^-/-)，然后将每个个体的生长繁殖性能与该个体上ZNF2-RIP1位点的基因型进行关联分析，并通过单因素方差分析进行生产性能差异显著性检测。

表2.ZNF2-RIP1位点的基因型与大白猪群体的生长繁殖性状关联分析

注：同列相同字母表示组间差异不显著；不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；校正背膘厚＝实测背膘厚×CF，在式中，CF＝A/(A+(B×(实测体质量－100)))，其中，A_公猪＝12.402，B_公猪＝0.106530；A_母猪＝13.706，B_母猪＝0.119624。

在大白猪群体中，校正背膘厚与ZNF2-RIP1位点上SINE插入多态呈显著性相关(P＜0.05)，杂合转座子有插入基因型(SINE^+/-)的个体的校正背膘厚显著高于纯合转座子无插入基因型(SINE^-/-)的个体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 814

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtggaata gcacgaagaa cactgtacac agactgagcc ttgggcagca cccatgtttc 60

cagggcaaga ctgggaaaaa aaagagtcac agagatgcag gcttagtggt agaagcaagt 120

aaggccaatg tagtatcata gcagctacaa tatctgttta caagaagcat aaacttgtca 180

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aatgcattga gggagttccc gtcgtggcgc agtggttaac gaatccgact aggaaccatg 300

aggttgcggg ttcgatccct gcccttgctc agtgggttaa tgatccggcg ttgccgtgag 360

ctgtggtgta ggttgcagac gcggctcgga tcccgcgttg ctgtggctct ggcgtaggcc 420

ggtggctaca gctccgattc aacccctagc ctgggaacct ccatatgccg cgggagcggc 480

ccaagaaata gcaacaataa caacaacaac aacaacaaag acaaaagaca aaaaaaaaaa 540

taaataaatt aagaaatgca ttgacagttt ttcaagcaag caatttcagg tgtgtgaggg 600

gtggaaagag aagaataatg gatttgagaa taccatgtgg tgatatggag tcaggaggta 660

tgtggaagtt tgatcatgaa aggagaacct aaaggagaac agttttgcta gaggaaggcc 720

atgggattta gtgaagagag ttttacattg aggaggattg tatctgttta aagatatgga 780

agaagctact ggagagattg gagatgctgg aaaa 814

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgtttcca gggcaagact 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctccagta gcttcttcca ta 22

Claims (10)

1.一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记，其特征在于，含有该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记位于SEQ ID NO:1序列的251到564位。

2.根据权利要求1所述的一个与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记，其特征在于，所述的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记位点在ZNF2基因的第1486到1799位。

3.根据权利要求1所述的与猪背膘厚关联的ZNF2基因内SINE转座子多态分子标记检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

根据权利要求1或2所述序列中SINE位置的两侧序列中设计上下游检测引物；

以猪的耳样提取的DNA为模板进行PCR扩增并获得产物；

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果图确定该位点的多态性和基因型。

4.根据权利要求3所述与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记检测方法，其特征在于，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ IDNO:3所示。

5.根据权利要求3所述与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记检测方法，其特征在于，所述基因型包括SINE^+/+，SINE^-/-和SINE^+/-。

6.根据权利要求5所述与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记检测方法，其特征在于，SINE^+/+基因型在744bp处出现特异性条带；SINE^+/-基因型同时在744bp和430bp出现特异性条带；SINE^-/-基因型在430bp处出现特异性条带。

7.根据权利要求3所述与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记检测方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒，变性至延伸35个循环，72℃延伸5分钟。

8.权利要求1所述的与猪背膘厚相关的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记在筛选猪背膘厚性状中的应用。

9.一种猪选育的方法，其特征在于，检测如权利要求1或2所述与猪背膘厚关联的ZNF2基因内的SINE转座子多态分子标记，以确定猪个体基因型是SINE^+/+，SINE^-/-或SINE^+/-，并根据选育需求筛选所需的基因型。

10.一种鉴定猪品种背膘厚的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有权利要求4所述的检测方法中采用的引物。

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